RU2469093C2 - ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2469093C2 RU2469093C2 RU2008150348/10A RU2008150348A RU2469093C2 RU 2469093 C2 RU2469093 C2 RU 2469093C2 RU 2008150348/10 A RU2008150348/10 A RU 2008150348/10A RU 2008150348 A RU2008150348 A RU 2008150348A RU 2469093 C2 RU2469093 C2 RU 2469093C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proc
- protein
- human protein
- pcid
- plasmid dna
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к плазмидной ДНК pCID-PROC для экспрессии рекомбинантного протеина С человека, линии клеток яичника китайского хомячка DG-CID-PROC-1 и способу получения рекомбинантного протеина С человека. Предложенное изобретение может быть использовано для получения рекомбинантного протеина С человека. Плазмидная ДНК pCID-PROC для экспрессии рекомбинантного протеина С человека содержит последовательность полноразмерной кДНК гена протеина С человека, представленную в Перечне последовательностей как последовательность SEQ ID NO:1. Плазмидную ДНК pCID-PROC характеризуют физической картой, приведенной на Фиг.1. Линию клеток яичника китайского хомячка DG-CID-PROC-1 получают путем трансформации линии клеток яичника китайского хомячка DG-44 указанной экспрессионной плазмидной ДНК pCID-PROC. Способ получения рекомбинантного протеина С человека включает культивирование в питательной среде указанной линии клеток DG-CID-PROC-1 и выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости. Предложенное изобретение позволяет увеличить продуктивность системы экспрессии протеина С и упростить выделение, активацию и очистку рекомбинантного активированного протеина С человека. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения активированного и интактного (зимогенного) протеина С человека.
Протеин С является витамин К-зависимым белком плазмы крови. Он входит в систему гемостаза и играет исключительно важную роль при регулировании свертывания крови. Протеин С синтезируется в виде неактивной молекулы предшественника, проходит многостадийный посттрансляционный процессинг в клеточных компартментах и секретируется в виде интактной (зимогенной) формы. Активация белка С происходит в кровотоке при участии тромбомодулин-тромбинового комплекса. Активированный протеин С вместе с кофактором - протеином S выполняет антикоагулянтную функцию. Активированный белок С может предотвращать внутрисосудистый тромбоз и подавлять рост имеющихся тромбов. Механизм действия активированного протеина С и механизм активации зимогена в активную протеазу подробно изложен в работе (Gardiner I.E., Griffin I.H., Progress in Hematology, vol XIII. pp.265-278, ed Elmer B.Brown. Grime and Strattom Inc., 1983,).
Активация протеина С непосредственно осуществляется тромбином, последней сериновой протеиназой каскада свертывания крови, и опосредована связанным с мембраной эндотелиальных клеток гликопротеином тромбомодулин. Тромбомодулин образует прочный нековалентный комплекс состава 1:1 с тромбином и полностью меняет функциональные свойства тромбина. Свободный тромбин в нормальных условиях активирует тромбоциты, конвертирует фибриноген до фибрина и факторы свертывания крови V и VIII до активных формы Va и VIIIa. В то же время тромбин в комплексе с тромбомодулином теряет все вышеуказанные свойства, но эффективно активирует интактный протеин С при физиологических концентрациях ионов кальция.
Активированный протеин С, в свою очередь, избирательно инактивирует активированные формы факторов свертываемости крови V и VIII, но не их исходные формы. Следует отметить, что основные события при запуске каскада свертывания крови происходят на поверхности клеток и требуют участия мембранно-связанных белков и фосфолипидов, в то время как факторы V и VIII свободно циркулируют в кровотоке и участвуют в петле положительной обратной связи при работе системы свертывания. При их активации тромбином они ускоряют активацию фактора Х и протромбина на 5 порядков и резко ускоряют генерацию тромбина в месте запуска каскада свертывания.
Таким образом, физиологическая роль активированного протеина С может быть описана как ограничение области запуска системы свертывания крови.
Основным кофактором активированного протеина С является протеин S, другой витамин К-зависимый белок плазмы крови. Протеин S более чем в 10 раз усиливает вызываемую активированным протеином С деградацию факторов Va и VIIIa.
Протеин С является важным терапевтическим агентом (ЕР 215549, ЕР 0191606) в качестве специфического антикоагулянта, имеющего потенциально более широкую область применения, чем традиционные антикоагулянты гепарин, варфарин (оксикумарин) или производные последнего. В отличие от традиционных антикоагулянтов, активированный или интактный протеин С не воздействует на систему свертывания крови до момента появления тромбина и не вызывает падения концентрации зимогенных белков системы свертывания. Вследствие этого, антикоагулянтая терапия протеином С потенциально является более безопасной, поскольку не вызывает постоянного риска возникновения кровотечений. Экзогенный интактный протеин С также может использоваться для заместительной терапии при наследственном дефиците протеина С, вызывающего смерть в младенческом возрасте при гомозиготном дефиците и частые тромбоэмболические состояния при гетерозиготной форме дефицита.
