JPH10236953A - P21 inducer - Google Patents
P21 inducerInfo
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- JPH10236953A JPH10236953A JP5706497A JP5706497A JPH10236953A JP H10236953 A JPH10236953 A JP H10236953A JP 5706497 A JP5706497 A JP 5706497A JP 5706497 A JP5706497 A JP 5706497A JP H10236953 A JPH10236953 A JP H10236953A
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- vesnarinone
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- cell
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、特定のカルボスチ
リル誘導体を有効成分とするp21(p21WAF1)誘導
剤に関する。[0001] The present invention relates to a p21 (p21 WAF1 ) inducer containing a specific carbostyril derivative as an active ingredient.
【0002】[0002]
【従来の技術】癌抑制遺伝子p53(以下「p53遺伝
子」)は、多くのヒト腫瘍で高頻度に変異をおこしてい
ることから注目されている癌抑制遺伝子のひとつであ
り、正常細胞の細胞周期や細胞の分化及びアポトーシス
誘導に重要な役割を担っていることが明らかにされてき
ている(Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 89, 7491-7495 (1
992);Cancer Res., 51, 6304-6311 (1991);Nature, 3
52, 345-347 (1991);Mol.Cell.Biol., 13, 1415-1423
(1993);Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 89, 4495-4499 (1
992);Cell, 74, 777-779 (1993);Proc.Natl.Acad.Sc
i., USA, 88, 8982-8986 (1991);Oncogene, 7, 1853-1
857 (1992);Blood, 83, 2230-2237 (1994);Cell Grow
th & Differentiation, 7, 21-30 (1996))。そして野
生型(wild-type)p53遺伝子のこれら機能は、変異
p53遺伝子では不活化されている(Cell, 70, 523-52
6 (1992))。2. Description of the Related Art The tumor suppressor gene p53 (hereinafter referred to as "p53 gene") is one of the tumor suppressor genes attracting attention because it frequently mutates in many human tumors. And has been shown to play an important role in cell differentiation and induction of apoptosis (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89 , 7491-7495 (1.
992); Cancer Res., 51 , 6304-6311 (1991); Nature, 3
52 , 345-347 (1991); Mol. Cell. Biol., 13 , 1415-1423.
(1993); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89 , 4495-4499 (1
992); Cell, 74 , 777-779 (1993); Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 88 , 8982-8986 (1991); Oncogene, 7 , 1853-1.
857 (1992); Blood, 83 , 2230-2237 (1994); Cell Grow
th & Differentiation, 7 , 21-30 (1996)). These functions of the wild-type p53 gene are inactivated by the mutant p53 gene (Cell, 70 , 523-52).
6 (1992)).
【0003】一方、p21遺伝子発現の誘導が、p53
に起因する細胞成長アレスト及びアポトーシス、並びに
ある種の癌細胞の分化誘導に関係していることが見出さ
れている(Cell, 75, 817-825 (1993);Cancer Res., 5
4, 1169-1174 (1994);Cell,76, 1013-1023 (1994);Pr
oc.Natl.Acad.Sci., USA, 89, 7491-7495 (1992))。該
p21遺伝子は、ヒト染色体6p21.2に位置してお
り、p53DNA結合サイトがp21コード配列の2.
4kb上流に見出されている(Cell, 75, 817-825 (199
3))。On the other hand, induction of p21 gene expression is
Has been found to be involved in cell growth arrest and apoptosis caused by E. coli and differentiation induction of certain cancer cells (Cell, 75 , 817-825 (1993); Cancer Res., 5 ).
4 , 1169-1174 (1994); Cell, 76 , 1013-1023 (1994); Pr
oc.Natl.Acad.Sci., USA, 89 , 7491-7495 (1992)). The p21 gene is located on human chromosome 6p21.2 and has a p53 DNA binding site of 2.p21 of the p21 coding sequence.
4 kb upstream (Cell, 75 , 817-825 (199
3)).
【0004】上記p21遺伝子によってコードされてい
る21kD核蛋白は、G1サイクリン依存性キナーゼ抑
制活性(G1-cyclin-dependent kinase inhibitory acti
vity)を有しており(Cell, 75, 805-816 (1993))、ま
た、p21は、細胞核抗原の増殖(proliferating cell
nuclear antigen)に依存して直接DNA複製を阻害す
ることが知られている(Nature, 369, 574-578 (199
4))。[0004] The 21-kD nucleoprotein encoded by the p21 gene has a G1-cyclin-dependent kinase inhibitory activity.
vity) (Cell, 75 , 805-816 (1993)), and p21 is a proliferating cell
It is known to directly inhibit DNA replication depending on nuclear antigen) (Nature, 369 , 574-578 (199
Four)).
【0005】また、細胞の分化は、セルサイクルのG1
の後期から誘導されることから、癌細胞にG1アレスト
を誘導することができれば、該癌細胞に分化やアポトー
シスを誘導できると考えられ、p21遺伝子の誘導はか
かる細胞のG1アレストを誘導できる点より、癌乃至免
疫異常の処置、治療に好ましい影響を与えると考えられ
る。[0005] Further, cell differentiation depends on G1 in the cell cycle.
Therefore, if G1 arrest can be induced in cancer cells, it is considered that differentiation and apoptosis can be induced in the cancer cells. Induction of the p21 gene is more likely to induce G1 arrest in such cells. It is thought to have a favorable effect on the treatment and treatment of cancer and immune disorders.
【0006】更に、自己免疫疾患では、病変の形成にC
D4リンパ球の活性化が関与していると考えられ、p2
1の発現はこのリンパ球の増殖を抑制する作用を奏し、
また例えばTh1やTh2リンパ球等を活性化するサイ
トカインの産生をも抑制し得、之等によって、例えばシ
ェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、SLE等の各種の
自己免疫疾患乃至免疫異常を処置できると考えられる。[0006] Furthermore, in autoimmune diseases, C is
Activation of D4 lymphocytes is thought to be involved, and p2
The expression of 1 acts to suppress the proliferation of this lymphocyte,
In addition, for example, it can suppress the production of cytokines that activate Th1 and Th2 lymphocytes and the like, and it is thought that they can treat various autoimmune diseases or abnormalities such as Sjogren's syndrome, autoimmune pancreatitis, and SLE. Can be
【0007】しかして、これら細胞におけるp21誘導
を可能とし、ひいてはG1アレストを可能とする手段の
提供が斯界にて望まれている。[0007] Thus, there is a need in the art to provide means for enabling p21 induction in these cells, and thereby enabling G1 arrest.
【0008】[0008]
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、上記斯界の要望に合致するp21誘導手段乃至細胞
のG1アレスト手段を提供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, it is an object of the present invention to provide a p21 inducing means or a G1 arresting means for cells which meets the needs of the art.
