JP2565446B2 - カテコールアミン測定方法 - Google Patents
カテコールアミン測定方法Info
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- JP2565446B2 JP2565446B2 JP4073296A JP7329692A JP2565446B2 JP 2565446 B2 JP2565446 B2 JP 2565446B2 JP 4073296 A JP4073296 A JP 4073296A JP 7329692 A JP7329692 A JP 7329692A JP 2565446 B2 JP2565446 B2 JP 2565446B2
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- catecholamine
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はカテコールアミン測定方
法及びその装置、特に発光法を用いた測定方法及び装置
の改良に関する。
法及びその装置、特に発光法を用いた測定方法及び装置
の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】カテコールアミンは神経伝達物質として
生体の恒常性維持に重要な機能を有しており、その生体
内における動態解析が大きな研究課題となっている。し
かしながら、カテコールアミンはその生体内における存
在量が微量であることから、高感度分析法が要望されて
いる。従来のカテコールアミン測定法としては、高速液
体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に電気化学検出器を組
み込んだ測定装置を用い、カテコールを電気化学的に検
出する方法が主に行なわれている。
生体の恒常性維持に重要な機能を有しており、その生体
内における動態解析が大きな研究課題となっている。し
かしながら、カテコールアミンはその生体内における存
在量が微量であることから、高感度分析法が要望されて
いる。従来のカテコールアミン測定法としては、高速液
体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に電気化学検出器を組
み込んだ測定装置を用い、カテコールを電気化学的に検
出する方法が主に行なわれている。
【０００３】しかしながら、この方法では、生体内にお
ける微量カテコールアミンを検出するには感度ならびに
選択性が低く、カテコールアミンの生体内微量変動を捕
えるには不十分であった。
ける微量カテコールアミンを検出するには感度ならびに
選択性が低く、カテコールアミンの生体内微量変動を捕
えるには不十分であった。
【０００４】そこで、このような生体内におけるカテコ
ールアミンの動態解析を行なうため、ラジオアイソトー
プを用いる方法も知られている。しかしながら、このラ
ジオアイソトープを用いる方法は微量分析を可能にする
という点では優れたものであるが、その廃棄物による環
境汚染が問題視されている。さらに、カテコールアミン
をあらかじめ蛍光物質に誘導体化したのち、ＨＰＬＣを
用いて分離し蛍光分析を行なう方法も知られている。
ールアミンの動態解析を行なうため、ラジオアイソトー
プを用いる方法も知られている。しかしながら、このラ
ジオアイソトープを用いる方法は微量分析を可能にする
という点では優れたものであるが、その廃棄物による環
境汚染が問題視されている。さらに、カテコールアミン
をあらかじめ蛍光物質に誘導体化したのち、ＨＰＬＣを
用いて分離し蛍光分析を行なう方法も知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記蛍
光測定法にあっては、内部標準物質に妨害ピークが重な
ることがあり、カテコールアミンの選択的測定に問題を
生じることがあった。本発明は前記従来技術の課題に鑑
がみなされたものであり、その目的は極微量のカテコー
ルアミン等を高感度で測定することのできるカテコール
アミン測定方法及び装置を提供することにある。
光測定法にあっては、内部標準物質に妨害ピークが重な
ることがあり、カテコールアミンの選択的測定に問題を
