JP2540031B2 - 組換えｄｎａ分子 - Google Patents

組換えｄｎａ分子

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JP2540031B2 JP61160998A JP16099886A JP2540031B2 JP 2540031 B2 JP2540031 B2 JP 2540031B2 JP 61160998 A JP61160998 A JP 61160998A JP 16099886 A JP16099886 A JP 16099886A JP 2540031 B2 JP2540031 B2 JP 2540031B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は分子生物学の分野、ことに枯草菌［バチルス
・サブチリス（Bacillus subtilis］のクローニングベ
クター、組換えDNA分子、このようなDNA分子で形質転換
したバチルス・サブチリスの菌株、異種DNA配列の発現
法及び異種DNA配列で遺伝暗号化された蛋白質の産生、
分泌の方法に関する。
特に、本発明は、異種DNA配列の発現及びバチルス・
サブチリスにおける前記配列により遺伝暗号化された蛋
白質の産生、分泌のためにクローニングベクターを用い
ること、クローニングベクター（中性プロテアーゼ遺伝
子内に存在する制限部位で便宜上切断される）及び目的
の蛋白質を遺伝暗号化する異種DNA配列で形成された組
換えDNA分子、この組換えDNA分子で形質転換され、異種
DNA配列を発現できかつこの配列によって遺伝暗号化さ
れた蛋白質を産生、分泌できるバチルス・サブチリスの
菌株、さらには目的の異種蛋白質を発現、産生、分泌す
る方法に関する。
本発明によるクローニングベクター、組換えDNA分
子、この組換えDNA分子で形質転換したバチリス・サブ
チリスの菌株及び異種蛋白質を産生、分泌する方法は、
異種DNA配列を発現させること及びこの配列で遺伝暗号
化された蛋白質を高収率で産生、分泌することを可能に
する。このようにして得られた蛋白質は、通常ならば化
学合成によって得られている薬品類、食品類、さらには
そのような製品の製造の分野において有用である。
グラム陰性の細菌、たとえば大腸菌［エシェリシア・
コリ（Escherichia coli）］は異種遺伝子を発現する能
力を有することが知られている。
しかしながら、エシェリシア・コリを異種蛋白質の産
生のための宿主として用いることには数々の欠点があ
る。すなわち、エシェリシア・コリは病原性のグラム陰
性菌であって、通常、人体又は動物の腸管系内で生存し
ており、さらに、この菌株の中には菌体内毒素を産生す
るものがある。
形質転換したエシェリシア・コリの菌体を用いる異種
蛋白質の培養生産法は、汚染、感染をさけるため密閉系
内で行われなければならない。このことはすべて生産コ
ストの上昇につながる。
さらに、エシェリシア・コリによって合成された生成
物は細胞内に保持されている。
従って、培養過程の終わりに細胞を破壊するか、溶菌
して生成物を回収することが必要である。
このような処理は所望の生成物を取り出すばかりか、
望ましくない物質までも取り出すことになる。従って、
後に分離、精製を行って、目的の生成物のみを人間又は
動物に用い得る形で回収することが必要である。
エシェリシア・コリによるこれら欠点のすべては、バ
チリス・サブチリスを宿主とすることで解決できる。バ
チリス・サブチリスは異種蛋白質の産生に特に好適であ
る。
事実、バチルス・サブチリスは非病原性、グラム陰性
の細胞であって、菌体内毒素を産生しない。
さらに、バチリス・サブチリスの細胞は細胞周辺腔を
有しておらず、合成された生成物は培地中に直接分泌さ
れるので汚染や精製の問題がほとんどなく培地から回収
される。
云うまでもなく、バチルス・サブチリスによる場合に
は数々の利点もあるが、これを異種蛋白質の産生のため
の宿主として使用することは、異種遺伝子の発現の効率
が低いこと及びこの遺伝子によって遺伝暗号化された蛋
白質の収率が低いことの２つの理由により、まれにしか
行われていない。
事実、バチルス類の他の菌に由来の遺伝子はバチルス
・サブチリスにおいて発現される（Sloma,Aら，「バチ
ルス・セレアス（Bacillus cereus）から得たタイプＩ
β−ラクタマーゼ遺伝子の分子クローニング及びヌクレ
オチド配列」,Nucl.Acids Res.,II,（1983）,p.4997-50
04及び（Gray,O.ら，「エシェリシア・コリ及びバチル
ス・サブチリス中のバチルス・リチェニフォルミス（B.
Licheniformis）の分子クローニング及びその発現」,J.
