JP2565446B2 - Catecholamine measurement method - Google Patents
Catecholamine measurement methodInfo
- Publication number
- JP2565446B2 JP2565446B2 JP4073296A JP7329692A JP2565446B2 JP 2565446 B2 JP2565446 B2 JP 2565446B2 JP 4073296 A JP4073296 A JP 4073296A JP 7329692 A JP7329692 A JP 7329692A JP 2565446 B2 JP2565446 B2 JP 2565446B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- catecholamine
- measuring
- reagent
- solution
- fluorescent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はカテコールアミン測定方
法及びその装置、特に発光法を用いた測定方法及び装置
の改良に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method and an apparatus for measuring catecholamine, and more particularly to an improvement of the measuring method and apparatus using a luminescence method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】カテコールアミンは神経伝達物質として
生体の恒常性維持に重要な機能を有しており、その生体
内における動態解析が大きな研究課題となっている。し
かしながら、カテコールアミンはその生体内における存
在量が微量であることから、高感度分析法が要望されて
いる。従来のカテコールアミン測定法としては、高速液
体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に電気化学検出器を組
み込んだ測定装置を用い、カテコールを電気化学的に検
出する方法が主に行なわれている。2. Description of the Related Art Catecholamine has an important function as a neurotransmitter for maintaining homeostasis in a living body, and its dynamic analysis in the living body has become a major research subject. However, since the amount of catecholamine present in the living body is very small, a highly sensitive analytical method has been demanded. As a conventional catecholamine measuring method, a method of electrochemically detecting catechol using a measuring device in which an electrochemical detector is incorporated in high performance liquid chromatography (HPLC) is mainly used.
【０００３】しかしながら、この方法では、生体内にお
ける微量カテコールアミンを検出するには感度ならびに
選択性が低く、カテコールアミンの生体内微量変動を捕
えるには不十分であった。However, this method has low sensitivity and selectivity for detecting a trace amount of catecholamine in the living body, and is insufficient to catch the trace amount variation of catecholamine in the living body.
【０００４】そこで、このような生体内におけるカテコ
ールアミンの動態解析を行なうため、ラジオアイソトー
プを用いる方法も知られている。しかしながら、このラ
ジオアイソトープを用いる方法は微量分析を可能にする
という点では優れたものであるが、その廃棄物による環
境汚染が問題視されている。さらに、カテコールアミン
をあらかじめ蛍光物質に誘導体化したのち、ＨＰＬＣを
用いて分離し蛍光分析を行なう方法も知られている。Therefore, a method using a radioisotope is also known in order to analyze the dynamics of catecholamines in the living body. However, although the method using this radioisotope is excellent in that it enables microanalysis, environmental pollution due to its waste is regarded as a problem. Furthermore, a method is also known in which catecholamine is derivatized with a fluorescent substance in advance and then separated using HPLC to perform fluorescence analysis.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記蛍
光測定法にあっては、内部標準物質に妨害ピークが重な
ることがあり、カテコールアミンの選択的測定に問題を
生じることがあった。本発明は前記従来技術の課題に鑑
がみなされたものであり、その目的は極微量のカテコー
ルアミン等を高感度で測定することのできるカテコール
アミン測定方法及び装置を提供することにある。However, in the above-mentioned fluorescence measuring method, interference peaks may overlap with the internal standard substance, which may cause a problem in the selective measurement of catecholamines. The present invention has been made in view of the above problems of the prior art, and an object thereof is to provide a catecholamine measuring method and apparatus capable of measuring an extremely small amount of catecholamine and the like with high sensitivity.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に本発明者らが鋭意検討した結果、カテコールアミンを
蛍光物質としたのち、ＴＤＰＯと過酸化水素と酸を含む
発光試薬に混合することにより、カテコールアミン濃度
に比例しかつ安定した発光が得られることを見出し、本
発明を完成するにいたった。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies by the present inventors in order to achieve the above-mentioned object, it was found that catecholamine was used as a fluorescent substance and then mixed with a luminescent reagent containing TDPO, hydrogen peroxide and an acid. The inventors have found that stable luminescence is obtained in proportion to the catecholamine concentration, and have completed the present invention.