Основной областью клинического применения активированного протеина С являются опасные для жизни тромботические состояния, в первую очередь синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром), возникающий, в том числе при развитии острого сепсиса.
Активированный протеин С является маркером сепсиса, а его уровень и дефицит коррелируют с тяжестью течения заболевания. Так, дефицит протеина С наблюдается более чем у 85% больных с тяжелым сепсисом; а также дефицит протеина С коррелирует с неблагоприятными клиническими исходами, такими как септический шок (тяжелый сепсис, сопровождающийся развитием артериальной гипотонии), ДВС-синдромом и полиорганной недостаточностью.
Поскольку концентрация протеина С в плазме крови очень мала и его отделение от других витамин К-зависимых белков системы гемостаза представляется весьма затруднительным, единственным способом получения активированного протеина С для медицинского применения является биосинтез, активация и очистка рекомбинатного белка. Наличие у протеина С так называемого Gla-домена, то есть кластера близкорасположенных остатков гамма-карбоксилированной глютаминовой кислоты, необходимо для нормального функционирования белка. Пост-трансляционное превращение остатков глютамина в остатки гамма-карбоксилированной глютаминовой кислоты возможно только в клетках млекопитающих и опосредовано сложной ферментной системой, использующей в качестве кофактора витамин К. Таким образом, единственным надежным источником рекомбинатного протеина С могут быть только культивируемые клетки млекопитающих.
Генетический вектор, содержащий полную кДНК протеина С человека, был получен путем скрининга фаговой библиотеки кДНК и описан в патентах США US4968626 и US 5302529.
Базовый способ экспрессии минигена протеина С в клетках млекопитающих описан в патенте США US 4959318. Он состоит в конструировании плазмиды, содержащей промотор вируса SV40, целевой ген и ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), котрансфекции данной плазмиды и вспомогательной плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотику неомицин, в клетки млекопитающих линий COS, BHK, A293, получению колоний стабильно трансфецированных клеток и их росту на селекционной среде, содержащей метотрексат. При использовании данного способа уровень секреции протеина С в культуральную среду оставался весьма низким и составлял около 0,05 мг/л. Кроме того, степень превращения интактного протеина С в нестабильную активированную форму была довольно значительной и при использовании линии клеток 293 достигала 90%.
Для увеличения уровня секреции протеина С были применены различные способы. В патенте США US 5618714 приведены данные об увеличении уровня секреции протеина С на 56-215% при увеличении температуры культивации клеток с 37°C до 39°C. Данный способ имеет ограниченную практическую пригодность, поскольку увеличение температуры культивации может приводить к падению жизнеспособности клеточной культуры и загрязнению секретированного протеина С продуктами распада клеток.
Другим способом увеличения продуктивности является использование систем экспрессии, основанных на введении в геном культивируемых клеток множественных копий гена протеина С. Такой подход был описан в патенте США US 5516650: при ко-трансфекции клеток линии BHK плазмидами pSV2-DHFR и pDX/PC962, содержащими ген DHFR и искусственный ген протеина С, соответственно, и последующем культивировании в присутствии метотрексата были получены клоны клеток-продуцентов, секретирующие протиеин С в культуральную среду с уровнем от 0,55 до 2,5 мг/л.
Наиболее близким по технической сущности аналогом настоящего изобретения является плазмида pL141, трансфецированная в клетки линии СНО-K1 (dhfr-), описанная в патенте США US 4775624. Использование данной системы позволяет достичь уровня секреции целевого белка в 1,8 мг/л культуры, но требует использования эмбриональной сыворотки в составе культуральной среды, что приводит к очень высокому загрязнению целевого белка посторонними полипептидами, в первую очередь бычьим сывороточным альбумином. Кроме того, уровень секреции протеина С оставался достаточно низким, что может быть связано с отсутствием полной сцепленности признаков устойчивости к метотрексату и секреции протеина С, вызванной использованием вектора с отдельными промоторами для целевого гена и гена DHFR.
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии получения активированного и интактного протеина C с более высоким выходом.
Технический результат достигался путем создания новой экспрессионной плазмидной ДНК pCID-PROC, кодирующей интактный протеин С человека и создание на ее основе линии-продуцента.