Bacteriol.,145，（1981）,p.422-428）が、異種遺伝子
のクローニング及び発現はわずか数例が技術誌に報告さ
れているにすぎない（Hardy,K.ら，「バチルス・サブチ
リス中におけるＢ型肝炎核抗原及び***ウイルス主抗
原の産生」,Nature,293，（1981）,p.481-483）。
このように使用が限られる理由の１つは、中でも、異
種遺伝子を効率よく発現させ、この異種遺伝子によって
遺伝暗号化された蛋白質の生産性を高めることを許容す
るクローニングベクターがないことである。
イタリー国特許出願第A/85 2093号において、本出願
人はハイブリッドプラスミドpSM127について記述してい
る。このハイブリッドプラスミドはバチルス・サブチリ
スSMS108（NRRL B−15898）の細胞内に導入されると200
mg/lを越える濃度で中性プロテアーゼ（蛋白質分解酵
素）を発現、産生することが可能である。
このハイブリッドプラスミド（第１図に遺伝子地図を
示す）は、中性プロテアーゼ遺伝子とプラスミドpUB110
（このプラスミドはバチルス・サブチリス中でのpSM127
の複製を保証し、カナマイシン耐性を遺伝暗号化する遺
伝子を含有する）とで形成される。
このハイブリッドプラスミドpSM127を含むバチルス・
サブチリスSMS108の細胞は米国イリノイ州ペオーリアの
Northern Regional Research CenterにNRRL B−15900と
して寄託されている。発明者らは、新たに、このプラス
ミドpSM127のBc1I-HindIII（765塩基対（bp）中に、中
性プロテアーゼ遺伝子の５′末端に位置して中性プロテ
アーゼの高収率産生に関与するDNA領域（nprR2と称され
る）を認めた。
これによれば、本発明の目的は、異種DNA配列の発現
及びこの異種DNA配列によって遺伝暗号化された蛋白質
の高収率産生のためにバチルス・サブチリスのクローニ
ングベクターとしてハイブリットプラスミドpSM127を用
いることにある。
本発明の目的はさらに、このクローニングベクターpS
M127（バチルス・サブチリスと適合するpUB110のレプリ
コン及びカナマイシン耐性を遺伝暗号化する遺伝子を含
む）と、目的の蛋白質を遺伝暗号化する異種DNA配列と
によって形成された組換えDNA分子（ここで、前記異種D
NA配列が中性プロテアーゼ遺伝子pSM127上に存在する制
限部位に挿入され、プロモーター領域、リボゾーム認識
部位、nprR2及び中性プロテアーゼのシグナル配列の制
御下にある）を提供するにある。本発明の他の目的は、
上述の組換えDNA分子で形質転換され、異種DNA配列を発
現でき、この配列によって遺伝暗号化された蛋白質を産
生、分泌できるバチルス・サブチリスの菌株を提供する
ことにある。さらに、本発明の目的は、好適な培地中で
上述の組換えDNA分子で形質転換したバチルス・サブチ
リスの菌株を培養することからなる異種蛋白質の製法に
ある。
本発明書において用いる用語の定義 発現 これは、DNA断片又は遺伝子が蛋白質を産生するプロ
セスを云う。これは転写のプロセス（すなわちDNA断片
からのmRNAの生成）及び翻訳（すなわちmRNAからの蛋白
質の生成）のプロセスによって起こる。
バチルス・サブチリスのクローニングベクター これは、バチルス・サブチリスの宿主細胞内でベクタ
ーが複製されることを可能にするレプリコンを有するプ
ラスミドであり、このベクターは１つ又はそれ以上の制
限部位で主要生物活性を損なうことなく切断される。好
適には、このベクターは、たとえばカナマイシン耐性又
はクロラムフェニコール耐性のような形質転換細胞の識
別に役立つマーカーを有する。
組換えDNA分子 これは、細胞の外部で互いに付着された各種ゲノムで
形成されたDNA分子であり、宿主細胞内に維持される能
力を有する。
ハイブリッドプラスミドpSM127における中性プロテア
ーゼの過生産に関与する領域の存在及び765塩基対のBc1
I-HindIII断片内におけるその位置は次のようにするこ
とによって証明された。
プラスミドpC194の1031bpのHpaII-MboI断片中に含有
されるクロラムフェニコールアセチルトランスファーゼ
（CAT）遺伝子（クロラムフェニコール耐性を遺伝暗号
化する）を、このプラスミドpC194を制限酵素HpaIIで処
理し、このように線状化したプラスミドをプラスミドpE
194の587bpの断片（pE194（BGSC 1E7）を制限酵素TaqI
及びMboIで消化することによって得た）へ付着させるこ
とにより単離した。
pC194の線状分子は、このpC194のHpaII付着端及びpE1
94のTaqI付着端が互いに付着するものであれば、pE194
のTaqI-MboI断片に付着して3497bpの線状分子を形成す
る。
3479bpのこの分子を制限酵素MboIで処理し、つづいて
pC194の1031bpのMboI断片及びpE194の587bpのTaqI-MboI
