JP2673659B2 - ペプチド - Google Patents
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Description
ペプチド及び該ペプチドを含有する医薬組成物に関する
ものである。
るペプチドが派生することが知られている。食品起源で
あるこれらペプチドには生体に対する安全性が期待でき
る。一般に食品蛋白質由来の生理活性ペプチドは、内因
性生理活性ペプチドとは異なり予想もつかないようなア
ミノ酸配列を持つものが多く、またその機能についても
複数あることから、今なお確認されていないものも数多
くあるものと思われる。ペプチドの持つ生理活性作用の
1つに貪食(ファゴサイトーシス)促進作用がある。こ
の作用は生体内に細菌等の外的異物が進入してきた場
合、好中球やマクロファージによる生体防御の初発反応
として重要である。本発明者は先にファゴサイトーシス
を活性化するペプチドとして、大豆グリシニンA1aサブ
ユニットに含まれるGln-Arg-Pro-Arg やHis-Cys-Gln-Ar
g-Pro-Arg がマクロファージの貪食能を高めることにつ
いて証明し、新規なペプチドとして報告してきた。
ら由来するペプチドについて更なる研究を行ったとこ
ろ、新たに大豆蛋白酵素分解物中にファゴサイトーシス
促進活性を初めとして、他にも優れた生理活性効果を持
つペプチドを見いだした。またその類似化合物について
も検討し、上記ペプチドと同様な効果を有することを見
いだして本発明を完成した。従って、本発明は上記生理
活性を有する新規ペプチド及び該ペプチドの新規な食品
及び医薬用途を提供せんとするものである。
る配列番号1〜10のペプチドに関するものである。 配列番号1:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg 配列番号2:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly 配列番号3:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro 配列番号4:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys 配列番号5:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn 配列番号6:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val 配列番号7:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro 配列番号8:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile 配列番号9:Met-Ile-Thr-Leu-Ala 配列番号10:Met-Ile-Thr-Leu さらに本発明は、上記配列番号1〜10で示されるペプチ
ド及びその医薬上許容される塩を有効成分とする免疫系
賦活作用を有する医薬組成物に関するものである。上記
配列番号1〜10で示されるペプチドは、配列の長さ13〜
4で、いづれも 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド の性状を有する。
チドは、大豆蛋白質を酵素加水分解し、得られた消化物
を、DEAE−セルロースカラムによるクロマトグラフ
ィー、さらにオクタデシリル(ODS)カラム及びフェ
ネチルカラムによる高速液体クロマトグラフィー(HP
LC)によって分画することによって得ることができ
る。
って得られる配列番号1のペプチドがファゴサイトーシ
ス促進作用を有することを見いだし、該ペプチドに基づ
いて更に研究を進めた結果、配列番号1のペプチド及び
その類似体である配列番号2〜10のペプチドもファゴサ
イトーシス促進作用を示し、また配列番号1〜8のペプ
チドが活性酸素産出促進作用を持つことを見いだした。
従って配列番号1〜10のペプチドは免疫系賦活作用を有
する医薬組成物として使用することができる。
列番号1のペプチドを得、これを更に加水分解し、分画
して配列番号2〜10のペプチドを得ることができるほ
か、ペプチド合成機を用いて公知の方法によって配列番
号1〜10のペプチドを得ることもできる。
造の一例を示すが、これらの例に限定されるものではな
い。
プチドの調製 A.消化酵素による調製法の概略を下記表−1に示す。 表−1 大豆蛋白質からの調製法の概略 大豆蛋白質 ↓ トリプシン消化 ↓ カラムクロマト(DEAEセルロースカラム) ↓ HPLC(ODS−カラム) ↓ HPLC(フェネチルカラム) ↓ HPLC(ODS−カラム) ↓ Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg
ペプチドの調製 分離大豆蛋白質50gを 800mlの水に溶解し、3000rpm ×
20分の遠心により可溶性画分を分離した。これを30分煮
沸し、 500mgのトリプシンを加え1N−NaOHでpH=
7.6 に調整して、37℃で消化を行った。5時間後煮沸に
より消化を停止させ、 10000rpm ×15分の遠心分離によ
って得た上澄み液の凍結乾燥によってトリプシン消化物
(固形物量23.8g)を得た。このうちの 100mgをDEA
E−セルロースカラム(DE−52、ワットマン製、担
体2ml)にロードし20mMのトリス−塩酸緩衝液(pH=7.
