JPH0636742B2 - 組換えｄｎａ宿主細胞の安定化と選択 - Google Patents

組換えｄｎａ宿主細胞の安定化と選択

Info

Publication number
JPH0636742B2
JPH0636742B2 JP56158595A JP15859581A JPH0636742B2 JP H0636742 B2 JPH0636742 B2 JP H0636742B2 JP 56158595 A JP56158595 A JP 56158595A JP 15859581 A JP15859581 A JP 15859581A JP H0636742 B2 JPH0636742 B2 JP H0636742B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
plasmid
gene
coli
fragment
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP56158595A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS57132885A (en
Inventor
チヤ−ルズ・エル・ヘルシユバ−ガ−
アンナ・ケイ・ラデユ−
ポ−ル・ア−ル・ロステツク・ジユニア
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly and Co filed Critical Eli Lilly and Co
Publication of JPS57132885A publication Critical patent/JPS57132885A/ja
Publication of JPH0636742B2 publication Critical patent/JPH0636742B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、機能的ポリペプチドを発現する組換えＤＮＡ
を含有する宿主細胞を安定化および選択する方法に関す
る。
さらに詳しくは、本発明は、組換えＤＮＡを含有する細
菌宿主細胞を安定化し、選択する方法であって、 ｉ）機能的なポリペプチドを発現する遺伝子、 ii）バクテリオファージλcI８５７のcIリプレッサー遺
伝子、 iii）該リプレッサー遺伝子によって発現されるリプレ
ッサーに感受性を有さない複製起点（レプリコン）およ
びプロモーターを含有する組換えＤＮＡクローニングベ
クターで細菌宿主を形質転換し、形質転換された細菌細
胞を、cIリプレッサー遺伝子を産生しないバクテリオフ
ァージλcI９０で感染させ、感染した形質転換細胞を溶
原化させる条件下で培養することからなる方法を提供す
るものである。
（Kaiser,A.D.（１９５７），Ｖirology３：４２−６
１；Berg,Ｄ．Ｅ．（１９７４），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６
２：２２４−２３３） 本発明は組換えＤＮＡクローニングベクター上に担持せ
しめた遺伝子によって抑制される致死性染色体マーカー
を使用することにより、組換えＤＮＡ宿主細胞を安定化
し、選択する手段を与える、選択系（システム）を提供
するものである。このことは、プラスミドのような組換
えＤＮＡクローニングベクターが時折細菌集団から急激
に消失すること、および工場規模の発酵生産では１０
１６以上の細胞が必要とされることから、特に重要であ
る。それ故、所望の生産物をコードする組換えＤＮＡを
プラスミドに挿入した場合には、必須要件ではないにし
ても、培養物を構成する細胞の全てが所望のプラスミド
を含むように、該プラスミドを含有する微生物培養物が
安定化されることが望ましい。このことは、外来ＤＮＡ
を含有する組換えプラスミドが周知のように不安定であ
り、一夜培養後の細胞母集団中、９０％以上が組換えプ
ラスミドを含まなくなることもあるので、重大である。
プラスミドを保持している細胞のみが所望の遺伝子を発
現し得ることから、生産能力が極端に低下する結果とな
る。
組換えプラスミドの安定化法は殆ど文献に記されておら
ず、また、いずれも極めて不都合な点を有している。そ
の一例は、抗生物質耐性遺伝子を組換えプラスミドに包
含させておき、適当な抗生物質を培養培地中に加えるこ
とから成る。抗生物質耐性遺伝子含有プラスミドを保持
する細胞は選択され、該プラスミドを保持しない細胞は
選択されず、従って排除される。この方法の主な欠点
は、抗生物質耐性菌の生産規模の増殖、発酵培地中での
高価な抗生物質の使用、並びに所望の生産物から抗生物
質を除去するための精製工程を必要とする点にある。
染色体の栄養要求突然変異を補う方法も、既知の組換え
プラスミド安定化法の一つである。この方法では発酵培
地の組成を厳しく制限して宿主細菌が必要とする栄養を
培地に加えずに発酵を行う必要がある。しかも、栄養共
生によって、プラスミドの消失後もなお細胞が増殖し得
る可能性がある。このように、これら２つの選択方法は
培地の特殊な処理に依存している。そのような制約は、
発酵工程の費用の増大、および生産性向上のためにとり
得る選択自由度の制限を招く。
従って、培地組成に依存せず、あらゆる発酵条件下で組
換えＤＮＡクローニングベクターを維持し得る、他の選
択方法が強く望まれている。細胞の自己不活化(suicid
e)がこの必要性を満たすために適応できる。即ち、染色
体に致死性マーカーを有し、組換えＤＮＡクローニング
ベクターにリプレッサーもしくは相補遺伝子を有する自
己不活化細胞を構築することができる。これらの内容を
組み込まれた細胞は、そのベクターを失った場合死滅す
ることになろう。本発明はこの原則を具現化し、培地中
の全生存細胞が所望の組換えＤＮＡクローニングベクタ
ーを担持することを保証するものである。このことは、
上記のどの欠点をも持たずに、培養の潜在的生産性を高
めることができることを意味しており、極めて重要であ
る。本明細書に述べるように、本発明はプラスミド含有
細菌集団を、プラスミドに担持されている遺伝子によっ
て抑制される致死性染色体マーカーを用いて選択し、維
持する方法に関するものである。
本発明の目的のために、本明細書中、組換えＤＮＡクロ
ーニングベクターとは、組換えプラスミドに限らず、バ
クテリオファージ、ウイルスなど、１もしくはそれ以上
の付加的ＤＮＡセグメントを付加することができる、あ
るいは既に付加されているＤＮＡ分子から成る物質を指
すものとする。
本明細書中、リプレッサーとは、組換えＤＮＡクローニ
ングベクター上にあって、宿主細胞の染色体中の致死性
遺伝子あるいは条件付致死性遺伝子の発現を抑制もしく
は妨げる遺伝子をいう。
本明細書中、機能なポリペプチドとは、回収可能で生物
学的に活性な、完全に異種の（ヘテロローガスな）ポリ
ペプチドもしくは前駆体、異種ポリペプチドと同種（ホ
モローガス）ポリペプチドの一部もしくは全部から成る
回収可能で生物学的に活性なポリペプチド、または異種
ポリペプチドと特異的に切断され得る生物学的に非活性
な同種ポリペプチドとから成る回収可能な生物学的に非
活性な融合ポリペプチドを意味する。
本明細書中、融合遺伝子生成物とは、同種ポリペプチド
の一部もしくは全部と融合している、回収可能な異種ポ
リペプチドを意味する。
本明細書中、マーカーとは、その機能と染色体もしくは
組換えＤＮＡクローニングベクター上の位置が分かって
いる遺伝子または遺伝子の組合せを意味する。
上記のように、本発明は組換えＤＮＡにコードされてい
る生成物を産生する培養物の培養に用いることができ
る。効果的な選択システムがない場合には、培養物中の
多くの細胞が所望のプラスミドを失ったしまい、その結
果、所望の生産物の生産が著しく低下する。本発明は培
養物中の全生存細胞が組換えＤＮＡクローニングベクタ
ーを保持することを保証するので、本発明を利用すれ
ば、培養物の潜在的な生産能が増強される。
本発明は、合成が組換えＤＮＡクローニングベクターに
よって決まるあらゆる物質の生産に適用できるので、極
めて多様性に富んでいる。好ましい組換えＤＮＡクロー
ニングベクターはプラスミドであるが、バクテリオファ
ージおよび本発明を例示するのに有用な他のベクターも
当業者には明白であろう。本発明の有用性はクローニン
グベクター上にクローニングされた他のマーカーとは無
関係なので、商業上あるいは研究的に価値のある１以上
の遺伝子を保持する組換え菌株にも本発明を利用するこ
とができる。
バクテリオファージλと大腸菌(E.coli)Ｋ１２との相互
作用を例にとり、組換えＤＮＡ宿主細胞の維持および安
定化における細胞自己不活化の適用性を説明する。バク
テリオファージλはテンペレートバクテリオファージで
あり、大腸菌Ｋ１２に感染した場合、排他的な２サイク
ルのいずれかをとる。溶菌段階では、バクテリオファー
ジＤＮＡは自律的に複製し、バクテリオファージ要素の
合成と組み立てを指示して細胞を死滅させると同時に成
熟したバクテリオファージを放出する。溶原化段階で
は、バクテリオファージはプロファージとして宿主染色
体中に集積され、染色体上でマーカーとして複製し、バ
クテリオファージ要素の合成を遮断する。バクテリオフ
ァージ遺伝子λcIは、溶原化状態を維持するリプレッサ
ーをコードしており、遺伝子がバクテリオファージ要素
を発現し、成熟することを阻害する。もしリプレッサー
が不活化されるか細胞から除去される場合には、プロフ
ァージは染色体から遊離して溶菌サイクルに入り、細胞
を死滅させる。欠損λcI遺伝子をもつバクテリオファー
ジは溶原化状態を維持することができず、機能的なリプ
レッサーが他の供給源から供給されない限り、細胞を死
に至らしめる。本発明の一実施態様では、例示するリプ
レッサー依存プロファージとしてλcI９０（Kaiser,A.
