JP2006503551A - アルデヒド脱水素酵素ii - Google Patents
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Abstract
Description
a)分子量100,000±10,000Da(2個の相同のサブユニットからなる)または分子量150,000±15,000Da(3個の相同のサブユニットからなる)であって、各々のサブユニットは分子量55,000±2,000Daを有する;
b)基質特異性:アルデヒド化合物に対して活性、
c)補助因子:ピロロキノリンキノン(PQQ)、
d)至適pH約6.5〜約8.0(L−ソルボソンからのビタミンCの製造に対して)または至適pH約9.0(L−ソルボソンからの2−ケト−L−グロン酸の製造に対して)、
e)阻害物質:Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、およびモノヨード酢酸、
を有する精製アルデヒド脱水素酵素を提供する。
本発明のSNDH IIは、電子受容体の存在下に、L−ソルボソンのビタミンCおよび/または2−KGAへの酸化を、以下の反応式にしたがって触媒する:
L−ソルボソン+電子受容体 → ビタミンCおよび/または2−KGA+還元された電子受容体
反応混合物は、最終容量が水100μlで、1.0mM PMS、25mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、1.0μM PQQ、1.0mM CaCl2、50mML−ソルボソンおよび酵素溶液からなり、この反応混合物はアッセイの直前に調製した。他に特記しない限り、反応は30℃で60分間行った。酵素活性の指標となるビタミンCの量は、高速液体クロマトグラフィーシステム(HPLC)により、264nmで測定したが、そのシステムは、UV検出器(東ソーUV8000;東ソー株式会社、東京都中央区京橋3−2−4、日本)、ジュアルポンプ(東ソーCCPE;東ソー株式会社)、積分器(島津C−R6A;島津製作所、京都市中京区西ノ京桑原町1、日本)およびカラム(YMC−PackポリアミンII;YMC社、3233 Burnt Mill Drive Wilimington, NC28403, USA)よりなる。酵素活性の他の指標である、製造された2−KGAの量は、上記のHPLCにより測定された。各々の製造に対する酵素活性の1単位は、反応混合物中に、ビタミンCおよび2−KGAをそれぞれ1mg製造する酵素の量として定義した。
反応混合物は、最終容量が水100μlで、0.1mM DCIP、1.0mM PMS、50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、1.0μM PQQ、2〜100mM 基質(L−ソルボソン、D−グルコソン、D−グルコース、など)および酵素溶液からなり、この反応混合物はアッセイの直前に調製した。反応は25℃でL−ソルボソンと共に開始し、酵素活性は、600nmでのDCIPの初期還元速度として測定した。酵素活性の1単位は、1分間あたり1μmolのDCIPの還元を触媒する酵素の量として定義した。DCIPの吸光係数はPH7.0で14.2mM-1であった。対照キュベットは、L−ソルボソンを除く全ての上記の成分を含んでいた。
酵素の基質特異性は、100mMリン酸カリウム(pH7.5)または100mMトリス−HCl(pH9.0)を緩衝液として用いた以外は、上記1b)に記載したのと同じ酵素アッセイ法を用いて測定した。pH7.5および9.0の双方において、D−グルコソン(2mM)、D−グルコース(100mM)、およびD−キシロース(100mM)に対するSNDH IIの相対活性は、L−ソルボソン(2mM)に対するそれより高かった。しかしながら、pH7.5および9.0の双方において、L−ソルボース(100mM)、D−ソルビトール(100mM)、およびL−グロノ−γ−ラクトン(100mM)に対する相対活性は、L−ソルボソンに対する活性の1%より低かった。これらの結果を表1Aに示す。
SNDH IIの反応速度と反応混合液のpH値との間の相関関係を、種々のpH値および100mM濃度の緩衝液を用いた以外は、上記1a)に記載したのと同じアッセイ方法により測定した。
この酵素は、ビタミンCの製造に対して、pH約6.5〜約8.0で比較的高い活性を示し、そして2−KGAの製造に対して、pH約9.0で、高い活性を示した。