断片によって形成される1618bpのDNAのMboI-MboI線状断
片を単離する。
ついで、このようにして得た1618bpの線状断片を、制
限酵素Bc1Iで切断したハイブリッドプラスミドpSM127に
付着させる。
このようにして、pSM127のDNA及び1618bpのMboI-MboI
断片のDNAで形成されるプラスミドpSM153を得る。つい
で、プラスミドpSM153を酵素BamHIで切断し、２つの断
片を生じさせる。そのうちの一方はpUB110の全配列を担
持する大略5000bpのものであり、他方は中性プロテアー
ゼを遺伝暗号化する遺伝子とクロラムフェニコール耐性
を遺伝暗号化するCAT遺伝子とを有する大略4700bpのも
のである。
ついで、4700bpの断片を、バチルス・サブチリスBGSC
1A1の細胞（クロラムフェニコールに対して感受性であ
り、低中性プロテアーゼ産生菌株である）の形質転換に
使用し、得られた形質転換菌株をクロラムフェニコール
耐性（CmR）によって選別する。
バチルス・サブチリスBGSC 1A1の形質転換は、菌染色
体内にこの断片の組込みが生じた場合にのみおこる。
この組込みは、pSM153のBamHI断片上に、中性プロテ
アーゼ遺伝子によって生成される染色体DNAと同質の領
域が存在する場合のみに生ずる。
第４図に示すように、CAT遺伝子の上流及び下流に位
置する領域においては染色体DNAとプラスミドDNAとの間
で二重乗換が生ずる。このことは、染色体レベルにおけ
るCm耐性を遺伝暗号化するCAT遺伝子の挿入につなが
り、この結果、バチルス・サブチリスBGSC 1A1のCm耐性
細胞（CmR）が得られる。
このCAT遺伝子の組込みに加えて、二重乗換はnprR2領
域（プラスミドpSM127上に存在する場合には、中性プロ
テアーゼの過産生を管理する）の組込みを生じる。
この理由から、このバチルス・サブチリスの菌株BGSC
1A1は中性プロテアーゼの低産生菌株であり、nprR2領
域の染色体レベルにおける組込みはこの菌株の蛋白質分
解活性を実質的に高める。
事実、このCmRバチルス・サブチリス菌株の80％は親
菌株BGSC 1A1に比べて100倍もの蛋白質分解活性を示
し、かくして、pSM127におけるnprR2領域の存在及びこ
の領域と中性プロテアーゼの過産生との間の相関関係が
確認された。
第2A図はnprR2領域のDNA配列を示し、第2B図はDNAの
同じ領域の配列がバチルス・サブチリスの菌株BGSC 1A1
における中性プロテアーゼ遺伝子の前に存在することを
示している。これらの配列を見るとわかるように、nprR
2領域は、遺伝子の開始点から124bpの距離のところで66
塩基対が欠除している点でバチルス・サブチリスBGSC 1
A1のnprR2領域とは異なっている。
本発明によれば、ハイブリッドプラスミドpSM127は、
異種DNA配列の発現及びバチルス・サブチリスにおける
この配列によって遺伝暗号化された蛋白質の高収率での
産生のためのクローニングベクターとして使用される。
ハイブリッドプラスミドpSM127（第１図）は、中性プ
ロテアーゼ遺伝子内に制限部位を呈し、この部位におい
て、nprR2コントロール配列、プロモーター、リボゾー
ム認識部位（RBS）、及び中性プロテアーゼの分泌に関
与するシグナル配列（PRE）をそこなうことなく切断さ
れる。
特に、クローニングベクターが切断される制限部位
は、PRO領域（成熟中性プロテアーゼを遺伝暗号化する
配列の上流に位置する）内に位置するHindIII及び成熟
中性プロテアーゼを遺伝暗号化するDNA領域内に存在す
るBglII及びEcoRIである。
このようにして切断したクローニングベクターを、次
いで、好適な異種DNA配列に付着させて、融合遺伝子
（すなわち、中性プロテアーゼ遺伝子の部分とクローニ
ングベクター中に挿入された異種DNA配列（第５図及び
第６図）とで構成される）を形成する。
このようにして得た組換えDNA分子は、クローニング
ベクターpSM127（バチルス・サブチリスに適合するpUB1
10のレプリコン及びカナマイシン耐性を遺伝暗号化する
遺伝子を含有する）及び融合遺伝子（その発現がプロモ
ーター及びRBS配列の存在により保証され、かつその過
産生及び分泌がそれぞれnprR2領域及びPRE領域の存在に
よって保証される）によって形成されている。
この組換えDNA分子によって形質転換されたバチルス
・サブチリスの菌株は、異種DNA配列を発現でき、かつ
この配列によって遺伝暗号化された蛋白質を高収率で産
生し、分泌できる。
本発明のクローニングベクター、組換えDNA分子、バ
チルス・サブチリス宿主細胞及び方法は、異種DNA配列
の発現及びこの配列によって遺伝暗号化された蛋白質の
産生及び分泌を可能にする。
このような蛋白質の例としては、β−ラクタマーゼ、
生長ホルモン及び、ヒトカルシトニンがあげられる。
本発明に従って、プラスミドpSM127を、ヒトカルシト
ニンを遺伝暗号化する遺伝子のクローニングに適用し
