JP2628106B2 - Apoptosis regulator - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、新しいアポトーシス調整剤に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel apoptosis regulator.

背景技術 本発明のアポトーシス調整剤は、下記一般式（１）で
表わされるカルボスチリル誘導体（以下「化合物
（１）」という）及びその塩から選ばれる少なくとも１
種を有効成分とするものである。BACKGROUND ART The apoptosis regulator of the present invention comprises at least one selected from carbostyryl derivatives represented by the following general formula (1) (hereinafter, referred to as “compound (1)”) and salts thereof.
The seed is the active ingredient.

（１）一般式 〔式中Ｒはフェニル環上に置換基として低級アルコキシ
基を有することのあるベンゾイル基を示す。カルボスチ
リル骨格の３位と４位との炭素間結合は一重結合又は二
重結合を示す。〕 上記化合物（１）及びその製法については、例えば特
公平１−43747号公報に記載されており、これが強心剤
として有用であることも公知である。(1) General formula [In the formula, R represents a benzoyl group which may have a lower alkoxy group as a substituent on the phenyl ring. The carbon-carbon bond between the 3-position and the 4-position of the carbostyril skeleton indicates a single bond or a double bond. The above compound (1) and its production method are described in, for example, Japanese Patent Publication No. 43747/1989, and it is also known that this compound is useful as a cardiotonic agent.

本発明者は、上記化合物（１）につき、更に研究を続
けた結果、これがその有している上記公知作用からは予
想困難な制癌作用、細胞の分化誘導能等を始めとするア
ポトーシス調整（抑制乃至促進）作用を有していること
を見い出した。The present inventor has further studied the compound (1), and as a result, it has been found that the compound (1) has an anticancer effect, a cell differentiation inducing ability, etc. which are difficult to predict from the above-mentioned known effects. (Suppression or promotion).

しかして従来より、細胞死は２つのタイプのメカニズ
ムにより起こるとされている。そのひとつは壊死と呼ば
れてきた古典的細胞死である。これは形態学的には、ミ
トコンドリアの著しい膨化、細胞質の膨化、核の変性と
それに続く細胞の崩壊及び自己融解により特徴付けら
れ、受動的及び偶発的に生じる。組織壊死は、細胞に対
する物理的外傷や化学的毒物等により一般に認められ
る。Thus, cell death has hitherto been attributed to two types of mechanisms. One of them is classic cell death, which has been called necrosis. It is morphologically characterized by marked mitochondrial swelling, cytoplasmic swelling, nuclear degeneration followed by cell disruption and autolysis, and occurs passively and accidentally. Tissue necrosis is generally recognized by physical trauma to cells, chemical poisons, and the like.

もうひとつのタイプはアポトーシス（プログラムされ
た細胞死）と呼ばれる（Kerr,J.F.R.and Wyllie,A.H.,B
r.J.Cancer,265,239（1972））。これは生理学上の種々
の条件下に起こるとされている。その形態学的特徴とし
ては、周囲の細胞との接触の欠乏、細胞質の濃縮化、エ
ンドヌクレアーゼの活性に関連したクロマチンの凝縮及
び核凝縮、核の分節化等を挙げることができ、更に細胞
表面の微絨毛の消失、細胞表面の平滑化（細胞表面の水
疱形成:membrance blebbing）等も観察され、またエン
ドヌヌクレアーゼ活性により、DNAのヌクレオソーム単
位が180〜200塩基長のDNAに断片化する現象も観察さ
れ、アポティック体の細胞の最終断片は隣接する細胞に
より貧食される機構として論じられている（Duvall,E.a
nd Wyllie,A.H.,Immunology Today,７（４）,115−119
（1986）:Science,245,301−305（1989））。上記ウイ
リーはまたグルココルチコイドにより誘発される胸腺細
胞のアポトーシスが、細胞内のエンドヌクレアーゼの活
性化を伴うことを報告している（Wyllie,A.H.,Nature,2
84,555−556（1986））。エンドヌクレアーゼ活性によ
りアポトーシスを受ける細胞のDNAは、オリゴヌクレオ
チドレベルまで断片化され、これはアガロースゲル電気
泳動を行なうことにより容易に確認できる。Another type is called apoptosis (programmed cell death) (Kerr, JFRand Wyllie, AH, B
rJCancer, 265, 239 (1972)). It is believed that this occurs under various physiological conditions. Its morphological features include lack of contact with surrounding cells, cytoplasmic enrichment, chromatin condensation and nuclear condensation associated with endonuclease activity, nuclear segmentation, and the like. Loss of microvilli and smoothing of the cell surface (membrane blebbing) are also observed, and the phenomenon that the nucleosome unit of DNA is fragmented into DNA of 180 to 200 bases in length due to endonuclease activity. Are also observed, and the final fragment of apoptotic cells has been discussed as a mechanism for phagocytosis by neighboring cells (Duvall, Ea
nd Wyllie, AH, Immunology Today, 7 (4), 115-119
(1986): Science, 245, 301-305 (1989)). The Willie also reports that apoptosis of thymocytes induced by glucocorticoids is accompanied by activation of intracellular endonucleases (Wyllie, AH, Nature, 2).
84, 555-556 (1986)). The DNA of cells undergoing apoptosis due to endonuclease activity is fragmented to the oligonucleotide level, which can be easily confirmed by agarose gel electrophoresis.

上記アポトーシスとは、発生や分化や組織のターンオ
ーバーの過程でみられる、予めプログラムされた細胞死
であると考えられる（Wyllie,A.H.,et al.,Int.Rev.Cyt
ol.,68,251−306（1980））。Apoptosis is thought to be pre-programmed cell death seen during development, differentiation and tissue turnover (Wyllie, AH, et al., Int. Rev. Cyt.
ol. , 68, 251-306 (1980)).

また、胸腺細胞ではカルシウムイオノファでカルシウ
ム濃度を上昇させたり、cAMP濃度を上昇させたりする
と、上記アポトーシスに特徴的なDNAの断片化が促進さ
れる（Wyllie,A.H.,et al.,J.Pathol.,142,67−77（198
4））ことから、アポトーシスのメカニズムに、カルシ
ウムイオンやcAMPの関与が推測されている。更にレチノ
イン酸やカルシウムイオノファにより分化誘導されるHL
−60細胞のアポトーシスが、上記の例として報告されて
いる。（Martin,S.J.,et al.,J.Immunol.,145,1859−18
67（1990）:Martin,S.J.,et al.,Clin.Exp.Immunol.,7
9,448−453（1990））。In addition, increasing the concentration of calcium or increasing the cAMP concentration of thymocytes with calcium ionophore promotes the DNA fragmentation characteristic of the apoptosis (Wyllie, AH, et al., J. Pathol. ., 142, 67-77 (198
4)) Therefore, it is speculated that the involvement of calcium ions and cAMP in the mechanism of apoptosis. HL induced differentiation by retinoic acid and calcium ionophore
Apoptosis of -60 cells has been reported as an example above. (Martin, SJ, et al., J. Immunol., 145, 1859-18
67 (1990): Martin, SJ, et al., Clin. Exp. Immunol. , 7,
9, 448-453 (1990)).

上記アポトーシスは、胚発生過程や正常の細胞回転の
盛んな細胞（例えば肝、副腎皮質、前立腺等）にみられ
る生理的細胞死から、グルココルチコイド処理、サイト
トキシック−Ｔ細胞による細胞障害、ホルモン依存性組
織の萎縮、放射線照射、NK細胞、キラー細胞、腫瘍壊死
因子（TNF）、リンホトキシン（LT）等のサイトカイン
類等によっても誘導されると報告されている（Wyllie,
A.H.,et al.,Int.Rev.Cytol.,68,251（1980）:Duvall,
E.and Wyllie,A.H.,Immunology Today,７,115−119（19
86）:Sellins,K.S.,et al.,J.Immunol.,139,3199（198
7）:Yamada,T.,et al.,Int.J.Radiat.Biol.,53,65（198
8）:Wyllie,A.H.,Nature,284,555（1980）:Schmid,D.
S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,83,1881−1885（1
986）:John,C.,et al.,J.Immunol.,129（４）,1782−17
87（1982）:Howell,D.M.,et al.,J.Immunol.,140,689−
692（1988）:Gillian.B.,et al.,Eur.J.Immunol.,17,68
9−693（1987））。その他に、ある種の抗体、例えば抗
CD3抗体、抗APO−Ｉ抗体、抗Fas抗体等（Trauth,B.C.,e
t al.,Science,245,301−305（1989）:Smith,C.A.,et a
l.,Nature,337,181−184（1989）:Tadakuma,T.,et al.,
Eur.J.Immunol.,20,779（1990））でもアポトーシスが
誘導され、悪性腫瘍での自然退縮（中村保夫他、臨床皮
膚科，35（４）,289−295（1981））の所見においても
アポトーシスが確認されている。The above-mentioned apoptosis may be caused by physiological cell death observed in cells undergoing embryogenesis and normal cell rotation (eg, liver, adrenal cortex, prostate, etc.), glucocorticoid treatment, cytotoxicity by cytotoxic-T cells, and hormone dependence. It has been reported that it is also induced by atrophy of sexual tissues, irradiation, NK cells, killer cells, cytokines such as tumor necrosis factor (TNF) and lymphotoxin (LT) (Wyllie,
AH, et al., Int. Rev. Cytol. , 68, 251 (1980): Duvall,
E. and Wyllie, AH, Immunology Today, 7 , 115-119 (19
86): Sellins, KS, et al., J. Immunol., 139, 3199 (198
7): Yamada, T., et al., Int. J. Radiat. Biol., 53 , 65 (198
8): Wyllie, AH, Nature, 284 , 555 (1980): Schmid, D.
S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83 , 1881-1885 (1
986): John, C., et al., J. Immunol., 129 (4), 1782-17
87 (1982): Howell, DM, et al., J. Immunol., 140, 689-
692 (1988): Gillian.B., Et al., Eur.J.Immunol., 17 , 68.
9-693 (1987)). In addition, certain antibodies, such as anti-
CD3 antibody, anti-APO-I antibody, anti-Fas antibody, etc. (Trauth, BC, e
t al., Science, 245, 301-305 (1989): Smith, CA, et a.
l., Nature, 337, 181-184 (1989): Tadakuma, T., et al.,
Apoptosis is also induced in Eur. J. Immunol. , 20, 779 (1990), and the findings of spontaneous regression in malignant tumors (Yasuo Nakamura et al., Clinical Dermatology, 35 (4), 289-295 (1981)) Apoptosis has also been confirmed.

一方、上記アポトーシスを抑制するものとしては、RN
A合成阻害剤であるアクチノマイシンＤ（Actinomycin
D）、蛋白合成阻害剤であるサイクロヘキシミド（Cyclo
heximide）、カルシウムイオン（Ca²⁺）キレート剤等が
報告されており、その他に免疫抑制剤であるサイクロス
ポリンＡ、造血系サイトカイン（IL−３、GM−CSF、Ｇ
−CSF等）、IL−２、bcl−２遺伝子産物等もアポトーシ
スを抑制すると報告されている（Cohen,J.J. J.Immuno
l.,132,38（1984）:Wyllie,A.H.,et al.,J.Pathol.,14
2,67（1984）:Shi,Y.,et al.,Nature,339,625（1989）:
Williams,G.T.,et al.,Nature,343,76（1990）:Nielo,
M.A.,J.Immunol.,143,4166（1989）:Vaux,D.L.,et al.,
Nature,335,1440（1988））。但し、上記シクロヘキシ
ミドは急性白血病細胞に、アクチノマイシンＤは小腸陰
窩細胞に、両者がHL−60細胞にそれぞれアポトーシスを
誘導する報告（Martin,S.J.,et al.,J.Immunol.,145,18
59−1867（1990）がある。逆にサイクロヘキシミドは、
Ｘ線照射前に存在し、Ｘ線照射により増加したリンパ球
系腫瘍細胞のアポトーシスを抑制し、アクチノマイシン
Ｄが上記アポトーシスを増加させる旨の報告もあり、ア
ポトーシスの抑制又は促進には、細胞の種類や条件、そ
の他の機序の関与も示唆されている（五十嵐忠彦ら、日
本血液学会誌、51（２）,144（1988））。いずれにせ
よ、細胞の分化、増殖、成熟がアポトーシスと密接な関
係にあり、之等細胞の分化、増殖等に関与する作用を有
する物質がアポトーシスにも関係すると考えられてい
る。On the other hand, those that suppress the apoptosis include RN
Actinomycin D (A)
D), a protein synthesis inhibitor cycloheximide (Cyclo
heximide), calcium ion (Ca ²⁺ ) chelating agents, etc., and cyclosporin A, an immunosuppressant, hematopoietic cytokines (IL-3, GM-CSF, G
-CSF etc.), IL-2, bcl-2 gene products, etc. are also reported to suppress apoptosis (Cohen, JJJ Immuno).
l., 132 , 38 (1984): Wyllie, AH, et al., J. Pathol., 14
2, 67 (1984): Shi, Y., et al., Nature, 339, 625 (1989):
Williams, GT, et al., Nature, 343, 76 (1990): Nielo,
MA, J. Immunol., 143, 4166 (1989): Vaux, DL, et al.,
Nature, 335, 1440 (1988)). However, the above cycloheximide induces apoptosis in acute leukemia cells, actinomycin D induces apoptosis in small intestinal crypt cells, and both induce apoptosis in HL-60 cells (Martin, SJ, et al., J. Immunol., 145 , 18).
59-1867 (1990). Cycloheximide, on the other hand,
It has been reported that apoptosis of lymphocytic tumor cells, which is present before X-ray irradiation and increased by X-ray irradiation, and that actinomycin D increases the above-mentioned apoptosis. Involvement of types, conditions, and other mechanisms has also been suggested (Tadahiko Igarashi et al., Journal of the Japanese Society of Hematology, 51 (2), 144 (1988)). In any case, the differentiation, proliferation, and maturation of cells are closely related to apoptosis, and it is considered that substances having an action related to the differentiation, proliferation, etc. of such cells are also involved in apoptosis.