酵素反応に対する温度の影響を、種々の温度を用いた以外は、上記1a)に記載したのと同じアッセイ方法により試験した。ビタミンCと2−KGAの双方の製造において、酵素反応は、少なくとも40℃まで安定に行われた。
この酵素のL−ソルボソン脱水素酵素活性に対する金属イオンと阻害剤の影響は、上記1b)に記載したのと同じアッセイ方法を用いて活性を測定することにより調べた。各化合物の溶液を、基本となる反応混合物に撹拌して入れ、反応を酵素の添加により開始した。結果を表2に示す。
酵素の分子量は、サイズ排除ゲルカラム(TSK−ゲルG3000 SWXL;東ソー株式会社、東京都港区赤坂1−7−7、日本)で測定した。酵素は、クロマトグラフィーで見かけの分子量が約100,000±10,000Daおよび約150,000±15,000に相当する2つのピークを示した。この酵素をCBBで染色した10%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析することにより、精製酵素が、各々分子量約55,000±2,000Daの2〜3個の均一なサブユニットからなることが示された。この酵素の二量体型および三量体型の双方が活性である。
100mM NaH2PO4−HCl(pH約1.0)50μl中の精製SNDH II(0.1mg)を等容量のメタノールで添加し、よく混合した。試料を遠心分離して、析出物を除去した。得られた上清を、補欠分子族の分析に使用した。抽出物の吸収スペクトルは、PQQ(三菱ガス化学、日本)の標準試料とほとんど同一であった。その吸収ピークは、251および348nmに見出された。さらに、逆相カラム(YMC−Pack Pro C18 AS−312;YMC株式会社)を用いる313nmの波長でのHPLC分析により、メタノールでのSNDH II抽出物は、標準PQQのそれと同じ保持時間を示した。
1mM〜8mMまでの種々の濃度のL−ソルボソンでの酸化反応の速度を測定して、L−ソルボソンのKm値を決定した。ミカエリス定数は、DCIPを反応の電子受容体として用いた場合の反応速度に基づくラインウィーバー・バーク(Lineweaver-Burk)プロットから、pH7.5および9.0で、それぞれ14.7mMおよび20.0mMであると計算された。
酵素の精製は、公知の精製法の任意の組み合わせ、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、塩析および透析により行う。
a)ソルボースから2−KGAを産生、
b)エタノールは酢酸に酸化される、
c)D−グルコースはD−グルコン酸と2−ケト−D−グルコン酸に酸化される、
d)ポリアルコールのケトン体生成能、
e)pH4および5のマンニトール培養液(24時間培養)中で外皮および環生長、およびpH4.5のグルコース培養液中で外皮生長、
f)グリセリンは実質的にはジヒドロキシアセトンに酸化されない、
g)ソルビトールおよびグルカル酸から2−ケト−D−グルカル酸を産生、ただし、グルコース、フルクトース、グルコン酸、マンニトールまたは2−ケト−D−グルコン酸からは非産生、
h)多形、外見上、鞭毛なし、
i)褐色色素がフルクトースから産生される、
j)バチルス メガテリウム(Bacillus megaterium)またはその細胞抽出物の存在下に共培養すると、良好に生長、
k)ストレプトマイシン感受性。
(1)細胞を液体培養液から遠心分離または濾過により採取する。
(2)採取した細胞を水、生理食塩水または適切なpHの緩衝溶液で洗浄する。
(3)洗浄した細胞を緩衝溶液に懸濁し、ホモジナイザー、ソニケーター、またはフレンチプレスにより、あるいはリゾチームなどでの処理により破砕して、破砕した細胞の溶液を得る。
(4)破砕細胞の無細胞抽出物から、好ましくは微生物の可溶性画分から、SNDH IIを単離して精製する。
SNDH IIの調製
すべての操作は8℃で行い、他に明記しない限り、緩衝液は0.05Mリン酸カリウム(pH7.0)であった。
(1)グルコノバクター オキシダンス DSM No. 4025(FERM BP−3812)の培養