生じることがあった。本発明は前記従来技術の課題に鑑
がみなされたものであり、その目的は極微量のカテコー
ルアミン等を高感度で測定することのできるカテコール
アミン測定方法及び装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に本発明者らが鋭意検討した結果、カテコールアミンを
蛍光物質としたのち、ＴＤＰＯと過酸化水素と酸を含む
発光試薬に混合することにより、カテコールアミン濃度
に比例しかつ安定した発光が得られることを見出し、本
発明を完成するにいたった。
に本発明者らが鋭意検討した結果、カテコールアミンを
蛍光物質としたのち、ＴＤＰＯと過酸化水素と酸を含む
発光試薬に混合することにより、カテコールアミン濃度
に比例しかつ安定した発光が得られることを見出し、本
発明を完成するにいたった。
【０００７】すなわち、本出願の請求項１記載のカテコ
ールアミン測定方法は、カテコールアミンを含む被測定
液にエチレンジアミンを含む蛍光試薬を混合する蛍光試
薬混合工程と、得られた蛍光試薬混合液を加熱すること
によってカテコールアミンを蛍光物質に変換する蛍光物
質生成工程と、蛍光物質混合液にビス［４−ニトロ−２
−（３，６，９−トリオキサデシルオキシカルボニル）
フェニル］オキサレート（ＴＤＰＯ）と過酸化水素と酸
を含む発光試薬を混合する発光試薬混合工程と、前記発
光試薬混合液により生成する発光の強度を測定する発光
強度測定工程と、を含むことを特徴とする。
ールアミン測定方法は、カテコールアミンを含む被測定
液にエチレンジアミンを含む蛍光試薬を混合する蛍光試
薬混合工程と、得られた蛍光試薬混合液を加熱すること
によってカテコールアミンを蛍光物質に変換する蛍光物
質生成工程と、蛍光物質混合液にビス［４−ニトロ−２
−（３，６，９−トリオキサデシルオキシカルボニル）
フェニル］オキサレート（ＴＤＰＯ）と過酸化水素と酸
を含む発光試薬を混合する発光試薬混合工程と、前記発
光試薬混合液により生成する発光の強度を測定する発光
強度測定工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】なお、液体クロマトグラフィーを用いてカ
テコールアミンを分離する場合の、移動相を構成する緩
衝液としてはｐＨ３付近の酢酸緩衝液を用いることが好
適である。また、エチレンジアミンを溶解する溶媒とし
てアセトニトリルとエタノールとの混合溶媒を用いるこ
とが好適である。また、ＴＤＰＯと過酸化水素水と酸を
溶解する溶媒としてジオキサンと酢酸エチルとの混合溶
媒を用いることが好適である。また、発光試薬中に用い
られる酸としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いるこ
とが好適である。
テコールアミンを分離する場合の、移動相を構成する緩
衝液としてはｐＨ３付近の酢酸緩衝液を用いることが好
適である。また、エチレンジアミンを溶解する溶媒とし
てアセトニトリルとエタノールとの混合溶媒を用いるこ
とが好適である。また、ＴＤＰＯと過酸化水素水と酸を
溶解する溶媒としてジオキサンと酢酸エチルとの混合溶
媒を用いることが好適である。また、発光試薬中に用い
られる酸としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いるこ
とが好適である。
【０００９】また、イミダゾールをあらかじめ蛍光試薬
に溶解させ、後の発光反応を測定することが特徴であ
る。また、発光試薬溶液に溶解する過酸化水素の濃度を
従来法（１２．５ｍＭ）より４倍以上にして用いること
が好適である。
に溶解させ、後の発光反応を測定することが特徴であ
る。また、発光試薬溶液に溶解する過酸化水素の濃度を
従来法（１２．５ｍＭ）より４倍以上にして用いること
が好適である。
【００１０】また、前記ＴＤＰＯの代わりに、例えばビ
ス−（２、４、６−トリクロロフェニル）オキサレート
等のシュウ酸エステルを用いることも好適である。
ス−（２、４、６−トリクロロフェニル）オキサレート
等のシュウ酸エステルを用いることも好適である。
【００１１】
【実施例】以下、図面に基づき本発明の好適な実施例を
説明する。図１には本発明の一実施例にかかるカテコー
ルアミン測定装置が示されている。同図に示す測定装置