D.（１９５７），Ｖirology３：４２−６１；Berg,Ｄ．
Ｅ．（１９７４），Ｖirology６２：２２４−２３３）
を用い、組換えＤＮＡクローニングベクター中にクロー
ニングされたcI遺伝子が機能なリプレッサーとして働
く。
本発明の選択システムおよびその有用性は、バクテリオ
ファージ・ラムダのλcI８５７のリプレッサー遺伝子を
インシュリン・プラスミドpIＡ２Ａ７△４△１およびpI
Ｂ７△４△１上にクローニングすることで示すことがで
きる。
プラスミドpPＲ１は、バクテリオファージλcI８５７の
２．５KbBglIIフラグメントをプラスミドpIＡ７△４△
１のユニークBamHＩ制限部位に挿入することにより構築
された。pIＡ７△４△１の制限部位と機能地図を添付の
第１図に示す。以下に説明するように、pIＡ７△４△１
は大腸菌のトリプトファン・プロモーター、抗生物質耐
性マーカー、およびヒト・インシュリンのＡポリペプチ
ド鎖と融合したtrpE蛋白の一部からなる融合遺伝子生産
物を発現する遺伝子を含有している。
プラスミドpIＡ７△４△１はpBＲ３２２から誘導された
ものであり、実施例１Ａ−Ｉに開示した方法で構築され
る。約束として、記号“△”は欠失を意味する。例え
ば、“△EcoRＩ−XbaＩ”を有するプラスミドは、EcoR
ＩとXbaIの制限酵素切断部位間のヌクレオチド配列部分
が、これらの酵素で消化されて除かれていることを意味
する。便宜上、ある欠失部分を数字で表示している。従
って、親プラスミドpBＲ３２２におけるテトラサイクリ
ン耐性に係る遺伝子に先行するEcoRＩ認識部位の最初の
塩基対("pb")から始めて、"△1"は１−３０bPの欠失
（即ち、△EcoRＩ−HindIII）を意味し、結果としてテ
トラサイクリン・プロモーター／オペレーター系が無能
力になっていることを意味する。"△2"は１−３７５bp
の欠失（即ち、△EcoRＩ−BamHＩ）を意味し、結果とし
てテトラサイクリンのプロモーター／オペレーターと、
テトラサイクリン耐性をコードしている構造遺伝子の一
部との双方が除去されていることを意味する。"△4"はt
rpオペロン断片の〜９００−〜１５００bpが欠失してお
り、trpDポリペプチドの構造遺伝子が除去されているこ
とを意味する。
バクテリオファージ・ラムダのλcI８５７のcIリプレッ
サー遺伝子をプラスミドpIＡ７△４△１にクローニング
すると、pPＲ１と呼ぶ新しいプラスミドが生成し、これ
はバクテリオファージ・ラムダが溶菌性の発展を阻害す
ると同時に、上記融合遺伝子生産物の生産物をもコード
している。pPＲ１の制限部位と機能地図を添付の第２図
に示す。図中、BglII−BamHＩ結合（ライゲーション）
部位は記号‘［Ｂ／Ｂ］’で表されている。
この新しいpPＲ１組換えプラスミドで、例えば大腸菌Ｋ
１２ＲＶ３０８［マウエル(Mauer)、J.Mol.Biol.、１３
９：１４７−１６１（１９８０)]、大腸菌Ｋ１２Ｃ６０
０［バッハマン(Bachman),Bacteriol.Rev.３６，５２６
−５５７（１９７２)]および大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−
MK−［チャン(Chang)およびコーエン(Cohen),Proc.Nat.
Acad.Sci.７１，１０３０−１０３４（１９７４)]を形
質転換し、得られた株をバクテリオファージλcI９０で
溶原化することができる。λcI９０は機能的なcI、リプ
レッサーを産生しないので、構築された菌株、大腸菌Ｋ
１２ＲＶ３０８λcI９０／pPＲ１、大腸菌Ｋ１２Ｃ６０
０λcI９０／pPＲ１および大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK
−λcI９０／pPＲ１はpPＲ１プラスミドを保持しなけれ
ばならないが、構築された菌株大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８
／pPＲ１、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００／pPＲ１および大腸菌
Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−／pPＲ１はプラスミドなしでも
同様によく生存する。これら菌株中のプラスミド保持に
ついて比較すると、本発明の菌株については、実質上，
全ての存在細胞が明らかに所望のプラスミドを保持して
いる。更に、大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８λcI９０／pPＲ
１、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００λcI９０／pPＲ１および大腸
菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−λcI９０／pPＲ１の各菌株は
pPＲ１プラスミドをも保持し、所望の融合遺伝子生産物
（ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法により検出でき
る）を産生するであろう。
プラスミドpPＲ３はバクテリオファージλcI８５７の
２．５kbBglIIフラグメントをプラスミドpIＢ７△４△
１のユニークBamHＩ制限部位に挿入することにより構築
された。pIＢ７△４△１の制限部位と機能地図を添付の
第３図に示す。以下に説明するように、pIＢ７△４△１
はヒトインシュリンのＢポリペプチド鎖と融合したtrp
Ｅ蛋白の一部からなる融合遺伝子生産物を発現する遺伝
子を含有している。
プラスミドpIＢ７△４△１はpIＡ７△４△１について記
載した方法と同様の方法でpBＲ３２２から誘導される。
詳細な構築法は、実施例９に示されている。
バクテリオファージ・ラムダλcI８５７のcIリプレッサ
ー遺伝子をpIＢ７△４△１にクローニングすると、新規
プラスミドpPＲ３が得られる。このプラスミドはバクテ
リオファージ・ラムダの溶解的増殖を阻止すると同時に
上記融合遺伝子生産物の生産物をもコードしている。pP
Ｒ３の制限部位と機能地図を添付の第４図に示す。図
中、BglII−BamHＩ結合部位は記号‘［Ｂ／Ｂ］’で表
されている。
この新しいpPＲ３組換えプラスミドで、例えば大腸菌Ｋ
１２ＲＶ３０８、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００、および大腸菌
Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−を形質転換体し、得られた菌株
をバクテリオファージλcI９０で溶原化することができ
る。溶原化pPＲ１含有菌株について既に記載したよう
に、構築された菌株大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８λcI９０／
pPＲ３、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００λcI９０／pPＲ３および
大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−λcI９０／pPＲ３はpPＲ
３プラスミドの保持を必要とするが、構築された大腸菌
Ｋ１２ＲＶ３０８／pPＲ３、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００／pP
Ｒ３および大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−／pPＲ３はプ
ラスミドを必要とせず、プラスミドなしでも同様によく
生存する。これら菌株中のプラスミド保持について比較
すると、本発明の菌株については、実質的に全ての存在
細胞が所望のプラスミドを保持していることが分か
る。。更に、大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８λcI９０／pPＲ
３、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００λcI９０／pPＲ３および大腸
菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−λcI９０／pPＲ３の菌株は自
身のプラスミドを保持しており、所望の融合遺伝子生産
物（ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法により検出で
きる）を産生するであろう。
本発明の例示に用いるバクテリオファージλcI８５７の
cIリプレッサー遺伝子は、温度感受性で、３８℃〜４４
℃もしくはそれ以上の温度で不活化する。それ故、温度
を３８℃〜４４℃に変化させると本発明によってあらか
じめ宿主細胞菌株中に包含せしめてあるラムダ・プロフ
ァージの溶解サイクルが誘発され、細胞が溶解されてし
まう。容易に判るように、宿主細胞の溶解を惹き起す致
死性マーカーを抑制する温度感受性リプレッサーを使用
し、リプレッサーを不活化する温度で宿主細胞を培養す
ることにより、本発明はまた細胞内生産物を精製するた
めに、簡単で便利かつ安価に細胞を溶解する方法を提供
するものである。
本明細書に示すように、本発明の好ましい実施態様で
は、致死性染色体マーカーを抑制するために、プラスミ
ド担持遺伝子を利用する。細胞の選択はレプリコンおよ
び他のプラスミド上遺伝子と無関係である。更に、ここ
に示した具体例はバクテリオファージλcI８５７を使用
しているが、機能的なリプレッサーを産生する他のλcI
遺伝子を使用することもできる。本発明を例示するのに
用いたプロファージはλcI９０突然変異を担っているの
で、機能的λcIリプレッサーを産生しない。他のバクテ
リオファージλ突然変異株も、もしそれらが機能的cI遺
伝子またはリプレッサーを欠失しているならば使用する
ことができる；容易に理解できるように、そのような突
然変異株が溶原化状態を維持するためには他の供給源か
らのリプレッサーが必要である。
本発明の選択システムでは、プラスミド含有宿主細胞に
種々の有用産生物を発現する遺伝子を担ったベクターを
含有させることができる。例えば、プラスミド担持遺伝
子は、天然遺伝子、非天然遺伝子、または一部天然一部
合成もしくは非天然遺伝子であってよい。具体的には、
本発明はヒトプレ−プロインシュリン、ヒトプロインシ
ュリン、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリンＢ
鎖、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホルモン、非ヒトイ
ンシュリン、ヒトインターフェロン、非ヒトインターフ
ェロン、ウイルス抗原、ウロキナーゼ、ペプチドホルモ
ン類、酵素類、ポリペプチド類、あるいは実質上研究ま
たは商業上価値ある他の遺伝子をコードしているプラス
ミド担持遺伝子を含有する細胞を選択し維持するのに使
用することができる。
本明細書に記載の、本発明の特定の実施態様では、プラ
スミドの複製および遺伝子生産物の発現は、それぞれpM
Ｂ１からのレプリコン[ボリバー(Bolivar)、Life Sci．
２５、８０７〜８１８（１９７９)]、およびlacもしく
はtrpプロモーターによって決定される。他のレプリコ
ンおよびプロモーターも、それらが大腸菌Ｋ１２におい
て機能的であり、用いられる特定のリプレッサーに対し
て感受性でない限り使用することができる。当業者であ
れば、どのレプリコンとプロモーターが大腸菌Ｋ１２で
機能的であり、特定のリプレッサーに対し感受性でない
かを直ちに理解し決定することができる。他のレプリコ
ンの例としてはColＥ１、ＮＲ１、ＲＫ２、ＲＫ６、pS
Ｃ１０１、ＲＰ１、ＲＰ４、Ｆ由来のレプリコン、およ
び大腸菌Ｋ１２中で複製が起こるバクテリオファージ等
