CN103175968A

CN103175968A - 一种胎膜早破检测试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN103175968A
Application number: CN2011104306192A
Authority: CN
Inventors: 张超; 陈奉玲; 洪莲
Original assignee: ANHUI DEEPBLUE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ANHUI DEEPBLUE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2013-06-26

Abstract

本发明公开了一种胎膜早破检测试剂盒，包括胎膜早破检测试纸条或试纸卡、缓冲液和棉拭子，所述试纸条或试纸卡包括包被有抗人***结合蛋白-1单克隆抗体1的检测区(T)和包被有抗鼠多克隆抗体的质控区(C)及包被有抗人***结合蛋白-1单克隆抗体2的胶体金。上述试剂盒的制备方法包括处理液的配置、试剂盒的制备、胶体金复合物的制备、喷金、切割、组装、切割、包装等步骤。该胎膜早破检测试剂盒特异性好、灵敏度高、检测快速且使用过程无痛苦，可用于家庭自测及床边检验。

Description

一种胎膜早破检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及检测试剂盒领域，更具体地说涉及一种胎膜早破检测试剂盒及制备方法。

背景技术

临产前的胎膜破裂称为胎膜早破(premature rupture of fetal membrane，prom)，是产科的一种常见并发症，其发病率国内报道约为10％。prom并发宫腔感染可导致早产、围生儿死亡，是母儿患病和死亡的重要原因之一。

现有技术中，采用金标准是诊断胎膜早破的一种准确方法，即在孕妇羊膜腔内注入染料(如美蓝)，若***内有被感染着色的液体流出即可诊断为胎膜早破，但采用金标准检测临床很难操作，并且造成患者的痛苦，故临床很少使用。临床上通常采用询问病史、患者自诉***有羊水流出、***分泌物pH值变味偏碱性(正常***分泌物pH为4.5～5.5)、显微镜下查见***分泌物涂片中出现羊水结晶等方法，这些方法虽然操作简单，但准确性、敏感性均较低。

胶体金免疫层析分析是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。层析过程中，金标记物于事先固相化于层析材料：如硝酸纤维素膜即NC膜上的抗原或抗体发生特异性的免疫反应而被截留，进一步富集，形成肉眼可见***条带，从而得到直观的实验结果，达到检测的目的。国际专利PCT/US2003/025125公开了一种采用双抗夹心胶体金免疫层析法检测***分泌物中羊水的装置和方法，其使用的两种单克隆抗体是针对a1-微球蛋白(PAMG-1)的不同抗原表位的。中国专利申请200620083734.1公开了一种一次性胎膜早破pH试纸诊断棒，但其敏感度不高，易引起假阴性。国际专利WO2007030890公开了一种利用ELISA方法检测羊水的方法，该法耗时长，需要操作仪器，对操作人员要求较高。因此亟需一种灵敏度高又便于操作、快捷的新型胎膜早破检测试剂盒。

本发明的发明人通过研究发现，非磷酸化***结合蛋白1(IGFBP-1)是妊娠3个月后直到分娩前羊水中最主要的蛋白质之一，当发生胎膜破裂时，羊水中的IGFBP-1可通过胎膜破口漏出到宫颈***中。且IGFBP-1在羊水中的体积分数比母亲血液中高100～1000倍，宫颈黏液、***和尿液对实验均无影响，检测IGFBP-1诊断prom与孕龄大小无关，对足月及未足月妊娠孕妇具有同样的诊断价值，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、检测快速且对患者无痛苦的胎膜早破检测试剂盒，可用于家庭自测及床边检验。

本发明的另一目的在于提供这种胎膜早破检测试剂盒的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种胎膜早破检测试剂盒，它包括胎膜早破检测试纸、缓冲液和棉拭子，所述检测试纸包括检测区(T)、质控区(C)及胶体金，其特征在于所述检测区(T)包被有抗人***结合蛋白-1单克隆抗体1，所述质控区(C)包被有抗鼠多克隆抗体，所述胶体金包被有抗人***结合蛋白-1单克隆抗体2。