また最近、アポトーシスに関連する治療法として、抗
Apo−Ｉ抗体による癌の治療も試みられている。骨髄異
形成症候群（MDS）の内で、汎血球減少が主体である不
応性貧血（RA）及び鉄芽球性貧血（RARS）では、造血細
胞の分化誘導剤としてのレチノイン酸や活性型ビタミン
D₃と、血小板産生細胞の過剰アポトーシスを抑制するア
ポトーシス調整剤としてのGM−CSFやIL−３の併用が望
ましく、また同MDSの内、芽球の増殖が優勢なRAEBや該R
AEBの移行期（RAEB−ｔ）では、上記レチノイン酸や活
性型ビタミンD₃が、造血細胞の芽球への分化を誘導する
分化誘導剤として、またエトポジド（etoposide）やア
クラルビシン（aclarubicin）が芽球の増殖を抑制（ア
ポトーシス促進）するアポトーシス調整剤として、それ
ぞれ働くとされている（Shibuya,T.,J.Clinical and Ex
perimental Medicine,160（５）,319−323（1992））。Recently, anti-apoptotic treatments
Treatment of cancer with Apo-I antibodies has also been attempted. Among myelodysplastic syndromes (MDS), refractory anemia (RA) and pancreatic anemia (RARS), mainly due to pancytopenia, have retinoic acid and active vitamins as hematopoietic cell differentiation inducers.
And D _3, GM-CSF and IL-3 in combination is preferable as suppressing apoptosis modifier excess apoptosis platelet producing cells, also of the same MDS, proliferation of blasts predominant RAEB and said R
In the transition period AEB (RAEB-t), the retinoic acid or an active vitamin D ₃ is, as a differentiation inducing agent to induce differentiation into hematopoietic cells of blasts, also Etopojido (etoposide) and aclarubicin (aclarubicin) bud It is said that each acts as an apoptosis regulator that suppresses the proliferation of spheres (promotes apoptosis) (Shibuya, T., J. Clinical and Ex
perimental Medicine, 160 (5), 319-323 (1992)).

また、ムラカミらは抗赤血球自己抗体を発現している
トランスジェニックマウスの約半数が自己のトレランス
の消失により自己免疫疾患を発症するとし、正常マウス
のような自己抗原と自己抗体産生細胞の反応によるアポ
トーシス誘導による自己抗体産生細胞の除去能の欠如に
よると報告している（Murakami,M.,et al.,Nature,357,
77−80（1992））。Murakami and colleagues also report that about half of transgenic mice expressing anti-erythrocyte autoantibodies develop autoimmune diseases due to loss of self-tolerance, and the reaction between autoantigens and autoantibody-producing cells as in normal mice. It has been reported that it is due to the lack of ability to remove autoantibody-producing cells by inducing apoptosis (Murakami, M., et al., Nature, 357 ,
77-80 (1992)).

ワタナベ−フクナガらはMRLlpr/lprマウスにおいて
は、アポトーシスに関与するFas分子に異常があり、胸
腺における自己反応性Ｔ細胞のネガティブセレクション
（アポトーシス）機構がうまく作動せず、その結果自己
免疫疾患が発症すると示唆している（Watanabe−Fukuna
ga,R.,et al.,Nature,356,314−317（1992））。Watanabe-Fukunaga et al. Found that in MRLlpr / lpr mice, the Fas molecule involved in apoptosis was abnormal, and the mechanism of negative selection (apoptosis) of autoreactive T cells in the thymus did not work, resulting in the development of autoimmune diseases. (Watanabe-Fukuna
ga, R., et al., Nature, 356, 314-317 (1992)).

モンタニエらは、HIV−感染患者からのＴリンパ球抽
出物中には、DNAのアポプテッイックなバンドが観察さ
れ、この現象は無症候群のHIV感染患者の90％、AIDSとA
RC患者の100％に観察され、アポトーシスの誘導がHIV感
染患者においても亢進していると報告している（Montag
nier,L.,et al.,Sixieme Colloque des Cent Gardes,9
−17（1991））。Montagnier et al. Have observed an apoptotic band of DNA in T lymphocyte extracts from HIV-infected patients, a phenomenon that is 90% of asymptomatic HIV-infected patients, AIDS and ADS.
It is observed in 100% of RC patients and reports that induction of apoptosis is also enhanced in HIV-infected patients (Montag
nier, L., et al., Sixieme Colloque des Cent Gardes, 9
-17 (1991)).

ニワトリ発生期の細胞死において、ニワトリ胚にNGF
（nerve growth factor:神経細胞の神経節で細胞の肥大
と神経繊維の伸長を促進する蛋白質）を前投与すると、
この発生過程の神経細胞死は完全に抑制され（Hamburge
r,V.,et al.,J.Neurosci.,１,60（1981））、逆にNGFに
対する抗体を投与すると、幼若な交感神経細胞の約90％
が失われてしまうと報告されている（Levi−Montalchin
i,R.and Booker,B.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,46,384
（1960））。During cell development during chick development, NGF is added to chicken embryos.
Pre-administration (nerve growth factor: a protein that promotes cell hypertrophy and nerve fiber elongation in ganglia of nerve cells)
Neuronal death during this development is completely suppressed (Hamburge
r, V., et al., J. Neurosci., 1 , 60 (1981)). Conversely, when an antibody against NGF is administered, about 90% of young sympathetic nerve cells are administered.
Has been reported to be lost (Levi-Montalchin
i, R.and Booker, B., Proc.Natl.Acad.Sci ., USA, 46, 384
(1960)).

クラークは自然に起こる神経細胞死を３つのタイプに
区別し、その中のタイプＩの形態学的特徴がアポトーシ
スと一致し、更に成長因子除去による細胞死ではタイプ
Ｉの細胞死が起こり、DNAの断片化も起ることから、こ
れをアポトーシスと考えている（Clark,P.G.H.,Anat Em
bryol.,181,195（1990）:J.Neurosci.,１,60（1981）:P
roc.Natl.Acad.Sci.,USA,46,384（1960）:Rawson,C.L.,
et al.,J.Cell.Biol.,113,671（1991））。Clark distinguishes spontaneous neuronal cell death into three types, in which the morphological characteristics of type I are consistent with apoptosis, and cell death by growth factor removal results in type I cell death, Since fragmentation also occurs, this is considered apoptosis (Clark, PGH, Anat Em
bryol., 181 , 195 (1990): J. Neurosci., 1 , 60 (1981): P
. roc.Natl.Acad.Sci, USA, 46, 384 (1960): Rawson, CL,
et al., J. Cell. Biol., 113, 671 (1991)).

エドワーズらはNGFにより交感神経細胞のプログラム
死を抑制できると報告しており、アポトーシスがNGFに
より抑制できると考えられる（Edwards,S.N.,et al.,J.
Neurochemistry,57（６）,2140−2143（1991））。Edwards et al. Report that NGF can suppress programmed death of sympathetic nerve cells, and that apoptosis may be suppressed by NGF (Edwards, SN, et al., J. Med.
Neurochemistry, 57 (6), 2140-2143 (1991)).

フィッシャーらの報告によれば、老化して学習障害を
持ったラットにNGFを投与すると、アルツハイマー病で
障害を受けることが知られている前脳基底野コリン作動
性神経細胞に該NGFが作用して、学習障害の回復がみら
れる（Fischer,W.,et al.,Nature,329,65（1987）:Bard
e Y−A,Neuron,2,1525（1989）:Hatanaka,H.,Develop B
rain Res.,30,47（1986）:Hatanaka,H.,et al.,Develop
Brain Res.,39,85（1988））。畠中らは上記NGFが分
化、成熟、生存維持、老化の防止に有効で、神経細胞の
障害に対する保護回復作用、脳の老化に伴う神経疾患、
特にアルツハイマー病での神経細胞死の防止作用を示す
可能性を示唆している（畠中寛、代謝、28,891−899（1
991））。According to a report by Fischer et al., When NGF is administered to aging and learning-impaired rats, the NGF acts on cholinergic neurons in the basal forebrain, which is known to be damaged by Alzheimer's disease. Recovery of learning disabilities is observed (Fischer, W., et al., Nature, 329, 65 (1987): Bard
e Y-A, Neuron, 2, 1525 (1989): Hatanaka, H., Develop B
rain Res., 30 , 47 (1986): Hatanaka, H., et al., Develop
Brain Res., 39 , 85 (1988)). Hatanaka and colleagues said that NGF is effective in differentiation, maturation, survival maintenance, prevention of aging, protection and recovery action against nerve cell damage, neurological diseases associated with brain aging,
In particular, they suggest that they may have a protective effect on neuronal cell death in Alzheimer's disease (Hatanaka Hiroshi, Metabolism, 28 , 891-899 (1).
991)).

更に薬剤耐性ウィルス性肝炎の肝障害においては、薬
剤又はウィルス感染により、直接的又は免疫的機序を介
するアポトーシス亢進が、肝障害に関与していると考え
られている（Bursh,W.,et al.,TiPS,13,245−251（199
2））。Furthermore, in the liver damage of drug-resistant viral hepatitis, it is thought that the apoptosis enhancement directly or through an immune mechanism is involved in the liver damage by drug or virus infection (Bursh, W., et al.). al., TiPS, 13 , 245-251 (199
2)).

一方、肝臓ではマイトジェンによって肝細胞が増殖
し、過形成状態をもたらすことが知られており、この状
態は肝細胞の脱落壊死、即ちアポトーシスにより正常化
される（Kerr,J.F.et al.,Br.J.Cancer,26,239−257（1
972））。該アポトーシスは肝臓において、過形成肝、
過形成性結節及び肝癌等で認められており（Columbano,
A.,et al.,Lab.Invest.,52,670−675（1985）:Columban
o,A.et al.,Am.J.Pathol.,116,441−446（1984））、ケ
ラーらはアポトーシスは炎症や線維増殖を伴わないと述
べている（Kerr,J.F.,et al.,Lancet,2,827−828（197
9））。之等のことから、急性及び慢性肝炎に対してア
ポトーシスを抑制することができれば、之等肝炎の治療
が可能と考えられる。また慢性肝炎が肝硬変、肝癌に移
行していく過程では、上記アポトーシスは抑制状態にあ
り、これがサイトトキシックＴ細胞による肝細胞の炎症
に続く線維化、肝硬変へと進展するものと考えられ、該
アポトーシスを促進させることができれば、肝炎の抑制
及び肝硬変への進展が防止できると考えられる。On the other hand, it is known that mitogen causes liver cells to proliferate in the liver, resulting in a hyperplastic state, and this state is normalized by hepatocyte shedding and necrosis, that is, apoptosis (Kerr, JF et al., Br. J. .Cancer, 26 , 239-257 (1
972)). The apoptosis occurs in the liver in a hyperplastic liver,
It has been observed in hyperplastic nodules and liver cancer (Columbano,
A., et al., Lab. Invest., 52, 670-675 (1985): Columban
o, A. et al., Am. J. Pathol., 116 , 441-446 (1984)), Keller et al. state that apoptosis is not associated with inflammation or fibrosis (Kerr, JF, et al., Lancet, 2, 827-828 (197
9)). From these facts, if it is possible to suppress apoptosis for acute and chronic hepatitis, it is considered that such hepatitis can be treated. In the process of transition of chronic hepatitis to liver cirrhosis and liver cancer, the above-mentioned apoptosis is in a suppressed state, which is considered to progress to fibrosis and cirrhosis following inflammation of hepatocytes by cytotoxic T cells. Can be considered to be able to suppress hepatitis and prevent progression to cirrhosis.

発明の開示 本発明によれば、化合物（１）及びその塩類から選ば
れる少なくとも１種を有効成分として含有するアポトー
シス調整剤が提供される。DISCLOSURE OF THE INVENTION According to the present invention, there is provided an apoptosis-modulating agent containing as an active ingredient at least one selected from compound (1) and salts thereof.

本発明アポトーシス調整剤は、アポトーシス調整能を
有しており、この作用に基づいて、例えば前述したよう
に、制癌剤、抗レトロウイルス剤、自己免疫疾患治療
剤、血小板減少症治療剤、アルツハイマー病治療剤、肝
炎、肝硬変等の肝疾患治療剤、癌転移抑制剤等として、
医薬品分野で有効である。The apoptosis-regulating agent of the present invention has apoptosis-regulating ability, and based on this action, for example, as described above, an anticancer agent, an antiretroviral agent, a therapeutic agent for an autoimmune disease, a therapeutic agent for thrombocytopenia, a therapeutic agent for Alzheimer's disease Drugs, hepatitis, liver disease treatment such as cirrhosis, cancer metastasis inhibitor, etc.
Effective in the pharmaceutical field.

上記化合物（１）を表わす一般式において、フェニル
環上に置換基として低級アルコキシ基を有することのあ
るベンゾイル基としては、ベンゾイル、２−メトキシベ
ンゾイル、３−メトキシベンゾイル、４−メトキシベン
ゾイル、２−エトキシベンゾイル、３−エトキシベンゾ
イル、４−エトキシベンゾイル、４−イソプロポキシベ
ンゾイル、４−ヘキシルオキシベンゾイル、3,4−ジメ
トキシベンゾイル、3,4−ジエトキシベンゾイル、3,4,5
−トリメトキシベンゾイル、2,5−ジメトキシベンゾイ
ル等等のフェニル環上に置換基として炭素数１〜６の直
鎖又は分枝状のアルコキシ基を１〜３個有することのあ
るベンゾイル基を例示できる。In the general formula representing the compound (1), the benzoyl group which may have a lower alkoxy group as a substituent on the phenyl ring includes benzoyl, 2-methoxybenzoyl, 3-methoxybenzoyl, 4-methoxybenzoyl, Ethoxybenzoyl, 3-ethoxybenzoyl, 4-ethoxybenzoyl, 4-isopropoxybenzoyl, 4-hexyloxybenzoyl, 3,4-dimethoxybenzoyl, 3,4-diethoxybenzoyl, 3,4,5
Benzoyl groups which may have 1 to 3 carbon atoms having 1 to 3 straight or branched alkoxy groups as substituents on the phenyl ring such as -trimethoxybenzoyl, 2,5-dimethoxybenzoyl and the like. .

本発明において有効成分として用いる上記化合物
（１）中、特に好ましいものとしては、例えば６−［４
−（3,4−ジメトキイベンゾイル）−１−ピペラジニ
ル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル及びその塩を例示
できる。Among the above-mentioned compound (1) used as an active ingredient in the present invention, particularly preferred are, for example, 6- [4
-(3,4-Dimethoxykibenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril and salts thereof.

上記有効成分化合物は、通常の酸を用いて容易に薬理
的に許容される塩を形成させ得、之等の塩も遊離形態の
化合物と同様に有効成分化合物として用いることができ
る。上記酸としては、硫酸、硝酸、塩酸、臭化水素酸等
の無機酸及び酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、エタンス
ルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、フマール酸、クエン
酸、コハク酸、安息香酸等の有機酸を例示できる。The above-mentioned active ingredient compound can easily form a pharmacologically acceptable salt using an ordinary acid, and these salts can be used as the active ingredient compound similarly to the free form compound. Examples of the acid include inorganic acids such as sulfuric acid, nitric acid, hydrochloric acid, and hydrobromic acid, and acetic acid, p-toluenesulfonic acid, ethanesulfonic acid, oxalic acid, maleic acid, fumaric acid, citric acid, succinic acid, benzoic acid, and the like. Can be exemplified.

本発明アポトーシス調整剤の有効成分である化合物
（１）は、通常、一般的な医薬製剤の形態で用いられ
る。かかる製剤は通常使用される充填剤、増量剤、結合
剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あ
るいは賦形剤を用いて調製される。この医薬製剤として
は各種の形態が治療目的に応じて選択でき、この代表的
なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、
顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤
等）、点眼剤等が挙げられる。The compound (1) which is an active ingredient of the apoptosis regulator of the present invention is generally used in the form of a general pharmaceutical preparation. Such a preparation is prepared using a commonly used diluent or excipient such as a filler, a bulking agent, a binder, a humectant, a disintegrant, a surfactant, and a lubricant. As the pharmaceutical preparation, various forms can be selected according to the purpose of treatment, and typical examples thereof include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions,
Examples include granules, capsules, suppositories, injections (solutions, suspensions, etc.), eye drops and the like.

錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分
野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白
糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸
カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦
形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブ
ドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチ
ルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カ
リウム、ポリビニルピロリドン糖の結合剤、乾燥デンプ
ン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン
末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシ
エチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナ
トリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳
糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素
添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウ
リル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デン
プン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナ
イト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステ
アリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑
沢剤等が例示できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮
を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被
錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠と
することができる。For molding into tablets, those conventionally known in the art can be widely used as carriers, for example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid, etc. Excipient, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, binder for polyvinylpyrrolidone sugar, dried starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder Disintegrating agents such as sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, monoglyceride stearate, starch, lactose, disintegrating inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil, Quaternary ammonium bases, absorption promoters such as sodium lauryl sulfate, humectants such as glycerin and starch, adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal silicic acid, purified talc, stearates, boric acid powder, Lubricants such as polyethylene glycol can be exemplified. Further, the tablets can be made into tablets coated with a usual coating, if necessary, such as sugar-coated tablets, gelatin-coated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets or double tablets or multilayer tablets.

丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分
野で従来公知なるものを広く使用でき、例えばブドウ
糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリ
ン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント
末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナランカン
テン等の崩壊剤等が例示できる。In molding into a pill form, those conventionally known in the art can be widely used as carriers, for example, excipients such as glucose, lactose, starch, cocoa butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc, gum arabic powder, Examples include binders such as tragacanth powder, gelatin and ethanol, and disintegrants such as laminaran agar.

坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公
知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコー
ル、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエス
テル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げること
ができる。For shaping in the form of suppositories, conventionally known carriers can be widely used, and examples thereof include polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohols, esters of higher alcohols, gelatin, and semi-synthetic glycerides.

注射剤として調製される場合には、液剤及び懸濁剤は
殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これら
液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に成形するに際しては、希
釈剤としてこの分野において慣用されているものを全て
使用でき、例えば水、エチルアルコール、プロピレング
リコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリ
オキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレ
ンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができ
る。尚、この場合等張性の溶液を調製するに充分な量の
食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有
せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛
化剤等を添加してもよい。When prepared as an injection, the solution and suspension are preferably sterilized and isotonic with blood, and when formed into the form of these solutions, emulsions and suspensions, they may be used as diluents. Any of those commonly used in the field can be used, and examples thereof include water, ethyl alcohol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. In this case, a sufficient amount of salt, glucose or glycerin to prepare an isotonic solution may be contained in the pharmaceutical preparation, and a usual solubilizing agent, buffer, soothing agent and the like may be added. You may.

更に本発明アポトーシス調整剤中には必要に応じて着
色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を
含有せしめてもよい。Furthermore, the apoptosis-controlling agent of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a flavor, a flavoring agent, a sweetening agent, and other pharmaceuticals as necessary.

上記医薬製剤中に含まれる有効成分化合物の量は、特
に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常全組成物
中１〜70重量％、好ましくは１〜30重量％含まれる量と
するのが適当である。The amount of the active ingredient compound contained in the pharmaceutical preparation is not particularly limited and may be appropriately selected in a wide range, but it is usually 1 to 70% by weight, preferably 1 to 30% by weight in the whole composition. Is appropriate.

上記医薬製剤の投与方法は特に制限はなく、各種製剤
形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に
応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、
乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合には経口投与され
る。また注射剤の場合には単独であるいはブドウ糖、ア
ミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に
は必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔
内投与される。坐剤の場合には直腸内投与され、点眼剤
の場合には目に適用される。The administration method of the above pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, gender and other conditions, degree of disease, and the like. For example, tablets, pills, solutions, suspensions,
Emulsions, granules and capsules are orally administered. In the case of an injection, it is administered intravenously, alone or as a mixture with a normal replenisher such as glucose or amino acid, and if necessary, intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally. In the case of suppositories it is administered rectally and in the case of eye drops it is applied to the eye.

上記医薬製剤の投与量は用法、患者の年齢、性別その
他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常
有効成分である化合物（１）の量は１日当り体重1kg当
り約0.5〜30mgとするのがよい。また、投与単位形態中
に有効成分を約10〜1000mg含有させるのがよい。The dose of the above pharmaceutical preparation is appropriately selected depending on the usage, the age of the patient, gender and other conditions, the degree of the disease, and the like. Usually, the amount of the compound (1) which is the active ingredient is about 0.5 to 30 mg / kg of body weight per day. It is good to do. The dosage unit form should preferably contain about 10-1000 mg of the active ingredient.

本発明アポトーシス調整剤は、その有するアポトーシ
ス調整能や細胞の分化誘導能等に基づいて、各種疾患に
適用でき、所望の薬理効果を期待できる。該適用疾患と
しては、より具体的には、例えば癌、AIDS、ARC（AIDS
関連疾患）、ATL（成人Ｔ細胞白血病:Adult T−cell le
ukemia）、毛様細胞性白血病（Hairy cell leukemi
a）、脊髄症（HAM/TSP）、呼吸器障害（HAB/HABA）、関
節症（HAAP）、ブドウ膜炎（HAU）等のHTLV−Ｉ関連疾
患、自己免疫疾患、例えばSLE（全身性エリテマトーデ
ス）、慢性関節リウマチ（RA）等の膠原病、潰瘍性大腸
炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、突発性
血小板減少性紫斑病（Idiopathic Thrombocytopenic Pu
rapura:ITP）、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、
橋本病、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病等を例示でき
る。また血小板減少を伴う各種の疾患、例えば骨髄異形
成症候群、周期性血小板減少症、再生不良性貧血、突発
性血小板減少症、汎発性血管内凝固症等にも、本発明ア
ポトーシス調整剤が適用できる。更に本発明調整剤は、
Ｃ型、Ａ型、Ｂ型、Ｆ型等の各種の肝炎、アルツハイマ
ー病、アルツハイマー型老年痴呆症、心筋炎、ARDS（成
人呼吸急迫症候群）感染症、肝硬変、前立腺肥大症、子
宮筋腫、気管支喘息、動脈硬化症、各種先天性奇形症、
腎炎、老人性白内障、慢性疲労症候群（Chronic Fatigi
u Syndrome）、筋ジストロフィー（Myotonic dystroph
y）等の各種疾患にも適応可能である。The apoptosis controlling agent of the present invention can be applied to various diseases based on its apoptosis controlling ability, cell differentiation inducing ability, and the like, and a desired pharmacological effect can be expected. More specifically, as the applicable disease, for example, cancer, AIDS, ARC (AIDS
Related diseases), ATL (Adult T-cell leukemia: Adult T-cell leukemia)
ukemia), Hairy cell leukemi
a), HTLV-I-related diseases such as myelopathy (HAM / TSP), respiratory disorder (HAB / HABA), arthropathy (HAAP), uveitis (HAU), and autoimmune diseases such as SLE (systemic lupus erythematosus) ), Collagen diseases such as rheumatoid arthritis (RA), ulcerative colitis, Sjogren's syndrome, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura (Idiopathic Thrombocytopenic Pu)
rapura: ITP), autoimmune hemolytic anemia, myasthenia gravis,
Examples include Hashimoto's disease and insulin-dependent (type I) diabetes. The apoptosis-modulating agent of the present invention is also applied to various diseases associated with thrombocytopenia, such as myelodysplastic syndrome, periodic thrombocytopenia, aplastic anemia, idiopathic thrombocytopenia, and generalized intravascular coagulation. it can. Further, the modifier of the present invention
Various types of hepatitis such as C, A, B, and F, Alzheimer's disease, Alzheimer's senile dementia, myocarditis, ARDS (adult respiratory distress syndrome) infection, cirrhosis, benign prostatic disease, uterine fibroids, bronchial asthma , Arteriosclerosis, various congenital malformations,
Nephritis, senile cataract, chronic fatigue syndrome (Chronic Fatigi
u Syndrome, muscular dystrophy (Myotonic dystroph)
It is applicable to various diseases such as y).

本発明アポトーシス調整剤は、例えば制癌剤として用
いる場合、その投与により、癌細胞を分化させた後又は
分化させることなく直接に、アポトーシスの誘導を促進
又は抑制でき、かくして制癌作用を発揮する。またこの
場合、本発明調整剤は、その製剤形態及び投与経路にか
かわらず、例えばこれを癌の化学療法剤として知られて
いる他の各種の制癌剤や放射線療法と併用することがで
きる。かくして、本発明の有効成分化合物は優れた制癌
効果を奏し得るため、併用する他の制癌剤の効果を一層
助長し、相乗効果を発揮させることができる。従って、
併用する制癌剤を通常用いられる量よりかなり少量とす
る場合でも、充分な癌治療効果が得られ、これにより併
用制癌剤の副作用の軽減化をはかることができる。かか
る化学療法剤としては、例えば５−フルオロウラシル
（５−FU、協和発酵工業株式会社製）、マイトマイシン
（Mitomycin−Ｃ、同上社製）、フトラフール（FT−20
7、大鵬薬品工業株式会社製）、エンドキサン（Endoxa
n、塩野義製薬株式会社製）、トヨマイシン（Toyomici
n、武田薬品工業株式会社製）等を例示できる。When the apoptosis-modulating agent of the present invention is used, for example, as an anti-cancer agent, administration thereof can promote or suppress induction of apoptosis after or directly without differentiation of cancer cells, and thus exert an anti-cancer effect. In addition, in this case, the agent of the present invention can be used, for example, in combination with various other anticancer agents and radiation therapy known as chemotherapeutic agents for cancer, regardless of the formulation form and administration route. Thus, since the active ingredient compound of the present invention can exhibit an excellent anticancer effect, it can further promote the effects of other anticancer agents used in combination and exert a synergistic effect. Therefore,
Even when the amount of the combined anticancer agent is considerably smaller than the amount usually used, a sufficient cancer therapeutic effect can be obtained, and thereby the side effects of the combined anticancer agent can be reduced. Examples of such chemotherapeutic agents include 5-fluorouracil (5-FU, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), mitomycin (Mitomycin-C, manufactured by Dojo Co., Ltd.), and furtafurol (FT-20).
7. Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.), Endoxa
n, Shionogi & Co., Ltd.), Toyomycin (Toyomici)
n, manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.).

本発明アポトーシス調整剤は、これを血小板減少症治
療に用いる場合、例えばRAやRARS等のMDS患者では、そ
の投与により細胞の分化誘導促進作用と共にアポトーシ
ス抑制作用が発揮され、かくして造血細胞の増殖を刺激
し、正常な分化、成熟を起こさせ得る。また、RAEBやRA
EB−ｔ等のMDS患者では、本発明調整剤の投与により芽
球を分化が誘導されると共に、芽球の増殖が抑制され、
かくして成熟細胞の増殖を起こさせ得る。また本発明調
整剤は、巨核球前駆細胞や巨核球細胞に作用して、その
分化、成熟を促進させることにより、血小板産生の促進
作用も期待できる。When the apoptosis-modulating agent of the present invention is used for treating thrombocytopenia, for example, in MDS patients such as RA and RARS, the administration of the agent exerts an apoptosis-inhibiting effect together with a cell differentiation-inducing accelerating effect, thus increasing the proliferation of hematopoietic cells. Can stimulate and cause normal differentiation, maturation. RAEB and RA
In MDS patients such as EB-t, the administration of the modulator of the present invention induces blast differentiation and suppresses blast proliferation,
Thus, growth of mature cells can occur. In addition, the agent of the present invention acts on megakaryocyte progenitor cells and megakaryocyte cells to promote their differentiation and maturation, so that an effect of promoting platelet production can be expected.

本発明アポトーシス調整剤を上記血小板減少症治療に
用いる場合は、これは従来公知の血小板増加剤等の他の
医薬品と併用でき、これにより之等併用薬剤の効果を助
長し、従って併用剤量をかなり少量としても充分な治療
効果を奏し得、副作用の軽減化をはかり得る場合があ
る。When the apoptosis-modulating agent of the present invention is used for the treatment of thrombocytopenia, it can be used in combination with other drugs such as conventionally known thrombocytopenia, thereby promoting the effect of the concomitant drug, and thus reducing the amount of the concomitant drug. Even in very small amounts, a sufficient therapeutic effect can be achieved, and side effects can be reduced in some cases.

本発明調整剤は、アルツハイマー病の治療及び予防剤
としても有用である。この場合、例えば古典的なアルツ
ハイマー病やアルツハイマー型老年痴呆症患者におい
て、本発明調整剤はアポトーシスの抑制によりNGF様作
用を示し、かくして上記治療及び予防効果を発揮する。
またこの場合、本発明製剤は従来公知の脳循環改善剤や
脳代謝改善剤等のアルツハイマー病治療剤と併用するこ
とができ、之等の効果を助長し、之等による副作用を軽
減できる場合がある。The modulator of the present invention is also useful as an agent for treating and preventing Alzheimer's disease. In this case, for example, in a patient with classical Alzheimer's disease or Alzheimer's senile dementia, the modulator of the present invention exhibits an NGF-like action by suppressing apoptosis, and thus exerts the above therapeutic and preventive effects.
Further, in this case, the preparation of the present invention can be used in combination with a conventionally known therapeutic agent for Alzheimer's disease such as a cerebral circulation improving agent or a cerebral metabolism improving agent, which may promote the effects thereof and reduce the side effects caused by the agents. is there.

更に本発明調整剤は、アポトーシスを制御することに
より、薬剤性及びウィルス性肝炎患者における肝炎の治
療乃至肝細胞の線維化防止を行ない得、従って肝硬変予
防剤として利用することができる。Further, by controlling apoptosis, the modulator of the present invention can treat hepatitis or prevent fibrosis of hepatocytes in patients with drug-induced and viral hepatitis, and thus can be used as an agent for preventing cirrhosis.

図面の簡単な説明 図１は、後記薬理試験例１に記載のアポトーシス調整
効果試験におけるDNAの断片化の結果を示す写真であ
る。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a photograph showing the results of DNA fragmentation in the apoptosis regulating effect test described in Pharmacological Test Example 1 described below.

図２は、後記薬理試験例５に記載のM12メラノーマ細
胞の増殖抑制効果試験の結果を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the results of a growth inhibitory effect test on M12 melanoma cells described in Pharmacological Test Example 5 described below.

図３は後記薬理試験例８に記載の自己免疫疾患に対す
る延命効果試験の結果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the results of a life extension test for an autoimmune disease described in Pharmacological Test Example 8 below.

図４〜図７は後記薬理試験例９に記載の血小板減少改
善効果試験の結果を示す写真である。4 to 7 are photographs showing the results of the thrombocytopenia improving effect test described in Pharmacological Test Example 9 below.