【0009】本発明者らは、上記目的より、鋭意研究を
重ねた結果、下記一般式(1)で表されるカルボスチリ
ル誘導体及びその塩が、所望のp21遺伝子発現を誘導
することを見出し、ここに本発明を完成するに至った。The inventors of the present invention have conducted intensive studies for the above purpose, and as a result, have found that the carbostyril derivative represented by the following general formula (1) and a salt thereof induce the desired p21 gene expression. Here, the present invention has been completed.
【0010】[0010]
【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば下
記一般式(1)で表わされるカルボスチリル誘導体及び
その塩から選ばれる少なくとも1種の化合物を有効成分
として含有することを特徴とするp21誘導剤が提供さ
れる。That is, according to the present invention, at least one compound selected from carbostyryl derivatives represented by the following general formula (1) and salts thereof is contained as an active ingredient. A p21 inducer is provided.
【0011】[0011]
【化2】 Embedded image
【0012】また本発明によれば、特に上記カルボスチ
リル誘導体が6−〔4−(3、4−ジメトキシベンゾイ
ル)−1−ピペラジニル〕−3、4−ジヒドロカルボス
チリル又はその塩である上記p21誘導剤が提供され
る。According to the present invention, in particular, the p21 derivative described above, wherein the carbostyril derivative is 6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril or a salt thereof. An agent is provided.
【0013】本発明p21誘導剤において、有効成分と
する上記一般式(1)で表されるカルボスチリル誘導体
及びその塩並びに之等の製法については、例えば特公平
1−43747号公報に記載されている。また、該公報
には該カルボスチリル誘導体が強心剤として有用である
ことも記載されている。更に、該カルボスチリル誘導体
については、これがアポトーシス調整能や細胞の分化誘
導能を有し、これら作用に基づいて各種の疾患に適応で
きることが、例えばWO93/00902号公報に教示
されている。しかしながら、本発明に係わるp21誘導
効果乃至G1アレスト誘導効果は、上記カルボスチリル
誘導体について記載された公知の作用とは関連がなく、
勿論、それら公知作用からは予測できるものではない。In the p21 inducer of the present invention, the carbostyril derivative represented by the above general formula (1), a salt thereof, and a production method thereof as an active ingredient are described in, for example, Japanese Patent Publication No. 43747/1989. I have. The publication also describes that the carbostyril derivative is useful as a cardiotonic agent. Furthermore, for example, WO 93/00902 teaches that the carbostyril derivative has an ability to regulate apoptosis and an ability to induce cell differentiation and can be adapted to various diseases based on these actions. However, the p21 induction effect to G1 arrest induction effect according to the present invention are not related to the known effects described for the carbostyril derivative,
Of course, it cannot be predicted from these known functions.
【0014】本発明誘導剤は、上記p21遺伝子の発現
誘導作用を奏することに基づいて、癌及び各種の免疫異
常、例えば、シェーグレン症候群、SLE等の治療乃至
処置に有用である。The inducing agent of the present invention is useful for the treatment or treatment of cancer and various immune disorders, for example, Sjogren's syndrome, SLE, etc., based on the effect of inducing the expression of the p21 gene.
【0015】尚、本発明誘導剤は、後記実施例に示され
るとおり、p53遺伝子の誘導を介して或はこれを介す
ることなく直接に、上記所望のp21遺伝子の発現を誘
導し、該p21遺伝子の誘導によれば、対象細胞におけ
る所望のG1アレストが誘導される。従って、本発明p
21誘導剤の利用によれば、変異p53を有する対象細
胞においても所望のp21誘導効果が奏せられ、また、
正常細胞においてはかかる誘導がないものと考えられる
ことから、上記各種の疾患に対して極めて良好に使用で
きる。The inducing agent of the present invention induces the expression of the above-mentioned desired p21 gene via the induction of the p53 gene or directly without through the induction of the p21 gene, as shown in the following Examples. , The desired G1 arrest in the target cell is induced. Therefore, the present invention p
According to the use of the 21-inducing agent, a desired p21-inducing effect can be exhibited even in a target cell having a mutant p53,
Since it is considered that there is no such induction in normal cells, it can be used very satisfactorily for the above various diseases.
【0016】[0016]
【発明の実施の形態】上記一般式(1)において示され
る各基は、より具体的にはそれぞれ次の通りである。即
ち、低級アルコキシ基としては、例えばメトキシ、エト
キシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、tert−
ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基等の炭素
数1〜6の直鎖又は分枝鎖状アルコキシ基を例示でき
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Each group represented by the above general formula (1) is more specifically as follows. That is, as the lower alkoxy group, for example, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, tert-
Examples thereof include linear or branched alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms such as butoxy, pentyloxy and hexyloxy groups.
【0017】フェニル環上に置換基として低級アルコキ
シ基を有することのあるベンゾイル基としては、例えば
ベンゾイル、2−メトキシベンゾイル、3−メトキシベ
ンゾイル、4−メトキシベンゾイル、2−エトキシベン
ゾイル、3−エトキシベンゾイル、4−エトキシベンゾ
イル、3−イソプロポキシベンゾイル、4−ブトキシベ
ンゾイル、2−ペンチルオキシベンゾイル、3−ヘキシ
ルオキシベンゾイル、3、4−ジメトキシベンゾイル、
2、5−ジメトキシベンゾイル、3、4、5−トリメト
キシベンゾイル基等のフェニル環上に置換基として炭素
数1〜6の直鎖又は分枝鎖状アルコキシ基を1〜3個有
することのあるベンゾイル基を例示できる。Examples of the benzoyl group which may have a lower alkoxy group as a substituent on the phenyl ring include, for example, benzoyl, 2-methoxybenzoyl, 3-methoxybenzoyl, 4-methoxybenzoyl, 2-ethoxybenzoyl, 3-ethoxybenzoyl , 4-ethoxybenzoyl, 3-isopropoxybenzoyl, 4-butoxybenzoyl, 2-pentyloxybenzoyl, 3-hexyloxybenzoyl, 3,4-dimethoxybenzoyl,
A phenyl ring such as 2,5-dimethoxybenzoyl, 3,4,5-trimethoxybenzoyl or the like may have 1 to 3 straight or branched alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms as substituents. A benzoyl group can be exemplified.
【0018】本発明において有効成分とする上記カルボ
スチリル誘導体中、特に好ましいものとしては、例えば
6−〔4−(3、4−ジメトキシベンゾイル)−1−ピ
ペラジニル〕−3、4−ジヒドロカルボスチリル(以下
「ベスナリノン」という)を例示できる。Among the above-mentioned carbostyryl derivatives as active ingredients in the present invention, particularly preferred are, for example, 6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril ( Hereinafter, "vesnarinone") can be exemplified.
【0019】上記カルボスチリル誘導体の塩には、通常
の酸を用いて形成される薬理学的に許容される酸付加塩
が包含される。該塩を形成する酸性化合物としては、具
体的には例えば硫酸、リン酸、硝酸、塩酸、臭化水素酸
等の無機酸、酢酸、蓚酸、マレイン酸、フマール酸、リ
ンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、エタンスルホン
酸、p−トルエンスルホン酸、安息香酸等の有機酸を例
示することができる。The above-mentioned salts of the carbostyril derivatives include pharmacologically acceptable acid addition salts formed using ordinary acids. Specific examples of the acidic compound that forms the salt include inorganic acids such as sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrochloric acid, and hydrobromic acid, acetic acid, oxalic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, tartaric acid, and citric acid. And organic acids such as succinic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and benzoic acid.
