JP2769311B2 - ヒト乳癌細胞に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒト乳癌細胞に対するモノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は免疫学並びに癌の
診断及び治療に有用なモノクローナル抗−ヒト乳癌抗体
に関する。 【０００２】 【従来の技術】１９７０年代半ば以来、ヒト乳癌関連抗
原と反応するネズミモノクローナル抗体の多数の報告が
存在する。これらの報告された研究においては、ネズミ
がヒト−乳脂肪球蛋白質（milk fat globule protein)
、乳癌セルライン、又は乳癌膜抽出物で免疫感作及び
追加免疫された。免疫脾細胞がマウス骨髄腫細胞と融合
され、そしてハイブリドーマが、***又は乳癌抗原に対
する培地の幾らかの特異性に基いて選択された。 【０００３】Taylor-Papadimitriou, J.等、インターナ
ショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J. Ca
ncer）（１９８１）２８：１７−２１；Yuan, D.等、Ｊ
ＮＣＩ（１９８２）６８：７１９−７２８；Ciocca, D.
R. 等、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.)４２：４
２５６−４２５８。これらの先行技術の抗体の正常組織
反応性はこの発明の抗体の正常組織反応性と異る。 【０００４】多くの先行研究者は、 "イムノトキシン"
を製造するための細胞毒性剤と抗体との連結を報告し又
は示唆した。最近の関心は、細菌又は植物由来の毒素の
酵素的活性部分（Ａ鎖）にヘテロ２官能剤を介して結合
したモノクローナル抗体のイムノトキシンに集中してい
る。Neville, D. M.及びYoule, R. J.、イムノロジカル
・レビュー（Immunol Rev.）（１９８２）６２：７５−
９１；Ross, W. C. J.等、ヨーロピアン・ジャーナル・
オブ・バイオケミストリー（European J. Biochem.）
（１９８０）１０４；Vitteta, E. S.イムノロジカル・
レビュー（Immunol Rev.）（１９８２）６１：１５８−
１８３；Rosa, V.等、キャンサー・リサーチ（Cancer R
es.)（１９８２）４２：４５７−４６４；Trowbridge,
I. W. 及びDomingo, D. J.、ネイチュアー（Nature) (C
omd)（１９８１）２９４：１７１−１７３。 【０００５】 【発明の概要】本発明は、乳癌組織に存在し、４５４Ｃ
１１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８４８４），４５２Ｆ２
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１０８１１），５２０Ｃ９（Ａ
ＴＣＣＮｏ．ＨＢ８６９６）及び７４１Ｆ８（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＨＢ１０８０７）から成る群から選択されたハ
イブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体と特
異的に結合する２１０ｋＤのモノマー蛋白質に特異的に
結合する標識されたモノクローナル抗体又はその断片を
含んで成る乳癌細胞検出剤；並びに乳癌組織に存在し、
４５４Ｃ１１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８４８４），４５
２Ｆ２（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０８１１），５２０Ｃ９
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８６９６）及び７４１Ｆ８（Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１０８０７）から成る群から選択さ
れたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗
体と特異的に結合する２１０ｋＤのモノマー蛋白質に特
異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片を含ん
で成るイムノトキシンを含む殺乳癌剤に関する。 【０００６】 【具体的な説明】この明細書において使用する場合、 "
モノクローナル抗体" は均一な抗体集団を有する抗体組
成物を意味する。抗体の起原又はそれが作られる方法に
関しては限定されないことが意図される。例示されるモ
ノクローナル抗−ヒト乳癌抗体に関してこの明細書にお
いて使用される "機能的に同等" なる語は、（ａ）例示
されたモノクローナル抗体を交差ブロックし；（ｂ）ヒ
ト乳癌細胞に選択的に結合し；（ｃ）Ｇ又はＭアイソタ
イプを有し；（ｄ）免疫沈澱又はサンドイッチイムノア
ッセイにより決定される場合同じ抗原に結合し；そして
（ｅ）リシンＡ鎖に結合された場合ＭＣＦ−７，ＣＡＭ
Ａ−１，ＳＫＢＲ−３、又はＢＴ−２０細胞の少なくと
も１つに対して約１０nMより小さいＴＣＩＤ５０％を示
すモノクローナル抗体を意味する。 【０００７】この発明のモノクローナル抗体生産性ハイ
ブリドーマに関してこの明細書において使用される場
合、 "子孫" なる語は、世代又は核型の同一性とは無関
係に、親により生産されるモノクローナル抗−ヒト−乳
癌抗体を生産する、親ハイブリドーマのすべての誘導
体、結果物及び子を包含することが意図される。 【０００８】モノクローナル抗体製造 この発明のハイブリドーマを調製するために使用される
抗体生産性融合パートナーは、マウス等ヒト以外の動物
を生ヒト乳癌細胞又はそれから調製される膜抽出物によ
り免疫感作することにより生じる。動物に免疫原量の細
胞又は抽出物を腹腔内接種し、そして次に同様の量の免
疫源により追加免疫する。最終追加免疫の数日後、免疫
された該動物から脾臓を集め、そして融合において使用
するため、これから細胞懸濁液を調製する。 【０００９】Buck, D. W. 等、イン・ビトロ（In Vitr
o）（１９８２）１８：３７７−３８１により改変され
たKohler, B 及びMilstein, G 、ネイチュアー（Natur
e）（１９７５）２５６：４９５−４９７の一般的体細
胞ハイブリダイゼーション技法を用いて、脾細胞とネズ
ミ腫瘍パートナーとからハイブリドーマを調製する。入
手可能なネズミ骨髄腫ライン、例えばサルク・インステ
ィテュート、セルディビジョンセンター、サンジェゴ、
カリホルニア、ＵＳＡをハイブリダイゼーションにおい
て使用することができる。 【００１０】基本的には、ポリエチレングリコールのご
とき融合剤を用いて腫瘍細胞と脾細胞とを融合せしめる
ことを含む。融合の後、融合媒体から細胞を分離し、そ
して選択的増殖培地、例えばＨＡＴ培地に増殖せしめる
ことによりハイブリダイズしていない親細胞を除去す
る。所望によりハイブリドーマを拡げ、そして抗原とし
て免疫剤（乳癌細胞又は膜抽出物）を用いて常用のイム
ノアッセイ法（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イ
ムノアッセイ、又は蛍光イムノアッセイ）により、抗−
ヒト乳癌活性について上清を測定する。陽性クローンを
さらに特徴付けてこれらがこの発明の抗体の基準に合致
するか否かを決定する。 【００１１】このような抗体を生産するハイブリドーマ
を、公知の方法を用いてイン−ビトロ又はイン−ビボで
増殖せしめることができる。モノクローナル抗体は、所
望により、常用の免疫グロブリン精製法、例えば硫酸ア
ンモニウム沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフ
ィー、及び限外濾過により、場合に応じて培地又は体液
から単離することができる。 【００１２】モノクローナル抗体選択／特徴付け モノクローナル抗体の重要な特徴付けは（１）これらの
免疫グロブリンクラス、（２）ヒト乳癌細胞に対するこ
れらの選択性及びこれらが結合するヒト乳癌細胞の範
囲、及び（３）効果的な抗−ヒト乳癌イムノトキシンを
製造する場合のその有用性である。 【００１３】与えられた抗体の選択性及び範囲は、
（１）ヒト乳癌組織及び細胞並びに（２）***及び他の
由来の正常なヒト組織又は細胞のパネルに対してそれを
試験することにより決定される。請求の範囲に記載され
ている抗体の選択において、約２２０００個の増殖ハイ
ブリドーマ培養物をまず、免疫乳癌膜又はセルライン、
８種類の正常組織膜のパネル、線維芽細胞セルライン及
び乳癌腫瘍凍結切片に対してスクリーニングした。 【００１４】新生物材料と反応するが正常な材料と反応
しないクローンをこの最初のスクリーニングにおいて同
定し、そしてアイソタイプの決定並びに選択性及び範囲
についての追加のスクリーニングにより選択した。追加
のスクリーニングは、１６個の正常組織切片、５種類の
正常血球型、１１個の非***新生物切片、２１個の乳癌
切片及び１４個の乳癌セルラインを用いる。抗体が約１
／３未満の正常組織及び血球タイプと強く結合すれば、
それらが乳癌に選択的に結合すると認められた。１２７
の抗体を精製し、そして追加のスクリーニングにおいて
試験した。 【００１５】許容し得る選択性及び範囲を示す抗体を、
カップリング剤としてＮ−サクシニミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）又はイミ
ノチオラン（ＩＴ）を用いてリシンＡ鎖に複合体化し
た。この複合体を２４時間組織培養測定においてＭＣＦ
−７，ＣＡＭＡ−１，ＳＫＢＲ−３、及びＢＴ−２０細
胞に対して試験した。 【００１６】１６種類の抗体が、これらの乳癌系の少な
くとも１つに対して許容し得るイムノトキシン活性（１
０nMより小さいＴＣＩＤ５０％）を示した。この１６種
類の内の７種類が同じ２１０，０００ダルトンの抗原を
認識し、７種類の内の６種類がおそらく同じエピトープ
を認識するが親和性において異ることが見出された。こ
れらの抗体の一層詳細な特徴付けが下記の例において与
えられる。 【００１７】免疫化学物質 最も重要なこの発明のモノクローナル抗体の免疫化学的
誘導体はイムノトキシン（抗体と細胞性毒素との複合
体）及びラベルされた（例えば、放射性ラベルされた、
酵素ラベルされた、又はフルオロクロームラベルされ
た）誘導体（この誘導体中でラベルはラベルされた抗体
を含有する免疫複合体を同定するための手段を提供す
る）である。 【００１８】イムノトキシンの細胞毒成分は、細胞毒性
剤、細菌もしくは植物起原の酵素的に活性な毒素、又は
これらの毒素の酵素的に活性な断片（ "Ａ鎖" ）であ
る。酵素的に活性な毒素及びその断片が好ましく、そし
てジフテリア毒素の非結合性活性断片であるジフテリア
Ａ鎖、エキソトキシンＡ鎖〔シュードモナス・アエルギ
ノーサ（Pseudomonas aeruginosa）から〕、リシンＡ
鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファーサルシ
ン、アレウリテス・フォルディー（Aleurites fordii）
蛋白質、ジアンチン蛋白質、フィトラッカ・アメリカナ
（Phytolacca americana）蛋白質（ＰＡＰＩ，ＰＡＰII
及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランチァ（momord
ica charantia)阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン
（crotin）、サポナリア・オフィシナリス（saponaria
officinalis ）阻害剤、ゲロニン（gelonin)、ミトゲリ
ン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictoci
n）、フェノマイシン、及びエノマイシンにより例示さ
れる。 【００１９】リシンＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活
性断片、アルビンＡ鎖、及びＰＡＰIIが好ましい。モノ
クローナル抗体とこれらの細胞毒性成分との複合体は種
々の２官能蛋白質カップリング剤を用いて調製すること
ができる。このような試薬の例はＳＰＤＰ，ＩＴ、イミ
ドエステルの２官能誘導体、例えばジメチルアジピミデ
ート・ＨＣｌ、活性エステル、例えばジサクシニミジル
スベレート、アルデヒド、例えばグルタルデヒド、ビス
−アジド化合物、例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）
ヘキサンジアミン、ビス−ジアゾニウム誘導体、例えば
ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジア
ミン、ジイソシアネート、例えばトルエン２，６−ジイ
ソシアネート、及びビス−活性弗素化合物、例えば１，
５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンである。 【００２０】診断の目的でヒト乳癌細胞をイン−ビトロ
で殺すために使用する場合、典型的には複合体が約１０
nM以上の濃度において細胞培養培地に加えられる。イン
−ビトロで使用するための適用の剤形及び方法は臨界的
ではない。培地又は灌流媒体との相溶性剤が一般に使用
されよう。細胞毒性を常用技法により読み取ることによ
って乳癌の存在又は程度を決定することができる。 【００２１】療法のためにイン−ビボで使用される場
合、イムノトキシンは療法的有効量（すなわち、患者の
腫瘍負担を除去し又は軽減する量）において患者に投与
される。これらは一般に、非経腸的に、好ましくは静脈
内に投与される。投与量及び投与方法は癌の性質（一次
癌又は転移癌）及びその集団、特定のイムノトキシンの
特徴、例えばその治療係数、患者、並びに患者の病歴に
依存するであろう。投与されるイムノトキシンの量は典