在一个优选的实施方案中，所述检测试纸为试纸条。此时，胎膜早破检测试剂盒包括胎膜早破检测试纸条、缓冲液和棉拭子。其中，所述胎膜早破检测试纸条由下往上依次由浸入区、胶体金、检测区、质控区和手持区组成。

在一个优选的实施方案中，所述检测试纸为试纸卡。此时，胎膜早破检测试剂盒还包括有滴管，即胎膜早破检测试剂盒包括胎膜早破检测试纸卡、缓冲液、棉拭子和滴管。其中，所述胎膜早破检测试纸卡还包括加样孔，即所述胎膜早破检测试纸卡由下往上依次由加样孔、胶体金、检测区、质控区和手持区组成。

一种胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：

(1)处理液的配置步骤：按浓度比例配置金标垫处理液、样品垫处理液、点膜抗体稀释液、标记抗体稀释液和胶体金复合物稀释液；

(2)试剂盒的制备步骤：通过膜材的处理、点膜、胶体金复合物的制备、喷金、膜材的切割、组装、大板的切割和包装步骤得到铝箔袋封装完整的试剂盒。

在点膜配液时，取羊抗鼠多克隆抗体，用PBS稀释成0.5mg/ml的抗体溶液。取***结合蛋白-1单克隆抗体1，用PBS稀释成1.0mg/ml的抗体溶液。

在胶体金复合物的制备过程中，所述胶体金复合物中每1ml胶体金加入5～20μlK₂CO₃，选择能够保持颜色不变的最低的pH值，一般选择1ml胶体金加入15μl1K₂CO₃

在胶体金复合物的制备过程中，所述胶体金复合物中每1ml胶体金结合5～15μg的抗人***结合蛋白-1单克隆抗体2。选择能够保持颜色不变的最小的蛋白量，一般为1ml胶体金结合10μg的蛋白，在实际操作中每1ml胶体金多补加10％的抗体蛋白。

本发明的优点有：(1)能检测出***分泌物中少至1ul的羊水，提前发现临床尚未发觉的微小破膜；(2)该指标诊断prom的灵敏度为98.0％，特异性达100.0％；(3)该试剂盒特异性好、灵敏度高、检测快速且使用对患者无痛苦；(4)操作简单，5分钟即可得到结果，在胎膜早破的临床诊断中具有较高的实用价值，可作为常规检查方法加以推广。

附图说明

图1为胎膜早破检测试纸条结构示意图。

图2为胎膜早破检测试纸条结构示意图。

具体实施方式

下面结合图1对本发明做进一步展开说明，但需要指出的是，本发明的胎膜早破检测试纸条并不限于这种特定的形状或结构。对于本领域技术人员显然可以理解的是，以下的说明内容即使不做任何调整或修正，也可以直接适用于在此未指明的其他类型或结构的试纸条。

图1为胎膜早破检测试纸条结构示意图，包括：其中，浸入区1、胶体金2、检测区3、质控区4、手持区5。在检测区(T)3包被有抗人***结合蛋白-1单克隆抗体1，质控区(C)4包被有抗鼠多克隆抗体，胶体金2包被有抗人***结合蛋白-1单克隆抗体2。

此时，胎膜早破检测试剂盒包括胎膜早破检测试纸条、缓冲液和棉拭子。在使用过程中，应先查看盒中所有物品。在未做好测试准备前，不要提前撕开铝箔袋。使用方法如下：1)将试剂盒内铝箔袋和缓冲液取出在室温下平衡。2)打开铝箔袋，取出检测试纸条，标明被检样品和病人信息。从铝箔袋中取出试纸条后，应在1小时内尽快使用。3)打开缓冲液，竖放在桌面，将采集好标本的***棉拭子放入缓冲液瓶内，在缓冲液中旋转稀释1分钟。4)将试纸条沿箭头方向垂直向下***稀释标本后的缓冲液中。5)待试纸条出现色带时拿出试纸条，试纸条放置桌面，15分钟内读取结果。