【0020】本発明薬剤の有効成分である一般式(1)
のカルボスチリル誘導体又はその塩は、通常、一般的な
医薬製剤の形態で用いられる。かかる製剤は、通常使用
される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面
活性剤、滑沢剤等の希釈剤乃至賦形剤を用いて調製され
る。この医薬製剤としては各種の形態が治療目的に応じ
て選択でき、その代表的なものとしては錠剤、丸剤、散
剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、
注射剤(液剤、懸濁剤等)等を例示できる。Formula (1) which is an active ingredient of the drug of the present invention
Is generally used in the form of general pharmaceutical preparations. Such a preparation is prepared by using a diluent or excipient such as a filler, a bulking agent, a binder, a humectant, a disintegrant, a surfactant and a lubricant which are usually used. Various forms can be selected as the pharmaceutical preparation depending on the purpose of treatment, and typical examples are tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories,
Examples include injections (solutions, suspensions, etc.).
【0021】錠剤の形態に成形するに際しては、担体と
してこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば
乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプ
ン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ
酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロ
ップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボ
キシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、
リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾
燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミ
ナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリ
オキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル
硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプ
ン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバタ
ー、水素添加油等の崩壊抑制剤、第4級アンモニウム塩
基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリ
ン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、
ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タル
ク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコー
ル等の滑沢剤等が例示できる。更に錠剤は必要に応じ通
常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包
錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重
錠、多層錠とすることができる。In the case of forming into tablets, carriers conventionally known in this field can be widely used, such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, and silicic acid. Excipients such as water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose,
Binders such as potassium phosphate and polyvinylpyrrolidone, dried starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, monoglyceride stearate, starch, lactose, etc. Disintegrants, sucrose, stearin, cocoa butter, disintegration inhibitors such as hydrogenated oil, quaternary ammonium bases, absorption promoters such as sodium lauryl sulfate, glycerin, humectants such as starch, starch, lactose, kaolin,
Examples thereof include adsorbents such as bentonite and colloidal silicic acid, and lubricants such as purified talc, stearates, powdered boric acid, and polyethylene glycol. Further, the tablets can be made into tablets coated with a usual coating, if necessary, such as sugar-coated tablets, gelatin-coated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets or double tablets or multilayer tablets.
【0022】丸剤の形態に成形するに際しては、担体と
してこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば
ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カ
オリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガン
ト末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナランカ
ンテン等の崩壊剤等が例示できる。In the form of pills, carriers conventionally known in the art can be widely used, such as excipients such as glucose, lactose, starch, cocoa butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc, and the like. Examples thereof include rubber powder, tragacanth powder, binders such as gelatin and ethanol, and disintegrants such as laminaran agar.
【0023】坐剤の形態に成形するに際しては、担体と
して従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレ
ングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコ
ールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を
挙げることができる。For shaping in the form of suppositories, conventionally known carriers can be widely used, and examples thereof include polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohols, esters of higher alcohols, gelatin, and semi-synthetic glycerides. it can.
【0024】注射剤として調製される場合には、液剤及
び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好まし
く、これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に成形するに際
しては、希釈剤としてこの分野において慣用されている
ものを全て使用でき、例えば水、エチルアルコール、プ
ロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコ
ール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオ
キシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げるこ
とができる。尚、この場合等張性の溶液を調製するに充
分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を医薬製剤中に
含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無
痛化剤等を添加してもよい。When prepared as an injection, the solution and suspension are preferably sterilized and isotonic with blood. When formed into the form of these solutions, emulsions and suspensions, they may be diluted. All the agents commonly used in this field can be used as the agent, and examples thereof include water, ethyl alcohol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. In this case, a sufficient amount of salt, glucose, glycerin, etc., for preparing an isotonic solution may be contained in the pharmaceutical preparation, and ordinary solubilizing agents, buffers, soothing agents, etc. are added. May be.
【0025】更に本発明G1アレスト誘導剤中には、必
要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や
他の医薬品を含有させてもよい。The G1 arrest inducer of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetener, and other pharmaceuticals as necessary.
【0026】本発明薬剤中に有効成分として含まれる有
効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲より適宜選
択されるが、通常全組成物中約1〜70重量%、好まし
くは約1〜30重量%程度の範囲とするのが適当であ
る。The amount of the active ingredient compound contained as an active ingredient in the medicament of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected from a wide range, but is usually about 1 to 70% by weight, preferably about 1 to 30% by weight of the whole composition. It is appropriate to set it in the range of about% by weight.
【0027】かくして得られる本発明医薬製剤の投与方
法は特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性
別、その他の条件、疾患の程度に応じて決定される。例
えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、筋肉内、皮
下、皮内、腹腔内投与等により投与され得る、これは必
要に応じてブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合し
て静脈内投与することもできる。錠剤、丸剤、顆粒剤、
カプセル剤等の固剤形態や経口投与用液剤形態の本発明
医薬製剤は、経口又は経腸投与され得る。また坐剤は直
腸内投与できる。The method of administering the pharmaceutical preparation of the present invention thus obtained is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, the age and sex of the patient, other conditions, and the degree of the disease. For example, a pharmaceutical preparation in the form of an injection can be administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal administration, or the like. It can also be administered. Tablets, pills, granules,
The pharmaceutical preparation of the present invention in a solid form such as a capsule or a liquid form for oral administration can be administered orally or enterally. Suppositories can be administered rectally.
【0028】本発明薬剤の投与量は、広範囲から適宜選
択でき、特に限定されるものではないが、通常一般式
(1)のカルボスチリル誘導体(及びその塩)が、一日
当り体重1kg当り約0.5〜30mg程度の範囲から
選択される量とされるのがよく、前記投与単位形態中に
有効成分が約10〜1000mg含有されるのが適当で
ある。また本発明p21誘導剤の投与は、一日1回又は
一日3〜4回に分けることもできる。The dose of the drug of the present invention can be appropriately selected from a wide range and is not particularly limited. Usually, the carbostyril derivative of the general formula (1) (and a salt thereof) is used in an amount of about 0 to 1 kg / body weight per day. The amount is preferably selected from the range of about 0.5 to 30 mg, and it is appropriate that the dosage unit form contains about 10 to 1000 mg of the active ingredient. The administration of the p21 inducer of the present invention can be divided into once a day or 3 to 4 times a day.
【0029】[0029]
【発明の効果】本発明によれば、一般式(1)で表わさ
れるカルボスチリル誘導体及び/又はその塩を有効成分
とするp21誘導剤が提供される。According to the present invention, there is provided a p21 inducer containing a carbostyril derivative represented by the general formula (1) and / or a salt thereof as an active ingredient.
