JP2704760B2 - 凝集抗体 - Google Patents
凝集抗体Info
- Publication number
- JP2704760B2 JP2704760B2 JP1153500A JP15350089A JP2704760B2 JP 2704760 B2 JP2704760 B2 JP 2704760B2 JP 1153500 A JP1153500 A JP 1153500A JP 15350089 A JP15350089 A JP 15350089A JP 2704760 B2 JP2704760 B2 JP 2704760B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- serum
- crp
- glutaraldehyde
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫血清検査に有用な凝集抗体、更に詳細に
は、免疫比濁法（以下、TIA法と称する）による抗原の
測定において、低濃度の抗原でも高感度に測定すること
のできる凝集抗体に関する。
は、免疫比濁法（以下、TIA法と称する）による抗原の
測定において、低濃度の抗原でも高感度に測定すること
のできる凝集抗体に関する。
〔従来の技術〕 臨床検査の中で免疫血清検査は操作が煩雑で測定に長
時間を要するが、近年、TIA法の開発により自動化が可
能となり、現在、TIA法による多くの臨床診断薬が提供
されている。
時間を要するが、近年、TIA法の開発により自動化が可
能となり、現在、TIA法による多くの臨床診断薬が提供
されている。
TIA法の測定原理は、抗原抗体反応により生ずる抗原
抗体複合物の濁度を光学的に測定することにある。しか
し、TIA法は低濃度領域における測定感度が低いという
欠点がある。そこで、抗原抗体複合物の粒子を大きくし
て濁度を高め測定感度を増大させる方法が行われてお
り、斯かる方法としてはラテックス比濁法がある。しか
しながら、ラテックス比濁法は測定レンジがせまく、高
濃度領域においてはTIA法に比較しプロゾーン現象が早
く現われるという問題点があった。
抗体複合物の濁度を光学的に測定することにある。しか
し、TIA法は低濃度領域における測定感度が低いという
欠点がある。そこで、抗原抗体複合物の粒子を大きくし
て濁度を高め測定感度を増大させる方法が行われてお
り、斯かる方法としてはラテックス比濁法がある。しか
しながら、ラテックス比濁法は測定レンジがせまく、高
濃度領域においてはTIA法に比較しプロゾーン現象が早
く現われるという問題点があった。
従って、測定レンジが広いというTIA法の利点を損う
ことなく、低濃度領域の抗原を高感度で測定できる方法
の開発が所望されていた。
ことなく、低濃度領域の抗原を高感度で測定できる方法
の開発が所望されていた。
斯かる実状において、本発明者は鋭意研究を行った結
果、化学的架橋剤を用いて重合したIgGの重合体を含む
凝集抗体を用いれば上記目的が達成されることを見出
し、本発明を完成した。
果、化学的架橋剤を用いて重合したIgGの重合体を含む
凝集抗体を用いれば上記目的が達成されることを見出
し、本発明を完成した。
従って、本発明は、検出すべき抗原に対して特異的な
IgGを化学的架橋剤を用いて重合した該IgGの２〜３量体
を含有することを特徴とする免疫比濁法に使用する凝集
抗体を提供するものである。
IgGを化学的架橋剤を用いて重合した該IgGの２〜３量体
を含有することを特徴とする免疫比濁法に使用する凝集
抗体を提供するものである。
本発明の凝集抗体は、抗血清から、硫安塩析、透析等
の常法によってγ−グロブリン分画を分離、精製し、こ
れを化学的架橋剤を用いて重合することにより調製され
る。
の常法によってγ−グロブリン分画を分離、精製し、こ
れを化学的架橋剤を用いて重合することにより調製され
る。
化学的架橋剤としては、例えばグルタルアルデヒド、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）、ジ−Ｎ
−（２−ニトロ−４−アジドフェニル）シスタミン−S,
S−ジオキシド、N,N′−フェニレンジマレイミド、アゾ
フェニレンジマレイミド、2,2′−ジカルボキシ−4,4′
−アゾフェニルジイソシアネート等が使用され、これら
はIgGの２〜20倍モルを使用するのが好ましい。抗体の
