JP2592386B2 - 胎児膜の破裂を検出する方法およびその方法を利用する試験キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は胎児膜の破裂を検出する方法に関し、その方
法は、妊娠女性の膣分泌物の試料中に存在するタンパク
質の測定と、胎児膜の破裂を検出するのに用いる試験キ
ットに基づいた方法である。

“胎児膜の早期破裂”（PROM）という用語は、出産予
定日または出産予定日以前の日の出産開始の少なくとも
24時間前に、胎児膜が自然に破裂することを意味する。
この現象は出産の約５〜10％に起こり、周産期志望の約
10％の原因である。胎児膜の早期破裂の約30〜50％は、
在胎齢が37週間より短いときつまり満期でないときに起
こる。このとき、胎児膜の破裂は子宮内感染の危険が著
しく増大するので、それを検出することは極めて重要で
ある。胎児膜破裂から出産までの時間経過が長ければ長
いほど感染する危険性が大きい。感染すると母親の死亡
と周産期の死亡の両方が増大する。

このように起こりかつ危険な問題であるにもかかわら
ず、胎児膜破裂が臨床上明確でない場合、被験者の胎児
膜破裂を検出する確実な方法は知られていない。

最も確実な方法はないが、膣内に羊水が存在すること
を表示させようとする場合に、いくつかの不満足な方法
が用いられている。公知の方法は、とくにFriendman ML
およびMcElin TW,“Diagnosis of ruptured fefal memb
rances",Am J Obstet Gynec、104巻、544〜550頁、1969
年に記載されている。この羊水結晶化試験法は、スライ
ドガラス上の特徴的な分枝状態すなわち“シダ”状パタ
ーンを観察することに基づいているが、そのパターンは
正常な膣分泌物のパターンとは異なっている。

スライドガラス上の分泌物を、例えばナイルブルー、
アクリジンオレンジまたはブロモチモールブルーで染色
することによる染色試験法で、上記パターンの差を検出
する試みがなされている。膣分泌物のpHの変化はニトラ
ジン（Nitrazin）試験法で検出することができる。上記
の文献には、羊水を蛍光化合物で染色して、その漏洩を
紫外光で目視観察する方法も記載されている。

これらの方法は、偽陽性または偽陰性の結果が得られ
る場合が非常に多いか、妨害物質に対して敏感である
か、または患者の健康に対する試験を伴うので不満足な
ものである。子宮感染症が存在しているか、または胎児
膜が破裂してから長時間経過している場合、間違った試
験結果が得られることがある。

また、胎児膜の早期破裂を検出するには、膣内に存在
する場合がある他の分泌物中の濃度に比べて、羊水中の
濃度が高い膣液中の化合物を測定することが有効であろ
うと提案されている。このような化合物としては、α−
フエトプロテイン（AFP）（Rochelsonら、“Rapid assa
ypossible application in the diagnosis of prematur
e rupture of the membrances",Obstet Gynecol、62
巻、414〜418頁、1983年）およびプロラクチン（PRL）
（Koninckxら、“Prolactin concentration in vaginal
fluid:a new method for diagnosing ruptured membra
nces",Br J Obstet Gynecol、88巻、607〜610頁、1981
年）が報告されている。上記の両方の化合物の羊水中の
濃度は、妊娠女性の血液中より明らかに高い。しかし、
膣液試料が血液を含有している場合には、これらの化合
物を測定することによって、少量の羊水が存在するのを
検出することは困難である。

従って、胎児膜の破裂を検出する簡単で信頼できる方
法を開発する必要があることは明らかである。このよう
な状況において、試験を実施する際には、迅速に試験結
果を得ることが極めて重要である。この目的を達成する
理想的な試験法は、実施することが簡単でかつ試験結果
が少なくとも30分以内に得られる迅速な試験法であり、
臨床試験法として現場で直ちに実施できる方法が好まし
い。

したがって本発明の目的は、胎児膜の破裂を検出する
新しい改善された方法であって、患者の個々の変動とは
無関係に測定される物質に対して特異的な方法を提供す
ることである。

