JP2791001B2

JP2791001B2 - グリコシル−蛋白誘導体

Info

Publication number: JP2791001B2
Application number: JP8231212A
Authority: JP
Inventors: 民雄菅原; 博行岩沢; 邦彦入江; 剛兆吉川; 哲奥野; 隆加藤
Original assignee: Dei Dei Esu Kenkyusho Kk
Current assignee: Dei Dei Esu Kenkyusho Kk
Priority date: 1990-02-16
Filing date: 1996-09-02
Publication date: 1998-08-27
Anticipated expiration: 2013-08-27
Also published as: JPH09118699A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、薬物を標的組織特
に骨髄又は脳に選択的に運搬させるための担体として有
用なグリコシル−蛋白誘導体及びその中間体に関する。

【０００２】

【従来の技術】骨髄組織は、赤血球、リンパ球、単球、
顆粒球を作り出す組織であり、体内の造血、免疫を担う
最も重要な組織である。ガン患者における放射線治療及
び抗癌剤投与によって、骨髄機能低下が起こることは、
現在避けることのできない副作用であり、骨髄抑制が起
った結果、白血球や血小板の大幅な減少、特に顆粒球の
減少に伴った重症感染症は大きな問題となっている。

【０００３】また、脳組織へ薬剤が輸送されるためには
血液脳関門を通過しなければならないため、脳内への薬
剤の移行を妨げている。このため、脳内への薬剤の運搬
手段の開発が要望されている。

【０００４】一方、近年の免疫学の発展に伴い、多くの
生理活性蛋白が単離精製され、その薬理作用についても
明らかにされてきている。更に遺伝子工学技術の発展に
伴い、多くのサイトカイン類、例えば赤血球の造血ホル
モンであるエリスロポエチン、白血球の造血因子である
数種類のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、更にα−、β
−、γ−インターフェロン、インターロイキン２等が、
大量生産できるようになり、医薬品への応用が試みられ
てきている。

【０００５】しかしながら、多くのサイトカイン類は、
生体内に投与した後、すばやく代謝されてしまうため、
目的とする組織での薬効発現が十分に達成できない問題
点がある。

【０００６】この問題点を解決するために、生理活性物
質や合成医薬品を標的部位に運搬する担体として、抗
体、糖蛋白、リポ蛋白、レクチン、ホルモン、リポソー
ム、デオキシリボ核酸、多糖類、合成ポリマー、ポリア
ミノ酸等、天然由来高分子、分子集合体及び合成ポリマ
ーに至る広い範囲の物質が提案されている。

【０００７】例えば、Proc. Nath. Acad. Sci. USA 84,
1487-1491 (1987) には数種のサイトカイン類をポリエ
チレングリコール等の合成ポリマーで修飾し、サイトカ
イン類自身の活性を失うことなく生体内での半減期を延
長させる研究が報告されている。

【０００８】また、特開昭６３−１５２３９３号公報に
は、糖鎖を有するポリエチレングリコール誘導体がサイ
トカイン類の修飾に用いることができ、この修飾蛋白は
生体内におけるクリアランスを遅延させ、あるいは特定
の細胞・組織への送達を向上させるために使用すること
が示唆されている。しかしながら、骨髄又は脳指向性に
関する報告は存在しない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、骨髄又は脳
細胞表面の糖認識性を利用し、薬物（サイトカイン類及
び低分子の医薬品等）を標的組織である骨髄又は脳組織
により多く送達することを可能とし、並びに薬物の生体
内半減期を遅延させることを可能とする薬物運搬担体の
発明であり、目的とする薬物を標的とする組織に送達す
るシステム（Targeting Drug Delivery System）の開発
を目的とするものである。

【００１０】特に本発明は、再生不良性貧血等の造血機
能の疾患、各種リンパ球疾患に伴う免疫不全症等の骨髄
機能異常を起こしている患者、更には、骨髄性白血病、
ミエローム、形質細胞腫、多発性骨髄腫等の骨髄性ガン
患者やガンの治療等に伴う副作用により骨髄機能低下を
引き起こしている患者に対して、その治療に使われる薬
物を効率よく骨髄組織に集めることによって、またその
薬物の生体内半減期を遅延させることができる、より高
い有効性が期待できる薬物運搬担体の開発を目的とする
ものである。

【００１１】また、本発明は、アルツハイマー病等の治
療のため、脳内への直接的な薬剤運搬担体の開発を目的
とするものであり、これにより少量の薬剤であっても、
その活性を保持したままで、かつ副作用の可能性を少な
くして治療を可能にする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、式：〔Ｒ−Ｏ−（ＣＨ₂)₂ Ｏ（ＣＨ₂)₂ Ｏ（ＣＨ₂)₃ −ＣＯ−〕_m −Ｚ（Ｉ) （式中Ｒはグリコシル基を表し、Ｚは蛋白を表し、ｍは
５〜５０を表す）で示されるグリコシル−蛋白誘導体で
ある。