は、カテコールアミン分離手段１０と、蛍光試薬混合手
段１２と、加熱手段１４と、発光試薬混合手段１６と、
発光検出手段１８とを含む。
説明する。図１には本発明の一実施例にかかるカテコー
ルアミン測定装置が示されている。同図に示す測定装置
は、カテコールアミン分離手段１０と、蛍光試薬混合手
段１２と、加熱手段１４と、発光試薬混合手段１６と、
発光検出手段１８とを含む。
【００１２】前記カテコールアミン分離手段１０は、移
動相タンク２０よりポンプ２２が移動相を構成する緩衝
液を送出する。この移動相中に、インジェクター２４よ
り各種カテコールアミンを含む被測定試料が注入され、
分離カラム２６により各種カテコールアミンが分離され
る。なお、分離カラム２６はＣａｔｅｃｈｏｌｐａｋ
（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）よりなり、カラムオーブン
２８により４０℃に維持されている。
動相タンク２０よりポンプ２２が移動相を構成する緩衝
液を送出する。この移動相中に、インジェクター２４よ
り各種カテコールアミンを含む被測定試料が注入され、
分離カラム２６により各種カテコールアミンが分離され
る。なお、分離カラム２６はＣａｔｅｃｈｏｌｐａｋ
（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）よりなり、カラムオーブン
２８により４０℃に維持されている。
【００１３】蛍光試薬混合手段１２は、蛍光試薬溶液が
貯留された蛍光試薬貯留タンク３０より、ポンプ３２に
より蛍光試薬が順次一定量ずつ送出され、前記分離カラ
ム２６からの溶出液に連続的に混合される。加熱手段１
４は前記蛍光試薬と溶出液との混合液が導通する反応コ
イル３４と、該反応コイル３４を一定温度（８０℃）に
維持する循環恒温槽３６とよりなる。発光試薬混合手段
１６は、発光試薬貯留タンク３８とポンプ４０よりな
り、発光試薬貯留槽３８からポンプ４０が発光試薬溶液
を順次一定量ずつ送出し、前記反応コイル３４より流出
する蛍光物質混合液に発光試薬を一定量づつ連続的に混
合する。
貯留された蛍光試薬貯留タンク３０より、ポンプ３２に
より蛍光試薬が順次一定量ずつ送出され、前記分離カラ
ム２６からの溶出液に連続的に混合される。加熱手段１
４は前記蛍光試薬と溶出液との混合液が導通する反応コ
イル３４と、該反応コイル３４を一定温度（８０℃）に
維持する循環恒温槽３６とよりなる。発光試薬混合手段
１６は、発光試薬貯留タンク３８とポンプ４０よりな
り、発光試薬貯留槽３８からポンプ４０が発光試薬溶液
を順次一定量ずつ送出し、前記反応コイル３４より流出
する蛍光物質混合液に発光試薬を一定量づつ連続的に混
合する。
【００１４】発光検出手段１８は、発光試薬混合液より
の発光量を測定している。また、インテグレータ４２
は、発光検出手段１８からの信号を処理してカテコール
アミンの定量を行う。本実施例にかかるカテコールアミ
ン測定装置は概略以上のように構成され、次にその作用
について説明する。まず、本実施例において移動相とし
てはｐＨ３付近の酢酸緩衝液を用いている。通常、カテ
コールアミンの分離にはｐＨ３付近のリン酸緩衝液が使
用されるが、このリン酸緩衝液は前記発光試薬との混合
後にリン酸塩を析出する。このため、種々の緩衝液を検
討した結果、酢酸緩衝液が最適であると確認した。
の発光量を測定している。また、インテグレータ４２
は、発光検出手段１８からの信号を処理してカテコール
アミンの定量を行う。本実施例にかかるカテコールアミ
ン測定装置は概略以上のように構成され、次にその作用
について説明する。まず、本実施例において移動相とし
てはｐＨ３付近の酢酸緩衝液を用いている。通常、カテ
コールアミンの分離にはｐＨ３付近のリン酸緩衝液が使
用されるが、このリン酸緩衝液は前記発光試薬との混合
後にリン酸塩を析出する。このため、種々の緩衝液を検
討した結果、酢酸緩衝液が最適であると確認した。
【００１５】また、本実施例においては蛍光試薬として
用いるエチレンジアミンを溶解する溶媒として、アセト
ニトリルとエタノールとの混合溶媒を用いている。従
来、エチレンジアミンは水に溶解して用いられていた
が、発光反応に入る前の発光試薬混合液は、有機溶媒を
多く含む方が高い発光強度が得られるため、エチレンジ