【0030】[0030]
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため製剤
例及び薬理試験例を挙げる。The present invention will be described in more detail with reference to Formulation Examples and Pharmacological Test Examples.
【0031】[0031]
【製剤例1】 ベスナリノン 5mg デンプン 132mg マグネシウムステアレート 18mg 乳糖 45mg 計 200mg 1錠中、上記組成物の錠剤を製造した。Formulation Example 1 Vesnarinone 5 mg Starch 132 mg Magnesium stearate 18 mg Lactose 45 mg Total 200 mg A tablet of the above composition was produced in one tablet.
【0032】[0032]
【製剤例2】 ベスナリノン 150g アビセル(商標名、旭化成株式会社製) 40g コーンスターチ 30g ステアリン酸マグネシウム 2g ヒドロキシプロピルメチルセルロース 10g ポリエチレングリコール−6000 3g ヒマシ油 40g メタノール 40g 上記有効成分化合物、アビセル、コーンスターチ及びス
テアリン酸マグネシウムを混合研磨後、糖衣R10mm
のキネで打錠する。得られた錠剤をヒドロキシプロピル
メチルセルロース、ポリエチレングリコール−600
0、ヒマシ油及びメタノールからなるフィルムコーティ
ング剤で被覆を行ない、フィルムコーティング錠を製造
する。Formulation Example 2 Vesnarinone 150 g Avicel (trade name, manufactured by Asahi Kasei Corporation) 40 g Corn starch 30 g Magnesium stearate 2 g Hydroxypropyl methylcellulose 10 g Polyethylene glycol-6000 3 g Castor oil 40 g Methanol 40 g The above-mentioned active ingredient compound, Avicel, corn starch and magnesium stearate After mixing and polishing, sugar coating R10mm
Tablet with kine. The obtained tablets were treated with hydroxypropyl methylcellulose, polyethylene glycol-600.
0, coating with a film coating agent consisting of castor oil and methanol to produce film coated tablets.
【0033】[0033]
【製剤例3】 ベスナリノン 150.0g クエン酸 1.0g ラクトース 33.5g リン酸二カルシウム 70.0g プルロニックF−68 30.0g ラウリル硫酸ナトリウム 15.0g ポリビニルピロリドン 15.0g ポリエチレングリコール(カルボワックス1500) 4.5g ポリエチレングリコール(カルボワックス6000) 45.0g コーンスターチ 30.0g 乾燥ラウリル硫酸ナトリウム 3.0g 乾燥スタアリン酸マグネシウム 3.0g エタノール 適量 上記有効成分化合物、クエン酸、ラクトース、リン酸二
カルシウム、プルロニックF−68及びラウリル硫酸ナ
トリウムを混合する。Formulation Example 3 Vesnarinone 150.0 g Citric acid 1.0 g Lactose 33.5 g Dicalcium phosphate 70.0 g Pluronic F-68 30.0 g Sodium lauryl sulfate 15.0 g Polyvinylpyrrolidone 15.0 g Polyethylene glycol (Carbowax 1500) 4.5 g Polyethylene glycol (Carbowax 6000) 45.0 g Corn starch 30.0 g Dry sodium lauryl sulfate 3.0 g Dry magnesium stearate 3.0 g Ethanol Appropriate amount Active compound, citric acid, lactose, dicalcium phosphate, Pluronic F Mix -68 and sodium lauryl sulfate.
【0034】上記混合物をNo.60スクリーンにて篩
別し、ポリビニルピロリドン、カルボワックス1500
及びカルボワックス6000を含むアルコール性溶液で
湿式粒状化する。必要に応じてアルコールを添加し、粉
末をペーカト状塊にする。コーンスターチを添加し、均
一な粒子が形成されるまで混合を続ける。No.10ス
クリーンを通過させ、トレイに入れ、100℃のオーブ
ンで12〜14時間乾燥する。乾燥粒子をNo.16ス
クリーンで篩別し、乾燥ラウリル硫酸ナトリウム及び乾
燥ステアリン酸マグネシウムを加え、混合し、打錠機で
所望の形状に圧縮成形する。The above mixture was designated as No. 60 screen, polyvinyl pyrrolidone, carbowax 1500
And wet granulation with an alcoholic solution containing Carbowax 6000. If necessary, alcohol is added to make the powder into a peat-like mass. Add corn starch and continue mixing until uniform particles are formed. No. Pass through 10 screens, place in trays and dry in oven at 100 ° C. for 12-14 hours. The dried particles were no. The mixture is sieved through 16 screens, dried sodium lauryl sulfate and dried magnesium stearate are added, mixed, and compression-molded into a desired shape using a tableting machine.
【0035】上記芯部をワニスで処理し、タルクを散布
して湿気の吸収を防止する。芯部の周囲に下塗り層を被
覆する。内服用のために充分な回数のワニス被覆を行な
う。錠剤を完全に丸く且つ滑らかにするために、更に下
塗り層及び平滑被覆を適用する。所望の色合が得られる
まで着色被覆を行なう。乾燥後、被覆錠剤を磨いて均一
な光沢の錠剤を調製する。The core is treated with varnish, and talc is sprayed to prevent moisture absorption. An undercoat layer is coated around the core. Apply varnish a sufficient number of times for internal use. An additional subbing layer and smooth coating are applied to make the tablet completely round and smooth. Color coating is carried out until the desired hue is obtained. After drying, the coated tablets are polished to prepare tablets of uniform gloss.
【0036】[0036]
【薬理試験例1】 (1) 細胞及びその培養:ヒト唾液腺腺扁平上皮癌細胞T
YS〔Am.J.Pathol., 124, 496-509 (1986)〕は、10
%新生仔ウシ血清(FCS; Bio-Whittaker)を添加したダ
ルベッコ改変イーグル培地(DMEM; GIBCO Labs.)を用
いて、5%CO2存在下に37℃で培養した。[Pharmacological Test Example 1] (1) Cells and their culture: human salivary gland squamous cell carcinoma cells T
YS [Am. J. Pathol., 124 , 496-509 (1986)] is 10
The cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 using Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM; GIBCO Labs.) Supplemented with 5% newborn calf serum (FCS; Bio-Whittaker).
【0037】(2) 化合物によるTYS細胞の処置:96
ウエルプレート(Falcon Labware)に、TYS細胞を2
×103細胞/ウエルとなるようにまいた(Day 0)。翌
日(Day 1)、ベスナリノンの10mg/mlDMSO
溶液を培地に加えることにより、種々濃度(5, 10, 30
又は50μg/ml)のベスナリノンを添加した。以後、同濃
度のベスナリノンを含む培地にて毎日培地交換した。細
胞増殖は、MTT法〔Cancer Res., 47, 936-942 (198
7)〕により評価した。(2) Treatment of TYS cells with compound: 96
Place 2 TYS cells in a well plate (Falcon Labware).