【００１３】本発明の上記化合物は、薬物を目的とする
細胞、臓器、器官、特に骨髄又は脳組織への薬物運搬担
体として利用することができる。薬物運搬担体は（ｉ）
生体適合性が良いこと、（ii) 投与後、一定時間は安定
であること、(iii) 薬物が作用部位に到達したとき化学
的、酵素的反応により薬物が遊離されること、が要求さ
れる。

【００１４】上記式の運搬担体を構成する糖鎖は、標的
とする細胞臓器、器官等を特異的に認識する能力を持っ
た標的識別部位として利用することができる。Ｒで示さ
れるグリコシル基としては、キシロピラノシル基、マン
ノピラノシル基、フコピラノシル基、２−ガラクトピラ
ノシル基、２−アセトアミド−２−デオキシ−フコピラ
ノシル基、２−アセトアミド−２−デオキシ−マンノピ
ラノシル基、２−アセトアミド−２−デオキシ−ガラク
トピラノシル基のような単糖類；マンノピラノシル−マ
ンノピラノシル基、（２−アセトアミド−２−デオキシ
−マンノピラノシル）−マンノピラノシル基、（２−ア
セトアミド−２−デオキシ−グルコピラノシル）−マン
ノピラノシル基、フコピラノシル−（２−アセトアミド
−２−デオキシ−グルコピラノシル）基、ガラクトピラ
ノシル−（２−アセトアミド−２−デオキシ−グルコピ
ラノシル）基、ガラクトピラノシル−（２−アセトアミ
ド−２−デオキシ−マンノピラノシル）基、ガラクトピ
ラノシル−グルコピラノシル基のような二糖類又はジ
（２−アセトアミド−２−デオキシ−グルコピラノシ
ル）−マンノピラノシル基、ジ（ガラクトピラノシル）
−２−アセトアミド−２−デオキシ−グルコピラノシル
基のような三糖類を挙げることができる。特に好ましく
は、マンノピラノシル基、フコピラノシル基、２−アセ
トアミド−２−デオキシ−フコピラノシル基、マンノピ
ラノシル−マンノピラノシル基、（２−アセトアミド−
２−デオキシ−グルコピラノシル）−マンノピラノシル
基、及びガラクトピラノシル−グルコピラノシル基が挙
げられる。

【００１５】式（Ｉ）の化合物において、糖鎖と蛋白を
結ぶ修飾剤のジオキサカルボン酸はエチレン基又はプロ
ピレン基を介したジオキサアルカン酸であり、好ましく
は５，８−ジオキサデカン酸である。糖鎖とジオキサカ
ルボン酸との結合はα−結合でもβ−結合でもよい。Ｚ
の蛋白としては、ヒト血清アルブミンのような蛋白であ
る以外に、それ自体生理活性蛋白であるサイトカイン類
のインターロイキン、エリスロポエチン、インターフェ
ロン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、潰瘍壊死
因子（ＴＮＦ）又はコロニー刺激因子（ＣＳＦ）であっ
てもよい。これらの蛋白自体は臓器特異性を持たない
が、標的識別能力を持つ糖鎖で化学修飾することにより
標的識別性を有するものになる。

【００１６】式（Ｉ）の運搬担体を製造するには、例え
ばグリコシル−ジオキサアルカン酸のアルキルエステル
又は２−アセトアミド−２−デオキシ−グリコシル−ジ
オキサアルカン酸のアルキルエステルにヒドラジンを反
応させ、得られた酸ヒドラジドを常法で酸アジドに変換
し、これを蛋白と反応させてグリコシル−ジオキサアル
カン酸が蛋白中のアミノ基の一部とアミド結合した目的
物を得る。修飾基の結合数は蛋白１分子当り５〜５０モ
ルである。修飾の程度は、蛋白に対するグリコシル−ジ
オキサアルカン酸のモル比を増減するか、又は蛋白とグ
リコシル−ジオキサアルカン酸の反応液濃度を増減する
ことによって選択することができる。

【００１７】反応に用いる溶媒は反応を妨害しないもの
であればいずれでもよいが、リン酸緩衝液、トリス緩衝
液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。反応は
中性付近で０℃〜室温で行われる。反応液は透析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等の通常の蛋白の
精製法により精製して目的物を得る。修飾基の導入数
は、修飾蛋白を塩酸で加水分解後エルソン−モーガン法
等で測定することにより知ることができる。

【００１８】グリコシル−ジオキサアルカン酸と蛋白と
の反応は、水溶性カルボジイミド等の縮合剤の存在下に
反応させることによっても製造することができる。また
ジオキサアルカン酸の他の活性誘導体を用いてもよく、
そのような活性誘導体としては、アミド化合物、活性エ
ステル、活性チオエステル等が挙げられる。これらの活
性誘導体は蛋白とアミド結合を形成させるために当業者
において適宜選択することができる。