【０００７】すなわち、本出願の請求項１記載のカテコ
ールアミン測定方法は、カテコールアミンを含む被測定
液にエチレンジアミンを含む蛍光試薬を混合する蛍光試
薬混合工程と、得られた蛍光試薬混合液を加熱すること
によってカテコールアミンを蛍光物質に変換する蛍光物
質生成工程と、蛍光物質混合液にビス［４−ニトロ−２
−（３，６，９−トリオキサデシルオキシカルボニル）
フェニル］オキサレート（ＴＤＰＯ）と過酸化水素と酸
を含む発光試薬を混合する発光試薬混合工程と、前記発
光試薬混合液により生成する発光の強度を測定する発光
強度測定工程と、を含むことを特徴とする。That is, the catecholamine measuring method according to claim 1 of the present application comprises the step of mixing a fluorescent reagent containing ethylenediamine with a fluorescent reagent containing ethylenediamine, and heating the obtained fluorescent reagent mixture. And a bis [4-nitro-2
-(3,6,9-trioxadecyloxycarbonyl)
A luminescence reagent mixing step of mixing a luminescence reagent containing phenyl] oxalate (TDPO), hydrogen peroxide and an acid; and a luminescence intensity measuring step of measuring the intensity of luminescence generated by the luminescence reagent mixed solution. And
【０００８】なお、液体クロマトグラフィーを用いてカ
テコールアミンを分離する場合の、移動相を構成する緩
衝液としてはｐＨ３付近の酢酸緩衝液を用いることが好
適である。また、エチレンジアミンを溶解する溶媒とし
てアセトニトリルとエタノールとの混合溶媒を用いるこ
とが好適である。また、ＴＤＰＯと過酸化水素水と酸を
溶解する溶媒としてジオキサンと酢酸エチルとの混合溶
媒を用いることが好適である。また、発光試薬中に用い
られる酸としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いるこ
とが好適である。When the catecholamines are separated by liquid chromatography, it is preferable to use an acetic acid buffer solution having a pH of about 3 as the buffer solution constituting the mobile phase. Further, it is preferable to use a mixed solvent of acetonitrile and ethanol as a solvent for dissolving ethylenediamine. Further, it is preferable to use a mixed solvent of dioxane and ethyl acetate as a solvent for dissolving TDPO, hydrogen peroxide solution and acid. In addition, it is preferable to use trifluoroacetic acid (TFA) as the acid used in the luminescent reagent.
【０００９】また、イミダゾールをあらかじめ蛍光試薬
に溶解させ、後の発光反応を測定することが特徴であ
る。また、発光試薬溶液に溶解する過酸化水素の濃度を
従来法（１２．５ｍＭ）より４倍以上にして用いること
が好適である。Further, it is characterized in that imidazole is previously dissolved in a fluorescent reagent and the subsequent luminescence reaction is measured. It is also preferable to use the concentration of hydrogen peroxide dissolved in the luminescence reagent solution at 4 times or more that of the conventional method (12.5 mM).
【００１０】また、前記ＴＤＰＯの代わりに、例えばビ
ス−（２、４、６−トリクロロフェニル）オキサレート
等のシュウ酸エステルを用いることも好適である。It is also preferable to use oxalic acid ester such as bis- (2,4,6-trichlorophenyl) oxalate instead of the TDPO.
【００１１】[0011]
【実施例】以下、図面に基づき本発明の好適な実施例を
説明する。図１には本発明の一実施例にかかるカテコー
ルアミン測定装置が示されている。同図に示す測定装置
は、カテコールアミン分離手段１０と、蛍光試薬混合手
段１２と、加熱手段１４と、発光試薬混合手段１６と、
発光検出手段１８とを含む。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Preferred embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. FIG. 1 shows a catecholamine measuring apparatus according to an embodiment of the present invention. The measuring device shown in the figure comprises a catecholamine separating means 10, a fluorescent reagent mixing means 12, a heating means 14, a luminescent reagent mixing means 16,
The light emission detection means 18 is included.
