JPS59102161A - 逆受身凝集反応による抗原検出用試薬 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、逆受身凝集反応を利用した抗原検出用試薬お
よび抗原検出法、さらに詳しくは、逆受身凝集反応に用
いる反応液（および／または希釈液）に特殊な処理をほ
どこしたヒトまたは動物血清を添加してなる非特異的凝
集反応を排除した抗原検出用試薬およびその処理血清を
用いた抗原検出法に関する。

免疫学的な反応を利用して抗原を検出する方法として一
般に逆受身凝集反応と呼ばれる反応を利用する方法があ
り−それは担体に抗体を感作（吸着）させ、これに対応
する抗原を作用させて生じる抗体感作担体の凝集像とし
て検出する方法であって、操作の簡便さと良好な感度お
よび精度を有することから生体体液中に含まれる微量抗
原の検出、定量に汎用されている。

この方法は、例えば担体として血球を用いる場合には、
その担体としての血球をまずホルマリンまたはグルグル
アルデヒドなどで固定し、この固定血球に検査すべき抗
原に対応する抗体を感作（吸着）させ、得られた抗体感
作血球を生理食塩液またはリン酸緩衝食塩液ＣＰＢＳと
略称する）を基材とする反応液Ｃ検体の希釈にも用いら
れるため希釈液ともいう）に浮遊させて抗体感作担体含
有反応液を調製し、これにあらかじめ反応液で希釈した
被検血清５を加えて反応させ、一定時間後に逆受身凝集
反応によって生じる感作血球凝集像を判定するものであ
る。しかしながら、この逆受身凝集反応には特定の抗体
と抗原との特異的抗原抗体反応のほかに一般に非特異凝
集反応を随伴することが多く、検査に支障をきたしてい
る。

この非特異的集反応番こは、何らの抗体も介さない自然
凝集、異種凝集と呼ばれる真打抗体を介する凝集反応、
さらにリウマチ因子（免疫グロブリンに対する抗体）に
よる凝集などがある。これらのうち自然凝集については
種々の方法で除去し得ることか知られて６いるが、抗体
を介する非特異反応については未だ充分な除去方法が見
い出されていない。一般に非特異凝集の除去方法として
、例えば一種々の動物血清またはその成分、種々の動物
血球膜成分、トリトンＸ１００、ブリジエ３５なトノ界
面活性剤、もしくはゼラチン、アラビアゴムなどの糊剤
などを反応液Ｃ希釈液）に添かす′ることか行なわれて
いるが、このような方法では完全な除去ができず、なお
非特異反応を起す抗体様物質が残り、かかる除去できな
い抗体様物質を含む被検血清がきわめて多く、抗原陽性
と判定されているのが実情である。

かかる事情のもとに、本発明者らは上記のような抗体に
よる非特異的凝集を完”全に除去し、常に正確な検出の
できる抗原検出用試薬を得るべく種々研究を重ねた結果
、抗体感作担体を含有する反応液に特定の処理をほどこ
したヒトまたは動物血清を添加することにより非特異凝
集を随伴しない逆受身凝集反応による抗原検出用試薬が
得られることを見い出し、本発明を完収するに至った。

すなわち、本発明は、逆受身凝集反応による抗原検出法
に用いる反応液（および／または希釈液）に、高濃度の
塩類溶液、低ｐ）Ｉ溶液および高ｐＨ溶液から選ばれる
処理液で処理したヒトまたは動物血清を添加してなる抗
原検出用試薬を提供するものである。

本発明はまた上記特定の処理をほどこしたヒトまたは動
物血清を逆受身凝集反応による抗原検出法に用いられる
抗体感作担体含有反応液および／または被検抗原含有希
釈液に添加して逆受身凝集反応を行なわせることにより
非特異凝集反応を排除した抗原検出法をも提供するもの
である。

