JP2877160B2 - 粒子のサイズによる分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、接線流動ろ過を用いたサイズに従った、リ
ポソームおよび脂質粒子のような粒子の分離方法に関す
る。記載されているようにこのろ過方法は、これらの粒
子を選択されたサイズ範囲に大量に分離することを可能
にするものであり、このサイズは使用されるフィルター
の孔サイズによって決められる。中空繊維もしくはチュ
ーブ、あるいは平板なもしくはひだに折られた薄板もし
くはフィルムのような、既知の接線流動ろ過装置および
材料がいずれも用いることができる。

本発明において、「接線流動ろ過（tangential flow
filtration）」および「交叉流動ろ過（cross flow fil
tration）」という語は相互に交換して用いられ、濃縮
された固体を膜に対し連続的に流しつづけることによ
り、膜表面に対して平行もしくは接して試料を通過もし
くは循環させ、水溶液もしくは有機溶液もしくは混合溶
液から懸濁された固体を分離するものとして定義され
る。このろ過器の孔サイズは、どの粒子がろ液中に除去
されるか、どれが供給残渣中に残されるかを決定する。
例えば5.0μｍの孔サイズのフィルターを有す接線流動
ろ過装置に試料供給貯蔵物を流すと、5.0μｍより小さ
い粒子はろ液中に流出される。5.0μｍより大の粒子は
残留物中に残る。

押出しやセラミックろ過装置を包含する従来のろ過方
法（マーチンら、1988年６月21日発行、米国特許第4,75
2,425号、およびマーチンら、1988年４月12日発行、米
国特許第4,737,323号）と異なり、本発明の方法はろ過
部表面上にろ過ケーキが形成されることを妨げる。また
その液体は膜表面を横切って流されるので、圧力による
より大きな粒子の行止りの（dead end）押出が行われる
ことはない。この液体の流動速度は従ってそれが膜を通
過する際のものと同じに保たれる。

本発明は接線流動ろ過技術を使用したサイズによる粒
子の分離に関し、特にリポソームおよび脂質粒子のよう
な粒子のサイズ粒子の分離に関する。当技術分野におけ
るいずれの方法で製造されたリポソームおよび脂質粒子
も、本発明の技術によって分離することができる。

リポソームは取り込まれた水性容量を有する完全に閉
鎖された二分子膜層である。リポソームはユニラメラ小
胞体（unilamellar vesicles）（単一膜二分子層を有
す）もしくはマルチラメラ小胞体（多数の膜二分子層に
よって特徴づけられる玉葱様構造をもち、各層は水性層
によって次の層と分けられている）であることもでき
る。この二分子層は疎水性“尾部”領域と親水性“頭
部”領域を有する２つの脂質モノレイヤー（一分子層）
から成っている。膜二分子層の構造は、単分子膜の疎水
性（無極性）の脂質モノレイヤの“尾部”が二分子層の
中心に向かっており、一方親水性（極性）の“頭部”が
水性層に向かうといったものとなっている。バンガム
（Bangham）等の、初期のリポソーム製造〔ジャーナル
オブ モレキュラー バイオロジー（J.Mol.Biol.），1
2,238−252,1965〕は有機溶媒中にリン脂質を懸濁さ
せ、次いでこの溶媒を蒸発乾燥させ、反応容器上にリン
脂質の膜を残留させるものである。続いて適当量の水性
相を添加し、この混合物を“膨潤（swell）”させ、そ
して得られたマルチラメラ（multilamellar）小胞体（M
LVs）からなるリポソームを機械的手段で分散させる。
この技術が、パパハジョポウロス（Papahadjiopoulos）
らによって記載された〔バイオヒミカ エト バオオフ
ィジカ ウント アクタ（Biochim.Biophys.Acta.）13
5,624−638,1968〕音波処理された小さなユニラメラお
よび大きなユニラメラ小胞体の開発のための基礎を提供
している。

ユニラメラ少胞体は、ここに参照のために引用されて
いるクリス（Cullis）ら、PCT公開番号87/00238、1986
年１月16日、名称“ユニラメラ小胞体製造のための押し
出し手法”に記載されている方法により押出機を用いて
作ることができる。この手法によって作られた小胞体
は、LUVETSと呼ばれ、加圧下で膜フィルターを通して押
し出される。小胞体は、200nmのフィルターから押し出
す技術によって作られてもよい。このような小胞体は、
VET₂₀₀sとして知られている。

使用することのできる他の種類のリポソームに、実質
的に均一なラメラ溶質分布を有することを特徴とするも
のがある。この種のリポソーム類は、レンク（Lenk）ら
米国特許第４、522,803で定義されているように、安定
複ラメラ小胞（SPLV）、ファウンテイン（Fountain）
ら、米国特許第４、588,579号に記載されているような
単相性小胞体及び上記のような凍結融解した多重ラメラ
小胞（FATMLV）、と呼ばれるものである。ここで、凍結
融解した多重ラメラ小胞体は少なくとも１回の凍結融解
サイクルにさらされるものであり；この方法はバリー
（Bally）らのPCT公開87/00043号、1987年１月15日、名
称“改善された取り込み効率を有するマルチラメラリポ
ソーム”に記載されている。

小胞体を製造するために使用される他の技術として
は、パパハジョポウロス（Papahadjiopoulos）らの1980
年11月25日発行の米国特許第4,235,871号の逆相蒸発小
胞体（REVs）をつくるものがある。

各種ステロール及びそれらの水溶性誘導体を、リポソ
ーム形成のために用いることができる。特に、ジャノフ
（Janoff）ら、PCT公開番号85/04578号、1985年10月24
日公開、名称“ステロイド性リポソーム”参照。メイヒ
ュー（Mayhew）ら、PCT公開番号WO85/00968、1985年３
月14日公開には、アルファートコフェロールある種のそ
の誘導体を含むリポソームで薬剤をカプセル化すること
によって、薬の毒性を低減させる方法が記載されてい
る。また、各種トコフェロール及びそれらの水溶性誘導
体が、リポソーム形成に用いられている。ジャノフ（Ja
noff）ら、PCT公開番号87/02219、1987年４月23日公
開、名称“アルファトコフェロールをベースにした小胞
体”参照。

リポソーム−薬搬送系において、薬のような生物活性
剤をリポソーム中に取り込み或いはリポソームと会合さ
せ、次いで治療すべき患者に投与する。例えば、ラーマ
ン（Rahman）ら、米国特許第3,993,754号；シアーズ（S
ears），米国特許第4,145,410号；パパハジョポラス（P
aphadjopoulos）ら、米国特許第4,235,871号；シュナイ
ダー（Suhneider），米国特許第4,114,179号；レンク
（Lenk）ら、米国特許第4,522,803号；及びファウンテ
イン（Fountain）ら、米国特許第4,588,578号参照。

本発明においては、共有された共係属出願、ジャノフ
らの米国特許出願第022,027号、1987年３月５日出願；
第069,908号、1987年７月６日出願；および第164,580
号、1988年３月７日出願、発明の名称“低毒性薬−脂質
系”、これらを参考にされたい、これらに記載されてい
る脂質粒子も又分離することができる。このように脂質
粒子は高薬−脂質複合体（HDLCs）としても知られてい
るが、リポソーム製造のための技術と実質的に同じ技術
によってつくられ、遊離の形で投与された薬よりも低い
毒性を有するものである。このような複合体は１もしく
はそれ以上の脂質と共に比較的高いモル比で薬を含有す
るものである。更に、共係属の米国特許出願第749,161
号、1985年６月26日、バリー（Bally）ら、発明の名称
「リポソーム中への抗新生腫瘍剤の取り込み」；および
共係属出願第164,557号、1988年３月７日出願、メイヤ
ー（Mayer）ら、発明の名称「リポソーム性抗新生腫瘍
化剤の高薬−脂質製剤」、この両者はここに参考のため
に引用しているが、これらの方法に従った膜透過性pH勾
配（transmembrane pH gradient）を用いてつくられた
リポソームが、接線流動ろ過の技術によりサイズで分離
することもできる。更に特定すれば、上記のバリー（Ba
lly）らの発明にしたがって、リポソームにイオン化し
得る生物活性剤を装薬し、ここではリポソームの二分子
膜層（bilayer）を貫通して膜透過性pH勾配が形成され
ているが、この剤はこの勾配によって装薬される。この
イオン勾配は、リポソーム膜を貫通して１もしくはそれ
以上の荷電された種（例えばＨ＋イオン）に対し濃度勾
配を作り出すことによってつくられる。このような勾配
は続いて、例えばドキソルビシン、ヴィンクリスチン、
エピルビシン、もしくはダウノルビシンのような抗新生
腫瘍剤といったイオン化し得る生物活性剤をリポソーム
中に累積することを促進する。

より特定的に、濃度勾配を形成するためにリポソーム
は第１の水性媒体の存在下で調製され、この媒体はリポ
ソームに取り込まれるものであり、またリポソームを囲
むものでもある。これらのリポソームの外部媒体は続い
て、周囲媒体を交換することなどによって、より酸性も
しくは塩基性のpHに調整される。このような方法が膜透
過性濃度勾配を形成する、第２の外部媒体がイオン化し
得る抗腫瘍剤のようなイオン化し得る生物活性剤を含有
するならば、Ｈ＋勾配は該薬を、遊離小胞体−結合生物
活性剤比が〔Ｈ＋〕内／〔Ｈ＋〕外比を反映するような
形で、リポソーム中に区画分割するであろう。上で挙げ
たメイヤー（Mayer）らに記載されているように、ドキ
ソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、およびビ
ィンクリスチンのような抗新生腫瘍剤はこの方法、これ
は「遠隔装薬」法としても引用されるが、それにより高
薬剤：脂質比でリポソーム中に堆積されることができ
る。このようなリポソームが接線流動ろ装置を貫通して
通されそのサイズに応じて分離される。