図８は後記薬理試験例10に記載の自己免疫疾患治療効
果試験の結果を示す写真である。FIG. 8 is a photograph showing the results of an autoimmune disease therapeutic effect test described in Pharmacological Test Example 10 below.

図９及び図10は後記薬理試験例11に記載のPC12細胞に
対する効果試験の結果を示す写真である。9 and 10 are photographs showing the results of an effect test on PC12 cells described in Pharmacological Test Example 11 described later.

図11は後記薬理試験例12に記載の肝不全に対する効果
試験の結果を示すグラフである。FIG. 11 is a graph showing the results of an effect test on liver failure described in Pharmacological Test Example 12 below.

図12は後記薬理試験例13に記載のB16メラノーマ細胞
の実験肺転移モデルに対する効果試験の結果を示すグラ
フである。FIG. 12 is a graph showing the results of an effect test on an experimental lung metastasis model of B16 melanoma cells described in Pharmacological Test Example 13 below.

発明を実施するための最良の形態 以下に、本発明アポトーシス調整剤の製剤例及びアポ
トーシス調整剤有効成分化合物につき行なった薬理試験
結果を挙げる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, preparation examples of the apoptosis regulator of the present invention and the results of pharmacological tests performed on the active ingredient compound of the apoptosis regulator will be described.

製剤例１ ６−〔４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペ
ラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチリル 150g アビセル（商標名，旭化成（株）製） 40g コーンスターチ 30g ステアリン酸マグネシウム 2g ヒドロキシプロピルメチルセルロース 10g ポリエチレングリコール−6000 3g ヒマシ油 40g メタノール 40g 上記有効成分化合物、アビセル、コーンスターチ及び
ステアリン酸マグネシウムを混合研磨後、糖衣R10mmの
キネで打錠する。得られた錠剤をヒドロキシプロピルメ
チルセルロース、ポリエチレングリコール−6000、ヒマ
シ油及びメタノールからなるフィルムコーティング剤で
被覆を行ない、フィルムコーティング錠を製造する。Formulation Example 1 6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 150 g Avicel (trade name, manufactured by Asahi Kasei Corporation) 40 g corn starch 30 g magnesium stearate 2 g hydroxypropyl Methylcellulose 10 g Polyethylene glycol-6000 3 g Castor oil 40 g Methanol 40 g After mixing and polishing the above active ingredient compound, Avicel, corn starch and magnesium stearate, the mixture is tableted with sugar coated R10 mm kine. The obtained tablets are coated with a film coating agent consisting of hydroxypropylmethylcellulose, polyethylene glycol-6000, castor oil and methanol to produce film-coated tablets.

製剤例２ ６−〔４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペ
ラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチリル 150.0g クエン酸 1.0g ラクトース 33.5g リン酸二カルシウム 70.0g プルロニックＦ−68 30.0g ラウリル硫酸ナトリウム 15.0g ポリビニルピロリドン 15.0g ポリエチレングリコール（カルボワックス1500） 4.5g ポリエチレングリコール（カルボワックス6000） 45.0g コーンスターチ 3.0g 乾燥ラウリル硫酸ナトリウム 3.0g 乾燥ステアリン酸マグネシウム 3.0g エタノール 適量 上記有効成分化合物、クエン酸、ラクトース、リン酸
二カルシウム、プルロニックＦ−68及びラウリル硫酸ナ
トリウムを混合する。Formulation Example 2 6- [4- (3,4-Dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 150.0 g Citric acid 1.0 g Lactose 33.5 g Dicalcium phosphate 70.0 g Pluronic F-68 30.0 g Sodium lauryl sulfate 15.0 g Polyvinyl pyrrolidone 15.0 g Polyethylene glycol (Carbowax 1500) 4.5 g Polyethylene glycol (Carbowax 6000) 45.0 g Corn starch 3.0 g Dry sodium lauryl sulfate 3.0 g Dry magnesium stearate 3.0 g Ethanol Mix acid, lactose, dicalcium phosphate, Pluronic F-68 and sodium lauryl sulfate.

上記混合物をNo.60スクリーンにて篩別し、ポリビニ
ルピロリドン、カルボワックス1500及びカルボワックス
6000を含むアルコール性溶液で湿式粒状化する。必要に
応じてアルコールを添加し、粉末をペースト状塊にす
る。コーンスターチを添加し、均一な粒子が形成される
まで混合を続ける。No.10スクリーンを通過させ、トレ
イに入れ、100℃のオーブンで12〜14時間乾燥する。乾
燥粒子をNo.16スクリーンで篩別し、乾燥ラウリル硫酸
ナトリウム及び乾燥ステアリン酸マグネシウムを加え、
混合し、打錠機で所望の形状に圧縮成形する。The above mixture was sieved with a No. 60 screen, and polyvinylpyrrolidone, carbowax 1500 and carbowax
Wet granulation with an alcoholic solution containing 6000. If necessary, alcohol is added to make the powder into a pasty mass. Add corn starch and continue mixing until uniform particles are formed. Pass through a No. 10 screen, place in a tray and dry in an oven at 100 ° C. for 12-14 hours. The dried particles are sieved through a No. 16 screen, and dried sodium lauryl sulfate and dried magnesium stearate are added.
The mixture is mixed and compression molded into a desired shape using a tableting machine.

上記芯部をワニスで処理し、タルクを散布して湿気の
吸収を防止する。芯部の周囲に下塗り層を被覆する。内
服用のために充分な回数のワニス被覆を行なう。錠剤を
完全に丸く且つ滑らかにするために、更に下塗り層及び
平滑被覆を適用する。所望の色合が得られるまで着色被
覆を行なう。乾燥後、被覆錠剤を磨いて均一な光沢の錠
剤を調製する。The core is treated with varnish and talc is sprayed to prevent moisture absorption. An undercoat layer is coated around the core. Apply varnish a sufficient number of times for internal use. An additional subbing layer and smooth coating are applied to make the tablet completely round and smooth. Color coating is carried out until the desired hue is obtained. After drying, the coated tablets are polished to prepare tablets of uniform gloss.

以下に示す供試化合物を用い、下記の薬理試験を行な
った。Using the test compounds shown below, the following pharmacological tests were performed.

〔供試化合物〕(Test compound)

1. ６−〔４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−
ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチリル 2. ６−〔４−（3,4,5−トリメトキシベンゾイル）−
１−ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチリル 3. ７−〔４−（3,4,5−トリメトキシベンゾイル）−
１−ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチリル 4. ７−〔４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−
ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチリル 5. ６−〔４−（４−エキシベンゾイル）−１−ピペラ
ジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチリル 6. ５−〔４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−
ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチリル 7. ６−〔４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−
ピペラジニル〕カルボスチリル 8. ８−〔４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−
ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチリル 薬理試験例１ アポトーシス調整効果試験 CMK細胞を10％牛胎児血清含有RPMI1640培地中にて１
×10⁵個/mlの濃度に調整した後、これに化合物１を30μ
g/mlの濃度で加えて、37℃で２日間及び４日間培養フラ
スコ中にて培養した。尚、コントロールとして溶媒のみ
を加えたものを同様にして培養した。1. 6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-
Piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 2.6- [4- (3,4,5-trimethoxybenzoyl)-
1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 3.7- [4- (3,4,5-trimethoxybenzoyl)-
1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 4.7- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-
Piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 5.6- [4- (4-Exibenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 6.5- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) ) -1-
Piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 7.6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-
Piperazinyl] carbostyril 8.8- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-
Piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril Pharmacological test example 1 Apoptosis regulating effect test CMK cells were cultured in RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum.
After adjusting the concentration to × 10 ⁵ cells / ml, compound 1 was added to the mixture at 30 μl.
g / ml at 37 ° C for 2 and 4 days in culture flasks. In addition, what added only the solvent as a control was cultured similarly.

培養フラスコから細胞を取出し、４℃で10分間200×
Ｇで遠心分離した。ペレットを低張緩衝液（10mMトリス
塩酸、1mM EDTA及び0.2％トリトンX100、pH7.5）に溶解
後、４℃で10分間、13000×Ｇにて遠心分離した。上清
を採取後、50％イソプロピルアルコール−0.5M NaCl中
にて、−20℃で一晩放置し、得られた沈殿物を４℃で10
分間、13000×Ｇで遠心分離後、上清をすて、乾燥し
た。次に10mMトリス塩酸−1mM EDTA（pH7.4）溶液に再
懸濁させ、最終濃度が0.1mg/mlの濃度になるように上清
にRNaseを添加し、37℃で１時間インキュベートした。Remove cells from culture flask and 200x for 10 minutes at 4 ° C
Centrifuged at G. The pellet was dissolved in a hypotonic buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA and 0.2% Triton X100, pH 7.5) and centrifuged at 13,000 × G at 4 ° C. for 10 minutes. After collecting the supernatant, the mixture was allowed to stand at -20 ° C overnight in 50% isopropyl alcohol-0.5M NaCl, and the resulting precipitate was collected at 4 ° C for 10 minutes.
After centrifugation at 13000 × G for 1 minute, the supernatant was discarded and dried. Next, the cells were resuspended in a 10 mM Tris-HCl-1 mM EDTA (pH 7.4) solution, RNase was added to the supernatant to a final concentration of 0.1 mg / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour.

更に、１×10⁶細胞数に相当する量のサンプルに対し
て、15mM EDTA、２％SDS、50％グリセロール及び0.05％
ブロモフェニルブルーを含有するローディング緩衝液
を、サンプルの1/5容量加え、65℃で10分間インキュベ
ートした。Furthermore, for a sample amount corresponding to 1 × 10 ⁶ cells, 15 mM EDTA, 2% SDS, 50% glycerol and 0.05%
Loading buffer containing bromophenyl blue was added to 1/5 volume of the sample and incubated at 65 ° C for 10 minutes.

得られたサンプルにつき、電気泳動を1.5％アガロー
スゲル中で100Vで100分間行なった。またDNAをエチジウ
ムブロマイドで染色した。The obtained sample was subjected to electrophoresis in a 1.5% agarose gel at 100 V for 100 minutes. DNA was stained with ethidium bromide.

得られた結果を図１に示す。 The results obtained are shown in FIG.

図中、両サイドのレーンはそれぞれマーカー（マーカ
ー１＝120、600及び1350bp、マーカー２＝72、420及び9
30bp）であり、左から２番目のレーンが化合物１添加２
日後を、左から３番目のレーンはコントロール２日後
を、左から４番目のレーンは化合物１添加４日後を、ま
た左から５番目のレーンはコントロール４日後をそれぞ
れ示す。In the figure, lanes on both sides are markers (marker 1 = 120, 600 and 1350 bp, marker 2 = 72, 420 and 9), respectively.
30bp), and the second lane from the left is Compound 1 addition 2
The third lane from the left shows 2 days after the control, the fourth lane from the left shows 4 days after the addition of Compound 1, and the fifth lane from the left shows 4 days after the control.

該図より、化合物１の添加によれば、DNA断片の表出
が電気泳動上に時間依存的に表れることが明らかであ
り、このことから、化合物１はCMK細胞に対して、アポ
トーシスを促進していることが判る。From the figure, it is apparent that the addition of Compound 1 causes the expression of DNA fragments to appear in an electrophoretic manner in a time-dependent manner, indicating that Compound 1 promotes apoptosis of CMK cells. You can see that

薬理試験例２ 癌細胞増殖抑制効果試験 （１）ヒト前骨髄性白血病細胞（HL−60）の調整 ヒト前骨髄性白血病細胞（HL−60）は、ガロ（Robert
Gallo）らにより樹立されたヒト白血病細胞株で、その
細胞の性質は文献〔Gallo,R.C.,et al.,Blood,54,713
（1979）〕に記載されており、アメリカンタイプカルチ
ャーコレクション（ATCC）に「ATCC No.CCL−240」なる
寄託番号で受託されている。Pharmacological test example 2 Cancer cell growth inhibitory effect test (1) Preparation of human promyelocytic leukemia cells (HL-60) Human promyelocytic leukemia cells (HL-60)
Gallo) et al., A human leukemia cell line established by the literature [Gallo, RC, et al., Blood, 54 , 713].
(1979)] and has been deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) under the deposit number "ATCC No. CCL-240".

上記HL−60は、FCS（牛胎児血清、ギブコ社）10％添
加RPMI−1640培地（ギブコ社）で１×10⁵個/mlに調整し
た。The HL-60 was adjusted to 1 × 10 ⁵ cells / ml in RPMI-1640 medium (Gibco) supplemented with 10% FCS (fetal calf serum, Gibco).

（２）ヒト胃癌細胞株（KATO−III）の調整 上記（１）と同様な培地で、１×10⁵個/mlに調整し
た。(2) Preparation of human gastric cancer cell line (KATO-III) The medium was adjusted to 1 × 10 ⁵ cells / ml in the same medium as in the above (1).

（３）供試化合物の調整 供試化合物１は、酢酸で溶解後、上記（１）と同様な
培地で希釈し、2N−NaOHで中和した後、100μg/ml、10
μg/ml及び1.0μg/mlの濃度に調整した。(3) Preparation of test compound Test compound 1 was dissolved in acetic acid, diluted with the same medium as in the above (1), neutralized with 2N-NaOH, and then dissolved in 100 μg / ml, 10 μg / ml.
The concentrations were adjusted to μg / ml and 1.0 μg / ml.

（４）ギムザ染色液の調整 ギムザ試薬（メルク社）をリン酸緩衝液（pH6.4）
で、50〜100倍に希釈し、ギムザ染色液とした。(4) Preparation of Giemsa staining solution Giemsa reagent (Merck) in phosphate buffer (pH 6.4)
Then, it was diluted 50 to 100 times to obtain a Giemsa staining solution.

（５）エステラーゼ染色液の調整 ナフトールAS・Ｄクロロアセテート法によるエステラ
ーゼ染色用試薬（武藤化学社）を用いた。(5) Preparation of esterase staining solution A reagent for esterase staining by naphthol AS · D chloroacetate method (Muto Chemical Co., Ltd.) was used.

（６）抗CD33モノクローナル抗体My9の調整 未熟な顆粒球に特異的に反応するモノクローナル抗体
My9（コールター社）は、１バイアル当り0.5mlの蒸留水
を添加し、溶解後使用した。(6) Preparation of anti-CD33 monoclonal antibody My9 Monoclonal antibody that specifically reacts with immature granulocytes
My9 (Coulter) was used after dissolving 0.5 ml of distilled water per vial and dissolving.

（７）結果 ａ）上記（１）で調整したHL−60に、上記（３）で調整
した供試化合物を最終濃度10μg/ml及び1.0μg/mlにな
るようにそれぞれ添加し、12穴培養プレート（コースタ
ー社）を用い、37℃,5％炭酸ガス培養器中で３〜４日培
養した。コントロールとしては、供試化合物無添加の培
地を用いた。培養後、各穴の細胞浮遊液を取り、0.2％
トリパンブルー含有リン酸緩衝液と混合し、顕微鏡下に
未染色の生細胞数を計測し、その結果から生細胞数１×
10⁵個/mlに再調整し、同様な方法で培養を続けた。(7) Results a) To the HL-60 prepared in the above (1), the test compound prepared in the above (3) was added to a final concentration of 10 μg / ml and 1.0 μg / ml, respectively, and cultured in 12 wells. Using a plate (Coaster), the cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 3 to 4 days. As a control, a medium containing no test compound was used. After culturing, remove the cell suspension from each well and add 0.2%
The cells were mixed with a trypan blue-containing phosphate buffer, and the number of unstained viable cells was counted under a microscope.
Readjusted to 10 ⁵ cells / ml, and the incubation was continued in the same manner.

