JP3025974B2

JP3025974B2 - 新規酵素、その製造法及びそれを用いたマルトオリゴ糖の製造法

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Publication number: JP3025974B2
Application number: JP02264855A
Authority: JP
Inventors: 隆一大矢; 健一濱保; 廣二辻; 進廣瀬; 晉平山本
Original assignee: 天野製薬株式会社
Priority date: 1990-10-01
Filing date: 1990-10-01
Publication date: 2000-03-27
Anticipated expiration: 2015-03-27
Also published as: JPH04141082A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新たに土壌から分離した新規な菌株、該菌株
から取得することができる新規酵素及び該酵素の製造法
並びにマルトオリゴ糖の製造方法に関する。

さらに詳細には、ズーグレア・ラミゲラ（Zoogloea r
amigera）KO−159、生澱粉にも作用してマルトペンタオ
ースを生成する能力を有する新規酵素（以下、G5生成酵
素という）、G5生成酵素を産生するズーグレア属に属す
る菌株を培養し、培養物から該酵素を採取する方法、さ
らに該酵素を用いて澱粉からマルトペンタオースを製造
する方法に関する。

マルトオリゴ糖に関する研究は、現在盛んに行われて
いる。つまり、マルトオリゴ糖は食品の増量剤、賦形
剤、包接剤として食品、医薬、工業製品あるいは臨床検
査用診断薬の原料に広く利用できるものとして期待され
ている。さらに近年においては機能性食品としての用途
にも期待されるものである。とくにマルトペンタオース
は現在ではアミラーゼ活性測定用の基質として使用され
ているのみであるが、溶解性に優れ、甘味がなく、ボデ
ィ感があるので製菓用材料として有望であり、また消
化、吸収性がよいので幼児、老人、病人用の滋養食とし
ての利用も可能である。このように有用なマルトペンタ
オースは安定した製造法が確立されることによって、そ
の用途もさらに大きく広がるものとして期待されてい
る。

〔従来技術〕

マルトオリゴ糖としてはマルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオースあるいはマルトペンタオース等
が挙げられるが、現在大量に生産されていないのはマル
トペンタオースのみである。

これらのマルトオリゴ糖は澱粉に各種のアミラーゼを
作用させることによって生産される。

澱粉からマルトペンタオースを生産する能力を有する
微生物起源のアミラーゼが今までにも報告されている。

例えば、バチルス（Bacillus）属に属する菌株の生産
するアミラーゼ（［アーカイブオブバイオケミスト
リイアンドバイオフィジックス（Archives of Bioc
hemistry and Biophysics）115巻、290−298（197
3）］、特公昭60−36278、特開昭60−34182）、アルカ
リゲネス（Alcaligenes）属に属する菌株の生産するア
ミラーゼ（特公昭63−51677）、シュードモナス（Pseud
omonas）に属する菌株の生産するアミラーゼ（特公平２
−9798）が報告されている。

しかしながら、これらのアミラーゼはマルトペンタオ
ースばかりでなくマルトテトラオースなどの他のマルト
オリゴ糖を生成したり、あるいはマルトペンタオースの
生成量が満足できるものではなく、さらにこれらのアミ
ラーゼは可溶性澱粉や液化澱粉には作用できるが、生澱
粉にはほとんど作用しない等、マルトペンタオース製造
に際しては広く工業的に使用するには問題点が多かっ
た。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、この現状に鑑み新たな性質を持つマル
トペンタオース生成酵素を産生する微生物を探索し、土
壌から新しく細菌を分離し、その細菌を培養することに
よって目的とするマルトペンタオース生成酵素が得られ
ることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成し
た。

即ち、本発明はズーグレア・ラミゲラKO−159、本菌
株から得られるG5生成酵素、G5生成酵素を産生するズー
グレア属に属する菌株を培養し、培養物から該酵素を採
取する方法、さらに該酵素を用いて生澱粉、可溶性澱
粉、澱粉の組成画分及び澱粉の分解反応物質からマルト
ペンタオースを収率良く製造する方法を提供するもので
ある。