В основе данной технологии лежит разработанная авторами плазмидная ДНК pCID-PROC длиной 6174 п.о., содержащая последовательность, кодирующую белок С человека. Она состоит из фрагмента ДНК длиной 1792 п.о., содержащего последовательность полноразмерной кДНК гена белка С человека, и фрагмента 4382 п.о. плазмиды pCID, содержащего
- регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию протеина C: конститутивный промотор вируса CMV, последовательность Козак (сайт связывания рибосом) и сигнал полиаденилирования вируса простого герпеса (HSV);
- последовательность фактора устойчивости трансфецированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR) и регуляторные элементы для экспрессии DHFR - последовательность IRES вируса энцефаломиокардита. (EMCV), обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках и сигнал полиаденилирования;
- ген устойчивости к антибиотику ампициллин и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E.coli.
Плазмида pCID-PROC содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции - PvuI (5640) SpeI (54) Hind III (2772).
Имеет молекулярную массу 3,82 мДа.
Плазмида была введена в клетки DG-44 методом липосомальной трансфекции (Straus S.E. et al. J Virol. 1981 Jul:390):290-4), был получен пул стабильно трансфицированных клеток при помощи культивирования в среде, не содержащей гипоксантина и тимидина. Амплификация кассеты в геноме клеток была проведена путем последовательных культивирований в присутствии возрастающих концентраций метотрексата. Был получен пул клеток, устойчивых к высокой концентрации метотрексата, и использован для клонирования методом предельного разведения. Полученные клоны клеток-продуцентов были проанализированы методом иммуноферментного анализа и были отобраны клоны, дающие максимальный уровень экспрессии протеина C. Среди них был выбран клон DG-CID-PROC-1, при культивировании которого в суспензионной форме в бессывороточной среде уровень секреции протеина С составлял не менее 4 мг/л.
Особенности созданной конструкции, линии клеток и результаты практического применения изобретения приведены на следующих фигурах.
Фиг.1. Схематическая карта pCID-PROC, где используются следующие обозначения:
Pvul (5640) Spel (54) Hind 111 (2773) - уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции;
Ampicillin (bla) resistance gene - ген устойчивости к ампициллину;
bla promoter - бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину;
CMYPromoter - эукариотический промотор цитомегаловируса;
Kozak - сайт связывания рибосом - последовательность Козак;
Start ATOprotein С - первый кодон рамки считывания белка С;
PROC - область, кодирующая открытую рамку считывания белка С;
polyA - область, соответствующая поли-А тракту кДНК PROC;
ЕСМУ IRES - сайт связывания рибосом - последовательность IRES энцефаломиокардита, обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках;
DHFR - последовательность фактора устойчивости трансфецированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR);
ТК polyA signal - сигнал полиаденилирования.
Фиг.2. Первичная нуклеотидная последовательность фрагмента NotI-NotI плазмиды pCID-PROC, содержащего кДНК человека (длина 1792 п.о.)
Фиг.3. Аминокислотная последовательность полипептида, транслирующегося с плазмиды pCID-PROC (длина 461 аминокислота; молекулярный вес 52078.06 Да).
Клеточная линия DG-CID-PROC-1 была депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур в Институте цитологии РАН 16.03.2010 г. под номером РККК (П) 732Д.
При этом зафиксированы следующие характеристики.
1. Наименование организации, где была получена линия культивируемых клеток животных: Общество с ограниченной ответственностью "Инновационный центр «Новые технологии и материалы»"
2. Автор или авторский коллектив, дата получения штамма: Ковнир СВ., Орлова Н.А., Воробьев И.И.; 25.06.2009
3. Адрес депозитора:
Юридический: 115093, г.Москва, ул. Большая Серпуховская 44, офис 33.
Почтовый: Гематологический Научный Центр РАМН, Москва, 125167, Новый Зыковский проезд, д.4а.
4. Регистрационный номер; авторское наименование штамма:
PKKK(H)732D; DG-CID-PROC-1.
5. Причины депонирования: продуцент рекомбинантного белка; штамм, перспективный для биотехнологии.
6. Происхождение штамма:
Родительские клетки: китайский хомячок, яичник, линия СНО DG44 (Invitrogen cGMP banked, США; Mol Cell Biol 5, 1750-1759 Kaufman RJ et al. 1985).
Трансфекция, клонирование: стабильная трансфекция выполнена в Лаборатории Медицинской Биотехнологии ГУ ГНЦ РАМН,
Трансфекционный агент: Unfectine-56sp.
Трансфецированная плазмида: pCID-PROC.
Система селекции: dhff knockout/метотрексат
Кратность клонирования: 2
7. Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования:
36 пассажей от трансфекции родительской клеточной линии СНО DG44
8. Стандартные условия выращивания (состав питательной среды, температура и т.д.):
Среда: бессывороточная, определенного химического состава, CD Opti СНО (Invitrogen, США).
Температура: +37°С.
Концентрация СО2: 8%.
Скорость перемешивания: 120-130 об/мин.