た。
ヒトカルシトニンは血液中のカルシウムのレベルを支
配するホルモンである。
このホルモンは現在は化学合成によって製造されてい
る。
本発明によれば、１つのDNA断片を以下の特性を有す
るものとして合成した。
−このヒトホルモンを構成する32個のアミノ酸を遺伝暗
号化するヌクレオチド配列を含むこと。
−プラスミドpSM127上の中性プロテアーゼ遺伝子中に存
在するBglII制限部位における挿入を可能にする末端を
有すること。
−カルシトニンの末端アミノ酸を遺伝暗号化するトリプ
レットの後にナンセンストリプレットを有すること。
−ヌクレオチドの配列が、DNA断片がBglII制限部位で挿
入された後、カルシトニン配列が中性プロテアーゼと同
じ解読方向に並んでいるようになっていること。
これにより、カルシトニンの合成を行うことが可能と
なり、カルシトニンそれ自体の開始トリプレットの前に
はストップコドンは存在しない。
保存、配列決定及び増殖のため、合成DNA断片をプラ
スミドpSM131（その構造はイタリー国特許第A/85 2134
号に記述されており、ただ１つのBalII制限部位が存在
することにより特徴づけられる）内でクローン化した。
次いで、pSM131及び合成DNA断片で合成されているハ
イブリッドプラスミドpSM170を精製して、クローン断片
の配列をMaxam及びGilbertの方法（Methods in Enzymol
gy,（1980）,Vol.65,p.499-560）によって確認した。
このプラスミドpSM170から単離した合成DNA断片を、
酵素T4リガーゼの存在下、温度14℃、16時間でクローニ
ングベクターpSM127（制限酵素BglIIで部分的に消化し
たもの）に付着させた。このようにして得たリガーゼ混
合物を用いて、Contente及びDubnauの方法（Mol.Gen.Ge
net.,167，（1979）,p.251-258）に従ってコンピテント
としたバチルス・サブチリスSMS108（NRRL B−15898）
を形質転換させた。
細胞をNB培養基上に塗沫し、形質転換された細胞をカ
ナマイシン耐性（KmR）及びカゼイン分解活性の不存在
に基づいて選別した。
バチルス・サブチリスSMS108（NRRL B−15898）（カ
ナマイシン耐性であり、リングをもたない）のKmRコロ
ニーから急速抽出法によってプラスミドを抽出し、これ
らプラスミドが合成DNA断片を含むものであることを確
認する目的で分析した。
当該分析を、制限酵素BglIIでこのプラスミドを消化
し、この消化反応で得た断片を7.5％アクリルアミドゲ
ル上で分離することによって実施した。
供試プラスミド中にプラスミドpSM174が確認された。
このプラスミドはpSM127とカルシトニンの合成DNA断片
とから形成されており、配列（第７図）の正しい読み取
りを有するように配向していた。
このバチルス・サブチリスの菌株SMS108（pSM174）は
ATCCに1985年６月26日付で寄託されている（ATCC 5316
8）。
このバチルス・サブチリスの菌株SMS108（pSM174）が
ヒトカルシトニンを発現し、分泌する能力を有すること
を、この菌株を37℃においてVY培養基（DIFCO）内で培
養し、同位元素標識免疫定量分析（RIA）によって様々
な時間間隔で上澄液の一定量を分析することによって確
認した。
以下に記載する実験例は単に例示のためのものであっ
て、本発明自体を何等制限するものではない。
例１ A.pC194のクロラムフェニコールアセチルトランスファ
ーゼ（CAT）遺伝子を担持するMboI断片の単離 プラスミドpC194（BGSC 1E17）５μｇを、制限酵素Hp
aII（ベーリンゲル−マンハイム）５単位（Ｕ）によ
り、この酵素の供給会社の推奨する条件下、50μｌ反応
容積中で線状化した。
次いで、この溶液を、TE（10mM Tris-HCl,1mM EDTA）
で飽和した等量のフェノールで処理し、プラスミドDNA
を3M酢酸ナトリウム1/10容及び95％エタノール2.5容で
沈殿させた。
反応混合物を毎分10,000回転で10分間遠心分離し、こ
のDNAを回収し、真空乾燥し、ついで66mM Tris-HCl（pH
7.5）、6mM MgCl2、10mMジオチスレイトール、1mMアデ
ノシン三リン酸（ATP）、プラスミドpE194（BGSC 1E7）
の587塩基対（bp）のTaqI-MboI断片５μｇ、及びT4 DNA
リガーゼ10Uを含有する溶液100μｌ中に再懸濁させた。
この溶液を温度14℃に18時間維持することによりリガ
ーゼ反応を行った。
なお、pE194（BGSC 1E7）の587bpの断片は、このプラ
スミド20μｇを酵素TaqI及びMboI 20Uにより供給会社
（ベーリンゲル−マンハイム）の仕様書に従って操作し
て消化することによって得た後、つづいてMaxam及びGil
bertによって記載された（Methods in Enzymology,Vol.