8 )によって展開し、非吸着画分を1mlずつ分取したと
ころ、活性ペプチドは2ml〜3mlの位置に溶出する画分
に含まれていた。次にこの画分を、ODS−カラム(Co
smosil 5C18-AR, 20 × 250mm、ナカライテスク製)、
続いてフェネチルカラム(4.7 × 250mm、Develosil Ph
A-T-5,野村化学製)にロードし、 0.1%トリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配(1%/min
)により展開した。これらカラムによる活性ペプチド
の溶出は、各々アセトニトリル33〜34%(図1参照)、
36〜37%の位置であった(図2参照)。さらにこの活性
画分をODS−カラム(Cosmosil 5C18-AR, 4.6× 150
mm、ナカライテスク製)にロードし、10mMのリン酸緩衝
液(pH=7.4 )を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配
(1%/min )により展開したところ、活性ペプチドは
アセトニトリル34〜35%の位置に単一のピークとして溶
出した(図3参照)。プロテインシーケンサーにて構造
決定したところ、活性ペプチドはMet-Ile-Thr-Leu-Ala-
Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg であることが判明し
た。
列番号1のペプチドの調製 置換率 0.70meq/gの Fmoc-Arg(Pmc)- 樹脂 0.3gをS
AM2ペプチド合成装置(バイオサーチ社)の反応容器
にセットし、デブロック液(ピペリジン:トルエン:ジ
メチルホルムアミド(DMF)=30:35:35)を加え攪
拌して9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)基
を除去した。この樹脂をジクロロメタン(DCM):D
MF=1:1で洗浄後、 Fmoc-Arg(Pmc)- 樹脂の4倍当
量のヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)及びFm
oc-Glyを加えてカップリングを行った。反応終了後、D
CM:DMF=1:1で洗浄し、Fmoc-Gly-Arg(Pmc)-樹
脂を得た。以下同様にしてN末端の Metまで合成し、D
CM、メタノールで洗浄し、Met-Ile-Thr(Bzl)-Leu-Ala
-Ile-Pro-Val-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Pro-Gly-Arg(Pmc)-樹
脂のペプチドを得た。上記樹脂に脱保護剤(トリフロロ
酢酸:水:チオアニソール:エタンジオール:エチルメ
チルサルファイド:フェノール=82:5:5:3:2:
3)を加えて、室温で4時間放置した。ついで分離した
樹脂を濾過後、エーテルで洗浄、凍結乾燥し、粗Met-Il
e-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg を得
た。これをODS−カラム(Cosmosil 5C18-AR, 20 ×
250mm、ナカライテスク製)にロードし、 0.1%トリフ
ロロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配による
HPLCにて精製したところ約 200mgの純品が得られ
た。なお上記において、Pmc は2,2,5,7,8−ペ
ンタメチルクローマン−6−スルホニル基、Bzl はベン
ジル基、Trt はトリチル基、Boc はt−ブトキシカルボ
ニル基を示す。
列番号2のペプチドの調製 置換率 0.55meq/gの Fmoc-Gly-樹脂 0.4gをSAM2
ペプチド合成装置(バイオサーチ社)の反応容器にセッ
トし、2と同様な方法で合成し相当する12残基ペプチド
−樹脂を得た。上記樹脂に脱保護剤(トリフロロ酢酸:
エタンジオール:アニソール=94:1:5)を加えて、
室温で1時間放置した。以下製造例2と同様にして、約
150mgの純品のMet-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-
Lys-Pro-Gly を得た。
列番号3のペプチドの調製 置換率 0.71meq/gの Fmoc-Pro-樹脂 0.3gをSAM2
ペプチド合成装置(バイオサーチ社)の反応容器にセッ
トし、2と同様な方法で合成し相当する11残基ペプチド
−樹脂を得た。以下製造例3と同様にして、約 150mgの
純品のMet-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro
を得た。
る配列番号4のペプチドの調製 置換率0.46meq/gのFmoc−Lys−樹脂
0.4gをSAM2ペプチド合成装置(バイオサーチ
社)の反応容器にセットし、2と同様な方法で合成し相
当する10残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例3と
同様にして、約150mgの純品のMet−Ile−T
hr−Leu−Ala−Ile−Pro−Val−As