本明細書において抗原検出用試薬とは、一般にこの種逆
受身凝集反応による抗原検出用に用いられる抗体感作担
体含有反応液、対照液として用いる抗体で感作していな
い未感作担体を含有する反応液、検体血清を希釈するた
めの希釈液、さらにそれら担体を浮遊される前の反応液
、ならびにそれら反応液、希釈液の凍結乾燥品を意味す
る。しかして、本発明においては上記担体を含有するか
または含有しない反応液および希釈液のいずれか一方ま
たは双方に特定の処理をほどこしたヒトまたは動物血清
または血清グロブリン画分を添加するものである。なお
、この逆受身凝集反応による抗原検出法で用いる反応液
および希釈液は同一組成のものを用いることが一般的で
あり、そのため反応液と希釈液の両者を含めて単に反応
液ということもある。また特定の処理をほどこした血清
には処理血清のほか処理血清グロブリン画分も含んでい
るが、これらを総称して単に処理血清ということもある
。

本発明の特徴は、特定の処理液にて処理したヒトまたは
動物血清、好ましくはその血清の免疫グロブリン画分を
用い、これを逆受身凝集反応による抗原検出用反応液お
よび／または希釈液に添加して逆受身凝集反応にしばし
ば随伴する非特異凝集反応を排除して正確かつ高感度で
抗原を検出することを可能にした点にある。

不発明で用いられる上記血清にはヒト血清のほか、モル
モット、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル、ブタ、
牛、馬、ニワ）ＩＪ、アヒル、七面鳥、ハトなどの動物
血清が含まれる。なお、前述したとおり、このヒトまた
は動物血清には血清グロブリン画分も含み、以下単にヒ
トまたは動物血清ということもある。

本発明で用いられるヒトまたは動物の血清を処理するた
めの処理液としては、アルカリ金属またはアルカリ土類
金属の塩化物、チオシアン酸塩−酢酸塩または硝酸塩、
もしくは尿素の１モルないし飽和濃度に近い濃度範囲を
有する高濃度塩類溶液、例えば、２〜６モル塩化マグネ
シウム溶液、２〜６モル塩化カルシウム溶液、２〜６モ
ル塩化ナトリウム溶液、２−６モル塩化カリウム溶液、
２〜１８モル塩化リチウム溶液、２〜１５モルチオシア
ン酸ナトリウム溶液、２〜１５モルチオシアン酸カリウ
ム溶液、２〜１５モルチオシアン酸マグネシウム溶液−
２〜１５モルチオシアン酸リチウム溶液、２〜１５モル
チオシアン酸カルシウム溶液、２〜１５モル酢酸ナトリ
ウム溶液、２〜１５モル酢酸マグネシウム溶液、１〜９
モル？ｉｎ２ナトリウム溶液−１〜３．５モル硝酸カリ
ウム溶液、１〜４．５モル硝酸マグネシウム溶液、３〜
Ｎｏモル尿素溶液など；　ｐＩ−１４以下の低ｐＨ溶液
、例えばグリシン−塩酸、クエン酸−リン酸ナトリウム
−クエン酸ナトリウム−塩酸などのｐＨ４以下、好まし
くはＰＩ−（２，０〜４．０の酸水溶液または緩衝液；
　ｐｌ−１９以上の高ｐＨ溶液、例えばホウ酸−ホウ砂
、ホウ酸−水酸化ナトリウム、ホウ砂−水酸化ナトリウ
ム、グリシン−水酸化ナトリウムなどのｐＨ９以上、好
ましくはｐＨ９，０−１２，０のアルカリ水溶液または
緩衝液が挙げられる。これらの処理液による処理は、通
常、前記血清（または血清グロブリン画分）の０．１〜
１０　ｗ／ｖ％、好ましくは１〜３　ｗ／ｖ％溶液を、
上記塩類溶液、好ましくは２〜５モル溶液、低ｐＨ溶液
または高ｐＨ溶液、好ましくは０．０５〜０．３モル溶
液にて１０分間〜５時間程度透析し、ついで生理食塩液
またはリン酸緩衝食塩液にて透析して行なわれる。