65,（1980）,p.499-560）ようにして５％アクリルアミ
ドゲルによって精製したものである。
pC194の線状分子をpE194のTaqI-MboI断片に付着さ
せ、このようにしてHpaII及びTaqI付着端が互いに付着
している3497bpの線状分子を形成させた。
リガーゼ反応の終了時、混合物をフェノールで処理
し、DNAを上述の如く沈殿させ、回収した。
次いで、このDNAを、75mM NaCl,10mM Tris HCl（pH7.
4）、10mM MgCl2及び1mMジチオスレイトールを含有する
溶液50μｌ内に再懸濁させ、制限酵素MboI 2Uで37℃、
１時間処理した。
この処理後、このDNAを５％アクリルアミドゲルへ載
荷し、1618bpの線状断片を溶出した。この線状断片はpC
194の1031bpのMboI-HpaII断片及びpE194の587bpのTaqI-
MboI断片から形成されている（第３図）。
B.プラスミドpSM127のBclI部位における1618bpの線状DN
A断片の挿入及びプラスミドpSM153の単離 供給会社（ベーリンゲル−マンハイム）の仕様書に従
って制限酵素BclI 1Uで消化したプラスミドpSM127 0.5
μｇを、66mM Tris-HCl（pH7.5）、6.6mM MgCl2、10mM
ジチオスレイトール、1mM EDTA、上記Ａで得たDNA断片
１μｇ及びT4 DNAリガーゼ1Uを含有する溶液10μｌ中に
懸濁させた。
反応を温度14℃で18時間行い、温度65℃、10分間で酵
素の不活性化を行った後、この混合物を用いて、クロラ
ムフェニコール及びカナマイシンに対して感受性であ
り、Contente及びDubnauによってMol.Gen.Genet.,167，
（1978）,p.251-258に開示された方法に従ってコンピテ
ントとされたバチルス・サブチリスSMS 108（NRRL B−1
5898）の細胞の形質転換を行った。
形質転換細胞の選別を、１％カゼイン及びカナマイシ
ン及びクロラムフェニコール各５μｇを含有するNBプレ
ート（その組成については例２に示す）上で行った。
プラスミドpSM153（その制限地図を第３図に示す）を
マイシン耐性（KmR）及びクロラムフェニコール耐性（C
mR）のコロニーの１つから単離した。
このプラスミドpSM153は、pSM127のDNA及びCAT遺伝子
を含有する1618bpのMboI-MboI断片から形成されてい
た。
pSM153内で見出される定位でのMboI-MboI断片の挿入
は、中性プロテアーゼ遺伝子の近位部分からBclI部位を
再構築することを許容する。
事実、pE194のMboI部位の４つの付着塩基（GATC）の
後にはアデニン（Ａ）が続いており、この結果、pSM127
のBclI及びMboIの付着端がこれら自身の中で対をなす場
合には配列TGATCA（これは酵素BclIで認識され、切断さ
れる）を形成する。
これは、pC194由来のMboI部位とpSM127のBclI部位と
の接合の場合には生じない。
C.pSM153上のnprR2の存在の証明 プラスミドpSM153 1μｇを供給会社（ベーリンゲル−
マンハイム）の仕様書に従い、10μｌの反応容積内で制
限酵素BamHI 1Uによって消化した。
BamHIでの切断により２つの断片を得た。その１つは
大略5000bpで、pUB110の全配列を担持しており、他は大
略4700bpで、中性プロテアーゼ遺伝子及びCATを遺伝暗
号化する1618bpの断片を有する。
このようにして消化したDNAを、S.Contente及びD.Dub
nauによって記載されたようにしてコンピテントとした
バチルス・サブチリスBGSC 1A1の細胞の形質転換に使用
し、クロラムフェニコール耐性によって形質転換細胞を
選別した（３μg/NB培養基ml）。
線状DNA分子は、これが細胞染色体に組込まれない限
りバチルス・サブチリスの細胞を形質転換するものでは
ない。
従って、CAT遺伝子の前に位置し、かつ中性プロテア
ーゼ遺伝子及びCAT遺伝子の後に位置する約750bpの断片
を含有する2350bpのBamHI断片（第４図）と細菌染色体
のそれぞれ同質領域との組換えが生じたCmRコロニーの
みを選別した。
このようにして得たCmRコロニーの約80％は、親菌株
バチルス・サブチリスBGSC 1A1で見出されるカゼイン分
解活性よりも高いカゼイン分解活性を示した。
カゼイン分解活性は、カゼインを含有するNBプレート
上でリングの寸法を調べることで確かめられる。酵素活
