JP2790320B2 - 耐熱性アミラーゼ並びにその製造及び使用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生澱粉に作用することができる新規な耐熱性
アミラーゼ、その製造方法、及び該アミラーゼを使用す
るオリゴ糖の製造方法に関する。この酵素の使用により
糖化工程の簡略化及び省エネルギーが可能となる。

〔従来の技術〕

マルトースは澱粉を加水分解して得られる歴史の古い
澱粉糖であるが、近年その食品素材、甘味材としての優
れた特性から食品加工分野での用途が広がりつつある。
精製マルトースは、輪液用として従来用いられていたグ
ルコースより優れているため医薬用としての需要が増え
ている。また、精製マルトースの製造の過程で副成する
マルトトリオースを含むオリゴ糖は甘味度がマイルド
で、かつ従来のデキストリンを主成分とする水飴より粘
度が低く、また保水性が高いなどの特徴がある為、最近
新しい甘味料として期待されている。

従来、澱粉を加水分解し各種糖を製造する工程におい
て、澱粉粒を水と共に加熱（85〜120℃）することによ
り糊化し、α−アミラーゼによって液化し、次いで夫々
の目的に応じ、グルコアミラーゼあるいはβ−アミラー
ゼによって糖化する方法が行われている。しかし、高濃
度の澱粉粒の糊化および液化には多量のエネルギーを必
要とする。また、糊化澱粉の粘度が高い為に特殊な装置
を必要とする。また、澱粉を高温下に糊化後液化する場
合は液化生成物の老化および液化生成物の還元性末端グ
ルコース残基の異性化により収率の低下が起るとされて
いる。

澱粉を70℃以下の糊化しない温度で、生澱粉分解性酵
素を作用させ糖化する事が可能となれば、その溶液は低
粘度であり、工程を簡略化出来ると同時にエネルギー的
にも有利となる。また、高温処理による還元性末端グル
コース残基の異性化も少く経済的に有利となる。一部で
生澱粉分解作用の強い糖化酵素を用いた無蒸煮アルコー
ル発酵の検討が行われているが未だ実用化の域に達して
いない。特開昭60−83595、及び同61−83595はアスペル
ギルス属に属する菌の生産する生澱粉分解性グルコアミ
ラーゼについて開示している。特開昭63−59881、及び
同63−59887はペニシリウム属に属する菌の生産する生
澱粉分解性グルコアミラーゼがα−アミラーゼとの共存
下により高い生澱粉分解性を示す事を開示している。特
開昭61−47189はフミコーラ属に属する菌の生産する生
澱粉分解性グルコアミラーゼについて開示している。し
かし生澱粉から直接糖化によりマルトースやマルトトリ
オースを製造する方法は報告されていない。

工業的に生澱粉を糖化してマルトース等を製造する際
には、糖化速度と同時に雑菌による汚染も問題となる。
これらの点から反応温度は澱粉が糊化しない範囲におい
て、出来るだけ高温側が望ましく、従って耐熱性アミラ
ーゼが求められている。

マルトースの製造に用いられるβ−アミラーゼは従来
は植物由来の酵素が用いられ、大麦あるいは大豆のβ−
アミラーゼがよく知られている。これら植物由来のβ−
アミラーゼは反応温度・耐熱性においてあるいは供給の
点で問題がある。したがって工業的使用に耐える熱安定
性や安定供給が可能な微生物由来のβ−アミラーゼが望
まれている。微生物由来のβ−アミラーゼについては多
くの報告がある（アミラーゼ；中村道徳監修、学会出版
センター、P86（1986））。しかしながら微生物による
β−アミラーゼの製造はまた実用化の域には達していな
い。

マルトースはβ−アミラーゼを澱粉鎖に使用させてそ
れをマルトース単位に加水分解することにより得られる
が、従来のβ−アミラーゼは澱粉中のα,1−６グリコシ
ル結合を加水分解できず、したがって澱粉からのマルト
ース収率を上げる目的で澱粉中の分枝すなわちα,1−６
グルコシル結合を切断する為にイソアミラーゼ、プルラ
ナーゼを併用するのが通常の方法である。しかしこれら
α,1−６結合を切断する酵素は高価である。