【００１９】本発明はまた、式（Ｉ）の薬物運搬担体を
製造するための中間体に関し、中間体は式（II）で示さ
れるグリコシル−ジオキサカルボン酸又はその活性誘導
体である。Ｒ−Ｏ−（ＣＨ₂)₂ Ｏ（ＣＨ₂)₂ Ｏ（ＣＨ₂)₃ ＣＯＯＨ（II）ここに、Ｒは特にキシロピラノシル基、フコピラノシル
基、ガラクトピラノシル基、２−アセトアミド−２−デ
オキシ−フコピラノシル基、２−アセトアミド−２−デ
オキシ−マンノピラノシル基、２−アセトアミド−２−
デオキシ−ガラクトピラノシル基、（２−アセトアミド
−２−デオキシ−マンノピラノシル）−マンノピラノシ
ル基、（２−アセトアミド−２−デオキシ−グルコピラ
ノシル）−マンノピラノシル基、フコピラノシル−（２
−アセトアミド−２−デオキシ−グルコピラノシル）
基、ガラクトピラノシル−（２−アセトアミド−２−デ
オキシ−グルコピラノシル）基、ガラクトピラノシル−
（２−アセトアミド−２−デオキシ−マンノピラノシ
ル）基、ガラクトピラノシル−グルコピラノシル基、ジ
（２−アセトアミド−２−デオキシ−グルコピラノシ
ル）−マンノピラノシル基又はジ（ガラクトピラノシ
ル）−２−アセトアミド−２−デオキシ−グルコピラノ
シル基のようなグリコシル基である。

【００２０】式（II）の中間体を製造するには、（Ａ）
ヒドロキシル基を保護したグリコシルハライドにω−ヒ
ドロキシジオキサアルカン酸アルキルエステルを反応さ
せて、グリコシル−α（又はβ）−ジオキサアルカン酸
アルキルエステルとし、これを脱保護して得られるか、
（Ｂ）また２−アセトアミド−２−デオキシ−グリコシ
ル−ジオキサアルカン酸アルキルエステルは対応する２
−アジド−２−デオキシ−グリコシル−ジオキサアルカ
ン酸アルキルエステルをアセチル化して得られる。更に
必要により他の活性誘導体に導くことができる。

【００２１】式（Ｉ）の運搬担体を製造するには、式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ₂)₂ Ｏ（ＣＨ₂)₂ Ｏ（ＣＨ₂)₃ −ＣＯＯＨ（II）の中間体から以下の反応式に示す方法により製造するこ
とができる。

【００２２】

【化１】

【００２３】

【化２】

【００２４】

【化３】

【００２５】

【化４】

【００２６】

【発明の効果】本発明のグリコシル−蛋白誘導体は、後
記試験例に示すように薬剤を結合させ、これを試験例に
示すように動物に投与したとき、薬剤を骨髄又は脳組織
に集中的に分布させることができる。

【００２７】

【実施例】以下に本発明の例及び試験例を示す。

【００２８】例１２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エトキシエタノー
ル（４０２）無水ジメチルホルムアミド３００mlに６０％水素化ナト
リウム１３．５ｇ（０．３３８モル）を懸濁させた溶液
に、トリエチレングリコール（４０１）５０．０ｇ
（０．３３モル）を滴下した。室温で１時間撹拌した後
に、臭化ベンジル５６．０ｇ（０．３３モル）を滴下
し、更に室温で１時間撹拌した。反応終了後減圧にて溶
媒を留去し、得られた残留物を酢酸エチル２００mlに溶
解し、水２００mlで洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、これを減圧下濃縮乾固すると油状粗生成
物が得られた。これをシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー〔シリカゲル７０−２３０メッシュ５００ｇ、溶媒
系：ヘキサン／酢酸エチル（１：１）〕で精製すると、
標記化合物（４０２）が２７．５ｇ（３４％）得られ
た。

【００２９】¹H-NMR(CDCl₃, δppm)：7.26 〜7.35(5H,
m),4.57(2H, s),3.73(2H, t, J=4.5Hz),3.66 〜3.71(6
H, m),3.63 〜3.65(2H, m),3.62(2H, t, J=4.5Hz),2.25
(1H, br) IR(neat)cm^-1： 3450(OH), 1099(C-O-C)

【００３０】例２２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エトキシエチルブ
ロミド（４０３）化合物（４０２）３６．０ｇ（０．１５モル）の無水エ
ーテル１００ml溶液に、氷冷下に三臭化リン１４．０ｇ
（０．０５２モル）を加えて１時間撹拌した。更に１時
間室温にて撹拌後、反応液に水１００mlを加えて、酢酸
エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、減圧下濃縮乾固するとシロップ状の粗生成物が得ら
れた。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔シ
リカゲル７０−２３０メッシュ２５０ｇ、溶媒系：ヘキ
サン／酢酸エチル（９：１）〕で精製すると、標記化合
物（４０３）が１３．６ｇ（３６％）得られた。