また本発明の目的は、患者が待っている間に実施する
迅速かつ簡単な方法（いわゆる臨床試験法）を提供する
ことである。

また本発明の目的は、上記のような検出を行うのに適
した試験キットであって、簡単で迅速な検出法を実施す
るための手段が入っている試験キットを開発することで
ある。

本発明の正確な特徴は、以下の説明と、内容が本願に
記載されている後記の請求の範囲から明らかになるであ
ろう。したがって、本発明は、妊娠女性の膣分泌物試料
中のタンパク質を測定することに基づいた、胎児膜破裂
を検出する方法に関する。上記の方法は、検出されるタ
ンパク質がインスリン様増殖因子結合タンパク質１（IG
FBP−１）であることを特徴とする方法であり、このタ
ンパク質が存在することは胎児膜破裂が原因であるが、
少なくとも一つの特異的なIGFBP−１結合物質によって
試料中に指示される。

本発明の方法では、特異的な結合物質の量：被測定タ
ンパク質の量の比率は、低濃度のIGFBP−１が陽性であ
ると解される反応を起こさないように調節される。陽性
反応は、羊水についてのみ特徴的な程度ほどに高い濃度
でなければ起こらない。本発明によれば、その感度の低
下は例えば試験を行う前に膣試料を希釈することによっ
て達成される。

胎児膜破裂を検出するために開発された本発明の試験
キットは、胎児膜破裂が原因で膣分泌物試料中にインス
リン様増殖因子結合タンパク質１（IGFBP−１）が存在
するのを検出するために、IGFBP−１に対して特異的な
結合活性を有する物質を含有する少なくとも一つの試験
を備えていることを特徴とするものである。

また本発明の試験キットには、IGFBP−１とその結合
物質との結合反応を指示する標識が入っている方が好ま
しく、かつ、該試薬中に含有されている特異的IGFBP−
１結合物質は、好ましくはIGFBP−１に対する特異的な
抗体である、特にモノクローナル抗体である。

インスリン様増殖因子結合タンパク質１（IGFBP−
１）は、男性と女性の各種の体液、例えば妊娠女性の血
清中に種々の濃度で存在するタンパク質である。このタ
ンパク質は、今までのところ、肝臓、脱落前および脱落
後の子宮内膜および卵巣でしか合成されないことが分か
っている。

IGFBP−１は、胎盤と胎児膜から、1980年に始めて精
製された（Bohnら、“Isolierung und Characterisieru
ng eines Neuen Plazentaspezifischen Proteins（PP1
2）",Arch gynecol、229巻、279〜291頁、1980年）。こ
のタンパク質は、胎盤起源のタンパク質と考えられたの
で胎盤タンパク質12（PP12）と呼称された。その後、PP
12および羊水から精製されたIGFBP−１は、同じＮ末端
アミノ酸配列を有し（Povoaら、“Crossreactions of s
erum somatomedin−binding protein in a radioimmuno
assay developed for somatomedin−binding protein i
solated from human amniotic fluid",Acta Endocrinol
ogica、107巻、563〜570頁、1984年）、かつPP12がIGF
I（インスリン様増殖因子Ｉ）を捕捉する（Koistinen
ら、“placental protein 12 is a decidual Protein t
hat binds somatomedin and has an identical N−term
inal amino acid sequence with somatomedin−binding
protein from human amniotic fluid",Endocrinolog
y、118巻、1375頁、1986年）ことが見出された。脱落膜
中でのIGFBP−１の合成は1985年に始めて報告された（R
utnenら、“Synthesis of placental protein 12 by hu
man decidua",Endocrinology 116巻、1304頁、1985
年）。ヒトヘパトーム細胞系由来のIGFBP−１の精製は1
988年に報告された（Leeら、“Insulin−like growth f
actor（IGF）binding protin complementary deoxyribo
nucleic acid from human HEP G2 hepatoma cells",Mol
Endocrinol、２巻、404頁、1988年）。この報告に関連
して、上記タンパク質の完全なアミノ酸配列が始めて報
告された。

羊水中のIGFBP−１の濃度は、通常、母親の血清中の
濃度より100〜1000倍高いことが見出されている（Rutan
enら、“Radioimmunoassay of placental protein 12:l
evels in amniotic fluid,cord blood and serum of he
althy adults,pregnant women and patients with trop
hoblastic disease",Am J Obstet Gynecol、144巻、460
頁、1982年）。しかしこの観察結果の臨床への適用につ
いては現在まで報告されていない。