〔発明が解決しようとする課題〕

以上のごとく、澱粉からマルトース又はその他のオリ
ゴ糖を工業的に製造するには種々の問題点があった。本
発明は、それらの種々の問題点を酵素の面から一挙に解
決しようとするものであり、具体的には、（１）生澱粉
に直接作用してそれを加水分解することができ、（２）
その場合にイソアミラーゼ等のいわゆる枝切酵素を併用
しないで澱粉を実質的に100％分解することができ、
（３）その結果、目的とするマルトース及びマルトトリ
オースを支配的に生成せしめることができ、（４）生澱
粉に作用される際に、雑菌の汚染を有効に防止できる程
高温で使用するのに十分な耐熱性を有し、そして（５）
細菌によって大量に製造することができる新規なアミラ
ーゼを提供するものである。本発明はさらに、この新規
な耐熱性アミラーゼの製造方法、及びそれを用いるマル
トースその他のオリゴ粒の製造方法を提供しようとする
ものである。

〔課題を解決するための手段〕

耐熱性酵素の性質 本発明は第一に生澱粉に作用することができる新規な
耐熱性アミラーゼを提供するものであり、この酵素の一
例を詳細に説明する。なお、以下に示す酵素の性質は後
記する実施例２で得た酵素を用いて得られた結果であ
る。

（１）作用：本発明のアミラーゼは生澱粉に作用し、主
としてマルトース、マルトトリオースとする。特に60℃
で生澱粉に作用した場合、生澱粉を実質的に100％分解
する。各種生澱粉に対する分解のし易さは小麦澱粉＞と
うもろこし澱粉＞甘藷澱粉＞馬齢薯澱粉の順である（第
１図参照）。

また、本発明の生澱粉分解性を有する耐熱性アミラー
ゼは各種生澱粉粒に対し強い吸着力を有し、この吸着力
が生澱粉の分解性を基礎づけている。

（２）至適pH及びpH安定性：本酵素の至適pHは6.0付近
である（第２図参照）。各pHの緩衝液中で室温（22℃）
にて１時間処理した場合pH5〜８において95％以上の残
存活性を示す（第２図参照）。

（３）至適温度:pH7.0において測定した至適温度は70℃
であり（第３図参照）、70℃で15分間処理した場合実質
的に不活性化されず、１時間処理した場合70℃で90％以
上、75℃で70％、80℃で50％の残存活性を有する（第３
図参照）。

（４）分子量：ゲル濾過法（ファルマシア製FPLS使用、
カラム：スパーロースTM12、溶出液:0.2M−NaCl含有の5
0mM酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0）にて52,000±5,
000である。

（５）紫外吸収スペクトル：リン酸緩衝液中にてμmax:
275nm、及び190nmに吸収を示す。

（６）元素分析値:C;59.4％、H;6.4％、N;15.3％。

酸素力価の測定法 本酵素の澱粉分解活性の測定は１％−可溶性澱粉液に
一定量の酵素液を加え、所定のpH及び温度にて反応さ
せ、５分後に生じた還元糖を3,5−ジニトロサリチル酸
法（DNS法）〔澱粉・関連糖質実験法、中村道徳他編、
学会出版センター発行43頁、（1986年）〕にて定量す
る。１分間にグルコース１μmole相等の還元糖を生成す
る力価を１単位とする。生澱粉の分解性の測定は、本酵
素の一定量を緩衝液に溶した液に生澱粉を濃度１％とな
る量を加え、温度30〜80℃、pH4.0〜9.0にて０〜24時間
振とう後生じた糖を上述のDNS法でグルコースの検量線
を用いて測定する。糖化度はいわゆるDE値で表わす。な
お、DE値は澱粉の分解の程度を特徴付けるものであり、
純デキストロースの還元力を100％として、分解された
澱粉の還元力を示す数値である。

生産微生物 本発明においては、前記のごとき性質を有する酵素を
生産することができるバシルス属細菌であればいずれも
使用することができ、このような細菌は、例えば土壌中
より次のようにして分離することができる。

２％小麦生澱粉を含む肉エキス−ポリペプトン寒天培
地で60℃において生育するコロニーのうち、ハローを形
成するものを分離し、液体培地に接種、一定時間の培養
後培地中の生澱粉分解活性の強い株を選択する。

この様にして分離された菌株の１つについてその菌学
的性質を詳細に調べ、バージェイズ・マニュアル・オブ
・ディタミネィティブ・バクテリオロジー第７版及び８
版の記載に基づき、本菌株はバチルス・ステアロサーモ
フィラスに属する菌株と同定し、更に、生澱粉分解性を
有する点で公知菌株のいずれとも相違することから新菌
株であると判断した。そこで、この菌株をバチルス・ス
テアロサーモフィラスＢ−１株と命名し、昭和63年６月
30日工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第10
120号として寄託し、そして平成元年５月26日に微工研
条寄第2440号としてブタペスト条約に基く国際寄託に移
管した。