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。プ
ロモーターの他の例として、バクテリオファージλ
ＰＬ′プロモーター、リポタンパク質プロモーター、リ
ボゾームタンパク質もしくはＲＮＡプロモーター、およ
び実質上他のあらゆるプロモーターが挙げられる。他の
レプリコンおよびプロモーターも構築可能であって、当
業者には自明である。
本発明は、上記の如く、また以下に説明するようにプラ
スミド担持遺伝子によって抑制される致死性染色体マー
カーを利用して、プラスミド含有細菌集団を選択し維持
する方法を開示する。多くの態様が本発明に可能であ
る。例えば、種々のバクテリオファージがバクテリオフ
ァージλと交換可能であり、他の種類の致死性突然変異
も、それらがプラスミド担持遺伝子によって抑制される
限り利用可能である。本発明に有用な致死性突然変異の
具体例を以下に示すがこれらに限定されるものではな
い。染色体ＤＮＡの複製、細胞壁の合成、リボゾーム機
能、ＲＮＡポリメラーゼ、tＲＮＡ合成と修飾、アミノ
アシルtＲＮＡ合成酵素、ＤＮＡの制限および修飾、お
よび細胞***突然変異である。他の致死性突然変異も当
業者には自明のものである。
大腸菌Ｋ１２は、それについての遺伝的生化学的情報が
豊富にあるので、本発明目的の宿主細胞として好都合で
ある。しかし、本発明は一つの属、種、株に限定される
ものではなく、致死性突然変異およびリプレッサーが利
用可能であるか、単離あるいは構築できる生物であれ
ば、何でも使用することができる。例えば、本発明は、
バシラス属(Bacillus)、バシラス・サブチリス(Bacillu
s subtilis)、スタフィロコッカス属(Staphylococcu
s)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、アクチノ
マイセテス属(Actinomycetes)、ストレプトマイセス属
(Streptomyces)、セラチア属(Serratia)、アグロバクテ
リウム属(Agrobactorium)、およびシュードモナス属(Ps
eudomonas)等の細菌類に適用可能であるが、これらに限
定されない。
本発明の実施態様は全て、培地組成に非感受性であると
いう共通の特徴を有する。それ故、本発明は広範な発酵
操作を可能とし、生産性を改善せしめる。
以下に実施例を挙げ本発明の好適な実施態様を示す。本
発明を構成するための説明および実際の処方を適宜記載
する。
実施例１ プラスミドpIＡ７△４△１の構築 Ａ．プラスミドpBＲＨtrpの構築 プラスミドpGM１は欠失△ＬＥ１４１３を含有する大腸
菌トリプトファン・オペロンを担持しているので、trp
リーダーの最初の６アミノ酸とtrpEポリペプチドの後方
約１／３との融合蛋白（以下、ＬＥ′と表わす）、並び
にtrpDポリペプチドの全てを、いずれもtrpプロモータ
ー−オペレーターの制御下に発現する［ミオザリ(Miozz
ari)ら、J.Bacteriology、１４５７−１４６６（１９７
８)]。大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０tna2trp△１０２／pGM１
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ame
rican Type Culture Collection)（ＡＴＣＣ No.３１
６２２）に寄託されており、該菌体からpGM１を好都合
に除去して下記の工程に使用することができる。
約２０μｇのプラスミドを、このプラスミドを５部位で
開裂する制限酵素PvuIIで消化した。次に、この遺伝子
フラグメントをEcoRＩリンカー（配列pＣＡＴＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧで表わされる自己相補性オリゴヌクレオチド
から成る）と結合させて、EcoRＩ部位含有プラスミドに
クローニングするためのEcoＩ開裂部位を調製した。ｐ
ＧＭ１から得た２０μｇのＤＮＡフラグメントを２００
ピコモルの５′−りん酸化合成オリゴヌクレオチドpＣ
ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧの存在下、２０μＴ４ＤＮＡ
リガーゼ・バッファー（２０mMトリス、pH７．６、０．
５mMＡＴＰ、１０ｍＭ Mg Ｃ2、５mMジチオスレイ
トール）中、１０単位のＴ4ＤＮＡリガーゼにより、４
℃で一夜、処理した。この溶液を結合が停止するまで１
０分間、７０℃に加熱した。リンカーをEcoRＩ消化によ
り開裂し、得られたEcoRＩ末端を持つフラグメントを５
％ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法（以下ＰＡＧＥ
という）により分離した。先ずゲルを臭化エチジウムで
着色し、ＵＶ光線で各フラグメントの位置を確かめ、必
要な部分をゲルから切断することにより、３つの大きい
フラグメントをゲルから単離した。各ゲルフラグメント
を３００μの０．１×ＴＢＥと共に透析バッグに入
れ、０．１×ＴＢＥバッファー中１００Ｖで１時間電気
泳動に付した（ＴＢＥバッファー：水１中に１０．８
gトリス塩基、５．５gホウ酸、０．０９gNa2ＥＤＴＡを
含有）。水溶液を透析バッグから集め、フェノール抽
出、クロロホルム抽出を行い、塩化ナトリウムで０．２
Ｍ濃度とした。ＤＮＡをエタノール沈澱の後、水中に回
収した。EcoRＩ粘着末端をもつtrpプロモーター／オペ
レーター含有遺伝子を、このプロモーター／オペレータ
ーを挿入することによりテトラサイクリング耐性となる
テトラサイクリン感受性プラスミドに挿入する方法で同
定した。以下に記載する全てのＤＮＡフラグメントの単
離は、上記のＰＡＧＥ処理の後、電気溶出法に付す方法
で行うものとする。
Ｂ．Ｔrpプロモーター／オペレーターの制御下にテトラ
サイクリン耐性を発現するプラスミドpBＲＨtrpの構築
および上記‘Ａ’で単離したＤＮＡフラグメントを含有
するＴrpプロモーター／オペレーターの同定と増幅 プラスミドpBＲＨ１［ロドリゲツ(Rodriguez)ら、Nucle
ic Acids Research ６、３２６７−３２８７（１９７
９)]アンピシリン耐性を発現し、テトラサイクリン耐性
に対する遺伝子を含有しているが、それに関連したプロ
モーターがないのでその耐性は発現しない。従って、こ
のプラスミドはテトラサイクリンに感受性を示す。EcoR
Ｉ部位にプロモーター／オペレーター・システムを導入
すると、該プラスミドはテトラサイクリン耐性となる。
プラスミドpBＲＨ１をEcoRＩで消化した。この酵素をフ
ェノール抽出、次いでクロロホルム抽出で除去した後、
該ＤＮＡをエタノール沈澱の後、水中に回収した。得ら
れたＤＮＡ分子を、別々の反応混液中、上記実施例１Ａ
で得た３つのＤＮＡフラグメントのそれぞれと上記の如
く、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって結合（ライゲート）さ
せた。反応混液中に存在するＤＮＡを用いて、コンピテ
ントな大腸菌Ｋ１２株２９４［バックマン(Backmam)
ら、Proc.Nat.Acad.Sci.ＵＳＡ、７３、４１７４−４１
９８（１９７６）；ＡＴＣＣ No.３１４４８］を標準
的な手法［ハーシュフイールド(Hershfield)ら、Proc.N
at.Acad.Sci.ＵＳＡ、７１、３４５５−３４５９（１９
７４）］で形質転換し、次いで、該細菌を２０μｇ／m
のアンピシリンと５μｇ／mのテトラサイクリンを
含んだＬＢ平板培地（ミラー(Miller)、１９７２年）で
平板培養した。
数個のテトラサイクリン耐性コロニーを選択し、プラス
ミドＤＮＡを単離してpBＲＨtrpと命名した。所望フラ
グメントの存在を制限酵素分析で確認した。プラスミド
pBＲＨtrpはβ−ラクタマーゼを発現し、アンピシリン
耐性を伝え、trpプロモーター／オペレーターを含むＤ
ＮＡフラグメントを保持している。このＤＮＡフラグメ
ントはまた、trpリーダーの最初の６アミノ酸とtrpEポ
リペプチドの後方約１／３との融合物である第一蛋白質
（ＬＥ′と命名）、trpDポリペプチドの最初の約半分に
相当する第二の蛋白質（Ｄ′と命名）、およびテトラサ
イクリン耐性遺伝子によってコードされている第三の蛋
白質をもコードしている。
Ｃ．プラスミドpSＯＭ７△２の構築 プラスミドpBＲＨtrpをEcoRＩ制限酵素で消化し、ＰＡ
ＧＥおよび電気溶出法で単離したフラグメントをEcoRＩ
−消化プラスミドpSＯＭ１１［板倉らSci．１９８、１
０５６（１９７７）；英国特許公報No.２００７６７６
Ａ］と結合させた。混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼでライ
ゲート（結合）させ、得られたＤＮＡを上記の如く大腸
菌Ｋ１２株２９４に導入した。形質転換体をアンピシリ
ン含有平板培地上で選択し、得られたアンピシリン耐性
コロニーをコロニーハイブリダイゼーション［グルーエ
ンシュタイン(Gruenstein)ら、Proc.Nat.Acad.Sci.ＵＳ
Ａ、７２、３９５１−３９６５（１９７５)]によりスク
リーニングした。pＢＲＨtrpから単離し、放射性Ｐ３２
で放射活性に標識したtrpプロモーター／オペレーター
含有フラグメントを上記手法のプローブとして使用し
た。いくつかのコロニーがコロニーハイブリダイゼーシ
ョン陽性として選択された。プラスミドＤＮＡを単離
し、挿入したフラグメントの方向を、制限分析、即ちBg
lIIおよびBamHII酵素を用いる二重消化により決定し
た。trpプロモーター／オペレーター・フラグメントを
適切な方向で保持する所望のプラスミドを含有するコロ
ニーを１０μｇ／mのアンピシリンを含有するＬＢ培
地（ミラー(Miller)、１９７２）中で増殖させた。所望
のプラスミドをpSＯＭ７△２と命名し、引き続き以下の
構築に使用した。
Ｄ．プラスミドpTrp２４の構築 １．暗号鎖の５′および３′末端にBglIIとEcoRＩ制限
部位とを持つＬＥ′ポリペプチドの遠隔領域のコドンを
含有する遺伝子フラグメントの構築 プラスミドpSＯＭ７△２をHindIII消化した後、ＬＥ′
暗号化領域内のBglII制限部位を越えて消化するように
選んだ条件下でラムダ・エキソヌクレアーゼ（５′→
３′エキソヌクレアーゼ）で消化した。約２０μｇのHi
ndIII消化pSＯＭ７△２をバッファー（２０mMグリシン
バッファー、pH９．６、１mM MgC2、1mMβ−メルカプ
トエタノール）に溶かした。この混合物を５単位のラム
ダ・エキソヌクレアーゼで室温において６０分間処理し
た。得られた反応混合物をフェノール抽出、クロロホル
ム抽出し、エタノールで沈澱させた。
ＬＥ′遺伝子フラグメントの遠位末端にEcoRＩ残基を創
成するために、プライマー３２ＰＣＣＴＧＴＧＣＡＴＧ
ＡＴを改良ホスホトリエステル法［クレア(Crea)ら、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.ＵＳＡ、７５、１０５７６５（１９７
８)]により合成し、ラムダエキソヌクレアーゼ消化によ
り生成したＬＥ′遺伝子フラグメントの一本鎖末端とハ
イブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、プラ
スミドpSＯＭ７△２のラムダ・エキソヌクレアーゼ処理
したHindIII消化生成物２０μｇを水２０μに溶か
し、上記５′−りん酸化オリゴヌクレオチド約８０ピコ
モルを含有する溶液６μと混合することにより行われ
た。この合成フラグメントをＬＥ′暗号配列の３′末端
にハイブリダイズし、ＬＥ′フラグメントの残る一本鎖
部分を、dAＴＰ、dTＴＰ、dGＴＰおよびdCＴＰを用い、
クレノウ(Klenow)のポリメラーゼＩで充填した。クレノ
ウ・ポリメラーゼＩはＤＮＡポリメラーゼＩを蛋白分解