特異的な結合物質に基づいた反応は公知である。抗体
は特異的な結合物質として最も普通に用いられる化合物
である。このようないわゆる免疫学的方法は、抗体がそ
の抗原の所定の部位（エピトープ）に特異的に結合する
性能に基づいている。いわゆるポリクローナル抗体は、
免疫化された動物の血清中に存在する免疫グロブリンの
混合物である。その混合物は、個々の動物毎に異なる。
ポリクローナル抗体と異なり、いわゆるモノクローナル
抗体は実験質条件下で培養される一つの細胞系で産生さ
れ、各抗体は均質であり、タンパク質化学で使用される
方法で特性を決定することができ、同一の形態で連続的
に産生される。

免疫学的方法は、一つだけの抗体を使用するように開
発することができる。この場合、試料中の抗原を、標識
を付けてあるが標識をつけていなければ試料の抗原と同
じ抗原を添加してこの抗原と、抗体の限定された量の結
合部位に対して競合させるように、反応条件を選択す
る。試料の抗原の濃度は、捕捉された標識の画分を分析
することによって測定される。濃度を測定できるように
するシグナルを生成するいくつもの標識物質として例え
ば放射性同位元素、酵素、化学発光化合物または蛍光化
合物を用いることができる。またこの方法は二つの異な
る抗体を利用することもできる（いわゆるサンドイッチ
法）。この場合は、抗体は、同じ抗原のエピトープを分
離するのに特異的であり、同時に同じ抗原分子に結合す
ることができる。一方の抗体は通常、固体の担体に固定
化され、他方の抗体には標識がつけられる。両方の抗体
は試料中の抗原に結合し、生成し複合体は、上記担体に
よって未結合の標識から分離することができる。捕捉さ
れた標識付き抗体の量は試料中の抗原の濃度に比例して
いる。

本発明の発明者は胎盤のタンパク質を研究してきた
が、その研究業績としてIGFBP−１（PP12）の濃度を測
定する放射線免疫検定法を開発した。さらに、IGFBP−
１に対するモノクローナル抗体が、その研究の結果とし
て開発された（Rutanenら、“Monoclonal antibodies t
o the 27−34 K insulin−like growth factor binding
protein",Biochem Biophys Res Commun、152巻、208
頁、1988年）。しかしその研究結果は臨床の用途に導入
されていない。

羊水中と、膣内に存在する他の分泌物中とのIGFBP−
１の濃度の比較を示す報告は文献には全く見られない。
本発明の発明者が率いる研究グループは、羊水中と血液
中および膣内に存在しうる分泌物中のIGFBP−１の濃度
を調査した（表１）。

血液中のIGFBP−１の量は固体毎に著しく変動してい
るが、すべての場合に、羊水中のIGFBP−１の濃度が母
親の血清中の濃度の100倍以上であるということは、対
になった血液と羊水の試料の試験結果から結論すること
ができる。上記の濃度の差は、発明者が知っている、血
液中と羊水中のタンパク質間の最大の差である。この理
由から、IGFBP−１は、羊水が血液と混合している場合
でも羊水の存在を検出するのに優れて適している。

逆に、タンパク質のAFPとPRLの対応する比率はかなり
変動するが、１〜10の大きさである。いくつかの場合に
は、これら被測定化合物の濃度が羊水中より血清中の方
が高いことが見出された。またこのような測定値は、AF
PとPRLの測定値に基づいた初期の試験法が完全には信頼
できない理由を示している。

本発明によれば、IGFBP−１試験法の検出限界を、血
液濃度が高い場合のIGFBP−１でも陽性の試験結果を与
えないようなレベルに調節することによって、陽性の試
験結果が常に、羊水が存在することによって確実に得ら
れるようにできることが分かった。このように、低濃度
の羊水由来のIGFBP−１でも、ごく少量の羊水しか血液
中に混合されていなくても検出することができる。

この検出限界は、例えば、試料中の血液にだけはまた
はいくつかの他の分泌物によってもたらされる低濃度の
IGFBP−１が陽性とみなされる試験結果を与えることが
ないような弱いシグナルを生成する標識を用いることに
よって、適切なレベルに調節することができる。強いシ
グナルを用いる場合には、この検出限界は、例えば試料
を希釈することによって低下させることができる。用い
るシグナルが定量的な試験結果を与える場合は、試料中
のIGFBP−１の濃度が、母親の血清でもたらされる、最
高の公知の濃度より低いときは常に陰性であるとみなす
ことができる。