【００１２】前記カテコールアミン分離手段１０は、移
動相タンク２０よりポンプ２２が移動相を構成する緩衝
液を送出する。この移動相中に、インジェクター２４よ
り各種カテコールアミンを含む被測定試料が注入され、
分離カラム２６により各種カテコールアミンが分離され
る。なお、分離カラム２６はＣａｔｅｃｈｏｌｐａｋ
（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）よりなり、カラムオーブン
２８により４０℃に維持されている。In the catecholamine separating means 10, the pump 22 delivers the buffer solution constituting the mobile phase from the mobile phase tank 20. A sample to be measured containing various catecholamines was injected from the injector 24 into the mobile phase,
Various catecholamines are separated by the separation column 26. The separation column 26 is a Catcholpack.
(150 mm × 4.6 mm) and maintained at 40 ° C. by the column oven 28.
【００１３】蛍光試薬混合手段１２は、蛍光試薬溶液が
貯留された蛍光試薬貯留タンク３０より、ポンプ３２に
より蛍光試薬が順次一定量ずつ送出され、前記分離カラ
ム２６からの溶出液に連続的に混合される。加熱手段１
４は前記蛍光試薬と溶出液との混合液が導通する反応コ
イル３４と、該反応コイル３４を一定温度（８０℃）に
維持する循環恒温槽３６とよりなる。発光試薬混合手段
１６は、発光試薬貯留タンク３８とポンプ４０よりな
り、発光試薬貯留槽３８からポンプ４０が発光試薬溶液
を順次一定量ずつ送出し、前記反応コイル３４より流出
する蛍光物質混合液に発光試薬を一定量づつ連続的に混
合する。In the fluorescent reagent mixing means 12, a constant amount of the fluorescent reagent is sequentially delivered by the pump 32 from the fluorescent reagent storage tank 30 in which the fluorescent reagent solution is stored, and the eluate from the separation column 26 is continuously supplied. Mixed. Heating means 1
Reference numeral 4 is composed of a reaction coil 34 through which the mixed liquid of the fluorescent reagent and the eluate is conducted, and a circulation thermostatic bath 36 for maintaining the reaction coil 34 at a constant temperature (80 ° C.). The luminescent reagent mixing means 16 comprises a luminescent reagent storage tank 38 and a pump 40, and the pump 40 sequentially delivers a fixed amount of the luminescent reagent solution from the luminescent reagent storage tank 38 into a fluorescent substance mixed solution flowing out from the reaction coil 34. The luminescent reagent is continuously mixed in fixed amounts.
【００１４】発光検出手段１８は、発光試薬混合液より
の発光量を測定している。また、インテグレータ４２
は、発光検出手段１８からの信号を処理してカテコール
アミンの定量を行う。本実施例にかかるカテコールアミ
ン測定装置は概略以上のように構成され、次にその作用
について説明する。まず、本実施例において移動相とし
てはｐＨ３付近の酢酸緩衝液を用いている。通常、カテ
コールアミンの分離にはｐＨ３付近のリン酸緩衝液が使
用されるが、このリン酸緩衝液は前記発光試薬との混合
後にリン酸塩を析出する。このため、種々の緩衝液を検
討した結果、酢酸緩衝液が最適であると確認した。The luminescence detecting means 18 measures the amount of luminescence from the luminescence reagent mixed solution. In addition, the integrator 42
Processes the signal from the luminescence detecting means 18 to catechol
Quantify the amine. The catecholamine measuring apparatus according to the present embodiment is roughly configured as described above, and its operation will be described below. First, in this example, an acetic acid buffer solution having a pH of about 3 is used as the mobile phase. Usually, a phosphate buffer solution having a pH of about 3 is used for the separation of catecholamines, and this phosphate buffer solution precipitates phosphate after mixing with the luminescent reagent. Therefore, as a result of examining various buffer solutions, it was confirmed that the acetate buffer solution was the most suitable.
