JP2540039B2 - プラスミドベクタ− - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、バシラス（Bacillus）属の菌株において発
現し、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝子の
クローニングに使用されるプラスミドベクター；クロー
ニングベクター及びヒト生長ホルモン構造遺伝子を包含
してなる組換DNA分子；及び構造遺伝子を発現させるこ
とができ、かつヒト生長ホルモンを高収率で産生する組
換DNA分子によって形質転換された微生物に係る。
現し、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝子の
クローニングに使用されるプラスミドベクター；クロー
ニングベクター及びヒト生長ホルモン構造遺伝子を包含
してなる組換DNA分子；及び構造遺伝子を発現させるこ
とができ、かつヒト生長ホルモンを高収率で産生する組
換DNA分子によって形質転換された微生物に係る。
本発明は、前記形質転換された微生物を好適な培養環
境で培養し、このようにして合成されたホルモンを菌か
ら回収することからなるヒト生長ホルモンの製法にも係
る。
境で培養し、このようにして合成されたホルモンを菌か
ら回収することからなるヒト生長ホルモンの製法にも係
る。
ヒト生長ホルモン（hGH）は、通常、各個人の生存
中、下垂体前葉で産生され、分泌されるもので、成人期
前では、その産生量も多い。
中、下垂体前葉で産生され、分泌されるもので、成人期
前では、その産生量も多い。
このホルモンは、アミノ末端部に分泌シグナル配列及
び成熟hGHタンパク質の配列を含有する前駆体（pre-hG
H）の形で産生される。分泌過程の間に、シグナル配列
は膜レベルにおいて除去され、成熟タンパク質が分泌さ
れる。
び成熟hGHタンパク質の配列を含有する前駆体（pre-hG
H）の形で産生される。分泌過程の間に、シグナル配列
は膜レベルにおいて除去され、成熟タンパク質が分泌さ
れる。
生長ホルモンはアミノ酸191個で構成されており、分
子量21,500ダルトンを有する。
子量21,500ダルトンを有する。
作用機序は末だ明確ではないが、hGHは骨格の生長、
窒素の固定及びタンパク質合成を促進し、脂質及び糖質
の代謝に影響を及ぼす。
窒素の固定及びタンパク質合成を促進し、脂質及び糖質
の代謝に影響を及ぼす。
ホルモン欠損による各種障害は、これまで、死体の下
垂体から単離されたヒト生長ホルモンを使用して治療さ
れていた。しかしながら、かかるホルモンの単離及び精
製の操作は煩雑であり、かつ高価である。
垂体から単離されたヒト生長ホルモンを使用して治療さ
れていた。しかしながら、かかるホルモンの単離及び精
製の操作は煩雑であり、かつ高価である。
さらに、得られるホルモンの量が少ないため、hGHに
よる治療は最も重篤なケースにのみ限られており、従っ
て、このホルモンを手ごろなコスト、良好な生産量で製
造できる他の方法の開発が希求されていた。
よる治療は最も重篤なケースにのみ限られており、従っ
て、このホルモンを手ごろなコスト、良好な生産量で製
造できる他の方法の開発が希求されていた。
遺伝子工学の分野における近年の発展により、異種遺
伝子を含有するハイブリッドDNA分子を構成し、このハ
イブリッド分子によって形質転換された微生物を培養し
て、構造遺伝子に係る暗号づけタンパク質を生産できる
ようになってきた。
伝子を含有するハイブリッドDNA分子を構成し、このハ
イブリッド分子によって形質転換された微生物を培養し
て、構造遺伝子に係る暗号づけタンパク質を生産できる
ようになってきた。
各種技術文献及び特許明細書には組換DNA技術による
ヒト生長ホルモンの生産に係る多数の方法が開示されて
いる。
ヒト生長ホルモンの生産に係る多数の方法が開示されて
いる。
英国特許出願第2,055,982号はハイブリッドプラスミ
ドベクターを構成し、このハイブリッドプラスミドベク
ターを使用して形質転換せしめたエシェリキア・コリ
（Escherichia coli）（E.コリと表示する）の菌株を培
養することによる半合成遺伝子、さらに詳述すればhGH
遺伝子の発現に関するものである。
ドベクターを構成し、このハイブリッドプラスミドベク
ターを使用して形質転換せしめたエシェリキア・コリ
（Escherichia coli）（E.コリと表示する）の菌株を培
養することによる半合成遺伝子、さらに詳述すればhGH
遺伝子の発現に関するものである。
ヨーロッパ特許公開第20,147号には、ヒト生長ホルモ
ンベクター及び該ベクターによって形質転換されたE.コ
リの菌株が開示されている。
ンベクター及び該ベクターによって形質転換されたE.コ
リの菌株が開示されている。
しかしながら、これらの公知の方法は、E.コリ（通
常、ヒト又は動物の腸管系に存在する病原性グラム陰性
細菌である）での発現ベクターを使用してhGHを生産す
るものである。
常、ヒト又は動物の腸管系に存在する病原性グラム陰性
細菌である）での発現ベクターを使用してhGHを生産す
るものである。
形質転換されたE.コリの菌株を発酵させるためには、
汚染及び伝染を防止するよう制御された培養システムを
使用する必要がある。
汚染及び伝染を防止するよう制御された培養システムを
使用する必要がある。
工業的には、バシラス属の菌は、E.コリの菌株に代わ
る好適な代用細菌である。これは、バシラス属の菌が非
病原性であり、容易に培養可能であり、かつ発酵工業に
おいて長期間使用されてきているものである（De babov
「ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・バシリ
ー（The Molecular Biology of the Bacilli）1,332（1
982））ことによる。
る好適な代用細菌である。これは、バシラス属の菌が非
病原性であり、容易に培養可能であり、かつ発酵工業に
おいて長期間使用されてきているものである（De babov
「ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・バシリ
ー（The Molecular Biology of the Bacilli）1,332（1
982））ことによる。
しかし、異種タンパク質の生産における宿主微生物と
してバシラス属の菌を使用することは、これまで制限さ
れていた。これは、主として、異種遺伝子を有効に発現
させかつその暗号づけタンパク質を高収率で産生するク
ローニングベクターに欠けていたためである。
してバシラス属の菌を使用することは、これまで制限さ
れていた。これは、主として、異種遺伝子を有効に発現
させかつその暗号づけタンパク質を高収率で産生するク
ローニングベクターに欠けていたためである。
発明者らは、バシラス属の菌の細胞内に好適な状態で
保有されうる（これにより、公知技術の問題点が解消さ
れる）クローニングベクターを開発し、本発明に至っ
た。従って、本発明の第１の目的はバシラス属の菌にお
いて発現可能であって、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化
する構造遺伝子をクローニングするために使用されるプ
ラスミドベクターにある。
保有されうる（これにより、公知技術の問題点が解消さ
れる）クローニングベクターを開発し、本発明に至っ
た。従って、本発明の第１の目的はバシラス属の菌にお
いて発現可能であって、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化
する構造遺伝子をクローニングするために使用されるプ
ラスミドベクターにある。
本発明の他の目的は、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化
するヌクレオチド配列にクローニングベクターを結合せ
しめることにより得られるバシラス属細菌においてヒト
生長ホルモンを発現する組換DNA分子にある。
するヌクレオチド配列にクローニングベクターを結合せ
しめることにより得られるバシラス属細菌においてヒト
生長ホルモンを発現する組換DNA分子にある。
本発明の他の目的は、生長ホルモン構造遺伝子を発現
させることができ、これにより、生長ホルモンを高収率
で産生しうる組換DNA分子によって形質転換されたバシ
ラス属の微生物にある。
させることができ、これにより、生長ホルモンを高収率
で産生しうる組換DNA分子によって形質転換されたバシ
ラス属の微生物にある。
本発明のさらに他の目的は、形質転換された微生物を
適当な培養環境で培養し、合成されたホルモンを菌から
分離することからなるヒト生長ホルモンの製法にある。
適当な培養環境で培養し、合成されたホルモンを菌から
分離することからなるヒト生長ホルモンの製法にある。
本発明の他の目的については、後述の実施例等の記載
より明らかになるであろう。
より明らかになるであろう。
本発明によれば、クローニングベクターは、特開昭61
-257,189号記載のベクターpSM143（ATCC 53038）を源と
し、750塩基対（bp）Xba I-EcoR Iフラグメントを下記
配列を有する合成73bpフラグメントにより置換すること
によって構成される。
-257,189号記載のベクターpSM143（ATCC 53038）を源と
し、750塩基対（bp）Xba I-EcoR Iフラグメントを下記
配列を有する合成73bpフラグメントにより置換すること
によって構成される。
73bpフラグメントを調製してプロモーター配列及びリ