〔問題点を解決するための手段及びその作用〕

上記の特性を有する酵素を産生する菌株の探索には以
下のような組成の培地を使用して行った。

トウモロコシデンプン 2.0 ％ポリペプトン 0.05％硝酸アンモニウム 0.1 ％硫酸マグネシウム・７水塩 0.02％リン酸一カリウム 0.14％塩化カルシウム 0.05％酵母エキス 0.01％（pH6.0に調整）上記の培地に少量の土壌を加え、35℃で２〜３日培養
した。生澱粉を分解して、コロニーの周りにハローを形
成する微生物をシャーレに移し、更に35℃、２〜３日間
培養した。明確なハローを形成する細菌を平板培地に画
線し、単離・純化を行った。以下に、この方法により単
離された本発明のズーグレア・ラミゲラKO−159の菌学
的性質を記載する。

上記の各試験は、BBLトリプチケースソイ寒天又は標
準寒天を前培養培地として用い、30℃でバージーズ・マ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
（Bergy's Manual of Systematic Bacteriology）第１
巻（1984）及びバージーズ・マニュアル・オブ・デタミ
ネイティブ・バクテリオロジー（Bergy's Manual of De
terminative Bacteriology）第８版（1974）に従い、諸
試験を行った。

本菌の特徴は、（１）偏性好気性（２）グラム陰性（３）周べん毛運動性（４）多形成、桿状細菌である。

従って、グラム陽性のコリネバクテリウム（Coryneba
cterium）、アルスロバクター（Arthrobacter）、Stalk
を有するカウロバクター（Caulobacter）、多形成を有
さないシュードモナス（Pseudomonas）、アルカリゲネ
ス（Alcaligenes）、キサントモナス（Xanthomonas）系
のいずれでもない。

相当するものとしてはアゾスピリリウム（Azospirill
ium）、ズーグレア（Zoogloea）、リゾビウム（Rhizobi
um）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）があり、
これらのいずれかに属する細菌である。これらは、分類
学的にいずれも近縁の関係にあって、一概に属を決める
のは難しく、従って形態・生理的諸性質を総合して考え
ねばならない。

アグロバクテリウム属と比較すると、耐塩性、３−ケ
ト−ラクトースの生成、シモンズクエン酸の分解、ラク
トース、シュクロース、サリシン等からの酸の生成、特
にカゼイン、澱粉、Tween−80、ゼラチンの分解項目で
異なり、これらに属する菌種に相当するものはない。

次にリゾビウム属と比較すると、本菌はその多形性、
生育性状（生育pH、温度、カードラン形成等）で極似す
るが、糖の利用性スペクトルが狭く（ラクトース、シュ
クロース等が不可）、又、ペプトンに良く生育し、カゼ
インを分解するが、硝酸・亜硝酸塩を利用しないことか
ら当てはまるものでない。

アゾスピリリウム属は現在２菌種のみが承認されてお
り、本菌は形態、生理学的に極めて類似する菌種と思わ
れた。しかし、ペプトン下における嫌気培養での生育及
びガス発生（脱窒反応）が認められないこと、更にGC含
量が64.4mol％であること（文献記載値でアゾスピリリ
ウム属が69〜71mol％でズーグレア属が65.3mol％であ
る）を根拠として、本菌を、結論的にズーグレア属菌と
同定した。

バージーズ・マニュアル記載のズーグレア属は１菌種
ズーグレア・ラミゲラのみであるが、ATCCでは３菌種を
有する。この中には、周べん毛のもの、脱窒素反応のな
いもの、tree−like、finger−like非形成のもの、シュ
クロース、ラクトースを資化するものが交差している
が、この３菌種に完全に一致するものはなかった。これ
らの考察を総合的に判断して本菌株をズーグレア・ラミ
ゲラの新菌株と同定し、ズーグレア・ラミゲラKO−159
と命名した。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第11738号（FERM P−11738）として寄託さ
れている。