ここまで述べてきたようにリポソームもしくは脂質粒
子を分離する方法に使用されるとき、接線流動ろ過は公
知のいずれの方法によってつくられたリポソームもしく
は脂質の粒子にも使用することができる。上で挙げた方
法に加えて、剪断もしくは音波処理のような追加のもし
くは択一的な方法によって、リポソームもしくは脂質粒
子の両者を形成することができる。本発明の１つの態様
では、それらはホモジナイズ化、コロイドミルもしくは
サイズ減少化押出し工程装置を採用するホモジナイズ技
術によって形成される。これらの装置のいずれが採用さ
れる場合にも、このホモジナイズ化装置を接線流動ろ過
装置に直接に（連続して）連結させることができる。さ
もなければ、このホモジナイズ化工程はろ過装置とは独
立して行うことができる。

物質の大ざっぱな分離のための接線流動もしくは交叉
流動ろ過の使用は知られている。マリナッチオ（Marina
ccio）ら（WO/85/03011、1985年７月18日公開）は血漿
搬出法（プラズマフェレーゼ）のための血液成分のよう
な生物学的液体の分離に使用する方法を開示している。
この方法においては、血液は有機高分子細孔ろ過膜に接
して（すなわち貫通して）通過させられ、微粒子物質は
除去される。他の使用においては、接線流動ろ過はビー
ルのろ過用に開示されており〔シャックルトン（Shackl
eton）、ヨーロッパ特許第0,208,450号、1987年１月14
日公開）、これは特に酵母細菌および他の懸濁固体のよ
うな微粒子物の除去のために使用されている。コーズ
（Kothe）ら（米国特許第4,644,056号、1987年２月17日
発行）も乳もしくは初乳からのイムノグロブリンの精製
におけるこの方法の使用を開示しており、そしてカスチ
ーノ（米国特許第4,420,398号、1983年12月13日発行）
はインターフェロンのような抗ウィルス性物質のウィル
ス粒子および細胞と同様に該物質を含有する汁からの分
離にそれを使用することを記載している。

接線流動ろ過装置は培養媒体中に懸濁している細胞の
濃縮に使用されている。用いられる膜のサイズは工程お
よび細胞分離の効率および速度に照らして選択される。
ラドレット（Radlett）〔1972,ジャーナル オブ アプ
ライド ケミカル バイオテクノロジー（J.Appl.Chem.
Biotechnol.）,22:495〕は、遠心分離および通常のろ過
のようなより普通に用いられている細胞分離法に代わる
ものとして接線流動ろ過を用いている。

同様にこの技術は細胞破片から細菌酵素の分離に用い
られてきている〔クアーク（Quirk）ら,1984,エンザイ
ム マイクロバイアル テクノロジー（Enzyme Microb.
Technol.）,6（５）:201〕。この技術を用いてクアーク
（Quirk）らは酵素を遠心分離という従来法を用いた場
合より高い収率でまたより少ない時間で単離することが
できた。薬学の分野での、注射のための滅菌水のろ過、
溶媒系の浄化、および汁および細菌培養液からの酵素の
ろ過を含む、いくつかの応用に対する接線流動ろ過の使
用がジェノヴェシ（Genovesi）により検討されている
〔1983,ジャーナル オブ ペアレンテラル アシ テ
クノロジー（J.Parennter.Aci.Technol.）37（３）:8
1〕。

集団における粒子サイズの制御は難しく、一般的には
成功していない。サイズに応じてリポソームもしくは脂
質粒子の分離において接線流動を過を使用する本発明は
商業的に重要な方法である。選択されたサイズのフィル
ターの使用、そして更に、異なったサイズの複数のフィ
ルターの連続的使用もしくは連続的取り付け（すなわち
ろ過系）が、特に希望されるサイズ範囲の粒子を得るた
めに粒子の分離のために開示されている。

サイズに応じてリポソームを選択するこれまでの試み
はいくつかの問題がある。例えば、フーアン（Huang）
〔1969、バイオケミストリー（Biochemistory）、8:34
4〕は超音波処理、遠心分離、0.1umの袋小路の（dead−
end）フィルターを通しての集団のろ過を包含し、最終
的にこのろ過物をセファロース4Bカラム上分子篩クロマ
トグラフィーにかけて大きいリポソームを除去するとい
う、小さなユニラメラ小胞体（SUV）を製造するための
多段階技術を記載している。バレンホルツ（Barenhol
z）ら〔1977、バイオケミストリー（Biochemistory）、
16:2806〕は超音波処理、遠心分離技術を用いて大きな
リポソームを除去する技術を発展させて、その後に続け
て１−４時間高速遠心分離を行った。ワット（Watt）ら
〔1978、バイオケミストリー（Biochemistory）、17:19
72〕は超音波処理に続く105,000×ｇでの遠心分離によ
りジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）の均一
なSUV集団を製造した。

SUVの均一な集団を得ようとする努力に加えて、より
大きなリポソーム、即ちMLVの均一な集団を得るための
非常に多くの試みがなされてきた。これらの努力の殆ど
が押出し工程において一連の膜フィルターを使用するこ
とを包含するものである。このように押出し技術は、種
々の孔サイズを有するフィルターを通してのMLVの連続
的押出しを包含する〔Olsonら、1979、バイオヒミカ
バイオフィジカ ウント アクタ（Biochimc.Biophys.A
cta.）,557:9;およびシャレリー（Schullery）ら、197
3,ケミカル アンド フィジカル リピッズ（Chem.Phy
s.Lipids）,12:75〕。このような工程ではMLVとSUVの混
合集合体を形成する。これらのリポソームはサイズに関
して均質で単一形態の分布は有せず、実際に多数の多き
かったり小さかったりするリポソームが混在している。
単一形態分布は粒子サイズのガウスの分布のカイ二乗値
が2.0より小さいが2.0であるようなものである。更に加
えてこれらの技術はリポソーム形成技術であり、異質の
サイズ集団から特定のサイズ範囲のリポソームを選択す
るという本発明に対立している。

マーチン（Martin）ら〔米国特許第4,752,425号、198
8年６月21日発行〕は溶媒および剤を含有する脂質の水
溶液中への注入を採用した高カプセル封入効率のリポソ
ーム形成法を開示した。この方法は更に得られたリポソ
ームをセラミックフィルターを通すという押出し法を包
含している。この注入工程の間、この懸濁液は完全にろ
過されて0.1umおよびそれ以下のリポソームろ過物を形
成する。

特定のより高いおよびより低いサイズ範囲を有するリ
ポソームの均質集団を得る技術には問題点が残ってい
る。本発明は、異質のサイズ集団から均質の特定のサイ
ズ分布のリポソームの選択を可能にすることによってこ
の問題を解決している。選択されたサイズのフィルター
の使用が特定のサイズ粒子の分離のために開示されてい
る。粒子の均質な分布というのは、本質的にあるサイズ
より大きい粒子はないし、またあるサイズより小さい粒
子はない、公知のよく特定されたサイズ分布を有する粒
子の集団である。本発明で使用される言葉として、「本
質的に」という言葉は約10％より多くない粒子、好まし
くは５％より多くない粒子が、接線流動フィルターサイ
ズによって決められる特定のサイズより大きかったり小
さかったりするものと理解されるべきである。この分野
において、このような分布は例えば3,4,5,10もしくは10
0ミクロンの本質的に最大のものと、本質的に最小の粒
子サイズの間の相違が一般的には知られておらず、本発
明において決まった操作により得られるものである。あ
る場合には、得られたリポソームもしくは脂質粒子の均
質分布は単一形態である。

粒子サイズの均一性が得られる度合いは試料の物理的
および科学的特性およびろ過条件によって影響を受け
る。例えば試料もしくは懸濁溶液の粘度および組成（電
荷）、およびフィルターの孔サイズおよび構成（厚さ；
フィルター上の非対称性の皮の存在；電荷、それは試料
のフィルターへの結合もしくは反発に影響をあたえる；
等）もまた、ろ過工程の効率および最終生成物の均質性
を決定する。

リポソームもしくは脂質粒子のサイズを揃える応用に
おいては、このようなフィルターは均質化もしくは粉砕
装置の下流に（連結して）付けることができ；このよう
な装置は試料をフィルターもしくはろ過系（２台のフィ
ルター、より上およびより下のサイズを切り捨てて粒子
の特定化を可能にする）に取り出す。さもなければ、こ
の均質化装置は独立して使用することができ、そして得
られた均質化物質はろ過装置に手動でもしくは別個の工
程で適用される。どちらの場合も得られたろ過物（もし
くは残留物、必要とされる生成物に依るが）が最終生成
物として回収される。その大きなサイズの故にそのフィ
ルターを通過しなかった物質（残留物）は次いで捨てる
ことができるし、さもなければ再サイズ調整のために均
質化もしくは粉砕装置へ、ついでろ過装置へと再循環さ
れ得る。各々を完全に循環させることによりろ液の総収
率は一般に増加する。

また一方、２もしくはそれ以上の接線流動ろ過装置は
均質化もしくは粉砕装置に平行に結合することができ
る。このような場合、ろ過装置は異なったサイズのフィ
ルターをいくつか有することができ、それによって同一
の供給試料を異なったサイズの生成物へと分離ができ
る。この場合、試料がリポソーム、脂質粒子もしくはサ
イズ調整のための他の物質であるならば、残留物は均質
化もしくは粉砕装置へと循環して戻して更にサイズ調整
を受けさせることができる。