型的には約０．１〜約１０mg／kg患者体重であろう。 【００２２】非経腸的投与のためには、イムノトキシン
は医薬として許容される非経腸担体と共に単位投与注射
形（溶液、懸濁液、乳濁液）として製剤化されるであろ
う。これらの担体は本来的に非毒性でありそして非療法
的である。このような担体の例は水、塩溶液、リンゲル
溶液、グルコース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンで
ある。 【００２３】非水性担体、例えば不揮発油及びオレイン
酸エチルを使用することもできる。担体としてリポゾー
ムを使用することもできる。担体は微量の添加剤、例え
ば等張性及び化学的安定性を増強するための物質、例え
ば緩衝剤及び防腐剤を含有することができる。イムノト
キシンは、典型的にはこれらの担体中に約１mg／ml〜１
０mg／mlの濃度で製剤化される。 【００２４】乳癌を処置するための細胞毒性放射性医薬
は、高線エネルギー移動（ＬＥＴ）放射性同位元素（例
えば、Ｙ，Ｐｒ）を抗体に結合することによって製造さ
れる。この明細書において使用される "細胞毒性成分"
なる語はこのような同位元素を包含することが意図され
る。 【００２５】抗体のラベルされた部分を作るために使用
されるラベルは、直接検出され得る成分、例えば蛍光色
素及び放射性ラベル、並びに検出されるために誘導体化
されなければならない成分、例えば酵素を包含する。こ
のようなラベルの例は32Ｐ，125Ｉ， 3Ｈ，14Ｃ、フル
オレッセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導
体、ダンシル、ウンベリフェロン、レシフェロン、２，
３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュパ
ーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、リゾチー
ム、及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼである。 【００２６】抗体を、これらのラベルにより公知の方法
で標識することができる。例えば、カップリング剤、例
えばアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミ
デート、サクシンイミド、ビス−ジアゾ化ベンザジン及
びこれらに類似するものを使用して抗体を上記の蛍光ラ
ベル、化学発光ラベル、及び酵素ラベルにより標識する
ことができる。 【００２７】抗体及びラベルされた抗体をイムノイメー
ジング法又はイムノアッセイ法において使用して、患者
における乳癌の存在を検出し、又はそれを有することが
すでに診断されている患者におけるそのような癌の状態
をモニターすることができる。癌の状態をモニターする
場合、定量的イムノアッセイ法を用いなければならな
い。 【００２８】このようなモニターにおいては測定は定期
的に行われ、そしてその結果を比較して患者の腫瘍負荷
が増加したか減少したかが決定される。使用することが
できる一般的測定技法には直接測定及び間接測定が含ま
れる。直接測定は患者からの組織サンプル又は細胞をラ
ベルされた抗体と共にインキュベートすることを含む。
サンプルが乳癌細胞を含むなら、ラベルされた抗体はそ
れらの細胞に結合するであろう。 【００２９】組織又は細胞を洗浄して未結合ラベル化抗
体を除去した後、組織サンプルをラベルされた免疫複合
体の存在について読み取る。間接測定においては、組織
又は細胞サンプルをラベルされていないモノクローナル
抗体と共にインキュベートする。次に、該モノクローナ
ル抗体に対するラベル化抗体（例えば、ラベルされた抗
ネズミ抗体）で処理し、洗浄し、そしてラベルされた三
次元複合体の存在について読み取る。 【００３０】診断的用途のためには、抗体は典型的には
キットの形で分配される。これらのキットは典型的に
は、適当な容器中ラベル化又は非ラベル化形の抗体、イ
ンキュベーション又は洗浄のための試験、キットが間接
測定形であればラベルされていない抗ネズミ抗体、並び
にラベルの性質に依存して基質及び誘導体化剤を含んで
成る。ヒト乳癌抗原対照及び指示書も含めることができ
る。次の例により、この発明の代表的モノクローナル抗
体の調製、特徴及び使用を詳細に記載する。これらの例
は、この発明に限定を加えることをなんら意図するもの
ではない。 【００３１】免疫感作 新しく外科摘出したヒト乳癌組織及び種々の正常組織を
用いて、ホモジナイズ及び非連続的シュークロースグラ
ジェント遠心により膜抽出物を調製した。ヒト乳癌セル
ラインをブレスト・キャンサー・タスク・フォース（Br
east Cancer Task Force）、アメリカン・タイプ、カル
チュアー・コレクション（ＡＴＣＣ）、及びメモリアル
・スローン・ケッタリングの Jargen Fogh博士から得
た。 【００３２】ブレスト・キャンサー・タスク・フォー
ス、ＡＴＣＣ、及びFogh博士により推奨されるようにし
て細胞を維持しそして継代した。免疫感作のため、１０
０μｇ（Lowry 測定) の蛋白質を含有する膜抽出物又は
一千万個の生乳癌細胞を５週令のＢａｌｂ／ｃマウスに
腹腔内投与した。マウスを１箇月間隔で同様に２回追加
免疫した。最後の追加免疫の３日後、細胞融合のため脾
臓を摘出した。 【００３３】ハイブリドーマ法 ネズミ骨髄腫系Ｓｐ−２／０−Ａｇ１４を用いてBuck,
D. W. 等の方法により体細胞ハイブリドを調製した。す
べてのハイブリドーマセルラインは限界稀釈法によりク
ローン化した。融合の半分は乳癌膜抽出物により免疫感
作したマウスからの脾細胞を用い、そして半分は乳癌セ
ルラインにより免疫感作したマウスからの脾細胞を用い
た。これらの融合から８３４２４個のウエルが設けら
れ、この内２２，４５９個がハイブリドーマの増殖を示
した。 【００３４】スクリーニング法 ハイブリドーマ上清を、免疫感作用乳癌膜抽出物を用い
る固相エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により又は免疫感作用乳癌セルラインを
用いる間接イムノフルオレッセンスアッセイにより、反
応性抗体について測定した。固相膜ＥＬＩＳＡのため、
４０μｌの０．１mg／ml乳癌膜蛋白質をポリ塩化ビニル
（ＰＶＣ）ミクロタイターウエルに４℃にて１２時間置
いた。 【００３５】抽出物を吸引し、そして１％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢ
Ｓ）によりウエルを洗浄した。次に、ウエルを１：１０
稀釈のハイブリダーマ上清４５μｌと共にインキュベー
トした。稀釈剤は、２５mMの緩衝剤、１０％ウシ血清及
び０．１％ナトリウムアジドから成る媒体であった。室
温にて３０分間置いた後、ウエルを再度洗浄し、そして
１：２００稀釈のパーオキシダーゼ接合ヤギ抗−マウス
ＩｇＧと共にインキュベートした。 【００３６】稀釈剤はＰＢＳであった。次にウエルをＰ
ＢＳで洗浄し、そして０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝
液（pH４．２）中２，２−アジノ−ジ（３−エチルベン
ズチアゾリンスルホン酸２００μｌと反応せしめた。ミ
クロエリサリーダー上で４０５nmにおける光学濃度を測
定した。各実験において、陽性対象である抗−β２ミク
ログロブリン５μｇ／mlを正常ヒト腎臓膜と反応せしめ
た。これは１．０±０．１（標準偏差）の光学濃度を与
えた。バックグラウンドは、マウスモノクローナル抗体
を含まない媒体を用いて０±０．１光学濃度単位（O.D)
であった。乳癌膜抽出物に対して０．７O.D より大きな
反応をもたらすウエルを保持した。 【００３７】間接イムノフルオレセンスセルラインアッ
セイのため、免疫感作用セルラインの１０万個の乳癌細
胞を、１セットの８チャンバースライドの各チャンバー
に入れた。同様にして、セルラインＣＣ９５からの１０
万個の線維芽細胞をチャンバーを有するスライドウエル
中で一夜インキュベートした。１％ＢＳＡを含有するＰ
ＢＳにより細胞を洗浄した。 【００３８】乳癌及び線維芽細胞の両者のウエルを、
１：１０稀釈のハイブリドーマ上清と共に４℃にて３０
分間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、そして
１：５０稀釈のフルオレッセインイソチオシアナート
（ＦＩＴＣ）−接合ヤギＦ（ａｂ′）2 抗−マウスＩｇ
と共に４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を３
回洗浄し、ＰＢＳ中１．５％ホルムアルデヒド中で固定
し、チャンバーを取り出し、そしてＰＢＳ中ですすい
だ。 【００３９】次に、スライドを、ポリビニルアルコー
ル、グリセリン、緩衝剤及び防腐剤を含有する組成物中
に配置し、そして蛍光顕微鏡により試験した。乳癌細胞
への強い蛍光結合を示すが線維芽細胞への蛍光結合を示
さないハイブリドーマウエルを保持した。５１５６個の
ハイブリドーマウエルが最初のスクリーニングにおいて
乳癌反応性を示した。 【００４０】次に、５１５６個の陽性ウエルからの上清
を、８種類の正常組織（肝臓、肺、結腸、胃、腎臓、扁
桃腺、脾臓及び膵臓）膜抽出物を用いる固相ＥＬＩＳＡ
において試験した。０．３より大きなＥＬＩＳＡ−Ｏ．
Ｄ．をもたらすすべてのウエルを廃棄した。１１０１個
の上清が正常組織抽出物と反応しないことが見出され
た。 【００４１】１１０１個のハイブリドーマ上清をヒト乳
癌組織の凍結切断に対して試験した。６ミクロンの切片
をスライドに付着させ、４℃にてアセトン中で１０分間
固定し、室温にて１０分間乾燥し、ＰＢＳで洗浄し、ウ
マ血清でブロックし、そして２００μｌの未稀釈のハイ
ブリドーマ上清と共に室温にて２０分間インキュベート
した。 【００４２】スライドをＰＢＳで洗浄し、そして最後に
３７℃にて２０分間、１：５０稀釈のパーオキシダーゼ
接合ラビット抗マウスＩｇと共にインキュベートし、Ｐ
ＢＳで再び洗浄し、そして最後に３７℃にて７．５分間
０．０１％過酸化水素を含有する０．０５ＭTris緩衝液
（pH７．２）中０．５mg／ｌジアミノベンジジンと共に
インキュベートした。スライドをヘマトキシリンで染色
し、脱水し、そして３５．９％メチル／ｎ−ブチルメタ
クリレートコポリマー、７．１％ブチルベンジルフタレ
ート及び０．３％２，６−ジtertブチル−ｐ−クレゾー
ルを含有する媒体中においた。１２４ウエルが乳癌選択
的結合をもたらし、そしてクローン化された。 【００４３】精製及びクラス決定 モノクローナル乳癌選択的抗体の免疫グロブリンクラス
及びサブクラスを決定した。次に、さらに、２〜３×１
０6 ハイブリドーマ細胞を０．２μＣｉ35Ｓメチオニン
を含有するメチオニン不含培地中で４時間増殖せしめる
ことにより抗体を内部的にラベルした。 【００４４】35Ｓ−ラベル抗体を固定されたスタフィロ
コッカスＡ細胞と、又はラビット抗−マウス免疫グロブ
リンによりプレコートされたスタフィロコッカスＡ細胞
を固定するために使用される組成物と免疫沈澱せしめ、
そしてこの免疫沈澱をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して
抗体ライト及びヘビー鎖の移動度、余分の鎖の欠落、並
びにスタフィロコッカスプロテインＡと結合する各抗体
の能力を決定した。 【００４５】抗体をイン−ビトロで拡張した。Ｂａｌｂ
／ｃ又はＦ１（Ｃ５７Ｂ／６×Ｂａｌｂ／ｃ）マウスに
０．５mlのプリスタンを腹腔内（ｉｐ）注入し、そして
１０〜１４日後ＰＢＳ中１００万個の対数期ハイブリド
ーマ細胞を接種した、腹水を−７０℃に貯蔵し、そして
解凍し、そしてさらに精製する前に０．８ミクロンフィ
ルターユニットを通して濾過した。 【００４６】スタフィロコッカスプロテインＡと結合す
るＩｇＧ抗体を、アガロース、デキストラン及び／又は
アクリルアミドを含有するプロテインＡ−クロマトグラ
フ樹脂上での、pH段階グラジエント溶出を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製した。プロテイ
ンＡを結合しなかったＩｇＧ抗体を、０℃にて４０％飽
和に硫酸アンモニウムを加えることにより沈澱せしめ
た。 【００４７】沈澱をＰＢＳ中に再溶解し、２０mMTris
（pH７．２）に透析し、そしてジエチルアミノエチルセ
ルロース（ＤＥＡＥ）の１．６×５０cmカラム上で、
１．５ｌの０〜６００mMＮａＣｌグラジエントにより４
℃にて１ml／分の流速で溶出することによりクロマトグ
ラフ処理した。各場合において、カラム画分をＳＤＳ−
ＰＡＧＥによりモニターし、最純抗体画分を一緒にし、
１〜３mg／mlに濃縮し、ＰＢＳ／０．０２％ＮａＮ3 に
透析し、そして４℃に貯蔵した。 【００４８】ＩｇＭ抗体を、アガロース、デキストラン
及び／又はアクリルアミドを含有するクロマトグラフ樹
脂の２．６×４０cmカラム上でのゲル濾過により、室
温、１ml／分の流速にてＰＢＳ／０．０１％ナトリウム
アジドで溶出することにより精製した。 【００４９】選択性決定 乳癌に対するこれらの選択性を評価するため、精製され
た抗体を、１６個の正常組織の切片に対する免疫パーオ
キシダーゼ切片により、及び５個の血球型に対する免疫
蛍光細胞ソーティングにより試験した。イムノパーオキ
シダーゼ染色は上記のようにして行ったが、但しハイブ
リドーマ上清の代りに、１〜４０μｇ／mlの範囲で、Ｐ
ＢＳ中の精製抗体の既知の稀釈を用いた。 【００５０】純粋な抗体をまず力価検定し、乳癌切断に
対して強いイムノパーオキシダーゼ染色をもたらす最小
濃度を見出し、そして次に正常組織試験のためにその濃
度で使用した。末梢血細胞（血小板、リンパ球、赤血
球、顆粒球、及び単球）を、多形核白血球から単球を分
離する媒体を用いて遠心により調製した。細胞を、上記
のようにして決定した最適濃度において、４℃にて３０
分間抗体と反応せしめ、洗浄し、１：５０稀釈の蛍光イ
ソチオシアナート−複合ヤギ抗−マウスＩｇと４℃にて
３０分間反応せしめ、再び洗浄し、そしてセルソーター