重合は、例えば、「医化学実験法講座４」、免疫化学、
303−304頁、に記載の方法に準じて、前記γ−グロブリ
ン分画の緩衝溶液にグルタルアルデヒド溶液を撹拌下に
加え、室温で２〜３時間反応させることによって行われ
る。
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）、ジ−Ｎ
−（２−ニトロ−４−アジドフェニル）シスタミン−S,
S−ジオキシド、N,N′−フェニレンジマレイミド、アゾ
フェニレンジマレイミド、2,2′−ジカルボキシ−4,4′
−アゾフェニルジイソシアネート等が使用され、これら
はIgGの２〜20倍モルを使用するのが好ましい。抗体の
重合は、例えば、「医化学実験法講座４」、免疫化学、
303−304頁、に記載の方法に準じて、前記γ−グロブリ
ン分画の緩衝溶液にグルタルアルデヒド溶液を撹拌下に
加え、室温で２〜３時間反応させることによって行われ
る。
γ−グロブリン分画は、第１図（Ａ）のFPLC（Fast
Protein Liquid Chromatography）システムによるゲル
濾過パターンに示すように、分子量約15万のIgGを主活
性成分とするものであるが、上記の化学的架橋剤との処
理により、第１図（Ｂ）のFPLCによるゲル濾過パターン
に示すように、分子量約30〜50万の活性成分が出現す
る。そして、この分子量約30〜50万の抗体は、分子量か
らIgGの２〜３量体であると推定され、このIgGの２〜３
量体はTIA法において抗原と反応した際の凝集能が著し
く優っている（第２図及び第３図参照）。
Protein Liquid Chromatography）システムによるゲル
濾過パターンに示すように、分子量約15万のIgGを主活
性成分とするものであるが、上記の化学的架橋剤との処
理により、第１図（Ｂ）のFPLCによるゲル濾過パターン
に示すように、分子量約30〜50万の活性成分が出現す
る。そして、この分子量約30〜50万の抗体は、分子量か
らIgGの２〜３量体であると推定され、このIgGの２〜３
量体はTIA法において抗原と反応した際の凝集能が著し
く優っている（第２図及び第３図参照）。
本発明の凝集抗体は、IgGの２〜３量体の含有量が多
いほど好ましいが、IgGの２〜３量体の活性が全抗体活
性の20％以上のものであれば、本発明の目的は達成され
る。
いほど好ましいが、IgGの２〜３量体の活性が全抗体活
性の20％以上のものであれば、本発明の目的は達成され
る。
本発明の上記技術はTIA法に使用する全ての抗体に適
用することができ、例えば抗CRP抗体、抗フィブリノー
ゲン抗体、抗アルブミン抗体、抗C3抗体、抗C4抗体、抗
Tf抗体、抗Cp抗体、抗α2M抗体、抗α1AT抗体、抗Hp抗
体、抗IAP抗体、抗AT III抗体、抗IgG抗体、抗IgA抗
体、抗IgM抗体等の凝集抗体を挙げることができる。
用することができ、例えば抗CRP抗体、抗フィブリノー
ゲン抗体、抗アルブミン抗体、抗C3抗体、抗C4抗体、抗
Tf抗体、抗Cp抗体、抗α2M抗体、抗α1AT抗体、抗Hp抗
体、抗IAP抗体、抗AT III抗体、抗IgG抗体、抗IgA抗
体、抗IgM抗体等の凝集抗体を挙げることができる。
本発明の凝集抗体は抗原と対応した際の凝集能が強
く、これを用いればTIA法により低濃度領域の抗原を高
感度で測定することができる。
く、これを用いればTIA法により低濃度領域の抗原を高
感度で測定することができる。
次に実施例を挙げて本発明を説明する。
実施例１ （ｉ）抗CRP血清（山羊）100mlとジエチルエーテル100m
lとを氷冷下混合し、30分間撹拌し、血清中の脂質分画
の除去を行った。脱脂後、抗血清中の残余のジエチルエ
ーテルを生食にて透析し、さらに0.1Mトリス塩酸（pH8.
0）緩衝液にて透析した。この様に処理された抗CRP脱脂
処理血清80mlと同量の生食とを混合し、混合液に対して
飽和硫安131mlをゆっくり滴下した。γ−グロブリン分
画を沈澱させた後30分間撹拌し、４℃にて一夜放置し
た。沈澱したγ−グロブリン分画を遠心により回収し、
溶解後の液量が40mlになる様、生食で沈澱を溶解した。
溶解後、0.1Mリン酸（pH6.7）の緩衝液で透析し、抗CRP
γ−グロブリン化血清した。
lとを氷冷下混合し、30分間撹拌し、血清中の脂質分画
の除去を行った。脱脂後、抗血清中の残余のジエチルエ
ーテルを生食にて透析し、さらに0.1Mトリス塩酸（pH8.