n−Lysを得た。
る配列番号5のペプチドの調製 置換率0.70meq/gのFmoc−Asn−樹脂
0.3gをSAM2ペプチド合成装置(バイオサーチ
社)の反応容器にセットし、2と同様な方法で合成し相
当する9残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例3と同
様にして、約150mgの純品のMet−Ile−Th
r−Leu−Ala−Ile−Pro−Val−Asn
を得た。
ドの調製 配列番号5のペプチドは、配列番号1のペプチドの酵素
による加水分解によっても得ることができる。用いる酵
素は配列番号1のペプチドに含まれるAsn-Lysのペプチ
ド結合を特異的に切断するメタロエンドペプチダーゼ、
アスパラギニルエンドペプチダーゼ等を使用する。以下
にその調製法の一例を示すが、使用する酵素はこの例に
限定されるものではない。配列番号1のペプチド20mg
に、500Uのメタロエンドペプチダーゼ(生化学工業製)
を含む 100mMのグリシン−NaOH緩衝液(pH=10.0)
2mlを加えて、70℃で5時間インキュベートした。反応
停止後この溶液をODS−カラム(Cosmosil5C18-AR,
4.6 × 150mm)を用い、0.1%トリフロロ酢酸を含む
アセトニトリルの直線的濃度勾配によるHPLCによっ
て精製した。アセトニトリル34%付近に溶出する画分を
凍結乾燥したところ約10mgの純品の配列番号5のペプチ
ドを得た。
る配列番号6のペプチドの調製 置換率0.52meq/gのFmoc−Val樹脂0.
4gをSAM2ペプチド合成装置(バイオサーチ社)の
反応容器にセットし、2と同様な方法で合成し相当する
8残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例3と同様にし
て、約100mgの純品のMet−Ile−Thr−L
eu−Ala−Ile−Pro−Valを得た。
る配列番号7のペプチドの調製 置換率0.71meq/gのFmoc−Pro−樹脂
0.3gをSAM2ペプチド合成装置(バイオサーチ
社)の反応容器にセットし、2と同様な方法で合成し相
当する7残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例3と同
様にして、約100mgの純品のMet−Ile−Th
r−Leu−Ala−Ile−Proを得た。
よる配列番号8のペプチドの調製 置換率0.55meq/gのFmoc−Ile−樹脂
0.4gをSAM2ペプチド合成装置(バイオサーチ
社)の反応容器にセットし、2と同様な方法で合成し相
当する6残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例3と同
様にして、約100mgの純品のMet−Ile−Th
r−Leu−Ala−IIeを得た。
よる配列番号9のペプチドの調製 置換率0.70meq/gのFmoc−Ala−樹脂
0.3gをSAM2ペプチド合成装置(バイオサーチ
社)の反応容器にセットし、2と同様な方法で合成し相
当する5残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例3と同
様にして、約50mgの純品のMet−Ile−Thr
−Leu−Alaを得た。
よる配列番号10のペプチドの調製 置換率0.58meq/gのFmoc−Leu−樹脂
0.3gをSAM2ペプチド合成装置(バイオサーチ
社)の反応容器にセットし、2と同様な方法で合成し相
当する4残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例3と同
様にして、約50mgの純品のMet−Ile−Thr
−Leuを得た。
組成、HPLCの溶出位置、及び薄層クロマトグラフィ
ーのRf値を表−2にまとめて示した。尚、配列番号1の
天然品(製造例1)及び合成品(製造例2)は、それら
の結果から同一品であることが判明した。従って、以下
では合成品を用いて検討を行っている。
Leu、AはAla、PはPro、VはVal、DはA
sp、KはLys、GはGly、RはArgを示す。 *1 6N−HCl 110℃の加水分解後の値であ
る。従って、ペプチド組成のAsnはAspとして検出
される。 *2 ODS−カラム(Cosmosil 5C18−
AR,4.6×150mm)を用いて、アセトニトリル
の直線的濃度勾配により測定している。 *3 メルク製のキーゼルゲルプレートを用い、室温に
て展開した。展開溶媒の組成は、ブタノール:酢酸:ピ
リジン:水=15:3:10:12である。
性を示す。 試験例1 ファゴサイトーシス活性の測定 試験方法: ヒト末梢血にリン酸緩衝液を含む生理食塩
水(PBS)を加え、1000rpm−5分の遠心分離で血球
を洗浄したのち、PBSにて4×106 個/mlの血球の懸
濁液を調製した。この溶液 100μl を採り、PBSに溶
解させたペプチド溶液10μl を加え37℃で10分インキュ
ベートを行い、ついでヒト末梢血でオブソニル化した4
×108 個/mlの蛍光標識ラテックスビーズ液10μl を加
え、さらに5分インキュベートを行った。EDTAを含
むPBSで反応を停止させ、遠心により血球を分離し、
