JP2835902B2 - 耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体及びその製造法 - Google Patents
耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体及びその製造法Info
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Description
ェリンに耐熱性を賦与した耐熱性ラクトフェリン−鉄結
合体に関する。また、本発明は、ラクトフェリン溶液に
鉄塩と重炭酸イオンを含むアルカリ塩とを添加すること
による耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体の製造法に関す
る。
記する)には、鉄吸収促進、過酸化脂質生成抑制、抗
菌、抗ウィルス、細胞増殖、免疫系の制御など様々な生
理活性を有することが知られており、これらの生理活性
を付加したLf含有食品、医薬品、飼料、化粧品などを
製造する試みがなされている。そして、このような製品
は、製造中に加熱殺菌されたり、使用時に熱湯と接触す
る機会が多い。しかしながら、Lfは熱に不安定な物質
であり、熱変性すると沈澱したり鉄結合能を失い、その
生理活性も失われてしまうという致命的な欠点があっ
た。
行われ、pH4にして加熱したLfは生のLfと同等の
鉄結合能を有することが報告されている〔Davids
onand Lonnerdal、Am.J.Phys
iol.、第257巻、G930〜G934、1989
年〕。しかし、このようにして調製されたLfは保存中
に次第に変性し、その生理活性が失われてしまうことも
判明している。また、イオン強度の低い条件でLfを加
熱すると生理活性を維持し得ることが開示されている
〔特開平4−108629号公報〕。しかし、実際の製
品を製造する系では、必ずしもイオン強度が低くないの
で実用的ではない。そこで、本発明者らは、pHと電気
伝導度Ωの関係が、Lfの熱安定化に及ぼす影響につい
て検討し、 logΩ ≦(2.96/pH)+0.64 (pH<5) logΩ ≦(29.37/pH)−4.62 (5≦pH≦7.9) logΩ ≦−0.917 (pH>7.9) となるようにLf含有溶液を調整するとLfの熱安定化
を図ることができることを見出した〔特開平4−826
9号公報〕。しかし、この条件を満たさない製品の場
合、この条件を満たすように調整したLf溶液と他の原
料溶液を別々に殺菌し、無菌的に両者を混合するという
手段を取らざるを得ない。ところが、乳等省令では、全
ての原料を混合した後に加熱殺菌を行うことが定められ
ており、Lf溶液と他の原料溶液を別々に殺菌して混合
する方法は、実際的ではないという問題があった。
問題を解決するべく、さらにLfの熱安定化について検
討を重ねた結果、Lfの鉄結合能を維持した状態で耐熱
性を賦与するためには基本的にLfそのものを改質する
ことが必要だという結論に達した。そして、水に溶解し
た時のpHが4以下である鉄塩と重炭酸イオンを含むア
ルカリ塩とをLf溶液に、それぞれ特定量の範囲で添加
することにより、Lfに特定量の範囲の鉄及び重炭酸イ
オンが結合し、かつLfのアミノ基に重炭酸イオンを介
して鉄が結合したLf−鉄結合体が生成され、このLf
−鉄結合体が耐熱性を有することを見出し、本発明をな
すに至った。したがって、本発明は、耐熱性Lf−鉄結
合体を提供することを課題とする。また、本発明は、こ
のような耐熱性Lf−鉄結合体を製造する方法を提供す
ることを課題とする。
クトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介して鉄が結
合した耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体に関する。本発
明におけるラクトフェリンに対する重炭酸イオン及び鉄
の結合範囲は、ラクトフェリン1g当り重炭酸イオン3
5〜400mg及び鉄40〜500mgである。また、
本発明は、水に溶解した時のpHが4以下である鉄塩を
Lf溶液に添加して溶解するか、あるいは、水に溶解し
た時のpHが4以下である鉄塩とLfとを一緒に溶解す
るかして得られる溶液に、重炭酸イオンを含むアルカリ
塩を添加し、溶液のpHを7以下に調整することによっ
て、ラクトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介して
鉄を結合させる耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体の製造
法に関する。そして、この場合、鉄塩の添加量はラクト
フェリン1g当り40〜500mg、重炭酸イオンを含
むアルカリ塩の添加量を0.35〜5gとすると前記ラ
クトフェリンに対する鉄及び重炭酸イオンが特定の比率
で結合した耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体を得ること