より上とより下のサイズ限界を有する別々のサイズの
粒子が必要とされる場合、均質化もしくは粉砕装置は、
連続して設けられている少なくとも２つのろ過装置に連
結することができる。この２台のろ過装置の１つは希望
されるより上の粒子サイズ限界のフィルター孔サイズを
有し、２つ目のものはより下の粒子サイズ限界のフィル
ター孔サイズを有するものである。試料が第１のフィル
ターを通過するとき、該孔サイズの限界より下の粒子は
ろ液中に通過して入ってくる。残留物は続いて、更にサ
イズ調整を行うために均質化もしくは粉砕装置を通して
再循環して戻すことができる。ろ液は次いでより低い限
界の孔サイズを有する次のフィルターを通じて循環され
る。このサイズより小さい粒子はろ液中に通過し、この
ろ液は捨てることができる。このようにしてその残留物
はより上とより下の特定されたサイズ限界の間の全ての
粒子を含有することになる。

この技術は少量のバッチの試料供給の分離に有用であ
るけれども、このものはリポソームもしくは脂質粒子の
大量のサイズ分離に特に有用であり、この様な分離は大
量の物質について脂質のろ過に通常付随する問題なしに
容易に達成することができる。このような問題はリポソ
ームもしくは脂質粒子が従来の「行き止まりの」ろ過工
程に付されるときに生ずるものであり、いくらかのリポ
ソームもしくは粒子はそれらのフィルターを通過させる
のに必要な圧力によって変形させられる可能性がある。
これらの粒子が変形させられる時、それらは実際の粒子
サイズよりも小さい孔サイズを通して通過することがで
き、そのフィルターの下流側部上で再構成される。すな
わち、このろ液は希望される範囲外のサイズの粒子で汚
染される恐れがある。生成物の分離の為の通常のろ過の
使用における第２の問題は、該フィルター表面上への生
成物の堆積および膜孔の場合によって起こり得る目詰ま
りである。フィルター表面に接している物質の一掃、こ
れが本発明の技術であるが、この堆積を阻止するのであ
る。更に、本発明の記載中に示唆されている脂質への応
用では接線流動法で採用される圧力より低い圧力（3.5K
g/cm²（50Psi）より低いものが典型的である）はリポソ
ームもしくは脂質粒子に物理的損傷（すなわち剪断）を
起こし難いものである。行き止まりのろ過に対する本発
明の他の利点は試料の連続的循環および残留物からの不
純物を洗い流す能力である。この試料はまた試料から懸
濁溶液を除去することによって濃縮することができ、そ
れによって望ましい効力を有す生成物となる。

本発明の他の特徴においては、この接線流動ろ過装置
はリポソームもしくは脂質粒子を形成するために用いる
ことができる。このような工程においては、脂質のよう
な両親媒性物質および水溶液中に懸濁された生物活性剤
は接線流動フィルターの膜表面を横切って互いに接触さ
せられることになる。ポンプによって与えられる制御さ
れた圧力および膜表面で出会う剪断力は脂質および水性
成分の相互作用を起こさしめ、１つの層を他の層へ流入
せしめるように制御できる。この２相混合の制御は、フ
ィルターの孔サイズおよびポンプ圧で決められる、望ま
れる特定サイズ範囲のリポソームの製造を可能にする。
更に特定すれば、脂質懸濁液を含有する溶液は接線流動
フィルターの第１の側面に接触させられ、一方、薬剤の
ような生物活性剤を含有することができる水性溶液はこ
のフィルターの第２の側面の周囲の領域に流入もしくは
注入される。ポンプを介してフィルターの水性側に与え
られる圧力は水性溶液をフィルターを横切って通過せし
め孔を通って脂質含有側へと通過せしめる。このフィル
ターの脂質側でリポソームが生成される。

特に、有機溶媒中に懸濁された脂質、例えば約100−1
000mg/mlでの卵ホスファチジルコリンのエタノール溶液
を、例えば中空繊維接線流動フィルターの超毛細管空間
中に通過させ；および例えば緩衝液もしくはサッカライ
ド溶液のような水性溶液をフィルターの内腔を通過させ
る。適用されたポンプ圧に応じて、この水性溶液は接線
流動フィルターの孔を通って通過し、超毛細管側上で脂
質溶液中にリポソームを形成する。このような系は連続
的流動系であり、これは大容量のリポソームの形成を可
能にする。また別の方法では、動的回転流動ろ過（dyna
mic rotary flow filtration）がリポソーム形成のため
の同様の技術において採用し得る。このようなろ過工程
はベンチマーク ロータリー フィルトレーション装置
（The Beuchmark Rotary Filtration unit）〔メンブレ
ックス インコーポレーション、ガーフィールド、ニュ
ージャージー州〕。この方法においては、脂質懸濁液は
フィルターの内腔を通って通過させられ、水性溶液は超
毛細管空間を通って通過させられる。この平な円筒フィ
ルターは回転軸に取り付けられ、回転されると渦を形成
し、この渦が該水溶液をフィルターを通じて内腔中に通
過せしめる。フィルター表面と内腔の間の相互表面にお
いて、該水溶液は内腔中を循環している脂質と共にリポ
ソームを形成る。このリポソーム形成物は続いて内腔か
ら除去される。

接線流動ろ過をまた採用する本発明のもう１つの特徴
は、溶媒から、あるいは製剤中の遊離の（取り込まれて
いない、もしくは会合していない）剤からリポソームも
しくは脂質粒子の分離である。このようなリポソーム外
もしくは脂質粒子外物質はその能力により、例えば膜孔
を通過することによって除去され、一方リポソームもし
くは粒子が残留物中に循環して残留している。望まれる
リポソームもしくは粒子サイズよりも小さなフィルター
サイズを使用することにより、フィルター孔からのこれ
らのより小さな溶媒もしくは遊離の剤分子の通過が生
じ、一方目的生成物を残存させる。上記の使用により、
徹底的な回転蒸発あるいは溶媒除去のための関連技術の
必要性を最小限にするかあるいは排除することができ
る。これは又、最終製剤から遊離薬剤のような遊離の微
粒子物のクロマトグラフによる分離の必要を排除するも
のである。これらの両方法は本発明のサイズ分離機能と
共に同時に行われる。一方または、リポソームもしくは
粒子の集団はサイズ分離（ろ過）工程に先立って溶媒−
もしくは遊離の薬−除去工程にさらすことができる。し
かしながら全ての工程は希望される機能に特定の好適な
フィルターサイズを選択することによって、同一の装置
で行うことができる。選ばれるフィルターサイズは除去
されるべき分子もしくは粒子のサイズに依っている。

接線流動ろ過装置のためのもう１つの使用が、マイク
ロカプセル、懸濁液、乳化液および異なった細胞の混合
物のような他の小さな粒子系のサイズに応じた分離およ
びクラス分けにおいて更に行われる。

本発明の更に追加される利点は、分離を無菌的に行う
ことができるというものである。規定されたサイズ分布
のリポソームもしくは脂質粒子を無菌的に調整すること
は進行中の問題である。

発明の要旨 この発明は、液体中に懸濁された粒子の混合物からサ
イズに応じて粒子を分離する方法に関し、この混合物を
第１の孔サイズの第１のフィルターを有す接線流動ろ過
に付し、そして次いでこのろ液を第２のより小さな孔サ
イズの第２のフィルターを有す接線流動ろ過に付すこと
を包含する。この工程はリポソームもしくは脂質粒子を
含有する粒子で行うことができる。これらのリポソーム
もしくは脂質粒子は更に、アンホテシリンＢのようなポ
リエン抗真菌剤のような生物活性剤を含有することがで
きる。この場合、リポソームもしくは脂質粒子の脂質に
対するアンホテリシンＢのモル比は約１モル％から約60
モル％、より好ましくは約16ないし約50モル％、最も好
ましくは約33モル％である。

接線流動ろ過工程は約10および約0.2μｍの間、好ま
しくは約５μｍの第１の孔サイズの第１のフィルターを
使用し、このものは規定された限界を越える粒子を排除
し、そして分子量約2,000で約２ミクロン、好ましくは
約1.0μｍの第２の孔サイズの第２のフィルターを使用
する。

粒子が脂質粒子である場合、それらは好ましくは、約
7:3のモル比のジミリストイルホスファチジルコリンお
よびジミリストイルホスファチジル−グリセロールと約
33モル％のアンホテリシンＢを含有する。

また一方、この生物活性剤はゲンタマイシンのような
アミノグリコシドを含有することができ、そしてこの粒
子はSPLVのようなリポソームであることができる。これ
らSPLVはホスファチジルコリンを含有することができ
る。これらリポソームは約５μｍの第１の孔サイズおよ
び約１μｍの第２の孔サイズを通すろ過によりサイズ選
択されることができる。この粒子はコロイドミルのよう
な均質化により粉砕してそのサイズを減少させることが
できる。得られた粒子は均質なサイズ分布を有すことが
でき、そしてマルチラメラもしくはユニラメラであるこ
とができる。

本発明のもう１つの態様においては、この接線流動ろ
過法は液体中に懸濁しているリポソームもしくは脂質粒
子を含有する混合物からリポソーム外もしくは脂質粒子
外物質を除去するために使用することができる。このよ
うな場合、この超リポソーム性もしくは超脂質粒子物質
はDMSOのような有機溶媒中に在る可能性がある。また一
方、この方法は取り込まれていない、或いは会合されて
いない生物活性剤を除去するために使用することができ
る。

本発明の又別の態様においては、この接線流動ろ過法
はリポソームもしくは脂質粒子を製造するために使用す
ることができ、その際、脂質を含有する溶液は接線流動
を過装置におけるフィルターの第１側部に接触させら
れ、一方、水溶液はこの接線流動ろ過装置のフィルター
の第２側部に流入もしくは注入される。この方法は、動
的回転フィルターもしくは中空繊維フィルターを用いて
行なうことができる。