【００３１】¹H-NMR(CDCl₃, δppm)：7.26 〜7.35(7H,
m),4.58(2H, s),3.81(2H, t, J=7.0Hz),3.66 〜3.71(6
H, m),3.61 〜3.63(2H, m),3.47(2H, t, J=6.7Hz) IR(neat)cm^-1： 1112(C-O-C)

【００３２】例３メチル４−〔２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エ
トキシ〕−２−メトキシカルボニルブタノエート（４０
４）６０％水素化ナトリウム１０．０ｇ（０．２５モル）の
無水ジメチルホルムアミド３００ml懸濁液に、マロン酸
ジメチル３３．０ｇを加えて、４０℃で１時間撹拌し
た。これに化合物（４０３）４１．１ｇ（０．１３６モ
ル）を一度に加えて、更に４０℃で６時間撹拌後、室温
で一晩放置した。反応混合物を１０％塩酸で中和し、溶
媒を減圧下に留去して得られた残留物を水１００ml及び
酢酸エチル２００mlで分配した。有機相を分離後、無水
硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去するとシロ
ップ状の粗生成物が得られた。これをシリカゲルカラム
クロマトグラフィー〔シリカゲル７０−２３０メッシュ
２５０ｇ、溶媒系：ヘキサン／酢酸エチル（２０：
１）〕で精製すると、標記化合物（４０４）が３６．８
ｇ（７７％）得られた。

【００３３】¹H-NMR(CDCl₃, δppm)：7.26 〜7.34(5H,
m),4.56(2H, s),3.72(3H, s),3.52(2H, t, J=5.9Hz),2.
18(2H, m) IR(neat)cm^-1： 1754(C=O), 1735(CO₂CH₃)

【００３４】例４メチル４−〔２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エ
トキシ〕ブタノエート（４０５）化合物（４０４）２３．２ｇ（６５．５ミリモル）及び
塩化ナトリウム４．５ｇ（７６．９ミリモル）を水４ml
とジメチルスルホキシド８０mlの混合液に加え、１５０
〜１６０℃で４時間加熱撹拌した。反応終了後、溶媒を
減圧下に留去し、得られた残留物を水１００ml及び酢酸
エチル１００mlで分配し、有機相を分離後無水硫酸ナト
リウムで乾燥した。溶媒を減圧下に留去して得られたシ
ロップ状の粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー〔シリカゲル７０−２３０メッシュ２５０ｇ、溶媒
系：ヘキサン／酢酸エチル（５：１）〕で精製すると、
標記化合物（４０５）が１７．０ｇ（８７％）得られ
た。

【００３５】¹H-NMR(CDCl₃, δppm)：7.24 〜7.33(5H,
m),4.57(2H, s),3.66(3H, s),3.63 〜3.68 (6H, m),3.5
7 〜3.58(2H, m),3.50(2H, t, J=6.2Hz),2.42(2H, t, J
=7.3Hz),1.90(2H, m) IR(neat)cm^-1： 1738(CO₂CH₃), 1113(C-O-C)

【００３６】例５メチル４−〔２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキ
シ〕ブタノエート（４０６）化合物（４０５）１６．６ｇ（５６．０ミリモル）のメ
タノール２０ml溶液に、１０％パラジウム炭素２．０ｇ
を加え、室温にて４時間水素添加した。反応終了後、触
媒をろ過し、ろ液を減圧下に濃縮乾固すると、無色油状
物の標記化合物４０６が１１．３ｇ（９９％）得られ
た。

【００３７】¹H-NMR(CDCl₃, δppm)：3.73(2H, t, J=4.
5Hz),3.68(3H, s),3.65 〜3.68(2H, m),3.57 〜3.63(4
H, m),3.51(2H, t, J=6.2Hz),2.42(2H, t, J=7.3Hz),1.
92(2H, m),1.70(1H, br) IR(neat)cm^-1： 3450(OH), 1738(CO₂CH₃), 1119(C-O-C) MS(EI)m/z ： 207(M+H⁺)