ができる。
ような分泌液から分離して得ることができる。この分離
方法は、どのような方法であっても構わない。このよう
なLfを大量に分離、精製する方法は、既に種々の提案
がなされている。また、本発明で用いるLfは、遺伝子
操作によって微生物、動物細胞、あるいはトランスジェ
ニック動物などに生産させたものであっても構わない。
pHが4以下を示すものであって、例えば、塩化第2
鉄、硝酸第2鉄、硫酸第2鉄などがある。なお、水に溶
解したときのpHが4以下を示すこれらの鉄塩以外の鉄
塩を用いても、Lfに耐熱性を付与することはできな
い。また、水に溶解したときのpHが4を越える鉄塩の
pHを酸で4以下として用いても、本発明の目的を達成
することはできない。本発明で用いる鉄塩の量は、Lf
1gに対し、鉄イオンとして40〜500mg、好まし
くは50〜200mgである。鉄塩の量が、40mgよ
り少ないと加熱時にLfの一部が沈澱するし、500m
gを超えると鉄の一部がLfと共に沈澱する。
酸イオンが含まれているものである。この重炭酸イオン
を含むアルカリ塩としては、重炭酸アンモニウム、重炭
酸ナトリウム、重炭酸カリウムなどを例示することがで
きる。なお、これらのアルカリ塩と通常用いられる水酸
化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウムなどのアル
カリとを併用して用いることもできる。また、pHを調
整する際に途中から重炭酸イオンを含むアルカリ塩を用
いることもできる。ただし、ここで重要なことは、Lf
1g当たり35〜400mgの重炭酸イオンを結合させ
なければならず、そのためには、Lf1g当たり重炭酸
イオンとして350mg〜5gのアルカリ塩をLf/鉄
塩混合溶液に添加する必要がある。重炭酸イオンの量
が、350mgより少ないと重炭酸イオンを介してLf
に結合する鉄量が少なくなるので、Lfに耐熱性を十分
で賦与できないし、5gより多いと過剰の重炭酸イオン
が鉄と反応して沈澱を形成する。なお、本発明におい
て、最終的な耐熱性Lf−鉄塩溶液のpHは7以下でな
ければならない。耐熱性Lf−鉄塩溶液のpHが7以上
となると沈澱が生成する。
ナトリウムを混合し、電気伝導度を調整してLfの殺菌
を行い、その後、殺菌済の他の原料と無菌的に混合し、
pH5.5でFe(mg)/Lf(g)=9.6の鉄強
化飲料を製造する方法を提案した〔特開平4−8269
号公報〕。しかし、その際にLf溶液に加える鉄量が少
なかったため、本発明のような耐熱性が賦与されたLf
−鉄結合体は形成されておらず、別々に殺菌を行う方法
を採用せざるを得なかった。
体は、その表面構造が天然Lfと異なる。Lfは、リジ
ンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を多く含有してお
り、これに鉄化合物を加えてpHを酸性にすると正に帯
電する。このLfの正電荷に重炭酸イオンが結合し、さ
らに鉄が結合して、本発明の耐熱性Lf−鉄結合体が生
成する。この耐熱性Lf−鉄結合体は、90℃で加熱し
ても安定である。
ると鉄飽和型Lfが生成することは古くから知られてい
る事実であり、Lfを構成するNローブと呼ばれる領域
とCローブと呼ばれる類似した二つの領域に、鉄イオン
がそれぞれ1分子づつ結合したものである。すなわち、
Nローブでは、Asp60、Tyr92、Tyr192
及びHis253(数字はN末端からのアミノ酸の順番
を示す、以下同様)の4個のアミノ酸残基に1分子の鉄
イオンが結合しており、さらに、この鉄に重炭酸イオン
が1個結合したものである。同様に、Cローブでは、A
sp395、Tyr435、Tyr528及びHis5
97に鉄イオンが結合している〔B.F.Anders
on et al.、J.Mol.Biol.、第20
9巻、711〜734頁、1989年〕。したがって、
通常鉄飽和型Lfは、Lf1g当たり、鉄1.4mg、
重炭酸イオン1.5mgそれぞれ結合したものとなる。
また、鉄飽和型Lfは、鉄が結合していないLfに比べ
ると若干安定性は増すが、65℃以上で加熱すると沈澱
してしまう。
Lfに結合して非遊離状態となり、安定化された鉄剤を
得ることができることが示されている〔特開平4─14
1067号公報〕。しかし、その明細書には、鉄を多量
に添加することによってLfに耐熱性が賦与されるとい
うことは何ら示されていないし、重炭酸塩を用いるとい
うことも何ら示されておらず、したがって、本発明の重
炭酸イオンを介して鉄が結合した耐熱性Lf−鉄結合体
とは全く異なるものと言える。
合量及び重炭酸イオンの結合量が、いわゆる鉄飽和型L
fより遙に多く、Lfがまるで鉄の鎧を着ているようで
ある。そして、この鉄の鎧のために、本発明の耐熱性L
f−鉄結合体は、抗体で認識され難くなる。次に、本発
明の耐熱性Lf−鉄結合体の抗体認識試験について示
す。
を所定量加え、さらに、Lf1g当たり0.12〜0.