的に開裂することで得られるフラグメントである。この
フラグメント５′→３′重合活性および３′→５′エキ
ソヌクレオチド分解(exonucleolytic)活性を有するが、
元の酵素の５′→３′エキソヌクレオチド分解活性は示
さない［コーンバーグ(Kornberg)、１９７４年、Ｗ．
Ｈ．Ｆreeman and Co.,SＦＯ、９８］。
反応混合物を５０℃に加熱し、１０℃まで徐々に冷却
し、次いでクレノウ酵素４μを加えた。室温で１５分
間、次いで３７℃で３０分間インキュベーションした
後、５μの0.25Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止し
た。反応混合物をフェノール抽出、次いでクロロホルム
抽出し、エタノールで沈澱させた。このＤＮＡを制限酵
素BglIIで開裂し、そのフラグメントをＰＡＧＥで分離
した。ゲルのオートラジオグラムから、所望の鎖長約４
７０bpの３２Ｐ−標識フラグメントが存在することが判
明し、これを電気溶出で回収した。概説したように、こ
のフラグメントＬＥ′(d)はBglII末端とプライマーの始
まりと一致する平滑末端を有する。
２．プラスミドpThα１の構築 プラスミドpThα１はチモシンアルファ１の合成遺伝子
をプラスミドpBＲ３２２に挿入することにより構築し
た。チモシンアルファ１をコードしているＤＮＡの合成
には、１６−オリゴヌクレオチド（Ｔ１〜Ｔ１６）の合
成と結合が含まれており、添付の第５図では両矢印で示
してある。MetコドンＡＴＧをＮ−末端に挿入し、５′
−末端が容易にEcoRＩおよびBamHＩで開裂したプラスミ
ドと結合するよう、一本鎖粘着端を形成するように設計
した。遺伝子の中心部にあるBglII部位が組換えプラス
ミドの分析に役立つことは容易に理解されるであろう。
オリゴデオキシリボヌクレオチドＴ１〜Ｔ１６は完全に
保護したトリデオキシリボヌクレオチド構築ブロックを
用いる改良ホスホトリエステル法により合成した［板倉
ら、Science、１９８、１０５６（１９７７）およびク
レアら(Crea)（１９７８）］。種々のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドを第１表に示す。
上記の合成は第６図に要約したフラグメントＴ１５につ
いての下記手法により代表される。Ｔ１５合成に用いる
種々のヌクレオチド・フラグメントは、図面に番号を付
して示してある。使用した略記号は次のとおりである。
ＴＰＳＴe:2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルホニ
ルテトラゾール；ＢＳＡ：ベンゼンスルホン酸：ＴＬ
Ｃ：薄層クロマドグラフィー；ＨＰＬＣ：高速液体クロ
マドグラフィー；ＤＭＴ：４，４′−ジメトキシトリチ
ル；ＣＥ：２−シアノエチル；Ｒ:p−クロロフェニル：
Bzベンゾイル；An：アニソール；iBu：イソブチリル；P
y：ピリジン；AcOH：酢酸；Ｅt3N：トリエチルアミン。
完全に保護したトリデオキシリボヌクレオチド４（８５
mg、0.05mmo）および２（１８０mg、0.1mmo）を
７：３(v／v)のクロロホルム／メタノール（各１０m
および２０m）中２％ＢＳＡで０℃において１０分間
処理し、５′−ヒドロキシ位で脱保護した。飽和重炭酸
アンモニウム水溶液２mを加えて反応を停止し、クロ
ロホルム２５mで抽出し、水（２×１０m）で洗浄し
た。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、少量（約５
m）まで濃縮して、石油エーテル（３５〜６０℃画
分）を加えて沈澱ささた。無色の沈澱物を遠心分離して
得、デシケーター中で真空乾燥し、シリカゲルtlc（メ
ルク６０Ｆ２５４、クロロホルム／メタノール、９：
１）で同質（ホモジーニアス）の６および８を得た。
トリマー１および３（２７０mg、0.15mmo；１４５m
g、0.075mmo）をトリエチルアミン／ピリジン／水
（1:3:1、v/v/v、１０m）で室温において２５分間処
理し、対応するホスホジエスチル（５および７）に変換
した。試薬をロータリー・エバポレーターで除去し、残
渣を無水ピリジン（３×１０m）と共に繰り返し蒸留
して乾燥した。トリマー８（0.05mmo）とトリマー７
を、無水ピリジン３m中でＴＰＳＴe(５０mg、0.15mmo
）と一緒にし、反応混合物を減圧下室温で２時間放置
した。ＴＬＣで分析すると、９５％のトリマー８がヘキ
サマー生成物に変換していた（１０％硫酸水をスプレー
し、６０℃に加熱することによりＤＭＴ基を肉眼視、検
出する）。水１．０mを加えて反応を停止し、減圧下
に溶媒を留去した。ピリジンをトルエンと共沸蒸留し、
トリマー４および２について上述したように、このヘキ
サマーの５′位を２％ＢＳＡ（８m）で脱保護した。
生成物（１０）をシリカゲル・カラム（メルク６０Ｈ、
３．５×５cm）にかけ、クロロホルム／メタノール溶媒
系（９８：２〜９５：５、v／v）で段階グラデイエント
溶出した。生成物１０を含むフラクションを蒸発乾固し
た。
同様に、トリマー５を６に結合させ、完全に保護した生
成物を直接シリカゲル上で精製した。後者の化合物を上
記のようにトリエチルアミン／ピリジン／水で処理して
３′末端で脱保護し、フラグメント９を得た。
最後に、ヘキサマー９と１０とを無水ピリジン２m
中、縮合剤としてＴＰＳＴe(７５mg、０．２２５mmo
）を用いて結合させた。反応終了後（４時間、室
温）、混合物をロータリー・エバポレーターで留去し、
残渣をシリカゲルによるクロマトグラフにかけた。生成
物１１（１６０mg）を石油エーテルによる沈澱処理で取
得した。本品はＴＬＣ上単一であった。化合物１１の一
部（２０mg）をピリジン（０．５m）にとかし、濃水
酸化アンモニウム（７m）で処理（８時間、６０
℃）、次いで８０％酢酸で処理（１５分間、室温）して
完全に脱保護した。酢酸を留去し、固型残渣を４％水酸
化アンモニウム水溶液（v／v、４m）にとかし、エチ
ルエーテル（３×２m）で抽出した。水層を１〜２m
に濃縮し、一部をＨＰＬＣに付して１２を精製した。主
要ピークに対応するフラクションを集め（約2.00、Ｄ
254単位）、約５mに濃縮した。最終産物１２をバイオ
ゲル（Bio−gel１．５×１００cm）Ｐ−２上、２０％エ
タノール水で溶出して脱塩し、濃縮乾固して水２００μ
に再懸濁し、Ａ254＝１０の溶液とした。１２の配列
は二次元配列分析により確認した。
完全なチモシンアルファ１遺伝子を、ソマトスタチン
［板倉ら、１９７７年］、インシュリン［ゲッデル(Goe
ddel)ら、１９７９年］および成長ホルモン［ゲッデ
ル、ヘイネカー(Heyneker)ら、Natura、２８１、５４４
（１９７９)]について既に詳細に記載されている方法に
従い、１６個の合成オリゴヌクレオチドから組立てた。
１０μｇのオリゴヌクレオチドＴ２〜Ｔ１５をＴ４ポリ
ヌクレオチド・キナーゼ［ゲッデルら、１９７９年］の
存在下、［Ｙ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（ニュー・イングラン
ド・ヌクレアー）により定量的にリン酸化し、約１Ｃｉ
／mmoの比活性のものを得た。放射性標識フラグメン
トを２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動
法により精製し、溶出したフラグメントの配列を二次元
電気泳動法／部分的蛇毒消化によるホモクロマトグラフ
ィー［ジェイ(Jay)ら、Nucleic Acids Res.１、３３１
（１９７４)]により証明した。フラグメントＴ１および
Ｔ１６は以後のライゲーション反応において不要な重合
を最小に止めるためにリン酸化せずにおいた。これらオ
リゴヌクレオチド（各２μｇ）を、公知の手法［ゲッデ
ルら、１９７９年］により、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
い、４フラグメントからなる４群で結合させた（第７図
参照）。反応生成物を７Ｍの尿素を含む１５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により精製した［マクサム(M
axam)およびギルバート(Gilbert)、Proc.Nat.Acad.Sc
i．ＵＳＡ、７１，３４５５（１９７７)]。４個の別個
の生成物を一緒にライゲートさせ、反応混合物を１０％
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法により分割した。
チモシンアルファ１遺伝子（９０−１０５塩基対）の大
きさに相当するＤＮＡを電気溶出した。
プラスミドpBＲ３２２（0.5μｇ）をBamHＩおよびEcoR
Ｉ制限エンドヌクレアーゼで処理し、そのフラグメント
をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離した。
大きなフラグメントを電気溶出によりゲルから回収し、
次いで組立てた合成ＤＮＡとライゲートさせた［ゲッデ
ル、ハイネカーら、１９７９年］。この混合物を用いて
大腸菌Ｋ１２株２９４、ＡＴＣＣ No.３１４４６を形
質転換した。５％形質転換混合物を２０μｇ／mアン
ピシリン含有ＬＢ平板培地で平板培養した。得られた４
個のアンピシリン耐性コロニーはテトラサイクリンに感
受性を示し、テトラサイクリン耐性遺伝子の挿入を示唆
した。これら４個のコロニーから得たプラスミドを分析
すると、それぞれの場合に、pThα１と命名されたプラ
スミドは、(a)pBR３２２自身には見出されないBglII部
位を有し、第５図に示すチモシンアルファ１遺伝子の存
在を意味し、(b)BamHＩ／EcoRＩ開裂によって生じた約
１０５の対のフラグメントを有することが判った。プラ
スミドpThα１（一定の比率で描かれていない）の構築
工程を第７図に示す。図中、濃い点は５′−リン酸基を
示す。
３．処理pThα１とＬＥ′(d)フラグメントの反応 プラスミドPThα１は、アンピシリン耐性を特定する遺
伝子と、５′暗号鎖末端をコードするEcoRＩ部位に、
３′末端をBamHＩ部位にクローニングしているチモシン
アルファ１を特定する構造遺伝子とを含有している。ま
た、チモシン遺伝子はBglII部位を有する。上で調製し
たＬＥ′(d)フラグメントを受け入れることのできるプ
ラスミドを創成するために、pThα１をEcoRＩで消化
し、次いでクレノウポリメラーゼＩにより、dTＴＰおよ
びdAＴＰと反応させてEcoRＩ残基を平滑末端化した。生
成物をBglIIで消化すると、アンピシリン耐成に関する
遺伝子を有し、対向する両側に粘着性のBglII残基と平
滑末端とを有する直鎖状のＤＮＡフラグメントを生じ
た。この生成物をＴ４リガーゼの存在下、BglII粘着末
端と平滑末端とを有するＬＥ′(d)フラグメントと反応
させて再環化し、プラスミドpTrp２４を得る。その際、
平滑末端ライゲーションが起きた位置にEcoRＩ部位が再
生される。
Ｅ．プラスミドpSＯＭ７△２△４の構築 pTrp２４をBglIIおよびEcoRＩで連続的に消化し、次い
でＰＡＧＥ、電気溶出処理すると、BglII粘着末端と、
３′暗号末端に隣接したEcoRＩ粘着末端とをもつＬＥ′
(d)ポリペプチドのコドンを有するフラグメントが生成
する。ＬＥ′(d)フラグメントをプラスミドpSom７△２
のBglII部位にクローニングすると、トリプトファン・
プロモーター／オペレーターの制御下で発現されるＬ
Ｅ′ポリペプチド／ソマトスタチン融合蛋白が生成され
る。そうするためには、(1)pSom７△２を部分的にEcoR
Ｉ消化してトリプトファン・プロモーター／オペレータ
ーから遠位のEcoRＩ部位を開裂すること、および(2)コ
ドンリーディングフレームを適当に維持し、EcoRＩ開裂
部位を再生させるためにプライマー配列を適切に選択す
ること、が必要である。