9. Культуральные свойства (способ культивирования, посевная доза, кратность рассева, время субкультивирования и другие ростовые характеристики и особенности штамма):
Способ культивирования: суспензионный, в колбах Эрленмейра на орбитальной качалке 130-135 об/мин.
Посевная доза: 300000 на 1 мл.
Кратность рассева: 1:2-1:6
Другие ростовые характеристики и особенности штамма:
Селективная среда - бессывороточная, определенного химического состава, CD Opti CHO (Invitrogen, США) с добавлением L-глутамина 8 мМ + метотрексат натрия 500 нМ.
Процедура пересева: - центрифугирование суспензии на скорости 1200 об/мин, 5 мин, ресуспендирование в новой ростовой среде.
Оптимальная плотность: 1,0-1,2×106 клеток/мл.
10. Характеристика культивирования в организме животного:
не предусмотрена при использовании клеточной линии в качестве продуцента.
11. Данные по видовой принадлежности:
китайский хомячок Cricetulus griseus, яичник.
Контроль видовой идентичности: кариологический, изоферментный (ЛДГ и Г6ФДГ).
12. Маркерные признаки и методы их оценки: иммунологические, цитогенетические, биохимические, физиологические:
Морфология: эпителиоподобная.
Кариология: 2п=22, пределы изменчивости по числу хромосом 10-28, модальное число хромосом 22, псевдодиплоид, имеются микрохромосомы, количество полиплоидов 9,0%.
Биохимия: Дигидрофолатредуктазная активность по резистентности к метотрексату.
13. Контроль контаминации бактериями, микоплазмами, грибами и вирусами: бактерии, грибы методом прямого посева на питательные среды LB и Сабуро-Эммонса не обнаружены; микоплазма по ПЦР и флуоресцентному анализу не обнаружена; вирусы - нет данных.
14. Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом (для иммуноглобулинов указание класса, специфичности и методов ее оценки):
рекомбинантный белок - активированный протеин С человека,
определение методами ИФА, вестерн-блоттинг с хемилюминесцентной детекцией.
15. Характеристика биосинтеза полезных продуктов, выход продукта в среду, уровень активности и метод определения с указанием сохранения полезного свойства при длительном культивировании:
Содержание активированного протеина С в культуральной среде (при суточном культивировании клеточной суспензии плотностью 1 млн кл./мл) не менее 4 мг/л, уровень постоянен в течение 12 последовательных пассажей.
16. Способ криоконсервирования (среда, криопротектор, режим замораживания и отгрева, условия длительного хранения, жизнеспособность после криоконсервирования с указанием методов ее оценки)
Среда: бессывороточная, определенного химического состава, CD
Opti CHO (Invitrogen, США).
Криопротектор: 10% ДМСО.
Режим замораживания и отгрева: замораживание клеточной суспензии в среде с добавлением криоконсерванта, скорость падения температуры не более 1°С/мин (теплоноситель - изопентанол); разморозка быстрая, на водяной бане при 37°С.
Условия длительного хранения: 10 клеток/мл в ампуле в жидком азоте. Жизнеспособность после криоконсервирования: 81% (окраска трепановым синим).
17. Другие особенности штамма (онкогенность, присутствие вирусов и т.д.)
Онкогенность: -
Чувствительность: везикулярный стоматит (Индиана), арбовирус Гета.
Устойчивость: полиовирус 2 типа, флавивирус Модок MODV, арбовирус Батон Виллоу.
Амплифицирванный ген: dhfr.
Копия справки о депонировании прилагается.
Практическая применимость заявляемого изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение генетической конструкции pCID-PROC, кодирующей протеин С человека, для трансфекции линии клеток DG-44
В качестве источника кДНК для клонирования минигена протеина С использовали клон pCMY6-XL41NM_000312 (проприетарная коллекция компании Origene), содержащий полностью секвенированную последовательность полноразмерной кДНК гена PROC, совпадающую с теоретически определенной кДНК гена PROC человека по данным HUGO (депонирована в публичной базе данных GeneBank (http://www.ncbl.nlin.nih.gov/sites/entrez NM_000312).
Фрагмент ДНК длиной 1792 п.о., содержащий ген протеина С, получали из очищенной плазмиды pCMY6-XL41NM_000312, рестриктированной препаративно эндонуклеазой рестрикции NotI. Продукты рестрикции смешивали с 1 мкл буферного раствора для нанесения и проводили разделение в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации, визуализированную при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл и проводили выделение ДНК, используя набор реактивов "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) согласно протоколу фирмы-производителя.