非妊娠女性および無傷の胎児膜を有する妊娠女性の膣
分泌物、精漿または尿中のIGFBP−１の濃度は、羊水中
のその濃度と比べて極めて低いということは、試験中に
判明した。それ故に、本発明の試験法は、羊水以外のIG
FBP−１の起源が、利用される試験条件下で偽陽性の試
験結果をもたらすことがないように設計することができ
る。表１に示すように、試験で判明した母親の血清中の
IGFBP−１の最高濃度は600μg/lであったが、一方、羊
水中の最低濃度は22000μg/lであった。したがって、試
料の羊水含有量がたとえ10％という少量であっても、そ
の羊水の存在によって生じるIGFBP−１の濃度は依然と
して2200μg/lであり、この濃度は、母親血清について
測定された最高濃度の３倍以上である。羊水中のIGFBP
−１の濃度は上記の濃度（22000μg/l）より著しく高
く、これに対して母親の血清中の濃度は上記の濃度（60
0μg/l）よりかなり低い場合が非常に多い。

本発明の試験法を実施するのに、少量（100〜200μ
ｌ）の膣分泌物で充分である。試料は、検鏡試験中、例
えば使い捨て注射器または試料採取用に特に設計された
滅菌用具を用いて採取するのが好ましい。

IGFBP−１の分子の大きさは充分大きくその分子量は
約25000Dなので、IGFBP−１はそれに対する抗体を生成
することができたが、これらの抗体は免疫学検定法に利
用できる。

したがって、本発明の方法は、IGFBP−１に対する抗
体またはIGFBP−１の他の特異的結合物質を使用するこ
とに基づいている。本発明の方法は迅速であり、その利
用範囲は適切な濃度範囲を含んでいるので、本発明の目
的である検出の用途、すなわち膣内に羊水が存在するこ
とを証明することによって胎児膜の破裂を検出するのに
好適である。

本発明の検定法の測定範囲に対して必要な濃度と同等
の高濃度のIGFBP−１は羊水以外の他の場所には存在し
ないから、本発明により好ましいIGFBP−１の検定法を
用いることによって、まず第一に、膣内の羊水を充分な
特異性で検出することができる。それ故に、他のIGFBP
−１の起源由来の汚染によって偽陽性の試験結果が生じ
ることはない。

本発明の好ましい実施態様では、測定範囲は、血液由
来のIGFBP−１が偽陽性の試験結果をもたらさないよう
に調節される。したがって本発明の試験法は、無傷の胎
児膜を通じて通常起こる少量の羊水の漏洩によって誤っ
た解釈を起こすほど敏感ではない。本発明の試験法に用
いられる単一もしくは複数の結合物質は、IGFBP−１と
しか特異的に結合しないで、いわゆる交差反応すなわち
誤った化合物の結合によって陽性反応が起こる可能性が
ない。

一方、羊水中のIGFBP−１の濃度は常に高いので、胎
児膜の破裂に伴い漏洩する羊水は、本発明の試験法で検
出されずに残留することはない。本発明の試験法は、そ
の試験時間が短いにもかかわらず、試料中の所望のIGFB
P−１の濃度から出発して陽性に変わり始めるような高
い親和性でIGFBP−１と結合する特異的な結合物質を利
用する。

本発明の試験法を開発する際にはいわゆるフック作用
（Hook effect）（前地帯現象の作用）をなくすように
注意した。この作用は、免疫反応において、抗原の濃度
が抗体の濃度に比較して非常に高いと、測定される抗原
抗体複合体が疑似的に減少する作用である。この場合、
高濃度の試料は逆に低い試験結果を与えることがあり、
このような試験結果は、この種の試験法では極めて有害
であり、偽陰性の試験結果をもたらす。このため、本発
明の試験法の好ましい実施態様を開発する際に、結合試
験とIGFBP−１の量の比率は、羊水中の公知の最高濃度
でも、測定されるシグナルを陰性に変えて誤った解釈を
させることがないように調節した。このように、偽陰性
の試験結果が起こる危険性は、本発明による試験法では
特に排除されている。