バチルス・ステアロサーモフィラスＢ−１の菌学的性
質は以下の通りである。

1.顕微鏡（含電顕）所見 グラム染色：陽性 形 態：桿菌 大 き さ:0.6×1.0×２〜3.5μｍ 多 形 性：なし 運 動 性：あり 鞭 毛：なし 胞 子：あり、椿円形で１〜1.8μｍの大きさで細
胞の先端に存在する。

抗 酸 性：なし 2.培養所見 肉汁寒天平板:24時間の培養で5mmの径程の不揃いのコロ
ニー。白色で辺縁不規則。

肉汁寒天斜面：白色。流れない。

肉 汁 液体：白濁。白色沈渣 肉汁ゼラチン穿刺：ゼラチンを液化。

リトマス・ミルク：酸性・凝固 3.生理学的性質 硝酸塩の還元：＋ MRテスト：− VPテスト：− インドールの生成：− 硫化水素の生成：− デンプンの加水分解性：＋ クエン酸利用性：− 硝酸（NO₃ ^-）の利用：− アンモニア（NH₄ ⁺）の利用：＋ 色素の生成：＋。わずかに水溶性の褐色色素を生成。

カタラーゼ：＋ オキシダーゼ：± 生育の範囲（pH）:5.5〜8.0 （温度）:45℃〜75℃ 酸素に対する態度：好気性 Ｏ−Ｆテスト:O 4.糖類などの酸化とガス発生並びに資化能 糖類 酸 ガス 資格能 Ｌ−アラビノース ＋ − ＋ Ｄ−キシロース ＋ − ＋ Ｄ−グルコース ＋ − ＋ Ｄ−マンノース ＋ − ＋ Ｄ−フラクトース ＋ − ＋ Ｄ−ガラクトース ± − ± 麦芽糖 ± − ＋ ショ糖 ＋ − ＋ 乳糖 − − − トレハロース ± − ＋ Ｄ−ソルビット − − − Ｄ−マンニット ＋ − ＋ イノシット − − − グリセリン ± − ± デンプン ＋ − ＋ 5.その他の性質 生澱粉分解性：生澱粉含有寒天培地にて本菌はハローを
形成するが、バチルス・ステアロサーモフィラスIFO 12
550はハローを形成しない。

酵素の製造方法 本発明はさらに、前記のごとき性質を有する耐熱性ア
ミラーゼの製造方法に関し、この方法は、該耐熱性アミ
ラーゼを生産することができるバシルス属細菌を培地中
で培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴
とする。

前述の如き培養に於いて、培地の炭素源としては各種
澱粉、澱粉加水分解物、コーンミール、小麦粉、廃糖蜜
等を単独で又は組合わせて使用可能である。これらの使
用量はその種類により異るが0.1％〜30％が好ましい。
窒素源としては大豆粉、綿実油カス、ペプトン、カゼイ
ン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、無機アンモニ
ウム塩、無機硝酸塩等を単独で又は組み合わせて使用す
ることができる。これらの使用量は種類により異るが0.
05％〜20％が好ましい。その他リン酸塩、マグネシウム
塩、FeSO₄,KCl,CaCl₂等の無機塩類、さらに必要に応じ
て有機微量栄養源を培地に添加する事ができる。

本発明のアミラーゼの生産は通常アミラーゼ生産に用
いられる培地中で該アミラーゼ生産能を有する微生物を
45〜75℃好ましくは50〜65℃の温度、5.5〜8.0好ましく
は6.0〜7.5のpHで固体または液体培養すれば良く、１〜
３日で著量の生澱粉分解性を有する耐熱性アミラーゼが
得られる。

本発明の酵素の精製は、酵素の精製に常用されている
方法に従って行うことができる。例えば、前記のように
して得られた培養液をまず、遠心分離、濾過等の方法に
より処理して菌体を除去する。こうして得た培養濾液又
は上清液を硫分画、さらにはゲル濾過、イオン交換カラ
ム分離等により処理して精製酵素を得ることができる。