【００３８】例６２−〔２−（３−メトキシカルボニルプロピルオキシ）
エトキシ〕エチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベン
ジル−β−Ｄ−マンノピラノシド（４０９）及び２−
〔２−（３−メトキシカルボニルプロピルオキシ）エト
キシ〕エチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル
−α−Ｄ−マンノピラノシド（４０８）化合物（４０６）５７７mg（２．８ミリモル）、炭酸銀
５００mg（１．７９ミリモル）及びドライライト５００
mgの塩化メチレン５ml溶液を窒素気流下０℃にて３０分
間撹拌した後、Koto, Morishima, Miyata, and Zen, Bu
ll. Chem. Soc.Jpn., 49, 2639 (1976)の方法で得た、
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α／β−マン
ノピラノシルｐ−ニトロベンゾエートの塩化メチレン
溶液に、乾燥塩化水素ガスを吹き込んで合成した２，
３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノピ
ラノシルクロリド（４０７）５８０mg（０．８４ミリモ
ル）の塩化メチレン溶液３mlをゆっくり滴下した。その
後、内温０〜５℃にて４時間撹拌した。反応終了後反応
物をセライトを用いてろ過し、不溶物を塩化メチレンで
よく洗浄した。ろ液及び洗液を合し、溶媒を減圧下留去
すると粗生成物１．１０４８ｇが得られた。粗生成物を
フラッシュクロマトグラフィー〔シリカゲル２３０〜４
００メッシュ６０部、溶媒系：酢酸エチル／ヘキサン
（２：３）〕にて分離精製すると標記化合物（４０９）
５２０mg（８１．２％）及び標記化合物（４０８）１２
０mg（１８．８％）が得られた。

【００３９】化合物 (409) 〔α〕_D ²⁴ - 44.6°(C O.67, CHCl₃)¹ H-NMR(CDCl₃,δppm)：7.18〜7.50(20H, m, aromatic
H),4.85〜4.97(2H, AB-q, J=12.5Hz, benzyl-CH₂),4.54
〜4.62(2H, AB-q, J=12Hz, benzyl-CH₂),4.50〜4.90(2
H, AB-q, J=12Hz, benzyl-CH₂),4.41〜4.51(2H, AB-q,
J=12Hz, benzyl-CH₂),4.44(1H, s, H-1),4.02〜4.08(1
H, m, H-2),3.64〜3.93(7H, m),3.63(3H, s, CO₂CH₃),
3.40〜3.64(8H, m),2.35〜2.40(2H, m, CH₂CO-),1.80〜
1.95(2H, m, CH₂CH₂CO-) IR(CHCl₃)cm^-1： 1726(CO₂CH₃) MS(FAB)m/z ： 751(M+Na⁺), 727(M-1)

【００４０】化合物 (408) 〔α〕_D ²⁴ + 13.9°(C O.70, CHCl₃)¹ H-NMR(CDCl₃,δppm)：7.18〜7.50(20H, m, aromatic
H),4.91(1H, d, J=1.71Hz, H-1),4.68〜4.75(2H, AB-q,
J=12.5Hz, benzyl-CH₂),4.604(2H, s, benzyl-CH₂),4.
47〜4.86(2H, AB-q, J=10.75Hz, benzyl-CH₂),4.51〜4.
65(2H, AB-q, J=12Hz, benzyl-CH₂),3.65〜4.00(8H,
m),3.63(3H, s, CO₂CH₃),3.44〜3.60(8H, m),2.30〜2.4
0(2H, m, CH₂CO-),1.80〜1.90(2H, m, CH₂CH₂CO-) IR(CHCl₃)cm^-1： 1725(CO₂CH₃) MS(FAB)m/z ： 727(M-1)

【００４１】例７２−〔２−（３−メトキシカルボニルプロピルオキシ）
エトキシ〕エチル−β−Ｄ−マンノピラノシド（４１
０）化合物（４０９）５００mg（０．６８６ミリモル）をメ
タノール１０mlに溶解し、１０％パラジウム−炭素５０
０mgを加えて、水素気流下室温にて激しく４０時間撹拌
した。反応終了後触媒をろ去し、ろ液を減圧下濃縮乾固
すると、標記化合物（４１０）２３２．４mg（９２％）
が得られた。

【００４２】化合物 (410) 〔α〕_D ²³ - 22.3°(C 2.18, MeOH)¹ H-NMR(CD₃OD,δppm)：4.53(1H, s, H-1),3.30〜4.00(1
4H, m),3.62(3H, s, CO₂CH₃),3.10〜3.25(2H, m),2.37
(2H, t, J=7.3Hz, CH₂CO-),1.83(2H, t, J=7.3Hz, CH₂C
H₂CO-) IR(CHCl₃)cm^-1： 3350(OH), 1732(CO₂CH₃) MS(FAB)m/z ： 391(M+Na⁺)