本発明のIGFBP−１試験法はできるだけ迅速に試験結
果が得られるように開発されており、このことは本発明
が目的とする検出を達成するのに医学上および経済上重
要である。必要な試料は、例えば、胎児膜が破裂した疑
いがある場合、婦人科検鏡試験を行うときに採取するこ
とができる。試料は、例えば注射器で採取するかまたは
採取用に製作されたサンプリング用具で採取することが
できる。

本発明の好ましい実施態様によれば、特異的な結合物
質と試料由来のIGFBP−１濃度の比率は、陽性の解釈を
もたらすシグナルが、試料中のIGFBP−１の濃度が高い
ときにのみ生じるよう、本発明の方法において適切に調
節される。正しい比率は、例えば、検出を行うために採
取した分泌物の試料を、試験を行う前に希釈することに
よって達成できる。その希釈は、試験中に起こる結合反
応にとって好都合な溶液、好ましくは本発明の試験法に
属する溶液で行うことが好ましい。その溶液としては、
例えば保護タンパク質を含有しかつpHが生理的pHに近い
リン酸緩衝液のような緩衝液が好ましい。

試験を実際に行ったときに分かったことは、希釈比
が、信頼できる試験結果を得るために少なくとも1:10で
なければならず、少なくとも1:20が有利であることであ
る。1:500またはさらに大きな希釈比も利用できる。本
発明によって、定性的なすなわちプラスまたはマイナス
の試験結果を得るには、希釈のレベルは、例えば母親の
血液中に存在するIGFBP−１が選択された標識の測定範
囲内で陽性の試験結果を与えるいき値以上である限り臨
界的でない。

また本発明の試験法は、例えば非常に多量の特異的結
合物質、および標識（そのシグナルはそれほど強くな
い）を用いることによって未希釈の試料で実施すること
ができる。このようにして、羊水由来の高濃度のIGFBP
−１だけが陽性の試験結果を与えることができる。

本発明によって、IGFBP−１の試験は、次のような二
つの特異的モノクローナル抗体を用いて有利に実施され
る。例えば、一方の抗体は小さなプラスチック製ビーズ
に結合され、他方の抗体には、例えば西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（HRP）のごとき酵素のような標識が結合さ
れている。適正に希釈された試料、酵素の標識を付けた
抗体、およびグリッパーにはさまれた抗体被覆ビーズを
試験管に入れる。この混合物をインキュベートすると、
試料中に存在するIGFBP−１は一方ではビーズに結合
し、他方では標識をつけた抗体に結合する。インキュベ
ートした後、ビーズを試験管から取出して、流水で洗浄
する。そのビーズを、標識として用いた酵素の基質が入
っている試験管内に入れる。試料が充分な量のIGFBP−
１を含有していたならば、インキュベーション中に、肉
眼で検出可能な色が生成する。試料がIGFBP−１を含有
していないかまたはその濃度が低すぎる場合、溶液は無
色のままである。

また本発明のIGFBP−１試験法は、第１の抗体を、そ
の試験法用に開発された膜の表面に結合させて実施する
ことができる。試料を上記の膜に接触させると、試料中
のIGFBP−１は前記の固定化抗体に特異的に結合する。
次いで、対応する態様を結合された抗体が添加され、次
にその抗体は上記膜上に存在するIGFBP−１に結合す
る。結合されている酵素は、洗浄された膜に添加するこ
とによって検出され、その酵素の沈澱する基質は酵素の
作用によってその色が変化する。このように試料が陽性
の場合、肉眼で検出可能な色が膜上に生成する。抗体で
コートされた膜によるこの種の試験は、例えば、この試
験用に特に設計されたプラスチック製容器に問題の膜を
結合させることによって実施できる。膜の下側に配置さ
れた吸収材は、試験液を膜の上にピペットでおとすと、
試験液を膜を通じて迅速に吸収する。対応して、上記の
膜は、一つの溶液から他の溶液にまたがるプラスチック
製の帯状体に連結してもよい。