上記のように処理して得られたヒトまたは動物血清（ま
たは血清グロブリン画分）を逆受身凝集反応用反応液お
よび／または希釈液に配合することにより従来法では除
去できなかったある種の非特異凝集反応をひき起す抗体
様物質をきわめて効果的に除去できる。すなわち、この
非特異抗体様物質は検体中に存在するある種の抗グロブ
リン抗体で、これは、その精製工程または感作工程にお
いて性状〔抗原性）の一部変化した抗体感作血球と反応
して非特異凝集を起こすものと考えられているが、この
抗グロブリン抗体は無処理の動物血清では吸収できない
にもかかわらす上記特定の処理をほどこしたヒトまたは
動物血清、とくに血清クロプリン画分ではその高い親和
性により効果的に吸収除去されうる。なおこの処理油清
または血清グロブリン画分は感作抗体と競合して抗グロ
ブリン抗体と反応するが分子が小さく運動性の大きい処
理血清または血清グロブリン画分の方が抗グロブリン抗
体と結合し易い。

本発明における処理血清または血清グロブリン画分は、
担体用の反応液か被検検体用の希釈液のいずれか一方ま
たは双方に添加することができる。

非特異凝集反応を抑制する効果は双方に加える場合が最
も犬であるが一方のみに添加した場合でも充分な抑制効
果がみられる。この処理血清またはグロブリン画分を添
加した担体含有液は凍結乾燥することもでき、それによ
って非特異凝集抑制効果は低下しない。この処理血清の
部重量は１μｇ〜１〜／　ｍｌ、好ましくは５μｇ〜１
００μｇ／耐である。処理血清グロブリン画分の場合は
０．２μｙ−〜０，２■、好ましくはｌμｇ〜２０μＱ
／ｙｓ／である。

用いられる担体としては通常用いられているものがその
まま用いられ、例えば赤血球、合成ラテツクヌ（通常粒
径０．１〜１．３μ、好ましくは０５〜１μ）、などが
挙げられ、これらは通常反応液に懸濁させた懸濁液の形
で用いられる。担体に検出すべき抗原に対応する抗体を
常法により吸着Ｃ感作）させることにより抗体感作担体
が得られる。

感作に月いる抗体と添加する処理血清または血清グロブ
リン画分とが異種動物から得たものでもかなりの抗グロ
ブリン抗体吸収効果が達成されるが、同種の動物血清を
用いるのが好ましい。

また反応液（希釈液）も通常用いられるものが用いられ
、例えば生理食塩液、リン酸緩衝食塩液ＣＰＢＳ）など
が挙げられる。

不発明の抗原検出用試薬は各種の抗原の検出ならびに定
量に用いえられ、例えばＢ型肝炎つイルヌ抗原、α−フ
ェトプロティン、Ｃ反応性フロティン（ＣＲＰ）その他
の各種微量抗原の検出、定量に適用される。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらシこ具体的に説明す
るが本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ （イ）反応液（希釈液）の調製 ＰＢＳ　（リン酸１水素２ナトリウム１７．０８ｆ、リ
ン酸２水素１カリウム２．５９　ＩＱおよび食塩４．９
１ｇを水１リットルに溶解して調製した緩衝液、ｐＨ７
，２）に健康ウサギ血清ｌＶ／Ｖ％−ヒツジ血球膜成分
０．０１　Ｗ／Ｖ　％および窒化す）１１ウム（防腐剤
）０．１ｗ／ｖ％を加えて反応液（希釈液）を調製する
。

（ロ）未処理モルモット血清および該モルモット血清グ
ロブリン画分添加反応液の調製８ 上記反応液に健康モルモット血清を０．５　ｑ／　ｗ、
１（蛋白量として）の割合で加えて「対照反応液工」を
得る。同様に健康モルモット血清グロブリン画分を０．
１■／１ａｌｃ蛋白量として）の割合にて添加して「対
照反応液■」を得る。

（ハ）塩化マグネシウムで処理したモルモット血清添加
反応液の調製− モルモット血清を１００倍容晋の５モル塩化マグネシウ
ム水溶液中で室温にて２時間透析したのち、１０００倍
容量の生理食塩液を用い４℃で１６時間透析して塩化マ
グネシウムを除去して塩化マグネシウム処理モルモット
血清を得る。この血清を０．０５ｒｎｇ／＋ｘ／（蛋白
量として〕の割合で前記（イ）で得た反応液に加えて「
血清添加反応液■」を得る。