グルコノバクター オキシダンス DSM No. 4025(FERM BP−3812)を、5.0%D−マンニトール、0.25%MgSO4・7H2O、1.75%コーンスティープリカー、5.0%パン酵母、0.5%尿素、0.5%CaCO3および2.0%寒天を含有する寒天プレート上で27℃、4日間成育させた。一白金耳の細胞を、2%L−ソルボース、0.2%酵母エキス、0.05%グリセリン、0.25%MgSO4・7H2O、1.75%コーンスティープリカー、0.5%尿素および1.5%CaCO3を含有する、500mlの三角フラスコ中の50mlの種母培養培地に接種し、30℃で180rpmで1日、回転振盪器で培養した。このようにして調製した種母培養物を2Lの培地に接種するために用いたが、この培地は3Lのジャーファーメンター中で、8.0%L−ソルボース、0.05%グリセリン、0.25%MgSO4・7H2O、3.0%コーンスティープリカー、0.4%酵母エキスおよび0.15%消泡剤を含んでいた。発酵パラメーターは、撹拌速度800rpmおよび30℃の温度で通気量0.5vvm(空気の容量/培地の容量/分)であった。pHは、発酵の間、水酸化ナトリウムで7.0に維持した。3セットのファーメンターを用いることにより、培養48時間後、グルコノバクター オキシダンス DSM No. 4025 株(FERM BP−3812)の細胞を含む培養液6Lを、連続遠心分離により採取した。細胞を含むペレットを回収し、適当量の食塩水に懸濁した。懸濁液を2,500rpm(1,000×g)で遠心分離した後、わずかに赤味がかった細胞を含む上清を回収して、培地の成分であったコーンスティープリカーおよび酵母エキス由来の不溶物質を除去した。次いで、上清を8,000rpm(10,000×g)で遠心分離して細胞ペレットを得た。その結果、湿潤重量38.4gのグルコノバクター オキシダンスDSM No. 4025(FERM BP−3812)の細胞を6Lの培養液から得た。
細胞ペーストの一部(19.2g)を100mlの緩衝液で懸濁し、フレンチ加圧細胞プレスを通した。損傷していない菌体を除去するために遠心分離した後、上清を無細胞抽出物とし、この無細胞抽出物を100,000×gで60分間遠心分離した。得られた上清(112ml)をグルコノバクター オキシダンス DSM No. 4025(FERM BP−3812)の可溶性画分とした。この画分を緩衝液に対して透析した後、L−ソルボソンからのビタミンC製造に対する比活性が0.172単位/mgタンパク質である透析画分112mlを次の精製工程に用いた。
透析物(112ml)を、緩衝液で平衡化したDEAE−セルロースのカラム(WhatmanDE-52,3×50cm;Whatman BioSystems Ltd., Springfield MIII, James Whatman Way, Maidstone, Kent, U.K.)にのせ、緩衝液で洗浄して副次的なタンパク質を溶出させた。次いで、緩衝液中0.28〜0.58MのNaClによる直線勾配溶出を行った。主たる酵素活性は、0.36MのNaClで溶出した。活性画分(97.5ml)を集めた。
前の工程からの透析活性画分の一部(97ml)を、緩衝液で平衡化したDEAE−セファロースCL−6Bのカラム(Pharmacia、3.0×25cm)にのせた。0.3MのNaClを含む緩衝液でカラムを洗浄した後、0.3〜0.45MのNaClの直線勾配を緩衝液に加えた。活性画分は、0.44〜0.47Mの範囲のNaCl濃度で溶出した。活性画分(40ml)を集め、緩衝液に対して透析した。
透析した活性画分(40ml)を、緩衝液で平衡化したQ−セファロース(Pharmacia,1.5×25cm)のカラムにのせた。0.3MのNaClを含む緩衝液でカラムを洗浄した後、0.3〜0.5MのNaClの直線勾配を緩衝液に加えた。活性画分は、0.44〜0.46Mの範囲のNaCl濃度で溶出した。
前工程からのプールした活性画分(17ml)を緩衝液に対して透析した。透析試料(17ml)を、緩衝液で平衡化したQ−セファロースのカラム(Pharmacia、1.5×25cm)にのせた。このカラムを0.33MのNaClを含む緩衝液で洗浄した後、0.33〜0.48MのNaClの直線勾配を緩衝液に加えた。活性画分は、0.45〜0.48Mの範囲のNaCl濃度で溶出した。