１６μｇのプラスミドpSom７△２を、２０mMトリス、pH
７．５、５mM MgC2、0.02ＮＰ４０界面活性剤および
１００mM NaCから成る２００μのバッファーで希釈
し、0.5単位のEcoRＩで処理した。３７℃で１５分間処
理した後、反応混合物をフェノール抽出、クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱の後、BglII消化に付した。大
きい方のフラグメントをＰＡＧＥ処理、次いで電気溶出
により単離した。このフラグメントはＬＥ′ポリペプチ
ドの近位末端のコドン“ＬＥ′(p)”、即ちBglII部位か
ら上流部分を含有している。このフラグメントを、次い
で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、上記ＬＥ′(d)フラ
グメントとライゲートしてプラスミドpSom７△２△４を
得、これを用いて大腸菌２９４株を形質転換すると、ト
リプトファン・プロモーター／オペレーターの制御下
に、完全に再構築されたＬＥポリペプチドとソマトスタ
チンとの融合蛋白質が効率よく生産された。
Ｆ．テトラサイクリン耐性を特定する遺伝子を囲んで、
その３′末端にPstI残基を有し、５′末端にBglII残基
を有する線状ＤＮＡの構築 プラスミドpBＲ３２２をHindIII消化し、HindIII突出末
端をＳ１ヌクレアーゼ消化した。Ｓ１ヌクレアーゼ消化
は、１０μｇのHindIII−開裂pBR３２２を３０μのＳ
１バッファー（0.3ＭNaC、1mMZnC2、２５mM酢酸ナ
トリウム、pH４．５）中で１０３００単位のＳ１ヌクレ
アーゼにより１５℃で３０分間処理することにより行っ
た。反応は１μの３０×Ｓ１ヌクレアーゼ停止溶液
（０．８Ｍトリス塩基、５０mMＥＤＴＡ）を加えて停止
させた。混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽出
し、エタノールで沈澱させた後、上述のようにEcoRＩで
消化した。ＰＡＧＥ処理および電気溶出により、EcoRＩ
粘着末端と暗号鎖がヌクレオチドチミジンで始まる平滑
末端を有するフラグメントを得た。チミジンで始まるＳ
１消化HindIII残基はクレノウ・ポリメラーゼＩ処理Bgl
II残基と結合することができ、結合によりBglII制限部
位が再構築される。
そこで、実施例１Ｃで調製したプラスミドpSＯＭ７△２
をBglII消化し、生成したBglII粘着末端を４種全てのデ
オキシヌクレオチド・トリリン酸エステルを使用し、ク
レノウ・ポリメラーゼＩで処理して二本鎖とした。得ら
れた生成物をEcoRＩで開裂し、ＰＡＧＥ処理して小さい
方のフラグメントを電気溶出し、トリプトファン・プロ
モーター／オペレーターとBglII部位から上流のＬＥ′
の“近位”配列（ＬＥ′(p)）のコドンを含むＤＮＡの
線状片を生成した。この生成物はEcoRＩ末端とBglII部
位を充填したことによる平滑末端とを所有していた。し
かし、上記Ｓ１−消化HindIIIフラグメントの平滑末端
に、この平滑末端を結合せしめることによりBglII部位
は再構成された。即ち、２個のフラグメントをT4ＤＮＡ
リガーゼの存在下でライゲートさせ、受容能力のある
（コンピテント）大腸菌株２９４細胞に導入することに
より増幅させ、再環化されたプラスミドpHＫＹ１０を形
成した。組換えプラスミドpHＫＹ１０を担持するテトラ
サイクリン耐性細胞を選択し、プラスミドＤＮＡを抽出
した。BglIIおよびPstIで消化し、ＰＡＧＥ法で単離す
ることにより、PstIとBglII粘着末端を有する所望の線
状ＤＮＡを得た。このようにしてpHＫＹ１０から生成し
たＤＮＡフラグメントは複製起源を有し、trpプロモー
ター／オペレーターの制御下に、trpＬＥ′ポリペプチ
ド融合蛋白とテトラサイクリン耐性をコードしている２
個の遺伝子の両者をコードしているプラスミドpIＡ７４
△１構築の際の成分として有用である。
Ｇ．Ｔrpプロモーター／オペレーターをもつ線状ＤＮＡ
の構築 実施例１Ｅで調製したプラスミドpSＯＭ７△２△４を部
分的EcoRＩ消化、次いでPstI消化に付した。生成したフ
ラグメントはtrpプロモーター／オペレーターを含有し
ており、ＰＡＧＥ処理、次いで、電気溶出により単離し
た。ソマトスタチン遺伝子の５′末端隣接位で開裂され
ているが、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロモーター
／オペレーター間に存在するEcoRＩ部位が開裂されてい
ないフラグメントを得るために、部分的EcoRＩ消化を行
った。アンピシリン耐性遺伝子内のPstIを切断すること
で失われたアンピシリン耐性は、上記実施例１Ｆで調製
した最終のpHＫＹ１０線状ＤＮＡ誘導体とのライゲーシ
ョンにより回復することができる。
Ｈ．インシュリンＡ鎖構造遺伝子の単離 インシュリンＡ鎖構造遺伝子を、プラスミドｐＩＡ１の
EcoRＩおよびBamI消化によって得た。プラスミドpIＡ１
の構築法は、ゲッテルら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、７
６、１０６（１９７９）に開示されている。所望のフラ
グメントをＰＡＧＥおよび電気溶出により精製したとこ
ろ、それはEcoRＩ末端とBamI末端とを有していた。
Ｉ．インシュリンＡ鎖構造遺伝子、Ｔrpプロモーター／
オペレーター、およびＰstIならびにBglII末端を有する
pHＫＹ１０線状ＤＮＡフラグメントの結合 インシュリンＡ鎖構造遺伝子、trpプロモーター／オペ
レーター含有線状ＤＮＡフラグメント（実施例１Ｇにて
調製）、およびpHＫＹ１０線状ＤＮＡフラグメント（実
施例１Ｆにて調製）を第１図に示したように、適切な方
向でライゲートさせ、所望のプラスミドpIＡ７△４△１
を構築した。プラスミドpIＡ７△４△１はアンピシリン
およびテトラサイクリン耐性を回復しているので、容易
に選択することができる。
実施例２ 組換えプラスミドpPＲ１の構築 プラスミドpIＡ７△４△１はバクテリオファージλcI８
５７の2.5KbBglIIフラグメントを含むλcIとλrexの挿
入が可能な１個のBamHI制限部位を有している。バクテ
リオファージλcI８５７はBglIIに感受性の６個の部位
を有する。１個のBglIIフラグメントは2.5Kbであり、λ
cI遺伝子およびλrex遺伝子を含有する[スジバルスキー
(Szybalski)およびスジバルスキー(Szybalski)、１９７
９、遺伝子(Gene)、７、２１７〜２８０：1980年、３月
号、オブライエン（Ｏ’Ｂrien)出版、遺伝子地図(Gene
tic Maps)、第１巻、ＮＩＨ]。BglIIフラグメントはBam
HIフラグメント上の５′−延長部と同一で且つ相補的な
ＧＡＴＣ配列をもつ５′−延長部を有する。ヒト・イン
シュリンプラスミドpIＡ２はBamHIにより開裂される単
一の部位を有する。このBamHI部位にクローニングする
とpIＡ７△４△１のTc耐性遺伝子が不活化される。BglI
IフラグメントとBamHIフラグメントとライゲートさせる
とその結合部位でＡＧＡＴＣＣ／ＴＣＴＡＧＧまたはＧ
ＧＡＴＣＴ／ＣＣＴＡＧ配列を有する組換え体が得られ
る。これらの配列はBglIIまたはBamHIによって開裂され
ない。従って、両酵素による制限処理で、pIＡ７△４△
１のBamHI部位にλBglIIフラグメントがライゲートされ
ているもの以外の全ライゲーション生成物が除去され
る。このようにして、λBglIIフラグメントをpIＡ７△
４△１のBamHI部位にライゲートすることにより、所望
のpPＲ１プラスミドが得られる。
これらの制限酵素は市販品を購入したもので、その使用
法は業者の説明書に依った。［制限酵素および説明書は
下記製造元より簡単に入手できる：ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリー、私書函６０１０、ロックビル、メリー
ランド２０８５０（Bethesde Research Laboratories I
nc.Box６０１０，Rockville,Maryland２０８５０）；ベ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカル、７９４１、
キャスルウェイ・ドライブ、私書函５０８１６、インデ
ィアナポリス、インディアナ４６２５０（Boehringer M
annheim Biochemicals,７９４１Castleway Drive,Ｐ．
Ｏ．Box５０８１６、Indianapolis,Indiana４６２５
０）；リサーチ・プロダクト・マイルス・ラボラトリー
ズ、エルクハート、インディアナ４６５１５（Research
Products,Miles Laboratories Inc.,Elkhart,Indiana
４６５１５）］。組換えＤＮＡ分子は、3.0×１０
−１３モルの制限ベクターと6.0×１０−１３モルのバ
クテリオファージλ制限フラグメントを含む0.10mの
反応混合物中でT4ＤＮＡリガーゼを用いて形成された。
他の、あるいはより完全な反応条件は、タナカ(Tanaka)
およびワイスブラム(Weissblum)のジャーナル・オブ・
バクテリオロジー(Tanaka and Weissblum,J.Bacterio
l.)、１２１、３５４〜３６２（１９７５）に開示され
ている。
実施例３ 組換えプラスミドpPＲ１による大腸菌Ｋ１２
Ｃ６００RK−MK−の形質転換 大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−〔チャン，コーエン，プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス(Chang and Cohen,Proc.Nat.Acad.Sci.),７１，
１０３０〜１０３４（１９７４）に記載〕の新鮮な一夜
培養物を新鮮なＬ−ブロス〔ミラー，１９７２，エクス
ペリメント・イン・モレキュラー・ジェネティックス，
コールド・スプリング・ハーバーラボ，コールド・スプ
リング・ハーバー、ニューヨーク(Miller,1972,Experim
ents in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab
s,Cold Spring Harabor,New York)に開示〕に１：１０
で継代培養し、３７０℃で１．０時間増殖させた。総量
６６０クレット単位(Klett unit)の細胞を取得し、2.5m
の１００mM塩化ナトリウム水で洗浄し、グリセロール
10.0％を含む１５０mM塩化カルシウム中に懸濁し、室温
で２０分間インキュベートした。細胞を遠心分離により
取得し、0.5mの塩化カルシウム−グリセロールに再懸
濁し、３〜５分間氷で冷却した後、凍結させた。この細
胞懸濁物を使用するまで液体窒素中に保存した。共有結
合的に閉環した環状ＤＮＡの形質転換能あるいは頻度は
保存ならびに貯蔵によって殆んど影響されなかった。細
胞を氷浴中で融解し、ＤＮＡ（実施例２に記載の方法で
調製）0.05m当り細胞0.1mの割合で、2.0μｇ／m
濃度となるように混合した。こうして調製した標品を氷
上で10.0分間冷却し、次いでＬ−ブロス0.85mで希釈
し、３２℃で2.0時間培養した後、Ｌ−寒天〔ミラー(Mi
ller)により開示（１９７２年)〕上に５×109λb2と共
に広げ、３２℃でインキュベートした。
形質転換体を大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−１pPＲ１と
命名し、選択して培養した。得られたコロニーが予期し
た表現型であるかどうかを試験し、プラスミドpPＲ１の
単離と増幅に使用した。プラスミドpPＲ１の制限酵素分
析によれば、λcIよりもλrex遺伝子の方がtrpE−イン
シュリンＡ鎖遺伝子に近かった。上で生成した形質転換
体には逆配向のプラスミドは認められなかった。