The cells were sowed at 10 3 cells / well (Day 0). The next day (Day 1), vesnarinone 10mg / ml DMSO
By adding the solution to the medium, various concentrations (5, 10, 30
Or 50 μg / ml) of vesnarinone. Thereafter, the medium was changed daily with a medium containing the same concentration of vesnarinone. Cell proliferation was determined by the MTT method [Cancer Res., 47 , 936-942 (198
7)].
【0038】(3) RNAの単離 細胞質総RNAは、Nonidet p-40(Sigma)を含む低張
緩衝液にて細胞を溶解後、核(nuclei)を除去して調製
した。(3) Isolation of RNA Cytoplasmic total RNA was prepared by lysing cells in a hypotonic buffer containing Nonidet p-40 (Sigma) and removing nuclei.
【0039】(4) ヒトp21WAF1cDNAのクローニン
グ:50μg/mlのベスナリノンによる3日間処置の
TYS細胞をより単離した5μgの上記細胞質総RNA
を、逆転写酵素(Molony murine leukemia virus;GIBC
O)及びランダムプライマー(GIBCO)を用いて逆転写
し、得られたcDNAをPCRに供した。PCRにおい
て、反応混合物中のdNTPsとプライマーの最終濃度
は、順次、200μM及び1μMとした。TaqDNA
ポリメラーゼ(Takara Shuzo Co., Ltd.)は、最終濃度
0.05U/μlにて混合物に加え、反応は、温度調節
機(Takara)中、94℃3分後、94℃1分、60℃
1.5分、72℃2.5分の30サイクルと72℃4分
の延長にて行なった。(4) Cloning of human p21 WAF1 cDNA: 5 μg of the above cytoplasmic total RNA which was isolated from TYS cells treated with 50 μg / ml of vesnarinone for 3 days
, Reverse transcriptase (Molony murine leukemia virus; GIBC
O) and a random primer (GIBCO) were used for reverse transcription, and the resulting cDNA was subjected to PCR. In PCR, the final concentrations of dNTPs and primers in the reaction mixture were 200 μM and 1 μM, respectively. TaqDNA
Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added to the mixture at a final concentration of 0.05 U / μl, and the reaction was performed in a temperature controller (Takara) after 3 minutes at 94 ° C, 1 minute at 94 ° C, 60 ° C.
The test was performed with 30 cycles of 1.5 minutes, 2.5 minutes at 72 ° C, and an extension of 4 minutes at 72 ° C.
【0040】使用したプライマーの配列は、次表に示
す。The sequences of the primers used are shown in the following table.
【0041】[0041]
【表1】 [Table 1]
【0042】得られたPCR産物(875 bp)をpst1
にて消化し、この消化物(208 bp)をpUC19ベクタ
ーの同制限酵素部位にサブクローニングした。クローン
化したヒトp21WAF1cDNAのDNA配列は、蛍光標
識プライマーとタカラのキット(Takara Taq Cycle Seq
uencing Kit; Takara)によるジデオキシ鎖ターミネー
ション法〔Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 74, 5463-9567
(1977)]により確認した。The obtained PCR product (875 bp) was converted into pst1
And the digest (208 bp) was subcloned into the same restriction enzyme site of the pUC19 vector. The DNA sequence of the cloned human p21 WAF1 cDNA was obtained by using a fluorescent labeled primer and Takara kit (Takara Taq Cycle Seq.).
uencing Kit; Takara) [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74 , 5463-9567]
(1977)].
【0043】電気泳動と走査は、シマズDNAセクエン
サー(Shimadzu DSQ-500 DNA sequencer; Shimadzu Cor
p.)にて行なった。Electrophoresis and scanning were performed using a Shimadzu DNA sequencer (Shimadzu DSQ-500 DNA sequencer; Shimadzu Corse).
p.).
【0044】(5) PCR−SSCP及びp53配列決
定:TYS細胞の染色体DNAは、DNA抽出キット
(DNA extraction kit; Stratagene)を用いて精製し
た。(5) PCR-SSCP and p53 sequencing: Chromosomal DNA of TYS cells was purified using a DNA extraction kit (Stratagene).
【0045】p53遺伝子のエクソン5、6、7及び8
に存在する変異の検出に、DNAセクエンサーを用いる
蛍光PCR−SSCPを行なった〔Biomedical Res., 1
6, 273-279 (1995)〕。これらのエクソンは、p53変
異のホットスポットを含むことが知られている〔Oncoge
ne, 10, 6681-6688 (1995)〕。Exons 5, 6, 7 and 8 of the p53 gene
Fluorescence PCR-SSCP using a DNA sequencer was performed for the detection of the mutation existing in [Biomedical Res., 1] .
6 , 273-279 (1995)]. These exons are known to contain hot spots for p53 mutations [Oncoge
ne, 10 , 6681-6688 (1995)].
【0046】エクソン8の直接配列決定の為、エクソン
5−8を含む2.8kbフラグメントを、温度調節機
(Gene Amp PCR System PJ2000; Perkin Elmer)中、L
APCRキット(Takara)を用いて増幅した(94℃1
分、58℃1分、70℃4の30サイクルと70℃7分
の延長;プライマー:表2に示すP3及びP4又はP5
使用)。For direct sequencing of exon 8, a 2.8 kb fragment containing exons 5-8 was ligated in a temperature controller (Gene Amp PCR System PJ2000; Perkin Elmer).
Amplified using APCR kit (Takara)
Min, 58 ° C for 1 min, 70 ° C for 4 cycles and 70 ° C for 7 min; primers: P3 and P4 or P5 shown in Table 2
use).
【0047】[0047]
【表2】 [Table 2]
【0048】PCR産物(2.8 kb)は、アガロースゲル
電気泳動により精製した。該PCR産物のDNA配列
は、DNAセクエンサー(ALFred DNA sequencer; Phar
maciaFine Chemical Co.)により市販のキット(ALFred
Auto Cycle Sequencing Kit;Pharmacia)を使用する前
記ジデオキシ鎖ターミネーション法により決定した(プ
ライマーとして表3に示す塩基配列のCy5標識P6プ
ライマーと、Cy5標識M13逆配列プライマー(Cy5
labeled-M13 reverse sequencing primer)を使用し
た)。The PCR product (2.8 kb) was purified by agarose gel electrophoresis. The DNA sequence of the PCR product was analyzed using a DNA sequencer (ALFred DNA sequencer; Phar
maciaFine Chemical Co.) (ALFred
The primers were determined by the dideoxy chain termination method using the Auto Cycle Sequencing Kit (Pharmacia) (as primers, a Cy5-labeled P6 primer having the nucleotide sequence shown in Table 3 and a Cy5-labeled M13 reverse sequence primer (Cy5
labeled-M13 reverse sequencing primer) was used).