Реципиентную плазмиду pCID получили на основе коммерчески доступной линеаризованной плазмидной ДНК pOptivec-TOPO при инкубации в деионизованной воде 30 минут с последующим лигированием ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва), проводившимся в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli штамма DH5ά, с генотипом F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 30 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°С на 60 секунд и инкубировали на льду 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона SOC (20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 250 мМ КСl, 10 мМ MgCl2) и инкубировали при 37°С 60 мин. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой 2xYT-агар (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 18 г/л агара), содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и помещали в термостат на 18 часов при 37°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 37°С и проводили выделение плазмидной ДНК с использованием набора реактивов "Wizard Plus SV Minipreps" («Promega», США) по стандартному протоколу фирмы-производителя..
Очищенную плазмиду pCID рестрицировали эндонуклеазой NotI, после чего проводили дефосфорилирование вектора щелочной фосфатазой (Fermentas, Литва) согласно рекомендациям производителя. Шелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°С в течение 20 минут. Рестрицированную и дефосфорилированную плазмиду обрабатывали равным объемом смеси фенол-хлороформ 1:1 и переосаждали водную фазу 3 объемами этанола. Центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл.
Реакцию лигирования очищенного фрагмента, соответствующего кДНК гена PROC человека, и реципиентной плазмиды проводили с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора (Fermentas, Литва). Лигирование вели в объеме 10 или 20 мкл, при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli штамма DH5ά, как описано выше, переносили суспензию трансформированных клеток на чашку Петри с твердой агаризованной средой 2xYT-агар, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и помещали в термостат на 18 часов при 37°С.
Колонии Е.coli анализировали на наличие вставки в правильной ориентации методом полимеразной цепной реакции (ПНР) клонов с использованием праймерных олигонуклеотидов CMVfor и PROC-AS к последовательности вектора (прямой) и вставки (обратный), поскольку сайт узнавания эндонуклеазы NotI является палиндромным. Первичные нуклеотидные последовательности праймеров CMVfor - 5'CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG3'; PROC-AS - 5'CCGTCGACGTGCTTGGACCA3'.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе Терцик МС2 («ДИК-технология», Россия) в объеме 12,5 мкл. Готовили инкубационную ПЦР-смесь следующего состава: 1х буфер для термостабильной ДНК-полимеразы; 10 пМ каждого праймерного олигонуклеотида; 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 1-2 ед. термостабильной ДНК-полимеразы с 0.1-0.2 мкг ДНК.
Бактериальные колонии переносили петлей в пробирки и одновременно делали штрихи на свежей, размеченной чашке Петри с твердой питательной средой 2xYT-агар с добавлением селективного антибиотика, которую затем помещали в воздушный термостат на 5-7 часов при 37°С.
Поверх ПЦР-смеси наслаивали 50 мкл легкого минерального масла и вели амплификацию по схеме: 1 цикл - денатурация - 94°С, 3 мин; 25 циклов - денатурация 94°С, 30 сек, отжиг Х°С 30 сек, достройка 72°С, 45-60 сек; 1 цикл - достройка 72°С, 7 мин, где расчет температуры отжига (X) производили по формуле: Х=2°С×n (А/Т)+4°С×n (Г/Ц) - 5°С, где n - число соответствующих нуклеотидов. Продукты ПЦР смешивали с 1 мкл буфера для нанесения и проводили разделение в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл).
Отобранные клоны, содержащие вставку в корректной ориентации наращивали 18 часов в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл и проводили выделение плазмидной ДНК с использованием набора реактивов "Wizard Plus SV Minipreps" («Promega», США) по стандартному протоколу фирмы-производителя. Полученные плазмиды анализировали методом рестрикции эндонуклеазой NotI и отбирали клоны, несущие 1 копию вставки.
3 отобранных таким образом плазмидных клона дополнительно исследовали методом ПЦР-секвенирования ДНК в области вставки с использованием стандартных и специфических праймеров CMVfor, PROC-AS, 1RESrev; PROC_DS1; PROC_DS2; PROC_DS3; PROC_DS4; PROC_C01; PROC_C02; PROC_C03; PROC_C04; первичные нуклеотидные последовательности праймеров:
CMVfor - 5'СОСАААТОООСООТАООСОТО3';
PROC-AS - 5'ССОТСОАСОТОСТТООАССА3';
1RESrev - 5'CGAAGCCGCTTGGAATAAGG3'
PROC_DS1 - 5'CCCTACAGGTGCCAGTGCC3';
PROC_DS2 - 5'TGGGAGGGCCGCTTCTG3';
PROC_DS3 - 5'TGCATGGATGAGTCCAAGAAGC3';
PROC_DS4 - 5'ATCCTCGGGGACCGGC3';
PROC_C01 - 5'GGCCTCCTCGAAGTCACAGATC3';
PROC_C02 - 5'CCGCGGATCTACTTGGTCTTC3';
PROC_C03 - 5'CACGAGGGTCTCCTGGCC3';
PROC_C04 - 5'AAGCCCAGCCCTGCAGG3').