中で試験した。 【００５１】洗浄緩衝液及び稀釈剤は１％ゼラチン及び
０．０２％ナトリウムアジドを含むＰＢＳであった。セ
ルソーターは、７６ミクロンのノズル、及び１ワットの
４８８nmアルゴンイオンレーザーを装着していた。焦点
を合わせるため、光学レール装置上に８mmの共焦レンズ
を使用した。他の使用フィルターは５１５nm干渉フィル
ター及び５１５nm吸収フィルター（散乱レーザー光のた
め）及び前方角光散乱のため中間濃度１．５フィルター
であった。フルオレッセイン蛍光の対数対前方角光散乱
の概略プロットをサンプル分析のために使用した。 【００５２】本発明のハイブリドーマにより生産される
抗体の結合挙動を下記の表１に報告する。表 １ 正常組織切片への抗体の結合 組 織 抗 体 膵 臓 食 道 肺 腎 臓 結 腸 胃 脳 扁桃腺 33F8 0 2E 0 1T 0 0 0 1Ly 113F1 2Ac 2E 0 0 0 2G 0 1E 245E7 1L 0 1A,M 0 0 2L 0 1E 2G3 2Ac 2E 1A 2T 0 1L 0 1E 260F9 1Ac 2E 0 1T 0 1G 0 2E 280D11 0 1E 0 2T,2B 1L 2L 0 0 266B2 1Ac,1D 2E 0 1T 0 0 0 2E 454C11 1D 1-2E 0 1T 0 0 0 1E 317G5 1Ac,I 0 0 2T 1G 0 0 0 520C9 0 0 0 1T 0 0 0 0 452F2 0 0 0 0 0 0 0 0 369F10 0 0 0 0 0 1G 0 0 736G9 0 0 0 0 0 0 0 0 741F8 0 0 0 0 0 0 0 0 758G5 0 0 0 1T 0 0 0 0 761B10 0 0 0 1T 0 0 0 0 【００５３】抗 体 肝 臓 心 臓 卵 巣 皮 膚 乳 房 骨 子 宮 膀 胱 33F8 0 0 0 1W 0 1Mk 1L 1E 113F1 0 0 0 0 0 0 0 1E 245E7 0 0 0 2S 2L 0 2L 1E 2G3 0 0 0 0 2E 0 2L 2E 260F9 2D 0 0 2E,2H 2E 0 1L 2E 280D11 2D 0 0 1E,1H 2L 2Gr 2G 0 266B2 0 0 0 2E,2W 1E 0 0 1E 454C11 1D 0 0 1E,H 1E 0 1G 1E 317G5 2D 0 0 0 0 0 1G 0 520C9 0 0 0 0 0 0 0 0 452F2 0 0 0 0 0 0 0 0 369F10 0 0 0 1S 0 0 0 0 736G9 0 0 0 0 0 0 0 0 741F8 0 0 0 0 0 0 0 0 758G5 0 0 0 0 0 0 0 761B10 0 0 0 0 0 0 0 【００５４】染色強度：２＝強；１＝弱；０＝陰性。 Ａ＝中隔細胞；Ａｃ＝腺房；Ｂ＝ボーマンのう；Ｄ＝
管；Ｅ＝表皮；Ｇ＝腺；Ｇｒ＝顆粒球；Ｈ＝毛包；Ｉ＝
島；Ｌ＝管腔士尖端細胞質；Ｌｙ＝リンパ球；Ｍ＝マク
ロファージ；Ｍｋ＝メガコニオサイト；Ｍｙ＝ミエリ
ン；Ｓ＝皮脂；Ｓｔ＝間質；Ｔ＝細管；Ｕ＝糸球体；Ｗ
＝汗腺。 血小板、赤血球、リンパ球、単球又は顆粒球に対する結
合は存在せず、但し２８０Ｄ１１は顆粒球と弱く結合す
る。いずれの抗体も線維芽細胞と結合しない。 【００５５】範囲決定 いかなる範囲の乳癌が各抗体によって認識されるかを決
定するため、乳癌選択的抗体を、２７個の異る乳癌の凍
結切片に対するイムノパーオキシダーゼ染色により試験
した。切片染色のために使用された乳癌はすべて浸潤腺
管内癌であり、従って、抗体結合と乳癌の組識学的タイ
プの関連はなされ得なかった。さらに、抗体結合と結節
状態又はエストロゲン受容体状態との間の関連も、提供
者の情報が得られる１２の癌について見出されなかっ
た。抗体は、転移乳癌及び原発性乳癌のウエルと同様に
反応した。請求の範囲に記載されている抗体についての
これらの試験の結果を下記の表２に報告する。 【００５６】表 ２ 乳癌組織切片に対する抗体の結合* 乳 癌 抗 体 LA KA JA IA HA GA Ｅ EA TA UA RA SA Ｏ 2G3 1 2 1 2 2 2 ND 2 2 2 2 2 2 33F8 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 113F1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 245E7 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 260F9 0 1 0 1 0 1 ND 1 2 0 0 0 1 280D11 2 2 0 1 2 1 ND 1 1 0 1 0 1 266B2 1 2 0 1 0 1 ND 0 2 1 1 0 1 454C11 1 2 0 2 1 1 ND 2 1 1 0 0 ND 317G5 1 ND 0 0 1 ND ND 0 0 0 1 1 ND 520C9 0 ND 0 2 0 ND ND 2 0 1 0 0 ND 452F2 0 2 0 2 0 0 ND 1 0 1 0 0 ND 369F10 2 2 2 2 0 1 ND 1 0 1 1 2 2 736G9 2 ND 0 2 0 ND ND 1 0 1 0 0 ND 741F8 0 ND 0 2 0 ND ND 2 0 1 0 0 0 758G5 1 ND 0 0 0 ND ND 2 0 1 0 0 ND 761B10 1 ND 0 2 0 ND ND 2 0 1 0 0 ND 【００５７】抗 体 Ｒ MA BA NA FA LMA LME MBA Ｚ YA KB OB 2G3 2 1 2 2 2 2 2 2 2 33F8 0 0 0 0 0 0 0 0 ND 113F1 0 0 0 0 0 0 0 0 ND 245E7 2 2 2 2 2 2 2 2 ND 260F9 0 0 1 1 1 0 1 1 0 280D11 1 1 1 0 1 1 1 1 1 266B2 0 1 1 2 1 0 1 1 1 454C11 0 2 0 0 1 0 1 1 ND 317G5 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 520C9 0 2 0 1 0 0 0 0 0 452F2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 369F10 0 0 2 2 2 2 2 2 1 736G9 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 741F8 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 758G5 0 2 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 761B10 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 【００５８】＊染色強度：２＝強；１＝弱；０＝陰性；
ＮＤ＝決定せず。 抗体をさらに、１４の乳癌セルラインに対するセルライ
ン免疫螢光測定により、乳癌認識の範囲について評価し
た。下記の表３は、請求の範囲に記載されている抗体に
ついてこれらの試験の結果を報告する。 【００５９】表 ３ 乳癌セルラインに対する抗体の結合* セルライン 抗 体 SKBr3 BT483 MCF7 BT20 ZR751 MDAMB231 CAMA1 2G3 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 33F8 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 113F1 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 245E7 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 260F9 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 280D11 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 266B2 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 454C11 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 317G5 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 520C9 ＋ ＋ − − − NT ＋ 452F2 ＋ ＋ − − ＋ NT ＋ 369F10 − ＋ − − − − ＋ 736G9 ＋ ＋ − NT NT NT ＋ 741F8 ＋ ＋ − NT NT NT ＋ 758G5 ＋ ＋ − NT NT NT − 761B10 ＋ ＋ − NT NT NT − 【００６０】抗 体 ALAB BT549 BT474 T47D MDAMB157 MDAMB330 ZR7530 2G3 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 33F8 ＋ ＋ ＋ − ＋ ＋ − 113F1 − − ＋ ＋ ＋ ＋ − 245E7 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 260F9 ＋ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 280D11 − ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 266B2 − − ＋ ＋ − ＋ ＋ 454C11 ＋ − NT − NT NT ＋ 317G5 ＋ − NT ＋ ＋ − ＋ 520C9 NT − NT − NT NT ＋ 452F2 ＋ − NT − NT NT ＋ 369F10 − − NT − NT NT − 736G9 NT − NT ＋ NT NT ＋ 741F8 NT − NT ＋ NT NT ＋ 758G5 NT − NT − NT NT ＋ 761B10 NT − − NT ＋ NT ＋ 【００６１】＊セルライン結合：＋＝陽性；−＝陰性；
ＮＴ＝試験せず。 最後に、抗体を１１の非***性癌に対するイムノパーオ
キシダーゼ染色により試験した。請求の範囲に記載され
ている抗体についての結果を下記の表４に報告する。 【００６２】表 ４ 癌に対する抗体の結合* 癌 抗 体 結 腸 肺 前立線 膵 臓 子 宮 リンパ腫 2G3 ２ ０ ２ ０ ２ ０ 33F8 ０ １ ０ ０ １ ０ 113F1 ０ ２ ０ ２ １ ２ 245E7 ０ ２ ２ ２ ２ ２ 260F9 ０ ０ １ １ １ ０ 266B2 ０ １ １ １ １ ０ 280D11 ０ ０ １ １ １ ２ 454C11 ０ ０ １ １ ２ ０ 317G5 １ １ ０ ０ １ ０ 520C9 ０ １ １ １ １ ０ 452F2 ０ ０ ０ ０ ０ ０ 369F10 ０ １ １ １ ０ ０ 736G9 ０ ０ ０ ０ ０ ０ 741F8 ０ ０ ０ ０ ０ ０ 758G5 ０ １ ０ ０ ０ ０ 761B10 ０ ０ ０ ０ ０ ０ 【００６３】抗 体 胃 膀 胱 食 道 黒色腫 卵 巣 2G3 ２ ０ ０ ２ ２ 33F8 ０ ０ ０ ０ １ 113F1 ２ ０ １ ０ ０ 245E7 ０ ０ ０ ０ ２ 260F9 ０ ０ １ ０ ２ 266B2 １ ０ １ ０ １ 280D11 ０ ０ ０ ０ ２ 454C11 ０ ０ ０ ０ １ 317G5 ０ ０ ０ ０ ０ 520C9 ０ ０ ０ ０ ０ 452F2 ０ ０ ０ ０ ０ 369F10 ０ ０ ０ ０ ２ 736G9 ０ ０ ０ ０ ０ 741F8 ０ ０ ０ ０ ０ 758G5 ０ ０ ０ ０ ０ 761B10 ０ ０ ０ ０ ０ ＊染色強度：２＝強；１＝弱；０＝陰性。各タイプの１種類の癌のみを試験した 。 【００６４】細胞毒性の評価 Carlsson, J.等、バイオケミカル・ジャーナル（Bioche
m. J.)（１９７８）１７３：７２３−７３７に記載され
ているようにしてＳＰＤＰにより、又はイミノチオラン
（ＩＴ）により処理されたリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）
に、請求の範囲に記載されている抗体を複合体化せしめ
た。 【００６５】ＳＰＤＰ複合体形成 ＳＰＤＰ（エタノール中２０mM）を２０倍モル過剰にお
いて抗体に加え、そして室温にて３０分間インキュベー
トした後、未反応ＳＰＤＰをＰＢＳに対する透析により
除去した。誘導体化の程度を、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）による還元の後３４３nmにおいてピリジン−２−
チオンの放出を測定することにより決定した。抗体に依
存して３〜８個のリジンアミノ酸基（抗体分子当り）が
ピリジル−ジスルフィド誘導体に転換された。 【００６６】ＳＰＤＰで処理された抗体をＲＴＡと複合
体化した。複合体形成の直前にＲＴＡを５０mM ＤＴＴ
で還元し、次にアガロース、デキストラン及び／又はア
クリルアミドを含有するクロマトグラフ樹脂のカラム上
で脱塩して蛋白質からＤＴＴを除去した。還元されたＲ
ＴＡを３〜５倍モル過剰のピリジルジスルフィド抗体に
加えた。典型的な反応混合物（１ml）は７μＭ抗体及び
３０μＭ ＲＴＡから成る。 【００６７】反応を４℃にて一夜進行させた。抗体への
ＲＴＡの複合体形成の程度を、ピリジン−２−チオンの
方法を測定することにより分光光度計により決定した。
平均して、複合体は抗体分子当り２〜３個のＲＴＡ分子
を含有する。このことは非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
（７．５％）により確認され、このゲルはさらに、典型
的な複合体調製物が１０％〜３０％の遊離抗体を含有す