オリゴ糖の製造方法 本発明はさらに、オリゴ糖の製造方法に関する。本発
明の前記酵素を生澱粉に作用させることにより主として
マルトースとマルトトリオースとから成るオリゴ糖混合
物が生成する。これらを一緒に採取してオリゴ糖製品を
得ることもでき、これらの混合物を常法に従って分離し
て、マルトース及び／又はマルトトリオースを単独に得
ることもできる。これらの方法はいずれも本発明の範囲
に属する。

本発明において、オリゴ糖の製造方法で用いる耐熱性
アミラーゼは、単に単離又は精製された耐熱性アミラー
ゼを意味するのみならず、この様なアミラーゼを含有す
るすべての酵素源を意味する。すなわち、酵素生産菌を
培養して得られた培養液はそのまま酵素源として用いる
ことができ、有利には培養液から菌体を分離し培養濾液
又は上清液を酵素液として用いる。また、必要に応じて
硫安分画法、膜分離法、クロマト分離法等通常酵素の精
製に用いられる方法による部分精製品又は完全に精製し
た高純度酵素として用いることも可能である。

糖化は生澱粉を水に懸濁し（通常10〜50％）、加熱に
よる糊化を行なうことなく生澱粉分解活性を有する耐熱
性アミラーゼによる直接分解を行なう。この場合従来の
澱粉糖化と異なりいわゆる液化型α−アミラーゼによる
澱粉の液化は必要としない。生澱粉の糖化は室温〜70
℃、pH4.5〜9.0にて行なう。澱粉の糊化温度は、澱粉の
種類により異なりこの場合澱粉が糊化せず粒状を保つ範
囲で反応温度を高温とするのが望ましい。より好ましく
は50〜65℃、pH5〜８が望ましい。分解反応は静置して
行なうことも可能であるが、澱粉乳が均一に懸濁する程
度に攪拌して行なうのが望ましい。

澱粉1gあたりの酵素の使用料は１〜300単位が適当で
あるが、反応温度、反応時間により酵素量を加減するの
が望ましい。分解される澱粉は、地下澱粉、地上澱粉に
かかわらず用いることができる。各種澱粉の分解のしや
すさは小麦澱粉＞とうもろこし澱粉＞かんしょ澱粉＞馬
鈴薯澱粉の順である。

次に実施例を挙げて説明する。

実施例1.酵素生産のための培養 0.5％肉エキス、１％ポリペプトン、0.5％NaClおよび
可溶性澱粉１％を含みNaOHにてpH7.0に調整後滅菌処理
した培地にバチルス・ステアロサーモフィラスＢ−１株
を植菌し55℃にて24時間振とう培養を行った。菌体を遠
心分離により除去した上澄はアミラーゼ活性1.06単位/m
lを示した。

実施2.酵素の精製法 培養液を遠心分離（10,000rpm、20分間）し、菌体を
除いた上澄液に硫安を70％飽和となる様に添加し24時間
放置した。遠心分離（10,000rpm、20分間）により粗酵
素沈殿を得た。粗酵素を10mM−リン酸緩衝液（pH7.2）
に溶し、不溶物を遠心分離（15,000rpm、20分間）した
後、上澄液をセファデックスＧ−100を用いゲル濾過を
行いアミラーゼ活性を示す分画に分取した。

次いでDEAEセルロース32にアミラーゼ活性分画を吸着
させ10mM−リン酸緩衝液（pH8.5）で溶出しアミラーゼ
活性分画を採取した。再度DEAEセルロース32にアミラー
ゼ活性分画を吸着させ10mM−リン酸緩衝液（pH7.2）で
溶出しアミラーゼ活性分画を採取した。純水にて透析後
凍結乾燥し酵素標品を得た。本酵素標品はディスク電気
泳動的に単一バンドを示した。この精製の経過を第１表
に示す。

実施例3.生澱粉分解率の測定 50ml容三角フラスコに40mgの各種生澱粉を入れ、リン
酸緩衝液（pH7.2）で調製した酵素溶液4ml（5.925単
位、60℃）を加えて50℃、60℃で振とうした。毎６時間
目にサンプリングし、遠心分離（1,000rpm、５分間）し
適当に希釈後生じた還元糖をDNS法にて測定した。生じ
た還元糖量はDE値にて示した（第１図）。生澱粉分解に
より生じた還元糖の組成はHPLC法（装置：日立665A−12
LC、検出器：示差屈折計ウォータースElecxtronics Uni
t、カラム：半井Cosmosil Packedカラム4.6×150mm、溶
離後：アセトニトリル／水＝75/25）により分析した。
生じた還元糖中でマルトースが主成分で次いでマルトト
リオース、グルコース（マルトース＞マルトトリオース
＞グルコース）であった。DE値および還元糖組成を勘案
すると60℃での生澱粉分解率はほぼ100％であった。