【００４３】例８２−〔２−（３−メトキシカルボニルプロキシオキシ）
エトキシ〕エチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−
β−Ｌ−フコピラノシド（４１２） H.M. Flowersらの方法〔Carbohydr. Res., 4, 189-195
(1967)〕により調製した２，３，４−トリ−Ｏ−アセチ
ル−α−Ｌ−フコピラノシルブロマイド（４１１）１６
６mg（０．４６９ミリモル）のベンゼン１０ml溶液に化
合物（４０６）１００mg（０．４８５ミリモル）、シア
ン化第二水銀１２３mg（０．４８５ミリモル）及び粉末
化した無水硫酸カルシウム３５０mgを加え、アルゴン気
流中室温で２４時間撹拌した。反応溶液をろ過後、ろ液
に酢酸エチル５mlを加え、水５mlで洗浄した。無水硫酸
マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮して得られたシロップ
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホル
ム：メタノール＝２００：１）で精製すると標記化合物
（４１２）が１３６mg（５８．６％）得られた。

【００４４】化合物 (412) 〔α〕_D ²⁵ -2.9°(C 1.1, CHCl₃)¹ H-NMR(CDCl₃,δppm)：1.22(3H, d, J=6.4Hz, H-6),1.9
9, 2.06, 2.18(9H, 3s, OAc),2.42(2H, t, J=7.3Hz, CH
₂, COOCH₃),3.68(3H, s, OCH₃),4.76(1H, d, J=8.1Hz,
H-1) IR(NaCl)cm^-1 ： 1750, 1700

【００４５】例９２−〔２−（３−メトキシカルボニルプロピルオキシ）
エトキシ〕エチル２，３，４−β−Ｌ−フコピラノシ
ド（４１３）化合物（４１２）１８０mg（０．３７６ミリモル）をメ
タノール２mlに溶解させた後、２８％ナトリウムメチラ
ート０．０５mlを加え、室温で２時間撹拌した。反応溶
液をアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ⁺)で中和し、イ
オン交換樹脂をろ取した後、ろ液を減圧濃縮すると標記
化合物（４１３）が１０９mg（８２．３％）得られた。

【００４６】〔α〕_D ²⁶ -2.1°(C 1.3, MeOH)¹ H-NMR(CD₃OD,δppm)：1.23(3H, d, J=6.6Hz, H-6),2.3
7(2H, t, J=7.6Hz, CH ₂ COOCH₃),3.67(3H, s, OCH₃),4.
19(1H, d, J=7.3Hz, H-1) IR(NaCl)cm^-1 ： 3450, 1740, 1070

【００４７】例１０２−〔２−（３−メトキシカルボニルプロピルオキシ）
エトキシ〕エチル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−
２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド
（４１４）及び２−〔２−（３−メトキシカルボニルプ
ロピルオキシ）エトキシ〕エチル３，４，６−トリ−
Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−β−Ｄ−マ
ンノピラノシド（４１５） Carbohydr. Res., 136, 153 (1985)の方法で合成した
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デ
オキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルブロマイド９３０mg
（２．３５ミリモル）とメチル４−〔２−（２−ヒド
ロキシエトキシ）エトキシ〕ブタノエート（４０６）４
８５mg（２．３５ミリモル）のトルエン２０ml溶液に、
銀シリケート７００mg及び粉末状モレキュラーシーブ４
Ａを５００mg加え、室温で１６時間撹拌した。反応溶液
をセライトを用いてろ過した後、ろ液を減圧下に濃縮乾
固し、得られた残渣をローバーカラム（ヘキサン：酢酸
エチル＝１：１）で精製すると標記化合物（４１４）５
２５mg（４３％）及び標記化合物（４１５）１４３mg
（１１．７％）が得られた。

【００４８】化合物 (414) 〔α〕_D ²⁴ + 58.2°(C O.57, CHCl₃)¹ H-NMR(CDCl₃,δppm)：5.39(1H, dd, J_3,4=10Hz, J_2,3=
4.0Hz, H-3),5.32(1H, t, J=10Hz, H-4),4.91(1H, s, H
-1),4.25(1H, dd, J_5,6a=4.5Hz, J_6a,6b=12Hz, H-6a),
4.02(1H, m, H-5),2.40(2H, t, J=7.5Hz, -CH ₂CO-),2.1
0, 2.09, 2.04(each 3H, each s, 3 × OAc) IR(film)cm^-1 ： 2110, 1747, 1438, 1369, 1230, 1049

【００４９】化合物 (415) 〔α〕_D ²⁴ - 60.1°(C O.9, CHCl₃)¹ H-NMR(CDCl₃,δppm)：5.24(1H, t, J_3,4=9.5Hz, H-4),
4.99(1H, dd, J_2,3=3.5Hz, H-3),4.79(1H, s, H-1),4.2
5(1H, dd, J_5,6a=5.5Hz, J_6a,6b=12Hz, H-6a),4.00(1H,
m, H-5),2.40(2H, t, J=7.5Hz, -CH ₂CO-),2.10, 2.08,
2.03(each 3H, each s, 3 × OAc) IR(film)cm^-1 ： 2112, 1743, 1371, 1236, 1055