実施例２ 各種処理液で処理したヒトおよび各種動物血清のグロブ
リン画分を添加した反応液の調製〜上記実施例１（ハ）
と同様にして、ヒト、モルモット−ウサギ、ヤギおよび
ニワトリの血清グロブリン画分１　ｗ／ｖ　％生理食塩
液をそれぞれ１００倍容量の５モル塩化マグネシウム水
溶液、５モル塩化カルシウム水溶液、３モルチオシアン
酸ナトリウム水溶液−５モル尿素水溶液、０．１モルグ
リシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，５）および０．１モルホ
ウ酸−ホウ砂緩衝液ＣＰＨＩＯＩ中で室温にて２時間透
析し、さらにそれぞれ生理食塩液にて透析して各薬品を
除去およびｐＨを中性に戻して各種処理血清グロブリン
画分を得る。これら処理血清グロブリン画分を０．０１
”’ｆ／肩ｌ（蛋白量として）の割合で前記実施例１（
イ）で調製した反応液に堤えて、各種の血清グロブリン
画分添加反応液を得る。

実施例 逆受身赤血球凝集反応によるＨＢｓ抗原−α−フェトプ
ロティンの検出における非特異反応の抑制実験 前記実施例１で得られた反応液、対照反応液■および■
、血清添加反応液■、および実施例２で得られた血清グ
ロブリン画分添加反応液のうち、モルモットの塩化マグ
ネシウム溶液処理血清グロブリン画分の添加反応液ｃ以
下、血清添加反応液■という）を用い、実施例１（イ）
の反応液（従来品）では非特異凝集反応を示す検体〔ヒ
ト血清）Ａ、Ｂ、Ｃの３例について検査した。

各反応液をマイクロプレー）　ＣＶ型）の８穴に２５μ
ｌずつ滴下し、検体２５μｌを最初の穴に入れ、希釈液
にて段階希釈したのち、これにアフイニテイクロマトグ
ラフイで高度に精製したモルモットのＨＢｓ抗体または
モルモットのα−フェトプロティン抗体を感作した０、
６％ヒツジ固定赤血球液（担体）２５μノを滴下し、混
和して室温にて２時間静置後、その凝集像を観察した。

その結果を第１表に示す。

第１表から明らかなように、従来品の反応液ならびに未
処耶モルモット血清またはそのグロブリン画分を添加し
た対照反応液■および■では非特異反応による凝集が認
められたのに対し、処理血清または血清グロブリン画分
を添加した血清添加反応液■および■を用いたものでは
凝集反応は陰性で非特異反応物が除去されていることを
示した。

実施例 逆受身赤血球凝集反応によるＨＢｓ抗原検出における非
特異反応抑制実験 前記実施例］（イ）で得られた反応液（従来品）および
実施例２で得られた各種血清グロブリン画分添加反応液
を用い、従来品の反応液では非特異反応を示す検体Ｂ（
ヒト血清）について前記実施例１と同様にして検査した
。その結果を第２表に示す。

第２表から明らかなように、本発明による処理廂清グロ
ブリン画分を添加した反応液ではいずれも非特異反応の
抑制効果が発揮され、なかでも、血球感作に用いた抗体
と同種動物のモルモットの血清を塩化マグネシウム溶液
、チオシアン酸ナトリウム溶液またはグリシン−塩酸緩
衝液で処理して得られた血清グロブリン画分を添加した
ものでは最も強い抑制効果を示した。

第　２　表　（続き） 実施例３ モルモットＨＢｓ抗体を感作したヒツジ血球液Ｃ以下、
対照血球液という）に、前記実施例２と同様にして得た
塩化マグネシウム処理モルモット血清グロブリン画分を
００１■／ｍｌｃ蛋白量として）の割合で添加して処理
血清グロブリン画分を添加して抗体感作担体含有反応液
ｃ以下、単に血清添加相体反応液という）を得る。

さらに、」二記血清添加担体反応液に牛血清アルブミン
をＩＷ／Ｖ％の割合に加えたのち常法により凍結乾燥し
て該血清添力り担体反応液の凍結乾燥品ｃ以下、単に凍
結乾燥担体という）を得る。