ボゾーム認識配列（RBS）を得る。これら両配列は、RNA
ポリメラーゼ及びバシラス属細菌リボゾームによって認
識されるものであり、上述の配列のコントロール下で配
置されたヒト生長ホルモンの構造遺伝子を効果的に発現
させる。
ボゾーム認識配列（RBS）を得る。これら両配列は、RNA
ポリメラーゼ及びバシラス属細菌リボゾームによって認
識されるものであり、上述の配列のコントロール下で配
置されたヒト生長ホルモンの構造遺伝子を効果的に発現
させる。
さらに詳述すれば、プラスミドベクターpSM143（その
制限酵素地図を第１図に示す）を、緩衝液中、37℃にお
いて制限酵素EcoR I及びXba Iで１時間消化する。つい
で、反応混合物をフエノール−クロロホルム及びクロロ
ホルム−イソアミルで処理することによって酵素反応を
停止させ、DNAを沈殿、分離し、最後に73bp合成フラグ
メントに結合させる。この結合反応は、緩衝液中、T4 D
NAリガーゼの存在下、14℃において、約６時間で行なわ
れる。E.コリのコンピテント菌を形質転換させるために
全リガーゼ混合物を使用し、形質転換された菌をアンピ
シリンを含有するプレート上で選別する。
制限酵素地図を第１図に示す）を、緩衝液中、37℃にお
いて制限酵素EcoR I及びXba Iで１時間消化する。つい
で、反応混合物をフエノール−クロロホルム及びクロロ
ホルム−イソアミルで処理することによって酵素反応を
停止させ、DNAを沈殿、分離し、最後に73bp合成フラグ
メントに結合させる。この結合反応は、緩衝液中、T4 D
NAリガーゼの存在下、14℃において、約６時間で行なわ
れる。E.コリのコンピテント菌を形質転換させるために
全リガーゼ混合物を使用し、形質転換された菌をアンピ
シリンを含有するプレート上で選別する。
得られた陽性のクローン（AmpR）の中から、750bpフ
ラグメントEcoR I-Xba Iが73bp合成フラグメントで置換
されているプラスミドを含有するクローンを選別する。
ラグメントEcoR I-Xba Iが73bp合成フラグメントで置換
されているプラスミドを含有するクローンを選別する。
ついで、このプラスミド（pSM 208と称する）を使用
して、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝子を
クローン化し、組換DNA分子を構成する。
して、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝子を
クローン化し、組換DNA分子を構成する。
生長ホルモンの構造遺伝子はManiatisらの方法（「モ
レキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニユ
アル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」p13
5,140,143-Cold Spring Harbor 1982）、実際に使用さ
れている合成法の１つ（「オリゴヌクレオチド・シンセ
シス−プラクティカル・アプローチ・シリーズ（Olgonu
cleotides Synthesis-Practical Approach Series）」I
RL Press Limited発行）又はGoeddelらの半合成法
（「ネーチャー（Nature）」281,p544（1979））により
得られる。
レキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニユ
アル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」p13
5,140,143-Cold Spring Harbor 1982）、実際に使用さ
れている合成法の１つ（「オリゴヌクレオチド・シンセ
シス−プラクティカル・アプローチ・シリーズ（Olgonu
cleotides Synthesis-Practical Approach Series）」I
RL Press Limited発行）又はGoeddelらの半合成法
（「ネーチャー（Nature）」281,p544（1979））により
得られる。
遺伝子の調製法は本発明を限定するものではない。本
発明によれば、hGHの構造遺伝子は、たとえば半合成法
により調製される。
発明によれば、hGHの構造遺伝子は、たとえば半合成法
により調製される。
さらに詳述すれば、全RNAをヒト下垂体組織から単離
し、その後、オリゴ（dT）セルロース上での親和性クロ
マトグラフィーにより、mRNA（RNAポリアデニレート）
を全RNAから分離する（Edmondsら「プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイイエ
ンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・
アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）」68,p1336（197
1））。ついで、得られたmRNAを使用し、Maniatisらの
方法（「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」p21
7,Cold Spring Harbor 1982）に従ってcDNAを合成す
る。
し、その後、オリゴ（dT）セルロース上での親和性クロ
マトグラフィーにより、mRNA（RNAポリアデニレート）
を全RNAから分離する（Edmondsら「プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイイエ
ンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・
アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）」68,p1336（197
1））。ついで、得られたmRNAを使用し、Maniatisらの
方法（「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」p21
7,Cold Spring Harbor 1982）に従ってcDNAを合成す
る。
得られた下垂体cDNA分子をHind III合成リンカー（Bi
olabs）に結合させ、プラスミドpBR 322のHind III制限
位置に挿入する。ついで、得られたハイブリッドプラス
ミド（pBR 322-cDNA）を使用して、アンピシリン耐性を
有するE.コリの菌を形質転換させる。
olabs）に結合させ、プラスミドpBR 322のHind III制限
位置に挿入する。ついで、得られたハイブリッドプラス
ミド（pBR 322-cDNA）を使用して、アンピシリン耐性を
有するE.コリの菌を形質転換させる。
陽性のクローンを、ハイブリダイゼーション法によ
り、hGH遺伝子のヌクレオチド領域に対して相補的関係
にあるDNAプローブを使用して検索し、ハイブリッドプ
ラスミドがpBR 322及びhGH遺伝子のcDNAを含有してなる
ものであるクローンを単離する。これらプラスミドの１
つからhGHのcDNAを単離し、プラスミドpUC9（Boehringe
r）にサブ−クローン化して、プラスミドpWHA 41を得る
（第２図）。
り、hGH遺伝子のヌクレオチド領域に対して相補的関係
にあるDNAプローブを使用して検索し、ハイブリッドプ
ラスミドがpBR 322及びhGH遺伝子のcDNAを含有してなる
ものであるクローンを単離する。これらプラスミドの１
つからhGHのcDNAを単離し、プラスミドpUC9（Boehringe
r）にサブ−クローン化して、プラスミドpWHA 41を得る
（第２図）。
次に、Hind IIIリンカーを、プラスミドpWHA41内に、
hGHを遺伝暗号化するcDNAの末端において挿入する。
hGHを遺伝暗号化するcDNAの末端において挿入する。
さらに詳述すれば、プラスミドpWHA 41を制限酵素Sma
Iで切断し、沈殿せしめ、反応混合物から分離する。
Iで切断し、沈殿せしめ、反応混合物から分離する。
ついで、緩衝液中、T4 DNAリガーゼの存在下、23℃に
おいて約14時間反応させることにより、得られたプラス
ミドDNAをHind III d（GAAGCTTC）合成リンカーに結合
させる。反応混合物をフエノール−クロロホルム及びク
ロロホルム−イソアミルの溶液で抽出することによって
酵素反応を停止させる。
おいて約14時間反応させることにより、得られたプラス
ミドDNAをHind III d（GAAGCTTC）合成リンカーに結合
させる。反応混合物をフエノール−クロロホルム及びク
ロロホルム−イソアミルの溶液で抽出することによって
酵素反応を停止させる。
プラスミドDNAを沈殿、分離し、緩衝液中で制限酵素H
ind IIIによって消化する。フエノール−クロロホルム
及びクロロホルム−イソアミルによる抽出を行なって該
酵素反応を停止させ、DNAを沈殿させる。
ind IIIによって消化する。フエノール−クロロホルム
及びクロロホルム−イソアミルによる抽出を行なって該
酵素反応を停止させ、DNAを沈殿させる。
ついで、沈殿物を、T4 DNAリガーゼの存在下、緩衝液
中に再懸濁化させ、14℃において14時間処理した後、全
リガーゼ混合物を使用してE.コリのコンピテント菌JM 1
01（BRL）を形質転換させる。得られた組換体から、ア
ンピシリン含有プレート上での選別により陽性コロニー
（AmpR）を単離し、これからプラスミドDNAを抽出し、
分析する。
中に再懸濁化させ、14℃において14時間処理した後、全