0）緩衝液にて透析した。この様に処理された抗CRP脱脂
処理血清80mlと同量の生食とを混合し、混合液に対して
飽和硫安131mlをゆっくり滴下した。γ−グロブリン分
画を沈澱させた後30分間撹拌し、４℃にて一夜放置し
た。沈澱したγ−グロブリン分画を遠心により回収し、
溶解後の液量が40mlになる様、生食で沈澱を溶解した。
溶解後、0.1Mリン酸（pH6.7）の緩衝液で透析し、抗CRP
γ−グロブリン化血清した。
（ii）半井化学社製グルタルアルデヒド（25％水溶液）
を生食にて100倍希釈する。室温にて抗CRP γ−グロブ
リン化血清20mlに100倍希釈グルタルアルデヒド水溶液
2.0mlをゆっくり滴下し、30分間撹拌後、４℃に３日間
静置した。グルタルアルデヒド処理後、22mlの0.1Mトリ
シン−NaOH（pH8.0）緩衝液（0.1M NaCl,0.1％ NaN3含
有）を加えて反応を停止させ、抗CRPグルタルアルデヒ
ド処理血清（凝集抗体）を得た。
を生食にて100倍希釈する。室温にて抗CRP γ−グロブ
リン化血清20mlに100倍希釈グルタルアルデヒド水溶液
2.0mlをゆっくり滴下し、30分間撹拌後、４℃に３日間
静置した。グルタルアルデヒド処理後、22mlの0.1Mトリ
シン−NaOH（pH8.0）緩衝液（0.1M NaCl,0.1％ NaN3含
有）を加えて反応を停止させ、抗CRPグルタルアルデヒ
ド処理血清（凝集抗体）を得た。
一方、グルタルアルデヒド処理していない抗CRP γ−
グロブリン化血清20mlには、100倍希釈グルタルアルデ
ヒド水溶液と同量の2.0mlの生食を添加し、同様に22ml
の0.1Mトリシン−NaOH緩衝液を加え、未処理抗CRP血清
とした。
グロブリン化血清20mlには、100倍希釈グルタルアルデ
ヒド水溶液と同量の2.0mlの生食を添加し、同様に22ml
の0.1Mトリシン−NaOH緩衝液を加え、未処理抗CRP血清
とした。
（iii）未処理抗CRP血清及び抗CRPグルタルアルデヒド
処理血清のFPLCシステムによるゲル濾過パターンは第１
図の（Ａ）及び（Ｂ）のとおりである。尚、ゲル濾過担
体にはSuperrose 6HR 10/30（10mm×30cm;分子量分画範
囲5000−5000000）、溶離液には0.02Mリン酸（pH7.4）
緩衝液（0.15M NaCl,0.1％ NaN3含有）を用い、流速0.
6ml/minで行い、0.6ml/tubeで分画分取した。
処理血清のFPLCシステムによるゲル濾過パターンは第１
図の（Ａ）及び（Ｂ）のとおりである。尚、ゲル濾過担
体にはSuperrose 6HR 10/30（10mm×30cm;分子量分画範
囲5000−5000000）、溶離液には0.02Mリン酸（pH7.4）
緩衝液（0.15M NaCl,0.1％ NaN3含有）を用い、流速0.