実施例 前記実験例１と同様にして逆受身凝集反応によるＩ−！
Ｂｓ抗原検出における上記血清添加担体液の凍結乾燥前
後での非特異反応抑制効果を実験した。

すなわち、前記実施例１（イ）の反応液（従来品）では
非特異反応を示す検体（ヒト血清〕Ａ＝　Ｂ、Ｃの３例
についてマイクロプレート上で段階希釈し、これに上記
実施例３における「″Ａ照血球液」「血清添加担体反応
液」および「凍結乾燥担体」（精製水により元の１・に
再溶解して使用）をそれぞれ滴下し、混和して室温にて
２時間静冒したのち、その凝集像を観察した。その結果
を第３表に示す。

第３表から明らかなように、血清添加担体反応液および
凍結乾燥担体のいずれも処理血清グロブリン画分を添加
しない対照血球液に比べて明らかな非特異反応の抑制効
果が認められ、この効果は凍結乾燥の前後で差異は認め
られなかった。

実施例４ （イ）反応液（希釈液）の調製 前記実施例１（イ）で用いたものと同じＰＢＳにグリシ
ン０．１　ｗ／ｖ　％および窒化ナトリウム（防腐剤）
Ｏ，１ｗ／ｖ％を加えて反応液（従来品）を得る。

（ロ）塩化マグネシウムで処理したモルモット血清およ
び血清グロブリン画分添か反応液の調製上記（イ）で得
た反応液に、前記実施例１（ハ）と同様にして得た塩化
マグネシウム溶液で処理したモルモット血清を０．０５
　’Ｗ、／ｌｔｌ　（蛋白量として）の割合で加えて処
理血清添加反応液Ｃ以下、血清添加反応液■という）を
得る。

同様に、上記反応液に、前記実施例２と同様にして得り
塩化マグネシウム溶液で処理したモルモット血清グロブ
リン画分を０．０　］、　Ｑ／ｒｘｌ　（蛋白量として
）の割合で加えて処理血清グロブリン画分添加反応液Ｃ
以下、血清添加反応液■という）を得る。

（ハ）未処理モルモット血清および血清グロブリン画分
添加反応液の調製 上記（イ）の反応液に健康モルモット血清を０．５■／
コ（蛋白量として）の割合で加えて「対照反応液■」を
得る。同様に健康モルモット血清グロブリン画分を０．
１　”Ｉ／ｍｅ　（蛋白量として）の割合で加えて「対
照反応液■」を得る。

実施例 上記実施例４で得られた反応液、血清添加反応液■およ
び■、対照反応液■および■を用い、実施例４（イ）の
反応液（従来品）では非特異凝集反応を示す検体〔ヒト
血清）Ａ、Ｂ−Ｃの３例について非特異反応の抑制効果
を実験した。

前記実験例１と同様にしてマイクロプレートに各反応液
を滴下、段階希釈したのち、これに感作担体としてモル
モットのＨＢｓ抗体を感作したラテックス懸濁液または
モルモットのＣ反応性プロティンＣＣＲＰ”＋抗体を感
作したラテックス懸濁液を滴下し、混和後、室温にて１
６時間静置したのちその凝集像を観察した。その結果を
第４表に示す。

第４表から明らかなように、本発明の処理血清および処
理血清グロブリン画分添加の反応液ではいずれも強い非
特異反応抑制効果が認められ、感作担体として抗体感作
ラテックスを用いた場合も前記実験例１における赤血球
担体と同様の効果を示した。

実施例 前記実験例４で用いたと同じモルモットのＨＢｓ抗体を
感作したラテツクヌ懸濁液およびモルモットのＣＲＰ抗
体を感作したラテツクヌ懸濁液に、それぞれ前記実施例
１および２と同様にして得た塩化マグネシウム処理モル
モット血清およびモルモット血清グロブリン画分をそれ
ぞれ０．０５’Ｖ／ｍｅおよび０．０　］　”９／　ｍ
ｔ　（蛋白量として）を添加して処理血清添加ラテツク
ヌ懸濁液ｃ以下、血清添加反応液■という〕および処理
血清グロブリン画分添加ラテツクフ懸濁液ｃ以下、血清
添加反応液■という）を得る。