前工程からの活性画分を、限外濾過装置(Centriprep-10)で濾過して、脱塩および濃縮した。脱塩および濃縮試料(780μl)の一部(750μl)を、3M硫酸アンモニウム(最終濃度:1.5M)を含む等量(750μl)の緩衝液に加えた。試料を遠心分離(15,000×g)した後、上清を、1.5M硫酸アンモニウムを含む緩衝液で平衡化した疎水性カラムRESOURCE ISO(Pharmacia、ベッド容量:1.0ml)にのせた。カラムを、1.5M硫酸アンモニウムを含む緩衝液で洗浄した後、タンパク質を、1.5〜0.75Mの硫酸アンモニウムの直線勾配を含む緩衝液で溶出した。SNDH IIに相当する活性は、1.04〜1.00Mの範囲の硫酸アンモニウム濃度で溶出した。活性画分を、透析カップ(透析カップMWCO 8000、第一純薬、東京都中央区日本橋3−13−5、日本)を用いて、緩衝液に対して透析した。その後、画分を集め、−20℃で保存した。
ビタミンCに対する比活性48.9単位/mgタンパク質および2−KGAに対する比活性12.3単位/mgタンパク質の精製酵素(0.039mg/ml)を以下の分析に用いた:
精製酵素(0.39μg)、L−ソルボソン(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)およびPQQ(1μM)を含む反応混合液を緩衝液100μl中で、1時間、30℃でインキュベーションした。反応生成物を薄層クロマトグラフィー(シリカゲル60F254,MERCK,64271 Darmstadt,ドイツ)およびHPLCで分析した。2種類の生成物、ビタミンCと2−KGAが酵素反応から得られた。ビタミンCについては、試料を、HPLCシステムで、アミノ−カラム(YMCパック ポリアミン−II、YMC社)によりアッセイした。2−KGAについては、試料を、HPLCシステムで、C−18カラム(YMCパック Pro C18、YMC社)によりアッセイした。
SNDH IIによるL−ソルボソンからのビタミンCまたは2−KGAの製造に対するpHの影響
酵素反応に対するpHの影響を試験した。緩衝液(100mM)100μl中の精製酵素(273ng)、L−ソルボソン(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)およびPQQ(1μM)を含む反応混合液を、1時間、30℃でインキュベーションした。反応生成物をHPLCで分析した。結果を表4に示す。
SNDH IIによるL−ソルボソンからのビタミンCまたは2−KGAの製造に対する温度の影響
酵素活性に対する温度の影響を試験した。25mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)100μl中の精製酵素(390ng)、L−ソルボソン(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)およびPQQ(1μM)を含む反応混合液を、1時間、種々の温度(20〜60℃)でインキュベーションした。反応生成物をHPLCで分析した。結果を表5に示す。
Claims (13)
- 以下の物理化学的性質:
a)分子量100,000±10,000Da(2個の相同のサブユニットからなる)または分子量150,000±15,000Da(3個の相同のサブユニットからなる)であって、各々のサブユニットは分子量55,000±2,000Daを有する;
b)基質特異性:アルデヒド化合物に対して活性、
c)補助因子:ピロロキノリンキノン(PQQ)、
d)至適pH約6.5〜約8.0(L−ソルボソンからのビタミンCの製造に対して)または至適pH約9.0(L−ソルボソンからの2−ケト−L−グロン酸の製造に対して)、
e)阻害物質:Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、およびモノヨード酢酸、
を有する精製アルデヒド脱水素酵素。 - アルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター(Gluconobacter)属に属する微生物に由来する、請求項1記載のアルデヒド脱水素酵素。
- 微生物がグルコノバクター オキシダンス(Gluconobacter oxydans)DSM No.4025株(FERM BP−3812)の同定特性をもつグルコノバクター オキシダンス(Gluconobacter oxydans)、その継代培養株または変異株である、請求項2記載のアルデヒド脱水素酵素。