【００１５】また、本実施例においては蛍光試薬として
用いるエチレンジアミンを溶解する溶媒として、アセト
ニトリルとエタノールとの混合溶媒を用いている。従
来、エチレンジアミンは水に溶解して用いられていた
が、発光反応に入る前の発光試薬混合液は、有機溶媒を
多く含む方が高い発光強度が得られるため、エチレンジ
アミンを溶解するための溶媒系を検討した結果、アセト
ニトリル／エタノール（９０／１０）が最適であること
を確認した。In this embodiment, a mixed solvent of acetonitrile and ethanol is used as a solvent for dissolving ethylenediamine used as a fluorescent reagent. Conventionally, ethylenediamine was used by dissolving it in water, but since the luminescent reagent mixed solution before entering the luminescence reaction has a higher luminescence intensity when it contains more organic solvent, it is a solvent system for dissolving ethylenediamine. As a result of examination, it was confirmed that acetonitrile / ethanol (90/10) was optimal.
【００１６】また、本実施例においては発光試薬として
ＴＤＰＯと過酸化水素及び酸を用いている。このＴＤＰ
Ｏを溶解するための溶媒としては、通常アセトニトリル
／酢酸エチル（５０／５０）の混合溶媒が用いられてき
たが、この混合溶媒では最終反応混合液が二層になるた
めベースラインのノイズが大きくなるという欠点があっ
た。そこで、本発明者らが種々の溶媒系を検討した結
果、ＴＤＰＯの溶媒としてジオキサン／酢酸エチル（５
０／５０）の混合溶媒が最適であることを確認した。In this embodiment, TDPO, hydrogen peroxide and acid are used as the luminescent reagent. This TDP
As a solvent for dissolving O, a mixed solvent of acetonitrile / ethyl acetate (50/50) has been usually used, but in this mixed solvent, since the final reaction mixed solution has two layers, the baseline noise is large. There was a drawback that Therefore, as a result of the investigations of various solvent systems by the present inventors, dioxane / ethyl acetate (5
It was confirmed that the mixed solvent of 0/50) was optimal.
【００１７】なお、カテコールアミンとエチレンジアミ
ンとの反応による蛍光物質生成反応は、最適ｐＨが８〜
９である。これに対し、発光反応に於ける最適ｐＨは６
〜７であり、このため蛍光物質生成後発光反応前にｐＨ
調整が必要となる。そこで、本発明者らがｐＨ調整のた
めの酸を種々検討した結果、ＴＦＡを発光試薬溶液に溶
解し、発光試薬と一緒に送液することとした。通常、ｐ
Ｈ調整のためには別途一台のポンプを用いてｐＨ調整液
を送液するが、この場合には混合の不完全さに由来する
と思われるベースラインの変動が生じる。しかしなが
ら、前述したようにＴＦＡを発光試薬溶液に溶解し、発
光試薬と一緒に送液することにより、ベースラインの変
動を解消すると共にｐＨ調整液の送液用ポンプも不要と
なった。The optimum pH of the fluorescent substance forming reaction by the reaction of catecholamine and ethylenediamine is 8 to 8.
9 On the other hand, the optimum pH in the luminescence reaction is 6
~ 7, and therefore pH after the fluorescent substance formation and before the luminescence reaction
Adjustment is required. Therefore, as a result of various studies by the present inventors on acids for pH adjustment, it was decided to dissolve TFA in a luminescence reagent solution and send it together with the luminescence reagent. Usually p
A separate pump is used to send the pH adjusting liquid for H adjustment, but in this case, there is a fluctuation in the baseline that is thought to be due to incomplete mixing. However, by dissolving TFA in the luminescent reagent solution and sending it together with the luminescent reagent as described above, the fluctuation of the baseline is eliminated and the pump for sending the pH adjusting liquid is no longer necessary.
