JPH0799372B2 - 逆受身凝集反応用非特異反応吸収剤 - Google Patents

逆受身凝集反応用非特異反応吸収剤

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JPH0799372B2
JPH0799372B2 JP60154905A JP15490585A JPH0799372B2 JP H0799372 B2 JPH0799372 B2 JP H0799372B2 JP 60154905 A JP60154905 A JP 60154905A JP 15490585 A JP15490585 A JP 15490585A JP H0799372 B2 JPH0799372 B2 JP H0799372B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト血液等に存在する特定の抗原を測定する逆
受身凝集反応を改良するものである。
〔従来の技術〕
逆受身凝集反応は、赤血球等の担体粒子に測定対象の抗
原に対する抗体を結合させ、この粒子が当該抗原の存在
によって凝集する反応を利用して抗原を測定する方法で
あるが、従来はこの抗体に兎、山羊等に免疫して得たポ
リクローナル抗体が利用されていた。
ところが、ポリクローナル抗体を取得するためには、免
疫源として抗原を大量に使用し、さらにポリクローナル
抗体の精製工程においてもアフィニティークロマトグラ
フィーのカラムにやはり抗原を使用するところから、抗
原が高価な場合にはコストが問題であった。また、ポリ
クローナル抗体は免疫動物の固体差、さらにはアフィニ
ティークロマトグラフィー等の精製工程において変性を
生じて製品のロット差の問題さらには抗体活性の低下あ
るいはバラツキの問題もあった。これらは製品管理ある
いは工程管理の負担を増大させるばかりでなく、担体粒
子に感作される抗体量が粒子面積に制限されることから
検出感度の低下にもつながっていた。
一方、これらの問題点を解決した方法として抗体にモノ
クローナル抗体を利用する方法が開発されている(特開
昭57−86051号公報、特開昭57−118159号公報及び特開
昭58−127167号公報)。
〔発明が解決しようとする問題点〕
ところが、このモノクローナル抗体を利用した場合には
非特異反応が高頻度で発生するためにこの方法は実用化
されるに至っていない。
例えば、マウスモノクローナル抗体を血球に感作してヒ
トα−フェトプロティンを測定する際に従来の血清希釈
用液等を利用した場合には、健常人血清で20〜50%、リ
ューマチ患者血清では50〜90%の頻度で非特異反応が発
生することが本発明者の実験で確認されている。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者はこのような問題点を解決して種々の利点を有
するモノクローナル抗体を利用した方法を実用化するべ
く鋭意検討を重ねた結果、測定対象と異種の抗原に対す
る抗体がこの非特異反応吸収剤として極めてすぐれてい
ることを見出して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、凝集反応する担体粒子に感作され
ているモノクローナル抗体と同種の動物由来であって、
測定対象の抗原と異なる抗原に対するモノクローナル抗
体よりなる、モノクローナル抗体を利用した逆受身凝集
反応用の非特異反応吸収剤に関するものである。
本発明の非特異反応吸収剤に利用されるモノクローナル
抗体(以下、「本発明のモノクローナル抗体」とい
う。)はまず、凝集反応する担体粒子に感作されている
モノクローナル抗体(以下、「感作モノクローナル抗
体」という。)と同種の動物由来のものである。これは
感作モノクローナル抗体がマウス由来のものであれば本
発明のモノクローナル抗体もやはりマウス由来のもので
なければならないことを意味する。動物は、マウスのほ
か、ラット、ヒト等を含み、その種類は特に制限されな
い。
次に、本発明のモノクローナル抗体は測定対象の抗原と
異なる抗原に対するものである。抗原の種類は特に限定
されないが、例えば、α−フェトプロティン(AFD)癌
胎児性抗原(CEA)免疫グロブリン(IgE、IgA等)、ア
ルブミン、フェリチン等の血漿蛋白質、HB8抗原、ヘル
ペスウイルス等のウイルス抗原、フィブリン分解生成
物、プロスタグランジン、テストステロン、ブロゲステ
ロン、サイロキシン等のホルモン、ジゴキシン、テオフ
ィリン、フェノバルビタール、フェニトイン、ペニシリ
ン、アミカシン等の薬物等の各種臓器、血中あるいは尿
中等に存在する抗原などである。
又、抗原特異性は明らかでないが、ミエローマ由来のモ
ノクローナル抗体も、本発明のモノクローナル抗体に含
まれる。
このようなモノクローナル抗体は一般的なモノクローナ
ル抗体の製法に準じて取得することができる。例えばマ
ウスに測定対象の抗原と異なるいずれかの抗原をアジュ
バントとともに数回腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出
してポリエチレングリコール等を用いてマウスミエロー
マ細胞と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによってモノク
ローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中で増殖させ
る。
増殖させたモノクローン細胞は腹腔中にて多量の単一抗
体すなわちモノクローナル抗体を産生し、腹水中に貯留
する。この腹水から、ゲルクロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー等によって、ポリクローナル抗
体の場合に見られる。免疫動物の固体差製品のロット
差、抗体活性の低下等の問題もなく再現性よく、グロブ
リン画分、すなわちモノクローナル抗体が精製される。
このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体は
そのままでも非特異反応吸収剤として充分使用しうる
が、特に検体中にリューマチ因子等が含まれている場合
にはこれを変性処理することによって非特異反応吸収能
を高めることができる。
変性処理はポリクローナル抗体について知られている変
性処理、例えば熱処理、酸処理、ジメチルスルホキシド
処理などを利用できる。処理の程度は一般に知られてい
る条件よりも強くするのがよく、例えば熱処理の場合に
は60〜65℃では1〜2時間程度、酸処理の場合にはpH2.