リガーゼ混合物を使用してE.コリのコンピテント菌JM 1
01（BRL）を形質転換させる。得られた組換体から、ア
ンピシリン含有プレート上での選別により陽性コロニー
（AmpR）を単離し、これからプラスミドDNAを抽出し、
分析する。
分析の結果、上記コロニーからのDNAは、Sma I部位の
位置にHind III制限部位を含有することが認められる。
位置にHind III制限部位を含有することが認められる。
プラスミドの酵素消化によって２つのフラグメントを
生成する。１つは約680個の塩基対を含有し、hGHの構造
遺伝子を代表するものである。陽性クローンの１つをJM
101（pSM 209）と称する。pSM 209から単離したプラス
ミドDNAを使用して、アミノ酸17からアミノ酸191までの
hGHを単離する。
生成する。１つは約680個の塩基対を含有し、hGHの構造
遺伝子を代表するものである。陽性クローンの１つをJM
101（pSM 209）と称する。pSM 209から単離したプラス
ミドDNAを使用して、アミノ酸17からアミノ酸191までの
hGHを単離する。
プラスミドpSM 209を制限酵素FnuD II（DNAのレベル
でアミノ酸16と17との間を切断する）及びHind III（停
止コドンの下流部を切断する）により切断する（第２
図）。
でアミノ酸16と17との間を切断する）及びHind III（停
止コドンの下流部を切断する）により切断する（第２
図）。
消化反応を公知の一般法に従って行ない、hGH17-191
の遺伝暗号化配列を含有する530 bp DNAフラグメントFn
ud II-Hind IIを、アクリルアミドゲル上での電気泳動
によって反応混合物から分離し、Maxam及びGilbertの方
法（「メソッズ・イン・エンザイモロギー（Methods in
Enzymolgy）」65巻、p499-560（1980））によって溶出
する。
の遺伝暗号化配列を含有する530 bp DNAフラグメントFn
ud II-Hind IIを、アクリルアミドゲル上での電気泳動
によって反応混合物から分離し、Maxam及びGilbertの方
法（「メソッズ・イン・エンザイモロギー（Methods in
Enzymolgy）」65巻、p499-560（1980））によって溶出
する。
ついで、hGHの初めの16個のアミノ酸を遺伝暗号化
し、これによりFnuD II制限部位を再構成する47bp配列
に530bp配列を結合せしめることにより、ヒト生長ホル
モンの完全配列を再構成する。47bp合成フラグメントに
ついては、530bpフラグメントFnuD II-Hind IIIへの結
合前、リン酸エステル化しておく。なお、47bpフラグメ
ントの配列は下記のとおりである。
し、これによりFnuD II制限部位を再構成する47bp配列
に530bp配列を結合せしめることにより、ヒト生長ホル
モンの完全配列を再構成する。47bp合成フラグメントに
ついては、530bpフラグメントFnuD II-Hind IIIへの結
合前、リン酸エステル化しておく。なお、47bpフラグメ
ントの配列は下記のとおりである。
リガーゼによる反応（T4 DNAリガーゼの存在下で行な
われる）を、フエノール−クロロホルム及びクロロホル
ム−イソアミルによって停止し、沈殿後、DNAを酵素Hin
d IIIで消化する。
われる）を、フエノール−クロロホルム及びクロロホル
ム−イソアミルによって停止し、沈殿後、DNAを酵素Hin
d IIIで消化する。
ついで、全消化混合物をアクリルアミド上で130V、３
時間で展開する。直線状分子を含有する約580 bpのバン
ドは、直線状フラグメントFnuD II-Hind III（530 bp）
で構成されており、47 bp合成フラグメントを電気溶出
する。
時間で展開する。直線状分子を含有する約580 bpのバン
ドは、直線状フラグメントFnuD II-Hind III（530 bp）
で構成されており、47 bp合成フラグメントを電気溶出
する。
47 bp配列はFnud II-Hind III（530 bp）フラグメン
トに２つの方向で結合されうるが、その一方のみがFnuD
II制限部位を再構成し、これにより、ヒト生長ホルモ
ンの完全構造遺伝子を形成するものである。
トに２つの方向で結合されうるが、その一方のみがFnuD
II制限部位を再構成し、これにより、ヒト生長ホルモ
ンの完全構造遺伝子を形成するものである。
本発明に従って、予じめ制限酵素Hind III及びEcoR I
により消化し、下記配列を有する合成フラグメント（そ
の末端３′にメチオニン遺伝暗号化トリプレットを含有
する）に結合せしめたプラスミドpUC 8において、580 b
pフラグメントをクローン化する。
により消化し、下記配列を有する合成フラグメント（そ
の末端３′にメチオニン遺伝暗号化トリプレットを含有
する）に結合せしめたプラスミドpUC 8において、580 b
pフラグメントをクローン化する。
この合成フラグメントは、前記プラスミドの末端５′
に相補的配列が存在するため、pUC 8のEcoR I末端にの
み結合しうる。
に相補的配列が存在するため、pUC 8のEcoR I末端にの
み結合しうる。
プラスミドpUC 8と580 bpフラグメントとの間のリガ
ーゼ反応は、T4 DNAリガーゼの存在下、14℃において約
６時間で行なわれる。
ーゼ反応は、T4 DNAリガーゼの存在下、14℃において約
６時間で行なわれる。
酵素を不活性化した後、リガーゼ混合物を使用して、
E.コリJM 101のコンピテント菌を形質転換せしめ、形質
転換されたものをアンピシリン耐性に基き選別する。
E.コリJM 101のコンピテント菌を形質転換せしめ、形質
転換されたものをアンピシリン耐性に基き選別する。
ついで、プラスミドDNAを陽性クローンから抽出し、
酵素EcoR I及びHind IIIで消化し、アガロースゲル上10
0V、２時間で分離する。
酵素EcoR I及びHind IIIで消化し、アガロースゲル上10
0V、２時間で分離する。
hGH構造遺伝子の完全配列及びメチオニン配列から構
成された590 bpフラグメントを含有するハイブリッドプ
ラスミドが見出だされる。530 bpフラグメントに対する
47 bp配列の結合方向が正しいことを、以下の方法によ
ってチェックする。
成された590 bpフラグメントを含有するハイブリッドプ
ラスミドが見出だされる。530 bpフラグメントに対する
47 bp配列の結合方向が正しいことを、以下の方法によ
ってチェックする。
上述の如くして得られたハイブリッドプラスミドを酵
素FnuD IIにより37℃において１時間消化し、酵素を不
活性化した後、消化混合物をアクリルアミドゲル上で11
0Vで３時間展開する。この際、これらプラスミドの１つ
（pSM210と称する）がhGHの構造遺伝子内で酵素FnuD II
で切断されていること（これにより、530 bpフラグメン
トに対して47 bp配列が正確な方向で結合していること
を示す）が観察される。
素FnuD IIにより37℃において１時間消化し、酵素を不
活性化した後、消化混合物をアクリルアミドゲル上で11
0Vで３時間展開する。この際、これらプラスミドの１つ
（pSM210と称する）がhGHの構造遺伝子内で酵素FnuD II
で切断されていること（これにより、530 bpフラグメン
トに対して47 bp配列が正確な方向で結合していること
を示す）が観察される。
本発明によれば、予じめ制限酵素によって切断せしめ
たプラスミドベクターpSM 208を、pSM 210から単離され
た約590bpのEcoR I-Hind IIIフラグメントに結合させる
ことによって組換DNA分子が構成される。
たプラスミドベクターpSM 208を、pSM 210から単離され
た約590bpのEcoR I-Hind IIIフラグメントに結合させる
ことによって組換DNA分子が構成される。
さらに詳述すれば、プラスミドpSM 208を緩衝液中、3
7℃においてHind III及びEcoR Iによって連続して切断
する。ついで、酵素反応を停止させ、DNAをエタノール
で沈殿させ、反応混合物から分離する。
7℃においてHind III及びEcoR Iによって連続して切断
する。ついで、酵素反応を停止させ、DNAをエタノール
で沈殿させ、反応混合物から分離する。
つづいて、pSM 210から単離したEcoR I−Hind IIIフ
ラグメントに、T4 DNAリガーゼの存在下でDNAを結合さ
せ、全リガーゼ混合物を使用して、バシラス属のコンピ
テント菌を形質転換させる。
ラグメントに、T4 DNAリガーゼの存在下でDNAを結合さ
せ、全リガーゼ混合物を使用して、バシラス属のコンピ
テント菌を形質転換させる。
宿主微生物として使用できるバシラス属の菌の例とし
ては、B.サチリス、B.アミロリキファシエンス（B.amyl
oliquefaciens）、B.セレウス（B.cereus）及びB.リケ
ニホルミス（B.licheniformis）がある。これらの中
で、特にB.サチリスが好適である。
ては、B.サチリス、B.アミロリキファシエンス（B.amyl
oliquefaciens）、B.セレウス（B.cereus）及びB.リケ
ニホルミス（B.licheniformis）がある。これらの中
で、特にB.サチリスが好適である。
本発明では、発明者らの実験室で単離されたB.サチリ
スSMS 108（NRRLB-15898）（his,leu,met,recE4,npr
−）を使用する。このB.サチリスを、Contente及びDubn
auにより開示された方法（「Mol.Gen.Gent.」167,251-2