アミンを溶解するための溶媒系を検討した結果、アセト
ニトリル／エタノール（９０／１０）が最適であること
を確認した。
用いるエチレンジアミンを溶解する溶媒として、アセト
ニトリルとエタノールとの混合溶媒を用いている。従
来、エチレンジアミンは水に溶解して用いられていた
が、発光反応に入る前の発光試薬混合液は、有機溶媒を
多く含む方が高い発光強度が得られるため、エチレンジ
アミンを溶解するための溶媒系を検討した結果、アセト
ニトリル／エタノール（９０／１０）が最適であること
を確認した。
【００１６】また、本実施例においては発光試薬として
ＴＤＰＯと過酸化水素及び酸を用いている。このＴＤＰ
Ｏを溶解するための溶媒としては、通常アセトニトリル
／酢酸エチル（５０／５０）の混合溶媒が用いられてき
たが、この混合溶媒では最終反応混合液が二層になるた
めベースラインのノイズが大きくなるという欠点があっ
た。そこで、本発明者らが種々の溶媒系を検討した結
果、ＴＤＰＯの溶媒としてジオキサン／酢酸エチル（５
０／５０）の混合溶媒が最適であることを確認した。
ＴＤＰＯと過酸化水素及び酸を用いている。このＴＤＰ
Ｏを溶解するための溶媒としては、通常アセトニトリル
／酢酸エチル（５０／５０）の混合溶媒が用いられてき
たが、この混合溶媒では最終反応混合液が二層になるた
めベースラインのノイズが大きくなるという欠点があっ
た。そこで、本発明者らが種々の溶媒系を検討した結
果、ＴＤＰＯの溶媒としてジオキサン／酢酸エチル（５
０／５０）の混合溶媒が最適であることを確認した。
【００１７】なお、カテコールアミンとエチレンジアミ
ンとの反応による蛍光物質生成反応は、最適ｐＨが８〜
９である。これに対し、発光反応に於ける最適ｐＨは６
〜７であり、このため蛍光物質生成後発光反応前にｐＨ
調整が必要となる。そこで、本発明者らがｐＨ調整のた
めの酸を種々検討した結果、ＴＦＡを発光試薬溶液に溶
解し、発光試薬と一緒に送液することとした。通常、ｐ
Ｈ調整のためには別途一台のポンプを用いてｐＨ調整液
を送液するが、この場合には混合の不完全さに由来する
と思われるベースラインの変動が生じる。しかしなが
ら、前述したようにＴＦＡを発光試薬溶液に溶解し、発
光試薬と一緒に送液することにより、ベースラインの変
動を解消すると共にｐＨ調整液の送液用ポンプも不要と
なった。
ンとの反応による蛍光物質生成反応は、最適ｐＨが８〜
９である。これに対し、発光反応に於ける最適ｐＨは６
〜７であり、このため蛍光物質生成後発光反応前にｐＨ
調整が必要となる。そこで、本発明者らがｐＨ調整のた
めの酸を種々検討した結果、ＴＦＡを発光試薬溶液に溶
解し、発光試薬と一緒に送液することとした。通常、ｐ
Ｈ調整のためには別途一台のポンプを用いてｐＨ調整液
を送液するが、この場合には混合の不完全さに由来する
と思われるベースラインの変動が生じる。しかしなが
ら、前述したようにＴＦＡを発光試薬溶液に溶解し、発
光試薬と一緒に送液することにより、ベースラインの変
動を解消すると共にｐＨ調整液の送液用ポンプも不要と
なった。
【００１８】なお、ＴＤＰＯによる発光反応を促進する
ために、蛍光試薬溶液にあらかじめイミダゾールを溶解
して用いたところ、イミダゾールを用いない場合に比較
して感度が５倍ほど上昇した。また、ＴＤＰＯによる発
光反応を促進するために、発光試薬溶液に溶解する過酸
化水素の濃度を従来法（１２．５ｍＭ）の４倍以上にし
て用いたところ、従来法の濃度を用いた場合に比較して
感度が５倍以上上昇した。
ために、蛍光試薬溶液にあらかじめイミダゾールを溶解
して用いたところ、イミダゾールを用いない場合に比較
して感度が５倍ほど上昇した。また、ＴＤＰＯによる発
光反応を促進するために、発光試薬溶液に溶解する過酸
化水素の濃度を従来法（１２．５ｍＭ）の４倍以上にし
て用いたところ、従来法の濃度を用いた場合に比較して
感度が５倍以上上昇した。
【００１９】また、本実施例において発光検出手段１８
内のホトマルチプライヤーとフローセルとの間にカット
フィルターの一つであるＹ−４６（４６０ｎｍでの透過
率は５０％で、それより長い波長の光を透過する。）を
配置することにより、カテコールアミンに由来する発光
の検出に影響を与えることなく、測定に用いた試薬の不