3〜2.8では1日〜2日間程度、ジメチルスルホキシド処
理の場合には7〜8Mにて30分〜1時間程度が適当であ
る。
本発明のモノクローナル抗体は血清希釈用液に添加して
使用するのが簡便である。添加量は検体が健常人血清の
場合には未変性のものを1〜10μg/ml程度、通常2μg/
ml程度でよく、検体がリューマチ患者血清の場合には変
性品を5〜500μg/ml程度使用したモノクローナル抗
体、又は変性の方法によって異なるが、通常10〜100μg
/ml程度でよい。このモノクローナル抗体は1種でもよ
く、また2種以上を併用してもよい。2種以上の場合の
添加量は合計で上記の量になればよい。一方、このモノ
クローナル抗体は血清希釈用液と別途に検体と接触させ
てもよい。その場合には、検体と感作モノクローナル抗
体が反応する際あるいはそれ以前に検体へ作用させるよ
うにする。
本発明の非特異反応吸収剤を適用する逆受身凝集反応は
担体粒子に感作される抗体がモノクローナル抗体であれ
ばその種類は問うところではなく、測定対象抗原は例え
ば前述の抗原が含まれる。モノクローナル抗体を感作す
る担体粒子も羊、ニワトリなどの赤血球(ホルマリン等
による固定したものも含む。)のほか、微生物担体(特
公昭50−2730号、特公昭52−48168号など)、ゼラチン
粒子(特開昭57−153658号など)、ラテックスなどの合
成高分子粒子、ベントナイト、カオリンなど抗原抗体反
応に基づく凝集反応に用いうるものであればいかなるも
のであってよい。
測定試薬キットには、通常この感作粒子及び本発明のモ
ノクローナル抗体を含む血清希釈用液のほか、復元液、
対照粒子、対照用陽性血清、非特異反応吸収用粒子など
が含まれる。
〔作用〕
本発明者は、種々検討の結果、血清には2種の非特異反
応因子が存在すると判断するに至った。その一は異種抗
体と呼ばれるもので、これがマウスイムノグロブリン
(モノクローナル抗体)等をも認識して非特異反応をひ
き起こす。もうひとつはリューマチ因子、すなわちリュ
ーマチ患者血清中に存在する抗グロブリン因子である。
本発明のモノクローナル抗体はこれらの因子と反応して
非特異反応を防止しているものと考えられる。
〔実施例〕
実施例1 公知の細胞融合法により、抗原(ヒトAFP CEA HB8ヒトI
gE等)をマウスに免疫し得られたリンパ球とミエローマ
細胞とをポリエチレングリコール等で融合してモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを確立し多量のモノクロ
ーナル抗体を得た。
AFPと反応しないモノクローナル抗体(抗CEA,抗HB8,抗
ヒトIgEモノクローナル抗体等)を1〜2mg/ml濃度に調
整し、63℃にて1.5時間加熱処理をした。
リン酸二ナトリウム・12水塩 19.2053g リン酸カリウム 2.9089g NaCl 4.383g 健康家兎血清(NRS) 10ml NaN3 1.5g 蒸留水 1000ml 上表に示した組成の溶液に熱変性させた前記のモノクロ
ーナル抗体を所定の濃度となるように添加したものを希
釈用液とした。
公知の方法により、ニワトリ赤血球をホルマリンで固定
した後、PBSで10万倍に希釈したタンニン酸溶液で処理
した。この赤血球の5%PBS浮遊液1容量部と抗原認識
部位の異なる(特異性の異なる)抗ヒトAFPモノクロー
ナル抗体三種類を混合した30μg/ml濃度のPBS溶液1容
量部を混合し、37℃に30分間赤血球の表面にモノクロー
ナル抗体を吸着させた。次いで3000rpmで10分間遠心沈
澱して赤血球を回収し、PBSで3回遠心洗浄した。
この操作によりモノクローナル抗体吸着血球を作製し
た。
前述の希釈用液を使用して、抗AFPモノクローナル抗体
感作赤血球とリューマチ患者血清との反応を調べた。
リューマチ患者血清はあらかじめ他の試験方法(RIA法,
EIA法)によりAFP値が5ng/ml以下であることを確認し
た。
リューマチ患者血清との反応はマイクロプレート法にて
行なった。操作法は下記に示した。
まず希釈用液をウエルNo.1に50μ,ウエルNo.2以降は
25μずつ入れ、さらにウエルNo.1に血清を5μ入れ
た。ダイリューター(25μ送り用)にてウエルNo.1か