すなわち本発明は、 1.以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含有する液体中に
懸濁された粒子を含有する混合物からサイズに従って粒
子を分離する方法：（ａ）その混合物を第１の孔サイズ
を有する第１フィルターを用いて接線流動ろ過せしめる
工程；および、 （ｂ）そのろ液をより小さい孔サイズを有する第２フィ
ルターを用いて接線流動ろ過せしめる工程、 2.その粒子がリポソームまたは脂質粒子を含有する上記
１記載の方法、 3.そのリポソームもしくは脂質粒子が更に生物活性剤を
含有する上記２記載の方法、 4.その生物活性剤がポリエン抗真菌剤を含有する上記３
記載の方法、 5.そのポリエン抗真菌剤がアンホテリシンＢを含有する
上記４記載の方法、 6.そのリポソームもしくは脂質粒子の脂質に対するアン
ホテリシンＢのモル比が約１モル％から約60モル％であ
る上記５記載の方法、 7.そのアンホテリシンＢのモル比が約16から約50モル％
である上記６記載の方法、 8.そのアンホテリシンＢのモル比が約33モル％である上
記７記載の方法、 9.その第１の孔サイズが約10と約0.2μｍの間である上
記８記載の方法、 10.その第１の孔サイズが約５μｍである上記８記載の
方法、 11.その第２の孔サイズが約2000分子量と約２ミクロン
の間にある上記８記載の方法、 12.その第２の孔サイズが約1.0μｍである上記11記載の
方法、 13.その粒子が7:3のモル比のジミリストイルホスファチ
ジルコリンおよびジミリストイルホスファチジルグリセ
ロール、および33モル％アンホテリシンＢを含有する上
記12記載の方法、 14.その生物活性剤がアミノグリコシドを含有する上記1
3記載の方法、 15.そのアミノグリコシド剤がゲンタマイシンである上
記14記載の方法、 16.そのリポソームがSPLVである上記15記載の方法、 17.そのリポソームがホスファチジルコリンを含有する
上記16記載の方法、 18.その粒子がリポソームを含有し、その生物活性剤が
アミノグリコシドを含有し、その際第１の孔サイズが約
５μｍおよび第２の孔サイズが約１μｍである上記３記
載の方法、 19.そのアミノグリコシドがゲンタマイシンを含有する
上記18記載の方法、 20.それらのサイズを減少させるため、その粒子を粉砕
する工程を含有する上記18記載の方法、 21.それらのサイズを減少させるため、その粒子を粉砕
する工程を含有する上記１記載の方法、 22.上記１記載の方法によって調製された均一のサイズ
の分布を有するリポソームもしくは脂質粒子の母集団、 23.そのリポソームがマルチラメラである上記22記載の
母集団、 24.そのリポソームがユニラメラである上記22記載の母
集団、 25.上記１記載の方法によって得られた均一のサイズ分
布を有するリポソームもしくは脂質粒子の母集団、 26.その脂質粒子が脂質および生物活性剤を含有する上
記22記載の母集団、 27.その脂質粒子がHDLCである上記26記載の母集団、 28.その脂質がモル比約7:3でジミリストイルホスファチ
ジルコリンおよびジミリストイルホスファチジルグリセ
ロールを含有する上記27記載の母集団、 29.その生物活性剤がポリエン抗真菌剤を含有する上記2
7記載の母集団、 30.そのポリエン抗真菌剤がアンホテリシンＢを含有す
る上記29記載の母集団、 31.そのアンホテリシンＢのモル比が約５−50モル％で
ある上記30記載の母集団、 32.その粒子のサイズが約0.2μｍと約10μｍとの間であ
る上記31記載の脂質粒子の母集団、 33.その粒子のサイズが約１から５μｍである上記22記
載の脂質粒子の母集団、 34.μｍそのアンホテリシンＢのモル比が約16−50モル
％である上記31記載の脂質粒子の母集団、 35.そのアンホテリシンＢのモル比が約33モル％である
上記34記載の母集団、 36.そのリポソームが脂質および生物活性剤を含有する
上記25記載の母集団、 37.その生物活性剤がアミノグリコシドである上記36記
載の母集団、 38.そのアミノグリコシドがゲンタマイシンである上記3
7記載の母集団、 39.そのリポソームのサイズが約0.2μｍと約10μｍとの
間である上記38記載の母集団、 40.そのリポソームがSPLVである上記39記載の母集団、 41.その脂質がホスファチジルコリンを含有する上記40
記載の母集団、 42.その生物活性剤が抗新生腫瘍剤である上記36記載の
母集団、 43.その抗新生腫瘍剤がドキソルビシン、ダウノルビシ
ン、エピルビシンもしくはビンクリスチンである上記42
記載の母集団、 44.そのリポソームのサイズが約5.0μｍと約1.2μｍと
の間である上記43記載の母集団、 45.混合物を接線流動ろ過せしめる工程を含有する液体
中に懸濁されたリポソームもしくは脂質粒子を含有する
混合物からリポソーム外もしくは脂質外粒子を除去する
方法、 46.そのリポソーム外もしくは脂質外粒子物質が有機溶
媒である上記45記載の方法、 47.その有機溶媒がDMSOを含有する上記46記載の方法、 48.そのリポソーム外又は脂質外粒子物質が取り込まれ
ていないかもしくは結合されていない生物活性剤である
上記45記載の方法、 49.以下の（ａ），（ｂ）工程を含有する限定された切
り捨て（cut off）以下のサイズの粒子の製造方法： （ａ）その粒子を均一にする工程および （ｂ）限定された切り捨て以上の粒子を除外する孔サイ
ズの第１のフィルターでその粒子を接線流動ろ過せしめ
る工程、 50.その均一化が粉砕することにより行われる上記49記
載の方法、 51.その粒子がリポソームもしくは脂質粒子を含有する
上記49記載の方法、 52.そのリポソームもしくは脂質粒子が生物活性剤を付
加的に含有する上記51記載の方法、 53.その生物活性剤がポリエン抗真菌剤を含有する上記5
2記載の方法、 54.ポリエン抗真菌剤がアンホテリシンＢを含有する上
記53記載の方法、 55.リポソームもしくは脂質粒子の脂質に対するアンホ
テリシンＢのモル比が約１モル％から約60モル％である
上記54記載の方法、 56.アンホテリシンＢのモル比が約16から約50モル％で
ある上記55記載の方法、 57.アンホテリシンＢのモル比が約33モル％である上記5
6記載の方法、 58.そのフィルター孔サイズが約10と約0.2μｍとの間で
ある上記57記載の方法、 59.そのフィルター孔サイズが約５μｍである上記58記
載の方法、 60.その粒子が約7:3のモル％のジミリストイルホスファ
チジルコリンおよびジミリストイルホスファチジルグリ
セロール、および約33モル％のアンホテリシンＢを含有
する上記59記載の方法、 61.その生物活性剤がアミノグリコシドを含有する上記5
2記載の方法、 62.そのアミノグリコシドがゲンタマイシンである上記6
1記載の方法、 63.そのリポソームがSPLVである上記62記載の方法、 64.そのリポソームがリン脂質を含有する上記63記載の
方法、 65.そのリン脂質がホスファチジルコリンを含有する上
記64記載の方法、 66.次の付加的工程を含有する上記49記載の方法： （ｃ）工程（ｂ）のろ液をより小さい孔サイズの第２の
フィルターで接線流動ろ過を行う工程、 67.上記66の記載に従って調整された均一のサイズ分布
を有するリポソームもしくは脂質粒子の母集団、 68.そのリポソームがマルチワメラである上記66記載の
母集団、 69.そのリポソームがユニラメラである上記66記載の母
集団、 70.その粒子がゲンタマイシンおよびホスファチジルコ
リンを含有するリポソームを含有し、その際第１の孔サ
イズ約５μｍおよび第２の孔サイズが約１μｍである上
記66記載の方法、 71.接線流動ろ過装置中のフィルターの第１の側部に脂
質含有液を接触させる一方、その接線流動ろ過装置中の
フィルターの第２の側部に水溶液を注入もしくは注射す
る工程を含有するリポソームもしくは脂質粒子を製造す
る方法、 72.用いられる接線流動ろ過系統が動的回転ろ過もしく
は中空繊維ろ過である上記71記載の方法、 に関するものである。

発明の詳細な説明 粒子の分離、特にリポソームおよび脂質粒子の接線流
動ろ過技術を用いての分離が記載されている。更に特定
すれば、この分離はリポソームおよび脂質粒子のサイズ
による分離という結果になる。このリポソームもしくは
脂質粒子は、生物活性剤、即ち生物学的活性を有する
剤、例えば薬、ホルモン、蛋白質、染料、ビタミンもし
くは造形剤を取り込むか、あるいは会合することができ
る。

例えば、ここに参考のため引用されている1988年３月
７日に出願された係属中の米国特許出願に記載されてい
る高薬：脂質複合体（HDLC_S）のような脂質粒子、この
ものはアンホテリシンＢを含有しており、この粒子は約
１ミクロンから約５ミクロン（um）のサイズ範囲にある
が、このものを得るために、初めの約0.1から約50μｍ
の材料の粒子サイズ範囲を有する不均質なサイズの試料
を約5.0μｍの孔サイズのフィルターを用いて接線的に
ろ過する。このろ液は約5.0μｍよりも小さい粒子を含
有しており、残留物は約5.0μｍよりも大なる粒子を含
有している。このろ液を次いで、約1.2μｍの孔サイズ
のようなより小さな孔サイズを使用してろ過する。この
第２のフィルターの孔サイズは決して限定されないが、
有効な範囲で小さいものであることができ、例えば分子
量約2,000である。本発明では約1.2μｍおよび約0.2μ
ｍのフィルターが好ましい。約5.0μｍのフィルターに
続いて約1.2μｍのフィルターが用いられるとき、ろ液
は微粒子（fine）のような約1.2μｍより小さな全粒子
を含有し、そして残留物は必要とされる約1.2から約5.0
μｍのサイズ範囲の最終生成物である。もしより大きな
サイズが必要あるいは受用し得るならば、例えば約10μ
ｍのフィルターを、より上のサイズの限界値を得るため
に使用することができる。