純物に由来する発光の影響を減少させることが可能とな
った。なお、前記カットフィルターを用いることによ
り、ベースラインのノイズが小さくなり、カットフィル
ターを用いない場合に比較して２倍ほど感度が上昇し
た。
内のホトマルチプライヤーとフローセルとの間にカット
フィルターの一つであるＹ−４６（４６０ｎｍでの透過
率は５０％で、それより長い波長の光を透過する。）を
配置することにより、カテコールアミンに由来する発光
の検出に影響を与えることなく、測定に用いた試薬の不
純物に由来する発光の影響を減少させることが可能とな
った。なお、前記カットフィルターを用いることによ
り、ベースラインのノイズが小さくなり、カットフィル
ターを用いない場合に比較して２倍ほど感度が上昇し
た。
【００２０】次に具体的なカテコールアミンの測定例に
ついて示す。１ｐｍｏｌの各種カテコールアミン（Ｎ
Ｅ：ノルエピネフリン、Ｅ：ネピネフリン、ＤＡ：ドー
パミン）と内部標準（Ｉ．ＳＴＤ）として１００ｐｍｏ
ｌの３，４−ジヒドロキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）
を含む被測定液を、次に示す測定条件により測定した。測定条件 溶離液 ：［５０ｍＭ Ｋ＋ Ａｃｅｔａｔｅ
（ｐＨ３．２０）／５０ｍＭ Ｋ＋ Ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ（ｐＨ３．２０）（９５／５）＋ １ｍＭＳｏｄｉｕ
ｍ Ｈｅｘａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ］／ＣＨ３ＣＮ
（９７／３） 流量 ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ カラム ：Ｃａｔｅｃｈｏｌｐａｋ（１５０ｍ
ｍ× ４．６ｍｍ） カラム温度 ：４０℃ 蛍光試薬溶液 ：［１０５ｍＭ ＥＤ ＋ １７５ｍ
Ｍ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］ｉｎ ＣＨ３ＣＮ／ＥｔＯＨ
（９０／１０） 流量 ：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ 反応コイル ：０．５ｍｍ× １５ｍ 反応温度 ：８０℃ 発光試薬溶液 ：０．２５ｍＭ ＴＤＰＯ＋ １５０
ｍＭ Ｈ２Ｏ２ ＋１１０ｍＭ ＴＦＡ ｉｎ Ｄｉｏｘａｎｅ／Ｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｔｅ
（５０／５０） 流量 ：１．４ｍｌ／ｍｉｎ
ついて示す。１ｐｍｏｌの各種カテコールアミン（Ｎ
Ｅ：ノルエピネフリン、Ｅ：ネピネフリン、ＤＡ：ドー
パミン）と内部標準（Ｉ．ＳＴＤ）として１００ｐｍｏ
ｌの３，４−ジヒドロキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）
を含む被測定液を、次に示す測定条件により測定した。測定条件 溶離液 ：［５０ｍＭ Ｋ＋ Ａｃｅｔａｔｅ
（ｐＨ３．２０）／５０ｍＭ Ｋ＋ Ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ（ｐＨ３．２０）（９５／５）＋ １ｍＭＳｏｄｉｕ
ｍ Ｈｅｘａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ］／ＣＨ３ＣＮ
（９７／３） 流量 ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ カラム ：Ｃａｔｅｃｈｏｌｐａｋ（１５０ｍ
ｍ× ４．６ｍｍ） カラム温度 ：４０℃ 蛍光試薬溶液 ：［１０５ｍＭ ＥＤ ＋ １７５ｍ
Ｍ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］ｉｎ ＣＨ３ＣＮ／ＥｔＯＨ
（９０／１０） 流量 ：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ 反応コイル ：０．５ｍｍ× １５ｍ 反応温度 ：８０℃ 発光試薬溶液 ：０．２５ｍＭ ＴＤＰＯ＋ １５０
ｍＭ Ｈ２Ｏ２ ＋１１０ｍＭ ＴＦＡ ｉｎ Ｄｉｏｘａｎｅ／Ｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｔｅ
（５０／５０） 流量 ：１．４ｍｌ／ｍｉｎ
【００２１】この結果、図２に示すように各カテコール
アミンが極めて高感度に検出された。尚、図２の各ピー
ク下部にはインテグレータ４２がクロマトグラムを定量
する際のベースラインが現れている。次に、本実施例に
かかる測定装置を用いてラット血漿中のカテコールアミ
ンを測定した。なお測定条件は前記同様とし、ラット血
漿の前処理は以下のように血漿中のカテコールアミンを
アルミナに吸着させ、過塩素酸でカテコールアミンを脱
着させる方法を用いた。ラット血漿の前処理 血漿（１００μｌ） （ａ） アルミナ（５ ｍｇ） （ｂ） 内部標準（ＤＨＢＡ， ２００ｐｍｏｌ／１０
μｌ） （ｃ） トリス塩酸緩衝液（１．５Ｍ， ｐＨ ８．
７， １００μｌ） 攪拌（１０分） 遠心（１分，８０００ｒｐｍ） アルミナ 水洗（０．５ｍｌ × ２） アルミナ ０．１Ｍ 過塩素酸（１００ｕｌ） 遠心（１分， ８０００ｒｐｍ） 注入（５０μｌ）
アミンが極めて高感度に検出された。尚、図２の各ピー
ク下部にはインテグレータ４２がクロマトグラムを定量
する際のベースラインが現れている。次に、本実施例に
かかる測定装置を用いてラット血漿中のカテコールアミ
ンを測定した。なお測定条件は前記同様とし、ラット血
漿の前処理は以下のように血漿中のカテコールアミンを
アルミナに吸着させ、過塩素酸でカテコールアミンを脱
着させる方法を用いた。ラット血漿の前処理 血漿（１００μｌ） （ａ） アルミナ（５ ｍｇ） （ｂ） 内部標準（ＤＨＢＡ， ２００ｐｍｏｌ／１０
μｌ） （ｃ） トリス塩酸緩衝液（１．５Ｍ， ｐＨ ８．
７， １００μｌ） 攪拌（１０分） 遠心（１分，８０００ｒｐｍ） アルミナ 水洗（０．５ｍｌ × ２） アルミナ ０．１Ｍ 過塩素酸（１００ｕｌ） 遠心（１分， ８０００ｒｐｍ） 注入（５０μｌ）
【００２２】図３に得られたクロマトグラムを示す。
尚、図３においても、各ピーク下部にベースラインが現
れている。同図より明かなように、各カテコールアミン
は明瞭に分離され、しかもベースラインの変動なども小
さく、極めて高感度のカテコールアミン検出が可能とな
ったことが示される。
尚、図３においても、各ピーク下部にベースラインが現
れている。同図より明かなように、各カテコールアミン
は明瞭に分離され、しかもベースラインの変動なども小
さく、極めて高感度のカテコールアミン検出が可能とな
ったことが示される。
【００２３】
【発明の効果】以上説明したように本発明にかかるカテ
コールアミン測定方法によれば、カテコールアミンを蛍
光物質に変換し、該蛍光物質とＴＤＰＯ、過酸化水素及
び酸を用いて発光させることとしたので、カテコールア
ミンを極めて高感度で測定することが可能となる。ま
た、本発明にかかる発光測定装置によれば、カテコール
アミン等を含む溶出液に蛍光試薬を加えて蛍光物質を形
成し更に発光試薬を加えてその発光を検出することとし
たので、カテコールアミンなどの微量成分を連続的にか
つ高感度に測定することが可能となる。
コールアミン測定方法によれば、カテコールアミンを蛍
光物質に変換し、該蛍光物質とＴＤＰＯ、過酸化水素及
び酸を用いて発光させることとしたので、カテコールア
ミンを極めて高感度で測定することが可能となる。ま
た、本発明にかかる発光測定装置によれば、カテコール
アミン等を含む溶出液に蛍光試薬を加えて蛍光物質を形
成し更に発光試薬を加えてその発光を検出することとし
たので、カテコールアミンなどの微量成分を連続的にか
つ高感度に測定することが可能となる。
【図１】本発明の一実施例にかかるカテコールアミン測
定装置の概略構成の説明図である。
定装置の概略構成の説明図である。
【図２】，
【図３】図１に示した測定装置を用いて実際のカテコー
ルアミンの測定を行なった結果を示すクロマトグラムで
ある。
ルアミンの測定を行なった結果を示すクロマトグラムで
ある。
１０ カテコールアミン分離手段 １２ 蛍光試薬混合手段 １４ 加熱手段 １６ 発光試薬混合手段 １８ 発光検出手段
Claims (7)
- 【請求項１】 カテコールアミンを含む被測定液にエチ
レンジアミンを含む蛍光試薬を混合する蛍光試薬混合工
程と、 前記蛍光試薬混合液を加熱し、各カテコールアミンを蛍