Для дальнейшей работы использовалась плазмида pCID-PROC, длиной 6174 п.о., не содержавшая мутаций, для которой были полные данные секвенирования. Методом ПЦР-секвенирования с использованием указанных выше праймерных олигонуклеотидов, для конструкции pCID-PROC определяли нуклеотидную последовательность обоих комплементарных цепей ДНК для области вставки кДНК гена PROC. Данные определения первичной нуклеотидной последовательности по двум цепям, полученные с прибора для автоматического капиллярного электрофореза, экспортировались в приложение ContigExpress программного пакета VectorNTI Suite (Invitrogen, США). С использованием стандартного алгоритма производился тримминг 5'-концевых и/или 3'-концевых областей фрагментов, после чего проводили сборку контига с использованием стандартных настроек. Проводили понуклеотидное сравнение полученной консенсусной последовательности с теоретически предсказанной. Помимо кодирующей области (ОРС) кДНК гена PROC, проводилось также секвенирование областей рестриктных сайтов NotI, по которым производилось клонирование фрагмента кДНК, а также наиболее значимых регуляторных элементов экспрессионного вектора (промотор, 1RES), анализ полученных данных проводился по аналогичному алгоритму. В результате секвенирования установили, что полученный препарат плазмиды не содержат мутаций в области вставки и кодирует кДНК гена PROC. Созданную генетическую конструкцию использовали для получения линии-продуцента.
Плазмидную ДНК pCID-PROC амплифицировали в клетках бактерий в препаративных количествах, выделили при помощи щелочного лизиса бактерий и трехстадийной хроматографической очистки (сорбенты Sepharose 4B Fast Flow, PlasmidSelect Xtra, Source 15 Q, Amersham) по методике производителя сорбентов, часть полученной высокоочищенной плазмидной ДНК, не содержащей пирогенов, дополнительно перевели в линейную форму рестрикцией PvuI и очистили от рестриктазы экстракцией фенолом-хлороформом и преципитацией этанолом. Полученные формы плазмиды для трансфекции клеток перевели в фосфатно-солевой раствор при помощи диализа и стерилизовали при помощи фильтра 0,22 мкм.
Пример 2. Конструирование эукариотических продуцентов протеина С DG-CID-PROC-1 трансфицированием клеток яичника хомячка линии DG-44 цитомегаловирусным вектором с использованием плазмиды pCID-PROC
Клетки яичника китайского хомячка линии DG-44, нокаутные по гену dhfr и адаптированные к культивированию в бессывороточной среде, были получены в компании Invitrogen, Ltd. (США). Описанная ниже методика трансформирования относится к клеткам DG-44, как линии клеток-хозяев, однако методика в целом применима и к большинству клеточных линий, включая другие линии клеток яичника китайского хомячка (СНО), человеческие эмбриональные почечные клетки линии 293, фибробласты почек сирийского хомячка ВНК, также пригодные для экспрессии конструкции pCID-PROC.
Клетки DG-44 полученные в криопробирках по 1 мл, содержащих замороженную суспензию клеток приблизительно 107 клеток в среде CD DG-44 (Gibco) с 10% диметилсульфоксида (DMSO). Содержимое сосуда размораживают при 37°С и добавляют к 30 мл полной среды DG-44. Полная среда состоит из ВП-44 (Cibco) с 8 mM L-глутамина и 1,8 мл/л сурфактанта Pluronic F-68 (BASF Inc.) и содержит достаточные для роста DHFR отрицательных клеток количества гипоксантина и тимидина. Клетки культивируют в колбах Эрленмеера на орбитальной качалке при 130 об/мин в атмосфере, содержащей 8% углекислого газа, при температуре 37°С. Подсчет плотности клеточной суспензии и доли живых клеток проводится в камере Горяева, при окрашивании трепановым синим. Субкультивируют с частотой 1 раз в 24-48 часов по достижении концентрации 1.2×106. Для этого удаляют старую среду центрифугированием в течение 5 минут на скорости 1200 об/мин, ресуспендируют клеточный осадок свежей средой и распределяют в новые колбы Эрленмеера с отношением субкультивирования 1:6.
За 48 часов до трансфекции клетки высевают по описанной методике в количестве 9×106 клеток на 1 колбу. В день трансфекции доля живых клеток должна составлять не менее 95%. Клетки в день трансфекции не центрифугируя разводят до конечной концентрации 1,5×107 клеток на 30 мл среды DG-44 в колбах Эрленмеера. Стерильную, осажденную этанолом плазмидную ДНК растворяют в PBS-буфере и используют для получения трансфекционной смеси, содержащей 18 мкг плазмидной ДНК, 15 мкл трансфекционного агента FreeStyle MAX (Invitrogen) в 1,2 мл вспомогательной среды Opti-Pro SFM MAX (Invitrogen). Плазмидная ДНК, используемая для трансфекции, представляет собой смешанные в соотношении 20:1 плазмиды pCID-PROC, линеаризованной эндонуклеазой рестирикции PvuI, и сверхспирализованной pEGFP. Трансфекционную смесь осторожно перемешивают и инкубируют 10-20 минут, а затем осторожно добавляют во вращающуюся колбу, содержащую клетки DG-44, в указанной выше концентрации. Экспрессируемый в трансфецированных клетках флуоресцентный белок используется для оценки эффективности трансфекции. Для этого через 12 часов после трансфекции в пробе клеток определяют долю флуоресцирующих при анализе с помощью пары оптических фильтров EGFP. Полученное соотношение характеризует интенсивность транзиентной экспрессии в трансфецированных клетках.