【００１８】なお、ＴＤＰＯによる発光反応を促進する
ために、蛍光試薬溶液にあらかじめイミダゾールを溶解
して用いたところ、イミダゾールを用いない場合に比較
して感度が５倍ほど上昇した。また、ＴＤＰＯによる発
光反応を促進するために、発光試薬溶液に溶解する過酸
化水素の濃度を従来法（１２．５ｍＭ）の４倍以上にし
て用いたところ、従来法の濃度を用いた場合に比較して
感度が５倍以上上昇した。When imidazole was previously dissolved in a fluorescent reagent solution in order to accelerate the luminescence reaction by TDPO, the sensitivity was increased by about 5 times as compared with the case where imidazole was not used. Further, in order to accelerate the luminescence reaction by TDPO, when the concentration of hydrogen peroxide dissolved in the luminescence reagent solution was used at 4 times or more that of the conventional method (12.5 mM), it was found that when the concentration of the conventional method was used. Compared with this, the sensitivity was increased by 5 times or more.
【００１９】また、本実施例において発光検出手段１８
内のホトマルチプライヤーとフローセルとの間にカット
フィルターの一つであるＹ−４６（４６０ｎｍでの透過
率は５０％で、それより長い波長の光を透過する。）を
配置することにより、カテコールアミンに由来する発光
の検出に影響を与えることなく、測定に用いた試薬の不
純物に由来する発光の影響を減少させることが可能とな
った。なお、前記カットフィルターを用いることによ
り、ベースラインのノイズが小さくなり、カットフィル
ターを用いない場合に比較して２倍ほど感度が上昇し
た。Further, in the present embodiment, the light emission detecting means 18
A catecholamine is arranged by disposing Y-46 (transmittance at 460 nm is 50%, which transmits light of a longer wavelength), which is one of the cut filters, between the photomultiplier and the flow cell. Luminescence derived from
It has become possible to reduce the influence of luminescence derived from the impurities of the reagent used for the measurement without affecting the detection of. By using the above-mentioned cut filter, the noise of the baseline was reduced, and the sensitivity was increased about twice as compared with the case where the cut filter was not used.
【００２０】次に具体的なカテコールアミンの測定例に
ついて示す。１ｐｍｏｌの各種カテコールアミン（Ｎ
Ｅ：ノルエピネフリン、Ｅ：ネピネフリン、ＤＡ：ドー
パミン）と内部標準（Ｉ．ＳＴＤ）として１００ｐｍｏ
ｌの３，４−ジヒドロキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）
を含む被測定液を、次に示す測定条件により測定した。測定条件 溶離液 ：［５０ｍＭ Ｋ＋ Ａｃｅｔａｔｅ
（ｐＨ３．２０）／５０ｍＭ Ｋ＋ Ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ（ｐＨ３．２０）（９５／５）＋ １ｍＭＳｏｄｉｕ
ｍ Ｈｅｘａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ］／ＣＨ３ＣＮ
（９７／３） 流量 ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ カラム ：Ｃａｔｅｃｈｏｌｐａｋ（１５０ｍ
ｍ× ４．６ｍｍ） カラム温度 ：４０℃ 蛍光試薬溶液 ：［１０５ｍＭ ＥＤ ＋ １７５ｍ
Ｍ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］ｉｎ ＣＨ３ＣＮ／ＥｔＯＨ
（９０／１０） 流量 ：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ 反応コイル ：０．５ｍｍ× １５ｍ 反応温度 ：８０℃ 発光試薬溶液 ：０．２５ｍＭ ＴＤＰＯ＋ １５０
ｍＭ Ｈ２Ｏ２ ＋１１０ｍＭ ＴＦＡ ｉｎ Ｄｉｏｘａｎｅ／Ｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｔｅ
（５０／５０） 流量 ：１．４ｍｌ／ｍｉｎNext, specific measurement examples of catecholamine will be shown. 1 pmol of various catecholamines (N
E: norepinephrine, E: nepinephrine, DA: dopamine) and 100 pmo as internal standard (I.STD)
l of 3,4-dihydroxybenzylamine (DHBA)
The liquid to be measured containing was measured under the following measurement conditions. Measurement conditions Eluent: [50 mM K + Acetate
(PH 3.20) / 50 mM K + Phosphat
e (pH 3.20) (95/5) + 1 mM Sodiu
m Hexanesulfonate] / CH 3 CN
(97/3) Flow rate: 0.5 ml / min Column: Catecholpak (150 m