58（1979））によってコンピテントとし、形質転換体を
カナマイシン耐性に基いて選別する。ついで、陽性クロ
ーンをプラスミドDNAの急速抽出法により検討する。こ
の際、これらの１つがpSM 208とhGHの構造遺伝子を含有
する590 bpフラグメントとから構成されたハイブリッド
プラスミドpSM 212を含有するものであることが観察さ
れる。なお、微生物B.サチリスSMS 108（pSM 212）につ
いては、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン・センター（American Type Culture Collection Cen
ter）にATCC 67097として寄託してある（1986年４月18
日）。
スSMS 108（NRRLB-15898）（his,leu,met,recE4,npr
−）を使用する。このB.サチリスを、Contente及びDubn
auにより開示された方法（「Mol.Gen.Gent.」167,251-2
58（1979））によってコンピテントとし、形質転換体を
カナマイシン耐性に基いて選別する。ついで、陽性クロ
ーンをプラスミドDNAの急速抽出法により検討する。こ
の際、これらの１つがpSM 208とhGHの構造遺伝子を含有
する590 bpフラグメントとから構成されたハイブリッド
プラスミドpSM 212を含有するものであることが観察さ
れる。なお、微生物B.サチリスSMS 108（pSM 212）につ
いては、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン・センター（American Type Culture Collection Cen
ter）にATCC 67097として寄託してある（1986年４月18
日）。
本発明では、菌株B.サチリス（pSM 212）を液体培地
で培養し、溶菌後、成熟ヒト生長ホルモンに相当するタ
ンパク質の存在を確認する。
で培養し、溶菌後、成熟ヒト生長ホルモンに相当するタ
ンパク質の存在を確認する。
さらに詳述すれば、形質転換された菌株を、カナマイ
シンを混入したVY培地（DIFCO）中、温度30ないし40
℃、約20時間で培養する。
シンを混入したVY培地（DIFCO）中、温度30ないし40
℃、約20時間で培養する。
この時間の経過後、菌懸濁液を遠心分離し、菌を回収
し、緩衝液で洗浄し、公知の一般法に従って溶菌処理す
る。
し、緩衝液で洗浄し、公知の一般法に従って溶菌処理す
る。
つづいて、溶菌物中における生長ホルモンの存在を、
エレクトロブロティング法（Towbinら「PNAS」1979,76,
4350-4354）又はクマシーブルーによる染色法（B.D.Hom
es及びD.Rickwood編「ゲル・エレクトロホレシス・オブ
・プロテインズ：ア・プラクティカル・アプローチ（Ge
l electrophoresis of proteins:A Practical Approac
h）」IRL Press Limited発行）によって確認する。
エレクトロブロティング法（Towbinら「PNAS」1979,76,
4350-4354）又はクマシーブルーによる染色法（B.D.Hom
es及びD.Rickwood編「ゲル・エレクトロホレシス・オブ
・プロテインズ：ア・プラクティカル・アプローチ（Ge
l electrophoresis of proteins:A Practical Approac
h）」IRL Press Limited発行）によって確認する。
確認の結果、分子量21,500を有しかつ天然のhGH標準
品と同一のタンパク質が、存在する全タンパク質の15な
いし20％の量で溶菌物中に存在することを示した。さら
に、免疫ブロッテイング法による分析の結果から明らか
なように、このタンパク質は抗−hGH抗体と特異的に反
応する。
品と同一のタンパク質が、存在する全タンパク質の15な
いし20％の量で溶菌物中に存在することを示した。さら
に、免疫ブロッテイング法による分析の結果から明らか
なように、このタンパク質は抗−hGH抗体と特異的に反
応する。
エーレンマイヤーフラスコで培養したB.サチリスの菌
株SMS 108（pSM 212）によって産生されるhGHの量は、
菌体ペースト6g/l当り約200mg/mlであった。
株SMS 108（pSM 212）によって産生されるhGHの量は、
菌体ペースト6g/l当り約200mg/mlであった。
培養を発酵法で実施する場合には、hGHの量は2g/l以
上である。
上である。
実施例１ プラスミドベクターpSM 208の調製 プラスミドpSM 143 1μｇを、50mM Tris-HCl（pH7.
5）、100mM NaCl及び10mM MgCl2を含有する緩衝溶液20
μｌ中、37℃、１時間で制限酵素EcoR I及びXba I（Boe
hringer）１単位により消化した。反応混合物をフエノ
ール−クロロホルム（1:1v/v）及びクロロホルム−イソ
アミル（24:1v/v）で抽出することによって酵素反応を
停止し、最終濃度が0.3Mとなるような量の酢酸ナトリウ
ム及びエタノール2 1/2容を添加してDNAを沈殿させた。
沈殿物を遠心分離法により分離し、66mM Tris-HCl（pH
7.6）、1mM ATP、10mM MgCl2及び15mM DTTを含有する緩
衝液20μｌ中に再懸濁化させ、T4 DNAリガーゼ１単位の
存在下、14℃、６時間で下記の合成フラグメント0.2μ
ｇに結合させ。
5）、100mM NaCl及び10mM MgCl2を含有する緩衝溶液20
μｌ中、37℃、１時間で制限酵素EcoR I及びXba I（Boe
hringer）１単位により消化した。反応混合物をフエノ
ール−クロロホルム（1:1v/v）及びクロロホルム−イソ
アミル（24:1v/v）で抽出することによって酵素反応を
停止し、最終濃度が0.3Mとなるような量の酢酸ナトリウ
ム及びエタノール2 1/2容を添加してDNAを沈殿させた。
沈殿物を遠心分離法により分離し、66mM Tris-HCl（pH
7.6）、1mM ATP、10mM MgCl2及び15mM DTTを含有する緩
衝液20μｌ中に再懸濁化させ、T4 DNAリガーゼ１単位の
存在下、14℃、６時間で下記の合成フラグメント0.2μ
ｇに結合させ。
70℃に10分間維持することにより反応を停止させ、Me
ssingの方法（「Methods in Enzymology」第101巻、20-
78（1983））によりコンピテントにしたE.コリの菌株JM
101（BRL）を形質転換させるために使用した。
ssingの方法（「Methods in Enzymology」第101巻、20-
78（1983））によりコンピテントにしたE.コリの菌株JM
101（BRL）を形質転換させるために使用した。
形質転換された菌を、アンピシリン50μg/mlを含有す
るLB（DIFCO）プレート上でアンピシリ耐性に基いて選
別した。
るLB（DIFCO）プレート上でアンピシリ耐性に基いて選
別した。
アンピシリ耐性（AmpR）コロニーの１つから単離され
たプラスミドpSM 208は第１図に示す制限酵素地図を有
しており、pSM 143のEcoR I-Xba Iフラグメントが73bp
合成フラグメントによって置換されていた。
たプラスミドpSM 208は第１図に示す制限酵素地図を有
しており、pSM 143のEcoR I-Xba Iフラグメントが73bp
合成フラグメントによって置換されていた。
実施例２ プラスミドpWHA 41におけるHind III部位の挿入 プラスミドpWHA 41 0.4μｇを、15mM Tris-HCl（pH8.
5）、15mM KCl、6mM MgCl2及び6mMメルカプトエタノー
ルを含有する緩衝液10μｌ中、25℃、１時間でSma I（B
oehringer）１単位によって切断した。最終濃度が20mM
となるまでEDTA（pH8）を添加し、フエノール−クロロ
ホルム（1:1（v/v））及びクロロホルム−イソアミル
（24:1（v/v））で抽出することにより反応を停止させ
た。反応混合物に最終濃度が0.3Mとなる量で酢酸ナトリ
ウムを添加すると共に、エタノール2 1/2容を添加し、
温度 −80℃に15分間維持してDNAを沈殿させた。Eppendorf遠
心分離機（モデル5450）で遠心分離した後、沈殿を分離
し、減圧乾燥し、66mM Tris-HCl（pH7.6）、1mM ATP、1
mMスペルミジン、10mM MgCl2、15mMジチオトレイトール
（DTT）及び子牛血清アルブミン（BSA）0.2mg/mlを含有
する緩衝液中に再懸濁化させた。
5）、15mM KCl、6mM MgCl2及び6mMメルカプトエタノー
ルを含有する緩衝液10μｌ中、25℃、１時間でSma I（B
oehringer）１単位によって切断した。最終濃度が20mM
となるまでEDTA（pH8）を添加し、フエノール−クロロ
ホルム（1:1（v/v））及びクロロホルム−イソアミル
（24:1（v/v））で抽出することにより反応を停止させ
た。反応混合物に最終濃度が0.3Mとなる量で酢酸ナトリ
ウムを添加すると共に、エタノール2 1/2容を添加し、
温度 −80℃に15分間維持してDNAを沈殿させた。Eppendorf遠
心分離機（モデル5450）で遠心分離した後、沈殿を分離
し、減圧乾燥し、66mM Tris-HCl（pH7.6）、1mM ATP、1
mMスペルミジン、10mM MgCl2、15mMジチオトレイトール
（DTT）及び子牛血清アルブミン（BSA）0.2mg/mlを含有
する緩衝液中に再懸濁化させた。
Hind III d（GAAGCTTC）リンカー（Boehringer）１μ
ｇを、66mM Tris-HCl（pH7.6）、1mA ATP、1mMスペルミ
ジン、10mM MgCl2、15mM DTT、BSA 0.2mg/ml及びT4 DNA
キナーゼ（Biolabs）２単位を含有する緩衝液10μｌ中
でリン酸エステル化させ、37℃で１時間インキュベート
した。ついで、反応混合物を、Sma Iで切断したpWHA 41
を含有する同じ溶液10μｌに添加し、T4 DNAリガーゼ１
単位の存在下、23℃で14時間インキュベートした。0.5M
EDTAを含有する溶液（pH8）１μｌを添加して反応を停
止させ、フエノール−クロロホルムで１回及びクロロホ
ルム−イソアミルで１回抽出し、酢酸ナトリウムを溶液
に最終濃度が0.3Mとなる量で添加した後、エタノール2
1/2容を添加して沈殿させた。溶液を80℃に15分間維持
し、ついで15分間遠心分離した。このようにして分離し
たDNAを、50mM Tris-HCl（pH8）、10mM MgCl2、50mM Na
Cl及び酵素Hind III（Boehringer）20単位を含有する緩
衝液100μｌ中に再懸濁化し、37℃で２時間30分インキ
ュベートした。フエノール−クロロホルム及びクロロホ
ルム−イソアミルでの抽出により反応を停止し、溶液に
酢酸ナトリウムを最終濃度が3Mとなるまで添加した後、
エタノール2 1/2容を添加することによりDNAを沈殿させ
た。遠心分離した後、10mM Tris-HCl（pH8）、1mM EDTA
及び100mM NaClを含有する溶液50ml中にDNAを再懸濁化
し、同じ緩衝液で平衡化したSephadex G50（2ml）カラ
ムに注入した。溶出されたDNAを上述の如く沈殿させ、5
0mM Tris-HCl（pH7.6）、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM A
TP及びT4 DNAリガーゼ（Boehringer）１単位を含有する
緩衝液20μｌに再懸濁化し、14℃で14時間インキュベー
トした。70℃に10分間維持することにより反応を不活化
し、E.コリJM 101（BRL）のコンピテント菌0.3mlを形質
転換させるために使用した（DNA1ng）。アンピシリン50
μg/mlを含有するLB（DIFCO）プレート上での選別で得
られた組換体から白色のAmpRコロニー12個を単離した。
ｇを、66mM Tris-HCl（pH7.6）、1mA ATP、1mMスペルミ
ジン、10mM MgCl2、15mM DTT、BSA 0.2mg/ml及びT4 DNA
キナーゼ（Biolabs）２単位を含有する緩衝液10μｌ中
でリン酸エステル化させ、37℃で１時間インキュベート
した。ついで、反応混合物を、Sma Iで切断したpWHA 41
を含有する同じ溶液10μｌに添加し、T4 DNAリガーゼ１
単位の存在下、23℃で14時間インキュベートした。0.5M
EDTAを含有する溶液（pH8）１μｌを添加して反応を停
止させ、フエノール−クロロホルムで１回及びクロロホ
ルム−イソアミルで１回抽出し、酢酸ナトリウムを溶液
に最終濃度が0.3Mとなる量で添加した後、エタノール2
1/2容を添加して沈殿させた。溶液を80℃に15分間維持
し、ついで15分間遠心分離した。このようにして分離し
たDNAを、50mM Tris-HCl（pH8）、10mM MgCl2、50mM Na
Cl及び酵素Hind III（Boehringer）20単位を含有する緩
衝液100μｌ中に再懸濁化し、37℃で２時間30分インキ
ュベートした。フエノール−クロロホルム及びクロロホ
ルム−イソアミルでの抽出により反応を停止し、溶液に
酢酸ナトリウムを最終濃度が3Mとなるまで添加した後、
エタノール2 1/2容を添加することによりDNAを沈殿させ
た。遠心分離した後、10mM Tris-HCl（pH8）、1mM EDTA
及び100mM NaClを含有する溶液50ml中にDNAを再懸濁化
し、同じ緩衝液で平衡化したSephadex G50（2ml）カラ
ムに注入した。溶出されたDNAを上述の如く沈殿させ、5
0mM Tris-HCl（pH7.6）、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM A
TP及びT4 DNAリガーゼ（Boehringer）１単位を含有する
緩衝液20μｌに再懸濁化し、14℃で14時間インキュベー
トした。70℃に10分間維持することにより反応を不活化
し、E.コリJM 101（BRL）のコンピテント菌0.3mlを形質
転換させるために使用した（DNA1ng）。アンピシリン50
μg/mlを含有するLB（DIFCO）プレート上での選別で得
られた組換体から白色のAmpRコロニー12個を単離した。
Rodriguez及びTaitの方法（「Recombinant DNA Techn
iques:An Introduction」p50-51,Addison-Wesley Publi
shing Co.）によるプラスミドDNAの急速抽出を行ない、
12個のコロニーについて分析を行なった。得られたDNA1
/20を、前述の反応混合物10ml中、制限酵素Hind III 1
単位で切断し、37℃で30分間インキュベートした。70℃
に10分間維持して酵素を不活性化した後、DNAを0.8％ア
ガロースゲル上に置き、100V、２時間で処理した。12個
すべてのコロニーがSma I部位の位置にHind III制限部
位を含有していた。予想したように、DNAを消化したと
ころ２つのフラグメントに分割され、その１つは約690
個の塩基対を含有するものであり、hGH遺伝子であっ
た。
iques:An Introduction」p50-51,Addison-Wesley Publi
shing Co.）によるプラスミドDNAの急速抽出を行ない、
12個のコロニーについて分析を行なった。得られたDNA1
/20を、前述の反応混合物10ml中、制限酵素Hind III 1
単位で切断し、37℃で30分間インキュベートした。70℃
に10分間維持して酵素を不活性化した後、DNAを0.8％ア
ガロースゲル上に置き、100V、２時間で処理した。12個
すべてのコロニーがSma I部位の位置にHind III制限部
位を含有していた。予想したように、DNAを消化したと
ころ２つのフラグメントに分割され、その１つは約690
個の塩基対を含有するものであり、hGH遺伝子であっ
た。
さらに分析を行なうためコロニーの１つ（JM101（pSM
209）と称する）を選択し、単離したプラスミドDNA（p
SM 209と称する）を、Maniatisらの方法（「Molecular
Cloning,A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor 19
82）により抽出した。
209）と称する）を選択し、単離したプラスミドDNA（p
SM 209と称する）を、Maniatisらの方法（「Molecular
Cloning,A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor 19
82）により抽出した。
実施例３ hGH構造遺伝子の単離 アミノ酸17からアミノ酸191までの成熟生長ホルモン
を遺伝暗号化するDNA配列を、プラスミドpSM 209から、
制限酵素FnuD II（DNAをアミノ酸16と17との間で切断す
る）及び酵素Hind III（停止コドンの下流部を切断する
（第２図））で処理することにより単離した。
を遺伝暗号化するDNA配列を、プラスミドpSM 209から、
制限酵素FnuD II（DNAをアミノ酸16と17との間で切断す
る）及び酵素Hind III（停止コドンの下流部を切断する
（第２図））で処理することにより単離した。
その後、プラスミドpSM 209 50μｇを、6mM Tris-HCl
（pH7.4）、6mM NaCl、6mM MgCl2及び6mM β−メルカプ
トエタノールを含有する反応混合物200μｌ中、37℃、
１時間で、酵素FnuD（Biolabs）50単位によって切断し
た。70℃に10分間維持することによって反応を不活化し
た後、溶液を50mM Tris-HCl（pH8）、10mM MgCl2及び50
mM NaClの濃度に調整し、酵素Hind III（Boehringer）5
0単位の存在下、37℃でさらに１時間インキュベートし
た。フエノール−クロロホルム及びクロロホルム−イソ
アミルによる抽出を行なって反応を停止させ、ついで酢
酸ナトリウムを最終濃度0.3Mとなるまで添加した後、エ
タノール2 1/2容を添加してDNAを沈殿させた。−80℃で
15分間インキュベートし、Eppendorf遠心分離機で15分
間遠心分離した後、沈殿物をTE（10mM Tris-HCl（pH8）
及び1mM EDTA）50μｌ中に再懸濁化し、６％アクリルア
ミドゲル上に置いた。電圧130Vを３時間通電することに
よってDNAを分離した後、Maxam及びGilbertらの方法
（「Methods in Enzymology」第65巻、p499-540,1980）
に従って、約530bpのバンドを溶出した。このバンド
は、アミノ酸17から191までのhGH遺伝暗号化配列を有す
るフラグメントを含有する。
（pH7.4）、6mM NaCl、6mM MgCl2及び6mM β−メルカプ
トエタノールを含有する反応混合物200μｌ中、37℃、
１時間で、酵素FnuD（Biolabs）50単位によって切断し
た。70℃に10分間維持することによって反応を不活化し
た後、溶液を50mM Tris-HCl（pH8）、10mM MgCl2及び50
mM NaClの濃度に調整し、酵素Hind III（Boehringer）5
0単位の存在下、37℃でさらに１時間インキュベートし
た。フエノール−クロロホルム及びクロロホルム−イソ
アミルによる抽出を行なって反応を停止させ、ついで酢
酸ナトリウムを最終濃度0.3Mとなるまで添加した後、エ
タノール2 1/2容を添加してDNAを沈殿させた。−80℃で
15分間インキュベートし、Eppendorf遠心分離機で15分
間遠心分離した後、沈殿物をTE（10mM Tris-HCl（pH8）
及び1mM EDTA）50μｌ中に再懸濁化し、６％アクリルア
ミドゲル上に置いた。電圧130Vを３時間通電することに
よってDNAを分離した後、Maxam及びGilbertらの方法
（「Methods in Enzymology」第65巻、p499-540,1980）
に従って、約530bpのバンドを溶出した。このバンド
は、アミノ酸17から191までのhGH遺伝暗号化配列を有す
るフラグメントを含有する。
hGHの初めのアミノ酸16個を遺伝暗号化すると共に、F
nuD IIを再構成しうる下記配列の合成47bpフラグメント
を使用することによって、ヒト生長ホルモンの完全配列
を再構成した。
nuD IIを再構成しうる下記配列の合成47bpフラグメント
を使用することによって、ヒト生長ホルモンの完全配列
を再構成した。
DNA合成装置SYSTEM ONE（Beckman）を使用し、２種の
相補的47塩基DNA鎖を合成した。
相補的47塩基DNA鎖を合成した。
合成47bpフラグメント1.25μｇを、66mM Tris-HCl（p
H7.6）、1mM ATP、1mMスペルミジン、10mM MgCl2、15mM
DTT、0.2mg/ml BSA及びT4 DNAキナーゼ（Biolabs）２
単位を含有する緩衝液20μｌ中、37℃、１時間でリン酸
エステル化した。ついで、キナーゼ反応で使用したもの
と同じ緩衝液250μｌ中、T4 DNAリガーゼ（Boehringe
r）５単位の存在下、予じめpSM 209から単離したDNA Fn
uD II-Hind IIIの530bpフラグメント３μｇに合成フラ
グメントを結合させた。この反応を14℃で14時間行な
い。その後、フエノール−クロロホルム及びクロロホル
ム−イソアミルによる抽出を行なって酵素を不活性化
し、上述の如く酢酸ナトリウム及びエタノールを添加し
た後、水相からDNAを沈殿させた。
H7.6）、1mM ATP、1mMスペルミジン、10mM MgCl2、15mM
DTT、0.2mg/ml BSA及びT4 DNAキナーゼ（Biolabs）２
単位を含有する緩衝液20μｌ中、37℃、１時間でリン酸
エステル化した。ついで、キナーゼ反応で使用したもの
と同じ緩衝液250μｌ中、T4 DNAリガーゼ（Boehringe
r）５単位の存在下、予じめpSM 209から単離したDNA Fn
uD II-Hind IIIの530bpフラグメント３μｇに合成フラ
グメントを結合させた。この反応を14℃で14時間行な
い。その後、フエノール−クロロホルム及びクロロホル
ム−イソアミルによる抽出を行なって酵素を不活性化
し、上述の如く酢酸ナトリウム及びエタノールを添加し
た後、水相からDNAを沈殿させた。
沈殿物を、50mM Tris-HCl（pH8）、10mM MgCl2及び50
mM NaClを含有する緩衝液50μｌに再懸濁化し、酵素Hin
d III 5単位を使用して37℃で30分間消化した。70℃に1
0分間維持することにより反応を停止し、６％アクリル
アミドゲル上に注入した。電気泳動（130V、３時間）
後、約580塩基対のバンドを単離、溶出した。該バンド
はFnuD II-Hind IIIフラグメント及び合成47bpフラグメ
ントでなる直線状分子を含有していた。この分子（合成
フラグメントがFnuD II-Hind IIIフラグメントに結合す
る際、２つの方向性があるが、その１つの方向性を有す
るもの）は生長ホルモンの完全構造遺伝子を再構成し、
E.コリ プラスミドpUC 8（BRL）でクローン化される。
mM NaClを含有する緩衝液50μｌに再懸濁化し、酵素Hin
d III 5単位を使用して37℃で30分間消化した。70℃に1
0分間維持することにより反応を停止し、６％アクリル
アミドゲル上に注入した。電気泳動（130V、３時間）
後、約580塩基対のバンドを単離、溶出した。該バンド
はFnuD II-Hind IIIフラグメント及び合成47bpフラグメ
ントでなる直線状分子を含有していた。この分子（合成
フラグメントがFnuD II-Hind IIIフラグメントに結合す
る際、２つの方向性があるが、その１つの方向性を有す
るもの）は生長ホルモンの完全構造遺伝子を再構成し、
E.コリ プラスミドpUC 8（BRL）でクローン化される。
実施例４ pUC 8における生長ホルモン構造遺伝子のクローニング プラスミドpUC 8 2.5μｇを、50mM Tris-HCl（pH
8）、10mM MgCl2及び50mM NaClを含有する溶液中、37
℃、30分間でHind III 2.5単位によって消化させた。酵
素反応を不活化し、ついでTris-HCl（pH8）を最終濃度1
00mMまで添加した後、37℃において、さらに30分間、Ec
oR I 2.5単位と共にインキュベートした。
8）、10mM MgCl2及び50mM NaClを含有する溶液中、37
℃、30分間でHind III 2.5単位によって消化させた。酵
素反応を不活化し、ついでTris-HCl（pH8）を最終濃度1
00mMまで添加した後、37℃において、さらに30分間、Ec
oR I 2.5単位と共にインキュベートした。
フエノール−クロロホルムにより反応を不活性化し、
沈殿、分離したDNAを、10mM Tris-HCl（pH8）、1mM EDT
A及び1mM過塩素酸ナトリウムを含有する緩衝液50μｌ中
に再懸濁化し、イソプロパノール25μｌを添加すること
により再度沈殿させた。このようにして消化したpUC 8
を、下記配列を有する合成DNAフラグメントに結合させ
た。
沈殿、分離したDNAを、10mM Tris-HCl（pH8）、1mM EDT
A及び1mM過塩素酸ナトリウムを含有する緩衝液50μｌ中
に再懸濁化し、イソプロパノール25μｌを添加すること
により再度沈殿させた。このようにして消化したpUC 8
を、下記配列を有する合成DNAフラグメントに結合させ
た。
このフラグメント（Beckman DNA合成機を使用して合
成される）は、末端５′に相補的配列が存在するため、
pUC 8のEcoR I末端にのみ結合可能である。
成される）は、末端５′に相補的配列が存在するため、
pUC 8のEcoR I末端にのみ結合可能である。
66mM Tris-HCl（pH7.6）、1mM ATP、1mMスペルミジ
ン、10mM MgCl2、15mM DTT、BSA 0.2mg/ml及びT4 DNAリ
ガーゼ１単位を含有する反応混合物125μｌ中におい
て、前述の如くEcoR I及びHind IIIにより消化したpUC
8 2.5μｇに合成フラグメント0.185μｇを結合させ、14
℃で６時間インキュベートした。ついで、70℃に10分間
維持して不活性化した反応混合物を、キナーゼ２単位と
混合し、37℃においてさらに１時間インキュベートし
た。フエノール−クロロホルム及びクロロホルム−イソ
アミルによる抽出を行なって反応を停止し、5M NaClO41
/5容を添加した後、イソプロパノール0.5容によりDNAを
沈殿させた。遠心分離後、50mM Tris-HCl（pH8）、10mM
MgCl2及び50mM NaClを含有する緩衝液25μｌに沈殿物
を再懸濁化させ、Hind III 5単位を使用して37℃におい
て１時間消化した。フエノール−クロロホルム及びクロ
ロホルム−イソアミルによる抽出を行なって反応を停止
し、酢酸ナトリウム及びエタノールを使用してDNAを沈
殿させた。前述の如く合成フラグメントが挿入されたE.
コリ プラスミドpUC 8の直線状分子１μｇを、66mM Tr
is-HCl（pH7.6）、1mM ATP、10mM MgCl2、15mM DTT及び
T4 DNAリガーゼ１単位を含有する緩衝液50μｌ中、14
℃、６時間で、完全hGH構造遺伝子を再構成する直線状
分子0.8μｇに結合させた。酵素を不活性化した後、反
応混合物を使用して、E.コリJM 101のコンピテント菌を
形質転換させた。
ン、10mM MgCl2、15mM DTT、BSA 0.2mg/ml及びT4 DNAリ
ガーゼ１単位を含有する反応混合物125μｌ中におい
て、前述の如くEcoR I及びHind IIIにより消化したpUC
8 2.5μｇに合成フラグメント0.185μｇを結合させ、14
℃で６時間インキュベートした。ついで、70℃に10分間
維持して不活性化した反応混合物を、キナーゼ２単位と
混合し、37℃においてさらに１時間インキュベートし
た。フエノール−クロロホルム及びクロロホルム−イソ
アミルによる抽出を行なって反応を停止し、5M NaClO41
/5容を添加した後、イソプロパノール0.5容によりDNAを
沈殿させた。遠心分離後、50mM Tris-HCl（pH8）、10mM
MgCl2及び50mM NaClを含有する緩衝液25μｌに沈殿物
を再懸濁化させ、Hind III 5単位を使用して37℃におい
て１時間消化した。フエノール−クロロホルム及びクロ
ロホルム−イソアミルによる抽出を行なって反応を停止
し、酢酸ナトリウム及びエタノールを使用してDNAを沈
殿させた。前述の如く合成フラグメントが挿入されたE.
コリ プラスミドpUC 8の直線状分子１μｇを、66mM Tr
is-HCl（pH7.6）、1mM ATP、10mM MgCl2、15mM DTT及び
T4 DNAリガーゼ１単位を含有する緩衝液50μｌ中、14
℃、６時間で、完全hGH構造遺伝子を再構成する直線状
分子0.8μｇに結合させた。酵素を不活性化した後、反
応混合物を使用して、E.コリJM 101のコンピテント菌を
形質転換させた。
アンピシリン（50μg/ml）を含有するプレート上での
選別により得られた形質転換体の中でも、12個の白色コ
ロニー（AmpR）についてプラスミドDNAの急速抽出によ
り分析を行なった。得られたDNA1/20を、50mM Tris-HCl
（pH8）、MgCl210mM及び50mM NaClを含有する緩衝液20
μｌ中、37℃、30分で、EcoR I 1単位及びHind III 1単
位を使用して消化した。DNAを0.8％アガロースゲル上に
置き、電位差100Vを２時間通電して分離せしめた。12個
のコロニーから得られたプラスミドDNAは、530bpフラグ
メントを含有する590bpフラグメント、47ヌクレオチド
の合成配列及びメチオニン遺伝暗号づけトリプレットを
有する同様の合成配列を含有することを示した。
選別により得られた形質転換体の中でも、12個の白色コ
ロニー（AmpR）についてプラスミドDNAの急速抽出によ
り分析を行なった。得られたDNA1/20を、50mM Tris-HCl
（pH8）、MgCl210mM及び50mM NaClを含有する緩衝液20
μｌ中、37℃、30分で、EcoR I 1単位及びHind III 1単
位を使用して消化した。DNAを0.8％アガロースゲル上に
置き、電位差100Vを２時間通電して分離せしめた。12個
のコロニーから得られたプラスミドDNAは、530bpフラグ
メントを含有する590bpフラグメント、47ヌクレオチド
の合成配列及びメチオニン遺伝暗号づけトリプレットを
有する同様の合成配列を含有することを示した。
530bpフラグメントに対して47bp配列が正確に結合さ
れていることをチェックするため、プラスミドDNA0.2μ
ｇを、50mM Tris-HCl（pH8）、10mM MgCl2及び50mM NaC
lを含有する緩衝液20μｌ中、37℃、１時間で、酵素Fnu
D II 1単位を使用して消化した。酵素を不活性化した
後、DNAを６％アクリルアミドゲル上に置き、120Vで３
時間処理した。12個のプラスミドのうち５個が、hGH構
造遺伝子内で、酵素FnuD IIによって切断されていた。
この結果、530bpフラグメントに対して合成47bpフラグ
メントが正確に結合されていることが明らかである。こ
れらのプラスミドの１つをpSM 210と称する。
れていることをチェックするため、プラスミドDNA0.2μ
ｇを、50mM Tris-HCl（pH8）、10mM MgCl2及び50mM NaC
lを含有する緩衝液20μｌ中、37℃、１時間で、酵素Fnu
D II 1単位を使用して消化した。酵素を不活性化した
後、DNAを６％アクリルアミドゲル上に置き、120Vで３
時間処理した。12個のプラスミドのうち５個が、hGH構
造遺伝子内で、酵素FnuD IIによって切断されていた。
この結果、530bpフラグメントに対して合成47bpフラグ
メントが正確に結合されていることが明らかである。こ
れらのプラスミドの１つをpSM 210と称する。
実施例５ pSM 208におけるhGHのクローニング プラスミドpSM 208 2μｇを、50mM Tris-HCl（pH
8）、10mM MgCl2及び50mM NaClを含有する溶液中、37
℃、30分間で、Hind III 2単位を使用して消化した。反
応混合物を不活性化し、Tris-HCl（pH8）を最終濃度100
mMまで添加した後、EcoR I 2単位と共に、37℃におい
て、さらに30分間インキュベートした。フエノール−ク
ロロホルム及びクロロホルム−イソアミルによる抽出を
行って反応を停止し、エタノールを添加してDNAを沈殿
させた。
8）、10mM MgCl2及び50mM NaClを含有する溶液中、37
℃、30分間で、Hind III 2単位を使用して消化した。反
応混合物を不活性化し、Tris-HCl（pH8）を最終濃度100
mMまで添加した後、EcoR I 2単位と共に、37℃におい
て、さらに30分間インキュベートした。フエノール−ク
ロロホルム及びクロロホルム−イソアミルによる抽出を
行って反応を停止し、エタノールを添加してDNAを沈殿
させた。
プラスミドpSM 208について記載した方法と同様にし
て、プラスミドpSM 210 3μｇを制限酵素Hind III及びE
coR Iを使用して消化した。
て、プラスミドpSM 210 3μｇを制限酵素Hind III及びE
coR Iを使用して消化した。
エタノールを添加して沈殿させた後、DNAをTE20μｌ
中に再懸濁化し、６％アクリルアミドゲル上に置いた。
電気泳動処理（130V、３時間）後、hGHの完全構造遺伝
子を含有する約590bpバンドを単離し、溶出した。つい
で、hGH構造遺伝子0.5μｇを、66mM Tris-HCl（pH7.
6）、1mM ATP、10mM MgCl2、15mM DTT及びT4 DNAリガー
ゼ１単位を含有する反応混合物20μｌ中、14℃、14時間
で、予じめEcoR I及びHind IIIで消化したプラスミドpS
M 208 2μｇに結合させた。ついで、混合物１μｇを使
用して、Contente及びDub-nauの記載（「Mol.Gen.Gene
t.」167,251-258, 1979）に従ってコンピテントとしたB.サチリスSMS 108
を形質転換させた。
中に再懸濁化し、６％アクリルアミドゲル上に置いた。
電気泳動処理（130V、３時間）後、hGHの完全構造遺伝
子を含有する約590bpバンドを単離し、溶出した。つい
で、hGH構造遺伝子0.5μｇを、66mM Tris-HCl（pH7.
6）、1mM ATP、10mM MgCl2、15mM DTT及びT4 DNAリガー
ゼ１単位を含有する反応混合物20μｌ中、14℃、14時間
で、予じめEcoR I及びHind IIIで消化したプラスミドpS
M 208 2μｇに結合させた。ついで、混合物１μｇを使
用して、Contente及びDub-nauの記載（「Mol.Gen.Gene
t.」167,251-258, 1979）に従ってコンピテントとしたB.サチリスSMS 108
を形質転換させた。
発明者らの研究室で開発された菌株SMS 108について
は、NRRL B-15898として、ノーザン・リージョナル・リ
サーチ・センター（Northern Reg-ional Research Cent
re）に寄託されている。
は、NRRL B-15898として、ノーザン・リージョナル・リ
サーチ・センター（Northern Reg-ional Research Cent
re）に寄託されている。
形質転換された菌を、カナマイシン５μg/mlを含有す
るVYプレート上で選別した。
るVYプレート上で選別した。
ついで、陽性のカナマイシン耐性コロニー12個につい
て、プラスミドDNAの急速抽出によって検討をおこなっ
た。hGH構造遺伝子を有するフラグメントとのハイブリ
ッドプラスミド（pSM 212）を含有するコロニーの１つ
をSMS 101（pSM 212）と称する。
て、プラスミドDNAの急速抽出によって検討をおこなっ
た。hGH構造遺伝子を有するフラグメントとのハイブリ
ッドプラスミド（pSM 212）を含有するコロニーの１つ
をSMS 101（pSM 212）と称する。
実施例６ B.サチリスSMS 108（pSM 212）におけるhGHの発現 B.サチリスの菌株SMS 108（pSM 212）でのhGH遺伝子
の発現をチェックするため、該菌株を液体培地で育成
し、溶菌後、成熟生長ホルモンに相当するタンパク質の
存在を免疫ブロット法（Towbinら「PNAS」1979,第76
巻、No.9,p4350-4354）によって検出した。
の発現をチェックするため、該菌株を液体培地で育成
し、溶菌後、成熟生長ホルモンに相当するタンパク質の
存在を免疫ブロット法（Towbinら「PNAS」1979,第76
巻、No.9,p4350-4354）によって検出した。
SMS 108（pSM 212）の培養物を、カナマイシン（濃度
５μg/ml）含有VY培地（DIFCO子牛肉浸出ブイヨン（vea
l infusion broth）25g/l、DIFCO酵母抽出物5g/l）にお
いて37℃で20時間育成した。
５μg/ml）含有VY培地（DIFCO子牛肉浸出ブイヨン（vea
l infusion broth）25g/l、DIFCO酵母抽出物5g/l）にお
いて37℃で20時間育成した。
培養基10mlをSorvall遠心分離機において5000rpmで10
分間遠心分離し、30mM Tris-HCl（pH7.5）及び50mM NaC
lを含有する緩衝液で菌を２回洗浄し、8M尿素、SDS 1
％、β−メルカプトエタノール１％及び62.5mM Tris-HC
l（pH6.8）を含有する溶液10ml中に再懸濁化した。Fren
ch Pressure Cell（AMINCO）を使用し、36000Psiで溶菌
処理した。
分間遠心分離し、30mM Tris-HCl（pH7.5）及び50mM NaC
lを含有する緩衝液で菌を２回洗浄し、8M尿素、SDS 1
％、β−メルカプトエタノール１％及び62.5mM Tris-HC
l（pH6.8）を含有する溶液10ml中に再懸濁化した。Fren
ch Pressure Cell（AMINCO）を使用し、36000Psiで溶菌
処理した。
溶菌物20μｌを12.5％ポリアクリルアミドSTSゲル（L
aenmli「Nature」1970,第277巻,680）上に置き、25mAで
３時間電気泳動処理した後、クマシーブルー（B.D.Hame
s及びD.Rickwod編「Gelelectrophoresis of proteins:A
practical approach」IRL Press Limited発行）又はニ
トロセルロースフィルターへの移行（Schleicher＆Schu
ll、孔サイズ45μｍ）（Towbin）によってタンパク質を
定置した。
aenmli「Nature」1970,第277巻,680）上に置き、25mAで
３時間電気泳動処理した後、クマシーブルー（B.D.Hame
s及びD.Rickwod編「Gelelectrophoresis of proteins:A
practical approach」IRL Press Limited発行）又はニ
トロセルロースフィルターへの移行（Schleicher＆Schu
ll、孔サイズ45μｍ）（Towbin）によってタンパク質を
定置した。
Towbinの開示の如くフィルターを処理し、家兎抗−hG
H抗体（Miles）及びペルオキシダーゼと接合させた家兎
抗−IgGヤギ抗体を使用することにより、hGHの存在が明
らかになった。
H抗体（Miles）及びペルオキシダーゼと接合させた家兎
抗−IgGヤギ抗体を使用することにより、hGHの存在が明
らかになった。
クマシーブルーによる染色では、見かけ分子量21,500
を有し、天然のhGH標準品（Calbiochem）と同一であ
り、かつ全タンパク質の約15-20％を構成しているタン
パク質の存在を示した。（第３図参照;A:SMS 108,B:SMS
108（pSM 212）、C:天然hGH,D:分子量標準品）。
を有し、天然のhGH標準品（Calbiochem）と同一であ
り、かつ全タンパク質の約15-20％を構成しているタン
パク質の存在を示した。（第３図参照;A:SMS 108,B:SMS
108（pSM 212）、C:天然hGH,D:分子量標準品）。
このタンパク質は、免疫エレクトロブロット分析の結
果（第４図参照;A:SMS 108,B:SMS 108（pSM 212）,C:天
然hGH,D:分子量標準品）から明らかなように、抗‐hGH
抗体と特異的に反応する。B.サチリスの菌株SMS（pSM 2
12）から産生されるhGHの量は、発酵を実験質的条件
（培養基１当たり菌ペースト6g）下、エーレンマイヤ
ーフラスコで行なう場合には約200mg/lである。培養を1
0l発酵槽で行なう場合には、１当たりhGH2g以上を得
ることが可能であった。
果（第４図参照;A:SMS 108,B:SMS 108（pSM 212）,C:天
然hGH,D:分子量標準品）から明らかなように、抗‐hGH
抗体と特異的に反応する。B.サチリスの菌株SMS（pSM 2
12）から産生されるhGHの量は、発酵を実験質的条件
（培養基１当たり菌ペースト6g）下、エーレンマイヤ
ーフラスコで行なう場合には約200mg/lである。培養を1
0l発酵槽で行なう場合には、１当たりhGH2g以上を得
ることが可能であった。
第１図はプラスミドpSM 143,pSM 208及びpSM 212の制限
酵素地図を示す図、第２図はプラスミドpSM 209,pSM 21
0及びpSM 212を構成するために要求される操作の概略
図、第３図はB.サチリスの各菌株から抽出されたタンパ
ク質のSDS−アクリルアミドゲル上での分離の状態を示
す写真、第４図は免疫ブロッティングの結果を示す写真
である。
酵素地図を示す図、第２図はプラスミドpSM 209,pSM 21
0及びpSM 212を構成するために要求される操作の概略
図、第３図はB.サチリスの各菌株から抽出されたタンパ
ク質のSDS−アクリルアミドゲル上での分離の状態を示
す写真、第４図は免疫ブロッティングの結果を示す写真
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (7)
- 【請求項１】バシラス（Bacillus）属の菌において発現
し、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝子のク
ローニングに使用されるプラスミドベクターにおいて、
制限酵素地図 を有するプラスミドpSM143（ATCC 53038）の750塩基対X
ba I-EcoR Iフラグメントを下記の配列 を有する合成73塩基対フラグメントで置換したことを特
徴とする、プラスミドベクター（pSM208）。 - 【請求項２】制限酵素地図 を有する組換DNA分子（pSM 212）において、制限酵素地
図 を有するプラスミドベクターpSM208を制限酵素Hind III
及びEcoR Iで切断し、ついでT4 DNAリガーゼの存在下、
ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝子に結合さ
せたことを特徴とする、組換DNA分子（pSM 212）。 - 【請求項３】ヒト生長ホルモンの製法において、制限酵
素地図 を有する組換DNA分子（pSM 212）をバシラス属の菌に挿
入し、形質転換された菌を好適な培養環境で培養し、合
成されたヒト生長ホルモンを前記バシラス属の菌から回
収することを特徴とする、ヒト生長ホルモンの製法。 - 【請求項４】特許請求の範囲第３項記載の製法におい
て、前記バシラス属の菌がバシラス・サチリス（Bacill
us subtilis）である、ヒト生長ホルモンの製法。 - 【請求項５】特許請求の範囲第４項記載の製法におい
て、前記バシラス・サチリスがバシラス・サチリスSMS1
08（NRRL B-15898）である、ヒト生長ホルモンの製法。 - 【請求項６】特許請求の範囲第３項記載の製法におい
て、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝子を含
有する組換DNA分子（pSM 212）によって形質転換された
菌がバシラス・サチリスSMS108（pSM 212）（ATCC 6709
7）である、ヒト生長ホルモンの製法。 - 【請求項７】特許請求の範囲第３項記載の製法におい
て、溶菌処理後、バシラス・サチリスSMS108（pSM 21
2）（ATCC 67097）からヒト生長ホルモンを回収する、
ヒト生長ホルモンの製法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT20345/86A IT1189104B (it) | 1986-05-07 | 1986-05-07 | Vettore plasmidico ad espressione in bacillus utile per il clonaggio del gene strutturale che codifica per l'ormone della crescita umano e procedimento per la produzione di detto ormone |
| IT20345A/86 | 1986-05-07 | ||
| US07/837,659 US5334531A (en) | 1986-05-07 | 1992-02-14 | Plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63185385A JPS63185385A (ja) | 1988-07-30 |
| JP2540039B2 true JP2540039B2 (ja) | 1996-10-02 |
Family
ID=26327499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62109916A Expired - Lifetime JP2540039B2 (ja) | 1986-05-07 | 1987-05-07 | プラスミドベクタ− |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5334531A (ja) |
| EP (1) | EP0245218B1 (ja) |
| JP (1) | JP2540039B2 (ja) |
| DE (1) | DE3788592T2 (ja) |
| ES (1) | ES2061524T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1228925B (it) * | 1987-08-07 | 1991-07-10 | Eniricerche Spa | Procedimento per la preparazione dell'ormone della crescita umano |
| IT1274168B (it) * | 1994-04-15 | 1997-07-15 | Eniricerche Spa | Vettore plasmidico e suo impiego per la produzione di proteine eterologhe |
| DE4437005C1 (de) * | 1994-10-15 | 1996-01-18 | Bernhardt Dr Med Hildebrandt | Wickelschutzvorrichtung für Motorsensen (Freischneider) mit Fadenschneidkopf |
| US6995246B1 (en) * | 2000-10-19 | 2006-02-07 | Akzo Nobel N.V. | Methods for removing suspended particles from soluble protein solutions |
| US20060024288A1 (en) * | 2004-08-02 | 2006-02-02 | Pfizer Inc. | tRNA synthetase fragments |
| US8282921B2 (en) * | 2004-08-02 | 2012-10-09 | Paul Glidden | tRNA synthetase fragments |
| CN101993887B (zh) * | 2010-08-13 | 2013-04-17 | 江南大学 | 一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| IT1156317B (it) * | 1982-09-08 | 1987-02-04 | Anic Spa | Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione |
| US4452775A (en) * | 1982-12-03 | 1984-06-05 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules |
| US4760025A (en) * | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| JPS60137291A (ja) * | 1983-12-26 | 1985-07-20 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現ベクター |
| IT1208514B (it) * | 1985-03-19 | 1989-07-10 | Eniricerche Spa | Vettori plasmidici ad espressione in escherichia coli e/o bacillussubtilis. |
-
1987
- 1987-04-13 DE DE87830142T patent/DE3788592T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-13 ES ES87830142T patent/ES2061524T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-13 EP EP87830142A patent/EP0245218B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-07 JP JP62109916A patent/JP2540039B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-02-14 US US07/837,659 patent/US5334531A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63185385A (ja) | 1988-07-30 |
| DE3788592D1 (de) | 1994-02-10 |
| EP0245218A3 (en) | 1988-11-17 |
| ES2061524T3 (es) | 1994-12-16 |
| DE3788592T2 (de) | 1994-04-28 |
| EP0245218A2 (en) | 1987-11-11 |
| US5334531A (en) | 1994-08-02 |
| EP0245218B1 (en) | 1993-12-29 |
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