実施例４ プラスミドpPＲ１の増幅、単離、および大腸
菌Ｋ１２ＲＶ３０８の形質転換 大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−１pPＲ１のプラスミドＤ
ＮＡをクロラムフェニコールと一緒に増幅し、透明化リ
ゼイト法(cleared lysate procedure)〔バザラル，ヘリ
ンスキー，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー(Bazaral and Helinski,J.Mol.Biol.),３６，１８
５〜１９４（１９６８）に開示〕により単離した。共有
結合的に閉環した環状ＤＮＡを、CsCと二沃化プロピ
ジウム中での平衡化超遠心法により精製した。二沃化プ
ロピジウムを２−プロパノールで抽出し、ＤＮＡをCsC
中、−２０℃で貯蔵した。有効なＤＮＡ溶液をセファ
デックス(Sephadex)ＰＤ１０〔ファルマシア(Pharmaci
a)８００センテニラル・アベニュー，ピスカータウエ
イ，ニュー・ジャージー・０８８５１(Centennial Ave,
Piscataway,New Jersey)〕上クロマトグラフィーに付
し、ＳＳＣ／１０バッファー（0.015Ｍ−NaC，0.0015
Ｍ−クエン酸ナトリウム、pH7.0）中に移し換えた。
組換えプラスミドpPＲ１による大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８
の形質転換は、３００mM塩化カルシウムを用いる他は実
施例３の操作法に従って実施した。標品を0.85mのＬ
−ブロスで希釈し、３２℃で２．０時間培養し、５×１
０９λb2と共にＬ−寒天上に広げ、３２℃でインキュベ
ートした。生存コロニーが予期した表現型であるか否か
を試験すると、所望の大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８／pPＲ１
形質転換体を構成していた。
実施例５ λcI９０を用いた溶原化による大腸菌Ｋ１２
ＲＶ３０８λcI９０／pPＲ１の構築 大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８／pPＲ１（実施例４に従って調
製）を３５クレット単位になるまで３２℃で増殖させ、
次いで４５℃で60.0分間保持した。細胞を感染多重度２
０でλcI９０に感染させ、４５℃で４０分間培養した。
コロニーを１０μｇ／mのアンピシリンを含むＬ−寒
天上、３２℃でインキュベートした。生成した大腸菌Ｋ
１２ＲＶ３０８λcI９０／pPＲ１のコロニーは３２℃で
生育し、４２℃で感受性を有することが試験の結果証明
された。
実施例６ 組換えプラスミドpPＲ１による大腸菌Ｋ１２
Ｃ６００の形質転換 所望の構築は、実質上、実施例４の方法に従って実施す
る。生存コロニーが予期した表現型であるかどうかを試
験することにより、所望の大腸菌Ｋ１２Ｃ６００／pPＲ
１形質転換体を構成しているか否かを確認することがで
きる。
実施例７ λcI９０での溶原化による大腸菌Ｋ１２Ｃ６
００λcI９０／pPＲ１の構築 所望の構築は、実質上、実施例５の方法に従って実施す
る。得られる大腸菌Ｋ１２Ｃ６００λcI９０／pPＲ１の
コロニーは３２℃における増殖および４２℃における感
受性を試験し、確認することが出来る。
実施例８ λcI９０での溶原化による大腸菌Ｋ１２Ｃ６
００RK−MK−λcI９０／pPＲ１の構築 所望の構築は、実施例３の方法に従って大腸菌Ｋ１２Ｃ
６００RK−MK−／pPＲ１を製造し、次に、この形質転換
体を実質上、実施例５の操作法に従ってバクテリオファ
ージλcI９０で溶原化することにより行われた。生存コ
ロニーが予期した表現型であるかどうかを試験したとこ
ろ、所望の株を構成していた。
実施例９ プラスミドpIＢ７△４△１の構築 所望のプラスミドは、最終的なライゲーションにインシ
ュリンＡ鎖ではなくインシュリンＢ鎖を特定する構造遺
伝子を用いる他は実施例１Ａ−Ｉの操作法に従って構築
された。但し、インシュリンＢ鎖構造遺伝子はプラスミ
ドpIＢ１〔構築は、ゲッデルら(Goeddel)により１９７
９年に開示〕のEcoRＩおよびBamHI消化によって得られ
た。インシュリンＢ鎖をコードしているＤＮＡフラグメ
ントを、ＰＡＧＥ処理および電気溶出によって精製する
と、EcoRＩ末端およびBamHI末端を有するフラグメント
が得られた。
プラスミドpIＢ７△４△１は第３図に示したとおりであ
って、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性が再生
されているので、容易に選択される。
実施例１０ 組換えプラスミドpPＲ３の構築 バクテリオファージλcI８５７の２．５ＫｂＢｇIIフ
ラグメントを含有するλcIおよびλrex遺伝子をpIＢ７
△４△１にクローニングするには、プラスミドpIＢ７△
４△１のユニークBamHI制限部位を利用する。この操作
は実質上、実施例２の方法に従って実施する。λＢｇ
IIフラグメントをpIＡ７△４△１のBamHI部位にライゲ
ーションさせると所望のプラスミドpPＲ３が得られる。
実施例１１ 組換えプラスミドpPＲ３による大腸菌Ｋ１
２Ｃ６００RK−MK−の形質転換 実施例２ではなくて、実施例１０で調製したＤＮＡを用
いる他は、実質上、実施例３の操作法に従って大腸菌細
胞を形質転換した。
この形質転換体を大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−１pPＲ
３と命名し、選択して培養した。得られたコロニーが所
期の表現型であるかどうかを試験し、プラスミドpPＲ３
の単離および増幅に利用した。プラスミドpPＲ３の制限
酵素分析によればλcIよりもλrex遺伝子の方がtrpE−
インシュリンＢ鎖遺伝子に近かった。上記の形質転換体
には、逆配向のプラスミドは認められなかった。
実施例１２ 組換えプラスミドpPＲ３の増幅、単離、お
よび大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８への導入 大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK／１pPＲ３のプラスミドＤ
ＮＡを実質上、実施例４の操作法に従って増幅および単
離した。プラスミドpPＲ３を大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８に
導入して大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８／pPＲ３を得る操作は
実質上、実施例４に従った。
実施例１３ 組換えプラスミドpPＲ３による大腸菌Ｋ１
２Ｃ６００の形質転換 プラスミドpPＲ３を大腸菌Ｋ１２Ｃ６００に導入して大
腸菌Ｋ１２Ｃ６００／pPＲ３を得る操作は実質上、実施
例３の方法に従った。生存コロニーが所期の表現型であ
るかどうかを試験すると、所望の大腸菌Ｋ１２Ｃ６００
／pPＲ３形質転換を構成していた。
実施例１４ λcI９０での溶原化におる大腸菌Ｋ１２Ｒ
Ｖ３０８λcI９０／pPＲ３の構築 所望の構築は、実質上、実施例５の方法に従って大腸菌
Ｋ１２ＲＶ３０８／pPＲ３をバクテリオファージλcI９
０で溶原化することにより実施される。得られる大腸菌
Ｋ１２ＲＶ３０８λcI９０／pPＲ３コロニーは３２℃に
おける増殖と４２℃における感受性を試験することで確
認できる。
実施例１５ λcI９０での溶原化による大腸菌Ｋ１２Ｃ
６００λcI９０／pPＲ３の構築 所望の構築は、実質上、実施例５の方法に従って、大腸
菌Ｋ１２Ｃ６００／pPＲ３をバクテリオファージλcI９
０で溶原化することにより実施される。得られる大腸菌
Ｋ１２Ｃ６００λcI９０／pPＲ３のコロニーは３２℃に
おける増殖と、４２℃における感受性とを試験すること
で確認できる。
実施例１６ λcI９０での溶原化による大腸菌Ｋ１２Ｃ
６００RK−MK−λcI９０／pPＲ３の構築 所望の構築は、実施例１１記載の方法に従って大腸菌Ｋ
１２Ｃ６００RK−MK−／pPＲ３を調製し、次いで、実質
上、実施例５の方法に従って形質転換体をバクテリオフ
ァージλcI９０で溶原化することにより実施した。得ら
れた大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−λcI９０／pPＲ３コ
ロニーは、３２℃における増殖と、４２℃における感受
性とを試験することで確認された。
実施例１７ 選択および非選択性の組換えプラスミドpP
Ｒ３含有宿主細胞の安定性を測定する方法 プラスミドの保持を試験するための株を、周期的に新鮮
な培地に継代培養することにより、非選択性培地（Ｌ−
ブロス）で対数増殖させた。組換えプラスミド上のApr
遺伝子を用いて、プラスミド含有細胞の頻度を検定する
ことにより求めた。段階希釈した培養株をＬ−寒天培地
上に展開し、１０μｇ／mアンピシリンの存在もしく
は非存在下に３２℃で増殖させた。プラスミド+細胞の
頻度は、アンピシリン非存在下、Ｌ−寒天培地上で生育
したコロニーの総数に対するアンピシリン耐性コロニー
の比で表わした、または、Ｌ−寒天上のコロニーを１０
μｇ／mアンピシリン含有Ｌ−寒天上にレプリカ平板
培養し、３２℃で増殖させてもよい。プラスミド+細胞
の頻度は、アンピシリン非存在下における、Ｌ−寒天上
で生育したコロニー総数に対するアンピシリン耐性コロ
ニーの割合で示される。
組換えプラスミドの安定性は、上記実施例１７の記載に
従って測定された。大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−λcI
９０／pPＲ３および大腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−／pP
Ｒ３株に関する結果を％で表２に示した。
表２の結果は、本発明の選択システムが組換えプラスミ
ドを細菌集団に保持せしめる上で、非常にすぐれた選択
システムであるということを明確に示すものである。大
腸菌Ｋ１２Ｃ６００RK−MK−／pPＲ３培養物の約１００
％の細胞が３４回の培希釈培養後にプラスミドを欠損し
ていた。しかし本発明の選択システムを有する大腸菌Ｃ
６００RK−MK−λcI９０／pPＲ３培養物中の細胞では３
４回の培希釈培養後でもプラスミドを欠損している細胞
は全くみとめられなかった。さらに増殖させるとわずか
にプラスミドの分離が認められた。しかしながら、結果
はおそらく、プロファージとプラスミドとの組換えを反
映しているものと思われる。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpIＡ７△４△１の制限部位および機
能地図、第２図はプラスミドpPＲ１の制限部位および機
能地図、第３図はプラスミドpIＢ７△４△Ｉの制限部位
および機能地図、第４図はプラスミドpPＲ３の制限部位
および機能地図、第５図はチモシンアルファＩ遺伝子の
塩基配列およびそれによってコードされているアミノ酸
配列の模式図、第６図はフラグメントＴ１５の合成工程
図、第７図はプラスミドpTrα１の構築模式図である。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】組換えＤＮＡを含有する細菌宿主細胞を安
    定化および選択する方法であって、 ｉ）機能的なポリペプチドを発現する遺伝子、 ii）バクテリオファージλcI８５７のcIリプレッサー遺
    伝子、および iii）該リプレッサー遺伝子によって発現されるリプレ
    ッサーに感受性を有さない複製起点およびプロモーター
    を含有する組換えＤＮＡクローニングベクターで細菌宿
    主を形質転換し、形質転換された細菌細胞を、cIリプレ
    ッサー遺伝子を産生しないバクテリオファージλcI９０
    で感染させ、感染した形質転換細胞を溶原化させる条件