また陽性の試験結果を示す色は、抗体に酵素で標識を
付けて、その酵素がその基質の色を変化させる方法以外
の方法でも得ることができる。酵素の代わりに染料を抗
体に結合させてもよい。染料の強度は、陽性の場合に、
固定化されたIGFBP−１に結合された標識の色が肉眼で
検出できるように充分強くなければならない。金もしく
はセレンのコロイドまたは分散染料がかような染料とし
て使用できる。このような試料の利点は、別個の基質の
反応相が必要でない場合、試験時間が短いということで
ある。対応して、抗体は着色したラテックス粒子に結合
させてもよい。直接肉眼で見える色に基づいたこのよう
な検出法を用いる場合、免疫クロマトグラフィ迅速測定
法をIGFBP−１について使用することができる。一般に
第一抗体が小領域に結合されている膜が用いられる。他
の領域に、色素で標識を付けられた第二抗体が乾燥され
ている。液体の試料が添加されると、前記の第二抗体が
膜上に移行し始める。試料が充分な量のIGFBP−１を含
有している場合は、標識を付けた抗体に結合した抗原が
さらに膜に固定化された抗体に結合する点に着色した領
域が生成する。試料が陰性の場合、着色領域は生成せず
染料が膜の上に移行する。

またIGFBP−１の試験は凝集の原理によって実施する
ことができる。この場合、肉眼で見て検出可能な反応
は、例えば抗体でコートされたラテックスのような粒子
と試料中の抗原とを凝集させて両者を結合させる反応で
構成されている。逆に凝集反応の阻害も検出できる。

IGFBP−１の、抗体のみならず他の特異的な結合物
質、およびそれらの組合わせも本発明の方法と試験キッ
トに用いることができる。この場合には、例えば、IGFB
P−１がIGF（インスリン様増殖因子）に自然に結合する
特性を利用することができる。

本発明の試験法を実施する際に、フィンランド特許第
84863号に説明されている検定法を用いてもよい。その
内容は本願に援用するものとする。

本発明によるIGFBP−１の試験法は、決定的な方式
で、胎児膜の早すぎる破裂に関する問題を除くことがで
きる。胎児膜が破裂した後は、感染する危険があるの
で、患者は出産までの集中的な追跡検査を行う必要があ
る。胎児膜が早期に破損した疑いがある場合、検査に基
づいて、患者は入院させなければならないかまたは帰宅
させるべきかを決定しなければならない。この決定は経
済上および医学上の両方について重要である。つまり経
済上は退院までの入院日時の経費として、および医学上
は上記の決定が胎児と母親の両者の死亡率に直接影響す
るので重要である。

本発明の試験キットにはIGFBP−１の特異的結合物質
に基づいた試験が入っている。試験法によって、試薬は
結合物質の溶液でもよく、または特異的な結合質でコー
トされたビーズもしくは膜のような固体相でもよく、ま
たはラテックスもしくは染料の粒子で製造されていても
よい。例えば、一段検定法では、キットには、上記要素
の組合わせが入っている。その特異的な結合物質として
は、IGFBP−１に対して特異的なモノクローナル抗体で
構成されたものが有利である。

上記の試薬に加えて、キットには、結合反応の後、試
料中の充分の濃度のIGFBP−１を検出することができる
標識が入っている方が有利である。結合反応を有利に検
出する標識は、IGFBP−１に対する他の抗体に結合され
たシグナル生成標識である。その標識は例えば、IGFBP
−１に対する他の抗体に結合された酵素、放射製同位元
素、またはその色で認識される化合物である。その標識
が酵素の場合、試験キットは、酵素の基質を含有してい
る方が有利である。

上記の必須の試薬に加えて、試験キットには、試料を
希釈するのに用いる希釈溶液が入っている方が有利であ
る。前記溶液としては、例えば保護タンパク質を含有し
pHが生理的pHに近いリン酸緩衝液のような検定緩衝液を
含有しているものが有利である。希釈緩衝液の量は、所
定量の試料が希釈溶液に添加されるとき、例えば1:20の
ような最終希釈率を達成できるように調節することがで
きる。

また試験キットには、使い捨て滅菌注射器またはこの
試験法用に特に開発された用具のようなサンプリング用
具が入っている。

また本発明の試験キットは、膣分泌物の試料と、試験
を実施するのに用いる関連希釈溶液とを採取するための
簡単な用具を備えている。また試験キットは、患者自身
が膣内に挿入することができる、抗体でコートされた試
験用帯状体を備えている。このような試験キットは家庭
試験に好適であり、女性が、胎児膜が破裂しているので
はないかと思い病院に行くべきか否かと考えているとき
に、自分で家庭にて使用できる。