m × 4.6 mm) Column temperature: 40 ° C. Fluorescent reagent solution: [105 mM ED + 175 m
M Imidazole] in CH 3 CN / EtOH
(90/10) Flow rate: 0.25 ml / min Reaction coil: 0.5 mm × 15 m Reaction temperature: 80 ° C. Luminescent reagent solution: 0.25 mM TDPO + 150
mM H 2 O 2 +110 mM TFA in Dioxane / Ethyl Acetate
(50/50) Flow rate: 1.4 ml / min
【００２１】この結果、図２に示すように各カテコール
アミンが極めて高感度に検出された。尚、図２の各ピー
ク下部にはインテグレータ４２がクロマトグラムを定量
する際のベースラインが現れている。次に、本実施例に
かかる測定装置を用いてラット血漿中のカテコールアミ
ンを測定した。なお測定条件は前記同様とし、ラット血
漿の前処理は以下のように血漿中のカテコールアミンを
アルミナに吸着させ、過塩素酸でカテコールアミンを脱
着させる方法を用いた。ラット血漿の前処理 血漿（１００μｌ） （ａ） アルミナ（５ ｍｇ） （ｂ） 内部標準（ＤＨＢＡ， ２００ｐｍｏｌ／１０
μｌ） （ｃ） トリス塩酸緩衝液（１．５Ｍ， ｐＨ ８．
７， １００μｌ） 攪拌（１０分） 遠心（１分，８０００ｒｐｍ） アルミナ 水洗（０．５ｍｌ × ２） アルミナ ０．１Ｍ 過塩素酸（１００ｕｌ） 遠心（１分， ８０００ｒｐｍ） 注入（５０μｌ）As a result, as shown in FIG. 2, each catecholamine was detected with extremely high sensitivity. In addition, each peak in FIG.
The integrator 42 quantifies the chromatogram at the bottom of the screen
The baseline for doing is appearing. Next, catecholamine in rat plasma was measured using the measuring apparatus according to this example. The measurement conditions were the same as above, and the pretreatment of rat plasma was carried out by the following method in which catecholamine in plasma was adsorbed on alumina and the catecholamine was desorbed with perchloric acid. Pretreatment of rat plasma (100 μl) (a) Alumina (5 mg) (b) Internal standard (DHBA, 200 pmol / 10)
μl) (c) Tris-HCl buffer (1.5 M, pH 8.
7, 100 μl) Stirring (10 minutes) Centrifugation (1 minute, 8000 rpm) Alumina water washing (0.5 ml × 2) Alumina 0.1M Perchloric acid (100 ul) Centrifugation (1 minute, 8000 rpm) Injection (50 μl)
【００２２】図３に得られたクロマトグラムを示す。
尚、図３においても、各ピーク下部にベースラインが現
れている。同図より明かなように、各カテコールアミン
は明瞭に分離され、しかもベースラインの変動なども小
さく、極めて高感度のカテコールアミン検出が可能とな
ったことが示される。The obtained chromatogram is shown in FIG.
In addition, in FIG. 3, the baseline is present below each peak.
Has been. As is clear from the figure, each catecholamine was clearly separated, and the fluctuation of the baseline was small, indicating that it was possible to detect catecholamine with extremely high sensitivity.
【００２３】[0023]
【発明の効果】以上説明したように本発明にかかるカテ
コールアミン測定方法によれば、カテコールアミンを蛍
光物質に変換し、該蛍光物質とＴＤＰＯ、過酸化水素及
び酸を用いて発光させることとしたので、カテコールア
ミンを極めて高感度で測定することが可能となる。ま
た、本発明にかかる発光測定装置によれば、カテコール
アミン等を含む溶出液に蛍光試薬を加えて蛍光物質を形
成し更に発光試薬を加えてその発光を検出することとし
たので、カテコールアミンなどの微量成分を連続的にか
つ高感度に測定することが可能となる。As described above, according to the catecholamine measuring method of the present invention, catecholamine is converted into a fluorescent substance, and the fluorescent substance and TDPO, hydrogen peroxide and an acid are used to emit light. It becomes possible to measure catecholamine with extremely high sensitivity. According to the luminescence measuring device of the present invention, a fluorescent reagent is added to an eluate containing catecholamines to form a fluorescent substance, and a luminescent reagent is further added to detect the luminescence thereof. It becomes possible to measure the components continuously and with high sensitivity.