    下で培養することからなる方法。
  2. 【請求項２】ベクターがプラスミドである請求項１に記
    載の方法。
  3. 【請求項３】cIリプレッサー遺伝子を含有するベクター
    がプラスミドpPＲ１またはpPＲ３である請求項２に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】細菌細胞が大腸菌細胞である請求項１、２
    または３に記載の方法。
JP56158595A 1980-10-03 1981-10-02 組換えｄｎａ宿主細胞の安定化と選択 Expired - Lifetime JPH0636742B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19355680A 1980-10-03 1980-10-03
US193556 1980-10-03
US275088 1981-06-18
US06/275,088 US4506013A (en) 1980-10-03 1981-06-18 Stabilizing and selecting recombinant DNA host cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4320470A Division JPH0669369B2 (ja) 1980-10-03 1992-11-30 安定化された組換えｄｎａ宿主細胞

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS57132885A JPS57132885A (en) 1982-08-17
JPH0636742B2 true JPH0636742B2 (ja) 1994-05-18

Family

ID=26889117

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP56158595A Expired - Lifetime JPH0636742B2 (ja) 1980-10-03 1981-10-02 組換えｄｎａ宿主細胞の安定化と選択
JP4320470A Expired - Lifetime JPH0669369B2 (ja) 1980-10-03 1992-11-30 安定化された組換えｄｎａ宿主細胞

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4320470A Expired - Lifetime JPH0669369B2 (ja) 1980-10-03 1992-11-30 安定化された組換えｄｎａ宿主細胞

Country Status (21)

Country Link
US (1) US4506013A (ja)
EP (1) EP0049619B1 (ja)
JP (2) JPH0636742B2 (ja)
AU (1) AU543168B2 (ja)
BR (1) BR8106374A (ja)
CA (1) CA1189467A (ja)
DD (1) DD209476A5 (ja)
DE (1) DE3177100D1 (ja)
DK (1) DK437281A (ja)
ES (1) ES8305413A1 (ja)
FI (1) FI813069L (ja)
GB (1) GB2084584B (ja)
GR (1) GR75339B (ja)
IE (1) IE51796B1 (ja)
IL (1) IL63981A (ja)
NZ (1) NZ198539A (ja)
PH (1) PH19901A (ja)
PL (1) PL233296A1 (ja)
PT (1) PT73768B (ja)
RO (1) RO87260A (ja)
SU (1) SU1187725A3 (ja)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5878589A (ja) * 1981-11-06 1983-05-12 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd プラスミド含有微生物の培養法
US4436815A (en) * 1981-11-27 1984-03-13 Eli Lilly And Company Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cells
US4650761A (en) * 1981-11-27 1987-03-17 Eli Lilly And Company Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cell
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
IL68366A (en) * 1982-04-15 1990-08-31 Genentech Inc Process for expressing a gene encoding a protein comprising the enzymatic portion of human urokinase in a microorganism or cell culture
US5112755A (en) * 1982-04-15 1992-05-12 Genentech, Inc. Preparation of functional human urokinase proteins
US4863855A (en) * 1982-05-14 1989-09-05 The Research Foundation Of State University Of New York Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts
US4530904A (en) * 1982-09-03 1985-07-23 Eli Lilly And Company Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria
US4673641A (en) * 1982-12-16 1987-06-16 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Co-aggregate purification of proteins
GB8308483D0 (en) * 1983-03-28 1983-05-05 Health Lab Service Board Secretion of gene products
US4912046A (en) * 1983-06-27 1990-03-27 Genentech, Inc. Portable inducible control system
US4637980A (en) * 1983-08-09 1987-01-20 Smithkline Beckman Corporation Externalization of products of bacteria
EP0155189A3 (en) * 1984-03-16 1987-09-16 Genentech, Inc. Expression of cell wall degrading proteins and host cells harboring dna encoding such protein
IL71555A (en) * 1984-04-15 1992-06-21 State Of Israel Israel Inst Fo Bovine interferon
US5871957A (en) * 1984-05-25 1999-02-16 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs
US5723292A (en) * 1984-05-25 1998-03-03 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs
AU600885B2 (en) * 1984-05-25 1990-08-30 Zymogenetics Inc. Stable DNA constructs
US5081020A (en) * 1984-08-27 1992-01-14 Bio-Technology General Corp. Expression vectors containing λPL promoter, T1 T2 rRNA termination sequence and origin of replication derived from a constitutive high copy number plasmid hosts and related methods
US5059529A (en) * 1984-08-27 1991-10-22 Bio-Technology General Corp. Stabilized expression vectors containing λPL promoter and the gene for the cI434 repressor, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods
US5143836A (en) * 1984-08-27 1992-09-01 Bio-Technology General Corp. Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda pl promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof
CA1340597C (en) * 1984-08-27 1999-06-22 Haim Aviv Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods
US5162217A (en) * 1984-08-27 1992-11-10 Bio-Technology General Corp. Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda PL promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof
US5759816A (en) * 1984-08-27 1998-06-02 Bio-Technology General Corp. Expression vectors containing λPL promoter and T1 T2 rRNA termination sequence plasmids containing the vectors hosts containing the plasmids and related methods
US5112744A (en) * 1984-08-27 1992-05-12 Bio-Technology General Corp. Plasmids for the production of human Cu-Zn superoxide dismutase, bacterial hosts containing the plasmids and methods for production and recovery of such superoxide dismutase
US4766066A (en) * 1984-09-27 1988-08-23 Eli Lilly And Company Method of using bacteriophage lambda p1 promoter to produce a functional polypeptide in streptomyces