27日目及び33日目のHL−60に対する細胞増殖抑制効果
を表１に示した。Table 1 shows the cell growth inhibitory effects on HL-60 on days 27 and 33.

また上記（２）で調整したKATO−IIIについても同様
に培養し、24日目及び33日目のKATO−IIIに対する細胞
増殖抑制効果を表２に示した。The KATO-III prepared in the above (2) was cultured in the same manner, and the cell growth inhibitory effects on KATO-III on the 24th and 33rd days are shown in Table 2.

表１及び表２より、腫瘍細胞は、供試化合物の濃度に
依存して、増殖が抑制されることが明らかである。 From Tables 1 and 2, it is clear that the growth of tumor cells is suppressed depending on the concentration of the test compound.

ｂ）HL−60の分化 上記（１）で調整したHL−60を、ａ）で用いたのと同
様に培養し、27日目の細胞をスライドグラス上に添加し
ギムザ染色を行なった後、顕微鏡下で形態学的観察を行
なった所、供試化合物を添加した場合には、供試化合物
無添加の場合と比較して、形態学的変化として顆粒を持
つ細胞に分化していることが認められた。またナフトー
ルAS・Ｄクロロアセテート法によるエステラーゼ染色の
結果からも、HL−60の70〜85％が顆粒球に分化している
ことが認められた。b) Differentiation of HL-60 The HL-60 prepared in the above (1) was cultured in the same manner as in a), the cells on day 27 were added to a slide glass, and Giemsa staining was performed. Morphological observations under a microscope showed that when the test compound was added, it differentiated into cells with granules as morphological changes compared to the case without the test compound. Admitted. The results of esterase staining by the naphthol AS-D chloroacetate method also confirmed that 70 to 85% of HL-60 had differentiated into granulocytes.

ｃ）抗CD33モノクローナル抗体My9との反応性 上記（１）で調整したHL−60を、ａ）で用いたのと同
様に培養し、27日目の細胞を１×10⁶個/mlに調整し、そ
の100μｌと蛍光標識（FITC）したMy9の10μｌとを反応
させた後フローサイトメトリー法で測定し、その陽性率
を表３に示した。c) Reactivity with anti-CD33 monoclonal antibody My9 The HL-60 prepared in (1) above was cultured in the same manner as in a), and the cells on the 27th day were adjusted to 1 × 10 ⁶ cells / ml. Then, 100 μl of the mixture was reacted with 10 μl of fluorescence-labeled (FITC) My9, and measured by flow cytometry. The positive rate is shown in Table 3.

表３より、供試化合物添加の場合、HL−60の未分化な
細胞が減少し、分化した細胞の比率が多くなったことを
認めた。 Table 3 shows that when the test compound was added, the number of HL-60 undifferentiated cells decreased and the ratio of differentiated cells increased.

以上の結果より、本発明の有効成分化合物には、腫瘍
細胞への増殖抑制効果及び分化誘導能が認められた。From the above results, the active ingredient compound of the present invention was confirmed to have a growth inhibitory effect on tumor cells and an ability to induce differentiation.

薬理試験例３ 分化誘導性試験 （８）モノクローナル抗体FH−６の調整 シアリルLe^Xを認識するモノクローナル抗体FH−６に
蛍光標識（FITC）し、本発明有効成分化合物とFH−６と
の反応性を、以下の通り、フローサイトメトリー法で検
討した。Fluorescence labeled (FITC) to a monoclonal antibody recognizing FH-6 adjustments sialyl Le ^X Pharmacological Test Example 3 Differentiation inducing test (8) a monoclonal antibody FH-6, the present invention the active ingredient compound and reactivity with FH-6 Was examined by a flow cytometry method as follows.

（９）モノクローナル抗体FH−６との反応性 上記（１）で調整したHL−60に、上記（３）で調整し
た供試化合物を最終濃度1.0μg/ml及び10μg/mlになる
ようにそれぞれ添加し、37℃、５％炭酸ガス培養器中で
２時間培養した。その後細胞数を１×10⁶個/mlに調整
し、その100μｌと蛍光標識したFH−６の10μｌとを反
応させ、フローサイトメトリー法で測定し、その陽性率
を表４に示した。(9) Reactivity with monoclonal antibody FH-6 The test compound prepared in the above (3) was added to the HL-60 prepared in the above (1) at final concentrations of 1.0 μg / ml and 10 μg / ml, respectively. The mixture was added and cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator for 2 hours. Thereafter, the number of cells was adjusted to 1 × 10 ⁶ cells / ml, and 100 μl of the mixture was reacted with 10 μl of fluorescently labeled FH-6, and measured by flow cytometry. The positive rate is shown in Table 4.

以上の結果より、本発明有効成分化合物の添加で、HL
−60の細胞表面からシアル酸が減少していることが認め
られた。このことは、HL−60が分化し、シアリダーゼ活
性が高まったことを示している。 From the above results, the addition of the active ingredient compound of the present invention, HL
It was confirmed that sialic acid was reduced from the cell surface of −60. This indicates that HL-60 was differentiated and sialidase activity was increased.

薬理試験例４ ヒト前骨髄性白血病細胞（HL−60）に対する効果 HL−60を10％FCS添加RPMI−1640培地にて37℃、５％C
O₂下で培養し、細胞濃度を５×10⁴個/mlになるように調
製した。Pharmacological test example 4 Effect on human promyelocytic leukemia cells (HL-60) HL-60 in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS at 37 ° C, 5% C
The cells were cultured under O ₂ to prepare a cell concentration of 5 × 10 ⁴ cells / ml.

次に、６穴のマイクロプレート（コースター社製）の
各穴に各供試化合物を30μg/ml含む上記培地をそれぞれ
添加した後、37℃、５％CO₂下で３日間培養した。尚コ
ントロール群として、上記培地のみを添加して同様に培
養する群を設けた。培養後、各培養細胞浮遊液をエッペ
ンドルフチューブに取り、0.2％トリパンブルー含有リ
ン酸緩衝液で染色した後、生細胞数を血球計算盤にて計
測した。Next, the above-mentioned medium containing 30 μg / ml of each test compound was added to each well of a 6-well microplate (manufactured by Coaster), and then cultured at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 3 days. As a control group, there was provided a group in which only the above-mentioned medium was added and culture was performed in the same manner. After culturing, each cultured cell suspension was placed in an Eppendorf tube, stained with 0.2% trypan blue-containing phosphate buffer, and the number of viable cells was counted using a hemocytometer.

上記細胞を１×10⁷個/mlに調製し、その100μｌにフ
ルオレセインイソチアネート（FITC）標識抗ヒトCD11b
抗体（Mol、コールター社製）５μｌを添加し、氷上で3
0分間暗所にて反応させた。反応後、0.1％BSA（牛血清
アルブミン、シグマ社製）含有PBS（リン酸緩衝液、日
水製薬社製）で２回洗浄し、最終的に500μｌに懸濁さ
せた後、フローサイトメトリー法により、プロファイル
II（コールター社製）にて蛍光強度を測定した。The above cells were prepared at 1 × 10 ⁷ cells / ml, and 100 μl of the cells were added to fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled anti-human CD11b.
Add 5 μl of antibody (Mol, manufactured by Coulter), and place on ice for 3 hours.
The reaction was performed in the dark for 0 minutes. After the reaction, the plate was washed twice with PBS (phosphate buffer, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 0.1% BSA (bovine serum albumin, manufactured by Sigma) and finally suspended in 500 μl, followed by flow cytometry. By profile
The fluorescence intensity was measured by II (manufactured by Coulter).

その結果を表５及び表６に示す。 The results are shown in Tables 5 and 6.

之等各表より各供試化合物を用いた群ではいずれも細
胞増殖抑制効果が認められ、CD11b発現の増加により、
顆粒球、単球・マクロファージ系への分化誘導を促進し
ていることが認められた。 In each of the groups using each test compound from each table, a cell growth inhibitory effect was observed, and an increase in CD11b expression resulted in
It was recognized that the induction of differentiation into granulocytes, monocytes and macrophages was promoted.

薬理試験例５ M12メラノーマ細胞の増殖抑制効果試験 この試験は１群10匹のBalb/cヌードマウスを用いて実
施した。Pharmacological Test Example 5 M12 melanoma cell growth inhibitory effect test This test was performed using 10 Balb / c nude mice per group.

試験開始日（０日目）にM12メラノーマ細胞の２×10⁶
個を、試験群マウスに移植した。腫瘍容量が100mm³に達
した時、試験群マウスに供試化合物１の10mg/kg/日を経
口投与した。上記投与は25日目から55日目まで30回行な
った。腫瘍細胞移植後、腫瘍の径をキャピラリーを用い
て毎日測定した。腫瘍容量は下式により計算した。On the test start day (day 0), 2 × 10 ⁶ M12 melanoma cells
Individuals were transplanted into test group mice. When the tumor volume reached 100 mm ³ , mice in the test group were orally administered 10 mg / kg / day of test compound 1. The above administration was performed 30 times from the 25th day to the 55th day. After transplantation of the tumor cells, the diameter of the tumor was measured daily using a capillary. Tumor volume was calculated by the following formula.

腫瘍容量（mm³）＝（長径）×（短径）^２×1/2 結果を図２に示す。Tumor volume (mm ³ ) = (major axis) × (minor axis) ² × 1/2 The results are shown in FIG.

尚、図２には、対照群（コントロール、供試化合物無
投与）マウスの同結果を併記する。また図中＊はスチュ
ーデンツＴテストによる有意差ｐ＜0.05を示す。図２よ
り、供試化合物の投与により、M12メラノーマ細胞の増
殖を有意に抑制できることが判る。FIG. 2 also shows the same results of the control group (control, no test compound administered) mice. In the figure, * indicates a significant difference p <0.05 according to the Student's T test. FIG. 2 shows that the administration of the test compound can significantly suppress the growth of M12 melanoma cells.

薬理試験例６ ATL感染細胞の増殖抑制効果試験 供試化合物として化合物１を用い、以下の薬理試験を
行なった。Pharmacological Test Example 6 ATL-infected cell growth inhibitory effect test The following pharmacological test was performed using Compound 1 as a test compound.

（ａ）ヒト末梢血急性リンパ性白血病細胞（Molt−４）
の調製 ヒト末梢血急性リンパ性白血病細胞（Molt−４）〔J.
Minowada,et al.,J.Natl.Cancer Inst.,49,891−895（1
972）:ATCC CRL1582〕を、10％FCS（牛胎児血清、ギブ
コ社製）添加RPMI−1640培地（ギブコ社製）で１×10⁵
個/mlに調製し、ATLウイルス非感染細胞とした。(A) Human peripheral blood acute lymphocytic leukemia cells (Molt-4)
Preparation of human peripheral blood acute lymphocytic leukemia cells (Molt-4) [J.
Minowada, et al., J. Natl. Cancer Inst., 49 , 891-895 (1
972): ATCC CRL1582] in RPMI-1640 medium (Gibco) supplemented with 10% FCS (fetal calf serum, Gibco) at 1 × 10 ⁵
ATL virus-uninfected cells.

（ｂ）ヒト成人Ｔ細胞白血病細胞（5S）の調製 ヒト成人Ｔ細胞白血病細胞（5S）を、10％FCS（ギブ
コ社製）添加RPMI−1640培地（ギブコ社製）で１×10⁵
個/mlに調製し、ATLウイルス感染細胞とした。(B) Preparation of human adult T-cell leukemia cells (5S) Human adult T-cell leukemia cells (5S) were added to 10% FCS (manufactured by Gibco) in RPMI-1640 medium (manufactured by Gibco) at 1 × 10 ^5.
Cells / ml and used as ATL virus-infected cells.

（ｃ）供試化合物の調製 化合物１を塩酸に溶解後、上記と同培地で希釈し、2N
NaOHで中和後、１μg/ml、10μg/ml及び30μg/mlの各
濃度に調製して利用した。(C) Preparation of test compound After dissolving compound 1 in hydrochloric acid, dilute with the same medium as above, and add 2N
After neutralization with NaOH, the solution was adjusted to concentrations of 1 μg / ml, 10 μg / ml and 30 μg / ml and used.

（ｄ）薬理試験 24穴培養プレート（ヌンク社製）の各ウェルに、上記
（ａ）及び（ｂ）で調製した各細胞を入れ、これに上記
（ｃ）で調製した供試化合物を添加（最終濃度１μg/m
l、10μg/ml及び30μg/ml）し、37℃、５％炭酸ガス培
養器中で４日間培養した。コントロール（対照）として
は、供試化合物無添加の培地を用いた。上記培養終了
後、各ウェルの細胞浮遊液をとり、生細胞数を計測し
た。(D) Pharmacological test Each cell prepared in the above (a) and (b) is put into each well of a 24-well culture plate (manufactured by Nunc), and the test compound prepared in the above (c) is added thereto ( Final concentration 1μg / m
1, 10 μg / ml and 30 μg / ml) and cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator for 4 days. As a control, a medium containing no test compound was used. After the completion of the culture, the cell suspension in each well was taken, and the number of viable cells was counted.

その結果を表７に示す。 Table 7 shows the results.

表７より、本発明有効成分化合物（化合物１）は、AT
LVウイルス非感染細胞に対しては影響を与えることな
く、ATL感染細胞に対して１μg/mlの濃度より、強力に
その増殖を抑制する効果を奏することが明らかである。 Table 7 shows that the compound of the present invention (Compound 1)
It is clear that the proliferation of ATL-infected cells is strongly inhibited at a concentration of 1 μg / ml without affecting the cells not infected with the LV virus.

薬理試験例７ 抗レトロウイルス活性の試験 （ａ）ヒトトランスフォーム正常Ｔ細胞（MT−４）の調
製 ヒトトランスフォーム正常Ｔ細胞（MT−４）〔Nagum
o,T.and Hoshino,H.,Jpn.J.Cancer Res.,79,9−11（18
8）〕を、10％FCS（ギブコ社製）添加RPMI−1640培地
（ギブコ社製）で２×10⁵個/mlに調製した。Pharmacological Test Example 7 Test of antiretroviral activity (a) Preparation of normal human transformed T cells (MT-4) Normal human transformed T cells (MT-4) [Nagum
o, T. and Hoshino, H., Jpn. J. Cancer Res., 79 , 9-11 (18
8)] was adjusted to 2 × 10 ⁵ cells / ml in RPMI-1640 medium (manufactured by Gibco) supplemented with 10% FCS (manufactured by Gibco).