ることを示した。 【００６８】複合体混合物をＨＰＬＣサイズ排除カラム
上でクロマトグラフ処理して残留未反応ＲＴＡから複合
体を分離した。カラムを０．１Ｍ硫酸ナトリウム／０．
０２Ｍリン酸ナトリウム（pH６．８）中で平衡化した。
複合体混合物（０．７ml）を注入し、次に１ml／分の流
速でクロマトグラフ処理した（室温）。０．５mlの画分
を集め、そしてピーク複合体画分をプールし、そして細
胞毒性試験の前に濾過除菌した。 【００６９】イミノチオラン複合体 ０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ
（pH８．０）（以後Ｐ−ＥＤＴＡ緩衝液と称する）を約
３０mg／mlの抗体を室温にて約１５分間にわたり１mM
５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴ
ＮＢ）と反応せしめ、そして次に氷浴中で０℃に冷却す
る。この溶液に、２．５ＩＴ分子／抗体分子とするのに
十分なＩＴを加え、そして得られた溶液を０〜５℃にて
約２４時間貯蔵する。次に、これを０〜５℃にて３００
倍過剰容積のＰ−ＥＤＴＡ緩衝液に対して透析する。 【００７０】１mM ＤＴＴを含有するＰ−ＥＤＴＡ中に
正常に貯蔵されたＲＴＡを限外濾過して１０〜１５mg／
mlの濃度とし、そして０〜５℃にて３００倍過剰容積の
Ｐ−ＥＤＴＡに対して透析する。十分なＲＴＡを誘導体
化された抗体に加えて、１．０〜１．２のＲＴＡ上遊離
チオール／誘導体化抗体上ブロックされたチオールとす
る。この混合物を室温にて２時間インキュベートする。 【００７１】カップリング反応混合物を、固体支持体に
留められた青色色素を基礎とするクロマトグラフ樹脂の
カラムに適用し、次にこの混合物を室温にてＰ−ＥＤＴ
Ａにより溶出する。カラムの大きさを、出発抗体mg当り
約２mlのベッドボリウムを含むようにする。未複合体化
抗体の最初のピークがカラムから溶出した後、溶離液を
１Ｍ ＮａＣｌ含有Ｐ−ＥＤＴＡに切り換える。 【００７２】この緩衝液において、免疫複合体及び未反
応ＲＴＡが非常にシャープなピークとして溶出する。こ
れをプールし、そして１０倍過剰容積の０．１５Ｍリン
酸ナトリウム（pH７．１）（以後、Ｐｉ緩衝液と称す
る）に対して０〜５℃にて透析する。透析された蛋白質
を０〜５℃にてゲルのカラムに適用し、そし６cm／時の
流速にて緩衝液により溶出する。 【００７３】カラムの大きさを、少なくとも２５mlのベ
ッドボリウム／mlの適用蛋白質を含むようにする。免疫
複合体は単一ピークとして排除容積のわずかに後に溶出
し、これはこれに続く２量体化及び単量体ＲＴＡのピー
クからベースライン分離される。一緒にした免疫複合体
ピークを３５psi にて限外濾過し、５．０mg／mlの最終
濃度としそして濾過除菌する。細胞毒性試験 【００７４】この細胞毒性試験において使用された試験
ヒト乳癌系はＭＣＦ−７，ＣＡＭＡ−１，ＳＫＢＲ−
３、及びＢＴ−２０であった。ヒト線維芽細胞セルライ
ンＣＣ９５及びＷＩ−３８を陰性対照として使用した。
１mlの培地中４００００個の試験細胞を、１セットの８
mlガラスバイアルに加え、そして次に複合体稀釈物（１
００μｇ／mlのＢＳＡ含有ＰＢＳ中）を加えた。３７℃
にて２２時間インキュベートした後、培地を吸引し、単
層をＰＢＳで洗浄し、そして35Ｓメチオニンを補充した
メチオニン不含培地を加えた。 【００７５】バイアルをさらに３７℃にて２時間インキ
ュベートし、培地を除去し、そして細胞を、１mg／mlの
メチオニンを含有する１０％トリクロロ酢酸２mlにより
２回洗浄した。細胞を乾燥し、シンチレーション溶液を
加え、そしてシンチレーションカウンター中で放射能を
測定した。細胞毒性を、対照（未処理）蛋白質合成の５
０％をもたらす複合体の組織培養阻害量（ＴＣＩＤ５０
％）として表示した。これらの細胞毒性試験の結果を下
記の表５中に報告する。 【００７６】表 ５ 乳癌イムノトキシンの細胞毒性〔ＴＣＩＤ５０％（nM）〕 RTA複合体 アイソタイプ MCF-7 CAMA-1 SKBR-3 BT-20 CC95 WI-38 260F9 G1 0.1 0.4 0.06 9 >50 >50 317G5 G1 0.4 5 10 2 >50 >50 113F1 G3 0.5 0.6 10 6 >50 >50 2G3 G1 0.8 1 >50 15 >50 ND 266B2 G1 1 5 0.5 10 >50 ND 280D11 G1 1 1 0.9 >40 >50 >50 245E7 G1 6 8 8 4 >50 >50 454C11 G2a 6 >20 0.3 30 >50 >50 33F8 G1 10 ND ND ND - ND -ND 369F10 M 10 ND ND ND ND ND 520C9 G1 >50 >50 10 >50 452F2 G1 20 10 736G9 G1 >50 >50 1.3 >50 741F8 G1 >80 >80 >80 758G5 G1 >50 0.3 761B10 G1 >50 1.0 ＮＤ＝決定されず。 【００７７】複合体のイン−ビボ試験 ２４５Ｅ７，２８０Ｄ１１、及び２６０Ｆ９とＲＴＡと
の複合体を、カップリング剤としてイミノチオラン又は
ＳＰＤＰを用いて上記のようにして製造した。ＸＭ−１
ヒト乳癌細胞に対するこれらの複合体のイン−ビボ効果
を下記のようにして評価した。 【００７８】雌性無胸腺Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウ
ス（２０〜２４ｇ）を用いた。中心壊死の兆候を有しな
い６００〜８００mm3 の腫瘍から１．０mm3 の断片を得
た。マウスに０．０５mlの懸濁液を中外側穿刺により腋
領域にｓ．ｃ移植した。移植の７日又は１４日後、マウ
スの重量を測定し、そしてその腫瘍負荷をキャリパスを
用いて移植片を測定することにより評価した。 【００７９】対照マウスＱ２Ｄ×６の尾静脈に複合体を
ｉ．ｖ．注射して特定の複合体の最大許容投与量を決定
した。これらの結果に基いて、腫瘍担持マウスに複合体
を投与するための投与量方法を選択した。腫瘍担持マウ
ス群及び対照マウス群に、前記選択された投与量・方法
に従って複合体を注射した。動物反応、副作用、及び死
亡率を腫瘍体積及び動物体重の測定と共に毎日モニター
した。試験期間の終りにおける腫瘍体積の変化を、試験
期間にわたる測定の全体の平均に基いて算出した。これ
らの試験の結果を下記の表６に報告する。 【００８０】表 ６ 複 合 体 ＬＤ50（μｇ／ｍ） 投与量／スケジュール 245E7-SPDP-RTA ４１０ 125μｇ iv/qod×６ 245E7-IT-RTA ３５０ 200μｇ iv/qod×５ 280D11-IT-RTA ３５０ 200μｇ iv/qod×５ 200μｇ iv/qod×４ 260F9-IT-RTA ４００ 200μｇ iv/qod×５ 100μｇ iv/qod×３−４ 245E7-IT-RTA 200μｇ iv/qod×５＋280D11-IT-RTA(カクテル） 【００８１】 腫 瘍 齢／体積 ％ ＭＸ１− ＦＢＷ 複 合 体 (6〜10マウス／群） 腫瘍増殖阻害 ＩＢＷ 245E7-SPDP-RTA 18d(300-400) 74.8(D14)3動物のみ 1.15 245E7-IT-RTA 14d(100-200) 62.5(D14)P<0.05 0.93 280D11-IT-RTA 14d(100-200) 70.0(D13)P<0.01 (1) 0.99 6d(25-50) 80.0(D14)P<0.02 0.97 260F9-IT-RTA 14d(100-200) 20.3(D14) NS(2) 1.02 14d(100-200) 17.6(D14) NS(3) 1.01 245E7-IT-RTA 14d(100-300) 70.0(D14)P<0.01 1.00 ＋280D11-IT-RTA(カクテル） 80.0(D10)P<0.001 0.91 （１）退化６０．５％（Ｄ６）Ｐ＜０．００１ ０．８４ （２）５０．８％（Ｄ１１）Ｐ＜０．０５ ０．９８ （３）４４．８％（Ｄ１１）Ｐ＜０．１ ０．８７ ＮＳ＝有意差なし Ｄ＝処理開始後の日数 【００８２】抗体親和性及び抗原濃度 請求の範囲に記載されている抗体の幾つかをヨード化
し、そしてＭＣＦ−７又はＢＴ−２０細胞への結合につ
いて試験した。抗体をクロラミンＴを用いて 125Ｉによ
り約１０μＣｉ／μｇの比活性にラベルした。免疫放射
化学的純度を決定するため、０．５mlのウシ胎児血清中
１００，０００cpm の２種類のラベル化抗体を標的細胞
の５つのアリコートに０℃にて１５分間順次吸着せしめ
（一般にアリコート当り４，０００，０００ＭＣＦ−７
乳癌細胞）、そして各吸着後の上清液中の残りの放射能
を測定した。会合定数を測定するため、既知濃度のラベ
ル化及び非ラベル化モノクローナル抗体をウシ胎児血清
中標的細胞と共に氷中で１５分間インキュベートした。 【００８３】次に、細胞／抗体混合物のアリコートをガ
ンマーカウンター中で計数し、又はミクロフォルドフィ
ルタープレート（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック）を通し
て濾過しそしてそのフィルターをカウントした。フィル
ター上の液中に残留する未結合抗体を考慮するため、同
じ濃度の抗体を含有するがしかし細胞を含有しない対照
を並行して処理した。会合定数及び標的当たりの抗原コ
ピー数を、親和性試験結果から計算し、そして下記の表
７に報告する。 【００８４】表 ７ 抗 体 ｎ Ｋａ ｎＫａ ２Ｇ３ 3.７ｅ６ 9.１ｅ６ 3.４ｅ１３ １１３Ｆ１ 2.３ｅ６ 1.１ｅ９ 2.５ｅ１５ ２６０Ｆ９ 3.１ｅ５ 5.６ｅ７ 1.７ｅ１３ ２６６Ｂ２ 8.０ｅ４ 2.７ｅ８ 2.２ｅ１３ ２８０Ｄ１１ 3.９ｅ５ 8.８ｅ６ 3.４ｅ１２ ３１７Ｇ５ 3.２ｅ６ 1.６ｅ６ 5.１ｅ１２ ４５２Ｆ２ 2.５ｅ５ 6.８ｅ６ 1.７ｅ１２ ４５４Ｃ１１ 3.９ｅ５ 4.８ｅ７ 1.９ｅ１３ ５２０Ｃ９０ 5.０ｅ５ 8.２ｅ６ 4.１ｅ１２ ｎ＝ＭＣＦ−７細胞当り抗原コピー数； Ｋａ＝ＭＣＦ−７に対する会合定数。 ｎＫａはｎとＫａとの積であり、そして細胞当り結合抗
体に対する抗体濃度に関連する。 【００８５】抗体に対する免疫沈澱試験は、それらの内
の７つ（４５４Ｃ１１，４５２Ｆ２，５２０Ｃ９，７３
６Ｇ９，７４１Ｆ８，７５８Ｇ５、及び７６１Ｂ１０）
は癌性***組織に見出される共通の単量体の約２１０，
０００ダルトン蛋白質に結合することを示した。７種類
の内の６種類（４５２Ｆ２，５２０Ｃ９，７３６Ｇ９，
７４１Ｆ８，７５８Ｇ５、及び７６１Ｂ１０）は２１
０，０００ダルトン蛋白質上の同じエピトープを認識す
ると信じられる。相対的アフィニティー研究は、これら
６種類の内５２０Ｃ９が最高の会合定数を示すことを示
した。 【００８６】請求の範囲に記載されているモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマのサンプルはアメリカ
ン・タイプ・カルチュアー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）、１２３０１パークラウイドライブ、ロックビル、
メリーランド２０８５２−１７７６、米国に寄託され
た。２１０，０００ダルトン蛋白質上の同じエピトープ
を認識する抗体を生産する６種類のハイブリドーマの内
５２０Ｃ９のみが寄託された。寄託されなかった５種類
は５２０Ｃ９と機能的に同等であると考えられる。これ
らのＡＴＣＣ受託番号及び寄託日は次の通りである。 【００８７】 ハイブリドーマ／抗体名称 寄託日 受託番号 ２６０Ｆ９ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８８ １１３Ｆ１ 1984年１月27日 ＨＢ ８４９０ ２Ｇ３ 1984年１月27日 ＨＢ ８４９１ ２８０Ｄ１１ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８７ ２６６Ｂ２ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８６ ２４５Ｅ７ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８９ ４５４Ｃ１１ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８４ ３３Ｆ８ 1985年１月９日 ＨＢ ８６９７ ３１７Ｇ５ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８５ ５２０Ｃ９ 1985年１月８日 ＨＢ ８６９６ ３６９Ｆ１０ 1984年12月13日 ＨＢ ８６８２ ＊２６０Ｆ９−１Ｃ９ 1984年11月７日 ＨＢ ８６６２ ３１７Ｇ５（ＣＴＣＣ ００５５） 1984年12月28日 ＨＢ ８６９１ ７８８Ｇ６（ＣＴＣＣ ００５６） 1984年12月28日 ＨＢ ８６９２ ＊このクローンは２６０Ｆ９の子孫であり、そして２６０Ｆ９より良好な抗 体生産株であることが見出された。 これらの寄託はブタペスト条約のもとで行われたものであり、そしてその規定 に従って維持され他人に対して接近可能にされる。
診断及び治療に有用なモノクローナル抗−ヒト乳癌抗体
に関する。 【０００２】 【従来の技術】１９７０年代半ば以来、ヒト乳癌関連抗
原と反応するネズミモノクローナル抗体の多数の報告が
存在する。これらの報告された研究においては、ネズミ
がヒト−乳脂肪球蛋白質（milk fat globule protein)
、乳癌セルライン、又は乳癌膜抽出物で免疫感作及び
追加免疫された。免疫脾細胞がマウス骨髄腫細胞と融合
され、そしてハイブリドーマが、***又は乳癌抗原に対
する培地の幾らかの特異性に基いて選択された。 【０００３】Taylor-Papadimitriou, J.等、インターナ
ショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J. Ca
ncer）（１９８１）２８：１７−２１；Yuan, D.等、Ｊ
ＮＣＩ（１９８２）６８：７１９−７２８；Ciocca, D.
R. 等、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.)４２：４
２５６−４２５８。これらの先行技術の抗体の正常組織
反応性はこの発明の抗体の正常組織反応性と異る。 【０００４】多くの先行研究者は、 "イムノトキシン"
を製造するための細胞毒性剤と抗体との連結を報告し又
は示唆した。最近の関心は、細菌又は植物由来の毒素の
酵素的活性部分（Ａ鎖）にヘテロ２官能剤を介して結合
したモノクローナル抗体のイムノトキシンに集中してい
る。Neville, D. M.及びYoule, R. J.、イムノロジカル
・レビュー（Immunol Rev.）（１９８２）６２：７５−
９１；Ross, W. C. J.等、ヨーロピアン・ジャーナル・
オブ・バイオケミストリー（European J. Biochem.）
（１９８０）１０４；Vitteta, E. S.イムノロジカル・
レビュー（Immunol Rev.）（１９８２）６１：１５８−
１８３；Rosa, V.等、キャンサー・リサーチ（Cancer R
es.)（１９８２）４２：４５７−４６４；Trowbridge,
I. W. 及びDomingo, D. J.、ネイチュアー（Nature) (C
omd)（１９８１）２９４：１７１−１７３。 【０００５】 【発明の概要】本発明は、乳癌組織に存在し、４５４Ｃ
１１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８４８４），４５２Ｆ２
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１０８１１），５２０Ｃ９（Ａ
ＴＣＣＮｏ．ＨＢ８６９６）及び７４１Ｆ８（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＨＢ１０８０７）から成る群から選択されたハ
イブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体と特
異的に結合する２１０ｋＤのモノマー蛋白質に特異的に
結合する標識されたモノクローナル抗体又はその断片を
含んで成る乳癌細胞検出剤；並びに乳癌組織に存在し、
４５４Ｃ１１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８４８４），４５
２Ｆ２（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０８１１），５２０Ｃ９
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８６９６）及び７４１Ｆ８（Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１０８０７）から成る群から選択さ
れたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗
体と特異的に結合する２１０ｋＤのモノマー蛋白質に特
異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片を含ん
で成るイムノトキシンを含む殺乳癌剤に関する。 【０００６】 【具体的な説明】この明細書において使用する場合、 "
モノクローナル抗体" は均一な抗体集団を有する抗体組
成物を意味する。抗体の起原又はそれが作られる方法に
関しては限定されないことが意図される。例示されるモ
ノクローナル抗−ヒト乳癌抗体に関してこの明細書にお
いて使用される "機能的に同等" なる語は、（ａ）例示
されたモノクローナル抗体を交差ブロックし；（ｂ）ヒ
ト乳癌細胞に選択的に結合し；（ｃ）Ｇ又はＭアイソタ
イプを有し；（ｄ）免疫沈澱又はサンドイッチイムノア
ッセイにより決定される場合同じ抗原に結合し；そして
（ｅ）リシンＡ鎖に結合された場合ＭＣＦ−７，ＣＡＭ
Ａ−１，ＳＫＢＲ−３、又はＢＴ−２０細胞の少なくと
も１つに対して約１０nMより小さいＴＣＩＤ５０％を示
すモノクローナル抗体を意味する。 【０００７】この発明のモノクローナル抗体生産性ハイ
ブリドーマに関してこの明細書において使用される場
合、 "子孫" なる語は、世代又は核型の同一性とは無関
係に、親により生産されるモノクローナル抗−ヒト−乳
癌抗体を生産する、親ハイブリドーマのすべての誘導
体、結果物及び子を包含することが意図される。 【０００８】モノクローナル抗体製造 この発明のハイブリドーマを調製するために使用される
抗体生産性融合パートナーは、マウス等ヒト以外の動物
を生ヒト乳癌細胞又はそれから調製される膜抽出物によ
り免疫感作することにより生じる。動物に免疫原量の細
胞又は抽出物を腹腔内接種し、そして次に同様の量の免
疫源により追加免疫する。最終追加免疫の数日後、免疫
された該動物から脾臓を集め、そして融合において使用
するため、これから細胞懸濁液を調製する。 【０００９】Buck, D. W. 等、イン・ビトロ（In Vitr
o）（１９８２）１８：３７７−３８１により改変され
たKohler, B 及びMilstein, G 、ネイチュアー（Natur
e）（１９７５）２５６：４９５−４９７の一般的体細
胞ハイブリダイゼーション技法を用いて、脾細胞とネズ
ミ腫瘍パートナーとからハイブリドーマを調製する。入
手可能なネズミ骨髄腫ライン、例えばサルク・インステ
ィテュート、セルディビジョンセンター、サンジェゴ、
カリホルニア、ＵＳＡをハイブリダイゼーションにおい
て使用することができる。 【００１０】基本的には、ポリエチレングリコールのご
とき融合剤を用いて腫瘍細胞と脾細胞とを融合せしめる
ことを含む。融合の後、融合媒体から細胞を分離し、そ
して選択的増殖培地、例えばＨＡＴ培地に増殖せしめる
ことによりハイブリダイズしていない親細胞を除去す
る。所望によりハイブリドーマを拡げ、そして抗原とし
て免疫剤（乳癌細胞又は膜抽出物）を用いて常用のイム
ノアッセイ法（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イ
ムノアッセイ、又は蛍光イムノアッセイ）により、抗−
ヒト乳癌活性について上清を測定する。陽性クローンを
さらに特徴付けてこれらがこの発明の抗体の基準に合致
するか否かを決定する。 【００１１】このような抗体を生産するハイブリドーマ
を、公知の方法を用いてイン−ビトロ又はイン−ビボで
増殖せしめることができる。モノクローナル抗体は、所
望により、常用の免疫グロブリン精製法、例えば硫酸ア
ンモニウム沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフ
ィー、及び限外濾過により、場合に応じて培地又は体液
から単離することができる。 【００１２】モノクローナル抗体選択／特徴付け モノクローナル抗体の重要な特徴付けは（１）これらの
免疫グロブリンクラス、（２）ヒト乳癌細胞に対するこ
れらの選択性及びこれらが結合するヒト乳癌細胞の範
囲、及び（３）効果的な抗−ヒト乳癌イムノトキシンを
製造する場合のその有用性である。 【００１３】与えられた抗体の選択性及び範囲は、
（１）ヒト乳癌組織及び細胞並びに（２）***及び他の
由来の正常なヒト組織又は細胞のパネルに対してそれを
試験することにより決定される。請求の範囲に記載され
ている抗体の選択において、約２２０００個の増殖ハイ
ブリドーマ培養物をまず、免疫乳癌膜又はセルライン、
８種類の正常組織膜のパネル、線維芽細胞セルライン及
び乳癌腫瘍凍結切片に対してスクリーニングした。 【００１４】新生物材料と反応するが正常な材料と反応
しないクローンをこの最初のスクリーニングにおいて同
定し、そしてアイソタイプの決定並びに選択性及び範囲
についての追加のスクリーニングにより選択した。追加
のスクリーニングは、１６個の正常組織切片、５種類の
正常血球型、１１個の非***新生物切片、２１個の乳癌
切片及び１４個の乳癌セルラインを用いる。抗体が約１
／３未満の正常組織及び血球タイプと強く結合すれば、
それらが乳癌に選択的に結合すると認められた。１２７
の抗体を精製し、そして追加のスクリーニングにおいて
試験した。 【００１５】許容し得る選択性及び範囲を示す抗体を、
カップリング剤としてＮ−サクシニミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）又はイミ
ノチオラン（ＩＴ）を用いてリシンＡ鎖に複合体化し
た。この複合体を２４時間組織培養測定においてＭＣＦ
−７，ＣＡＭＡ−１，ＳＫＢＲ−３、及びＢＴ−２０細
胞に対して試験した。 【００１６】１６種類の抗体が、これらの乳癌系の少な
くとも１つに対して許容し得るイムノトキシン活性（１
０nMより小さいＴＣＩＤ５０％）を示した。この１６種
類の内の７種類が同じ２１０，０００ダルトンの抗原を
認識し、７種類の内の６種類がおそらく同じエピトープ
を認識するが親和性において異ることが見出された。こ
れらの抗体の一層詳細な特徴付けが下記の例において与
えられる。 【００１７】免疫化学物質 最も重要なこの発明のモノクローナル抗体の免疫化学的
誘導体はイムノトキシン（抗体と細胞性毒素との複合
体）及びラベルされた（例えば、放射性ラベルされた、
酵素ラベルされた、又はフルオロクロームラベルされ
た）誘導体（この誘導体中でラベルはラベルされた抗体
を含有する免疫複合体を同定するための手段を提供す
る）である。 【００１８】イムノトキシンの細胞毒成分は、細胞毒性
剤、細菌もしくは植物起原の酵素的に活性な毒素、又は
これらの毒素の酵素的に活性な断片（ "Ａ鎖" ）であ
る。酵素的に活性な毒素及びその断片が好ましく、そし
てジフテリア毒素の非結合性活性断片であるジフテリア
Ａ鎖、エキソトキシンＡ鎖〔シュードモナス・アエルギ
ノーサ（Pseudomonas aeruginosa）から〕、リシンＡ
鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファーサルシ
ン、アレウリテス・フォルディー（Aleurites fordii）
蛋白質、ジアンチン蛋白質、フィトラッカ・アメリカナ
（Phytolacca americana）蛋白質（ＰＡＰＩ，ＰＡＰII
及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランチァ（momord
ica charantia)阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン
（crotin）、サポナリア・オフィシナリス（saponaria
officinalis ）阻害剤、ゲロニン（gelonin)、ミトゲリ
ン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictoci
n）、フェノマイシン、及びエノマイシンにより例示さ
れる。 【００１９】リシンＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活
性断片、アルビンＡ鎖、及びＰＡＰIIが好ましい。モノ
クローナル抗体とこれらの細胞毒性成分との複合体は種
々の２官能蛋白質カップリング剤を用いて調製すること
ができる。このような試薬の例はＳＰＤＰ，ＩＴ、イミ
ドエステルの２官能誘導体、例えばジメチルアジピミデ
ート・ＨＣｌ、活性エステル、例えばジサクシニミジル
スベレート、アルデヒド、例えばグルタルデヒド、ビス
−アジド化合物、例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）
ヘキサンジアミン、ビス−ジアゾニウム誘導体、例えば
ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジア
ミン、ジイソシアネート、例えばトルエン２，６−ジイ
ソシアネート、及びビス−活性弗素化合物、例えば１，
５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンである。 【００２０】診断の目的でヒト乳癌細胞をイン−ビトロ
で殺すために使用する場合、典型的には複合体が約１０
nM以上の濃度において細胞培養培地に加えられる。イン
−ビトロで使用するための適用の剤形及び方法は臨界的
ではない。培地又は灌流媒体との相溶性剤が一般に使用
されよう。細胞毒性を常用技法により読み取ることによ
って乳癌の存在又は程度を決定することができる。 【００２１】療法のためにイン−ビボで使用される場
合、イムノトキシンは療法的有効量（すなわち、患者の
腫瘍負担を除去し又は軽減する量）において患者に投与
される。これらは一般に、非経腸的に、好ましくは静脈
内に投与される。投与量及び投与方法は癌の性質（一次
癌又は転移癌）及びその集団、特定のイムノトキシンの
特徴、例えばその治療係数、患者、並びに患者の病歴に
依存するであろう。投与されるイムノトキシンの量は典
型的には約０．１〜約１０mg／kg患者体重であろう。 【００２２】非経腸的投与のためには、イムノトキシン
は医薬として許容される非経腸担体と共に単位投与注射
形（溶液、懸濁液、乳濁液）として製剤化されるであろ
う。これらの担体は本来的に非毒性でありそして非療法
的である。このような担体の例は水、塩溶液、リンゲル
溶液、グルコース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンで
ある。 【００２３】非水性担体、例えば不揮発油及びオレイン
酸エチルを使用することもできる。担体としてリポゾー
ムを使用することもできる。担体は微量の添加剤、例え
ば等張性及び化学的安定性を増強するための物質、例え
ば緩衝剤及び防腐剤を含有することができる。イムノト
キシンは、典型的にはこれらの担体中に約１mg／ml〜１
０mg／mlの濃度で製剤化される。 【００２４】乳癌を処置するための細胞毒性放射性医薬
は、高線エネルギー移動（ＬＥＴ）放射性同位元素（例
えば、Ｙ，Ｐｒ）を抗体に結合することによって製造さ
れる。この明細書において使用される "細胞毒性成分"
なる語はこのような同位元素を包含することが意図され
る。 【００２５】抗体のラベルされた部分を作るために使用
されるラベルは、直接検出され得る成分、例えば蛍光色
素及び放射性ラベル、並びに検出されるために誘導体化
されなければならない成分、例えば酵素を包含する。こ
のようなラベルの例は32Ｐ，125Ｉ， 3Ｈ，14Ｃ、フル
オレッセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導
体、ダンシル、ウンベリフェロン、レシフェロン、２，
３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュパ
ーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、リゾチー
ム、及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼである。 【００２６】抗体を、これらのラベルにより公知の方法
で標識することができる。例えば、カップリング剤、例
えばアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミ
デート、サクシンイミド、ビス−ジアゾ化ベンザジン及
びこれらに類似するものを使用して抗体を上記の蛍光ラ
ベル、化学発光ラベル、及び酵素ラベルにより標識する
ことができる。 【００２７】抗体及びラベルされた抗体をイムノイメー
ジング法又はイムノアッセイ法において使用して、患者
における乳癌の存在を検出し、又はそれを有することが
すでに診断されている患者におけるそのような癌の状態
をモニターすることができる。癌の状態をモニターする
場合、定量的イムノアッセイ法を用いなければならな
い。 【００２８】このようなモニターにおいては測定は定期
的に行われ、そしてその結果を比較して患者の腫瘍負荷
が増加したか減少したかが決定される。使用することが
できる一般的測定技法には直接測定及び間接測定が含ま
れる。直接測定は患者からの組織サンプル又は細胞をラ
ベルされた抗体と共にインキュベートすることを含む。
サンプルが乳癌細胞を含むなら、ラベルされた抗体はそ
れらの細胞に結合するであろう。 【００２９】組織又は細胞を洗浄して未結合ラベル化抗
体を除去した後、組織サンプルをラベルされた免疫複合
体の存在について読み取る。間接測定においては、組織
又は細胞サンプルをラベルされていないモノクローナル
抗体と共にインキュベートする。次に、該モノクローナ
ル抗体に対するラベル化抗体（例えば、ラベルされた抗
ネズミ抗体）で処理し、洗浄し、そしてラベルされた三
次元複合体の存在について読み取る。 【００３０】診断的用途のためには、抗体は典型的には
キットの形で分配される。これらのキットは典型的に
は、適当な容器中ラベル化又は非ラベル化形の抗体、イ
ンキュベーション又は洗浄のための試験、キットが間接
測定形であればラベルされていない抗ネズミ抗体、並び
にラベルの性質に依存して基質及び誘導体化剤を含んで
成る。ヒト乳癌抗原対照及び指示書も含めることができ
る。次の例により、この発明の代表的モノクローナル抗
体の調製、特徴及び使用を詳細に記載する。これらの例
は、この発明に限定を加えることをなんら意図するもの
ではない。 【００３１】免疫感作 新しく外科摘出したヒト乳癌組織及び種々の正常組織を
用いて、ホモジナイズ及び非連続的シュークロースグラ
ジェント遠心により膜抽出物を調製した。ヒト乳癌セル
ラインをブレスト・キャンサー・タスク・フォース（Br
east Cancer Task Force）、アメリカン・タイプ、カル
チュアー・コレクション（ＡＴＣＣ）、及びメモリアル
・スローン・ケッタリングの Jargen Fogh博士から得
た。 【００３２】ブレスト・キャンサー・タスク・フォー
ス、ＡＴＣＣ、及びFogh博士により推奨されるようにし
て細胞を維持しそして継代した。免疫感作のため、１０
０μｇ（Lowry 測定) の蛋白質を含有する膜抽出物又は
一千万個の生乳癌細胞を５週令のＢａｌｂ／ｃマウスに
腹腔内投与した。マウスを１箇月間隔で同様に２回追加
免疫した。最後の追加免疫の３日後、細胞融合のため脾
臓を摘出した。 【００３３】ハイブリドーマ法 ネズミ骨髄腫系Ｓｐ−２／０−Ａｇ１４を用いてBuck,
D. W. 等の方法により体細胞ハイブリドを調製した。す
べてのハイブリドーマセルラインは限界稀釈法によりク
ローン化した。融合の半分は乳癌膜抽出物により免疫感
作したマウスからの脾細胞を用い、そして半分は乳癌セ
ルラインにより免疫感作したマウスからの脾細胞を用い
た。これらの融合から８３４２４個のウエルが設けら
れ、この内２２，４５９個がハイブリドーマの増殖を示
した。 【００３４】スクリーニング法 ハイブリドーマ上清を、免疫感作用乳癌膜抽出物を用い
る固相エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により又は免疫感作用乳癌セルラインを
用いる間接イムノフルオレッセンスアッセイにより、反
応性抗体について測定した。固相膜ＥＬＩＳＡのため、
４０μｌの０．１mg／ml乳癌膜蛋白質をポリ塩化ビニル
（ＰＶＣ）ミクロタイターウエルに４℃にて１２時間置
いた。 【００３５】抽出物を吸引し、そして１％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢ
Ｓ）によりウエルを洗浄した。次に、ウエルを１：１０
稀釈のハイブリダーマ上清４５μｌと共にインキュベー
トした。稀釈剤は、２５mMの緩衝剤、１０％ウシ血清及
び０．１％ナトリウムアジドから成る媒体であった。室
温にて３０分間置いた後、ウエルを再度洗浄し、そして
１：２００稀釈のパーオキシダーゼ接合ヤギ抗−マウス
ＩｇＧと共にインキュベートした。 【００３６】稀釈剤はＰＢＳであった。次にウエルをＰ
ＢＳで洗浄し、そして０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝
液（pH４．２）中２，２−アジノ−ジ（３−エチルベン
ズチアゾリンスルホン酸２００μｌと反応せしめた。ミ
クロエリサリーダー上で４０５nmにおける光学濃度を測
定した。各実験において、陽性対象である抗−β２ミク
ログロブリン５μｇ／mlを正常ヒト腎臓膜と反応せしめ
た。これは１．０±０．１（標準偏差）の光学濃度を与
えた。バックグラウンドは、マウスモノクローナル抗体
を含まない媒体を用いて０±０．１光学濃度単位（O.D)
であった。乳癌膜抽出物に対して０．７O.D より大きな
反応をもたらすウエルを保持した。 【００３７】間接イムノフルオレセンスセルラインアッ
セイのため、免疫感作用セルラインの１０万個の乳癌細
胞を、１セットの８チャンバースライドの各チャンバー
に入れた。同様にして、セルラインＣＣ９５からの１０
万個の線維芽細胞をチャンバーを有するスライドウエル
中で一夜インキュベートした。１％ＢＳＡを含有するＰ
ＢＳにより細胞を洗浄した。 【００３８】乳癌及び線維芽細胞の両者のウエルを、
１：１０稀釈のハイブリドーマ上清と共に４℃にて３０
分間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、そして
１：５０稀釈のフルオレッセインイソチオシアナート
（ＦＩＴＣ）−接合ヤギＦ（ａｂ′）2 抗−マウスＩｇ
と共に４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を３
回洗浄し、ＰＢＳ中１．５％ホルムアルデヒド中で固定
し、チャンバーを取り出し、そしてＰＢＳ中ですすい
だ。 【００３９】次に、スライドを、ポリビニルアルコー
ル、グリセリン、緩衝剤及び防腐剤を含有する組成物中
に配置し、そして蛍光顕微鏡により試験した。乳癌細胞
への強い蛍光結合を示すが線維芽細胞への蛍光結合を示
さないハイブリドーマウエルを保持した。５１５６個の
ハイブリドーマウエルが最初のスクリーニングにおいて
乳癌反応性を示した。 【００４０】次に、５１５６個の陽性ウエルからの上清
を、８種類の正常組織（肝臓、肺、結腸、胃、腎臓、扁
桃腺、脾臓及び膵臓）膜抽出物を用いる固相ＥＬＩＳＡ
において試験した。０．３より大きなＥＬＩＳＡ−Ｏ．
Ｄ．をもたらすすべてのウエルを廃棄した。１１０１個
の上清が正常組織抽出物と反応しないことが見出され
た。 【００４１】１１０１個のハイブリドーマ上清をヒト乳
癌組織の凍結切断に対して試験した。６ミクロンの切片
をスライドに付着させ、４℃にてアセトン中で１０分間
固定し、室温にて１０分間乾燥し、ＰＢＳで洗浄し、ウ
マ血清でブロックし、そして２００μｌの未稀釈のハイ
ブリドーマ上清と共に室温にて２０分間インキュベート
した。 【００４２】スライドをＰＢＳで洗浄し、そして最後に
３７℃にて２０分間、１：５０稀釈のパーオキシダーゼ
接合ラビット抗マウスＩｇと共にインキュベートし、Ｐ
ＢＳで再び洗浄し、そして最後に３７℃にて７．５分間
０．０１％過酸化水素を含有する０．０５ＭTris緩衝液
（pH７．２）中０．５mg／ｌジアミノベンジジンと共に
インキュベートした。スライドをヘマトキシリンで染色
し、脱水し、そして３５．９％メチル／ｎ−ブチルメタ
クリレートコポリマー、７．１％ブチルベンジルフタレ
ート及び０．３％２，６−ジtertブチル−ｐ−クレゾー
ルを含有する媒体中においた。１２４ウエルが乳癌選択
的結合をもたらし、そしてクローン化された。 【００４３】精製及びクラス決定 モノクローナル乳癌選択的抗体の免疫グロブリンクラス
及びサブクラスを決定した。次に、さらに、２〜３×１
０6 ハイブリドーマ細胞を０．２μＣｉ35Ｓメチオニン
を含有するメチオニン不含培地中で４時間増殖せしめる
ことにより抗体を内部的にラベルした。 【００４４】35Ｓ−ラベル抗体を固定されたスタフィロ
コッカスＡ細胞と、又はラビット抗−マウス免疫グロブ
リンによりプレコートされたスタフィロコッカスＡ細胞
を固定するために使用される組成物と免疫沈澱せしめ、
そしてこの免疫沈澱をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して
抗体ライト及びヘビー鎖の移動度、余分の鎖の欠落、並
びにスタフィロコッカスプロテインＡと結合する各抗体
の能力を決定した。 【００４５】抗体をイン−ビトロで拡張した。Ｂａｌｂ
／ｃ又はＦ１（Ｃ５７Ｂ／６×Ｂａｌｂ／ｃ）マウスに
０．５mlのプリスタンを腹腔内（ｉｐ）注入し、そして
１０〜１４日後ＰＢＳ中１００万個の対数期ハイブリド
ーマ細胞を接種した、腹水を−７０℃に貯蔵し、そして
解凍し、そしてさらに精製する前に０．８ミクロンフィ
ルターユニットを通して濾過した。 【００４６】スタフィロコッカスプロテインＡと結合す
るＩｇＧ抗体を、アガロース、デキストラン及び／又は
アクリルアミドを含有するプロテインＡ−クロマトグラ
フ樹脂上での、pH段階グラジエント溶出を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製した。プロテイ
ンＡを結合しなかったＩｇＧ抗体を、０℃にて４０％飽
和に硫酸アンモニウムを加えることにより沈澱せしめ
た。 【００４７】沈澱をＰＢＳ中に再溶解し、２０mMTris
（pH７．２）に透析し、そしてジエチルアミノエチルセ
ルロース（ＤＥＡＥ）の１．６×５０cmカラム上で、
１．５ｌの０〜６００mMＮａＣｌグラジエントにより４
℃にて１ml／分の流速で溶出することによりクロマトグ
ラフ処理した。各場合において、カラム画分をＳＤＳ−
ＰＡＧＥによりモニターし、最純抗体画分を一緒にし、
１〜３mg／mlに濃縮し、ＰＢＳ／０．０２％ＮａＮ3 に
透析し、そして４℃に貯蔵した。 【００４８】ＩｇＭ抗体を、アガロース、デキストラン
及び／又はアクリルアミドを含有するクロマトグラフ樹
脂の２．６×４０cmカラム上でのゲル濾過により、室
温、１ml／分の流速にてＰＢＳ／０．０１％ナトリウム
アジドで溶出することにより精製した。 【００４９】選択性決定 乳癌に対するこれらの選択性を評価するため、精製され
た抗体を、１６個の正常組織の切片に対する免疫パーオ
キシダーゼ切片により、及び５個の血球型に対する免疫
蛍光細胞ソーティングにより試験した。イムノパーオキ
シダーゼ染色は上記のようにして行ったが、但しハイブ
リドーマ上清の代りに、１〜４０μｇ／mlの範囲で、Ｐ
ＢＳ中の精製抗体の既知の稀釈を用いた。 【００５０】純粋な抗体をまず力価検定し、乳癌切断に
対して強いイムノパーオキシダーゼ染色をもたらす最小
濃度を見出し、そして次に正常組織試験のためにその濃
度で使用した。末梢血細胞（血小板、リンパ球、赤血
球、顆粒球、及び単球）を、多形核白血球から単球を分
離する媒体を用いて遠心により調製した。細胞を、上記
のようにして決定した最適濃度において、４℃にて３０
分間抗体と反応せしめ、洗浄し、１：５０稀釈の蛍光イ
ソチオシアナート−複合ヤギ抗−マウスＩｇと４℃にて
３０分間反応せしめ、再び洗浄し、そしてセルソーター
中で試験した。 【００５１】洗浄緩衝液及び稀釈剤は１％ゼラチン及び
０．０２％ナトリウムアジドを含むＰＢＳであった。セ
ルソーターは、７６ミクロンのノズル、及び１ワットの
４８８nmアルゴンイオンレーザーを装着していた。焦点
を合わせるため、光学レール装置上に８mmの共焦レンズ
を使用した。他の使用フィルターは５１５nm干渉フィル
ター及び５１５nm吸収フィルター（散乱レーザー光のた
め）及び前方角光散乱のため中間濃度１．５フィルター
であった。フルオレッセイン蛍光の対数対前方角光散乱
の概略プロットをサンプル分析のために使用した。 【００５２】本発明のハイブリドーマにより生産される
抗体の結合挙動を下記の表１に報告する。表 １ 正常組織切片への抗体の結合 組 織 抗 体 膵 臓 食 道 肺 腎 臓 結 腸 胃 脳 扁桃腺 33F8 0 2E 0 1T 0 0 0 1Ly 113F1 2Ac 2E 0 0 0 2G 0 1E 245E7 1L 0 1A,M 0 0 2L 0 1E 2G3 2Ac 2E 1A 2T 0 1L 0 1E 260F9 1Ac 2E 0 1T 0 1G 0 2E 280D11 0 1E 0 2T,2B 1L 2L 0 0 266B2 1Ac,1D 2E 0 1T 0 0 0 2E 454C11 1D 1-2E 0 1T 0 0 0 1E 317G5 1Ac,I 0 0 2T 1G 0 0 0 520C9 0 0 0 1T 0 0 0 0 452F2 0 0 0 0 0 0 0 0 369F10 0 0 0 0 0 1G 0 0 736G9 0 0 0 0 0 0 0 0 741F8 0 0 0 0 0 0 0 0 758G5 0 0 0 1T 0 0 0 0 761B10 0 0 0 1T 0 0 0 0 【００５３】抗 体 肝 臓 心 臓 卵 巣 皮 膚 乳 房 骨 子 宮 膀 胱 33F8 0 0 0 1W 0 1Mk 1L 1E 113F1 0 0 0 0 0 0 0 1E 245E7 0 0 0 2S 2L 0 2L 1E 2G3 0 0 0 0 2E 0 2L 2E 260F9 2D 0 0 2E,2H 2E 0 1L 2E 280D11 2D 0 0 1E,1H 2L 2Gr 2G 0 266B2 0 0 0 2E,2W 1E 0 0 1E 454C11 1D 0 0 1E,H 1E 0 1G 1E 317G5 2D 0 0 0 0 0 1G 0 520C9 0 0 0 0 0 0 0 0 452F2 0 0 0 0 0 0 0 0 369F10 0 0 0 1S 0 0 0 0 736G9 0 0 0 0 0 0 0 0 741F8 0 0 0 0 0 0 0 0 758G5 0 0 0 0 0 0 0 761B10 0 0 0 0 0 0 0 【００５４】染色強度：２＝強；１＝弱；０＝陰性。 Ａ＝中隔細胞；Ａｃ＝腺房；Ｂ＝ボーマンのう；Ｄ＝
管；Ｅ＝表皮；Ｇ＝腺；Ｇｒ＝顆粒球；Ｈ＝毛包；Ｉ＝
島；Ｌ＝管腔士尖端細胞質；Ｌｙ＝リンパ球；Ｍ＝マク
ロファージ；Ｍｋ＝メガコニオサイト；Ｍｙ＝ミエリ
ン；Ｓ＝皮脂；Ｓｔ＝間質；Ｔ＝細管；Ｕ＝糸球体；Ｗ
＝汗腺。 血小板、赤血球、リンパ球、単球又は顆粒球に対する結
合は存在せず、但し２８０Ｄ１１は顆粒球と弱く結合す
る。いずれの抗体も線維芽細胞と結合しない。 【００５５】範囲決定 いかなる範囲の乳癌が各抗体によって認識されるかを決
定するため、乳癌選択的抗体を、２７個の異る乳癌の凍
結切片に対するイムノパーオキシダーゼ染色により試験
した。切片染色のために使用された乳癌はすべて浸潤腺
管内癌であり、従って、抗体結合と乳癌の組識学的タイ
プの関連はなされ得なかった。さらに、抗体結合と結節
状態又はエストロゲン受容体状態との間の関連も、提供
者の情報が得られる１２の癌について見出されなかっ
た。抗体は、転移乳癌及び原発性乳癌のウエルと同様に
反応した。請求の範囲に記載されている抗体についての
これらの試験の結果を下記の表２に報告する。 【００５６】表 ２ 乳癌組織切片に対する抗体の結合* 乳 癌 抗 体 LA KA JA IA HA GA Ｅ EA TA UA RA SA Ｏ 2G3 1 2 1 2 2 2 ND 2 2 2 2 2 2 33F8 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 113F1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 245E7 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 260F9 0 1 0 1 0 1 ND 1 2 0 0 0 1 280D11 2 2 0 1 2 1 ND 1 1 0 1 0 1 266B2 1 2 0 1 0 1 ND 0 2 1 1 0 1 454C11 1 2 0 2 1 1 ND 2 1 1 0 0 ND 317G5 1 ND 0 0 1 ND ND 0 0 0 1 1 ND 520C9 0 ND 0 2 0 ND ND 2 0 1 0 0 ND 452F2 0 2 0 2 0 0 ND 1 0 1 0 0 ND 369F10 2 2 2 2 0 1 ND 1 0 1 1 2 2 736G9 2 ND 0 2 0 ND ND 1 0 1 0 0 ND 741F8 0 ND 0 2 0 ND ND 2 0 1 0 0 0 758G5 1 ND 0 0 0 ND ND 2 0 1 0 0 ND 761B10 1 ND 0 2 0 ND ND 2 0 1 0 0 ND 【００５７】抗 体 Ｒ MA BA NA FA LMA LME MBA Ｚ YA KB OB 2G3 2 1 2 2 2 2 2 2 2 33F8 0 0 0 0 0 0 0 0 ND 113F1 0 0 0 0 0 0 0 0 ND 245E7 2 2 2 2 2 2 2 2 ND 260F9 0 0 1 1 1 0 1 1 0 280D11 1 1 1 0 1 1 1 1 1 266B2 0 1 1 2 1 0 1 1 1 454C11 0 2 0 0 1 0 1 1 ND 317G5 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 520C9 0 2 0 1 0 0 0 0 0 452F2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 369F10 0 0 2 2 2 2 2 2 1 736G9 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 741F8 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 758G5 0 2 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 761B10 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 【００５８】＊染色強度：２＝強；１＝弱；０＝陰性；
ＮＤ＝決定せず。 抗体をさらに、１４の乳癌セルラインに対するセルライ
ン免疫螢光測定により、乳癌認識の範囲について評価し
た。下記の表３は、請求の範囲に記載されている抗体に
ついてこれらの試験の結果を報告する。 【００５９】表 ３ 乳癌セルラインに対する抗体の結合* セルライン 抗 体 SKBr3 BT483 MCF7 BT20 ZR751 MDAMB231 CAMA1 2G3 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 33F8 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 113F1 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 245E7 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 260F9 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 280D11 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 266B2 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 454C11 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 317G5 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 520C9 ＋ ＋ − − − NT ＋ 452F2 ＋ ＋ − − ＋ NT ＋ 369F10 − ＋ − − − − ＋ 736G9 ＋ ＋ − NT NT NT ＋ 741F8 ＋ ＋ − NT NT NT ＋ 758G5 ＋ ＋ − NT NT NT − 761B10 ＋ ＋ − NT NT NT − 【００６０】抗 体 ALAB BT549 BT474 T47D MDAMB157 MDAMB330 ZR7530 2G3 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 33F8 ＋ ＋ ＋ − ＋ ＋ − 113F1 − − ＋ ＋ ＋ ＋ − 245E7 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 260F9 ＋ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 280D11 − ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ 266B2 − − ＋ ＋ − ＋ ＋ 454C11 ＋ − NT − NT NT ＋ 317G5 ＋ − NT ＋ ＋ − ＋ 520C9 NT − NT − NT NT ＋ 452F2 ＋ − NT − NT NT ＋ 369F10 − − NT − NT NT − 736G9 NT − NT ＋ NT NT ＋ 741F8 NT − NT ＋ NT NT ＋ 758G5 NT − NT − NT NT ＋ 761B10 NT − − NT ＋ NT ＋ 【００６１】＊セルライン結合：＋＝陽性；−＝陰性；
ＮＴ＝試験せず。 最後に、抗体を１１の非***性癌に対するイムノパーオ
キシダーゼ染色により試験した。請求の範囲に記載され
ている抗体についての結果を下記の表４に報告する。 【００６２】表 ４ 癌に対する抗体の結合* 癌 抗 体 結 腸 肺 前立線 膵 臓 子 宮 リンパ腫 2G3 ２ ０ ２ ０ ２ ０ 33F8 ０ １ ０ ０ １ ０ 113F1 ０ ２ ０ ２ １ ２ 245E7 ０ ２ ２ ２ ２ ２ 260F9 ０ ０ １ １ １ ０ 266B2 ０ １ １ １ １ ０ 280D11 ０ ０ １ １ １ ２ 454C11 ０ ０ １ １ ２ ０ 317G5 １ １ ０ ０ １ ０ 520C9 ０ １ １ １ １ ０ 452F2 ０ ０ ０ ０ ０ ０ 369F10 ０ １ １ １ ０ ０ 736G9 ０ ０ ０ ０ ０ ０ 741F8 ０ ０ ０ ０ ０ ０ 758G5 ０ １ ０ ０ ０ ０ 761B10 ０ ０ ０ ０ ０ ０ 【００６３】抗 体 胃 膀 胱 食 道 黒色腫 卵 巣 2G3 ２ ０ ０ ２ ２ 33F8 ０ ０ ０ ０ １ 113F1 ２ ０ １ ０ ０ 245E7 ０ ０ ０ ０ ２ 260F9 ０ ０ １ ０ ２ 266B2 １ ０ １ ０ １ 280D11 ０ ０ ０ ０ ２ 454C11 ０ ０ ０ ０ １ 317G5 ０ ０ ０ ０ ０ 520C9 ０ ０ ０ ０ ０ 452F2 ０ ０ ０ ０ ０ 369F10 ０ ０ ０ ０ ２ 736G9 ０ ０ ０ ０ ０ 741F8 ０ ０ ０ ０ ０ 758G5 ０ ０ ０ ０ ０ 761B10 ０ ０ ０ ０ ０ ＊染色強度：２＝強；１＝弱；０＝陰性。各タイプの１種類の癌のみを試験した 。 【００６４】細胞毒性の評価 Carlsson, J.等、バイオケミカル・ジャーナル（Bioche
m. J.)（１９７８）１７３：７２３−７３７に記載され
ているようにしてＳＰＤＰにより、又はイミノチオラン
（ＩＴ）により処理されたリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）
に、請求の範囲に記載されている抗体を複合体化せしめ
た。 【００６５】ＳＰＤＰ複合体形成 ＳＰＤＰ（エタノール中２０mM）を２０倍モル過剰にお
いて抗体に加え、そして室温にて３０分間インキュベー
トした後、未反応ＳＰＤＰをＰＢＳに対する透析により
除去した。誘導体化の程度を、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）による還元の後３４３nmにおいてピリジン−２−
チオンの放出を測定することにより決定した。抗体に依
存して３〜８個のリジンアミノ酸基（抗体分子当り）が
ピリジル−ジスルフィド誘導体に転換された。 【００６６】ＳＰＤＰで処理された抗体をＲＴＡと複合
体化した。複合体形成の直前にＲＴＡを５０mM ＤＴＴ
で還元し、次にアガロース、デキストラン及び／又はア
クリルアミドを含有するクロマトグラフ樹脂のカラム上
で脱塩して蛋白質からＤＴＴを除去した。還元されたＲ
ＴＡを３〜５倍モル過剰のピリジルジスルフィド抗体に
加えた。典型的な反応混合物（１ml）は７μＭ抗体及び
３０μＭ ＲＴＡから成る。 【００６７】反応を４℃にて一夜進行させた。抗体への
ＲＴＡの複合体形成の程度を、ピリジン−２−チオンの
方法を測定することにより分光光度計により決定した。
平均して、複合体は抗体分子当り２〜３個のＲＴＡ分子
を含有する。このことは非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
（７．５％）により確認され、このゲルはさらに、典型
的な複合体調製物が１０％〜３０％の遊離抗体を含有す
ることを示した。 【００６８】複合体混合物をＨＰＬＣサイズ排除カラム
上でクロマトグラフ処理して残留未反応ＲＴＡから複合
体を分離した。カラムを０．１Ｍ硫酸ナトリウム／０．
０２Ｍリン酸ナトリウム（pH６．８）中で平衡化した。
複合体混合物（０．７ml）を注入し、次に１ml／分の流
速でクロマトグラフ処理した（室温）。０．５mlの画分
を集め、そしてピーク複合体画分をプールし、そして細
胞毒性試験の前に濾過除菌した。 【００６９】イミノチオラン複合体 ０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ
（pH８．０）（以後Ｐ−ＥＤＴＡ緩衝液と称する）を約
３０mg／mlの抗体を室温にて約１５分間にわたり１mM
５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴ
ＮＢ）と反応せしめ、そして次に氷浴中で０℃に冷却す
る。この溶液に、２．５ＩＴ分子／抗体分子とするのに
十分なＩＴを加え、そして得られた溶液を０〜５℃にて
約２４時間貯蔵する。次に、これを０〜５℃にて３００
倍過剰容積のＰ−ＥＤＴＡ緩衝液に対して透析する。 【００７０】１mM ＤＴＴを含有するＰ−ＥＤＴＡ中に
正常に貯蔵されたＲＴＡを限外濾過して１０〜１５mg／
mlの濃度とし、そして０〜５℃にて３００倍過剰容積の
Ｐ−ＥＤＴＡに対して透析する。十分なＲＴＡを誘導体
化された抗体に加えて、１．０〜１．２のＲＴＡ上遊離
チオール／誘導体化抗体上ブロックされたチオールとす
る。この混合物を室温にて２時間インキュベートする。 【００７１】カップリング反応混合物を、固体支持体に
留められた青色色素を基礎とするクロマトグラフ樹脂の
カラムに適用し、次にこの混合物を室温にてＰ−ＥＤＴ
Ａにより溶出する。カラムの大きさを、出発抗体mg当り
約２mlのベッドボリウムを含むようにする。未複合体化
抗体の最初のピークがカラムから溶出した後、溶離液を
１Ｍ ＮａＣｌ含有Ｐ−ＥＤＴＡに切り換える。 【００７２】この緩衝液において、免疫複合体及び未反
応ＲＴＡが非常にシャープなピークとして溶出する。こ
れをプールし、そして１０倍過剰容積の０．１５Ｍリン
酸ナトリウム（pH７．１）（以後、Ｐｉ緩衝液と称す
る）に対して０〜５℃にて透析する。透析された蛋白質
を０〜５℃にてゲルのカラムに適用し、そし６cm／時の
流速にて緩衝液により溶出する。 【００７３】カラムの大きさを、少なくとも２５mlのベ
ッドボリウム／mlの適用蛋白質を含むようにする。免疫
複合体は単一ピークとして排除容積のわずかに後に溶出
し、これはこれに続く２量体化及び単量体ＲＴＡのピー
クからベースライン分離される。一緒にした免疫複合体
ピークを３５psi にて限外濾過し、５．０mg／mlの最終
濃度としそして濾過除菌する。細胞毒性試験 【００７４】この細胞毒性試験において使用された試験
ヒト乳癌系はＭＣＦ−７，ＣＡＭＡ−１，ＳＫＢＲ−
３、及びＢＴ−２０であった。ヒト線維芽細胞セルライ
ンＣＣ９５及びＷＩ−３８を陰性対照として使用した。
１mlの培地中４００００個の試験細胞を、１セットの８
mlガラスバイアルに加え、そして次に複合体稀釈物（１
００μｇ／mlのＢＳＡ含有ＰＢＳ中）を加えた。３７℃
にて２２時間インキュベートした後、培地を吸引し、単
層をＰＢＳで洗浄し、そして35Ｓメチオニンを補充した
メチオニン不含培地を加えた。 【００７５】バイアルをさらに３７℃にて２時間インキ
ュベートし、培地を除去し、そして細胞を、１mg／mlの
メチオニンを含有する１０％トリクロロ酢酸２mlにより
２回洗浄した。細胞を乾燥し、シンチレーション溶液を
加え、そしてシンチレーションカウンター中で放射能を
測定した。細胞毒性を、対照（未処理）蛋白質合成の５
０％をもたらす複合体の組織培養阻害量（ＴＣＩＤ５０
％）として表示した。これらの細胞毒性試験の結果を下
記の表５中に報告する。 【００７６】表 ５ 乳癌イムノトキシンの細胞毒性〔ＴＣＩＤ５０％（nM）〕 RTA複合体 アイソタイプ MCF-7 CAMA-1 SKBR-3 BT-20 CC95 WI-38 260F9 G1 0.1 0.4 0.06 9 >50 >50 317G5 G1 0.4 5 10 2 >50 >50 113F1 G3 0.5 0.6 10 6 >50 >50 2G3 G1 0.8 1 >50 15 >50 ND 266B2 G1 1 5 0.5 10 >50 ND 280D11 G1 1 1 0.9 >40 >50 >50 245E7 G1 6 8 8 4 >50 >50 454C11 G2a 6 >20 0.3 30 >50 >50 33F8 G1 10 ND ND ND - ND -ND 369F10 M 10 ND ND ND ND ND 520C9 G1 >50 >50 10 >50 452F2 G1 20 10 736G9 G1 >50 >50 1.3 >50 741F8 G1 >80 >80 >80 758G5 G1 >50 0.3 761B10 G1 >50 1.0 ＮＤ＝決定されず。 【００７７】複合体のイン−ビボ試験 ２４５Ｅ７，２８０Ｄ１１、及び２６０Ｆ９とＲＴＡと
の複合体を、カップリング剤としてイミノチオラン又は
ＳＰＤＰを用いて上記のようにして製造した。ＸＭ−１
ヒト乳癌細胞に対するこれらの複合体のイン−ビボ効果
を下記のようにして評価した。 【００７８】雌性無胸腺Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウ
ス（２０〜２４ｇ）を用いた。中心壊死の兆候を有しな
い６００〜８００mm3 の腫瘍から１．０mm3 の断片を得
た。マウスに０．０５mlの懸濁液を中外側穿刺により腋
領域にｓ．ｃ移植した。移植の７日又は１４日後、マウ
スの重量を測定し、そしてその腫瘍負荷をキャリパスを
用いて移植片を測定することにより評価した。 【００７９】対照マウスＱ２Ｄ×６の尾静脈に複合体を
ｉ．ｖ．注射して特定の複合体の最大許容投与量を決定
した。これらの結果に基いて、腫瘍担持マウスに複合体
を投与するための投与量方法を選択した。腫瘍担持マウ
ス群及び対照マウス群に、前記選択された投与量・方法
に従って複合体を注射した。動物反応、副作用、及び死
亡率を腫瘍体積及び動物体重の測定と共に毎日モニター
した。試験期間の終りにおける腫瘍体積の変化を、試験
期間にわたる測定の全体の平均に基いて算出した。これ
らの試験の結果を下記の表６に報告する。 【００８０】表 ６ 複 合 体 ＬＤ50（μｇ／ｍ） 投与量／スケジュール 245E7-SPDP-RTA ４１０ 125μｇ iv/qod×６ 245E7-IT-RTA ３５０ 200μｇ iv/qod×５ 280D11-IT-RTA ３５０ 200μｇ iv/qod×５ 200μｇ iv/qod×４ 260F9-IT-RTA ４００ 200μｇ iv/qod×５ 100μｇ iv/qod×３−４ 245E7-IT-RTA 200μｇ iv/qod×５＋280D11-IT-RTA(カクテル） 【００８１】 腫 瘍 齢／体積 ％ ＭＸ１− ＦＢＷ 複 合 体 (6〜10マウス／群） 腫瘍増殖阻害 ＩＢＷ 245E7-SPDP-RTA 18d(300-400) 74.8(D14)3動物のみ 1.15 245E7-IT-RTA 14d(100-200) 62.5(D14)P<0.05 0.93 280D11-IT-RTA 14d(100-200) 70.0(D13)P<0.01 (1) 0.99 6d(25-50) 80.0(D14)P<0.02 0.97 260F9-IT-RTA 14d(100-200) 20.3(D14) NS(2) 1.02 14d(100-200) 17.6(D14) NS(3) 1.01 245E7-IT-RTA 14d(100-300) 70.0(D14)P<0.01 1.00 ＋280D11-IT-RTA(カクテル） 80.0(D10)P<0.001 0.91 （１）退化６０．５％（Ｄ６）Ｐ＜０．００１ ０．８４ （２）５０．８％（Ｄ１１）Ｐ＜０．０５ ０．９８ （３）４４．８％（Ｄ１１）Ｐ＜０．１ ０．８７ ＮＳ＝有意差なし Ｄ＝処理開始後の日数 【００８２】抗体親和性及び抗原濃度 請求の範囲に記載されている抗体の幾つかをヨード化
し、そしてＭＣＦ−７又はＢＴ−２０細胞への結合につ
いて試験した。抗体をクロラミンＴを用いて 125Ｉによ
り約１０μＣｉ／μｇの比活性にラベルした。免疫放射
化学的純度を決定するため、０．５mlのウシ胎児血清中
１００，０００cpm の２種類のラベル化抗体を標的細胞
の５つのアリコートに０℃にて１５分間順次吸着せしめ
（一般にアリコート当り４，０００，０００ＭＣＦ−７
乳癌細胞）、そして各吸着後の上清液中の残りの放射能
を測定した。会合定数を測定するため、既知濃度のラベ
ル化及び非ラベル化モノクローナル抗体をウシ胎児血清
中標的細胞と共に氷中で１５分間インキュベートした。 【００８３】次に、細胞／抗体混合物のアリコートをガ
ンマーカウンター中で計数し、又はミクロフォルドフィ
ルタープレート（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック）を通し
て濾過しそしてそのフィルターをカウントした。フィル
ター上の液中に残留する未結合抗体を考慮するため、同
じ濃度の抗体を含有するがしかし細胞を含有しない対照
を並行して処理した。会合定数及び標的当たりの抗原コ
ピー数を、親和性試験結果から計算し、そして下記の表
７に報告する。 【００８４】表 ７ 抗 体 ｎ Ｋａ ｎＫａ ２Ｇ３ 3.７ｅ６ 9.１ｅ６ 3.４ｅ１３ １１３Ｆ１ 2.３ｅ６ 1.１ｅ９ 2.５ｅ１５ ２６０Ｆ９ 3.１ｅ５ 5.６ｅ７ 1.７ｅ１３ ２６６Ｂ２ 8.０ｅ４ 2.７ｅ８ 2.２ｅ１３ ２８０Ｄ１１ 3.９ｅ５ 8.８ｅ６ 3.４ｅ１２ ３１７Ｇ５ 3.２ｅ６ 1.６ｅ６ 5.１ｅ１２ ４５２Ｆ２ 2.５ｅ５ 6.８ｅ６ 1.７ｅ１２ ４５４Ｃ１１ 3.９ｅ５ 4.８ｅ７ 1.９ｅ１３ ５２０Ｃ９０ 5.０ｅ５ 8.２ｅ６ 4.１ｅ１２ ｎ＝ＭＣＦ−７細胞当り抗原コピー数； Ｋａ＝ＭＣＦ−７に対する会合定数。 ｎＫａはｎとＫａとの積であり、そして細胞当り結合抗
体に対する抗体濃度に関連する。 【００８５】抗体に対する免疫沈澱試験は、それらの内
の７つ（４５４Ｃ１１，４５２Ｆ２，５２０Ｃ９，７３
６Ｇ９，７４１Ｆ８，７５８Ｇ５、及び７６１Ｂ１０）
は癌性***組織に見出される共通の単量体の約２１０，
０００ダルトン蛋白質に結合することを示した。７種類
の内の６種類（４５２Ｆ２，５２０Ｃ９，７３６Ｇ９，
７４１Ｆ８，７５８Ｇ５、及び７６１Ｂ１０）は２１
０，０００ダルトン蛋白質上の同じエピトープを認識す
ると信じられる。相対的アフィニティー研究は、これら
６種類の内５２０Ｃ９が最高の会合定数を示すことを示
した。 【００８６】請求の範囲に記載されているモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマのサンプルはアメリカ
ン・タイプ・カルチュアー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）、１２３０１パークラウイドライブ、ロックビル、
メリーランド２０８５２−１７７６、米国に寄託され
た。２１０，０００ダルトン蛋白質上の同じエピトープ
を認識する抗体を生産する６種類のハイブリドーマの内
５２０Ｃ９のみが寄託された。寄託されなかった５種類
は５２０Ｃ９と機能的に同等であると考えられる。これ
らのＡＴＣＣ受託番号及び寄託日は次の通りである。 【００８７】 ハイブリドーマ／抗体名称 寄託日 受託番号 ２６０Ｆ９ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８８ １１３Ｆ１ 1984年１月27日 ＨＢ ８４９０ ２Ｇ３ 1984年１月27日 ＨＢ ８４９１ ２８０Ｄ１１ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８７ ２６６Ｂ２ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８６ ２４５Ｅ７ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８９ ４５４Ｃ１１ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８４ ３３Ｆ８ 1985年１月９日 ＨＢ ８６９７ ３１７Ｇ５ 1984年１月27日 ＨＢ ８４８５ ５２０Ｃ９ 1985年１月８日 ＨＢ ８６９６ ３６９Ｆ１０ 1984年12月13日 ＨＢ ８６８２ ＊２６０Ｆ９−１Ｃ９ 1984年11月７日 ＨＢ ８６６２ ３１７Ｇ５（ＣＴＣＣ ００５５） 1984年12月28日 ＨＢ ８６９１ ７８８Ｇ６（ＣＴＣＣ ００５６） 1984年12月28日 ＨＢ ８６９２ ＊このクローンは２６０Ｆ９の子孫であり、そして２６０Ｆ９より良好な抗 体生産株であることが見出された。 これらの寄託はブタペスト条約のもとで行われたものであり、そしてその規定 に従って維持され他人に対して接近可能にされる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
// Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 ビョーン，マイケル ジェイ.
アメリカ合衆国，カリフォルニア
94547，ハーキュリーズ，オリーブ コ
ート 109
(56)参考文献 ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ,
43，Ｐ．1295−1300（1983)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．乳癌組織に存在し、４５４Ｃ１１（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＨＢ８４８４），４５２Ｆ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．Ｈ
Ｂ１０８１１），５２０Ｃ９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８
６９６）及び７４１Ｆ８（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１０８
０７）から成る群から選択されたハイブリドーマにより
分泌されるモノクローナル抗体と特異的に結合する２１
０ｋＤのモノマー蛋白質に特異的に結合する標識された
モノクローナル抗体又は該モノマー蛋白質に特異的に結
合するその断片を含んで成る乳癌細胞検出剤。 ２．前記モノクローナル抗体が、４５４Ｃ１１（ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．ＨＢ８４８４），４５２Ｆ２（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＨＢ１０８１１），５２０Ｃ９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．
ＨＢ８６９６）及び７４１Ｆ８（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ
１０８０７）から成る群から選択されたハイブリドーマ
により分泌されるものである、請求項１に記載の乳癌細
胞検出剤。 ３．前記モノクローナル抗体が約４．８×１０７の会合
定数を有するものである、請求項１に記載の乳癌細胞検
出剤。 ４．乳癌組織に存在し、４５４Ｃ１１（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＨＢ８４８４），４５２Ｆ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．Ｈ
Ｂ１０８１１），５２０Ｃ９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８
６９６）及び７４１Ｆ８（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１０８
０７）から成る群から選択されたハイブリドーマにより
分泌されるモノクローナル抗体と特異的に結合する２１
０ｋＤのモノマー蛋白質に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体又は該モノマー蛋白質に特異的に結合するその
断片を含んで成るイムノトキシンを含む殺乳癌剤。 ５．前記モノクローナル抗体が、４５４Ｃ１１（ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．ＨＢ８４８４），４５２Ｆ２（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＨＢ１０８１１），５２０Ｃ９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．
ＨＢ８６９６）及び７４１Ｆ８（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ
１０８０７）から成る群から選択されたハイブリドーマ
により分泌されるものである、請求項４に記載の殺乳癌
剤。 ６．前記モノクローナル抗体が約４．８×１０７の会合
定数を有するものである、請求項４に記載の殺乳癌剤。
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