- 微生物がグルコノバクター オキシダンス(Gluconobacter oxydans)DSM No. 4025(FERM BP−3812)、その継代培養株または変異株である、請求項3記載のアルデヒド脱水素酵素。
- 以下の物理化学的性質:
a)分子量100,000±10,000Da(2個の相同のサブユニットからなる)または分子量150,000±15,000Da(3個の相同のサブユニットからなる)であって、各々のサブユニットは分子量55,000±2,000Daを有する;
b)基質特異性:アルデヒド化合物に対して活性、
c)補助因子:ピロロキノリンキノン(PQQ)、
d)至適pH約6.5〜約8.0(L−ソルボソンからのビタミンCの製造に対して)または至適pH約9.0(L−ソルボソンからの2−ケト−L−グロン酸の製造に対して)、
e)阻害物質:Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、およびモノヨード酢酸、
を有するアルデヒド脱水素酵素の製造方法であって、好気性条件下、水性栄養培地中で、上記の性質を有するアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物を培養し、その微生物の細胞を破砕し、そしてその微生物の破砕された細胞の無細胞抽出物からアルデヒド脱水素酵素を単離精製することを含んでなる方法。 - 反応が、pH約5.5〜9.0および温度約20〜約50℃で行われる、請求項5記載の方法。
- 電子受容体の存在下に、アルデヒドを、以下の物理化学的性質:
a)分子量100,000±10,000Da(2個の相同のサブユニットからなる)または分子量150,000±15,000Da(3個の相同のサブユニットからなる)であって、各々のサブユニットは分子量55,000±2,000Daを有する;
b)基質特異性:アルデヒド化合物に対して活性、
c)補助因子:ピロロキノリンキノン(PQQ)、
d)至適pH約6.5〜約8.0(L−ソルボソンからのビタミンCの製造に対して)または至適pH約9.0(L−ソルボソンからの2−ケト−L−グロン酸の製造に対して)、
e)阻害物質:Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、およびモノヨード酢酸、
を有する精製アルデヒド脱水素酵素または上記の性質を有するアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物と接触させることを含んでなる、カルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから製造する方法。 - 微生物がグルコノバクター オキシダンス(Gluconobacter oxydans)DSM No. 4025株(FERM BP−3812)の同定特性をもつグルコノバクター オキシダンス(Gluconobacter oxydans)、その継代培養株または変異株である、請求項5〜7のいずれか1項記載の方法。
- 微生物がグルコノバクター オキシダンス(Gluconobacter oxydans)DSM No.4025(FERM BP−3812)、その継代培養株または変異株である、請求項8記載の方法。
- ラクトンがビタミンCであり、カルボン酸が2−ケト−L−グロン酸であり、そしてアルドースがL−ソルボソンである、請求項7記載の方法。
- 反応が、ビタミンCおよび2−ケト−L−グロン酸の製造に対して、それぞれpH約5.5〜約9.0および温度約20〜約50℃で行われる、請求項7〜10のいずれか1項記載の方法。
- 反応が、ビタミンCの製造に対して、pH約6.5〜約8.0および温度約20〜約40℃で、そして、2−ケト−L−グロン酸の製造に対して、pH約9.0および温度約20〜約30℃で行われる、請求項7〜11のいずれか1項記載の方法。
- 電子受容体の存在下に、アルデヒドを、精製アルデヒド脱水素酵素またはアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物と接触させることを含んでなる、カルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから製造する方法における、請求項1の精製アルデヒド脱水素酵素の使用。
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