【0049】[0049]
【表3】 [Table 3]
【0050】(6) ノーザンブロット解析:細胞質RNA
(20μg)を、フォルムアルデヒド/1.0%アガロー
スゲルにて電気泳動しこれをナイロンフィルター(Hybo
nd-N; Amersham)にブロットした。このナイロンフィル
ターを、50%フォルムアミド、5×食塩−リン酸ナト
リウム−EDTA(saline-sodium phosphate-EDTA)、
0.1%SDS、5×デンハルト(Denhardt's)溶液及
び100μg/mlサケ***DNA存在下に、42℃、
15〜20時間、32P標識cDNAプローブとハイブ
リダイゼーションを行った。0.1×SSC(standard
saline citrate)−0.5%SDSにて、室温で2回
及び50℃40分間にて1回十分に洗浄した。X線フィ
ルムへの露光は、増強スクリーンを用いて−70℃で行
なった。(6) Northern blot analysis: cytoplasmic RNA
(20 μg) was electrophoresed on a formaldehyde / 1.0% agarose gel, and this was subjected to a nylon filter (Hybo
nd-N; Amersham). 50% formamide, 5 × salt-sodium phosphate-EDTA (saline-sodium phosphate-EDTA),
42 ° C. in the presence of 0.1% SDS, 5 × Denhardt's solution and 100 μg / ml salmon sperm DNA
Hybridization was performed with a 32P-labeled cDNA probe for 15 to 20 hours. 0.1 × SSC (standard
The cells were sufficiently washed twice with 0.5% SDS at room temperature and once at 50 ° C. for 40 minutes. Exposure to X-ray film was performed at -70 ° C using an intensifying screen.
【0051】使用したプローブは、TYS細胞よりクロ
ーン化した完全なオープンリーディングフレームを有す
るヒトp21WAF1cDNA(875 bp)、ヒトTGF−β
1の(ATCC No. 59955)のSma1−Sma1フラグメ
ント(592 bp)及びヒトβ−アクチン(ATCC No.77644:
HFBCA46)pHFβA−1のKho1−Xho1フラグ
メント(2.1 kb)である。The probes used were human p21 WAF1 cDNA (875 bp) having a complete open reading frame cloned from TYS cells and human TGF-β.
No. 1 (ATCC No. 59955) and Sma1-Smal fragment (592 bp) and human β-actin (ATCC No. 77644:
HFBCA46) is a Kho1-Xho1 fragment (2.1 kb) of pHFβA-1.
【0052】また、シグナルのデンシトメトリック解析
は、NIHイメージ1.44プログラム及び/又はBA
S−2000IIイメージ解析システム(Fiji photo fil
m)によって行なった。Also, the densitometric analysis of the signal is performed by NIH Image 1.44 program and / or BA
S-2000II image analysis system (Fiji photo fil
m).
【0053】(7) イムノブロット:TYS細胞を、SD
Sゲル電気泳動ロード用緩衝液に混合して10分間沸騰
した。得られた抽出物を、12.5%ポリアクリルアミ
ドゲルに電気泳動に付し(50μg蛋白/レーン)、イン
モビロン−Pメンブラン(Immobilon-P membrane;Milli
pore Corp.)にトランスファーした〔Nature, 227, 680
-685 (1970)〕。パーオキシダーゼ結合第2抗体(horse
radish peroxydase-conjugated second antibodies; Am
ersham)と化学発光試薬(Amersham)を使用して、抗p
21WAF1モノクローナル抗体6B6(PharMingen)と免
疫反応した蛋白を検出した〔Anal.Biochem., 151, 205-
209 (1985)〕。(7) Immunoblot: TYS cells were isolated from SD
Mix in S-gel electrophoresis loading buffer and boil for 10 minutes. The obtained extract was subjected to electrophoresis on a 12.5% polyacrylamide gel (50 μg protein / lane), and Immobilon-P membrane (Millimobil-P membrane; Millimeter) was used.
pore Corp.) [Nature, 227 , 680
-685 (1970)]. Peroxidase-conjugated second antibody (horse
radish peroxydase-conjugated second antibodies; Am
ersham) and a chemiluminescent reagent (Amersham).
A protein immunoreactive with 21 WAF1 monoclonal antibody 6B6 (PharMingen) was detected [Anal. Biochem., 151 , 205-.
209 (1985)].
【0054】(2)結果 (1) TYS細胞の増殖 TYS細胞の増殖に対するベスナリノンの効果をMTT
法により試験した結果、ベスナリノンは、濃度依存的に
細胞の増殖を著しく抑制した。(2) Results (1) Proliferation of TYS cells The effect of vesnarinone on the proliferation of TYS cells was determined by MTT.
As a result of the test, vesnarinone significantly suppressed the cell growth in a concentration-dependent manner.
【0055】(2) TYS細胞のp53遺伝子発現 PCR−SSCP解析により、TYS細胞のp53遺伝
子エクソン8に移動度の相違する変異バンドの存在が確
認された。当該部位の直接DNA配列決定の結果、TY
S細胞は、281位のコドン Asp(GAC) が His(CAC) に
置換した変異p53遺伝子を有することが確認された。(2) Expression of p53 gene in TYS cells PCR-SSCP analysis confirmed the presence of a mutant band having a different mobility in exon 8 of p53 gene in TYS cells. As a result of direct DNA sequencing of the site, TY
It was confirmed that the S cell had a mutant p53 gene in which the codon Asp (GAC) at position 281 was replaced with His (CAC).
【0056】(3) p21WAF1遺伝子の誘導 ベスナリノン(Vesnarinone)で処理したTYS細胞に
おけるp21WAF1mRNAの発現をノーザンブロット解
析により評価した。結果を図1及び図2に示す。(3) Induction of p21 WAF1 gene The expression of p21 WAF1 mRNA in TYS cells treated with vesnarinone was evaluated by Northern blot analysis. The results are shown in FIGS.
【0057】図1中、「A」は、ベスナリノン処理
(+)又は非処理細胞(−:コントロール)における、
p21WAF1、TGF−β1及びβ−アクチン(β−acti
n)の第1日(Day1)から第4日(Day4)にお
ける上記オートラジオグラフィーを、同図1中、「B」
は、それらのデンシトメトリック解析結果を、β−アク
チンに対比したmRNAレベル(mRNA levels relative
to β-actin)として表した結果をそれぞれ示す。In FIG. 1, “A” indicates that in vesnarinone-treated (+) or untreated cells (−: control)
p21 WAF1 , TGF-β1 and β-actin (β-acti
The autoradiography from the first day (Day 1) to the fourth day (Day 4) of n) is shown by “B” in FIG.
Shows the results of their densitometric analysis as mRNA levels relative to β-actin.
to β-actin).
【0058】図2は、ベスナリノン処理又はTGF−β
1処理細胞における同上結果を示す。FIG. 2 shows vesnarinone treatment or TGF-β
The same result as above for one treated cell is shown.