下記の実施例は本発明の試験法の実例を示すが本発明
を限定するものではない。

実施例 １ プラスチック製ビーズを抗IGFBP−１抗体（6305,Medi
x Biochemica）でコートした。他のIGFBP−１抗体（630
3,Medix Biochemica）に標識の酵素（西洋ワサビペルオ
キシダーゼ、HRP）を結合させた。0.3％のウシ血清アル
ブミン（BSA）を含有するリン酸緩衝液を検定緩衝液と
して使用した。この緩衝液は界面活性材と安定材も含有
し、そのpHは7.4であった。IGFBP−１の迅速試験を、下
記の指示にしたがって実施した。

IGFBP−１の迅速試験の実施： 1. 200μｌの6303−HRP−標識を、試料の試験管（検定
緩衝液で1:50の希釈率で希釈）にピペットで添加した。

2. 100μｌの試料（検定緩衝液で1:20の希釈率で希
釈）を上記試験管に添加した。

3. IGFBP−１抗体でコートされ、グリッパーではさま
れたビーズを上記試験管に入れ、５分間インキュベート
した。

4. グリッパーにはさまれたビーズを溶液から取出し、
流水で30秒間洗浄した。

5. 上記の洗浄したビーズを基質溶液（2,2′−アジノ
−ジ−〔３−エチル−ベンズチアゾリンスルホネート
（６）〕、ABTS）（透明試験管にピペットで採取した40
0μｌ）に移した。

6. 上記の試験管を琥珀色の遮蔽バイアルびん中で光に
対して保護して５分間静置させた。

7. 溶液の色を、直ちに検査するか、または反応停止溶
液（200μｌ）を加えて反応を停止させてから検査し
た。溶液が無色の場合は陰性で、緑色の場合は陽性であ
った。

比較を行いかつ適切な希釈率を確認するために、実施
例１で先に記載した手順にしたがって試験を実施した。
この場合、試料は羊水でそのIGFBP−１の濃度は約20000
0μg/lであり、試験を行う前に1:20,1:100,1:500および
1:2500の希釈率で希釈し、対応して、血清の試料はIGFB
P−１の濃度が＞100μg/lであり、試験を行う前に1:20
の希釈率で希釈した。

測定された代表的な吸光度を以下に示す。 試 料 希釈率 A₄₁₄ 目視製の評価 羊 水 1:20 0.931 ＋ 羊 水 1:100 1.021 ＋ 羊 水 1:500 0.679 ＋ 羊 水 1:2500 0.212 ± 血清１ 1:20 0.044 − 血清２ 1:20 0.049 − 検定緩衝液 0 0.036 − 実施例 ２ ニトロセルローズ帯状体の狭い領域をIGFBP−１抗体
（6305,Medix Biochemica）でコートする。着色したラ
テックス粒子も他のIGFBP−１抗体（6303,Medix Bioche
mica）でコートする。上記のコートされたラテックス粒
子を、抗体の領域を含有する膜の帯状体の他方の末端上
で乾燥させる。IGFBP−１迅速試験を下記の指示にした
がって上記の膜上で実施する。

IGFBP−１膜試験の実施： 1. 緩衝液で希釈した試料の数滴を、ラテックス粒子が
乾燥されている上記帯状体の一部に、ピペットでとお
す。

2. 数分間のインキュベーション中に、試料は膜上を移
行し、ラテックス粒子は液体によって抗体でコートされ
た領域を越えて帯状体の他方の末端に移動する。

3. 帯状体を検査する。着色領域が生成すれば試験結果
は陽性である。

実施例 ３ 小面積のナイロン膜をIGFBP−１抗体（6305,Medix Bi
ochemica）でコートする。そのコートされた膜をプラス
チック製カップ状容器の上に配置し、真下の方に吸収材
（処理されたセルロース）を結合させる。他のIGFBP−
１抗体（6303,Medix Biochemica）を標識酵素（西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、HRP）に結合させる。IGFBP−１
迅速試験を下記の指示にしたがって実施する。