（ｂ）供試化合物の調製 化合物１を塩酸に溶解後、上記と同培地で希釈し、2N
NaOHで中和後、１μg/ml、10μg/ml、30μg/ml及び100
μg/mlの各濃度に調製して利用した。(B) Preparation of test compound After dissolving compound 1 in hydrochloric acid, dilute with the same medium as above, and add 2N
After neutralization with NaOH, 1 μg / ml, 10 μg / ml, 30 μg / ml and 100 μg / ml
Each concentration of μg / ml was prepared and used.

（ｃ）薬理試験 12穴培養プレート（コースター社製）の各ウェルに、
上記（ａ）で調製した各細胞及び上記（ｂ）で調製した
供試化合物（最終濃度１μg/ml、10μg/ml、30μg/ml及
び100μg/ml）を入れ、更に、HIV浮遊液50μl/ウェルを
添加して各ウェル細胞を感染させ、37℃、５％炭酸ガス
培養器中で３日間培養した。コントロール（対照）とし
ては、供試化合物無添加の培地を用いた。上記培養終了
後、各ウェルの細胞浮遊液をとり、生細胞数を計測し
た。(C) Pharmacological test In each well of a 12-well culture plate (manufactured by Coaster),
Each cell prepared in the above (a) and the test compound prepared in the above (b) (final concentration: 1 μg / ml, 10 μg / ml, 30 μg / ml and 100 μg / ml) were added, and further, 50 μl / well of the HIV suspension Was added to each well to infect cells, and the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator for 3 days. As a control, a medium containing no test compound was used. After the completion of the culture, the cell suspension in each well was taken, and the number of viable cells was counted.

次いで、上記各ウェルの細胞浮遊液を遠心分離（1500
rpm×５分間）し、培養上清750μｌを得た。Next, the cell suspension in each well was centrifuged (1500
(rpm × 5 minutes) to obtain 750 μl of the culture supernatant.

上記で得られた培養上清750μｌをエッペンドルフチ
ューブ（1.8ml）に入れ、更に4M NaClとPEG−6000（シ
グマ社製）を加え、０℃で２時間反応させてウィルスを
沈降させ、遠心分離（15000rpm×20分間）により該ウイ
ルス沈降物を得た。この沈降物に溶液Ｉ〔50％グリセリ
ン（和光純薬社製）、25mMトリス・塩酸（pH7.5）、50m
M KCl、0.025％トリトンＸ−100（シグマ社製）及び5mM
DTT（シグマ社製）〕と溶液II〔0.9％トリトンＸ−100
（シグマ社製）及び1.5M KCl〕を加え、０℃で30分間要
して溶解させた。得られたウイルス溶解液10μｌに5mg/
ml BSA（牛血清アルブミン：シグマ社製）、1Mトリス・
塩酸、100mM DTT（シグマ社製）、1M KCl、10mMポリＡ
（シグマ社製）、0.15mM TTP（シグマ社製）、200mM Mg
Cl₂、0.15mMオリゴdT（NEN社製）及び〔³H〕−TTP（NEN
社製）を加え、37℃で１時間反応させた。反応後、直ち
に氷中に入れて反応を停止させ、フィルター（DE−81 F
ilter;ワットマン社製）に全量をスポットして乾燥し
た。乾燥後、0.5M Na₂HPO₄で３回洗浄し、エタノール中
ですすぎ落として乾燥させ、膜上のDNA中に取り込まれ
た〔³H〕−TTPの放射能活性を液体シンチレーションカ
ウンターで計測して、これを逆転写酵素活性（単位:cp
m）として求めた。750 μl of the culture supernatant obtained above is placed in an Eppendorf tube (1.8 ml), 4 M NaCl and PEG-6000 (manufactured by Sigma) are further added, and the mixture is allowed to react at 0 ° C. for 2 hours to sediment the virus. (15000 rpm × 20 minutes) to obtain the virus precipitate. Solution I [50% glycerin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 25 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 50 m
M KCl, 0.025% Triton X-100 (manufactured by Sigma) and 5 mM
DTT (manufactured by Sigma)] and solution II [0.9% Triton X-100
(Manufactured by Sigma) and 1.5 M KCl], and dissolved at 0 ° C. for 30 minutes. 5 mg / 10 μl of the obtained virus lysis solution
ml BSA (bovine serum albumin: Sigma), 1M Tris
Hydrochloric acid, 100 mM DTT (manufactured by Sigma), 1 M KCl, 10 mM poly A
(Manufactured by Sigma), 0.15 mM TTP (manufactured by Sigma), 200 mM Mg
Cl ₂ , 0.15 mM oligo dT (manufactured by NEN) and [ ³ H] -TTP (NEN
Was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Immediately after the reaction, the reaction was stopped by placing on ice and the filter (DE-81 F
ilter; manufactured by Whatman) and dried. After drying, the plate was washed three times with 0.5 M Na ₂ HPO ₄ , rinsed in ethanol, dried, and the radioactivity of [ ³ H] -TTP incorporated into the DNA on the membrane was measured using a liquid scintillation counter. This is used as the reverse transcriptase activity (unit: cp
m).

上記で求められた生細胞数（×10⁴個）及び逆転写酵
素活性（cpm）の結果を表８に示す。Table 8 shows the results of the number of living cells (× 10 ⁴ ) and the reverse transcriptase activity (cpm) determined above.

表８より、本発明有効成分化合物（化合物１）は、30
μg/ml及び100μg/mlの用量で、細胞増殖の抑制ととも
に逆転写酵素活性を強力に抑制することが判った。 Table 8 shows that the active ingredient compound of the present invention (Compound 1) was 30
It was found that the doses of μg / ml and 100 μg / ml strongly suppressed reverse transcriptase activity as well as cell proliferation.

上記薬理試験例６及び薬理試験例７の結果から、本発
明に有効成分として利用する化合物は、強力な抗レトロ
ウイルス活性を有することが明らかである。From the results of the above pharmacological test examples 6 and 7, it is clear that the compound used as an active ingredient in the present invention has strong antiretroviral activity.

薬理試験例８ 自己免疫疾患モデル動物に対する効果 W/BF₁:（NZW×BXSB）F₁マウスは、自然発症自己免疫
疾患マウスであり、ループス腎炎だけでなく、高血圧症
と心筋梗塞を高頻度に合併するモデル動物である〔Han
g,L.M.,et al.,J.Exp.Med.,154,216−221（1981）］。
また、加齢とともに抗血小板抗体が出現し著しい血小板
減少が認められ、ITPのモデル動物でもある〔Oyaizu,
N.,et al.,J.Exp.Med.,167,2017−2077（1988）〕。該
モデルは生後８ケ月以内に90％以上は心筋梗塞または腎
不全で死亡することが報告されている〔池原進，代謝，
増刊号，26,169−176（1989）〕。Pharmacological Test Example 8 autoimmune disease model effects on animals _{W / BF 1: (NZW ×} BXSB) F 1 mice are spontaneous autoimmune disease mouse, not only lupus nephritis, hypertension and myocardial infarction frequently It is a model animal that merges [Han
g, LM, et al., J. Exp. Med., 154 , 216-221 (1981)].
In addition, anti-platelet antibodies appeared with age and marked thrombocytopenia was observed, which is also a model animal for ITP (Oyaizu,
N., et al., J. Exp. Med., 167 , 2017-2077 (1988)]. The model has been reported to kill more than 90% of myocardial infarction or renal failure within 8 months of age [Susumu Ikehara, Metabolism,
Special issue, 26 , 169-176 (1989)].

W/BF₁:（NZW×BXSB）F₁マウスに対する延命効果及び
血球、抗血小板抗体への本発明の化合物１投与による効
果を検討した。The effect of prolonging the life of W / BF ₁ : (NZW × BXSB) F ₁ mice and the effect of administering Compound 1 of the present invention on blood cells and anti-platelet antibodies were examined.

W/BF₁:（NZW×BXSB）F₁マウスは、14週齢（紀和実験
動物社より購入）より使用した。各実験には、１群10匹
のマウスを使用した。 _{W / BF 1: (NZW ×} BXSB) F 1 mice were used from 14 weeks of age (Kiwa purchased from experimental animal, Inc.). For each experiment, 10 mice were used per group.

上記各群のマウスには、通常この種のマウスに与える
餌料（オリエンタル酵母社製）及び水を与えた。The mice in each of the above groups were fed with food (Oriental Yeast Co., Ltd.) and water which are usually given to mice of this type.

化合物１（ロットNo.9D87M）は、0.5％カルボキシメ
チルセルロース（CMC:Carboxy Methyl Cellulose;セロ
ゲン社製）溶液に懸濁して実験に供した。該化合物１を
マウス体重1kg当り、100mg/kg/日及び300mg/kg/日で14
週齢より投与を開始し、20週齢まで６週間、５投２休で
強制経口投与した。また、コントロール群として無投与
群を設けた。Compound 1 (Lot No. 9D87M) was suspended in a 0.5% carboxymethylcellulose (CMC: Carboxy Methyl Cellulose; manufactured by Cellogen) solution and used for the experiment. Compound 1 was administered at a dose of 100 mg / kg / day and 300 mg / kg / day
Administration was started at the age of week, and gavage administration was performed for 5 weeks and 2 rests for 6 weeks until 20 weeks of age. A non-administration group was provided as a control group.

（１）観察項目は、延命作用として14週齢から20週齢ま
での生死数を観察し、統計学的処理は、無投与群を対照
にGeneralised Wilcoxon testにより有意差を検定し
た。その結果を第３図に示す。(1) As observation items, the number of survivors from the age of 14 weeks to the age of 20 weeks was observed as a life-prolonging effect, and the statistical processing was performed by using the non-administered group as a control to test a significant difference by a Generalized Wilcoxon test. FIG. 3 shows the results.

該図中、縦軸は、生死数のパーセント（％）、横軸は
週齢（14週齢から20週齢）を示す。In the figure, the vertical axis indicates the percentage (%) of the number of living and dying, and the horizontal axis indicates the age (14 to 20 weeks).

該図より化合物１の100mg/kg/日投与群では、20週齢
まで死亡例が認められなかった。また、300mg/kg/日投
与群では、18週齢時に２匹の死亡が観察された。無投与
群は、17週齢で２匹、18週齢で１匹、19週齢で３匹の死
亡が確認され、本発明有効成分化合物（化合物１）によ
る自己免疫疾患モデルマウスに対する延命効果が確認さ
れた。According to the figure, in the group administered with Compound 1 at 100 mg / kg / day, no deaths were observed until the age of 20 weeks. In the 300 mg / kg / day administration group, two animals died at the age of 18 weeks. In the non-administration group, 2 animals at 17 weeks of age, 1 animal at 18 weeks of age, and 3 animals at 19 weeks of age were confirmed, and the active ingredient compound of the present invention (Compound 1) showed a prolonged survival effect on autoimmune disease model mice. confirmed.

（２）血球分析は、14、16、18、20週齢に眼底採血によ
り血液サンプルを採血し、自動血球分析装置（Coulter
JR;コールター社製）を用いて血球数（白血球数、赤血
球数、血小板数）の変動を測定した。また、白血球の分
画数（好中球数、リンパ球数）は血液塗末標本を作製
し、ライト・ギムザ染色後、測定した。統計学的処理
は、各採血日の無投与群を対照にスチューデントのｔテ
スト（Student′s t−test）によって検定した。(2) Blood cell analysis was performed by collecting blood samples by fundus blood sampling at 14, 16, 18, and 20 weeks of age, and using an automatic blood cell analyzer (Coulter).
The change in blood cell count (white blood cell count, red blood cell count, platelet count) was measured using JR; In addition, the number of leukocyte fractions (the number of neutrophils and the number of lymphocytes) was determined after preparing a blood smear and staining with Wright Giemsa. Statistical processing was performed by the Student's t-test using the non-administration group on each blood collection day as a control.

その結果を表９に示す。 Table 9 shows the results.

W/BF₁マウスの血液学的特徴は前記池原の報告にある
ように加齢とともに白血球増多と血小板の減少が認めら
れる。白血球数は無投与群、化合物１投与群で加齢と共
に増加傾向が認められ、本発明有効成分化合物の影響は
認められなかった。血小板数については、無投与群で
は、14週齢（1144.5±121.3/mm³）より減少が認めら
れ、20週齢時においては14週齢時の約５分の１（228.0
±90.0/mm³）まで減少した。しかし、本発明有効成分化
合物（化合物１）300mg/kg/日投与群は、投与開始時よ
り血小板数の減少抑制効果が現われ、20週齢では（823.
3±24.5mm³）で無投与群（228.0±90.0/mm³）に対し有
意な抑制効果が認められた。また、赤血球数においても
同様な結果が得られた。 W / BF ₁ mice hematological characteristics decrease of leukocytosis and platelets is observed with aging as in the report of the Ikehara. The leukocyte count tended to increase with age in the non-administration group and the compound 1 administration group, and the effect of the compound of the present invention was not observed. In the non-administration group, the platelet count decreased from 14 weeks of age (1144.5 ± 121.3 / mm ³ ), and at the age of 20 weeks, it was about one fifth (228.0
± 90.0 / mm ³ ). However, in the group administered with 300 mg / kg / day of the active ingredient compound of the present invention (compound 1), the effect of suppressing the decrease in platelet count appeared from the start of administration, and at the age of 20 weeks (823.
3 ± 24.5 mm ³ ), a significant inhibitory effect was observed in the non-administration group (228.0 ± 90.0 / mm ³ ). Similar results were obtained for the red blood cell count.

（３）W/BF₁マウスには、オヤイズ（Oyaizu）らが血小
板減少の原因が抗血小板抗体の出現によって起こること
を報告しているが、上記（２）の如く、本発明化合物１
の投与によって血小板の減少が抑制されたことから、20
週齢時の抗血小板抗体を同定した。(3) The W / BF ₁ mice, Oyaizu (see, Oyaizu) et the cause of thrombocytopenia is reported to occur by the appearance of anti-platelet antibodies, as described above (2), the present compound 1
Administration reduced the decrease in platelets.
Antiplatelet antibodies at the age of one week were identified.

抗血小板抗体の測定は、Balb/cマウスより採取した血
小板と20週齢まで投与したW/BF₁血漿と共に30分間室温
でインキュベートし、２回洗浄後、FITC標識抗マウスIg
G（タゴ社製；コードNo.6250）と反応させて染色後、FA
CSアナライザー（EPICS−Profile II、コールター社
製）で解析した。陰性のコントロールは、Balb/cマウス
の血漿が98％陰性になるようにセットし、各検体のサン
プルの陽性率を求めた。The measurement of anti-platelet antibody was performed by incubating platelets collected from Balb / c mice with W / BF ₁ plasma administered up to 20 weeks of age at room temperature for 30 minutes, washing twice, and FITC-labeled anti-mouse Ig.
G (manufactured by Tago; code No. 6250) and stained.
Analysis was performed using a CS analyzer (EPICS-Profile II, manufactured by Coulter Corporation). The negative control was set so that the plasma of the Balb / c mouse was 98% negative, and the positive rate of each sample was determined.