Данное изобретение включает вектор экспрессии, содержащий селективный маркер для эукариотических клеток, нокаутных по гену dhfr. Известно использование дигидрофолатредуктазного (dhfr) гена или производного dhfr-гена (dhfr-mix), придающего устойчивость к метотрексату (МТХ), в качестве селективного маркера для введения гена или плазмиды в клеточные линии, лишенные dhfr, и последующее применение метотрексата для размножения копий плазмид. Клетки DG-44 являются dhfr нокаутными (негативными), поэтому трансфектанты, содержащие плазмиду pCID-PROC с последовательностью гена dhfr, селектируются на основе dhfr-позитивного фенотипа, так как способны расти в среде, лишенной гипоксантина и тимидина. Клеточные линии, нокаутные по dhfr-гену и трансформированные dhfr-содержащими плазмидами, могут быть отобраны на основе dhfr-позитивного фенотипа.
Для отбора стабильных трансформантов с включением в хромосомную последовательность генетической конструкции pCID-PROC трансфецированные клетки DG-44 пересаживают в среду OptiCHO (Invitogen), не содержащую гипоксантин и тимидин, и культивируют по следующей методике. Проводят подсчет плотности клеточной суспензии и доли живых клеток в счетной камере Горяева при окрашивании трепановым синим. Затем удаляют старую среду центрифугированием в течение 5 мин на скорости 1200 об/мин, ресуспендируют клеточный осадок свежей средой CD OptiCHO (Invitogen), с добавлением L-глутамина в конечной концентрации 8 mM, и распределяют в новые колбы Эрленмеера по 9×106 клеток на колбу. Клетки культивируют в колбах Эрленмеера на орбитальной качалке при 130 об/мин в атмосфере, содержащей 8% углекислого газа при температуре 37°С. Субкультивируют с частотой 1 раз, в 3 дня в течение 10-14 дней до достижения доли живых клеток более 90%. В качестве контроля при отборе трансфектантов, положительных по dhfr, используют клетки, трансфецированные плазмидным вектором pOptiVec, экспрессирующие дигидрофолатредуктазу без сцепленности этого признака с другими. По достижении доли живых клеток 90% и более замораживается промежуточный клеточный банк с образцами, содержащими по 107 клеток в 1 мл среды CD OptiCHO с добавлением 10% DMSO.
Для амплификации целевого признака экспрессии активированного белка С проводится селекционное культивирование в присутствии нарастающих доз метотрексата. Для этого образцы из промежуточного банка размораживаются по описанному выше протоколу с теми изменениями, что в качестве культивационной среды используется CD OptiCHO (Invitrogen), с добавлением L-глутамина в конечной концентрации 8 mM. Затем в культивационную среду добавляется метотрексат в диапазоне концентраций от 250 нМ до 4 мкМс удвоением рабочей концентрации МТХ на каждом шаге амплификации. Переход к следующему шагу амплификации осуществляют каждые 14-21 день по достижении доли живых клеток более 90%. На каждом шаге амплификации уровень экспрессии протеина С в культуре клеток определяется иммуноферментным анализом. Клетки-продуценты последнего шага амплификации клонируются методом предельных разведений и адаптируются к культивированию на твердой подложке.
Описанные в данном примере методики применимы для создания линий клеток-продуцентов активированного белка С на основе любых эукариотических клеточных линий, имеющих генетический нокаут гена dhfr-, как прикрепленных, так и суспензионных, а также трансформированных как описанным методом, так и с использованием других липосомальных агентов, а также методами кальций-фосфатной трансфекции, нуклеофекции или микроинъекции.
Claims (3)
1. Плазмидная ДНК pCID-PROC для экспрессии рекомбинантного протеина С человека, содержащая последовательность полноразмерной кДНК гена протеина С человека, представленную в Перечне последовательностей как последовательность SEQ ID NO:1, при этом указанная плазмида характеризуется физической картой, приведенной на фиг.1.
2. Линия клеток яичника китайского хомячка DG-CID-PROC-1 - продуцент рекомбинантного протеина С человека, полученная путем трансформации линии клеток яичника китайского хомячка DG-44 экспрессионной плазмидной ДНК pCID-PROC по п.1.