可通过检测区和质控区出现的色带情况判断结果如下：1)阳性：在检测区(T)及控制区(C)各出现一条色带，检测结果为阳性。2)阴性：仅在控制区(C)出现一条色带，检测结果为阴性。3)无效：控制区(C)无色带出现，表明试验无效，应重新进行检测。该试剂盒能检测出的人***结合蛋白-1的最低检出量为20ng/ml。

图2为胎膜早破检测试纸卡结构示意图，包括：其中，胶体金2、检测区3、质控区4、手持区5、加样孔6。此种型式的检测试纸仅独立设置了加样孔，这就需要试剂盒中带有滴管，将待测样品溶液滴加至加样孔，其他步骤和结果判断方法同上，再此不做赘述。

胎膜早破检测试剂盒的制备方法，包括处理液的配置和试剂盒的制备两个大步骤，具体步骤明细如下：

1)处理液的配制

A金标垫处理液的配制：Tris-Hcl(10mM，PH＝7.4)+0.5％PVP+0.5％TW-20

B样品垫处理液配制：Tris-Hcl(0.1MPH＝9.0)+1％PVP+1.0％S17+0.8％Casein+0.3％TritonX-100

C点膜抗体稀释液配制：PBS{PB(10mM，PH＝7.4)，0.85％NaCl}

D标记抗体稀释液的配制：PB(10mM，PH＝7.4)

E胶体金复合物稀释液的配制：PB(10mM，PH＝7.4)+20％蔗糖+1％BSA

2)试剂盒的制备

A膜材的处理：

a样品垫的处理：将领用的样品垫(SB08)，用已经配制好的处理液浸泡，充分浸泡后置于烘房烘至湿度降到30％以下就可以收取膜材，收取的膜材要放置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口待用。

b样品垫的处理：将领用的金标垫(KB50)，用已经配制好的处理液浸泡，充分浸泡后置于烘房烘至湿度降到30％以下就可以收取膜材，收取的膜材要放置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口待用。

B点膜：

a配液：取羊抗鼠多克隆抗体，用PBS稀释成0.5mg/ml的抗体溶液。取***结合蛋白-1单克隆抗体1，用PBS稀释成1.0mg/ml的抗体溶液。

b贴膜：领取NC膜和PVC胶板，将NC膜贴于PVC胶板的指定区域。

c点膜：开启点膜喷金仪，设置好对应的参数，点膜浓度为1μl/cm，开始点膜。点好膜的胶板置于37℃烘箱中，烘12个小时，开启除湿机使烘箱所处的环境温度降为30％后即可收取胶板，收取的胶板置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。

C胶体金复合物的制备

a最佳PH值的测定

按上表配制胶体金复合物，选择能够保持颜色不变的最低的PH值，一般选择1ml胶体金+15μlK₂CO₃

b最小蛋白结合量

按上表配制胶体金复合物，选择能够保持颜色不变的最小的蛋白量，一般为1ml胶体金结合10u g的蛋白，在实际操作中每1ml胶体金多补加10％的抗体蛋白。通常，每更换一次胶体金或者抗体，将重新找最佳PH值和最小蛋白结合量。

c胶体金复合物的制备：取一定量的胶体金，加入相应量的0.1MK₂CO₃，在磁力搅拌器上混匀，加入相应量的抗体溶液，磁力搅拌30min，再加入PEG20000使终浓度为0.1％，再磁力搅拌30min，4℃8000r离心40min，弃上清，沉淀用金标稀释液复溶(每20ml胶体金最后浓缩为1ml)。4℃储存备用。

D喷金

a调试：开启喷金仪，取出已处理好的的金标垫，用配制好的胶体金复合物进行喷金，先调试不同的喷金浓度(如2μl/cm、3μl/cm、4μl/cm、5μl/cm)置于37℃烘箱中，烘两个小时，挑选适合的原材料组装成板，最终确定哪种喷金浓度最合适。

b喷金：按照调试的结果用点膜喷金仪进行喷金，喷好后置37℃烘箱中，烘两个小时，开启除湿机使烘箱所处的环境温服降为30％后即可收取金标垫，收取的金标垫置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。

E膜材的切割：领取吸水纸CH27、已处理的样品垫和已喷金的金标垫，开启除湿机，使环境的温度降为30％以下后，按照一定的尺寸进行切割，切割好后的金标垫、样品垫、吸水纸置于不同的铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。

F组装：领取PE膜条和MAX线，开启除湿机，使环境的湿度降为30％以下后取出已切割好的金标垫、样品垫、吸水纸和点过膜的胶板，揭掉金标垫位置的贴条，贴上金标垫，使金标垫少部分压着NC膜，再贴上样品垫，使使样品垫部分压着金标垫，贴上吸水纸，吸水纸少部分压着NC膜，最后贴上PE膜条和MAX线。组装好的胶板置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。

G大板的切割：开启除湿机，使环境的湿度降为30％以下后取出已组装好的大板，再开启切割机，按照一定的尺寸切割，将切割好的试纸条置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。

H内包封口：将试纸条和干燥剂放入铝箔袋内，一个铝箔袋放一个试纸条和干燥剂。按生产日期调整封口机字码，开启封口机，预热至180℃，进行封口。封好后关闭封口机，贴待验证及流动卡，注明品名、批号、规格、生产日期、操作人。入中间站或外包，填写记录。

本发明对于切割试纸的宽度没有任何限制，只要能实现本发明的技术方案即可，通常试纸宽度应不小于2.5mm，以保证液体移行速度应不低于10mm/min。最终胎膜早破检测试剂盒的包装没有任何限制，试剂盒内包装的数量可随机，例如可以为1人份/盒、2人份/盒、3人份/盒、5人份/盒、10人份/盒、20人份/盒、50人份/盒、100人份/盒等等。

实施例

通过采用前述使用方法对本发明的胎膜早破检测试剂盒(***结合蛋白-1检测试剂盒)(胶体金免疫层析法)进行了200例临床样本的验证试验，对照组采用传统的胎膜早破诊断标准，即采用pH试纸检测***分泌物pH＞7或直接镜检***分泌物见到羊齿状结晶及***窥器检查可见少量液体自宫颈口流出为判断标准。结果显示试验产品与对照组无显著性差异，试验产品达到临床诊断金标准结果。

尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和修改，其所产生的功能作用仍未超出说明书及附图所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种胎膜早破检测试剂盒，包括胎膜早破检测试纸、缓冲液和棉拭子，所述检测试纸包括检测区(T)、质控区(C)及胶体金，其特征在于所述检测区(T)包被有抗人***结合蛋白-1单克隆抗体1，所述质控区(C)包被有抗鼠多克隆抗体，所述胶体金包被有抗人***结合蛋白-1单克隆抗体2。

2.如权利要求1所述的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所述检测试纸为试纸条。

3.如权利要求2所述的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所述试纸条由下往上依次由浸入区、胶体金、检测区、质控区和手持区组成。

4.如权利要求1所述的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所述检测试纸为试纸卡。

5.如权利要求4所述的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括滴管。

6.如权利要求4或5所述的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所述试纸卡还包括加样孔，由下往上依次由加样孔、胶体金、检测区、质控区和手持区组成。

7.权利要求1-6任一项胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：

8.如权利要求7所述的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述羊抗鼠多克隆抗体溶液的浓度为0.5mg/ml。

9.如权利要求7所述的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述***结合蛋白-1单克隆抗体1溶液的浓度为0.5mg/ml。

10.如权利要求7所述的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述胶体金复合物中每1ml胶体金加入5～20μlK₂CO₃。

11.如权利要求7所述的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述胶体金复合物中每1ml胶体金结合5～15μg的抗人***结合蛋白-1单克隆抗体2。