【００５０】例１１２−〔２−（３−メトキシカルボニルプロピルオキシ）
エトキシ〕エチル２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ
−マンノピラノシド（４１６）化合物（４１５）５２５mg（１．０１ミリモル）の無水
メタノール１０ml溶液に、１M ナトリウムメトキシド−
メタノール溶液０．２５mlを加え、室温に４時間放置し
た。反応液にイオン交換樹脂アンバーライトＩＲ−１２
０Ｂ（Ｈ⁺ 型）を加えて中和した後、樹脂をろ去し、少
量のメタノールで洗浄した。ろ液及び洗液を合し、減圧
下で溶媒を留去すると、シロップ状の標記化合物（４１
６）１５４mgが得られた。

【００５１】例１２２−〔２−（３−メトキシカルボニルプロピルオキシ）
エトキシ〕エチル２−アセタミド−２−デオキシ−α
−Ｄ−マンノピラノシド（４１７）化合物（４１６）１５０mg（０．３８１ミリモル）のエ
タノール４ml溶液に、塩化ニッケル六水和物３８０mg
（１．６ミリモル）をエタノール１０mlに溶解した液
０．１mlを加えた後、水素化ホウ素ナトリウム４３mg
（１．１４３ミリモル）のエタノール溶液に４mlを撹拌
しながら加えた。室温で３０分間撹拌した後、反応液に
酢酸を加えて中和した。次いで無水酢酸０．５mlを加え
て室温に１時間放置した。反応混合物を減圧下で濃縮乾
固して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（クロロホルム：メタノール＝７：１）で精製すると標
記化合物（４１７）が１５７mgが得られた。

【００５２】〔α〕_D ²⁶ + 26.4°(C 0.62, MeOH)¹ H-NMR(CD₃OD,δppm)：4.72(d, 1H, J=1Hz, H-1),4.31
(dd, 1H, J_1,2=1Hz, J_2,3=4.7Hz),2.01(s, 3H, NAc) IR(KBr)cm^-1： 3446, 1730, 1660, 1550, 1132, 1068

【００５３】例１３ネオグリコプロティン（４１９）化合物（４１３）８５mg（０．２４１ミリモル）のエタ
ノール０．８ml溶液に、ヒドラジンヒドラート０．２４
mlを加え、室温で２４時間撹拌した。反応溶液を減圧濃
縮した後、水１mlを加え、更に減圧濃縮することにより
２−〔２−（３−ヒドラジノカルボニルプロピルオキ
シ）エトキシ〕エチル β−Ｌ−フコピラノシド８５mg
を得た。これにＤＭＦ３mlを加えて溶解させ、−２５℃
に冷却後、４N 塩化水素のジオキサン溶液０．１４mlを
加えた。更に同温で亜硝酸ｔ−ブチル３５．５mg（０．
２４１ミリモル）のＤＭＦ０．２ml溶液を加えて３０分
間撹拌した後、スルファミン酸１６．８mgのＤＭＦ０．
２ml溶液を加え、１５分間撹拌することにより、対応す
る酸アジドを含む反応溶液を得た。これを０℃に冷却し
た人血清アルブミン（ＨＳＡ）３３２mg（４．８２×１
０^-3ミリモル）のホウ酸緩衝液（０．０８M Ｎａ₂ Ｂ₄
Ｏ₇ 、０．３５M ＫＨＣＯ₃)２０mlに加え、同温で２４
時間撹拌した。４℃で一晩透析後、凍結乾燥することに
よりフコース修飾アルブミン（４１９）３４３mgの粉末
を得た。フェノール−硫酸法によりＨＳＡ／モルに結合
した糖鎖のモル数は２８であることがわかった。

【００５４】ネオグリコプロティンと使用した中間体の
一覧を表１に示した。導入された糖含量は、中性糖の場
合にはフェノール−硫酸法により、ヘキソサミンの場合
には４N 塩酸による加水分解後、エルソン−モーガン法
で行った。またこれらのネオグリコプロティンの物理恒
数を表２に示した。

【００５５】

【表１】

【００５６】

【表２】

【００５７】試験例ネオグリコプロティン４１８、４１９及び４２０を検体
試料として、またＨＳＡを対照試料として用意した。下
記方法により試料をヨードラベル化し、動物における分
布実験を行った。

【００５８】試験方法各ネオグリコプロテインを、クロラミンＴ法を用いてヨ
ードラベル化した。その結果、比活性１８〜３０ MBq／
２０μg 蛋白質のヨードラベル化ネオグリコプロテイン
を得た。放射性ヨードが蛋白に結合していることを確認
するために、ＴＣＡ処理を行った。即ち、０．５％牛の
血清アルブミン含有０．１M リン酸緩衝液を用いて適当
に希釈した後、その３００μl を試験管に取り、１５％
ＴＣＡ（トリクロル酢酸）溶液６００μl を加え、撹拌
後３，０００rpm で１０分間遠心し、上清、沈殿中に存
在する放射性ヨードの活性を測定した。その結果、全放
射活性の９５％以上が沈殿中に存在しており、放射性ヨ
ードが蛋白に結合していることがわかった。