実施例4. とうもろこし澱粉を5g秤量し、0.1M酢酸緩衝液（pH6.
0）15mlに懸濁し、耐熱性アミラーゼ50単位含有するよ
うに調製した酵素液5mlを加え55℃で12時間振とうし
た。反応液をHPLC法（装置：日立665−12LC、検出器：
示差屈折計ウォータースElectoronics Unit、カラム：
半井Cosmosil Packedカラム4.6×150mm、溶離液：アセ
トニトリル／水＝75/25）により分析した。反応に用い
た澱粉に対してグルコース2.6％、マルトース56.5％、
マルトトリオース32.8％が生成した。

実施例5. 実施例２の基質を小麦粉澱粉に変え、反応温度を60℃
とした以外はすべて実施例２に記載した方法と同一の方
法によって生澱粉の分解を行なったところ、グルコース
2.1％、マルトース51.3％、マルトトリオース39.4％を
含有するオリゴ糖液が得られた。

実施例6. とうもろこし澱粉、馬鈴薯澱粉、かんしょ澱粉、及び
小麦澱粉をそれぞれ5gずつ秤量し、耐熱性アミラーゼ10
0単位を含む0.1M酢酸緩衝液（pH6.0）を加え、60℃で24
時間振とうした。反応液中の糖をHPLCで分析したところ
各反応液の組成は第２表に示す如くであった。

〔発明の効果〕 マルトース、マルトトリオースを製造するに際して、
生澱粉分解活性を有する耐熱性アミラーゼを用い生澱粉
を直接分解する本法を採用すると、従来のβ−アミラー
ゼを用いる方法と比較し、いわゆる枝きり酵素を必要と
せず用いる、また装置的、エネルギー的に有利な澱粉糖
化プロセスを構築することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の生澱粉分解活性を有する耐熱性アミラ
ーゼによる各種生澱粉の分解タイムコースを示すグラフ
である。 第２図において、左側は該酵素の至適pHを示すグラフで
あり、そして右側は該酵素を各pHで室温（22℃）、１時
間処理した時の残存酵素活性を示すグラフである。 第３図において、左側は該酵素の至適温度を示すグラフ
であり、そして右側は温度安定性すなわち各温度で一定
時間処理した後の該酵素の残存酵素活性を示すグラフで
ある。

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の性質： 作用：生澱粉に作用して主としてマルトース及びマル
   トトリオースを生成し、60℃において生澱粉を実質的に
   100％分解する； 至適pH:6.0付近； pH安定性：緩衝液中で室温にて１時間処理したときpH
   5〜８において95％以上の残存活性を示す； 至適温度:70℃； 温度安定性:pH7.0にて70℃で15分間処理した場合実質
   的に失活せず、70℃で１時間処理した場合90％以上の残
   存活性を示す；並びに 分子量：ゲル濾過法にて測定した時52,000±5,000; を有する耐熱性アミラーゼ。
2. 【請求項２】請求項１に記載の耐熱性アミラーゼの製造
   方法であって、該アミラーゼを生産する能力を有するバ
   シルス属細菌を培地中で培養し、培養物から該アミラー
   ゼを採取することを特徴とする方法。
3. 【請求項３】前記バシルス属細菌がバシルス・ステアロ
   サーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）Ｂ−
   １株である請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】マルトース及びマルトトリオースを主成分
   とするマルトオリゴ糖を製造する方法であって、請求項
   １に記載の耐熱性アミラーゼを生澱粉に作用させること
   を特徴とする方法。
5. 【請求項５】マルトースの製造方法であって、請求項１
   に記載の耐熱性アミラーゼを生澱粉に作用させることに
   よってマルトース及びマルトトリオースを主成分とする
   マルトオリゴ糖を生成せしめ、次にマルトースを単離す
   ることを特徴とする方法。
6. 【請求項６】マルトトリオースの製造方法であって、請
   求項１に記載の耐熱性アミラーゼを生澱粉に作用させる
   ことによってマルトース及びマルトトリオースを主成分
   とするマルトオリゴ糖を作用せしめ、次にマルトトリオ
   ースを単離することを特徴とする方法。