性の増加は、pSM153、従ってpSM127上に存在するDNA断
片におけるnprR2領域の存在を確認するものである。
例２ ヒトカルシトニン遺伝子のクローニング及びpSM174の調
製 プラスミドpSM131 0.1μｇを、20mMグリシン−NaOH、
10mM MgCl2、7mM β−メルカプトエタノール（pH9.5）
の溶液20μｌ中、酵素BglII 0.1単位（Ｕ）（ベーリン
ゲル−マンハイム）により温度37℃、１時間で消化し
た。
65℃、10分間でこの酵素を不活性化した後、消化混合
物２μｌ（プラスミドDNA10ng）を、カルシトニンの合
成断片10ng及び酵素T4 DNAリガーゼ（ベーリンゲル−マ
ンハイム）0.1Uを含有する66mM Tris-HCl（pH7.6）、6.
6mM MgCl2、10mMジチオスレイトール及び1mM ATPの溶液
18μｌ中に添加した。
リガーゼ反応を14℃において16時間行った。
この酵素を65℃で10分間不活性化した後、リガーゼ混
合物10μｌを、Mandel及びHigaによって開示された方法
（J.Mol.Biol.,53，（1970）,p.159-162）に従ってコン
ピテントとしたエシェリシア・コリHB101の形質転換に
使用した。形質転換細胞の選別をテトラサイクリン（T
c）15μg/mlを含有するＬ寒天（DIFCO）のプレート上で
行った。
TcRコロニーから合成カルシトニン断片を含有するプラ
スミドpSM170を取出した。
クローン化した断片の配列をMaxam及びGilbertの方法
（Methods in Enzymology,Vol.65,（1980）,p.499-56
0）によって確認した。
プラスミドpSM170 30μｇを、20mMグリシン−NaOH、1
0mM MgCl2及び7mM β−メルカプトエタノール（pH9.5）
を含有する溶液150μｌ中において酵素BglII 30Uにより
37℃で１時間消化させた。このようにして得られたプラ
スミドDNA断片を7.5％アクリルアミドゲル上で分離し、
134塩基対の合成カルシトニン断片を含有するDNA断片を
Maxam及びGilbertによって開示された方法（Methods in
Enzymology,Vol.65,（1980）,p.526-527）に従って溶
出した。
pSM127 1μｇを、20mMグリシン−NaOH、10mM MgCl2、
7mM β−メルカプトエタノール（pH9.5）を含有する溶
液50μｌ中で酵素BglII 1Uにより37℃で１時間消化し
た。
消化混合物に134bpのDNA断片120ngを加えた後、3M酢
酸ナトリウム（pH5.5）及び98％エタノール150μｌを添
加することによって−80℃、20分間でDNAを沈殿させ
た。沈殿したDNAを、毎分10,000回転で10分間遠心分離
することにより反応混合物から分離し、乾燥し、T4 DNA
リガーゼ1Uを含有する66mM Tris-HCl（pH7.6）、46.6mM
MgCl2、10mMジチオスレイトール及び1mM ATPの溶液10
μｌ中に再懸濁させた。
この混合物を14℃で16時間培養し、酵素を65℃、10分
間の処理で不活性化した後、リガーゼ混合物５μｌを、
Contente及びDubnauの方法（Mol.Gen.Genet.,167，（19
79）,p.251-258）に従ってコンピテントとしたバチルス
・サブチリスSMS108（NRRL B−15898）の形質転換に使
用した。
次いで、形質転換した細胞を下記の成分を有するNB培
養地のプレートにおいてカナマイシン耐性及カゼイン分
解活性の不存在に基づいて選別した。
DIFCO栄養ブロス 8.00g MgSO4・７H2O 0.25g KCl 1.00g DIFCO寒天 15.00g FeSO4・７H2O 0.28g MnCl2 1.25mg Ca(NO3)2 164.00mg カゼイン 10.00g カナマイシン 5mg H2O １ Rodriguez及びTaitによって記載された方法（Recombi
nant DNA Techniques:an introduction,（1983）,addis
on-Wesley Publishing Company）に従ってリングをもた
ないKmRコロニーからプラスミドを抽出した。次いで、
合成断片を含有するプラスミドを、酵素BglIIによる消
化及びこのようにして得られたプラスミドDNA断片の7.5
％アクリルアミドゲルにおける分離によって確認した。
pSM127中における合成カルシトニンの定位は、このプ
ラスミドを酵素BstEII（この酵素の制限部位は合成断片