【００５９】このヨードラベル化ネオグリコプロテイン
を用いて、動物における分布実験を行った。まず、ヨー
ドラベル化ネオグリコプロテイン４μg を０．５％牛の
血清アルブミン含有０．１M リン酸緩衝液（pH７．４）
１mlに溶解し、投与検液とした。またヨードラベルの比
活性が高いときは、未標識のネオグリコプロテインを用
いて希釈を行い、投与検液とした。

【００６０】この溶液をＳＤ系雄性ラット（体重２４０
〜３００ｇ）に、体重１００ｇ当り０．１mlになるよう
に大腿静脈より投与した。その後、正確に１分、２分、
３分後に頸静脈より採血を行い、投与後５分後に下大動
脈より全身血を採取し脱血死させる。その後、直ちに心
臓、肺臓、胸腺、脾臓、腎臓、筋肉、骨髄、皮膚、肝臓
を採取した。

【００６１】投与後１分、２分、３分、５分の血清及び
５分の全血液、心臓、肺臓、胸腺、脾臓、腎臓、筋肉、
骨髄、皮膚、肝臓を正確に秤量し、その放射活性を測定
した。

【００６２】また、投与検液及び投与後５分の血清中に
存在する放射活性が、ネオグリコプロテインに結合して
いることを確認するために、ＴＣＡ処理を行った。操作
は前述と同様に行い、全放射活性の９０％以上がネオグ
リコプロテインに結合していることを確認した。

【００６３】次に、得られた血清中濃度（投与後１分、
２分、３分及び５分）の結果より、投与後０分から５分
までの血清中濃度下面積（ＡＵＣ_0-5)を台形近似法を用
いて計算した。ＡＵＣ_0-5 は、次式により定義される。ＡＵＣ_0-5 ＝∫⁵ ₀ ＣｄｔここでＣはネオグリコプロテインの時間（ｔ）における
血清中濃度である。

【００６４】更に、ネオグリコプロテインの各組織中濃
度とＡＵＣ_0-5 の比から、組織分布クリアランスを計算
した。その結果を表３に示した。

【００６５】このことは、グリコシル−蛋白誘導体は骨
髄組織を標的組織とする薬物運搬担体として有用である
ことを示している。

【００６６】

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/76 Ａ６１Ｋ 37/48 (72)発明者奥野哲埼玉県三郷市早稲田８−５−18 (72)発明者加藤隆千葉県柏市東１−７−１グランドール亜梨104 (56)参考文献特開昭58−15993（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/76 C07K 14/52 C07H 15/04 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式：〔Ｒ−Ｘ−〕_m −Ｚ（式中、Ｒはグリコシル基を表し、ＸはＯ−（ＣＨ₂)₂
Ｏ（ＣＨ₂)₂ Ｏ（ＣＨ₂)₃ −ＣＯを表し、Ｚは蛋白を表
し、ｍは１０〜５０を表す）で示されるグリコシル−蛋
白誘導体を含有する薬剤運搬担体。
【請求項２】グリコシル基が、キシロピラノシル基、
マンノピラノシル基、フコピラノシル基、ガラクトピラ
ノシル基、２−アセトアミド−２−デオキシ−フコピラ
ノシル基、２−アセトアミド−２−デオキシ−マンノピ
ラノシル基、２−アセトアミド−２−デオキシ−ガラク
トピラノシル基、マンノピラノシル−マンノピラノシル
基、（２−アセトアミド−２−デオキシ−マンノピラノ
シル）−マンノピラノシル基、（２−アセトアミド−２
−デオキシ−グルコピラノシル）−マンノピラノシル
基、フコピラノシル−（２−アセトアミド−２−デオキ
シ−グルコピラノシル）基、ガラクトピラノシル−（２
−アセトアミド−２−デオキシ−グルコピラノシル）
基、ガラクトピラノシル−（２−アセトアミド−２−デ
オキシ−マンノピラノシル）基、ガラクトピラノシル−
グルコピラノシル基、ジ（２−アセトアミド−２−デオ
キシ−グルコピラノシル）−マンノピラノシル基又はジ
（ガラクトピラノシル）−２−アセトアミド−２−デオ
キシーグルコピラノシル基である、請求項１記載の薬剤
運搬担体。
【請求項３】蛋白が、アルブミン、サイトカイン類又
は酵素である、請求項１又は２記載の薬剤運搬担体。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項記載のグリ
コシル−蛋白誘導体を含有する骨髄への薬剤運搬担体。
【請求項５】請求項１〜３のいずれか１項記載のグリ
コシル−蛋白誘導体を含有する脳への薬剤運搬担体。