本発明の接線流動ろ過装置で使用されるフィルターは
広い範囲の有機高分子フィルターから選ぶことができ
る。このようなフィルターとしては、ナイロン、ポリビ
ニリデンフルオライド（PVDF）、セルロースアセテート
／ナイトレート、ポリスルホン、ポリプロピレンおよび
ポリアミドの細孔膜が挙げられるが、これらに限定され
ることはない。セラミックフィルターおよび金属フィル
ターのような他のフィルターを使用することもできる。

荷電された表面を有する膜、例えばカルボキシルもし
くはスルホンアニオン性機能置換基を有するもの、もし
くはナイロン荷電膜もまた使用できる。このような荷電
された膜は製剤が荷電された脂質を含有するとき効率よ
く用いることができる。非対称構造を有する膜、例えば
逆透析、透析および超ろ過工程で用いられるようなもの
もまた使用できる。上で述べた構成の内、好ましい膜
は、膜を横切って対称構造を有する細孔タイプのもので
ある。このような膜を含有する好適なフィルター組立部
品としては、例えば中空管もしくは中空繊維を有するカ
ートリッジ、または板状フレーム上に設けられた巻きフ
ラットもしくは折りたたまれたシートのようなものがあ
るが、これらに限定されることはない。振とう細胞装置
もまた接戦流動ろ過装置として使用することができる
（アミンコーポレーション、デンバース、マサチューセ
ッツ市販されている）。このような系においては、振動
する櫂が膜表面に対し接線的な動きの中で供給試料を循
環させる。

ここに記載されているように適用のために、最も適し
ている膜は溶媒に対し抵抗性があり、そして、衛生的に
するもしくは滅菌化に服し易いものである：後者の場
合、圧力消毒、蒸気噴射（steam flushing）、潅注もし
くはエチレンオキシド露出などによっている。それら
は、試料から水性溶媒もしくは有機溶媒の除去をさせる
ために十分に親水性もしくは疎水性であるべきである。
上で名を挙げられたフィルムは、それらが行うべき特定
の機能（いくつかを挙げれば、溶媒除去、遊離の薬の除
去および／またはサイズによる分離等）に応じて選択さ
れるであろう。例えばポリプロピレンおよびセラミック
膜は有機溶媒に十分耐性であり、一方、ポリスルホンや
セルロースアセテート／ナイトレート膜は一般に耐性で
はない、上で述べた膜はいずれも水性溶媒の除去あるい
はリポソームもしくは脂質粒子のサイズ分離のために使
用することができる。このような膜の使用は目的とする
生成物の直径および適当な孔サイズの利用によってのみ
限定される。

ポリプロピレンおよびナイロン（疎水性）膜が使用さ
れるとき、この膜が使用前にエタノールのような水混合
可能有機溶媒でぬらされているときに最もよい効果が得
られる。このぬらす工程は膜を通してこの溶媒を再循環
することにより数分間で行われる。この溶媒は次いで脱
イオン水もしくは0.9％生理食塩水のような水性溶液で
膜を洗い流すことにより除去される。

このろ過はいずれの温度でも行うことができ、使用さ
れる脂質もしくは薬の温度制限により決定されるべきで
ある。例えば、この方法は約４℃から約25℃の寒い中で
行うことができる。試料はポンプにより提供される力に
よってろ過装置を循環させられる。使用できるポンプは
次のようなタイプを包含する：積極的置換回転ロープ
（positive displacement rotary lobe）、ギア、遠心
分離型、振動板式（diaphram）もしくは蠕動性タイプで
ある。本発明においては回転ローブポンプが好ましい。
操作圧力（導入圧、このものがろ過速度に影響を与え
る）は、容積、粘度、試料の組成、また使用される膜の
構成および表面積のような多数の変数に依存している。
この操作圧はフィルターを横切って圧力が差別されるの
でフィルターの各側部で一般的に低い。一般的に、分離
率を上げるために流量割合を増加する。試料の粘度が増
加するに従って、もしくは試料粒子のサイズが級別する
フィルター孔のサイズに近づくにしたがって、適用され
る圧力は少なくすることができる；圧力関数はまた使用
されるフィルター材および試料組成にも依存している。
結局、フィルターが荷電されている場合、通過する試料
の電荷（同じ電荷、もしくは反対の電荷）が、フィルタ
ーを通って流れる速度を決めることができ（各々、より
遅く、もしくはより速く）、その結果、適用されるポン
プ圧を決める。フィルターの形態（中空繊維もしくは
管、あるいは平らなシート）が圧力設定に対する更に追
加される変数である。同様に試料の置換基による膜細孔
の吸着および／または閉塞（occulsion）のような更な
る考慮がろ過の最大の効率のよい速度を規定し得るので
ある。例えば、このような閉塞が、ある試料容量の操作
を行なったのちフィルターの交換を必要とし得る。圧力
関数は低圧ろ過の業界で働いている当業者によって決定
される。

一般的に、本発明で用いられる場合、中空繊維フィル
ムフィルター（ポリプロピレン、ポリスルホンなど）の
最大圧力は約3.5Kg/cm²（50PST）であり、セラミック中
空繊維フィルムフィルターは約10.5Kg/cm²（150PST）、
一方平らなシート膜は同様の圧力に耐えることができ
る。好適な圧力の選択は、脂質生成物および接戦流動ろ
過の業界の当業者が決定するのが最もよい。圧力が高す
ぎると、リポソームもしくは粒子の押出し、ケーキ生成
または剪断力によるリポソームの破壊を起こすことにな
る恐れがある。

試料は何回も再循環されるのが好ましく、循環の回数
は試料の容量、粘度および電荷によって決められる。例
えば試料の容量および／または粘度が増大するにつれて
再循環の時間も増大する。脂質濃度もまたフィルターを
通しての再循環の時間およびろ過速度を決定するのであ
る。例えば高度に粘性の製剤においては、より小さな粒
子がフィルター表面に届くことができず、ろ液中に排出
される。このような場合、供給貯蔵物の希釈および／又
は再循環速度の低減が必要とされ得る。更に試料の再循
環の時間も増加されるかもしれない。

操作期間は、必要とされるサイズの粒子の収率が最高
になるとき、そして試料が過剤反応を起こさないとき、
そして多くの微細物を含有するときが、選ばれるであろ
う。操作をする人は、反応操作中に試料の一定量を取っ
てそのサイズを試験することができ、その試験は例えば
視覚マイクロメーターを有する光学顕微鏡で、あるいは
準弾性光散乱法（QELS）もしくはマルヴェーンの粒子サ
イズ測定技術を用いてそのサイズを試験し、集団の一般
的サイズを測定し次いでろ過を続けるか中止するかを決
めることができる。

流出物（ろ液）がフィルターから回収されるとき、水
性もしくは有機溶液（例えば滅菌緩衝液もしくは0.9％
生理食塩水）が、全容量を一定に保つためにを液が除去
されるのと同じ速度で残留物に添加することができる。
この透析ろ過工程が得られる粒子収率を高める。原則的
に、フィルターを通じて自由に通過し得る（即ち、ゼロ
拒絶計数）種（例えばリポソームや脂質粒子のような粒
子）の約90％を除去するために残留物の約2.3倍容量の
緩衝液で洗浄して残留物の容量を維持することができ
る。目的とする種の約99％を除去するために、フィルタ
ーを通す洗浄液の容量は残留物容量の２×2.3倍であ
る。特に述べれば、1.0mlの洗浄液が該系から除去され
る1.0mlのろ液に代わるのである。この透析ろ過操作に
より得られる希釈ろ液は接線流動ろ過を用いて後から濃
縮することができる。また一方、一連の希釈および濃縮
が目的種のろ液への通過を増大させるために用いること
ができる。さもなければ、全試料が、水性溶液の追加を
要求しないフィルターを通して再循環される。

これまで述べてきたように、２もしくはそれ以上の接
線流動ろ過装置は一連のものとして連結させることがで
き、例えばこの複数のろ過装置の間に、１台のポンプを
置いて第２のろ過のために十分な流量を供給し、より上
およびより下のサイズ限界を有する特定サイズに分離さ
れた生成物を得る。一方、択一的にあるいは付加的に均
質化装置をろ過装置に連結させることができ、均質化さ
れた試料がこの装置から直接ろ過系に通される。ポンプ
は均質化装置（ホモジナイザー）とフィルターの間に接
続してフィルター中への供給流動速度を保持することが
できる。ろ過生成物は該フィルターから貯蔵タンクへと
通すことができ、一方十分均質化されていない残留物は
ホモジナイザーへポンプで戻され、フィルター中でさら
に処理を受ける前に更なるサイズ調整を受けることがで
きる。

本発明のリポソームもしくは脂質複合体は各々の薬の
ようないずれの生物活性剤をも取り込みもしくは複合化
することができる。リポソームの場合、薬はリポソーム
に取り込まれるか会合し、その例としてはネオマイシン
Ｂ、パロモマイシン、リボスタマイシン、リヴィドマイ
シン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシン、
トブラマイシン、ゲンタマイシイン、ネチルマイシン、
ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンおよ
びシソマイシンのようなアミノグリコンド類がある。本
発明のリポソームに取り込まれるか合合され得る他の生
物活性剤としては抗新生腫瘍剤がある。抗新生腫瘍剤と
しては、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、もし
くはエピルビシンのようなアントラサイクリン、ヴィン
ブラスチンもしくはヴィンクリスチンのようなヴィンカ
アルカロイド、５−フルオロウラシルのようなプリンも
しくはピリミジン誘導体、ミトキサンスロン、メクロル
エタアミン塩酸塩もしくはシクロフォスファミドのよう
なアルキル化剤、マイトマイシンもしくはブレオマイシ
ンのような抗新生腫瘍抗生物質がある。本発明の方法に
よってろ過することのできる脂質粒子を形成する脂質と
複合化される他の生物活性剤としては、ナイスタチン、
ピマヰシン、カンジシジン、フィリピンおよび好ましく
はアンホテリシンＢのようなポリエン抗真菌剤がある。

上記したように、本発明のリポソームもしくは脂質粒
子はその形成のための技術分野で知られているいずれの
技術によってもつくることができる。本発明の一態様に
おいては、均質化装置がリポソームもしくは粒子の処理
に用いられる。このような均質化装置としてはガウリン
タイプもしくはマイクロフルイダイザー（マイクロフル
イディスク インコーポレーション）タイプホモジナイ
ザー、コロイドミルもしくは同様の粉砕装置、またはリ
ポソームもしくは脂質粒子を押出し装置を通してつくる
サイズ低減装置〔クリスら、PCT公開87/00238、1986年
１月16日、名称：ユニラメラ小胞体を製造するための押
出し技術〕などがあるが、これらに限定されることはな
い。

本発明の均質化の点においては、ホモジナイザーもし
くはコロイドミルが、約0.7ないし約1.05Kg/cm²（約10
ないし約15Psi）の支持圧力（back pressure）で約１な
いし４リットル／分でミルへと運ぶポンプのセットに連
結され、供給試料は粉砕され、生成物はタンク中に回収
される。リポソームもしくは粒子の目標とするサイズ
が、このミルを通すことによって得ることのできるもの
より小さい場合はこの原料を２（ないし数）回このコロ
イドミルを通して再処理することができる。ろ過技術の
場合と同様に、最終点に到達したかどうかの決定は光学
顕微鏡、QEUS、マルヴェルンもしくは同様の技術で粉砕
された試料の一定量を検査することによって行うことが
できる。理想的には、この粉砕工程の最終点には殆どの
粒子もしくはリポソームが最終生成物のサイズ範囲に入
ったとき到達する。この粉砕生成物のサイズによる分離
は次いで接線流動フィルターを使用して処理し、目的と
する特定のサイズを選ぶことができる。

上記のようにアンホテリシンＢを含有する脂質粒子15
リットルの処理に当ってミルを通しての18サイクルがろ
過工程の前に必要とされる。この数値は上記条件によっ
て変わることが期待できる。用いられる脂質濃度は必要
とされる処理サイクル数を更に決定するということにな
る。高度に粘性の試料は効率的にろ過されることは期待
されないというように、薬の量およびタイプも又、必要
とされる粉砕時間を決定するであろう。

ろ過処理が溶媒を除去するために使用できる場合に
は、最終点の達成（例えば約99％の溶媒が除去される）
はガスクロマトグワフィーの標準技術によって決定され
る。製剤から遊離の薬剤が除去されることが希望される
場合には、約99％より少ない遊離の薬が残っている最終
点（上記のように透析ろ過が用いられたとき）に到達し
たという決定は例えば比色分析によって行われる。

本発明のもう１つの態様においては、リポソームもし
くは脂質粒子が接線流動ろ過処理を用いて形成される。
この処理では、例えばアンホテリシンＢのような薬剤が
例えばDMSOのような溶媒に懸濁されて、貯蔵器から中空
繊維フィルターの起毛管空間へと提供される。メチレン
クロライドのような溶媒中の脂質が、チューブを経由し
て中空繊維フィルターの内腔へと供給される。DMSO中の
アンホテリシンＢは、ろ液側に維持されているより高い
圧力に応じてフィルターの孔を通して内腔中へと入り、
そこで脂質と複合化し粒子を形成する。この溶媒はこの
同じ処理の間に生理食塩水溶液、緩衝水溶液、水もしく
はエタノールのような好適な置換溶媒を用いる透析ろ過
により除去される。脂質および生物活性剤の濃度は、も
しそれが含まれているならば、他の方法によりリポソー
ムもしくは脂質粒子を製造する際に採用されるようなも
のであることができる。

接線流動ろ過処理を用いるリポソーム形成の他の実施
例においては、規定されたサイズのリポソームはイオン
化し得る生物活性剤で、遠隔的に（remote）製薬されて
いる。このリポソーム形成方法においては水溶液、例え
ば比較的に酸性もしくは塩基性pHのマルトース水溶液
を、中空繊維ろ過装置、例えば0.1umのポリポロピレン
の内腔中に約0.14Kg/cm²（約2.0Psi）の圧力で循環させ
る。脂質例えば卵ホスファチジルコリン（EPC）は同様
にチューブを通じてフィルターの起毛管空間に供給され
る。このマルトース溶液は内腔側に維持されたより高い
圧力で応じて孔を通じて起毛管空間へ排出され、そこで
脂質と接触しリポソームを形成する。形成されたおよび
サイズ選択されたリポソームの溶液は続いて比較的に塩
性もしくは酸性pHに調整され、そしてイオン化し得る生
物活性剤がこのリポソームと混合される。

上記の方法にしたがってイオン化し得る生物活性剤を
遠隔的に製薬されたリポソーム、そして特にドキソルビ
シンのようなイオン化し得る抗新生腫瘍剤をこれらの方
法で製薬したリポソームのサイズ選択において、その操
作は次のようにして行われる。酸性緩衝液、特に約300m
Mクエン酸、約pH4.0中の卵ホスファチジルコリンおよび
コレステロール（3:1重量比）を用いてリポソームを形
成する。得られたリポソームは例えばガウリンもしくは
マイクロフルイタイザーホモジナイザーのような均質
化、もしくは押出しのような該技術分野で知られている
いずれかの方法を用いてサイズを減少させることができ
る。これらのリポソームは接線流動ろ過法によりpH約4.
0の緩衝液中でろ過し、まず第一に例えば約0.2μｍの孔
サイズを有するフィルターを通し、次いでろ液を例えば
約0.1μｍの孔サイズを有する第二の接線流動フィルタ
ーを通過させる。この残留物は約0.1−0.2μｍの間のサ
イズのリポソームを有する最終生成物である。このリポ
ソームを次いで約0.20μｍの孔サイズの減菌フィルター
を通す。炭酸ナトリウムのような適当な緩衝液を用いて
pHを約7.5に調整した後、ドキソルビシンが添加され、
そしてこのものは膜透過pH勾配の結果リポソーム中に堆
積される。一方また、この残留物は凍結乾燥して使用す
るまで貯蔵することができる。使用に当って、この凍結
乾燥物は比較的に塩基性pH、例えば約pH7.5の緩衝液を
用いて再構築することができる。更に加えて、この残留
物（約0.20μｍ接線流動ろ過から）はガウリンホモジナ
イザーのようなこの目的のために知られているいずれか
の装値を用いて均質化することができる。この場合、試
料が第一の接線流動フィルターを通過した後、目的とす
る生成物の上限のサイズ限界より上の残留物は更に処理
を行うためにホモジナイザー中に戻して再循環すること
ができる。

本発明のリポソームもしくは脂質粒子のために、いず
れの好適な脂質も用いることができる。ここで用いられ
る脂質という語は、脂質物質の疎水性部分が二分子膜層
（bilayer）の方向へ向き、一方親水性部分が水性相へ
向かうような二分子膜層になるいずれの好適な物質をも
意味するものである。脂質としてはトリグリセライドの
ような高度に疎水性成分、コレステロールのようなステ
ロール類および両親媒性脂質が挙げられる。本発明のリ
ポソーム形成に用いることのできる脂質としては、例え
ばホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノ
ールアミン（PE）、ホスファチジルセリン（PS）、ホス
ファチジルジグリセロール（PG）、ホスファチジン酸
（PA）、ホスファチジルイノシトール（PI）、スフィン
ゴミエリン（SPM）および同様のもののようなリン脂質
を単独で、もしくは組合せたものが用いられる。このリ
ン脂質は合成のものでもよいし、また卵もしくは大豆の
ような天然品から得られたものであることもできる。ジ
ミリストィルホスファチジルコリン（DMPC）およびジミ
リストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）のよう
な合成リン脂質もまた用いることができる。好ましい実
施態様においては、リン脂質卵ホスファチジルコリン
（EPC）が用いられる。このリポソームはまた、コレス
テロール（PEG−コレステロール類）、コプロスタノー
ル、コレスタノールもしくはコレスタンのポリエングリ
コール誘導体、およびEPCとコレステロールの組合せの
ような他のステロイド成分を含有することもできる。こ
れらはまたコレステロールへミサクシネート（CHS）等
のステロールの有機酸誘導体も含有することができる。
トコフェロールの有機酸誘導体、例えばアルファトコフ
ェロールヘミクサンネート（THS）が、リポソーム形成
成分として用いることができる。CHS−およびTHS−含有
の両リポソームおよびそれらのトリ塩形態は一般に、こ
れらのステロール類を含有するリポソーム形成のための
技術分野で知られているいずれの方法によっても製造す
ることができる。特に、ジャノフら、PCT公開第85/0457
8号、1985年10月24日出願、発明の名称「ステロイド性
リポソーム」「およびジャノフら、PC公開第87/02219
号、1987年４月23日、発明の名称「アルファートコフェ
ロールを基体とする小胞体」を参照されたい。このリポ
ソームはまたグリコリピドを含有することもできる。

リポソームもしくは脂質粒子の製造の間、有機溶媒が
脂質を溶解するために使用することができる。好適な有
機溶媒としては種々の極性および誘電特性を有するもの
が挙げられ、このものが脂質を溶解するのであり、例え
ばクロロホルム、メタノール、エタノールおよびメチレ
ンクロライドが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。その結果、脂質を含有する溶液（脂質および
他の成分が均一に全体に分布した混合物）が形成され
る。溶媒は生物活性剤（薬剤）を溶解するために使用で
き、そして必要な場合にはジメチルスルホキシド（DMS
O）を包含した上で名を挙げた溶媒のいずれもが使用で
きる。溶媒は一般に、生物適合性、低毒性および溶解能
力を基にして選択される。