及び中性プロテアーゼ遺伝子内に位置する）で消化する
ことで証明される。
正しい定位であると、それぞれ大略7900bp及び560bp
の２つの断片を生ずるが、正しい定位でない場合には大
略7900bpの断片及び650bpの断片を生ずる。
急速抽出によって得たプラスミドの消化を、30μｌの
反応容積内において、酵素BstEII 1Uにより、この酵素
の供給会社（ベーリンゲル−マンハイム）によって示さ
れた条件下で行った。プラスミドDNA断片を7.5％アクリ
ルアミドゲル上で分離した。
このようにして、正しい定位をもってpSM127内に挿入
された合成カルシトニン断片を有するプラスミドpSM174
（第７図）を単離することが可能であった。
Maxam及びGilbertの方法を用いる配列分析により、得
られた構造が正しいことを確認した。
バチルス・サブチリスSMS108（pSM174）がヒトカルシ
トニンを発現し、分泌する能力を有することを、上澄液
を同位元素標識免疫定量分析（RIA）することで証明し
た。
バチルス・サブチリスSMS108（pSM174）の菌株及びバ
チルス・サブチリスSMS108（NRRL B−15898）の菌株
を、それぞれ50mlのVY（DIFCOヴィール インフュージ
ョン ブロス25g/l、酵母エキス5g/l、H2O 1）を収容
する250mlのエーレンマイヤー フラスコにおいて温度3
7℃で培養した。
１時間毎に一定量（1ml）をこの培養ブロスから取り
出し、４℃においてエッペンドルフ遠心分離機モデル54
14で10分間遠心分離した。
このようにして得た上澄液に、プロテアーゼ阻害剤と
して、フェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）
及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を最終濃度がそれ
ぞれ1mM及び5mMとなるように加えた。
このように処理した上澄液の一定量をカルシトニンの
RIA試験に用いた。これには供給会社Eiken Chemical社
のキット及びその操作仕様を用いた。
得られた結果を第１表に示す。
【図面の簡単な説明】
第１図はpUB110及び中性プロテアーゼ遺伝子で形成され
たプラスミドpSM127の制限酵素地図、第2A図は中性プロ
テアーゼの過産生に関与するnprR2領域のヌクレオチド
配列を示す図、第2B図はバチルス・サブチリスBGSC 1A1
中の中性プロテアーゼ遺伝子の前に存在するnprR2領域
のヌレクオチド配列を示す図、第３図はpC194のCAT遺伝
子及びプラスミドpSM127で形成されるプラスミドpSM153
の構築を説明する図、第４図はバチルス・サブチリスBG
SC 1A1の細菌染色体とCAT遺伝子及びnprR2領域を含む47
00塩基対のpSM153断片との間で生じ得る２つの組換えを
説明する図、第５図は異種遺伝子がpSM127のBglII領域
部位で挿入されている組換えDNA分子の構成を説明する
図、第６図は異種遺伝子がpSM127のHindIII制限部位で
挿入されている組換えDNA分子の構成を説明する図、第
７図はカルシトニン遺伝子を有する合成DNAを含むpSM17
4の構成及び制限酵素地図を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 アントニオ・メーレ イタリー国パビーア市ビア・ラルディラ ーゴ５ (56)参考文献 特開 昭58−500590（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−56080（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−181374（ＪＰ，Ａ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】バチルス・サブチリスにおいて異種蛋白質
    を発現及び分泌するために使用される組換えDNA分子に
    おいて、ａ）プラスミドpSM127から単離した中性プロテ
    アーゼ遺伝子のnprR2、プロモーター領域、リボゾーム
    認識部位及びシグナル配列を包含する下記ヌクレオチド
    配列 を有するDNA配列と、ｂ）前記異種蛋白質を遺伝暗号化
    する異種遺伝子とを包含してなり、前記異種遺伝子の発
    現が前記DNA配列の制御下にあることを特徴とする、組
    換えDNA分子。