これに塩化アンモニウム溶血剤を加えて溶血させ白血球
を得た。これをETDAを含むPBSに懸濁後、フロー
サイトメトリーにて測定した。
赤血球を溶血させHEPES−生理食塩緩衝液に溶かし
2×106 個/mlの好中球浮遊液を作製した。この液
125μlにHEPES−生理食塩緩衝液355μl、
5mMチトクロム−C溶液10μl、及び10μlのペ
プチド水溶液を加え、37℃で15分インキュベートし
た。15分後氷中にて急冷することによりインキュベー
トを停止させた。この溶液を遠心分離し、上澄み液の5
50nm及び468nmの吸光度から活性酸素産出量を
計算した。活性酸素産出量は下記の計算式によって算出
した。 活性酸素産出量=(A1−A2)×k ただし式中、 A1は波長550nmによる吸光度 A2は波長468nmによる吸光度 k は係数(測定に1cmセルを用いた場合の係数は9
5である。)
対する倍率で示した。
にロードして得られた活性画分を、ODSカラムによる
HPLCにより溶離させた時の、該成分の吸光度を測定
したチャートである。
を、フェネチルカラムによるHPLCにより溶離させた
時の、該成分の吸光度を測定したチャートである。
画分を、中性ODSカラムにより溶離させた時の、該成
分の吸光度を測定したチャートである。
Claims (4)
- 【請求項1】 次式で示される配列番号1ないし10の生
理活性を有するペプチド。 配列番号1:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg 配列番号2:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly 配列番号3:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro 配列番号4:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys 配列番号5:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn 配列番号6:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val 配列番号7:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro 配列番号8:Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile 配列番号9:Met-Ile-Thr-Leu-Ala 配列番号10:Met-Ile-Thr-Leu - 【請求項2】 請求項1記載の配列番号1ないし10で示
されるペプチド及びその医薬上許容される塩よりなる群
から選択される1種又は2種以上を有効成分とする免疫
系賦活作用を有する医薬組成物。 - 【請求項3】 免疫系賦活作用がファゴサイトーシス促
進作用である請求項2記載の医薬組成物。 - 【請求項4】 免疫系賦活作用が活性酸素産出促進作用
である、請求項1記載の配列番号1ないし8のペプチド
及びその医薬上許容される塩の1種又は2種以上を有効
成分とする請求項2記載の医薬組成物。
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
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JP6037707A JP2673659B2 (ja) | 1994-02-11 | 1994-02-11 | ペプチド |
Publications (2)
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JPH07224093A JPH07224093A (ja) | 1995-08-22 |
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ID=12505004
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6037707A Expired - Lifetime JP2673659B2 (ja) | 1994-02-11 | 1994-02-11 | ペプチド |
Country Status (1)
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EP3117831A1 (en) * | 2015-07-16 | 2017-01-18 | Nuritas Limited | Peptides for use in promoting transport of glucose into skeletal muscle |
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-
1994
- 1994-02-11 JP JP6037707A patent/JP2673659B2/ja not_active Expired - Lifetime
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