6ml/minで行い、0.6ml/tubeで分画分取した。
また、各分画について、蛋白濃度、力価、凝集能を調
べた。蛋白濃度は各分画を11倍希釈し、波長280nmで吸
光度を測定した。力価はベッカー法により測定した。凝
集能は各分画を第２試薬とし、CRP抗原5mg/dlを検体と
して試験例１と同様にして測定した。その結果は、第２
図（未処理抗CRP血清）及び第３図（抗CRPグルタルアル
デヒド処理血清）のとおりである。
べた。蛋白濃度は各分画を11倍希釈し、波長280nmで吸
光度を測定した。力価はベッカー法により測定した。凝
集能は各分画を第２試薬とし、CRP抗原5mg/dlを検体と
して試験例１と同様にして測定した。その結果は、第２
図（未処理抗CRP血清）及び第３図（抗CRPグルタルアル
デヒド処理血清）のとおりである。
試験例 実施例１の（ii）で得た抗CRPグルタルアルデヒド処
理血清と未処理CRP血清のTIAにおける凝集能を比較する
ため、0.1Mトリシン−NaOH緩衝液でさらに各々４倍希釈
し、第２試薬とした。また第１試験には市販のオートTI
A−CRP S R1 CL「ニッスイ」用いた。測定には日立736
−15型自動分析機を使用し、パラメーターは２ポイント
アッセイ（測光ポイント８−20），サンプル量15μ,R
1量300μ,R2量100μ，主波長340nm,副波長700nm,K
Factor＝10000で実施した。その結果は第４図のとおり
である。
理血清と未処理CRP血清のTIAにおける凝集能を比較する
ため、0.1Mトリシン−NaOH緩衝液でさらに各々４倍希釈
し、第２試薬とした。また第１試験には市販のオートTI
A−CRP S R1 CL「ニッスイ」用いた。測定には日立736
−15型自動分析機を使用し、パラメーターは２ポイント
アッセイ（測光ポイント８−20），サンプル量15μ,R
1量300μ,R2量100μ，主波長340nm,副波長700nm,K
Factor＝10000で実施した。その結果は第４図のとおり
である。
実施例２ 実施例１（ｉ）の抗CRP血清の代りに抗C4血清（山
羊）を使用して同様に操作して抗C4γ−グロブリン化血
清を得、これを実施例１（ii）と同様に処理して抗C4グ
ルタルアルデヒド処理血清（凝集抗体）を得た。
羊）を使用して同様に操作して抗C4γ−グロブリン化血
清を得、これを実施例１（ii）と同様に処理して抗C4グ
ルタルアルデヒド処理血清（凝集抗体）を得た。
試験例２ 実施例２で得た抗C4グルタルアルデヒド処理血清と未
処理抗C4血清〔実施例１（ii）と同様にして調製した〕
のTIAにおける凝集能を試験例１と同様（但し、サンプ
ル量20μ（21倍希釈）、R1量350μ、R2量100μで
実施）にして試験した。その結果は第５図のとおりであ
る。
処理抗C4血清〔実施例１（ii）と同様にして調製した〕
のTIAにおける凝集能を試験例１と同様（但し、サンプ
ル量20μ（21倍希釈）、R1量350μ、R2量100μで
実施）にして試験した。その結果は第５図のとおりであ
る。
第１図は未処理抗CRP血清及び抗CRPグルタルアルデヒド
処理血清のFPLCシステムによるゲル濾過パターンを示す
図である。第２図は、未処理抗CRP血清の各分画の蛋白
濃度、力価、凝集能を示す図である。第３図は抗CRPグ
ルタルアルデヒド処理血清の各分画の蛋白濃度、力価、
凝集能を示す図である。第４図は未処理抗CRP血清と抗C
RPグルタルアルデヒド処理血清のTIAにおける反応性を
示す図である。第５図は未処理抗C4血清と抗C4グルタル
アルデヒド処理血清のTIAにおける反応性を示す図であ
る。
処理血清のFPLCシステムによるゲル濾過パターンを示す
図である。第２図は、未処理抗CRP血清の各分画の蛋白
濃度、力価、凝集能を示す図である。第３図は抗CRPグ
ルタルアルデヒド処理血清の各分画の蛋白濃度、力価、
凝集能を示す図である。第４図は未処理抗CRP血清と抗C
RPグルタルアルデヒド処理血清のTIAにおける反応性を
示す図である。第５図は未処理抗C4血清と抗C4グルタル
アルデヒド処理血清のTIAにおける反応性を示す図であ
る。
Claims (3)
- 【請求項１】検出すべき抗原に対して特異的なIgGを化
学的架橋剤を用いて重合した該IgGの２〜３量体を含有
することを特徴とする免疫比濁法に使用する凝集抗体。 - 【請求項２】IgGの２〜３量体の活性が全抗体活性の20
％以上である請求項１記載の凝集抗体。 - 【請求項３】化学的架橋剤がグルタルアルデヒドである
請求項１又は２記載の凝集抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1153500A JP2704760B2 (ja) | 1989-06-15 | 1989-06-15 | 凝集抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1153500A JP2704760B2 (ja) | 1989-06-15 | 1989-06-15 | 凝集抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0318758A JPH0318758A (ja) | 1991-01-28 |
| JP2704760B2 true JP2704760B2 (ja) | 1998-01-26 |
Family
ID=15563920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1153500A Expired - Lifetime JP2704760B2 (ja) | 1989-06-15 | 1989-06-15 | 凝集抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2704760B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4433059A (en) * | 1981-09-08 | 1984-02-21 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Double antibody conjugate |
| JPS6175261A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-04-17 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 免疫複合体定量用標準物質 |
-
1989
- 1989-06-15 JP JP1153500A patent/JP2704760B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0318758A (ja) | 1991-01-28 |
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