US5840527A (en) * 1984-12-11 1998-11-24 Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik Gmbh Recombinant alveolar surfactant protein
US5169761A (en) * 1984-12-11 1992-12-08 California Biotechnology Inc. Dna encoding and expression systems for alveolar surfactant proteins
US4659805A (en) * 1984-12-11 1987-04-21 California Biotechnology, Inc. Recombinant alveolar surfactant protein
US4912038A (en) * 1984-12-11 1990-03-27 California Biotechnology Inc. Recombinant DNA sequence encoding alveolar surfactant protein
DK594084A (da) * 1984-12-12 1986-06-13 Novo Industri As Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning
US5206154A (en) * 1985-01-28 1993-04-27 Xoma Corporation Method of producing cecropins by microbiological techniques
US5028530A (en) * 1985-01-28 1991-07-02 Xoma Corporation AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques
DK275685D0 (da) * 1985-06-18 1985-06-18 Benzon As Alfred Stabilisering af biologiske systemer
SE8505027D0 (sv) * 1985-10-24 1985-10-24 Kabigen Ab A lytic virulent phage, a hostcell containing same and a process for protein production
AU7232087A (en) * 1986-03-26 1987-10-20 Genexpress Aps Biological containment
US5279939A (en) * 1986-08-18 1994-01-18 Smithkline Beecham Corporation Protein protease inhibitors from streptomyces
WO1988005820A1 (en) * 1987-01-29 1988-08-11 California Biotechnology, Inc. Recombinant alveolar surfactant protein
NL8701450A (nl) * 1987-06-22 1989-01-16 Solvay Werkwijze voor het transformeren van cellen.
US4960707A (en) * 1987-08-17 1990-10-02 Associated Universities, Inc. Recombinant plasmids for encoding restriction enzymes DpnI and DpnII of streptococcus pneumontae
US5002875A (en) * 1987-08-28 1991-03-26 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Plasimids containing the gene for DNA polymerase I from Streptococcus pneumoniae
US5198346A (en) * 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) * 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
WO1996040947A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Washington University Recombinant bacterial system with environmentally limited viability
HUE031597T2 (en) * 2009-05-22 2017-07-28 Merial Inc Antibiotic-free plasmid

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) * 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
AT373279B (de) * 1977-11-08 1984-01-10 Genentech Inc Verfahren zur herstellung eines rekombinationsclonbildungstraegers
US4356270A (en) * 1977-11-08 1982-10-26 Genentech, Inc. Recombinant DNA cloning vehicle
DE2963374D1 (en) * 1978-10-10 1982-09-09 Univ Leland Stanford Junior Recombinant dna, method for preparing it and production of foreign proteins by unicellular hosts containing it
JPS55156591A (en) * 1979-05-23 1980-12-05 Ajinomoto Co Inc Method for stabilizing property of bacteria containing plasmid

Also Published As

Publication number Publication date
IL63981A0 (en) 1982-01-31
JPS57132885A (en) 1982-08-17
AU7601281A (en) 1982-04-08
CA1189467A (en) 1985-06-25
JPH05292951A (ja) 1993-11-09
GR75339B (ja) 1984-07-13
JPH0669369B2 (ja) 1994-09-07
EP0049619B1 (en) 1989-09-06
PT73768B (en) 1983-11-30
NZ198539A (en) 1985-07-12
ES506000A0 (es) 1982-12-16
PL233296A1 (en) 1983-07-18
DE3177100D1 (en) 1989-10-12
FI813069L (fi) 1982-04-04
DD209476A5 (de) 1984-05-09
GB2084584B (en) 1984-02-08
GB2084584A (en) 1982-04-15
SU1187725A3 (ru) 1985-10-23
IE812297L (en) 1982-04-03
ES8305413A1 (es) 1982-12-16
EP0049619A3 (en) 1983-03-16
PH19901A (en) 1986-08-13
BR8106374A (pt) 1982-06-22
PT73768A (en) 1981-11-01
IE51796B1 (en) 1987-04-01
US4506013A (en) 1985-03-19
EP0049619A2 (en) 1982-04-14
AU543168B2 (en) 1985-04-04
DK437281A (da) 1982-04-04
RO87260A (ro) 1986-07-30
IL63981A (en) 1989-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0636742B2 (ja) 組換えｄｎａ宿主細胞の安定化と選択
US4436815A (en) Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cells
Senecoff et al. The FLP recombinase of the yeast 2-micron plasmid: characterization of its recombination site.
JP2694840B2 (ja) ポリペプチドを微生物により発現させる方法
GB2121047A (en) Microbial expression of quasi-synthetic genes
CS238645B2 (en) Design method of plasmide capable to separate heterological gen
US4530904A (en) Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria
US4650761A (en) Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cell
EP0159123B1 (en) Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives
JP2549504B2 (ja) Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物
US4732859A (en) Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria
EP0154539A2 (en) Recombinant DNA expression vectors and method for gene expression
US5021340A (en) Cloning vector, molecules of recombinant DNA, bacillus subtilis strains transformed with the said molecules and methods for the expression of heterologous genes and the production and secretion of proteins coded by the said genes
JPH0712312B2 (ja) 改良された抗生物質耐性遺伝子
JP2538200B2 (ja) ポリペプチド分泌発現ベクタ―及び形質転換微生物
CA1156166A (en) Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
JPH0695940B2 (ja) 枯草菌およびその形成方法
JPH062065B2 (ja) 魚類の成長ホルモン遺伝子および該遺伝子のコ−ドするポリペプチド
JPH01502639A (ja) ヒトインターロイキン―２の合成についてコードする組換えプラスミドＤＮＡｐＰＲ―１Ｌ２―１９、その工学的作出方法及びそれを含有するヒトインターロイキン―２産生細菌大腸菌ＶＮ２ジェネティカＶＬ９０３（ｐＰＲ―１Ｌ２―１９）株
HU200366B (en) Process for producing modified hygromycin resistance gene