上記血清添加反応液■および■を用い、実験例４と同様
にして非特異反応の抑制効果を実験した。

その結果を第５表に示す。第５表から明らかなように、
感作ラテツクヌ懸濁液に処理血清または処理廂清グロブ
リン画分を添加した場合も同様の抑制効果を示した。な
お、感作ラテツクヌ懸濁液と検体希釈用希釈液（反応液
）の両者に添加した場合、より顕著な効果を示した。

ト １［ 〜 Ｆ ρ− 翫 ： １ 宕 Ｖ− ：１ 停 実施例 逆受身赤血球凝集反応によるＨＢｓ抗原の検出における
特異抗原検出実験 前記実施例１で得られた反応液（従来品）、および血清
添加反応液■を用い、ＨＢｓ抗原陽性を示すＢ型肝炎患
者血清り＝　Ｅの２例について前記実験例Ｊと同様にし
て検査した。その結果を第６表に示す。

第６表から明らかなように、本発明による処理モルモッ
ト血清を添かした反応液を用いても、従来の反応液を用
いたときと同じ凝集価を示し、感作血球と抗原との特異
的な反応を妨害しなかった。

なお、同様にして、実施例１の感作血球の代わりに実施
例３の凍結乾燥担体を用いても、特異的な反応を妨害し
なかった。

第６表 実施例 ラテツクヌ凝集反応によるＨＢｓ　抗原の検出における
特異抗原検出実験 前記実施例４で得られた反応液（従来品）およ液 び血清添加反応■および■を用い、ＨＢｓ抗原陽△ 性を示すＢ型肝炎患者血清り、Ｈの２例について、前記
実験例４と同様にして検査した。その結果を第７表に示
す。

ラテツクヌ凝集反応でも血球凝集反応の場合と同様に、
本発明による処理モルモット血清が、感作ラテックヌと
抗原との特異的な反応を妨害しなかった。

第７表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）高濃度塩類溶液、低ｐＨ溶液または高ｐＨ溶液で
   処理した血清または血清グロブリン画分を配合したこと
   を特徴とする逆受身凝集反応による抗原検出用試薬。 （２）該高濃度塩類溶液が、アルカリ金属またはアルカ
   リ土類金属の塩イビ物、チオシアン酸塩、酢酸塩または
   硝酸塩の１モル以上の高濃度溶液である前記第（１）項
   の試薬。 （３）該高濃度塩類溶液が尿素溶液である前記第（１）
   項の試薬。 （４）該低ｐＨ溶液がｐＨ４以下の酸水溶液または緩衝
   液である前記第（１）項の試薬。 （５〕該高ｐＨ溶液がｐＩ−（９以上のアルカリ水溶液
   または緩衝液である前記第（１）項の試薬。 （６）該処理血清の添加量が１μ！　−１□／　ｍｌで
   ある前記第（１）項の試薬。 （７）該処理血清グロブリン画分の添加量が０．２μｇ
   〜０．２〜／ゴである前記第（１）項の試薬。 （８）凍結乾燥品である前記第（１）項の試薬。 （９）逆受身凝集反応用抗体感作担体含有反応液および
   ／または被検検体含有希釈液に、高濃度塩類溶液、低ｐ
   Ｈ溶液または高ｐＨ溶液で処理した血清または血清グロ
   ブリン画分を添加し、該処理血清または血清グロブリン
   画分添加反応液および／または希釈液を用いて逆受身凝
   集反応に付すことを特徴とする抗原検出法。 （１０）該高濃度塩類溶液がアルカリ金属またはアルカ
   リ土類金属の塩化物、チオシアン酸塩−酢酸塩または硝
   酸塩の１モル以上の高濃度溶液である前記第（９）項の
   検出法。 （１１）該高濃度塩類溶液が尿素溶液である前記第（９
   ）項の検出法。 （１２）該低ｐＨ溶液がｐＨ４以下の酸水溶液または緩
   衝液である前記第（９）項の検出法。 （１３）該高ｐＨ溶液がｐＨ９以上のアルカリ水溶液ま
   たは緩衝液である前記第（９）項の検出法。 （１４）該処理血清の添加量がｌμｆ”ｌｑ／ｍｅであ
   る前記第（９）項の検出法。 〔１５）該処理血清グロブリン画分の添加量が０．２μ
   ｇ〜０．２■／ゴである前記第（９）項の検出法。