光物質に変換する蛍光物質生成工程と、 前記蛍光物質混合液に、ビス［４−ニトロ−２−（３，
６，９−トリオキサデシルオキシカルボニル）フェニ
ル］オキサレート（ＴＤＰＯ）などのシュウ酸エステル
と過酸化水素と酸とを含む発光試薬溶液を混合する発光
試薬混合工程と、 前記発光試薬混合液から生成する発光の強度を測定する
発光強度測定工程と、を備えたことを特徴とするカテコ
ールアミン測定方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法において、液体クロ
マトグラフィーを用いてカテコールアミンを分離して被
測定液を得、該液体クロマトグラフィーにおいてカテコ
ールアミンを分離するための移動相を構成する緩衝液と
してｐＨ３付近の酢酸緩衝液を用いることを特徴とする
カテコールアミン測定方法。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の方法において、エ
チレンジアミンを溶解する溶媒としてアセトニトリルと
エタノールとの混合溶媒を用いることを特徴とするカテ
コールアミン測定方法。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の方法に
おいて、ＴＤＰＯと過酸化水素と酸とを溶解する溶媒と
して、ジオキサンと酢酸エチルとの混合溶媒を用いるこ
とを特徴とするカテコールアミン測定方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４記載の方法において、発光
試薬とともに用いられる酸としてトリフルオロ酢酸を用
いることを特徴とするカテコールアミン測定方法。 - 【請求項６】 請求項１〜５記載の方法において、蛍光
試薬溶液にイミダゾールを溶解しておくことを特徴とす
るカテコールアミン測定方法。 - 【請求項７】 請求項１〜６記載の方法において、発光
試薬溶液に溶解する過酸化水素の濃度を５０ｍＭ以上に
して用いることを特徴とするカテコールアミン測定方
法。
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|---|---|---|---|
| JP4073296A JP2565446B2 (ja) | 1992-02-25 | 1992-02-25 | カテコールアミン測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4073296A JP2565446B2 (ja) | 1992-02-25 | 1992-02-25 | カテコールアミン測定方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05232026A JPH05232026A (ja) | 1993-09-07 |
| JP2565446B2 true JP2565446B2 (ja) | 1996-12-18 |
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ID=13514063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP2565446B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Family Cites Families (2)
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| JPS60205262A (ja) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | １，２−ジフエニルエチレンジアミンを用いるカテコ−ルアミンの定量方法 |
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-
1992
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| JPH05232026A (ja) | 1993-09-07 |
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