5gの重炭酸ナトリウムを添加して、ウシLf溶液のp
Hを6.5に調整した。そして、このウシLf溶液とp
H6.6の0.1モルイミダゾール緩衝液/0.3モル
食塩とを等量混合した。一方、ELISA用プレートに
抗ウシLf抗体をコートした後、ブロックエース(大日
本製薬(株)販売)でブロッキングしておき、先に調製
したウシLf溶液を添加して、室温で1時間反応させた
後、パーオキシダーゼを標識した抗ウシLf抗体を反応
させた。反応後、プレートをよく洗浄した後、ABTS
基質を加えて、405nmの吸光度を測定した。各鉄塩
濃度における抗体認識結果について表1に示す。
合する鉄塩の量が増えるに従い、抗体で認識されるLf
の濃度は減少した。なお、対照として、重炭酸ナトリウ
ムの代わりに水酸化ナトリウムを用いてpHを6.5に
調整したLf/鉄溶液を作製しようと試みたが、沈澱が
生じてELISAに供することができなかった。
安定化試験について示す。
鉄イオンとして120mgとなるようにLf溶液に添加
し、1モル重炭酸ナトリウム溶液でpHを6.3に調整
した。そして、この溶液を、最終濃度が0.05モルイ
ミダゾール/0.15モル食塩(pH6.6)となるよ
うに加え、90℃で10分間加熱してLfの沈澱生成を
観察した。その結果を表2に示す。
きのpHが4以下を示す鉄塩を用いるとLfに耐熱性を
付与することができるが、それ以外の鉄塩を用いても耐
熱性を付与することができないこと、(2)水に溶解し
たときのpHが4を越える鉄塩を酸でpH4以下として
も耐熱性を付与することができないこと、及び(3)鉄
塩の使用量には一定の範囲があることが分る。
塩化第2鉄を鉄イオン濃度として最終濃度20〜1,0
00μg/mlとなるように添加し、重炭酸ナトリウム
を4mg〜210mg加えpHを6.2に調整した。こ
の溶液を水で20mlにメスアップし、次いで、この溶
液8mlずつを0.1モルイミダゾール/塩酸/0.3
モル食塩(pH6.6又はpH7.3)の緩衝液各8m
lと等量混合した。混合した後の溶液のpHは各々6.
5又は7.2であった。この混合溶液を90℃で10分
間加熱し、室温まで自然冷却した後、3,000rp
m、10分間遠心分離して、上清中のLf含量をBio
Rad Protein Assayで測定した。上清
中に残存しているLfの割合を表3に示す。
当たりの鉄量が40〜500mgの範囲において、本発
明の耐熱性Lf−鉄結合体は、90%以上の熱安定性を
示した。
製品を製造するに際し、特に制限はないが、製品の最終
pHと電気伝導度Ωの関係が、 logΩ >(2.96/pH)+0.64 (4≦pH<5) logΩ >(29.37/pH)−4.62 (5≦pH≦7) であるような場合に本発明の耐熱性Lfを用いるとよ
い。なぜならば、pHと電気伝導度Ωの関係が、上記の
関係を示さない場合、既に開示されたLfの殺菌方法
(特開平4−8269号公報)を用いることで十分であ
り、また、pHが7を越える場合、上述したように本発
明の耐熱性Lfを用いることができないからである。な
お、pHが7を越える場合、pHを7以下とするため
に、若干量の酸を添加しても構わない。その後、通常実
施されている工程に従い、加熱殺菌あるいは滅菌を行
う。加熱処理方法としては、65℃、30分間の低温殺
菌処理、120℃、2〜3秒間、あるいは140〜15
0℃、3〜5秒間の処理、さらにはレトルト処理を用い
ることも可能である。また、乾燥を行えば耐熱性Lf−
鉄結合体を含有する粉末製品を得ることもできる。な
お、乾燥方法としては、凍結乾燥法を用いてもよいが、
大量に処理する場合、乾燥コストの安い噴霧乾燥法を用
いることが好ましい。
合体含有製品は、鉄を含んでいるので、貧血の予防ある
いは治療を目的とした食品、飼料、医薬品などとして特
に適している。また、病原菌の付着阻止効果〔特開平3
─220130号公報〕を賦与した医薬品、飼料、食
品、化粧品などとしても適している。なお、本発明の耐
熱性Lf−鉄結合体は、鉄を含んでいるが殆ど鉄臭が感
じられないので、鉄強化飲料の素材として利用するのに
も適している。
する。
4gとを水8lに溶解し、攪拌機で激しく攪拌しながら
重炭酸ナトリウム5gを添加してpHを6.4に調整し
た。そして、全体の容積が10lとなるまで加水し、L
f10g/l、鉄イオン100mg/gLf及び重炭酸
イオン107mg/gLfを含む耐熱性Lf−鉄結合体
溶液を調製した。本溶液の半量5lを凍結乾燥した結
果、5.3gの粉末を得た。次にSephadex G
−25(ファルマシア社製)を水で平衡化したもの10
0mlを内径2cm、高さ50cmのカラムに充填し、
得られた溶液のうち1mlを負荷した。水で溶出し、ボ
イドボリューム画分を集め、Bio−Rad社のPro
tein Assay kitでLfを定量し、さらに
ICPによって鉄含量を測定した。その結果、Lf9.
7mg、鉄イオン1.03mgであった。すなわちLf
1g当り106mgの鉄が結合していることが確かめら
れた。尚、当然のことながら他の画分にはLfも鉄も溶
出されていなかった。
0.4gとを水100mlに溶解し、スターラーでよく
攪拌しながら1モル重炭酸ナトリウム溶液を添加して、
pHを3.5に調整し、さらに、1N水酸化ナトリウム
を添加してpHを6.2に調整して耐熱性Lf−鉄結合
体溶液を得た。次に、脱脂粉乳2kgを水20lに還元
し、乳酸をごく少量加えてpHを6.5に調整した。こ
のようにして調製した還元脱脂乳と先に調製した耐熱性
Lf−鉄結合体溶液100mlとを混合した後、均質化
を行った。そして、プレート型殺菌機で120℃、2秒
間殺菌した後、直ちに5℃に冷却した。このようにして
得られた耐熱性Lf−鉄結合体を含む製品は、電気伝導
度が6.5ms/cm、pHが6.5で、耐熱性Lf−
鉄結合体含量25mg/l、鉄含量164mg/g、L
f及び重炭酸イオン含量0.17g/gLfであった。
この耐熱性Lf−鉄結合体を含む製品を2週間冷蔵庫に
保存した後、その一部を1,200×g、10分間遠心
分離したが、沈澱は認められず、鉄臭も殆ど感じられな
かったので、耐熱性Lf−鉄結合体が安定して存在して
いると判断された。
溶液1.3lを脱脂乳100lに溶解し、均質化した
後、150℃で4秒間滅菌を行った。滅菌後、直ちに4
℃まで冷却して、250mlずつ紙容器に無菌充填し
た。この耐熱性Lf−鉄結合体を含む製品を37℃で3
ヶ月保存した後、1,200×g、10分間遠心分離し
て沈澱物の有無を調べたが、沈澱は全く認められなかっ
た。また、製品中の大腸菌数及び一般細菌数は、共に0
であった。さらに、製品中に鉄が存在しているので、保
存中に褐変が進行する恐れがあったが、極わずかに茶褐
色を帯びているだけで、実用的には殆ど問題にはならな
い程度の変化であった。
性を有し、しかも従来知られているLfと同様の鉄結合
能を維持している。したがって、従来の方法で加熱殺菌
あるいは滅菌するとLfの鉄結合能が失なわれていた製
品に本発明の耐熱性Lf−鉄結合体を加え生体にとって
有用なLfを供給することができる。
Claims (2)
- 【請求項1】 ラクトフェリン1g当たり、重炭酸イオ
ンが35〜400mg、鉄が40〜500mg結合し、
かつラクトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介して
鉄が結合した耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体。 - 【請求項2】 水に溶解したときのpHが4以下である
鉄塩をラクトフェリン1g当たり鉄として40〜500
mgの割合でラクトフェリン溶液に添加し、重炭酸イオ
ンを含むアルカリ塩をラクトフェリン1g当たり重炭酸
イオン濃度にして0.35〜5g加えてpHを7以下に
調整することを特徴とする、ラクトフェリン1g当り重
炭酸イオンが35〜400mg、鉄が40〜500mg
結合し、ラクトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介
して鉄が結合した耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体の製
造法。
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