ら順に2n希釈し、室温にて30分放置した。30分後先に作
製したモノクローナル抗体感作血球浮遊液を希釈用液に
て0.6%セルに調整し、ウエルNo.1から順に25μずつ
滴下した。振とう攪拌後室温に静置し、約1時間半後凝
集像を判定した。
結果を下表に示した。
2例のリューマチ患者血清についてのみ示したが、血清
によって凝集力価が異なっていた。しかしながら凝集力
価の高い血清であっても、熱変性モノクローナル抗体を
100μg/ml濃度となるように希釈液へ添加すれば、非特
異凝集因子を同時吸収することが出来、非特異凝集反応
の発生は皆無であった。
一方、この熱変性モノクローナル抗体を加えなかった場
合には80〜90%のリューマチ患者血清について非特異凝
集反応が発生した。
実施例2 実施例1で得た抗AFPモノクローナル抗体以外のモノク
ローナル抗体を1〜2mg/ml濃度に調整し、0.1Mグリシン
・塩酸(pH2.3)溶液にて透析し酸変性させた。変性後
生塩食塩水にて透析して0.1Mグリシン・塩酸溶液を除去
した。
実施例1と同じ1%NRS含有PBS溶液に酸変性させた上記
のモノクローナル抗体を所定の濃度に添加して希釈用液
を調製した。
この希釈用液と実施例1と同じ抗AFPモノクローナル抗
体感作血球を用い、実施例1と同様にしてマイクロプレ
ート法でリューマチ患者血清との反応を調べたところ、
いずれのモノクローナル抗体の場合も実施例1と同様に
非特異凝集因子を除去することができた。
実施例3 実施例1に示す組成の1%NRS含有0.15MPBS溶液に実施
例1で得た抗AFPモノクローナル抗体以外の未熱変性モ
ノクローナル抗体を2μg/mlになるように加えて希釈用
液を調製した。この希釈用液と実施例1と同じ抗AFPモ
ノクローナル抗体感作血球を用い、健常人血清について
非特異凝集反応の発生率を調べたところ、非特異凝集反
応の発生は皆無であった。
一方、抗AFPモノクローナル抗体以外のモノクローナル
抗体を希釈用液に加えなかった場合の非特異凝集反応発
生率は20〜50%であった。
〔発明の効果〕
本発明の非特異反応吸収剤を使用することにより、モノ
クローナル抗体を逆受身凝集反応に利用しても健常人血
清はむろんのことリューマチ患者血清についても非特異
凝集反応の発生を完全に防止できる。本発明の非特異反
応吸収剤はモノクローナル抗体の逆受身凝集反応への利
用をはじめて実用的に可能にしたものであり、これによ
り、AFPその他一般に高価なものが多い抗原の使用量を
大巾に低下させてコストダウンをさせることができる。
また、モノクローナル抗体の品質が安定しておりかつ製
造段階で変性、失活の問題がないところから測定結果に
対する信頼度を高めるとともに検出感度を向上させるこ
とができる。従来のポリクローナル抗体を使用した場合
のAFP検出感度は25〜50ng/ml程度であったが、モノクロ
ーナル抗体を使用することにより5〜10ng/mlまで高め
ることができた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−146855(JP,A) 特開 昭55−12419(JP,A)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】凝集反応する担体粒子に感作されているモ
    ノクローナル抗体と同種の動物由来であって、測定対象
    の抗原と異なる抗原に対するモノクローナル抗体よりな
    る、モノクローナル抗体を利用した逆受身凝集反応用の
    非特異反応吸収剤
  2. 【請求項2】測定対象の抗原と異なる抗原に対するモノ
    クローナル抗体が血清希釈用液中に含まれた状態にある
    特許請求の範囲第1項記載の非特異反応吸収剤
  3. 【請求項3】測定対象の抗原と異なる抗原に対するモノ
    クローナル抗体が蛋白変性処理によって処理されたもの
    である特許請求の範囲第1項記載の非特異反応吸収剤
JP60154905A 1985-07-13 1985-07-13 逆受身凝集反応用非特異反応吸収剤 Expired - Lifetime JPH0799372B2 (ja)

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