1. 検定緩衝液で希釈した試料の数滴をピペットで膜に
おとして、その溶液を膜を通じて吸収させる。

2. 上記のカップが保有しているのと同等量の洗浄溶液
（約1ml）をピペットでおとし、その溶液を上記の膜を
通じて吸収させる。

3. 標識溶液の数滴をピペットでおとし、その溶液を上
記の膜を通じて吸収させる。

4. 約1mlの洗浄溶液をピペットでおとし、その溶液を
上記の膜を通じて吸収させる。

5. 酵素の沈降基質の数滴をピペットで膜の上におと
し、その溶液を上記の膜を通じて吸収させる。

6. 膜を検査する。着色した領域が生成した場合、試験
結果は陽性である。

本発明の試験法の実施例は、いくつかの免疫測定方法
で例示されている。しかし、本発明の方法は、本発明の
適用範囲から逸脱することなく、上記の説明と後記の請
求の範囲内で変更させることができることは、当業者に
とって明らかなことである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−195848（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／9268（ＷＯ，Ａ) 国際公開90／569（ＷＯ，Ａ) Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏａｓｓａｙ，10 （４），325−37，（1989) Ｃｈｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，164 （３）293−303，（1987)

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】膣分泌物の試料中に存在するタンパク質を
   測定することに基づいた、胎児膜の破裂を検出する方法
   であって、 検出されるタンパク質がインスリン様増殖因子結合タン
   パク質１すなわちIGFBP−１であり、試料中のIGFBP−１
   の濃度が羊水の存在以外の起源由来のIGFBP−１のいき
   値以上の場合にのみ陽性の試験結果が出現するように、
   試験条件を調節することによって、胎児膜の破裂によっ
   てもたらされるIGFBP−１の存在がIGFBP−１の少なくと
   も一つの特異的結合物質で試料中に検出されることを特
   徴とする方法。
2. 【請求項２】使用される特異的結合物質がIGFBP−１に
   対する抗体であることを特徴とする請求の範囲１記載の
   方法。
3. 【請求項３】抗体がモノクローナル抗体であることを特
   徴とする請求の範囲２記載の方法。
4. 【請求項４】測定が、IGFBP−１結合物質および標識を
   つけた別の結合物質でそのシグナルが検出可能な結合物
   質に基づいた試験を用いて行われることを特徴とする請
   求の範囲１〜３のいずれか一つに記載の方法。
5. 【請求項５】膣から採取された試料が、試料中のIGFBP
   −１の濃度を低下させるために、試験を行う前に希釈さ
   れることを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれか一つ
   に記載の方法。
6. 【請求項６】希釈率が少なくとも1:10で、好ましくは1:
   20であることを特徴とする請求の範囲５記載の方法。
7. 【請求項７】標識を付けた試薬を用い、そのシグナル
   は、測定されるIGFBP−１の濃度が充分高い場合にのみ
   陽性の試験結果を与えることを特徴とする請求の範囲1,
   2または３に記載の方法。
8. 【請求項８】請求の範囲１の方法にしたがって胎児膜の
   破裂を検出するための試験キットであって、 該キットが、インスリン様増殖因子結合タンパク質１す
   なわちIGFBP−１の存在を検出するために、IGFBP−１の
   特異的結合物質を含有する少なくとも一つの試薬を備
   え、前記キットは、膣分泌物の試料中のIGFBP−１の濃
   度が羊水の存在以外の起源由来のIGFBP−１のいき値以
   上の場合にのみ陽性のシグナルを与えるよう構成されて
   いることを特徴とする試験キット。
9. 【請求項９】さらに、結合反応を検出する標識を備えて
   いることを特徴とする請求の範囲８記載の試験キット。
10. 【請求項１０】標識が生成するシグナルの感度の範囲
    は、羊水の存在下で高濃度のIGFBP−１がもたらされる
    場合にのみ陽性の試験結果が生じるような方式で調節さ
    れることを特徴とする請求の範囲９記載の試験キット。
11. 【請求項１１】試薬が、IGFBP−１の特異的結合物質と
    して、特異的IGFBP−１抗体を、好ましくはモノクロー
    ナル抗体を含有していることを特徴とする請求の範囲8,
    9または10に記載の試験キット。
12. 【請求項１２】結合反応を検出する標識が、他のIGFBP
    −１結合物質に結合されたシグナル生成物質であること
    を特徴とする請求の範囲９または10に記載の試験キッ
    ト。
13. 【請求項１３】特異的結合物質に基づいた試験が、固相
    もしくは不溶液粒子に結合した結合物質、または結合物
    質の溶液からなることを特徴とする請求の範囲８に記載
    の試験キット。