【図１】本発明の一実施例にかかるカテコールアミン測
定装置の概略構成の説明図である。FIG. 1 is an explanatory diagram of a schematic configuration of a catecholamine measuring apparatus according to an embodiment of the present invention.
【図２】，[Fig. 2]
【図３】図１に示した測定装置を用いて実際のカテコー
ルアミンの測定を行なった結果を示すクロマトグラムで
ある。FIG. 3 is a chromatogram showing the results of actual measurement of catecholamines using the measuring device shown in FIG.
１０ カテコールアミン分離手段 １２ 蛍光試薬混合手段 １４ 加熱手段 １６ 発光試薬混合手段 １８ 発光検出手段 10 Catecholamine Separation Means 12 Fluorescent Reagent Mixing Means 14 Heating Means 16 Luminescent Reagent Mixing Means 18 Luminescence Detecting Means
Claims (7)
レンジアミンを含む蛍光試薬を混合する蛍光試薬混合工
程と、 前記蛍光試薬混合液を加熱し、各カテコールアミンを蛍
光物質に変換する蛍光物質生成工程と、 前記蛍光物質混合液に、ビス［４−ニトロ−２−（３，
６，９−トリオキサデシルオキシカルボニル）フェニ
ル］オキサレート（ＴＤＰＯ）などのシュウ酸エステル
と過酸化水素と酸とを含む発光試薬溶液を混合する発光
試薬混合工程と、 前記発光試薬混合液から生成する発光の強度を測定する
発光強度測定工程と、を備えたことを特徴とするカテコ
ールアミン測定方法。1. A fluorescent reagent mixing step of mixing a fluorescent reagent containing ethylenediamine with a measured solution containing catecholamine; a fluorescent substance producing step of heating the fluorescent reagent mixed solution to convert each catecholamine into a fluorescent substance; Add bis [4-nitro-2- (3,3
A luminescent reagent mixing step of mixing a luminescent reagent solution containing an oxalic acid ester such as 6,9-trioxadecyloxycarbonyl) phenyl] oxalate (TDPO), hydrogen peroxide and an acid, and the luminescent reagent mixed solution. And a luminescence intensity measuring step of measuring luminescence intensity.
マトグラフィーを用いてカテコールアミンを分離して被
測定液を得、該液体クロマトグラフィーにおいてカテコ
ールアミンを分離するための移動相を構成する緩衝液と
してｐＨ３付近の酢酸緩衝液を用いることを特徴とする
カテコールアミン測定方法。2. The method according to claim 1, wherein catecholamine is separated using liquid chromatography to obtain a liquid to be measured, and pH 3 is used as a buffer solution constituting a mobile phase for separating catecholamine in the liquid chromatography. A method for measuring catecholamines, which comprises using a nearby acetate buffer.
チレンジアミンを溶解する溶媒としてアセトニトリルと
エタノールとの混合溶媒を用いることを特徴とするカテ
コールアミン測定方法。3. The method for measuring catecholamine according to claim 1 or 2, wherein a mixed solvent of acetonitrile and ethanol is used as a solvent for dissolving ethylenediamine.
おいて、ＴＤＰＯと過酸化水素と酸とを溶解する溶媒と
して、ジオキサンと酢酸エチルとの混合溶媒を用いるこ
とを特徴とするカテコールアミン測定方法。4. The catecholamine measurement according to claim 1, wherein a mixed solvent of dioxane and ethyl acetate is used as a solvent for dissolving TDPO, hydrogen peroxide and an acid. Method.
試薬とともに用いられる酸としてトリフルオロ酢酸を用
いることを特徴とするカテコールアミン測定方法。5. The method for measuring catecholamine according to claim 1, wherein trifluoroacetic acid is used as the acid used together with the luminescent reagent.
試薬溶液にイミダゾールを溶解しておくことを特徴とす
るカテコールアミン測定方法。6. The method for measuring catecholamine according to claim 1, wherein imidazole is dissolved in the fluorescent reagent solution.