【0059】p21WAF1及びTGF−β1の発現は、5
0μg/mlのベスナリノンによる1日の処理により増
強された。ベスナリノンによるTYS細胞の処理は、T
GF−β1mRNAの若干の発現増強をみたが、一方、
p21WAF1mRNA発現は、化合物処理後、第1、第3
及び第4日目に著しい増強が認められた。5ng/ml
のTGF−β1単独のTYS細胞処理は、同様にp21
WAF1発現を誘導する(図2)。ベスナリノン又はTGF
−β1単独によるp21WAF1誘導は、試験した24時間
においては時間依存的な増強が認められた(但し、TG
F−β1処理細胞におけるp21WAF1発現は、6時間目
までに一過的な低下をみた)。更に、図2によれば、T
GF−βは、今回の実験条件下ではベスナリノンよりも
p21WAF1発現のより強い誘導剤であることが分かる。
p21WAF1mRNAの増加は、ベスナリノン又はTGF
−β処理後2時間足らずで認められ、この誘導は早い
(rapid)ことが分かる。p21WAF1mRNAの一定し
たレベル(steady-state level)は、ベスナリノン又は
TGF−β添加後24時間にわたり増加し続けた。一
方、β−アクチンの量は一定していなかった(図2)。
ベスナリノン処理細胞では、2時間目に増加しその後1
2時間から24時間目にかけて減少した。これは、TG
F−β1処理細胞における12時間目までの一定したβ
−アクチンレベルと比べて極めて対象的である。このこ
とは、β−アクチンの発現がベスナリノンによる処理後
少なくとも6時間の間はこれに影響されている可能性を
示唆している。The expression of p21 WAF1 and TGF-β1 was 5
Enhanced by one day treatment with 0 μg / ml vesnarinone. Treatment of TYS cells with vesnarinone
Although the expression of GF-β1 mRNA was slightly enhanced,
p21 WAF1 mRNA expression was observed in the first and third
And on day 4, significant enhancement was noted. 5ng / ml
Of TGF-β1 alone in TYS cells
Induces WAF1 expression (FIG. 2). Vesnarinone or TGF
Induction of p21 WAF1 by -β1 alone showed a time-dependent enhancement at 24 hours tested (except TG
P21 WAF1 expression in F-β1 treated cells showed a transient decrease by 6 hours). Further, according to FIG.
GF-β is found to be a stronger inducer of p21 WAF1 expression than vesnarinone under the conditions of the present experiment.
An increase in p21 WAF1 mRNA is due to vesnarinone or TGF
Less than 2 hours after -β treatment, this induction is rapid. The steady-state level of p21 WAF1 mRNA continued to increase over 24 hours after addition of vesnarinone or TGF-β. On the other hand, the amount of β-actin was not constant (FIG. 2).
Vesnarinone-treated cells increased at 2 hours and then
It decreased from 2 hours to 24 hours. This is TG
Constant β up to 12 hours in F-β1 treated cells
-Extremely symmetric compared to actin levels. This suggests that β-actin expression may be affected for at least 6 hours after treatment with vesnarinone.
【0060】(4) p21WAF1蛋白の発現 ベスナリノン処理TYS細胞におけるp21WAF1蛋白の
発現を、イムノブロット解析により評価した結果を図3
に示す。[0060] (4) p21 WAF1 expression of p21 WAF1 proteins in expression vesnarinone processing TYS cell protein, Fig. 3 the results of evaluation by immunoblot analysis
Shown in
【0061】図3中、レーン1はコントロール(ベスナ
リノン非処理,Vesnarinone 0 μg/ml)を、レーン2か
ら4は順次ベスナリノンの10μg/ml、30μg/
ml及び50μg/ml処理細胞の結果をそれぞれ示
す。In FIG. 3, lane 1 shows a control (untreated with vesnarinone, Vesnarinone 0 μg / ml), and lanes 2 to 4 show 10 μg / ml and 30 μg / ml of vesnarinone sequentially.
Shown are the results for cells treated with ml and 50 μg / ml, respectively.
【0062】イムノブロット解析の結果によれば、ベス
ナリノンによるp21WAF1蛋白の発現は、添加した同化
合物の濃度依存的な態様にて増強された。According to the result of the immunoblot analysis, the expression of p21 WAF1 protein by vesnarinone was enhanced in a concentration-dependent manner of the added compound.
【0063】[0063]
【薬理試験例2】 (1) 実験方法 日本クレア株式会社より購入した6週齢のBALB/c
AJcl−nuヌードマウス(雌)を用いた。飼育はク
リーンラックで行ない、飼料、水とも滅菌したものを与
えた。[Pharmacological test example 2] (1) Experimental method BALB / c of 6 weeks old purchased from CLEA Japan
AJcl-nu nude mice (female) were used. The breeding was performed in a clean rack, and feed and water were sterilized.
【0064】ヒト胃癌細胞株MKN−45(低分化腺
癌)は、直径10cmのプラスチック製培養シャーレに
15mlの10%FBSを含むPRMI1640培地
(日水製薬社製)培養した。コンフリューエント(conf
luent)になったところで、細胞はPBS(−)溶液
(日水製薬社製)で洗浄し、0.125%トリプシン
(ディフコ社製)を含む0.01%EDTA(同仁化学
研究所)溶液によってフラスコから剥離し、ハンクス溶
液(ギブコ社製)とPBS(−)溶液を1:1に混合し
た液に細胞を浮遊させて、細胞浮遊液を調製した。The human gastric cancer cell line MKN-45 (poorly differentiated adenocarcinoma) was cultured in a plastic culture dish of 10 cm in diameter in 15 ml of PRMI1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical) containing 10% FBS. Confluent (conf
When the cells have become luten), the cells are washed with a PBS (-) solution (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and then washed with 0.01% EDTA (Dojindo Laboratories) containing 0.125% trypsin (manufactured by Difco). The cells were detached from the flask, and the cells were suspended in a 1: 1 mixture of a Hanks solution (manufactured by Gibco) and a PBS (-) solution to prepare a cell suspension.
【0065】上記細胞浮遊液は、10匹のヌードマウス
腹側部皮下に1.6×107細胞(0.3ml)づつ移
植した。腫瘍塊が形成されたところでマウスを屠殺し、
摘出した腫瘍は、被膜と壊死部を除いた後、ハンクス溶
液にて洗浄し、2〜3mm角のできるだけ均一な立方状
の腫瘍片を作成し、120匹のヌードマウス背部皮下に
トロカー(trocar)針を用いて移植した。The above cell suspension was transplanted subcutaneously to the abdomen of 10 nude mice at 1.6 × 10 7 cells (0.3 ml). When the tumor mass was formed, the mice were sacrificed,
The removed tumor was washed with Hank's solution after removing the capsule and the necrotic part, and a cubic tumor piece of 2-3 mm square was formed as uniform as possible, and a trocar was placed subcutaneously on the back of 120 nude mice. Implanted with a needle.
【0066】ヌードマウスは腫瘍を移植日(0日目)よ
り、腫瘍体積が100mm3前後に達する日(8日目)
に腫瘍体重により群分けした(n=7)。In the nude mice, the day when the tumor volume reaches around 100 mm 3 from the day of transplantation of the tumor (day 0) (day 8).