  2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載のものにおい
    て、前記異種遺伝子がヒトカルシトニンを遺伝暗号化す
    るものである、組換えDNA分子。
  3. 【請求項３】特許請求の範囲第２項記載のものにおい
    て、前記異種遺伝子が制限部位Bg1IIに挿入されてい
    る、組換えDNA分子。
  4. 【請求項４】特許請求の範囲第３項記載のものにおい
    て、ATCC 53168として寄託されたバチルス・サブチリス
    SMS108（pSM174）中に存在する、組換えDNA分子。
  5. 【請求項５】バチルス・サブチリスにおいて異種蛋白質
    を発現及び分泌するために使用される組換えDNA分子で
    あって、ａ）プラスミドpSM127から単離した中性プロテ
    アーゼ遺伝子のnprR2、プロモーター領域、リボゾーム
    認識部位及びシグナル配列を包含する下記ヌクレオチド
    配列 を有するDNA配列と、ｂ）前記異種蛋白質を遺伝暗号化
    する異種遺伝子とを包含してなり、前記異種遺伝子の発
    現が前記DNA配列の制御下にある組換えDNA分子を得る方
    法において、１）寄託番号NRRL B−15900を有するバチ
    ルス・サブチリス中に存在する前記プラスミドpSM127
    を、HindIII、Bg1II及びEcoRIでなる群から選ばれる制
    限酵素での消化によって線状化し、２）前記１）で得た
    線状化プラスミドを、T4 DNAリガーゼの存在下、該線状
    化プラスミドとの付着端を有する前記異種遺伝子と結合
    させることを特徴とする、組換えDNA分子を得る方法。
  6. 【請求項６】特許請求の範囲第５項記載の方法におい
    て、前記工程１）において前記プラスミドpSM127を制限
    酵素Bg1IIで消化し、前記工程２）における前記異種遺
    伝子がヒトカルシトニンを遺伝暗号化するものである、
    組換えDNA分子を得る方法。
  7. 【請求項７】異種蛋白質を発現及び分泌するために使用
    する組換えDNA分子で形質転換されたバチルス・サブチ
    リスにおいて、前記組換えDNA分子が、ａ）プラスミドp
    SM127から単離した中性プロテアーゼ遺伝子のnprR2、プ
    ロモーター領域、リボゾーム認識部位及びシグナル配列
    を包含する下記ヌクレオチド配列 を有するDNA配列と、ｂ）前記異種蛋白質を遺伝暗号化
    する異種遺伝子とを包含してなり、前記異種遺伝子の発
    現が前記DNA配列の制御下にあるものであることを特徴
    とする、形質転換されたバチルス・サブチリス。
  8. 【請求項８】特許請求の範囲第７項記載の微生物におい
    て、前記異種遺伝子がヒトカルシトニンを遺伝暗号化す
    るものである、形質転換されたバチルス・サブチリス。
  9. 【請求項９】特許請求の範囲第７項又は第８項記載の微
    生物において、ATCC 53168として寄託されたバチルス・
    サブチリスSMS108（pSM174）である、形質転換されたバ
    チルス・サブチリス。
  10. 【請求項１０】異種蛋白質を発現及び分泌する方法にお
    いて、Ｉ）適宜の培養基中において温度10〜51℃で、
    ａ）プラスミドpSM127から単離した中性プロテアーゼ遺
    伝子のnprR2、プロモーター領域、リボゾーム認識部位
    及びシグナル配列を包含する下記ヌクレオチド配列 を有するDNA配列と、ｂ）前記異種蛋白質を遺伝暗号化
    する異種遺伝子とを包含してなり、前記異種遺伝子の発
    現が前記DNA配列の制御下にある組換えDNA分子で形質転
    換したバチルス・サブチリスを培養し、II）異種蛋白質
    を前記培養基から単離し、精製することを特徴とする、
    異種蛋白質を発現及び分泌する方法。
  11. 【請求項１１】特許請求の範囲第10項記載の方法におい
    て、形質転換したバチルス・サブチリスがATCC 53168と
    して寄託されたバチルス・サブチリスSMS108（pSM174）
    である、異種蛋白質を発現及び分泌する方法。
  12. 【請求項１２】特許請求の範囲第10項記載の方法におい
    て、前記異種蛋白質がヒトカルシトニンである、異種蛋
    白質を発現及び分泌する方法。
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