本発明の微生物は新規なアミラーゼ、即ちG5生成酵素
を生産する能力を有している。

更に、本発明はG5生成酵素を産生する能力のある、ズ
ーグレア属に属する菌株を培養して該酵素を生産する方
法を提供する。

本発明に使用できる微生物はズーグレア属に属し、G5
生成酵素産生能を有する微生物であれば使用できるが、
好ましくは本発明のズーグレア・ラミゲラKO−159が挙
げられる。

これらの微生物を培養し、G5生成酵素を取得するため
の培養法及び精製法等について述べる。

本発明を実施するにあたり、その培養形態としては液
体培養、固体培養いずれも可能であるが工業的には撹拌
培養を行うのが有利である。

使用する培養源としては一般に微生物培養に用いられ
る炭素源、窒素源、無機塩及びその他の微量栄養源の
他、ズーグレア属に属する微生物の利用出来る栄養源で
あれば全て使用出来る。培地の炭素源としては澱粉、デ
キストリン、マルトース、グルコース、ラスターゲン、
グリセリン等の他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独で
又は組合せて用いられる。窒素源としては無機窒素源、
有機窒素源のいずれも使用可能であり無機栄養源として
は硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ソ
ーダ、塩化アンモニウム等が挙げられる。又、有機窒素
源としては大豆、米、トウモロコシ、小麦などの粉、
糠、脱脂粕をはじめコーンステイープリカー、ペプト
ン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス等が挙
げられる。無機塩及び微量栄養素としてはリン酸、マグ
ネシウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の
他ビタミン、非イオン界面活性剤、消泡剤等の菌の生育
やG5精製酵素の生産を促進するものであれば必要に応じ
て使用出来る。

培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育しG5生成酵
素が産生する範囲であれば良く、好ましくは30〜40℃で
ある。培養時間は条件により異なるがG5生成酵素が最も
産生される時間まで培養すれば良く、通常１〜４日程度
である。

G5生成酵素は液体培養では培養液中に溶解されてお
り、培養終了後培養液より固形分を除いた培養ろ液より
採取される。

培養ろ液よりG5生成酵素を精製するには通常の酵素精
製に用いられるあらゆる方法が使用出来る。例えばエタ
ノール、アセトン、イソプロピルアルコール等の有機溶
媒による処理、硫安、食塩等による塩析、透析、限外ろ
過法、イオン交換クロマトグラフイー、吸着クロマトグ
ラフイー、ゲルろ過、吸着剤、等電点分画等の方法が使
用出来る。又これらの方法を適当に組合せる事によりG5
生成酵素の精製度が上る場合は適宜組合せて行う事が出
来る。

これらの方法によって得られる酵素には安定化剤とし
て各種の塩類、糖類、蛋白質、脂質、界面活性剤等を加
え或いは加えることなく、限外ろ過濃縮、逆浸透濃縮、
減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥の方法を施すことにより
液状又は固形の精製G5生成酵素を得ることが出来る。

ズーグレア・ラミゲラKO−159の生産するG5生成酵素
の酵素化学的性質について以下に記す。

なお、酵素活性は特に指定しない限り下記の方法に従
って測定した。

澱粉分解酵素活性測定法（ａ）可溶性澱粉分解活性 1.25％可溶性澱粉 0.2 ml 蒸留水 0.15ml 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0） 0.1 ml 酵素液 0.05ml 上記の反応液を37℃、15分間放置して反応を行った。ソ
モギー試薬1mlの添加により反応を停止し、その後ソモ
ギー−ネルソン法に従って還元糖を測定した。

酵素活性は37℃、１分間に１μmoleのグルコースに相
当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

（ｂ）生澱粉分解活性２％トウモロコシ生澱粉懸濁液〔0.1M酢酸ナトリウム（pH6.0）に懸濁〕 1ml 酵素液 1ml 上記の反応液で37℃、４時間振盪反応を行った。反応終
了後、15,000rpm、10分間遠心分離した。その上澄液中
の可溶性全糖をフェノール−硫酸法で測定した。

酵素活性は37℃、１時間に生澱粉を分解して1mgの可
溶性糖を生成する酵素量を１単位とした。

（１）作用：生澱粉、可溶性澱粉に作用し主にマルトペ
ンタオースを生成し、その後時間の経過と共にマルトー
スとマルトトリオースに水解する。

（２）至適pH:pH6.0〜7.0 （第１図に示す。）（３）至適温度 Ca²⁺存在下 :50℃（pH6.0〜10分間） Ca²⁺非存在下:40℃（pH6.0〜10分間）（第２図に示す。）（４）安定pH Ca²⁺存在下 :pH4.0〜9.0（50℃、10分間） Ca²⁺非存在下:pH5.0〜9.0（50℃、10分間）（第３図に示す。）（５）温度安定性:45℃以下（pH6.0、15分間） Ca²⁺で50℃まで安定性が増加する。

（第４図に示す。）（６）基質特異性：生澱粉、可溶性澱粉及びグリコーゲ
ン等に作用し、プルランには実質的に作用しない。その
結果を第１表に記載する。

基質特異性は還元力の増加で測定し、相対活性で示し
た。

本酵素による生成物のアノマー型を知るために、可溶
性澱粉を基質として、堀場製高速自動旋光計SEPA−200
を用い、光路長10cmで測定した結果、酵素反応経過と共
に旋光度の減少がみられ、本酵素が澱粉からα−アノマ
ーの生成物を切り出していることが示された。（第５図
に示す。）（７）分子量：約63,000（SDS−PAGE）（８）等電点:pI8.4（EPLC P−カラム）（９）沈降係数:4.7S 以上に示した性質を有するG5生成酵素は従来のマルト
ペンタオース生成アミラーゼとして知られているバチル
ス・リケニフォルミス（Bacilluslicheniformis）584、
バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バ
チルス・セレウス（Bacillus cereus）NY−14、シュー
ドモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）KO−8940、ア
ルカリゲネス・ファエカリス（Aspergillus faecalis）
IAM−1015等の生産する酵素と比較すると第２表に示す
ように、等電点、分子量、生澱粉分解性など、いずれも
従来知られている酵素の性質とは異なっている。

本発明のG5生成酵素は可溶性澱粉を始め生澱粉にも作
用してマルトペンタオースを生成する。従って、生澱
粉、可溶性澱粉、澱粉の組成画分及び澱粉の分解反応生
成物の少なくとも１種以上の物質にG5生成酵素を作用さ
せることにより、マルトペンタオースが生成・蓄積す
る。反応を行うに当たり、G5生成酵素の性質を考慮して
マルトペンタオースの生成量が最大になるような条件を
選定するべきである。

ここで澱粉とは、ワキシーコーン、小麦、コーン、
米、カッサバ、サツマイモ、サゴやし、ジャガイモ等か
らの各種生澱粉及びそれらをα−アミラーゼ等で可溶化
した液化澱粉等を原料として使用できる。また、澱粉の
組成画分としては、例えばアミロース、アミロペクチン
などがあり、澱粉の分解反応生成物としては、たとえば
白色デキストリン、黄色デキストリン、ブリティシュガ
ム等の培焼デキストリン；酸化澱粉、低粘性変性（酵
素，酸，機械高速回転等の処理による）澱粉などの加工
澱粉；リン酸澱粉，酢酸澱粉等の澱粉エーテル，澱粉エ
ステル等の澱粉誘導体；物理処理（高周波処理や湿熱処
理）澱粉、α−澱粉等を挙げることができる。これらは
単独もしくは組み合わして使用する。

反応後、加熱して酵素を失活させて反応を停止し、反
応液から常法によりマルトペンタオースを得ることがで
きる。

次に本発明を試験例、実施例でより詳しく説明する。

実施例１ G5生成酵素生産菌株の培養及びその培養過程ズーグレア・ラミゲラKO−159（FERM P−11738）菌株
を500ml坂口フラスコ中の100mlのpeptone−bouillon培
地で30℃、24時間振盪培養し、前培養とした。1000ml坂
口フラスコ中の500mlの本明細書の７頁に記載した生澱
粉培地に前培養をした菌株を移植し、30℃で３日間培養
した。

前記培養液から経時的に約5mlを採取し、以下の試験
を行った。

この内の一部（0.5ml）を10倍に希釈、懸濁し、15分
間放置し、培地中の生澱粉を沈降させた。上澄液を660n
mで吸光度を測定し生育度とした。残りの培養液は15,00
0rpm、10分間遠心分離した後、上澄液をとり、pH及び可
溶性全糖を測定した。更に上澄液は粗酵素として可溶性
及び生澱粉分解活性を測定した。ズーグレア・ラミゲラ
KO−159菌株の生育、可溶性全糖の蓄積量、可溶性及び
生澱粉分解酵素、pH変化の結果を第６図に示す。

第６図からも判るように、本菌株はトウモロコシ生澱
粉を分解、可溶化すると共に菌体外へ生澱粉及び可溶性
澱粉を分解する酵素を生産した。生育度が最高になるの
は２日目であったが、生澱粉及び可溶性澱粉分解活性は
３日目が最も高かった。又、pHは生育と共に4.2付近ま
で減少した。

実施例２酵素の精製（特に記載しない限り精製操作
は、５℃で行う）実施例１で得られた培養液をろ過した液（2000ml）に
20分間蒸気滅菌したコーンスターチ５％（w/v）を加え
て一夜撹拌し、酵素を澱粉に吸着させた。次いでデカン
テーションによって上澄液を除去し、沈降した澱粉を冷
水で洗浄・ろ過してろ取した。この澱粉を更に冷水で洗
浄・ろ過後、50℃に保持した0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
（pH6.0）中に分散させ、２時間撹拌して吸着した酵素
を溶出させた。溶出後、ろ過して澱粉を除去し溶出液を
得た。

あらかじめ0.01M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）で平
衡化させたCM−セファデックスＣ−50カラム（2.8×21c
m）に酵素を吸着させ、０−1M NaCl濃度勾配溶出法で溶
出した。溶出してきた酵素画分を分取し、PM−10限外ろ
過膜（アミコン社製）で濃縮した。精製過程を第３表に
示す。

最終の精製したG5生成酵素標品はSDS−ポリアクリル
アミド電気泳動法により単一に純化されていることが明
らかとなり、標準蛋白質との比較から分子量は、約63,0
00であった。

試験例１ G5生成酵素の活性に及ぼすEDTAの影響実施例１で得られた精製G5生成酵素の各種濃度のEDTA
溶液中で37℃、30分間放置して可溶性澱粉分解活性及び
生澱粉分解活性に及ぼすEDTAの影響について検討した。
その結果を第７図に示す。

第７図からも判るように、G5生成酵素の生澱粉分解活
性は可溶性澱粉分解活性に比べてEDTAの影響を受けにく
いことが判った。

試験例２濃縮培養ろ液の各種生澱粉分解力の比較実施例１で得られた培養液を8,000rpm、15分間遠心分
離し、その上澄液を限外ろ過器（旭化成製）で濃縮し、
更にPM−10限外ろ過膜（アミコン社製）を用いて濃縮し
た。これを0.01M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に対し
て透析を行い、濃縮培養ろ液とした。

この濃縮培養ろ液を米、小麦、トウモロコシ、サツマ
イモ、ジャガイモ澱粉を基質として短時間（４時間）作
用させ、その生澱粉分解力の初速度を比較した。初速度
の測定は下記のようにして行った。

１％生澱粉懸濁液 1.0ml 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0） 0.5ml 濃縮培養ろ液（0.6単位/ml） 0.5ml （可溶性澱粉分解活性）上記の反応液を37℃で４時間振盪反応させた。反応終
了後、15,000rpm、10分間遠心分離した後、その上澄液
中の全糖量をフェノール−硫酸法で測定し、生澱粉の分
解初速度（可溶化率）を求める。その結果を第８図に示
す。

濃縮培養ろ液の各種生澱粉の対する分解力はその基質
の植物起源によって大きな差が現れた。小麦澱粉や米澱
粉はよく分解されたが、ジャガイモ澱粉は作用を受けに
くかった。

試験例３精製したG5生成酵素の各種生澱粉分解力の比
較ワキシーコーン、小麦、コーン、米、カッサバ、サツ
マイモ、サゴやし、ジャガイモからの各種生澱粉を基質
として実施例２で得られた精製したG5生成酵素を下記の
反応条件で反応させその生澱粉分解能を比較した。（第
９図及び第10図に示す） G5生成酵素（31.2単位） 200μｌ（可溶性澱粉分解活性） 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）11.74ml 1M−Cacl₂ 60μｌ各種生澱粉 600mg 上記の反応液を37℃で反応する。

（生澱粉 50mg/2.6単位/ml反応液）精製酵素の各種生澱粉に対する分解力はその基質の植
物起源によって大きな差が現れた。しかし、いずれの場
合でも添加酵素量を増加することによりほぼ100％分解
する事ができると考えられる。

試験例４精製したG5生成酵素の各種オリゴ糖に対する
作用各種オリゴ糖（マルトース、マルトトリオース、マル
トテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオ
ース、マルトヘプタオース）を基質として、以下の条件
で反応した。

0.01M酢酸緩衝液（pH6.0） 50μｌ（各オリゴ糖を２％含有）酵素液（５単位） 50μｌ（可溶性澱粉分解活性） 37℃、１時間反応し、展開溶媒としてｎ−ブタノー
ル：ピリジン：水＝6:4:3を使用し２回展開した。その
結果、マルトースに対しては糖転移酵素として作用して
マルトトリオース、マルトテトラオース等の高重合度の
オリゴ糖を生成する。マルトトリオースにはほとんど作
用しない。マルトテトラオース、マルトペンタオース、
マルトヘキサオース、マルトヘプタオースを水解して各
種の低重合度のオリゴ糖を生成するがグルコースはほと
んど生成しない。

実施例３濃縮培養液による生澱粉及び可溶性澱粉の分
解生成物（１）生澱粉の分解トウモロコシ生澱粉を基質として、実施例２に記載し
た濃縮培養ろ液と作用させて、経時的に生成オリゴ糖を
薄層及び高速液体クロマトグラフィーで同定し、定量を
行った。

１％トウモロコシ生澱粉懸濁液 1.0ml 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0） 0.5ml 濃縮培養ろ液（0.6単位/ml） 0.5ml （可溶性澱粉分解活性）上記反応液を37℃で振盪して反応を行った。その結果
を第11図に示す。

トウモロコシ生澱粉を基質とした場合、時間の経過と
共に還元糖は上昇し、６時間を経過した後は反応は見か
け上、平衡に達した。又、オリゴ糖はマルトペンタオー
スが主に生成され、経時的に徐々に分解されていく傾向
が見られた。

（２）可溶性澱粉の分解可溶性澱粉を基質として、実施例２に記載した濃縮培
養ろ液と作用させて、経時的に生成オリゴ糖を薄層及び
高速液体クロマトグラフィーで同定し、定量を行った。

1.25％可溶性澱粉 200μｌ 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0） 100μｌ蒸留水 150μｌ濃縮培養ろ液（0.6単位/ml） 50μｌ（可溶性澱粉分解活性）上記反応液を37℃で振盪して反応を行った。その結果
を第12図に示す。

可溶性澱粉を基質とした場合は反応初期にはマルトペ
ンタオースが主に生成した。そして時間の経過とともに
マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースが
生成し、更に少量のグルコースが生成した。

生澱粉を基質とした場合、可溶化された糖は少量であ
ったが、マルトース、マルトテトラオース、マルトペン
タオースの三種類のみ定量できた。

マルトペンタオースが基質の9.5％（w/w）に達し、マ
ルトテトラオース、マルトースの生成量の最大で二倍に
なった。明らかに本濃縮培養ろ液はオリゴ糖生成アミラ
ーゼであることを示している。

可溶性澱粉を基質として用いた場合、マルトース、マ
ルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオ
ースが全反応時間を通して生成されたが、マルトヘキサ
オース、マルトヘプタオースは反応初期にわずか検出で
きたのみで、グルコースについては全く検出できなかっ
た。全反応期間を通じてマルトペンタオースが最も多量
に生成し、その生成量は反応時間60分で最大49％に達
し、マルトテトラオースの約５倍、マルトトリオース、
マルトースのそれぞれ10倍であった。本酵素は明らかに
マルトペンタオース生成アミラーゼの性質を示してい
る。

〔発明の効果〕

本発明により、新規なアミラーゼ即ち生澱粉及び可溶
性澱粉に作用してオリゴ糖、特にマルトペンタオースを
生成する酵素が提供され、本発明により食品、医薬業界
におけるマルトペンタオースの利用が拡大される。

【図面の簡単な説明】

第１図から第４図は、G5生成酵素の酵素化学的性質を示
すものであり、各々至適pH、至適温度、pH安定性及び温
度安定性を示す。なお、第１図及び第３図において、−
○−はCaイオンの存在下で酢酸緩衝液を使用した結果を
示し−□−はCaイオンの非存在下で酢酸緩衝液を使用し
た結果を示し、−●−はCaイオンの存在下でトリス−酢
酸緩衝液を使用した結果を示し、−■−はCaイオンの非
存在下でトリス−酢酸緩衝液を使用した結果を示す。第
２図及び第４図においては、−●−はCaイオン存在下の
結果であり、−○−はCaイオンの非存在下での結果を示
している。第５図、は酵素反応時の可溶性澱粉分解生成物の旋光度
変化を示すものである。第６図は、ズーグレア・ラミゲラKO−159菌株の生育とG
5生成酵素の産生過程を示し、図中で、−●−は可溶性
全糖量を、−○−は生育度、−□−は培養液のpHを示す
ものであり、棒グラフにおいては、白は可溶性澱粉分解
活性を示し、黒は生澱粉分解活性を示す。第７図は試験例１の結果、即ちEDTAのG5生成酵素に及ぼ
す影響を示すものであり、−●−は生澱粉分解活性を示
し、−○−は可溶性澱粉分解活性を示す。第８図は、試験例２の結果、即ち各種生澱粉に対する濃
縮培養ろ液による分解初速度の比較を示す。第９図は、試験例３の結果、即ち各種生澱粉に対する精
製したG5生成酵素による分解率を示し、図中で、−●−
はワキシーコーン、−○−は小麦、−□−はコーン、−
■−は米、−▲−はカッサバ、−△−はサツマイモ、−
◆−はサゴやし、−◇−はジャガイモの各生澱粉の結果
を示す。第10図は、試験例３の結果、即ち各種生澱粉に対する精
製したG5生成酵素による精製還元糖量を示し、図中の記
号は第８図と同じである。第11図は、実施例３の結果、即ちトウモロコシ生澱粉に
濃縮培養ろ液を作用させたときのオリゴ糖の生成を示
し、図中で−○−は還元糖量、−●−はマルトペンタオ
ース生成量、△はマルトース生成量、□はマルトテトラ
オース生成量を示す。第12図は、実施例３の結果、即ち可溶性澱粉に濃縮培養
ろ液を作用させたときのオリゴ糖の生成を示し、−●−
はマルトペンタオース生成量、−□−はマルトテトラオ
ース生成量、△はマルトース生成量、▲はマルトトリオ
ース生成量、■はグルコース生成量を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:01）審査官内田俊生 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/26 - 9/34 C12N 1/20 C12P 19/14 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の（ａ）から（ｈ）の酵素化学的性質
を有するG5生成酵素を生産することによって特徴づけら
れるズーグレア・ラミゲラ（Zoogloea ramigera）KO−1
59。（ａ）作用：生澱粉及び／又は可溶性澱粉に作用し主に
マルトペンタオースを生成し、その後時間の経過と共に
マルトースとマルトトリオースに水解する。（ｂ）基質特異性：生澱粉、可溶性澱粉、グリコーゲン
等に作用し、プルランに実質的に作用しない。（ｃ）至適pH:pH6.0〜7.0 （ｄ）至適温度:50℃（Ca²⁺存在下）（ｅ）安定pH:pH4.0〜9.0（Ca²⁺存在下）（ｆ）温度安定性:50℃まで（Ca²⁺存在下）（ｇ）分子量：約63,000 （ｈ）等電点:pI8.4
【請求項２】少なくとも下記の酵素化学的性質を有する
新規なG5生成酵素。（ａ）作用：生澱粉及び／又は可溶性澱粉に作用し主に
マルトペンタオースを生成し、その後時間の経過と共に
マルトースとマルトトリオースに水解する。（ｂ）基質特異性：生澱粉、可溶性澱粉、グリコーゲン
等に作用し、プルランに実質的に作用しない。（ｃ）至適pH:pH6.0〜7.0 （ｄ）至適温度:50℃（Ca²⁺存在下）（ｅ）安定pH:pH4.0〜9.0（Ca²⁺存在下）（ｆ）温度安定性:50℃まで（Ca²⁺存在下）（ｇ）分子量：約63,000 （ｈ）等電点:pI8.4
【請求項３】ズーグレア属に属し、下記の（ａ）〜
（ｈ）の酵素化学的性質を有するG5生成酵素を生産する
微生物を培養し、培養物から該G5生成酵素を採取するこ
とを特徴とするG5生成酵素の製造法。（ａ）作用：生澱粉及び／又は可溶性澱粉に作用し主に
マルトペンタオースを生成し、その後時間の経過と共に
マルトースとマルトトリオースに水解する。（ｂ）基質特異性：生澱粉、可溶性澱粉、グリコーゲン
等に作用し、プルランに実質的に作用しない。（ｃ）至適pH:pH6.0〜7.0 （ｄ）至適温度:50℃（Ca²⁺存在下）（ｅ）安定pH:pH4.0〜9.0（Ca²⁺存在下）（ｆ）温度安定性:50℃まで（Ca²⁺存在下）（ｇ）分子量：約63,000 （ｈ）等電点:pI8.4
【請求項４】生澱粉、澱粉の組成画分および澱粉の分解
反応生成物の少なくとも１種以上に、少なくとも下記の
酵素化学的性質を有するG5生成酵素を作用させることを
特徴とするマルトオリゴ糖の製造法。（ａ）作用：生澱粉及び／又は可溶性澱粉に作用し主に
マルトペンタオースを生成し、その後時間の経過と共に
マルトースとマルトトリオースに水解する。（ｂ）基質特異性：生澱粉、可溶性澱粉、グリコーゲン
等に作用し、プルランに実質的に作用しない。（ｃ）至適pH:pH6.0〜7.0 （ｄ）至適温度:50℃（Ca²⁺存在下）（ｅ）安定pH:pH4.0〜9.0（Ca²⁺存在下）（ｆ）温度安定性:50℃まで（Ca²⁺存在下）（ｇ）分子量：約63,000 （ｈ）等電点:pI8.4
【請求項５】マルトオリゴ糖がマルトペンタオースであ
る特許請求項第４項記載の製造法