3. Способ получения рекомбинантного протеина С человека, включающий следующие стадии:
- культивирование в питательной среде линии клеток по п.2 - продуцента рекомбинантного протеина С человека; и
- выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.
- культивирование в питательной среде линии клеток по п.2 - продуцента рекомбинантного протеина С человека; и
- выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008150348/10A RU2469093C2 (ru) | 2008-12-19 | 2008-12-19 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008150348/10A RU2469093C2 (ru) | 2008-12-19 | 2008-12-19 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008150348A RU2008150348A (ru) | 2010-06-27 |
RU2469093C2 true RU2469093C2 (ru) | 2012-12-10 |
Family
ID=42683125
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008150348/10A RU2469093C2 (ru) | 2008-12-19 | 2008-12-19 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2469093C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2552170C2 (ru) * | 2013-05-14 | 2015-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Экспрессионный плазмидный вектор моноцистронной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, линия клеток млекопитающих-продуцентов рекомбинантного белка, способ получения рекомбинантного белка |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
US4959318A (en) * | 1985-06-27 | 1990-09-25 | Zymogenetics, Inc. | Expression of protein C |
RU1830081C (ru) * | 1987-12-04 | 1993-07-23 | Эли Лилли Энд Компани | Способ получени рекомбинантного активированного белка С человека |
US5302529A (en) * | 1985-08-15 | 1994-04-12 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Plasmid coding for human protein C |
US5516650A (en) * | 1985-06-27 | 1996-05-14 | Zymogenetics, Inc. | Production of activated protein C |
-
2008
- 2008-12-19 RU RU2008150348/10A patent/RU2469093C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
US4959318A (en) * | 1985-06-27 | 1990-09-25 | Zymogenetics, Inc. | Expression of protein C |
US5516650A (en) * | 1985-06-27 | 1996-05-14 | Zymogenetics, Inc. | Production of activated protein C |
US5302529A (en) * | 1985-08-15 | 1994-04-12 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Plasmid coding for human protein C |
RU1830081C (ru) * | 1987-12-04 | 1993-07-23 | Эли Лилли Энд Компани | Способ получени рекомбинантного активированного белка С человека |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2552170C2 (ru) * | 2013-05-14 | 2015-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Экспрессионный плазмидный вектор моноцистронной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, линия клеток млекопитающих-продуцентов рекомбинантного белка, способ получения рекомбинантного белка |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2008150348A (ru) | 2010-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6754414B2 (ja) | ヒト細胞系における組換えヒトタンパク質の無血清安定トランスフェクションおよび製造 | |
JP2024096417A (ja) | 改変された幹細胞メモリーt細胞、その作製方法およびその使用方法 | |
JP7075463B2 (ja) | 哺乳類細胞の培養方法 | |
KR20130140221A (ko) | 감마 카르복실화를 필요로 하는 단백질 생산용 벡터를 포함하는 숙주 세포 | |
AU2008205445A1 (en) | Method for producing gamma-carboxlated proteins | |
US20230383276A1 (en) | Process for making recombinant antidote to factor xa inhibitor | |
JPH04228066A (ja) | 外来遺伝子発現用培養細胞 | |
EP1405910A1 (en) | Process for producing human thrombin by gene modification technique | |
RU2469093C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА | |
RU2561466C2 (ru) | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора | |
RU2500816C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАК380, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 1E6 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ | |
Guarna et al. | Effect of cDNA copy number on secretion rate of activated protein C | |
JP4157644B2 (ja) | 高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法 | |
RU2585532C2 (ru) | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека и способ получения указанного фактора | |
RU2429294C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА | |
BR102017004788B1 (pt) | Método de produção de cola de fibrina de origem recombinante | |
EP2633058B1 (en) | Method for mass production of factor vii/viia | |
TWI316958B (ru) | ||
RU2744592C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pET21-TF7, обеспечивающая синтез модифицированного тканевого фактора, и штамм Escherichia coli BL21(DE3) pET21-TF7 - продуцент рекомбинантного тканевого фактора человека | |
RU2552170C2 (ru) | Экспрессионный плазмидный вектор моноцистронной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, линия клеток млекопитающих-продуцентов рекомбинантного белка, способ получения рекомбинантного белка | |
JP2005073509A (ja) | ヒトアンチトロンビンの生産方法 | |
CN104293737A (zh) | 一种包含表达功能性重组人凝血因子ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法 | |
RU2448160C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pAP271, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ФАКТОРА VII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, И ЛИНИЯ КЛЕТОК Mesocricetus auratus ВНК 21 k.13 (2H7) - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА | |
CN105400819A (zh) | 一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法 | |
RU2500818C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАР227, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 2H5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161220 |