その結果を表10に示す。 Table 10 shows the results.

該表において、N.Tは、測定時において死亡していた
ため測定不可を示し、数字は陽性率パーセント（％）を
示す。 In the table, NT indicates that measurement was impossible because it died at the time of measurement, and the numbers indicate percent positive rate (%).

該表より、無投与群では、陽性率が19.6±5.5％であ
ったのに対し、本発明有効成分化合物（化合物１）100m
g/kg/日投与群では、陽性率13.2±2.7％、300mg/kg/日
投与群では、陽性率10.7±2.2％と用量依存的な抗血小
板抗体の抑制が認められた。According to the table, in the non-administration group, the positive rate was 19.6 ± 5.5%, whereas the active ingredient compound of the present invention (Compound 1) was 100 m
In the g / kg / day group, the positive rate was 13.2 ± 2.7%, and in the 300 mg / kg / day group, the positive rate was 10.7 ± 2.2%, indicating a dose-dependent suppression of antiplatelet antibodies.

W/BF₁マウスは、前述の如くヒト慢性ITPの自然発症モ
デルマウスであり、生後３ケ月よりループス腎炎を発症
し、８ケ月以前に90％以上は心筋梗塞又は腎不全で死亡
するが、このマウスの治療方法としては正常のBalb/cマ
ウスの骨髄を移植することにより治療できることが報告
されている［Ikehara,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,82,2483−2487（1985）;Yasumizu,R.,et al.,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,84,6555−6557（1987）;Ikehara,S.,
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,56,3306−53310（198
9）］。また、実際の臨床においても最も有効なITPの治
療は、現在の所骨髄移植とされている。W / BF ₁ mice are spontaneous mouse model of the aforementioned as human chronic ITP, develop lupus nephritis than age 3 months, 8 months earlier 90% or more but die in myocardial infarction or renal insufficiency, the It has been reported that mice can be treated by transplanting bone marrow of normal Balb / c mice [Ikehara, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.
SA, 82 , 2483-2487 (1985); Yasumizu, R., et al., Proc. N
atl.Acad.Sci.USA, 84, 6555-6557 (1987) ; Ikehara, S,.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 56 , 3306-53310 (198
9)]. The most effective treatment for ITP in actual clinical practice is currently bone marrow transplantation.

本発明有効成分化合物のカルボスチリル誘導体は、上
記（１）〜（３）の結果から判るようにW/BF₁マウスに
対して有意な延命効果を示し、同時にこのマウスの血液
学的特徴である抗血小板抗体の出現による血小板減少を
も抑制することから、自己免疫疾患改善作用を持つこと
が判る。Carbostyril derivative of the present invention the active ingredient compound, the (1) showed a significant life-prolonging effect on the W / BF ₁ mice As can be seen from the results to (3), is simultaneously hematological characteristics of the mouse It also suppresses thrombocytopenia due to the appearance of anti-platelet antibodies, indicating that it has an autoimmune disease ameliorating effect.

薬理試験例９ 血小板減少改善効果試験 １）供試化合物１の調製 化合物１を1N塩酸に溶解後、FCS（牛胎児血清、ギブ
コ社製）で希釈し、1mg/ml溶液を調製した。同溶液を10
％FCS添加RPMI−1640培地（フロー社製）に添加し、1N
−NaOHで中和した後、30μg/mlの濃度に調製して利用し
た。Pharmacological Test Example 9 Thrombocytopenia-Improving Effect Test 1) Preparation of Test Compound 1 Compound 1 was dissolved in 1N hydrochloric acid and diluted with FCS (fetal bovine serum, Gibco) to prepare a 1 mg / ml solution. 10
% FCS-added RPMI-1640 medium (manufactured by Flow) and 1N
After neutralization with -NaOH, the solution was adjusted to a concentration of 30 µg / ml and used.

２）CMK細胞の調製 CMK細胞は、サトウらによって急性巨核芽球性白血病
患者から樹立され、抗血小板抗体（抗糖タンパクII b/I
II a抗体、抗糖タンパクI b抗体、Plt−１抗体）と反応
し、また、細胞質内にα顆粒、血小板分離膜の形成が認
められる等巨核球様の性質を有することから巨核球の増
殖・分化の解析に用いられている〔Sato,T.,et al.,Ex
p.Hematol.,15,495（1987）;Sunami,S.,et al.,Blood,7
0,368（1987）;Komatsu,N.,et al.,Blood,74（１）42−
48（1989）;Fuse,A.,et al.,British J.Haematology,7
7,32−36（1991）；日本血液学会雑誌，53（２）294−2
95,317−318（1990）〕。2) Preparation of CMK cells CMK cells were established from patients with acute megakaryoblastic leukemia by Sato and colleagues, and anti-platelet antibodies (anti-glycoprotein II b / I
IIa antibody, anti-glycoprotein Ib antibody, Plt-1 antibody), and has megakaryocyte-like properties such as formation of α-granules and platelet separation membranes in the cytoplasm.・ Used for analysis of differentiation [Sato, T., et al., Ex
p.Hematol., 15 , 495 (1987); Sunami, S., et al., Blood, 7
0 , 368 (1987); Komatsu, N., et al., Blood, 74 (1) 42-
48 (1989); Fuse, A., et al., British J. Haematology, 7
7 , 32-36 (1991); Journal of the Japanese Society of Hematology, 53 (2) 294-2
95,317-318 (1990)].

CMK細胞は、千葉大医学部小児科佐藤武幸先生より供
与を受け、５×10⁴個/mlの細胞を10％FCS含有RPMI−164
0倍地中で培養し、４日毎に細胞数で継代した。CMK cells were provided by Dr. Takeyuki Sato of the Department of Pediatrics, Chiba University School of Medicine, and 5 × 10 ⁴ cells / ml were added to 10% FCS-containing RPMI-164.
The cells were cultured in medium 0 and passaged every 4 days based on the number of cells.

３）CMK細胞の血小板関連抗原発現に及ぼす化合物１の
影響 CMK細胞１×10⁵個/mlを化合物１を30μg/ml含む10％F
CS含有RPMI−1640倍地中で４日間培養し、細胞表面の血
小板関連抗原の発現をFITC標識Plt−１抗体（コールタ
ー社製）を用いてフローサイトメトリー（フロー社製）
により測定した。また、化合物１を含まない培地のみを
溶媒対照とした。3) Effect of Compound 1 on expression of platelet-associated antigen in CMK cells 1 × 10 ⁵ CMK cells / ml in 10% F containing 30 μg / ml of Compound 1
After culturing in CS-containing RPMI-1640 medium for 4 days, expression of platelet-related antigen on the cell surface was determined by flow cytometry (manufactured by Flow Co.) using FITC-labeled Plt-1 antibody (manufactured by Coulter).
Was measured by In addition, only a medium containing no compound 1 was used as a solvent control.

細胞表面抗原の解析はCMK細胞１×10⁶個/100μｌをチ
ューブ（フィッシャー社製）に採り、FITC標識Plt−１
抗体を５μｌを加えて４℃で30分間反応させた後、0.1
％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で３回洗浄後、陽
性細胞率及び蛍光強度を測定した。For analysis of cell surface antigen, 1 × 10 ⁶ CMK cells / 100 μl were taken in a tube (Fisher), and FITC-labeled Plt-1 was collected.
After adding 5 μl of the antibody and reacting at 4 ° C. for 30 minutes, 0.1
After washing three times with a phosphate buffer containing 5% bovine serum albumin, the percentage of positive cells and the fluorescence intensity were measured.

上記Plt−１抗体（コールター社製）は、血小板関連
抗原である糖タンパクII b/III aと認識する抗体で、CM
K細胞では、分化或いは成熟に伴って増加することが報
告されている〔Komatsu,N.,et al.,Blood,74（１）42−
48（1989）〕。The Plt-1 antibody (manufactured by Coulter) is an antibody that recognizes glycoprotein IIb / IIIa, a platelet-associated antigen, and is CM
It has been reported that K cells increase with differentiation or maturation [Komatsu, N., et al., Blood, 74 (1) 42-
48 (1989)].

その結果を表11に示す。 Table 11 shows the results.

該表より、使用したCMK細胞の約96％がPlt−１抗体で
認識される血小板関連抗原の陽性細胞であり、化合物１
の30μg/ml添加によっても陽性細胞率の変化は認められ
なかった。 According to the table, about 96% of the CMK cells used were positive for platelet-related antigen recognized by the Plt-1 antibody.
No change in the percentage of positive cells was observed even with the addition of 30 μg / ml.

しかしながら、細胞当りの抗原発現量を表す平均蛍光
強度を比較した場合、溶媒対照の平均蛍光強度を100％
とすると、化合物１を30μg/ml添加した細胞では191％
であり、化合物１添加によるCMK細胞表面上のPlt−１抗
体で認識される血小板関連抗原の発現量が約２倍に増加
したことが判る。However, when comparing the average fluorescence intensity representing the amount of antigen expression per cell, the average fluorescence intensity of the solvent control was 100%
As a result, 191% was obtained in cells to which 30 μg / ml of compound 1 was added.
It can be seen that the addition of Compound 1 increased the expression level of the platelet-related antigen recognized by the Plt-1 antibody on the surface of the CMK cells about 2-fold.

４）CMK細胞の形態観察 CMK細胞１×10⁵個/mlを化合物１を含む10％FCS含有RP
MI−1640倍地中で４日間培養し細胞の形態を位相差写真
により観察した。また、一部の細胞を採り、サイトスピ
ン標本を作成後、ライトギムザ染色により細胞の形態を
観察した。4) Morphological observation of CMK cells 1 × 10 ⁵ CMK cells / ml containing compound 1 and RP containing 10% FCS
The cells were cultured in MI-1640 medium for 4 days, and the morphology of the cells was observed by a phase contrast photograph. In addition, a part of the cells was collected, a cytospin specimen was prepared, and the cell morphology was observed by Wright Giemsa staining.

その結果を図４〜図７に示す。図４及び図６は、溶媒
対照を示し、図５及び図７は化合物１の30μg/ml投与に
よる細胞の位相差図及び染色図を示す。The results are shown in FIGS. 4 and 6 show a solvent control, and FIGS. 5 and 7 show a phase contrast diagram and a staining diagram of cells by administration of Compound 1 at 30 μg / ml.

該位相差図より、本発明の化合物１を30μg/ml添加し
た細胞では血小板産生過程様の細胞の断片化が認められ
た。また、染色図より本発明化合物１を添加した細胞で
は、細胞膜の発芽と核の分葉化が認められた。From the phase contrast diagram, it was confirmed that the cells to which the compound 1 of the present invention was added at 30 μg / ml showed fragmentation of cells in a manner similar to the platelet production process. From the staining diagram, germination of the cell membrane and lobulation of the nucleus were observed in the cells to which the compound 1 of the present invention was added.

上記の結果より、本発明の有効成分であるカルボスチ
リル誘導体は、CMK細胞表面上の血小板関連抗原の発現
量を増加させ、血小板産生過程様の細胞の断片化を起こ
し、更に細胞の細胞膜の発芽と核の分葉化を生ぜしめる
ことから、CMK細胞の分化或いは成熟を促進すると考え
られる。従ってこの特有な作用によって、巨核球前駆細
胞或いは巨核球細胞に作用してその分化、成熟を促進す
ることにより血小板の産生を促進し、血小板減少を改善
することが期待できる。From the above results, the carbostyril derivative, which is an active ingredient of the present invention, increases the expression level of platelet-related antigen on the surface of CMK cells, causes fragmentation of cells in a platelet production process-like manner, and further germinates cell membranes of cells. And nucleation of the nucleus, it is thought to promote the differentiation or maturation of CMK cells. Therefore, it can be expected that this unique action acts on megakaryocyte progenitor cells or megakaryocyte cells to promote their differentiation and maturation, thereby promoting platelet production and improving thrombocytopenia.

薬理試験例10 自己免疫疾患治療効果試験 この試験には雌性MRL/Mp−lprマウス（７週齢、日本
チャールズ・リバー社より購入）を19週齢より、１群５
匹ずつ使用した。Pharmacological Test Example 10 Autoimmune Disease Therapeutic Effect Test In this test, female MRL / Mp-lpr mice (7 weeks old, purchased from Charles River Japan, Inc.) from 19 weeks of age, 5 per group
They were used individually.

上記供試マウスは自己免疫疾患を自然発症するマウス
であり、その病態の特徴としては、ヒトSLE（Systemic
lupus erythematosus）様の免疫複合体糸球体腎炎、リ
ンパ腫、血管炎、多発性関節炎等が知られている（Theo
filopolos,A.and Dixon,F.J.,Adv.Immunology,37,269
（1985）:Murphy,E.D.Roths,J.B.,Autocommunity and l
ymphoproliferation,Elsevier North Holland,New yor
k,207−221（1978）：谷口吉弘、現代医療，21,131（19
89））。The test mouse is a mouse spontaneously developing an autoimmune disease, and its pathological condition is characterized by human SLE (Systemic
Known lupus erythematosus-like immune complex glomerulonephritis, lymphoma, vasculitis, polyarthritis, etc. (Theo
filopolos, A.and Dixon, FJ, Adv.Immunology , 37, 269
(1985): Murphy, EDRoths, JB, Autocommunity and l
ymphoproliferation, Elsevier North Holland, New yor
k, 207-221 (1978): Yoshihiro Taniguchi, Modern Medicine, 21 , 131 (19
89)).

化合物１投与群及びコントロール群（無処置群）の各
マウスには、マウス飼料（オリエンタル酵母社製）及び
水を与えた。Each mouse of the compound 1 administration group and the control group (untreated group) was supplied with mouse feed (manufactured by Oriental Yeast) and water.

化合物１は0.5％カルボキシメチルセルロース（CMC、
第一工業製薬社製）溶液に懸濁させて用いた。Compound 1 is 0.5% carboxymethylcellulose (CMC,
(Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) solution.

化合物１をマウス体重1kg当り300mg/kg/日の量で19週
齢より投与開始し、25週齢まで週５投２休で強制投与し
た（化合物１投与群）。Administration of Compound 1 was started at the age of 19 weeks at a dose of 300 mg / kg / day per 1 kg of mouse body weight, and gavage administration was carried out 5 weeks and 2 days a week until 25 weeks of age (Compound 1 administration group).

各群マウスにつき、尿蛋白量変化、リンパ腫径、耳介
の血管炎及び脱毛の有無を調べた。For each group of mice, changes in urine protein, lymphoma diameter, vasculitis of the pinna, and the presence or absence of hair loss were examined.

その結果、化合物１投与群はコントロール群と対比し
て、尿蛋白量の上昇を抑制する傾向が認められた。また
リンパ腫径がコントロール群の9.0±0.8mmに比して7.8
±1.3mmとなっており、その肥大がやや抑制された。As a result, the compound 1 administration group tended to suppress the increase in urine protein level as compared with the control group. The lymphoma diameter was 7.8 compared to 9.0 ± 0.8 mm in the control group.
It was ± 1.3 mm, and its hypertrophy was slightly suppressed.

上記血管炎、脱毛及びリンパ腫の程度を比較した結果
を図８に示す。FIG. 8 shows the results of comparing the degree of vasculitis, alopecia and lymphoma.

図より、化合物１投与群ではコントロール群に比して
血管炎及び脱毛の改善並びにリンパ腫径の縮少が認めら
れた。As shown in the figure, in the compound 1 administration group, vasculitis and hair loss were improved and the lymphoma diameter was reduced compared to the control group.

以上の結果より、化合物１投与によれば、アポトーシ
ス調整作用に基づく自己免疫疾患改善作用が期待できる
ことが判る。From the above results, it can be seen that administration of Compound 1 can be expected to improve the autoimmune disease based on the apoptosis-modulating effect.

薬理試験例11 PC12細胞に対する効果試験 ５％熱非働化（56℃、30分）ウマ血清と10％ウシ胎児
血清（FCS）を含むダルベッコ変法MEM（Ｄ−MEM）培地
で継代したPC12細胞を、コラーゲンでコートした直径35
mmプラスチックペトリディッシュに６×10⁴細胞/3ml培
地の濃度で移植した。移植２日目に、種々の濃度の化合
物１、神経成長因子（NGF、和光純薬社製）及びFCSのそ
れぞれを含むＤ−MEM（コントロール）に交換し、その
それぞれにつき培養を続け、３日目の細胞の形態変化を
位相差顕微鏡により観察した。Pharmacological Test Example 11 Effect test on PC12 cells PC12 cells subcultured in Dulbecco's modified MEM (D-MEM) medium containing 5% heat-inactivated (56 ° C, 30 minutes) horse serum and 10% fetal calf serum (FCS) Was coated with collagen and had a diameter of 35
The cells were transplanted into a mm plastic Petri dish at a concentration of 6 × 10 ⁴ cells / 3 ml medium. On the second day of transplantation, the cells were replaced with D-MEM (control) containing various concentrations of compound 1, nerve growth factor (NGF, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and FCS, and culturing was continued for each of them for 3 days. The morphological change of the eye cells was observed with a phase contrast microscope.

その結果を図９及び図10に示す。 The results are shown in FIGS.

図９は上段がFCSのみ添加の対照群、下段が化合物１
の30μg/ml添加群であり、図より、上段に比して、下段
では典型的な形態変化である神経線維様突起の形成が観
察され、最も顕著な神経線維様突起形成はFCS0.3％共存
下（下段左）で観察されることが判る。共存FCS濃度を
更に高くすると形態の異なる細胞も出現する（下段中央
及び右）。かくして、全細胞の30〜50％に形態変化が誘
導された。In FIG. 9, the upper row shows the control group to which only FCS was added, and the lower row shows Compound 1
As shown in the figure, formation of nerve fiber-like projections, which is a typical morphological change, was observed in the lower row compared to the upper row. It can be seen that it is observed under coexistence (lower left). When the co-existing FCS concentration is further increased, cells with different morphologies also appear (lower middle and right). Thus, morphological changes were induced in 30-50% of all cells.

図10は上段がNGFのみ添加群（但し0.3％FCS共存下）
であり、下段が0.3％FCS存在下に化合物１の30μg/mlと
NGF（０〜30ng/ml）とを添加した群である。該図より、
上段に認められるNGF刺激による神経様突起の形成に加
えて、下段では化合物１とNGFの共存（但し0.3％FCS共
存下）によって、それらのそれぞれ単独よりも上記突起
の伸長が促進されていると認められた。In Fig. 10, the upper row is the group to which only NGF is added (however, in the presence of 0.3% FCS)
And the lower row is 30 μg / ml of Compound 1 in the presence of 0.3% FCS.
This is a group to which NGF (0 to 30 ng / ml) was added. From the figure,
In addition to the NGF-stimulated neurite formation seen in the upper row, the lower row shows that the coexistence of compound 1 and NGF (but in the presence of 0.3% FCS) promotes the elongation of the above-mentioned projections more than those alone. Admitted.

上記各図より、本発明の有効成分化合物１はアポトー
シス調整作用に基ずくNGF様の作用を示し、このことか
らアルツハイマー病の治療剤として有用であることが判
る。From each of the above figures, it can be seen that the active ingredient compound 1 of the present invention exhibits an NGF-like action based on an apoptosis-modulating action, which is useful as a therapeutic agent for Alzheimer's disease.

薬理試験例12 肝不全に対する効果試験 雄性BALB/cマウス（７週齢、日本エスエルシー社より
購入）に、P.acnes加熱死菌（大阪市立大学医学部第３
内科、溝口先生より贈与）3mg/bodyを静脈内投与した。
その７日後に溶媒（0.5％CMC、第一工業製薬社製）投与
群、非投与群と共に、化合物１の10mg/kg又は100mg/kg
を経口投与した試験群を設けた。上記化合物１投与の１
時間後にLPS（Lipopoly saccharide、シグマ社製）の５
μg/bodyを静脈内投与して、急性肝障害を誘発させた。Pharmacological test example 12 Effect test on liver failure Male BALB / c mice (7 weeks old, purchased from SLC, Inc.) were subjected to heat-killed P.acnes (Osaka City University Medical School No. 3)
3 mg / body was intravenously administered.
Seven days later, 10 mg / kg or 100 mg / kg of Compound 1 was administered together with the vehicle (0.5% CMC, manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) administration group and the non-administration group.
Was administered orally. 1 of the above compound 1 administration
5 hours after LPS (Lipopoly saccharide, Sigma)
Acute liver injury was induced by intravenous administration of μg / body.

上記各群マウスの生存率をLPS投与７日後まで観察し
た。The survival rate of each group of mice was observed up to 7 days after LPS administration.

結果を図11に示す。 The results are shown in FIG.

該図より、化合物１の10mg/kg投与群（試験群）の生
存率は30％で、化合物１の100mg/kg投与群（試験群）の
生存率は70％であった。これに対して非投与群の生存率
は０％、溶媒投与群では10％であった。このことから、
化合物１は、急性肝炎モデルに対して、用量依存的に優
れた延命効果を奏することが判り、かくしてアポトーシ
ス調整作用に基ずく肝炎治療剤として有効であると認め
られる。From the figure, the survival rate of the 10 mg / kg administration group of Compound 1 (test group) was 30%, and the survival rate of the 100 mg / kg administration group of Compound 1 (test group) was 70%. In contrast, the survival rate in the non-administration group was 0%, and that in the vehicle administration group was 10%. From this,
Compound 1 was found to exert an excellent life-prolonging effect in an acute hepatitis model in a dose-dependent manner, and thus was confirmed to be effective as a therapeutic agent for hepatitis based on an apoptosis-modulating effect.

薬理試験例13 B16メラノーマ細胞の実験肺転移モデルに対する効果試
験 ２×10⁶細胞のB16マウスメラノーマ細胞（Koren,S.an
d Fleischmann,W.R.,J.Interferon Reseach,６,473−48
2（198）を、予め化合物１の３μg/ml又は10μg/mlを添
加するか無添加の10％FBS（ギブコ社製）添加イーグル
−MEM培地（日本製薬社製）に懸濁させた。75cm²のフラ
スコ（コーニング社製）にて５％炭酸ガス下に、37℃の
インキュベーター（ナショナルアプリアンス、モデル53
00（National appliancet,model 5300））で４日間培養
した。培養後、細胞をダルベッコPBS^(-)（日水製薬社
製）溶液で洗浄し、0.05％トリプシン（フロー社製）溶
液を加えてフラスコから剥離した。1200回転で５分間遠
心分離（日立製作所製、05PR−22使用）して２回洗浄
後、0.2％トリパンブルー（和光純薬社製）溶液を加
え、血球計算板（No.J7796,KAYAGAKI WORKS）にて、生
細胞数を数え、ハンクス（Hank′ｓ、フロー社製）溶液
にて細胞数を1.5×10⁶個/mlに希釈調製した。Pharmacological Test Example 13 Effect test of B16 melanoma cells on experimental lung metastasis model 2 × 10 ⁶ B16 mouse melanoma cells (Koren, S.an
d Fleischmann, WR, J. Interferon Reseach, 6 , 473-48
2 (198) was suspended in an Eagle-MEM medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) supplemented with 10% FBS (manufactured by Gibco) with or without the addition of 3 μg / ml or 10 μg / ml of compound 1. In a 75 cm ² flask (manufactured by Corning Incorporated) under a 5% carbon dioxide gas atmosphere at 37 ° C (National Appliance, Model 53)
00 (National appliance, model 5300)) for 4 days. After the culture, the cells were washed with Dulbecco's PBS ^(-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) solution, added with a 0.05% trypsin (Flow Co., Ltd.) solution and detached from the flask. After washing twice by centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes (using 05PR-22, manufactured by Hitachi, Ltd.), 0.2% trypan blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) solution was added, and a hemocytometer (No. J7796, KAYAGAKI WORKS) The number of viable cells was counted, and the number of cells was diluted to 1.5 × 10 ⁶ cells / ml with Hanks' (manufactured by Flow Corporation) solution.

次に、上記で得られた処理細胞を、１群７匹のC57BL/
6マウス（７週齢、雌性、日本チャールズ・リバー社よ
り購入）の尾静脈から３×10⁵個ずつ移植し、12日後に
マウスを頚椎脱臼して殺し、肺に転移したコロニー数を
計測した。Next, the treated cells obtained above were combined with 7 C57BL /
Six mice (7 weeks old, female, purchased from Charles River Japan, Inc.) were transplanted 3 × 10 ⁵ cells each from the tail vein, and 12 days later, the mice were killed by dislocation of the cervical spine and the number of colonies metastasized to the lung was counted. .

その結果を図12及び下記表12に示す。 The results are shown in FIG. 12 and Table 12 below.

上記図及び表より、３μg/mlの化合物１を含む培地で
培養した細胞を移植した群及び10μg/mlの化合物１を含
む培地で培養した細胞を移植した群のいずれにおいて
も、明らかに転移抑制効果が認められた。このことか
ら、本発明の有効成分化合物は、アポトーシス調整作用
に基ずいて、癌転移抑制剤として有用であることが判
る。 From the above figures and tables, metastasis was clearly inhibited in both the group transplanted with cells cultured in the medium containing 3 μg / ml of Compound 1 and the group transplanted with cells cultured in the medium containing 10 μg / ml of Compound 1. The effect was recognized. This indicates that the active ingredient compound of the present invention is useful as a cancer metastasis inhibitor based on the apoptosis-modulating effect.

産業上の利用可能性 本発明アポトーシス調整剤は、その特有のアポトーシ
ス調整能、細胞分化誘導能に基づいて、癌の化学療法剤
として有効利用できる。また抗レトロウイルス効果によ
りAIDS、ARC、ATL等の関連疾患やHTLV−Ｉ関連疾患の治
療剤として、自己免疫疾患の延命効果により自己免疫疾
患治療剤として、血小板関連抗原の発現量の増加効果に
より血小板減少症治療剤として、NGF様効果によるアル
ツハイマー病治療剤として、肝不全の延命効果により肝
炎治療剤として、癌転移抑制効果による癌転移抑制剤と
して、それぞれ有効である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The apoptosis regulating agent of the present invention can be effectively used as a chemotherapeutic agent for cancer based on its unique apoptosis regulating ability and cell differentiation inducing ability. Also, as a therapeutic agent for AIDS, ARC, ATL and other related diseases and HTLV-I related disease due to anti-retroviral effect, as a therapeutic agent for autoimmune disease due to prolonged effect of autoimmune disease It is effective as a therapeutic agent for thrombocytopenia, as a therapeutic agent for Alzheimer's disease due to an NGF-like effect, as a therapeutic agent for hepatitis due to a prolonged effect of liver failure, and as a cancer metastasis inhibitor due to a cancer metastasis suppressing effect.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｄ 215/22 Ｃ０７Ｄ 215/22 (31)優先権主張番号 特願平4 −100585 (32)優先日 平４(1992)３月25日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 市川 弘之 徳島県徳島市中通町３丁目11番地 (72)発明者 赤松 聖司 徳島県鳴門市***町川崎223―１ (72)発明者 齋藤 史郎 群馬県高崎市山名町2294―80──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Agency reference number FI Technical indication location // C07D 215/22 C07D 215/22 (31) Priority claim number Japanese Patent Application No. 4-100585 (32 ) Priority Date Hei 4 (1992) March 25 (33) Priority Country Japan (JP) (72) Inventor Hiroyuki Ichikawa 3-11 Nakadori-cho, Tokushima City, Tokushima Prefecture (72) Inventor Seiji Akamatsu Tokushima Prefecture 223-1 Kawasaki, Omamachi, Naruto (72) Inventor Shiro Saito 2294-80 Yamanamachi, Takasaki City, Gunma Prefecture

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】一般式 〔式中Ｒはフェニル環上に置換基として低級アルコキシ
基を有することのあるベンゾイル基を示す。カルボスチ
リル骨格の３位と４位との炭素間結合は一重結合又は二
重結合を示す。〕 で表わされるカルボスチリル誘導体及びその塩から選ば
れる少なくとも１種の化合物を有効成分として、薬理的
に許容される担体と共に含有することを特徴とするアポ
トーシス調整剤。(1) General formula [In the formula, R represents a benzoyl group which may have a lower alkoxy group as a substituent on the phenyl ring. The carbon-carbon bond between the 3-position and the 4-position of the carbostyril skeleton indicates a single bond or a double bond. ] An apoptosis-modulating agent comprising as an active ingredient at least one compound selected from the carbostyril derivative represented by the formula (1) and a salt thereof together with a pharmacologically acceptable carrier. 【請求項２】制癌剤として用いられる請求項１に記載の
アポトーシス調整剤。2. The apoptosis regulator according to claim 1, which is used as an anticancer agent. 【請求項３】抗レトロウイルス剤として用いられる請求
項１に記載のアポトーシス調整剤。3. The apoptosis regulator according to claim 1, which is used as an antiretroviral agent. 【請求項４】自己免疫疾患治療剤として用いられる請求
項１に記載のアポトーシス調整剤。4. The apoptosis regulator according to claim 1, which is used as a therapeutic agent for an autoimmune disease. 【請求項５】血小板減少症治療剤として用いられる請求
項１に記載のアポトーシス調整剤。5. The apoptosis regulator according to claim 1, which is used as a therapeutic agent for thrombocytopenia. 【請求項６】アルツハイマー病治療剤として用いられる
請求項１に記載のアポトーシス調整剤。6. The apoptosis-modulating agent according to claim 1, which is used as a therapeutic agent for Alzheimer's disease. 【請求項７】肝疾患治療剤として用いられる請求項１に
記載のアポトーシス調整剤。7. The apoptosis-modulating agent according to claim 1, which is used as a therapeutic agent for liver disease. 【請求項８】癌転移抑制剤として用いられる請求項１に
記載のアポトーシス調整剤。8. The apoptosis regulator according to claim 1, which is used as a cancer metastasis inhibitor.