本発明のリポソームもしくは脂質粒子は、薬のような
生物活性剤を取り込むか、もしくは会合することができ
る。この薬剤はサイズによる選択の態様もしくは接線流
動ろ過処理のリポソームの形成態様の両者において使用
することができる。これらの使用のための好適な生物活
性剤としてはナイスタチン、ピマリシン、カンジシジ
ン、フィリピンおよび好ましくはアンホテリシンＢのよ
うなポリエン抗真菌剤が挙げられるが、これらに限定さ
れることはない。使用することのできる他の生物活性剤
としては、上述のようにアミノグリコシド、例えばゲン
タマイシンのような抗菌性化合物、リファンパシンもし
くはアジドチミジン（AZT）のような抗ウィルス化合
物；アカチモン誘導体のような抗寄生虫化合物、ヴィン
ブラスチン、ヴィンクリスチン、マイトマイシンＣ、ド
キソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセートおよ
びとりわけシスプラチンのような抗新生腫瘍化合物；ア
ルブミンのような蛋白質、ジフテリア毒素のような毒
素、カタラーゼのような酵素、エストロゲンのようなホ
ルモン、アセチルコリンのような神経伝達物質、アルフ
ァーリポプロテインのようなリポプロテイン、ヒアルロ
ン酸のようなグリコプロテイン、IgGのような免疫グロ
ブリン、インターフェロンもしくはインターロイキンの
ような免疫調製剤、アルゼナゾIIIのような染料、¹⁴Cの
ような放射能標識剤、⁹⁹Teのような放射線不透化合物、
カルボキシフルオロセインのような蛍光物質、グリコー
ゲンのようなポリサッカロイド、エストロゲン受容体蛋
白質のような細胞受容体結合分子、インドメタシン、サ
リチル酸アセテート、イブプロフェン、サリンダック、
ピロキシカム、およびナプロキセンのような非ステロイ
ド性抗炎症剤；デキサメサゾンのような抗炎症剤；チモ
ロールもしくはピロカルピンのような抗緑内障剤、ジブ
カインのような麻酔剤、チミンのような核酸、RNAポリ
マーのようなポリヌクレオチド、アルファ遮断剤、ベー
タ遮断剤、カルシウム経路遮断剤、ACE阻害剤等のよう
な心臓血管剤およびCNS剤のようなものが例として挙げ
られるが、これらに限定されることはない。

リポソームもしくは脂質粒子水和工程において、蒸留
水（例えば注射用USP水）、生理食塩水（0.9％）のよう
な水性溶液もしくは水性緩衝液を用いることができる。
使用できる水性緩衝液としてはpH約7.0から7.5、好まし
くは7.2のリン酸塩緩衝生理食塩水「PBS」、トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩トリス」緩
衝液もしくはグリシン緩衝液が挙げられるが、これらに
限定されることはない。

本発明のリポソームは脱水（あるいは凍結乾燥）し
て、使用時まで長い期間貯蔵可能とすることができる。
標準的な凍結乾燥装置もしくは同様の装置がリポソーム
を凍結乾燥するために用いられ得る。リポソームは単に
それらを減圧下に置き、この懸濁溶液を蒸発させるだけ
で脱水することができる。さもなければ、リポソームお
よびそれを取り囲む媒体を脱水の前に液体窒素中で凍結
させることもできる。このような脱水はジャノフら、PC
T86/01103、1986年２月27日公開、参考のためにここに
引用されている方法にしたがい、保護糖のような１もし
くはそれ以上の保護剤の存在下で行うことができる。本
発明においては、脱水は接線流動ろ過（サイズ分離）工
程の前もしくは後のいずれかで行うことができる。

本発明の製剤は、（１）繰返しの投与；（２）抑制さ
れた搬送；もしくは（３）問題となっている遊離の薬剤
と実質的に同一もしくはそれより大の効力を有した上で
毒性が低減されていることを必要とする病気もしくは状
態の多くの治療において、動物（人間を含めて）に対し
て治療的に用いることができる。このような状態として
は、真菌感染症、ナイスタチンおよびアンホテリシンＢ
のような抗真菌剤で処理できるような局所的および全身
的症状および抗性物質化学治療剤に反応する細菌感染症
が挙げられるが、これらに限定されることはない。

製剤の投与形態が、この化合物が搬送される生物にお
ける部位および細胞を決定することができる。本発明の
リポソームおよび脂質粒子は単独で投与することができ
るが、一般には投与の意図した経路および標準的な薬剤
的慣習にしたがって選ばれた薬剤担体と混合して投与さ
れるであろう。例えば、特定の部位への搬送は局部的な
適用により最も容易に達成することができる（感染症が
外部のものである場合、例えば目、皮膚、耳における領
域または傷もしくはやけどのような痛い部分（afflicti
on））。このような局部的適用はクリーム、軟こう、ゲ
ル、乳化剤もしくはペーストの形で、傷められた領域に
直接適用される。また一方、これらの製剤は非経口的
に、例えば静脈内に、筋肉内にもしくは皮下に注射する
ことができる。非経口投与に対しては、それらは例えば
滅菌水性溶液の形態で使用することができ、このものは
他の溶質、例えば溶液を等張性とするのに充分な塩もし
くはグルコースを含有することができる。他の使用は製
剤の特別の特性に依存しているが、当業者によって想像
され得る。

真菌性もしくは細菌性病気の治療もしくは予防処理に
おける人間への投与については、投与される人間に対し
て適当な投与量を処方医が最終的に決めるであろう。そ
してこれは年齢、体重、病人の病気の性質および重さと
同様、個人の反応により、変わることが予測される。リ
ポソームもしくは脂質粒子の形態における薬の投与量は
一般的に、大体遊離の薬に対して採用されるものであろ
う。しかしながら、ある場合にはこれらの限度の範囲外
の投与量を投与することが必要となるかもしれない。

次の実施例は説明のためにのみ与えられるものであ
り、本発明の範囲を限定するためのものではない。

調製 アンホテリシンＢ粒子（HDLC_S）は以下の方法によっ
て形成された：アンホテリシンＢ（78.03mg）を５リッ
トルの圧力かん中で867mlのDMSOに添加し、溶解するた
めに25℃で３時間撹拌した。この溶液を25℃で第２の５
リットルの圧力かん中に滅菌的にろ過した。

ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）（60
g）および26.4gのジミリストイルホスファチジルグリセ
ロール（DMPG）（7:3モル比）を50リットルの圧力容器
中で21リットルのメチレンクロライドと一緒にし、完全
に溶解するまで混合した。次いでこのものを0.22umのテ
フロンフィルターを通して無菌的に50リットル三頚丸底
フラスコ中に無菌的にろ過した。このアンホテリシンB/
DMSO混合物を丸底フラスコ中の脂質溶液に添加し、（33
モル％アンホテリシンＢ溶液のために）次いでこの丸底
フラスコに4.32リットルの0.9％滅菌生理食塩水を添加
した。この懸濁液をバナナ型櫂で混合した。メチレンク
ロライドを40℃における20時間の真空蒸留工程（750mmH
g）で除去した。この時間経過後、５リットルがフラス
コ中に残った。

実施例１ 製剤の脂質／アンホテリシンＢ粒子5Lに0.9％滅菌生
理食塩水5Lを加えた。この溶液４リットル（4.04mg/ml
アンホテリシンＢ）を再生セルロースのフィルター膜を
備えた中空繊維接線流動ろ過透析ユニット バクスター
ト ラベノール（Baxter Travenol）（モデル15.11）の
入口および出口の出入口に、この溶液を含有する貯蔵器
から、シリコン蠕動管を通して、接続した。ワトソンマ
ルロウ蠕動ポンプをその接線流動装置へ250ml/分で配送
するために配置した。

同様に滅菌0.9％生理食塩水4L浴を取り付け、透析ユ
ニットの毛管外スペースに導くそのバクスター トラベ
ノール装置の出入口にポンプで押し出した。同様に蠕動
ポンプを、各貯蔵器中に一定の容量を保持するような速
度でそのユニットに生理食塩水を配送するために配置し
た。その生理食塩水管を脂質粒子に対して生理食塩水の
向流が達成されるようにその装置に取付けた。その溶液
を１時間向流的に循環し、次いでその生理食塩水溶液を
新しい生理食塩水に変えた。この工程はその溶液からDM
SOを除くものであった。

前−および後−透析DMSOの分析をテトロヒドロフラン
（THF）を用いる標準ガスクロマトグラフ技術を用いて
行った。前−透析DMSOは7.75％であり、後−透析DMSOは
0.05％であると決定された。得られた容量は4.3Lであっ
た。

実施例２ 上記実施例１の透析分離された粒子３リットルを以下
の技術に従ってサイズにより選択した。２つのフィルタ
ーパック〔ポリプロピレン導管（channels）で分離され
た各1/2ft²〕中に5nm孔サイズを有する1ft²のデュラポ
ール（Durapore）の平坦なシート膜を備えたペリコン
（Pellicon）接線流動ろ過装置をその粒子の大きさに従
って分けるのに用いた。その3Lの試料を含有する貯蔵器
を、4L/分で配送するために配置されたワトソンマルロ
ウ（モデル603U/R）蠕動ポンプにシリコン蠕動管と共に
接続し、次いでペリコン装置の入口に接続した。その入
口の圧力0.21Kg/cm²（3Psi）に調製した。そのペリコン
出口（残留物）における圧力は0.07Kg/cm²（1Psi）であ
り、このろ液口（ports）におけるそれは0.112Kg/cm
²（1.6Psi）であった。そのろ液の流動速度は約32ml/分
であり、ワトソン マルロウ（モデル603U/R）を用いて
ペリコン装置からポンプで押出した。

ろ液2500mlを集めた後、その試料を、その貯蔵器に滅
菌0.09％生理的食塩水を32ml/分で添加して透析ろ過し
た。付加的に1530mlのろ液がろ液／透析ろ液（diaflitr
ate）の全量4030mlに対して集められるまでこの工程を
続けた。標準ガスクロマトグラフ法により測定されたDM
SOの得られた濃度は0.01％であった。マルベルン（Malv
ern）粒子サイズ技術により測定されたその粒子のサイ
ズは1.0μｍ以下から4.7μｍであった。

実施例３ 1.0μｍ以下から50μｍのサイズ領域の脂質粒子を実
施例１の方法により調製し、次いで５μｍフィルターサ
イズを用いる実施例２の方法によってろ過し、4.5μｍ
までのサイズの粒子を得た。これらの粒子３リットルを
貯蔵器中に置き、この貯蔵器を、ゲルマン1.2μｍ（ア
クロフラックス、ひだのある平坦シート構造、900cm²）
接線流動フィルター装置の入口にシリコン蠕動管（ポン
プ付）で接続し、その流動速度を4L/分に調整した。そ
のろ液（1.2μｍまでの粒子サイズ）をそのろ液口を通
して集め、その残留物をその貯蔵器に再循環した。残留
物（410ml）を集めた。

実施例４ 水性生理食塩水溶液の容量（15.1L）に対して0.9重量
％で溶解されたゲンタマイシン（286g）およびメチレン
クロライド（24.5L）中に溶解された卵ホスファチジル
コリン（490g）を用いて、SPLV法〔レンク（Lenk）らの
米国特許明細書第4,522,803号、1985年７月11日発行の
操作によるもの、それはここに参照の為に引用されてい
る〕の手段により、ゲンタマイシンを含有するリポソー
ムを作った。このSPLVリポソームを0.9％水性生理食塩
水溶液で希釈した。サイズ約1.0μｍ以下−５μｍのこ
れらのリポソームを、実施例２の方法によりマイクロゴ
ン クロスフロー（Microgon Krosflow）II（マイクロ
ゴン インコーポレイテット、ラグナフィル カナダ）
接線流動ろ過系統を用いて容量8.2リットルから濃縮し
た。このフィルターの孔サイズは0.2μｍであり、その
表面積は10ft²であった。そのゲンタマイシンリポソー
ム8.2Lを含有する貯蔵器をシリコン蠕動管を用いてその
クロスフローフィルターの入口に接続した。フィルター
の出口に接続されているシリコン配管は残留物を貯蔵器
へ戻せしめる。ワトソンマーローの蠕動ポンプが生成物
をフィルター中へ注入するために使用された（流量率約
４リットル／分、入口圧0.21〜0.7Kg/cm²（３〜10Ps
i）、ろ液流量速度約75ml/分）。

この濃縮工程が終了した後、該ろ液のゲンタマイシン
濃度を標準的な比色技術を用いて測定し、7.92mgゲンタ
マイシン/mlの濃度を有することが見出された。透析ろ
過工程は次いで実施例２に従って行われた。ポンプで注
入する条件は上のものと同じであったが、約９リットル
の生理食塩水が透析ろ過のための系に添加された。この
ろ液をゲンタマイシンについてチェックしたところ、最
後の50mlは0.10mg/mlの濃度であった。このことは濃縮
物中の遊離のゲンタマイシンが透析ろ過の前の時点から
99％減少していることを示した。

ゲンタマイシンは0.2μｍフィルターの孔を自由に流
れ、従ってろ液中に見出される濃度は濃縮物（残留物）
中の遊離ゲンタマイシンを示唆している。

実施例５ アンホテリシンＢ粒子（HDLC_S）が次の方法に従って
形成された：アンホテリシンＢ（337.5g）を3375.0mlの
DMSOに添加し、そして25℃で5.5時間撹拌して溶解し
た。この溶液を25℃で５リットルの圧力かん中に滅菌ろ
過した。

ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）および
109.9gのジミリストイルホスファチジルグリセロール
（DMPG）（7:3モル比）を40リットルの圧力容器中で35.
2リットルのメチレンクロライドと一緒にし、混合して
完全に溶解した。この溶液を次いで0.22μｍのテフロン
フィルターを通して140リットルの処理タンク中に滅菌
ろ過した。メチレンクロリド（39.1リットル）を0.22μ
ｍテフロンフィルターを通して滅菌ろ過し、上記140ル
ットタンク中に添加した。このアンホテリシンB/DMSO混
合物を脂質溶液に添加し、（33モル％アンホテリシンＢ
溶液に対し）次いで16.5リットルの0.9％滅菌生理食塩
水をタンクに添加した。この懸濁液を船舶用プロペラで
混合した。このメチレンクロリドを滅菌チッ素ガス浄化
（purging）により除去した。約13時間後、最終温度は4
0℃より低かった。滅菌生理食塩水（7.0リットル）をバ
ッチに添加し、処理容器中の総容量が約27ルットルであ
るようにした。

この生成物を約５時間ギフォードウッドコロイドミル
を通して循環し、該脂質粒子の平均サイズを約5.0μｍ
にまで低減させた。粉砕後、生成物をアルファレーバル
回転丸型ポンプを用いて24gpmの平均流動速度でロミコ
ン5.0μｍセラミック接線流動フィルター（2ft²）を通
して総時間として10時間循環した。滅菌生理食塩水（41
0リットル）を140リットルの容器の頂部入口から30リッ
トルの一定量中に添加した。平均ろ過速度は約500ml/分
であった。このろ液を次いで貯蔵器に通し、アルファレ
ーバル回転丸型ポンプ駆動の1.2μｍレミコン2ft²セラ
ミックフィルターを、流量割合約36gpmで通過させるこ
とによって、濃縮した；（約14.5時間）ろ過速度は約50
0−600ml/分であった。このろ過がろ液中の1.2μｍおよ
びそれ以下の粒子を除去した。この1.2μｍ残留物を最
終物として回収した。

実施例６ ゲンタマイシンを含有するリポソームを実施例４の方
法にしたがってSPLV法によりつくった。これらのリポソ
ーム（100リットル）を0.22μｍ孔サイズの２台の2ft²
マイクロゴン中空繊維フィルター（平行型）を通すこと
によって接線流動ろ過をした。アルファレーバル回転丸
型ポンプが、各フィルターの平均流量割合15ガロン／分
でフィルターを通して生成物のろ過を行うために使用さ
れた。ろ過圧は次のようであった:Pin＝0.7Kg/cm²（10P
sig）;Pout＝0.175Kg/cm²（2.5Psig）膜を横切っての圧
は0.385〜0.42Kg/cm²（5.5〜6.0Psig）であった。元来1
00リットルの試料を最終的20リットルの生成物となるま
で濃縮することになるこのろ過は2.25時間、0.6リット
ル／分の流量速度で行われた。

この生成物を次いで透析ろ過して、平行型の４台のマ
イクロゴンフルターを通したろ過により遊離の（取り込
まれていない）ゲンタマイシンを除去した。生理食塩水
（20リットル）を0.2μｍの接線流動ろ過工程からの残
留物を含有する貯蔵タンクに添加し、該残留物を回収し
た。この工程を６回繰返し、その後、この生成物は20リ
ットルの生成物中に5.6mg/mlの取り込まれていないゲン
タマイシンを含有した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｂ０１Ｄ 37/00 Ｂ０１Ｄ 37/00 61/16 61/16 Ｂ０１Ｊ 13/02 Ｂ０１Ｊ 13/02 Ｚ (72)発明者 ダーニング，アンソニー，ジー アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19067 ヤードレイ ルックオーバーレ ーン 48 (72)発明者 クリムチャック，ロバート，ジェー アメリカ合衆国 ニュージャージィ州 08822 フレミントン ロッカフェロー ミルロード ボックス628エー (72)発明者 ポルトノフ，ジョエル アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 18954 リッチボロ グレゴリープレー ス 76 (72)発明者 トムショー，ミッチェル，エル アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19054 レビットタウン バイバーナム レーン 10 (56)参考文献 特開 昭62−3782（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−68429（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−167619（ＪＰ，Ａ) 特表 昭58−501323（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) B01D 61/14 500 B01D 61/16 B01D 37/00 B01D 13/02 A61K 31/70 ADU A61K 31/475 A61K 9/107 A61K 9/127

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）液体中に懸濁された粒子の混合物を
   第１の孔サイズを有する第１フィルターを用いて接線流
   動ろ過に付す工程； （ｂ）第１フィルターからろ液を回収する工程；および （ｃ）上記ろ液を第２の孔サイズを有する第２フィルタ
   ーを用いて接線流動ろ過に付す工程 を包含し、 第１の孔サイズは10ないし0.5ミクロンであり、 第２の孔サイズは2000分子量と２ミクロンの間であり、 第２の孔サイズは第１の孔サイズより小さいものであ
   る、 均一で限定されたサイズ分布を有するリポソーム性また
   は非リポソーム性脂質粒子を含有する製薬学的組成物を
   調製する方法。
2. 【請求項２】そのリポソーム性もしくは非リポソーム性
   脂質粒子が更に生物活性剤を含有する請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】その生物活性剤がポリエン抗真菌剤を含有
   する請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】そのポリエン抗真菌剤がアンホテリシンＢ
   を含有する請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】請求項１記載の方法によって調製された均
   一のサイズの分布を有するリポソーム性もしくは非リポ
   ソーム性脂質粒子の母集団。
6. 【請求項６】その粒子のサイズが0.2μｍと10μｍとの
   間である請求項５記載の脂質粒子の母集団。
7. 【請求項７】請求項１記載の方法において混合物を第一
   のフィルターに適用するに先立ち、粒子の混合物をホモ
   ジナイズ工程に付す工程を付加してなるリポソーム性ま
   たは非リポソーム性脂質粒子を含有する製薬学的組成物
   を調製する方法。
8. 【請求項８】請求項７に記載の方法に従って調製された
   均一のサイズ分布を有するリポソーム性もしくは非リポ
   ソーム性脂質粒子の母集団。