Were grouped according to tumor weight (n = 7).
【0067】ベスナリノンは、無菌条件下で0.5%C
MC(片山化学工業社製)を含む注射用蒸留水(大塚製
薬社製)に溶解して5mg/mlとなるように調製し、
マウス体重10g当たり0.1mlずつ経口ゾンテを用
いて4週間毎日経口投与した(投与量:50mg/k
g、ベスナリノン投与群)。Vesnarinone is 0.5% C under aseptic conditions.
It was dissolved in distilled water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) containing MC (manufactured by Katayama Chemical Industry Co., Ltd.) to prepare 5 mg / ml,
0.1 ml per 10 g of mouse body weight was orally administered every day for 4 weeks using oral Zonte (dose: 50 mg / k)
g, vesnarinone administration group).
【0068】また、コントロール群には、0.5%CM
Cを含む注射用蒸留水(0.2ml/20g、経口)を
投与した。The control group contained 0.5% CM
C-containing distilled water for injection (0.2 ml / 20 g, oral) was administered.
【0069】腫瘍塊は10%ホルマリンで固定後、パラ
フィン包埋した。標本は、切片を作成し、脱パラフィン
後、3%H2O2を含むメタノール溶液に10分間浸し
た。PSB(−)で洗浄後、10%正常ヤギ血清(Hist
ofine,ニチレイ)に室温で30分間浸した。PBS
(−)で洗浄後、100倍希釈した抗p53ウサギポリ
クローナル抗体(CM1、1:100;Medac)で室温
90分間染色した。PBS(−)で洗浄後、パーオキシ
ダーゼ標識したストレプトアビジン(streptoavidine,
Histofine, ニチレイ)で室温45分間染色した。0.
6mg/mlの3,3′−ジアミノベンジシジン(同仁
化学研究所)と0.3%H2O2を含むトリス−塩酸緩衝
液(pH7.4)に10分間浸漬して発色させた。The tumor mass was fixed in 10% formalin and then embedded in paraffin. The specimen was cut into sections, deparaffinized, and immersed in a methanol solution containing 3% H 2 O 2 for 10 minutes. After washing with PSB (-), 10% normal goat serum (Hist
ofine, Nichirei) at room temperature for 30 minutes. PBS
After washing with (-), the cells were stained with a 100-fold diluted anti-p53 rabbit polyclonal antibody (CM1, 1: 100; Medac) for 90 minutes at room temperature. After washing with PBS (-), peroxidase-labeled streptavidin (streptoavidine,
Histofine, Nichirei) for 45 minutes at room temperature. 0.
6 mg / ml of 3,3'-diaminobenzidine hepcidin Tris containing (Dojin Chemical Laboratories) and 0.3% H 2 O 2 - was developed by immersion for 10 minutes in HCl buffer (pH 7.4).
【0070】(2) 結果 結果を図4に示す。(2) Results The results are shown in FIG.
【0071】該図は、縦軸にp53陽性細胞(%)をと
り、上記ベスナリノン投与群及びコントロール群におけ
る各p53陽性細胞%を示したグラフ(*印は、スチュ
ーデンツt−テストによる有意差、p<0.01を示
す)であり、該図より、ベスナリノン投与群では、野生
型p53の発現が有意に増強されることが判る。This graph shows the percentage of each p53-positive cell in the vesnarinone-administered group and the control group with the p53-positive cells (%) on the vertical axis (* indicates a significant difference by the Student's t-test, p <0.01), which shows that the expression of wild-type p53 was significantly enhanced in the vesnarinone administration group.
【0072】以上の試験結果から、次のことが判る。即
ち、細胞にp21の発現が起こることにより、G1アレ
ストが誘導される。また、細胞はG1から分化し、分化
のプロセスに入ると考えられ、その結果、細胞の増殖が
停止し、また、CD4の活性化が抑制されると考えられ
る。The following can be understood from the above test results. That is, the expression of p21 in cells induces G1 arrest. In addition, cells are thought to differentiate from G1 and enter the process of differentiation, resulting in the cessation of cell proliferation and suppression of CD4 activation.
【図1】ベスナリノン(Vesnarinone)で処理したTY
S細胞におけるp21WAF1mRNAの発現をノーザンブ
ロット解析により評価した結果を示す図面に代わる写真
である。FIG. 1. TY treated with Vesnarinone
15 is a photograph instead of a drawing, showing the result of evaluating the expression of p21 WAF1 mRNA in S cells by Northern blot analysis.
【図2】ベスナリノン処理又はTGF−β1処理したT
YS細胞におけるp21WAF1mRNAの発現をノーザン
ブロット解析により評価した結果を示す図面に代わる写
真である。FIG. 2. Ts treated with vesnarinone or TGF-β1
15 is a photograph replacing a drawing, showing the result of evaluating the expression of p21 WAF1 mRNA in YS cells by Northern blot analysis.
【図3】ベスナリノン処理TYS細胞におけるp21
WAF1蛋白の発現をイムノブロット解析により評価した結
果を示す図面に代わる写真である。FIG. 3. p21 in vesnarinone-treated TYS cells
4 is a photograph replacing a drawing, showing the result of evaluating the expression of WAF1 protein by immunoblot analysis.
【図4】ベスナリノン投与により、野生型p53の発現
が有意に増強されることを示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing that administration of vesnarinone significantly enhances the expression of wild-type p53.
Claims (2)
キシ基を有することのあるベンゾイル基を示す。カルボ
スチリル骨格の3位と4位との炭素間結合は、一重結合
又は二重結合を示す。〕で表されるカルボスチリル誘導
体及びその塩から選ばれる少なくとも1種の化合物を有
効成分として含有することを特徴とするp21誘導剤。1. A compound of the general formula [In the formula, R represents a benzoyl group which may have a lower alkoxy group as a substituent on the phenyl ring. The carbon-carbon bond between the 3-position and the 4-position of the carbostyril skeleton indicates a single bond or a double bond. ] A p21 inducer comprising at least one compound selected from the carbostyril derivative represented by the formula (1) and a salt thereof as an active ingredient.
(3、4−ジメトキシベンゾイル)−1−ピペラジニ
ル〕−3、4−ジヒドロカルボスチリル又はその塩であ
る請求項1に記載のp21誘導剤。2. The method of claim 1, wherein the carbostyril derivative is 6- [4-
The p21 inducer according to claim 1, which is (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril or a salt thereof.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5706497A JPH10236953A (en) | 1997-02-24 | 1997-02-24 | P21 inducer |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5706497A JPH10236953A (en) | 1997-02-24 | 1997-02-24 | P21 inducer |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10236953A true JPH10236953A (en) | 1998-09-08 |
Family
ID=13045026
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5706497A Pending JPH10236953A (en) | 1997-02-24 | 1997-02-24 | P21 inducer |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10236953A (en) |
-
1997
- 1997-02-24 JP JP5706497A patent/JPH10236953A/en active Pending
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