試薬溶液に溶解する過酸化水素の濃度を５０ｍＭ以上に
して用いることを特徴とするカテコールアミン測定方
法。7. The method for measuring catecholamine according to claim 1, wherein the concentration of hydrogen peroxide dissolved in the luminescent reagent solution is 50 mM or more.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4073296A JP2565446B2 (en) | 1992-02-25 | 1992-02-25 | Catecholamine measurement method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4073296A JP2565446B2 (en) | 1992-02-25 | 1992-02-25 | Catecholamine measurement method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05232026A JPH05232026A (en) | 1993-09-07 |
| JP2565446B2 true JP2565446B2 (en) | 1996-12-18 |
Family
ID=13514063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4073296A Expired - Fee Related JP2565446B2 (en) | 1992-02-25 | 1992-02-25 | Catecholamine measurement method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2565446B2 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3355749B2 (en) * | 1994-01-06 | 2002-12-09 | 東ソー株式会社 | Analysis method for catecholamines |
| JP4735832B2 (en) | 2006-01-06 | 2011-07-27 | 株式会社ルミカ | Residual detergent detection method and residual detergent detection tool |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60205262A (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | Assay of catecholamine using 1,2-diphenylethylenediamine |
| JPH0310159A (en) * | 1989-06-08 | 1991-01-17 | Yuki Gosei Kogyo Co Ltd | Method for determining quantity of ribonucleic acid |
-
1992
- 1992-02-25 JP JP4073296A patent/JP2565446B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05232026A (en) | 1993-09-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kobayashi et al. | Application of high-performance liquid chromatography with a chemiluminescence detection system to determine catecholamines in urine | |
| Huang et al. | Chemiluminescence detection in capillary electrophoresis | |
| Won-Yong et al. | Determination of dansyl amino acids using tris (2, 2′-bipyridyl) ruthenium (II) chemiluminescence for post-column reaction detection in high-performance liquid chromatography | |
| Li et al. | Highly sensitive trivalent copper chelate-luminol chemiluminescence system for capillary electrophoresis detection of epinephrine in the urine of smoker | |
| Garcı́a-Campaña et al. | Derivatization of biomolecules for chemiluminescent detection in capillary electrophoresis | |
| He et al. | Enantioselective optodes | |
| CN107907607B (en) | High performance liquid chromatography detection method for clopidol related substances | |
| JPS6118985B2 (en) | ||
| Hwang et al. | Direct flameless atomic absorption determination of lead in the blood | |
| JP2565446B2 (en) | Catecholamine measurement method | |
| Liu et al. | Determination of valproic acid by high-performance liquid chromatography with photodiode-array and fluorescence detection | |
| Murray et al. | HPLC laser fluorometric determination of amines in beer | |
| CN112432906B (en) | Chiral substance qualitative and quantitative analysis method based on circular dichroism spectrum technology | |
| US9110047B2 (en) | Compound for forming fluorescent uranium complex, method for synthesizing thereof, fluorescent probe for detecting uranium and method for analyzing uranium | |
| US4540548A (en) | Method of detecting fluorescent materials and apparatus for their detection | |
| JPS5935142A (en) | Determination of catecholamine | |
| JP6359365B2 (en) | Precolumn derivatization LC-MS analysis for amino and carboxyl groups of amino acids | |
| Maeda et al. | Separation and Determination of Trace Dinitropyrenes by Means of Off-Line Reduction-HPLC-Chemihiminescence Detection. Application to Assessing Atmospheric Environment | |
| CN114034804B (en) | Method for measuring proline content in captopril tablet | |
| JP3355749B2 (en) | Analysis method for catecholamines | |
| JP2612652B2 (en) | Analysis of trace amounts of amino group-containing phospholipids | |
| CN115184481B (en) | Method for detecting content of N-tertiary butyl glycyl chloride | |
| JP3615425B2 (en) | Nitrogen-containing organic substance analyzer | |
| EP1580549A2 (en) | Process for producing chemical product and quality inspection process for chemical used in same | |
| JPH0575066B2 (en) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |