JP2528849B2 - 置換されたプロモ−タ−を使用する宿主による異種起原蛋白質の増強された分泌 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、宿主による異種起原蛋白質の増強された分
泌を促進する発現系と組換えDNA分子、そのような組換
えDNAを含有する宿主、またそのような宿主を使用して
所望の蛋白質を生産する方法に関する。

発明の背景 蛋白質は形質転換された微生物から、微生物を典型的
に破壊する細胞の溶菌のような方法によって抽出されな
ければならないため、組換えDNAの手法で調製される蛋
白質は往々にして単離するのが困難である。溶菌が起る
際に遊離される多数の異なる有機化合物のために、その
ような抽出手順で十分に純粋な蛋白質を高収量で得るこ
とは困難である。

典型的な分離手順に対するひとつの興味ある代替手段
は、選ばれた蛋白質を自分のまわりに分泌する宿主を持
つことである。分泌された蛋白質は比較的容易に培地か
ら分離され、微生物は分離操作後も生存を続け所望の蛋
白質をさらに生産し分泌することができる。

原核生物や真核生物によって本来分泌される蛋白質の
多くは、最初はアミノ酸数個分長いアミノ末端の延長部
分を含む前駆体の形で合成される。この延長部分は分泌
リーダーあるいはシグナル配列と呼ばれ、これによって
前駆蛋白質が微生物の細胞膜を通過し、培地あるいは細
胞のペリプラズム間隙に至ることが可能となる。分泌の
途中で分泌リーダーは蛋白質から切り離され、培地ある
いはペリプラズム間隙中に成熱蛋白質が生成する。

細菌における分泌の速さは典型的な場合非常に遅いに
もかかわらず、細菌による分泌は組換えDNA技術ととも
にずっと使用されて来た。例えばアメリカ合衆国特許
（United States Patents）4,411,994や4,338,397、ま
たヴィラーコマロフら（Villa-Komaroff et al）著、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA、753727-31（1978）を参照する
とよい。

酵母の一般的な安全性や酵母発酵に関する人類の経験
は、酵母を組換えDNA技術における宿主として使用する
ための望ましい候補にした。しかしながら、組換え酵母
から成熟蛋白質を分泌された形で得ようとした試みは低
収量に苦しんだと報告されている。例えば次の文献を参
照するとよい。シー・エヌ・チャンら（C.N.Chang et a
l）「酵母におけるハイブリッドインベルターゼシグナ
ルとヒトインターフェロン（IFN−α２）成熟型の認識
と開裂（Recognition and Cleavage of Hybrid Inverta
se Signals and Mature Forms of Human Interferon（I
FN−α２）in Yeast）」、酵母分子生物学会要旨（Meet
ing Abstracts,The Molecular Biology of Yeast）コー
ルド・スプリング・ハーバー研究所（Cold Spring Harb
or Laboratory）ニューヨーク州コールド・スプリング
・ハーバー（Cold Spring Harbor,New York）p.393（19
83），ビー・メイハックとエー・ハイネン（B.Meyhack
and A.Hinnen）「酵母PHO5プロモーター制御による外来
遺伝子の高発現（High Levels of Expression of Forei
gn Genes Under the Control of the Yeast PHO5 Promo
ter）」酵母分子生物学会要旨（Meeting Abstracts,The
Molecular Biology of Yeast）コールド・スプリング
・ハーバー研究所（Cold Spring Harbor Laboratory）
ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Cold
Spring Harbor,New York）p.156（1983）、エス・デー
・エムル（S.D.Emr）「酵母における蛋白質の局在化と
遺伝子発現の研究のためのMFα１−SUC2（α因子−イン
ベルターゼ）遺伝子融合（An MFα1-SUC2（α−Factor-
Invertase）Gene Fusion for Study of Protein Locali
zation and Gene Expression in Yeast）」Proc.Natl.A
cad.Sci.USA80pp.7080-84（1983）、エー・ブレークら
（A.Brake et al）「サッカロミセス・セレビシアにお
けるα因子支配による合成と成熟外来蛋白質の分泌（α
−Factor-Directed Synthesis and Secretion of Matur
e Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisia
e）」Proc.Natl.Acad.Sci.USA81pp.4642-46（1984）、
ジー・エー・ビターら（G.A.Bitter et al）「α因子遺
伝子融合によって支配されたサッカロミセス・セレビシ
アからの外来蛋白質の分泌（Secretion of Foreign Pro
teins From Saccharomyces cerevisiae Directed by
α−Factor Gene Fusions）」Proc.Natl.Acad.Sci.USA8
1pp.5330-34（1984）、エー・シンら（A.Singh et al）
「酵母におけるα因子−インターフェロン融合蛋白質の
合成、分泌およびプロセシング（Synthesis,Secretion
and Processing of α−Factor-Interferon Fusion Pro
teins in Yeast）」Nucl.Ac.Res.12pp.8927-38（198
4）、ヨーロッパ特許出願（European Patent Applicati
on）123,228、及びヨーロッパ特許出願（European Pate
nt Application）128,733、及びジー・ビターら（G.Bit
ter et al）「α因子フェロモン支配によるサッカロミ
セス・セレビシアからの外来蛋白質の分泌（Secretion
of Foreign Proteins from Saccharomyces cerevisiae
Directed by α−Factor Pheromone）」Nucl.Ac.Res.1
1pp.4049-63（1983）。

発明の要約 本発明は、異種起原蛋白質の増強された分泌を促進す
る発現系を提供することにより上述の問題を解決する。
我々は、多コピーベクター中の最高でも中程度の強さの
プロモーターと異種起原DNA分泌シグナル配列とを使用
した結果、強いプロモーターを使用する多コピーベクタ
ーによって形質転換された宿主の場合よりも、宿主から
所望の蛋白質が高収量で得られることを見出した。

従って、本発明の具体的表現態様のひとつは、選ばれ
た蛋白質の生産のための、及び蛋白質がその中で作られ
る宿主からの同蛋白質の分泌のための発現及び分泌調節
配列であるDNA配列を含む。当該配列は、（ａ）当該宿
主中で活性があり最高でも中程度の強さのプロモーター
と、（ｂ）当該宿主によって認識され、開始コドンで始
まり、当該プロモーターと機能的に連結された異種起原
DNA分泌シグナル配列を含む。発現及び分泌調節配列
は、所望の蛋白質をコードするDNA配列と機能的に連結
し、宿主を形質転換して所望の蛋白質を生産させ分泌さ
せるのに用いられる。酵母は好ましい宿主であり、アク
チン（ACT）及びイソ−１−シトクロームc(CYC1)プロモ
ーターは酵母宿主にとって好ましいプロモーターであ
る。エス・セレビシア（S.cerevisiae）は最も好ましい
宿主である。宿主がエス・セレビシア（S.cerevisiae）
の時は、分泌シグナル配列は好ましくはMFα1遺伝子の
分泌シグナル配列である。

本発明はまた、上述の組換えDNA分子によって形質転
換された宿主、及び所望の蛋白質の調製や分泌において
形質転換された宿主を使用する方法に関する。

図面の簡単な説明 第1A図はMFα1分泌前駆体の構造を示す。点刻された
領域はMFα1くり返し配列を隔てるスペーサー領域を示
す。分泌過程で分泌リーダーは矢印で示された位置で切
断される。

第1B図は所望の異種起原蛋白質と融合したアルファ配
偶因子（alpha mating factor）（MFα1）分泌リーダー
を含む酵母分泌前駆体の構造の一般的な図を示す。分泌
過程で分泌リーダーは矢印で示された位置で切断され
る。

第２図はMFα1発現調節配列とSMC遺伝子の融合遺伝子
の構造及びMFα1/SMC融合遺伝子の酵母発現ベクターへ
の挿入を示す。

第３図は二つのグラフを示している。すなわち生育
（600nmにおける光学密度によって反映される）とURA3
型の発現ベクターで形質転換された酵母種BJ1991（Yeas
t strain BJ1991）の培養液中のSMCレベルである。CYC1
プロモーター構造（p446/1）を有するものは（●）で、
ACTプロモーター構造（p364/1）を有するものは（▲）
で、MFα1プロモーター構造（p336/1）を有するものは
（■）で示されている。

第4A図はEcoRI部位で終るアクチンプロモーター断片
の構造を示す。

第4B図はアクチン及びpEX−５、pEX−７、及びpEX−
８ベクターそれぞれのプロモーター終結部分のDNAの構
造を示す。

第５図はACT及びCYC1プロモーターを基礎としたSMC分
泌ベクターの構築を示す。

第６図は酵母LEU2遺伝子を基礎としたSMC分泌ベクタ
ーの構造を示す。

第７図は二つのグラフを示している。すなわち生育
（600nmにおける光学密度によって反映される）とLEU2
型発現ベクターで形質転換された酵母種BJ1991（Yeast
strain BJ1991）の培養液中のSMCレベルである。CYC1プ
ロモーター構造を有するもの（504/5）は（●）で、ACT
プロモーター構造を有するもの（p482/18）は（▲）
で、MFα1プロモーター構造を有するもの（pMF-SMC,再
配列されたもの）は（■）で示されている。

第８図はTNFのための分泌ベクターの構築を示す。

第９図はTPAのための分泌ベクターの構築を示す。

発明の詳細な説明 本発明がより十分に理解されるために、以下の詳細な
説明が提供される。ここでは特に以下のいくつかの用語
が使用される。

クローン化−−非性的再生産によってある生物体ある
いはDNA配列から誘導された生物体あるいはDNA配列の集
団を得る過程。

組換えDNA分子あるいは雑種DNA−−生細胞の外で末端
どうしが連結され生細胞の中で維持可能な異なるゲノム
由来のDNA配列から構成される分子。

蛋白質−−線状に並んだ50個以上のアミノ酸を含むポ
リペプチド。例えば、プロインシュリン、血清アルブミ
ン、ヒト生長ホルモン、副甲状腺ホルモン、及びインタ
ーフェロンである。しかしながらここで使用される場
合、蛋白質の中には50個以下のアミノ酸からなるポリペ
プチド鎖も含める。

ポリペプチド−−隣接するアミノ酸のアミノ基とカル
ボキシル基の間のペプチド結合によって互いに連結され
たアミノ酸が線状に並んだもの。

発現−−ポリペプチドあるいは蛋白質を生産するため
に遺伝子によってひき起こされる過程。転写と翻訳が組
み合わされたものである。

転写−−遺伝子からmRNAを生産する過程。

翻訳−−mRNAから蛋白質あるいはポリペプチドを生産
する過程。

プロモーター−転写を開始するためのRNAポリメラー
ゼの結合に寄与するDNAの領域。細菌の発現系ではプロ
モーターはリボソーム結合部位の前に位置している。強
いプロモーターとは、RNAポリメラーゼに対して強い親
和力があり、それゆえに高い発現速度を得ることを助長
すると期待されるものと定義される。中程度の強さのプ
ロモーターは、RNAポリメラーゼに対して比較的低い親
和力を有する。

組換え系においては、プロモーターの強さは宿主、所
望の蛋白質及びその組換え系の発現ベクターによって影
響を受ける。これらの因子の効果は、以下でより十分に
議論される。所望の蛋白質を分泌しない系すなわち細胞
内発現系においては、mRNAレベルと発現された蛋白質の
レベルはプロモーターの強さに比例する。細胞内発現系
においては、プロモーターのコピー数の変化はプロモー
ターの強さが変化しても全く観察されない。ジェイ・メ
ラーら（J.Mellor et al）「サッカロミセス・セレビシ
アにおける異種起原蛋白質の発現に影響を与える因子
（Factors Affecting Heterologous Gene Expression i
n Saccharomyces cerevisiae）」Gene33pp.215-26（19
85）。分泌発現系においては、我々は、プロモーターの
強さが所定の宿主内で生産される多コピー発現ベクター
のコピー数に影響を与えることがあることを見出した。
分泌発現系においては、宿主は、中程度あるいは弱いプ
ロモーターを含む多コピーベクターの複製を多量に生産
するであろうが、強いプロモーターを含む多コピーベク
ターの複製は比較的少量しか生産しないだろう。プロモ
ーターの強さの評価は、当該プロモーターの発現調節配
列によって生産されたmRNAの細胞中の全mRNAに対する百
分率を基礎とする。表１に遺伝子のリストを示す。文献
中に述べられているように、それらに付随したプロモー
ター及び付随したmRNAを含む。プロモーターの強さの特
徴づけも含まれている。

1.ジェー・エル・ベネツェンとビー・ディ・ホール（J.
L.Bennetzen and B.D.Hall）「酵母におけるコドン選択
（Codon Selection in Yeast）」J.Biol.Chem.257pp.30
26-31（1982） 2.シー・エッチ・キムとジェー・アール・ワーナー（C.
H.Kim and J.R.Warner）「酵母におけるリボソーム蛋白
質に対するメッセンジャーRNA（Messenger RNA for Rib
osomal Proteins in Yeast）」J.Mol.Biol.165pp.78-89
（1983） 3.エッチ・ジェー・ヒメルファーブら（H.J.Himmelfarb
et al）「サッカロミセス・セレビシアのSUP45全能サ
プレッサー遺伝子の単離とその遺伝子産物の特徴づけ
（Isolation of the SUP45 Omnipotent Suppressor Gen
e of Saccharomyces cerevisiae and Characterizatio
n of its Gene Product）」Mol.Cell.Biol.5pp.816-22
（1985） 4.エム・ジェー・ドブソンら（M.J.Dobson et al）「TR
P1 5′領域によって支配されたヒトインターフェロン−
アルファのサッカロミセス・セレビシアにおける発現
（Expression in Saccharomyces cerevisiae of Human
Interferon-Alpha Directed by TRP1 5′Region）」Nu
cl.Ac.Res.11pp.2287-2302（1983） 一般に、解糖系の遺伝子のプロモーターは「強い」と考
えられている。しかしながら、熟練した経験者は、種の
異なる宿主中、異なる所望の蛋白質を用いると、あるい
は異なる多コピーベクター中ではプロモーターは同じ強
さを持たないこともあると理解するだろう。例えばエス
・セレビシア（S.cerevisiae）においては、MFα1プロ
モーターはMATα種の中では活性があるが、MATa種の中
では不活性である。熟練した経験者は、プロモーターの
強さは多数の因子に依存することを察知するだろう。単
にあるプロモーターが宿主，ベクター及び所望の蛋白質
のひとつの組合せについて適当でないからという理由だ
けで、そのプロモーターが宿主，ベクター及び所望の蛋
白質の別の組合せに対して適当でないだろうと考えるこ
とはできない。

本発明のプロモーターは、プロモーターの強さと多コ
ピーベクターのコピー数の組合せが所望の蛋白質の最適
の収量をもたらすべく選択されなければならない。中程
度の強さのプロモーターはプロモーターの強さとコピー
数の最もよい組合せをもたらす。高いコピー数のものと
組合せる比較的弱いプロモーターも本発明の範囲に含ま
れる。強いプロモーターは形質転換された宿主中の多コ
ピーベクターのコピー数に逆に影響を与え、そのような
形質転換体からは不満足な収量しか得られない。プラス
ミドのコピー数を意味があるほど減少させることなく最
大の強さを持つプロモーターが選択されるべきである。
一般に、そのプロモーターに該当する宿主中の全mRNAに
対する百分率が0.3％以下さらに好ましくは最高でも0.1
5％であるならば、プロモーターとしては、宿主，ベク
ター及び所望の蛋白質の与えられた組合せに関して最高
でも中程度の強さのものが考えられる。

リボソーム結合部位−−翻訳が開始できるべく、mRNA
がリボソームに結合するのを助けるmRNA上の部位をコー
ドするDNAの領域。細菌の発現系においては、リボソー
ム結合部位は、プロモーターの後（下流）で所望の蛋白
質を生産するために発現されるDNA配列の翻訳開始シグ
ナルの前（上流）に位置している。

遺伝子−−mRNAの鋳型として、特定のポリペプチドあ
るいは蛋白質に特徴的なアミノ酸配列をコードするDNA
の配列。

発現調節配列−−遺伝子と機能的に連結された時、そ
の遺伝子の発現を調節し制御するDNA配列。そのような
配列は次のものを含む。lacの系，β−ラクタマーゼの
系，trpの系，tac及びtrcの系，λファージの主要なオ
ペレーター及びプロモーター領域,fdコート蛋白質のコ
ントロール領域,SV40の初期及び後期プロモーター，ポ
リオーマ・ウイルス（polyomavirus）及びアデノウイル
ス（adenovirus）から誘導されたプロモーター，メタロ
チオニン（metallothionine）プロモーター，グリセリ
ン−３−リン酸キナーゼあるいは他の解糖系酵素のプロ
モーター、例えばPho5のような酸性フォスファターゼの
プロモーター，酵母α−配偶因子（α−mating factor
s）のプロモーター、及び原核生物あるいは真核生物の
細胞及びそれらのウイルス中の遺伝子の発現を調節する
と経験上知られている他の配列あるいはそれらの組合
せ。SV40初期領域において、ジヒドロ葉酸遺伝子酵素を
コードする遺伝子と共役してチャイニーズ・ハムスター
卵巣細胞（Chinese hamster ovary cells）中で選択的
に増幅され活発に翻訳される真核生物遺伝子の多数の複
製を含むセルライン（cell line）が生産されるよう
に、動物細胞においては、遺伝子が真核生物のプロモー
ターと連結されることが可能である。熟練した経験者
は、先に例としてあげたあらゆる発現調節配列が個々の
宿主，所望の蛋白質及びベクターの組合せに使用するの
に適しているわけではないことを察知するだろう。

蛋白質の前駆体−−蛋白質と機能的に連結されたシグ
ナル配列を持つ蛋白質。典型的な場合、前駆体は宿主内
で合成される。例えば、プレプロインシュリン，プレ血
清アルブミン，プレヒト成長ホルモン，プレ副甲状腺ホ
ルモン、及びプレインターフェロンがある。本発明に従
えば、前駆体のシグナル配列の同時並行の除去あるいは
切断とともに前駆体を宿主の細胞膜を通過して分泌させ
ることにより成熟蛋白質が得られる。

ヌクレオチド−−糖部分（五炭糖），リン酸、及び窒
素を含む複素環塩基からなるDNAあるいはRNAの単量体単
位。塩基はグリコシド炭素（五炭糖の１′炭素）を通じ
て糖部分と連結され、その塩素と糖の組合せはヌクレオ
シドと呼ばれる。塩基がヌクレオチドを特徴づける。四
種のDNA塩基はアデニン（「Ａ」），グアニン
（「Ｇ」），シトシン（「Ｃ」）及びチミン（「Ｔ」）
である。四種のRNA塩基はA,G,C及びウラシル（「Ｕ」）
である。

DNA配列−−隣接する五炭糖の３′と５′炭素の間の
リン酸ジエステル結合によってひとつひとつが連結され
たヌクレオチドの線状の連続。

コドン−−メッセンジャーRNA（「mRNA」）を介して
アミノ酸，翻訳開始シグナルあるいは翻訳終止シグナル
をコードする３個のヌクレオチド（トリプレット）のDN
A配列。例えば、ヌクレオチド・トリプレットTTA,TTG,C
TT,CTC,CTA及びCTGはアミノ酸ロイシン（「Leu」）をコ
ードし、TAG,TAA及びTGAは翻訳停止シグナルであり、さ
らにATGは翻訳開始シグナルである。

プラスミド−−宿主細胞中で複製されるための完全な
「複製単位（レプリコン）」を含む染色体外二本鎖DNA
配列。プラスミドが宿主生物内に置かれると、その生物
の特質がプラスミドのDNAのために変化すなわち形質転
換される。例えば、テトラサイクリン耐性（Tet^R）遺伝
子を有するプラスミドは、その前はテトラサイクリンに
感受性だった宿主細胞をそれに耐性のものに形質転換す
る。プラスミドによって形質転換された宿主細胞は「形
質転換された宿主」あるいは「形質転換体」と呼ばれ
る。

ファージあるいはバクテリオファージ−−蛋白質の外
殻あるいはコート（「カプシド（capsid）」）に包まれ
たDNA配列を含むバクテリアのウイルス。

クローン化運搬体−−宿主細胞中で複製可能で、例え
ば複製，コート蛋白質の生産あるいはプロモーターある
いは結合部位の消失等のDNAの必須な生物学的機能の消
失を伴わずに、その位置でそのDNA配列が確定できる形
で切断される１個あるいは数個のエンドヌクレアーゼ認
識部位によって特徴づけられ、例えばテトラサイクリン
耐性あるいはアンピシリン耐性等の、形質転換された細
胞の同定に使用するのに適したマーカーを含むプラスミ
ド，ファージDNAあるいは他のDNA配列。クローン化運搬
体はベクターとしても知られている。本発明において
は、ベクターは「多コピー」ベクターすなわち宿主内で
自分自身の多数のコピーを生産することが可能、でなけ
ればならない。複数のコピーを生産できない単一コピー
ベクターは本発明の範囲に含まれない。

宿主−−例えば、プラスミドの遺伝子の発現を通した
ポリペプチドあるいは蛋白質の生産のように、クローン
化運搬体による形質転換に際してクローン化運搬体が複
製しその外来生物学的機能を果すことを可能にする生物
体。

DNAシグナル配列−−mRNAの鋳型として、ポリペプチ
ドあるいは蛋白質のアミノ末端の典型的に疎水性のアミ
ノ酸の配列をコードするDNA配列、すなわち蛋白質の
「シグナル配列」あるいは「分泌リーダー配列」。分泌
のためには、そのようなDNAシグナル配列は、所望の蛋
白質のDNA配列に機能的に連結され、その直前でかつそ
の翻訳開始シグナル（例えばATG）の後に位置する。蛋
白質の前駆体が宿主の細胞膜を通過して運ばれ、前駆体
のシグナル配列が適切に切断されて分泌過程で蛋白質が
遊離されるためには、蛋白質の前駆体のシグナル配列の
一部のみが必要であるに過ぎないと信じられている。も
し宿主中で適切な成熟化（processing）が起こるとすれ
ば、シグナル配列の組合せあるいはシグナル配列の一部
が使用されてもかまわない。従って、ここで使用される
「DNAシグナル配列」という用語は、分泌のために要求
されるシグナル配列のそのような部分をコードするDNA
配列を含む。

本発明に従えば、所望の蛋白質の発現を実現するため
に、本発明の発現系は、所望の蛋白質をコードするDNA
配列と機能的に連結され、適切な宿主を形質転換するた
めに使用される。その後宿主は生育に適切な条件下で培
養されればよい。所望の蛋白質はその後培養物から単離
されればよい。もちろん最適の結果は、宿主，プロモー
ター，ベクター、及び生育条件の適切な選択を含む多く
の変化する要因に依存するだろう。

多くの宿主がこれまで組換えDNA技術において使用さ
れ、経験上よく知られている。極めて多様な宿主が本発
明の方法においては有効である。これらの宿主は例えば
次のようなものを含む。大腸菌（E．coli）（例えば大
腸菌HB101あるいは大腸菌MC1061）、枯草菌（Bacillu
s）、放線菌（Streptomyces）、及びシュウドモナス（P
seudomonas）のような細菌、酵母のようなカビ,CHO細
胞，マウス，ブタ，ウシ，鳥類あるいは魚類細胞のよう
な動物細胞、組織培養における植物細胞，ヒト組織細
胞，あるいは経験上知られている他の宿主。

適切な宿主の選択は、熟練によって認識される多くの
因子によって調整される。これらは例えば、選ばれたベ
クターとの和合性、所望の蛋白質の回収の容易さ、発現
の特性、生物学的安全性及び費用を含む。本発明におい
ては、宿主は使用されたプロモーターと使用された分泌
シグナル配列の双方を認識することができなければなら
ない。さらに、多コピーベクターによって形質転換され
た際に、宿主の生存能力ばかりでなく、所望の蛋白質の
宿主に対する毒性も考慮に入れられなければならない。
単独ではこれらのいずれの因子からも、特定の組換えDN
A分子あるいはポリペプチドに対して、絶対的な宿主の
選択を行うことはできない。その代りに、これらの因子
の均衡は、すべての宿主が特定の発現調節配列と機能的
に連結された特定のDNA配列の発現にとって必ずしも同
じように有効とは限らないという実状を知ることによっ
て打撃を受けなければならない。本発明はエス・セレビ
シア（S．cerevisiae）に限定されるものではないとは
いえ、酵母は好ましい宿主であり、さらにエス・セレビ
シア（S．cerevisiae）は特に好ましいものである。

種々のプロモーターが本発明の発現系において使用さ
れてよい。しかしながら、そのプロモーターが選ばれた
宿主中で活性がありかつ最高でも中程度の強さであるこ
とを条件とする。

所望の蛋白質の宿主に対する毒性はプロモーターの選
択に影響を与える。つまり、比較的毒性の弱い蛋白質の
分泌のためには、より毒性の強い蛋白質の分泌のためよ
り相対的に強いプロモーターが使用され得る。多コピー
ベクター中のプロモーターに付属したコード領域もプロ
モーターの強さに影響を与える。例えば、pgkプロモー
ターはそれ本来のコード領域（PGK）に付属した時は非
常に強いが、アルファ・インターフェロン遺伝子に付属
した時は弱い。ジェー・メローら（J.Mellor et al）
「サッカロミセス・セレビシアにおける異種起原遺伝子
の発現に影響を与える因子（Factors Affecting Hetero
logous Gene Expression in Saccharomyces cerevisia
e）」Gene 33 pp.215-26（1985）。プロモーターを選択
する際には、メローら（Mellor et al）によって述べら
れた強いプロモーター、supraのように、強いプロモー
ターと異種起原遺伝子の連結は強いプロモーターを相当
弱くするだろうことも正しく認識しなければならない。
プロモーターの強さはそのように多くの変化する要因に
影響されるため、あるプロモーターがひとつの宿主−ベ
クター−所望の蛋白質の組合せに使用するのに強すぎる
という事実は、そのプロモーターの異なる組合せでの使
用を排除するものではない。

本発明から作製された組換えDNA分子における使用に
ついて考慮されてよいプロモーターは、酵母エス・セレ
ビシア（S．cerevisiae）については、ACT（アクチン）
遺伝子，CYC1（イソ−１−シトクロムＣ）遺伝子，URA3
遺伝子のプロモーターを含む。キムとワーナー（Kim an
d Warner）J.Mol.Biol.165pp.79-89（1983）（mRNAレベ
ル約0.008％）。分泌発現系については、エス・セレビ
シア（S．cerevisiae）を用いる使用に対して適当でな
い強いプロモーターは、例えばG3PDH及びエノラーゼの
プロモーターを含む。

大腸菌（E．coli）及び枯草菌（B．subtilis）のよう
な細菌を用いる使用についての分泌発現系における望ま
しいプロモーターは、最高でも中程度の強さのものでな
ければならない。trp，trc，lacプロモーターのような
強いプロモーターは一般に避けられるべきである。しか
しながら、もし中程度の誘導生育条件が選ばれたとした
ら、中程度のプロモーターの強さは、trpあるいはlacプ
ロモーターのような制御されたプロモーターを用いて都
合よく調整されただろう。

実施例においては、我々は生育のすべての時期を通し
て活性のあるプロモーターを使用した。もし生育の間に
プロモーターが停止させられたとしたら、プロモーター
が誘導されない限り、ベクターのコピー数の調整はおそ
らく起こっていなかっただろう。しかしながら、制御さ
れたプロモーターは多分有利な点を与えなかっただろ
う。おそらく、高コピー分泌構成系における強いプロモ
ーターの作動開始は、大腸菌（E．coli）によるインシ
ュリンの分泌のように、ただちに宿主を溶菌しただろ
う。

上記において議論したように、我々は、分泌発現系に
ついて、もしプロモーターが宿主−ベクター−所望の蛋
白質の系において強ければ宿主は多コピーベクターのコ
ピーをほとんど作らず（すなわちコピー数が少く）、よ
り弱いプロモーターを持つ多コピーベクターからより多
いコピーが作られ（すなわちコピー数がより多く）、そ
の結果所望の蛋白質の収量が向上することを発見した。
しかしながら、最大のコピー数がCYC1プロモーター構成
系について見られたため（表２）、実施例３において議
論されるCYC1プロモーターより弱いプロモーター（例え
ばCYC7あるいはtrp1）の使用は、コピー数がより高いた
めに収量を向上させないだろう。最低の強さのプロモー
ターはそのプロモーターの強さによって制限され、また
最も強いプロモーターは制限されたコピー数しか与えな
い。いかなる理論にも拘束されることを望むものではな
いが、強いプロモーターと結合された高コピー数のもの
は結果的に高レベルのmRNA、所望の蛋白質の過剰分泌あ
るいはその両方をもたらすと思われる。強いプロモータ
ーを持つベクターによって形質転換された細胞を含む形
質転換体の集合においては、その集合の中にコピー数の
異なるものの混在が発生する。強いプロモーターを持ち
高いコピー数を持つ細胞は生育を停止し最終的には溶菌
するだろうし、それに対してより低いコピー数と同じ強
いプロモーターを持つ形質転換体は生き残るだろう。そ
の集合は最終的に低いコピー数の形質転換体だけを含む
ことになろう。一般的には、ティー・ジェー・シルハビ
ーら（T.J.Silhavy et al）「蛋白質局在化の機構（Mec
hanisms of Protein Localization）」Microbiol.Res.4
7pp.313-34（1983）を参照するとよい。

多コピーベクターと、特に本発明の発現系の挿入のた
めにそのベクター中で選ばれる部位は種々の因子、例え
ば特定の制限酵素に感受性の部位の数、発現される蛋白
質の大きさ，ベクターの配列に相関した開始あるいは停
止コドンの配置のような発現の特性、及び熟練した経験
者によって認識される他の因子によって決定される。ベ
クターの選択は、これらの因子の均衡によって決定さ
れ、すべての選択が与えられたひとつの場合について等
しく効果的であるわけではない。好ましいベクターは、
染色体及び非染色体DNAから誘導された複製の開始点を
含むプラスミドである。酵母エス・セレビシア（S．cer
evisiae）においては、種々のARS及び２μ型ベクター
（ボツティンら（Botstein et al））が好ましい。大腸
菌（E．coli）においては、ColE1,pBR322及びRP4プラス
ミドのような多コピープラスミド、あるいはM13及びラ
ムダファージベクターが使用され得る。動物細胞につい
ては、ウシ乳頭腫ウイルスを基礎とするベクターのよう
な非組み込み型の多コピーベクターが好ましい。ベクタ
ーの選択も選ばれたプロモーターによって影響されるだ
ろう。最適のプロモーターとベクターの系は、分泌され
た蛋白質の毒性（高すぎるコピー数あるいは強すぎるプ
ロモーターに基づく過剰生産による）を比較的弱くしか
もたらさないだろうし、また結果的により高い分泌のレ
ベルが得られる可能性がある。

本発明の異種起原分泌シグナル配列は宿主によって認
識され正しく成熟化（プロセシング）されなければなら
ない。当該シグナル配列は、自然界に存在するシグナル
配列、自然界に存在するシグナル配列の有効な部分、あ
るいは２個あるいはそれ以上のシグナル配列あるいはシ
グナル配列の有効な部分の組合せを含んでもよい。当該
シグナル配列は、プロモーター及び開始シグナル、ATG
の双方と機能的に連結されなければならない。好ましく
は、当該シグナル配列は翻訳開始シグナルから始まる。
好ましい実施態様においては、当該シグナル配列は、そ
れ自身の蛋白質の分泌を促進するために宿主によってす
でに使用されたシグナル配列から選択される。

所望の蛋白質はいかなるポリペプチドあるいは蛋白質
を含んでもよいし、また融合蛋白質，蛋白質前駆体，未
成熟蛋白質あるいはアミノ酸のいかなる所望の配列を含
んでもよい。しかしながら好ましくは、本発明の所望の
蛋白質は何らかの微生物あるいは細胞によって分泌され
る蛋白質、及びそれ以外のアミノ酸配列を含む。そのよ
うな分泌性の蛋白質及びそれ以外のアミノ酸配列の例
は、血清蛋白質，β−エンドルフィンのような鎮痛剤ポ
リペプチド，ソマトスタチン，インシュリン，成長ホル
モン（ヒト及びウシ），黄体形成ホルモン,ACTH,膵臓ポ
リペプチド蛋白質前駆体，プレプロインシュリン，プロ
インシュリン、及びインシュリンのＡ及びＢ鎖を含む。
本発明の所望の蛋白質は、選択された宿主によって本来
培地中に分泌される蛋白質及びそれ以外のアミノ酸配列
を含んでもよい。

本発明の所望の蛋白質は選択された宿主によって分泌
されることを必要としない。実施例６において示される
ように、宿主は、選ばれたシグナル配列と機能的に連結
された所望の蛋白質を作製し、小胞体の中へ所望の蛋白
質を正しく成熟化（プロセシング）する必要があるだけ
である。もし所望の蛋白質が宿主の分泌経路に入れば、
当該所望の蛋白質について配糖化のような利益が得られ
るかもしれない。しかしながら分泌は、所望の蛋白質に
とって好ましい結果である。もしウシ乳頭腫ウイルスか
ら誘導されたベクター（ディ・ディマイオら（D.DiMaio
et al）「マウス及び細菌細胞の双方の中でプラスミド
として繁殖するウシ乳頭腫ウイルスベクター（Bovine P
apilloma-Virus Vector that Propagates as a Plasmid
in Both Mouse And Bacterial Cells）」Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA.79pp.30-34（1982））のような非組み込み
型の多コピーベクターが中程度の強さのプロモーターと
連結されて使用されるならば、本発明は動物細胞におい
ても有用かもしれない。

これらに限定されるものではないが、以下の実施例は
本発明をさらに進んで説明するのに役に立つであろう。

実施例１ MFα1/SMC DNA配列の調製 本実施例では、形質転換された酵母の調製を述べる。
それは後の実施例において比較の目的のために使用され
る。本実施例の形質転換された酵母は、MFα1分泌リー
ダーとSMCをコードするDNA配列に機能的に連結されたMF
α1プロモーター（それは以下に示されるように酵母の
中で強いプロモーターである）を含むプラスミドを有す
る。他の実施例ではMFα1プロモーターのACT及びCYC1プ
ロモーターによる置換、及び種々に形質転換された酵母
の分泌レベルの比較を述べる。さらに、他の実施例で
は、SMC以外の所望の蛋白質をコードするDMA配列によっ
て特徴づけられるプラスミドを有する形質転換された酵
母の調製を述べる。

我々はまずMFα1前駆体（pre-MFα1）及びその付随す
る発現調節系についての遺伝子を単離し、それから我々
はそのMFα1プロモーターとシグナル配列をSMCのDNA配
列に機能的に連結した。MFα1の前駆体をコードするDNA
配列はすでにジェー・クリアンとアイ・ヘルスコウィッ
ツ（J.Kurjan and I.Herskowitz）によって配列決定さ
れている。「酵母フェロモン遺伝子（MFα）の構造：推
定されているα因子前駆体は成熟α因子の４個の縦に一
並に並んだコピーを含む（Structure of a Yeast Phero
mone Gene（MFα）:A Putative α−Factor Precursor
Contains Four Tandem Copies of Mature α−Facto
r）」Cell30pp.933-43（1982）。我々は、ケー・エー・
ナスミスとエス・アイ・リード（K.A.Nasmyth,and S.I.
Reed）によって作製されたライブラリー（「酵母におけ
る相補化による遺伝子の単離：細胞周期遺伝子の分子ク
ローン化（Isolation of Genes by Complementation in
Yeast:Molecular Cloning of a Cell-Cycle Gene）」P
roc.Natl.Acad.Sci.USA772119-23（1980））を用いてエ
ス・セレビシア（S．cerevisiae）からそれらのMFα1前
駆体及びその付随する発現調節配列をコードする遺伝子
を単離した。cdc28遺伝子の単離とクローン化のために
はナスミスとリード（Nasmyth and Reed）において述べ
られたcdc28変異株を使用する代りに、我々は公表され
たMFα1前駆体の97番目から102番目のアミノ酸に相当す
る次のオリゴヌクレオチドを使用した。

（５′）GTA CAT TGG TTG C/GCC G/A/TGG（３′） １個の分泌リーダーと４個のMFα1くり返し配列を含
むMFα1分泌前駆体は第1A図に示されている。点刻され
た領域はMFα1くり返し配列の間のスペーサー領域を示
す。第1B図に示されたように、４個のMFα1くり返し配
列を所望の異種起原蛋白質で置換する前に、1.7kbのEco
RI断片上に位置するMFα1前駆体遺伝子と付随する発現
調節配列は選択されたクローン化ベクターpUC18にサブ
クローン化された。その結果得られたプラスミド（p220
/3）はその時MFα1プロモーター，MFα1シグナル配列及
びMFα1DNAをコードする配列を含んでいた。MFα1プロ
モーターとMFα1シグナル配列からMFα1をコードする配
列を単離するために、我々はビー・エー・オーストラら
（B.A.Oostra et al）の文献で述べられた手順を用い
て、プラスミドp220/3に変異誘発をかけた。「部位指示
的変異誘発によって突き止められたポリオーマウイルス
中央Ｔ抗原の形質転換活性（Transforming Activity of
Polyoma Virus Middle-T Antigen Probed by Site-Dir
ected Mutagenesis）」Nature304pp.456-59（1983）。
変異誘発の結果以下に示すように、都合のよいBglII部
位が分泌リーダーとMFα1DNA配列のくり返しをコードす
る配列の間の連結部に導入された。

修飾されたオリゴマー： もとの配列： その結果得られたプラスミドはp254と名づけられた
（第２図）。MFα1プロモーターの５′末端に見出され
るBglII部位での意図されない切断を避けるためにそれ
はさらに修飾された。我々は、BglIIを用いる切断及びD
NAポリメラーゼＩの大（クレニュー（Klenow））フラグ
メント及びデオキシヌクレオチド三リン酸を用いる突出
末端の埋め込み及びT4リガーゼを用いるその後の連結に
よってこの望ましくないBglII部位を作り変えた。当該
プラスミドにおける異なる切断を与えるために（実施例
５及び６）、同じリジン−アルギニン間の（lys-arg）
切断部位に相当する位置に、上述の変異誘発に似た手順
で、１個のStuＩ部位が導入された。

修飾されたオリゴマー： BglII配列： 我々はその後、唯一のNcoＩ部位で始まる合成SMC遺伝
子を有する500bpHindIII断片をMFα1プロモーター及び
分泌リーダーを含んだ（上述の）プラスミドp254のHind
III部位に挿入することによってMFα1/SMC（分泌リーダ
ー／所望の蛋白質）を作製し、第２図に示されたよう
に、プラスミドＦ−９を得た。合成SMC遺伝子はジー・
ブエルら（G.Buell et al）らの文献に述べられてい
る。「ソマトメジンＣ（IGF−１）をコードする合成遺
伝子の大腸菌における発現の最適化（Optimizing the E
xpression in E．coli of a Synthetic Gene Encoding
Somatomedin−Ｃ（IGF−１））」Nucl.Ac.Res.13pp.192
3-38（1985）。我々はその後に、第２図に示されたよう
に、プラスミドＦ−９の△で示した部分を除去するため
にBglIIとNcoＩを用いてプラスミドＦ−９を切断し、同
時にS1処理と再連結を行いpS30/25を得た。MFα1分泌リ
ーダーとSMC構造DNA配列の正しい融合遺伝子は次の配列
を有していた（グリシンはSMCの最初のアミノ酸であ
る）。

（分泌リーダー） −AAA−AGA−GGT−CCT−（SMC） lys arg gly pro 結果として、SMC蛋白質が酵母によって正しく分泌さ
れるためにSMCのDNA配列がMFα1分泌リーダーに機能的
に連結された。

第２図に略述されたように、我々はそのMFα1/SMC融
合遺伝子を、大腸菌と酵母双方についての選択マーカー
（大腸菌はbla、酵母はURA3）ばかりでなく大腸菌と酵
母の複製開始点（それぞれoriと２μの複製開始点）も
有する酵母のシャトルベクターに導入した。本発現ベク
ターを用いて形質転換したエス・セレビシア（S．cerev
isiae）によるSMC分泌速度は第３図に示されている。

実施例２ ACT/MFα1/SMC DNA配列の調整 酵母のアクチンをコードするDNA配列はディ・ガルウ
ィッツとアイ・スレス（D.Gallwitz and I.Sures）の文
献に述べられている「分離した酵母遺伝子の構造：サッ
カロミセス・セレビシアにおけるアクチン遺伝子の全塩
基配列（Structure of a Split Yeast Gene:Complete N
ucleotide Sequence of the Actin Gene in Saccharomy
ces cerevisiae）」Proc.Natl.Acad.Sci.USA77pp.2546
-50（1980）。アクチンをコードするmRNAのレベル（デ
ィ・ガルウィッツら（D.Gallwitz et al）「酵母サッカ
ロミセス・セレビシアにおけるアクチン遺伝子:5′及び
３′末端地図の作製、両端からの解析及び推定された調
節配列（The Actin Gene in the YeastSaccharomyces
cerevisiae:5′and3′End Mapping,Flanking and Putat
ive Regulatory Sequences）」Nucl.Ac.Res.9pp.6339-5
0（1981））は、ACTプロモーターは中程度の強さのプロ
モーターであることを示唆する。表１を参照するとよ
い。またヒメルファーブ（Himmelfarb）、supraも参照
するとよい。

本実施例及び以下の実施例の構成において当該ACTプ
ロモーターを使用するために、我々はプロモーターの末
端部分に都合のよい制限酵素部位を配置した。第４図に
示されるように、プラスミドpYA301は、4kbのEcoRI-Bam
HI断片上にACT遺伝子とその付随する発現調節配列を含
む。プラスミドpYA301は、pBR322に挿入されたpYA208
（ガルウィッツとスレス（Gallwitz and Sures）、supr
a）の4kb EcoRI-BamHIのサブクローンである。我々はプ
ラスミドpYA301を唯一のXhoＩ部位で切断しそれをBal31
で処理した。経験上決定されたBal31処理の時間の後
で、我々はそのプラスミドをEcoRIで切断し、その突出
末端はDNAポリメラーゼＩの大（クレニュー（kleno
w））フラグメントを用いて埋められた。最後に、その
処理されたプラスミドは希釈した条件下で再連結され
た。その結果得られたプラスミドのおよそ半分が、ｐΔ
４であると正しく同定され、１個のEcoRI部位を含んで
いた。これらのEcoRI部位は、埋められたEcoRI末端をAC
TプロモーターのBal31末端に連結することによって形成
された。再連結されたプラスミドのATG開始コドン付近
における種々のｐΔ４プロモーター末端の構造は第4B図
に示されている。

単離されたACTプロモーターをMFα1シグナル配列とSM
Cの融合遺伝子に機能的に連結するために、我々はACTプ
ロモーターの３′末端をMFα1/SMC融合遺伝子のアミノ
末端と配偶させた。我々は、オーストラら（Oostra et
al）、supraの文献に記載された手順を使用し、次のよ
うな変異誘発を行うことによって、MFα1分泌リーダー
のATG開始コドンの上流に（すなわち翻訳の読み取り方
向でより前に）１個のEcoRI部位を導入することによっ
てこの目的を果した。

修飾されたオリゴマー もとの配列 我々はその結果得られたプラスミドをp269/20と名付け
た。

我々は、上述の通り単離されACTプロモーターを含ん
だpEX7（第４図）のBamHI-EcoRI断片を（MFα1分泌リー
ダーを有する）プラスミドp269/20のEcoRI-SalＩ断片に
連結し、第５図に示されたように、その断片をpUC8ベク
ターのBamHI及びSalＩ切断点の間に挿入した。我々はそ
の結果得られたプラスミド（p309/1）を、プラスミドp3
09/1のMFα1分泌リーダー領域をプラスミドpS30/25のSM
C遺伝子に連結された分泌リーダー領域で置換すること
によってさらに修飾した。プラスミドpS30/25は第２図
に示されている。その修飾は、プラスミドp309/1をPst
Ｉ及びHindIIIで切断することによって行われた。大き
い方の断片が単離され、pS30/25プラスミドをPstＩとHi
ndIIIで部分消化した結果得られたpS30/25の断片と連結
された。その結果得られたプラスミドp355/1（ACTプロ
モーター／MFα1分泌リーダー/SMC構造DNA配列）は、第
５図に示すように酵母シャトルベクターに移され、その
結果プラスミドp364/1が形成された。本プラスミドで形
質転換された酵母によるSMC分泌の速さは第３図に示さ
れている。

実施例３ CYC1/MFα1/SMCプラスミドの調製 誘導条件下で、イソ−１−シトクロムC（CYC1）の量
は酵母の全細胞蛋白質のおよそ0.2％であり、そのコー
ドするmRNAの量は全ポリ（Ａ）RNAの約0.05％である。
アール・エス・ジトマーとビー・ディ・ハール（R.S.Zi
tomer and B.D.Hall）「酵母シトクロムCメッセンジャ
ーRNA。CYC1遺伝子産物の試験管内翻訳と特異的免疫沈
澱（In Vitro Translation and Specific Immunopreci
pitation of the CYC1 Gene Product）」J.Biol.Chem.2
51 6320-26（1976）。従って、CYC1プロモーターは弱い
プロモーターである。

CYC1プロモーター／MFα1分泌リーダー/SMCをコード
する配列を構築するために、我々は、プラスミドp355/1
由来のSMC遺伝子と正しく融合したMFα1分泌リーダーを
有するEcoRI-HindIII断片を単離した。以上は第５図に
示されている。我々は、プラスミドp446/1を得るために
pEX−２のEcoRIとHindIII部位の間にこの断片を挿入し
た（第５図を参照）。

pEX−２は、ジェー・エフ・アーンストとアール・シ
ー・チャンの文献（J.F.Ernst and R.C.Chan）「アミノ
グリコシド系抗生物質に超感受性のエス・セレビシア変
異株の特徴（Characterization of S．cerevisiae Muta
nts Supersensitive to Aminoglycoside Antibiotic
s）」J.Bacteriol.163pp.8−14（1985）に述べられてい
る。

ベクターp446/1はCYC1プロモーターの調節下、MFα1/
SMC融合遺伝子を発現した。本ベクターによって形質転
換された酵母からのSMC分泌の速さは第３図に示されて
いる。

実施例４ 発現ベクター上のURA3遺伝子及びLEU2遺伝子双方を用い
たMFα1,ACT及びCYC1プロモーターを使用するSMCの分泌
の比較 MFα1分泌リーダーとMFα1，ACT、及びCYC1プロモー
ターを基礎とする三種のSMC発現ベクターの構築は以上
に述べた。これらのベクターのそれぞれは酵母における
分泌のための酵母URA3遺伝子を含んでいた。我々はまた
酵母LEU2遺伝子を用いる選択に基づくベクターを構築し
た。LEU2遺伝子のプラスミドの発現は部分的欠失のため
に低い。ロイシンが含まれない培地上での形質転換体の
生育を与えるためには、LEU2型発現ベクターの比較的高
いコピー数が必要とされる。イー・エルハートとシー・
ピー・ホーレンベルグ（E.Erhart and C.P.Hollenber
g）、「サッカロミセス・セレビシアの２μDNA組換えプ
ラスミド上の欠失したLEU2遺伝子の存在はキュアリング
及び高いコピー数が原因である（The Presence of a De
fective LEU2 Gene on 2μ DNA Recombinant Plasmids
of Saccharomyces cerevisiae is Responsible for Cu
ring and High Copy Number）」J.Bacteriol.、156pp.6
25-35（1983）。組換えDNA実験でURA3遺伝子あるいはLE
U2遺伝子を有する酵母の使用を議論するためには、ディ
・ボツティンら（D.Botstein et al）の文献を参照する
とよい。「不十分な宿主，酵母（SHY）：組換えDNA実験
のための生物学的封じ込めのための真核生物の系（Ster
ile Host Yeast（SHY）:a Eukaryotic System for Biol
ogical Containment for Recombinant DNA Experiment
s）」Gene 8 pp.17-24（1979）。

我々は、URA3プラスミドを用いて使用されたものに似
た手順を使い、選択されたプロモーター／MFα1分泌リ
ーダー/SMC構造配列をプラスミドpJDB207に挿入するこ
とによってLEU2型ベクターを構築した。その結果得られ
たプラスミドの構造は第６図に示されている。プラスミ
ドpJDB207はジェー・ディ・ベッグス（J.D.Beggs）「多
コピー酵母ベクター（Multiple-copy Yeast Vector
s）」、酵母の分子遺伝学（Molecular Genetics in Yea
st）、アルフレッド・ベンゾン・シンポジウム（Alfred
Benzon Symposium）16 383-95（1981）に述べられてい
る。

我々は、プラスミドpEX−２（ジェー・エフ・アーン
ストとアール・シー・チャン（J.F.Ernst and R.C.Cha
n）、supraに述べられている）から誘導された三種のUR
A型ベクターと三種のLEU2型ベクターで酵母種BJ1991を
形質転換した。我々は、組換え酵母種の二種をドイッチ
ェ・サムルング・フォン・ミクロオーガニスメン（Deut
sche Samulung Von Mikroorganismen）（西ドイツ培養
コレクション（West German Culture Collection））に
寄託した。一種、YE439は、ACTプロモーター／MFα1分
泌リーダー/SMC構造配列を有するLEU2型ベクターであ
る。それは1985年10月30日に寄託され、DSM3578に相違
ないと確認された。もうひとつの種、YE466は、CYC1プ
ロモーター／MFα1分泌リーダー/SMC構造配列を有するL
EU2型ベクターである。それは1985年10月30日に寄託さ
れDSM3579に相違ないと確認された。形質転換体は、ト
リプトファン及びロイシン（URA3型ベクターのため
に）、あるいはトリプトファン及びウラシル（LEU2型ベ
クターのために）を含む、エフ・シャーマンら（F.Sher
man et al）、「酵母遺伝学の方法（Methods in Yeast
Genetics）」コールド・スプリング・ハーバー研究所、
ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（198
1）に述べられた「SD」培地中で600nmにおける光学密度
２まで生育された。我々はこれらの培養物を、４％カザ
アミノ酸及びトリプトファンを含むSD培地からなる生産
培地に接種するのに使用した（接種量は生産培地の終容
積の10％だった）。生育の間の適当な時期に培養物の0.
5mlが小型遠心機を用いて沈澱された。我々は、もとの
培養物の容積の1/10の細胞沈澱物を５分間煮沸すること
によってドデシル硫酸ナトリウム（SDS）サンプル緩衝
液に再懸濁した。同緩衝液は、ユー・ケー、ラエムリ
（U.K.Laemmli）「バクテリオファージT4の頭部の会合
途中の構造蛋白質の切断（Cleavage of the Structural
Proteins During the Assembly of the Head of Bacte
riophage T4）」Nature227pp.680-85（1970）に述べら
れている。次に我々は、ラジオイムノアッセイ（ニコル
研究所式診断法（Nichols Institute Diagnostics）、
カリフォルニア州サン・ジュアン・カピストラーノ（Sa
n Juan Capistrano,California）」を使用して、再懸濁
した細胞沈澱物中の及び培養液中のSMCレベルを希釈後
に測定した。

６個の構成系すべてについて、全SMCの10％以下が細
胞に付随していた。我々が培養液中に存在するSMCを精
製し、それを分析したところ、アミノ末端の及びカルボ
キシル末端のアミノ酸はヒトSMCと同一であり、分泌さ
れたSMCの生物学的活性はヒトSMCと同じであることがわ
かった。驚くべきことに、使用された最も弱いプロモー
ター、CYC1が、第３及び７図及び表２に示されたように
最も高いSMCの分泌値を結果的に与えた。最も強いプロ
モーターが最も高い分泌値を与えると予想されたであろ
うから、これは意外だった。予想に反して、CYC1構成系
を有する形質転換体は最も遅く生育しSMC分泌のすでに
言明された至適曲線を示した。このことは、細胞の溶菌
とSMCの分解の存在を示している（第７図参照）。

予想に反した結果の理由を確定するために、我々はこ
こに述べられた形質転換体における生産培地中での３日
後のSMCプラスミドのコピー数と転写レベルを解析し
た。その結果は表２に示されている。我々は分泌系にお
けるコピー数とプロモーターの強さとの間の逆の関係を
発見した。最も弱いプロモーター（CYC1）を持つ分泌系
が最も高いコピー数を有することがわかった。MFα1構
成系は最も低いコピー数を有していた。平均のSMC転写
レベルはURA3及びLEU2構成系双方についてのコピー数に
比例していることがわかった。さらに、LEU2構成系にあ
っては、mRNAレベルは分泌レベルに比例していた。URA3
構成系にあっては、増加したmRNAに付随したSMC分泌レ
ベルの意味のある増加はなかった。理論に拘束されるこ
とを望むものではないが、URA3プラスミド消失の百分率
が高いために、URA3構成系の有するSMC分泌レベルに対
する結果は同一ではないと思われる。

かなりのURA3形質転換体は実際にほとんどあるいは全
くURA3発現プラスミドを有していない。このような非生
産的形質転換体は全体にわたるSMCの分泌にほとんど寄
与しない。考えられるところでは、かなりのURA3形質転
換体はまた高いコピー数と強力なプロモーターの強さを
有している。遅い生育と弱められた生存能力のためこれ
らの形質転換体はSMCの分泌にほとんど寄与しなかった
だろう。この示唆された機構はLEU2ベクターには適用さ
れない。なぜなら、ロイシンのない培地で生育させた形
質転換体におけるLEU2型ベクターの最小のコピー数は約
35であるからでる（エルハートとホレンベルグ（Erhart
and Hollenberg）、supra）。さらに、使用された生産
培地はロイシンを含むため（ウラシルは含まない）、こ
の培地では増加したコピー数はLEU2ベクター−形質転換
体の生育に要求されない。従って、LEU2で形質転換され
た酵母種はコピー数とmRNA含量に関してはURA3ベクター
より均質であると思われる。

URA3の転写にあっては、たとえ分泌レベルがかなり一
定のままであったとしても、mRNAレベルはプロモーター
の強さが弱くなるにつれて増加した。この傾向はURA3構
成系についての比較的低いコピー数を反映すると思われ
る。LEU2の転写については、mRNAの最小のレベルとSMC
の分泌を得るために少なくとも40のコピー数が要求され
ると思われる。

表２はSMCのアクチン転写に対する実際の割合を与え
るものではなく、数字は比較の目的のためだけのもので
ある。

６個のプラスミド構成系全てについての形質転換頻度
も表２に示されている。すべてのURA3型ベクターについ
てほぼ同じ形質転換頻度が得られた。しかしながら、LE
U2型ベクターについては劇的な差異が見られた。MFα1
プロモーター構成系は酵母中では全く形質転換されるこ
とができなかった。ACTプロモーター構成系については
比較的高い頻度が観察された。また対照（pJDB207）及
びACT構成系と比較すると、より低い形質転換の頻度がC
YC1構成系の特徴だった。我々は実際MFα1構成系を有す
る１個のまれなLEU2型ベクターを得た。しかしながらこ
の形質転換体は、表２で括弧で示されたように、少量の
SMCの合成を指示する再配列されたプラスミドを含んで
いた。この結果は、MFα1プロモーターはLEU2の欠陥に
よる効果を圧倒するのに十分高いコピー数を可能にしな
いことを示唆する。

従って、分泌の速さ、細胞の生存の能力、プロモータ
ーの強さ及びベクターのコピー数は相互関係を有すると
思われる。

実施例５ TNFの分泌 我々は第８図に示されたようにMFα1/SMC融合遺伝子
について上に述べた通りの手順を用い、MFα1分泌リー
ダーとヒト腫瘍壊死因子（TNF）をコードする遺伝子と
の融合遺伝子を構築した。さらに我々はTNFの分泌に対
するプロモーター置換の効果を解析した。

我々はベクターpTNF11（第８図参照）を構築するため
に次の３個の断片を連結した。（１）プロモーターとSt
uI部位で終るMFα1の分泌リーダー（すでに述べられたs
upra）を有する1.2kbのEcoRI-StuＩ断片、（２）酵母２
μの複製開始点と酵母における選択のためのURA3遺伝子
（すでに述べられたsupra）を有するpEX−２の9kbのEco
RI-HindIII断片、（３）TNF遺伝子を有する平滑末端に
されたHindIII断片（0.9kb）。３個目の断片を単離する
手順はディ・ペニカら（D.Pennica et al）「ヒト腫瘍
懐死因子：前駆体の構造、発現及び細胞障害性因子との
相同（Human Tumor Necrosis Factor:Precursor Struct
ure,Expression and Homology to Lymphotoxin）」Natu
re 312pp.724-29（1984）に開示されている。我々は、T
NF遺伝子の５′末端近傍に位置するAvaＩ部位からの延
長によってTNF遺伝子の５′末端を再生成するために合
成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、その平滑末端
にされたHindIII断片を生成させた（バリンがTNFの最初
のアミノ酸である）。MFα１とTNF遺伝子の連結部は次
の配列を有していた。

MFα1 TNF MFα1プロモーターではなく、ACTプロモーターを基礎
とするTNF分泌ベクターの構築も第８図に示されてい
る。我々はpACT-TNF-EXを構築するために次の３個の断
片を連結した。（１）TNF遺伝子に融合したMFα1分泌リ
ーダーの大部分（すでに述べられたsupra）を有するpTN
F11由来の1.2kb PstI-HindIII断片、（２）ACTプロモー
ターとMFα1リーダーの一部（すでに述べられたsupra）
を有する、第５図に示されたような、p355/1由来の0.5k
b BamHI-PstＩ断片、（３）pEX−２（すでに述べられた
supra）の9kb BamHI-HindIII断片。

我々はpTNF11あるいはpACT-TNF-EXを用いて酵母種BJ1
991を形質転換しUra⁺の原栄養株を選択した。形質転換
体はウラシルを欠くSD液体培地中で選択的に生育され
た。エフ・シャーマンら（F.Sherman et al）、supraに
おいて開示されたYPD培地を含む振とうフラスコは最小
量の培養物（終容積の10％）で接種が行われ、回転振と
う機上で30℃で保持された。培養途中の適当な時期に、
我々は小型遠心機を使用してその酵母培養物のサンプル
1mlを１分間遠心した。次に我々は細胞沈澱物をザイモ
ラーゼ（zymolase）で処理したスフェロプラストを生成
させた。我々はそれからそのスフェロプラストをもとの
培養物容積の20％の１％トライトンＸ−100を使用して
溶解し、次に短い遠心分離の処置によって細胞残滓の除
去を行った。

我々はTNFを含むサンプルを12.5％のSDSアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動し、常法によって蛋白質をニトロセ
ルロースに移した。我々は蛋白質のブロットをヒトTNF
に対するウサギ抗体で標識し、ペルオキシダーゼと共役
されたブタ抗ウサギ抗体を使用してTNF/抗TNF複合体を
含むブロットの領域を目に見えるようにした。培養液中
及び細胞抽出物中の最大のTNF発現の結果は表３に示さ
れている。結果は、MFα1プロモーターがACTプロモータ
ーによって置換された時にTNFの分泌の意味のある改善
が得られたことを示した。生産された全TNFのわずか10-
20％が細胞に付随していた。

実施例６ TPAの分泌 ヒト，ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチベータ
（TPA）をコードする遺伝子はTPAの最初のアミノ酸に相
当する位置に１個の都合のよいBglII部位を有する。デ
ィ・ペニカら（D.Pennica et al）、「大腸菌における
ヒト，ティッシュ型プラスミノーゲン・アクチベータcD
NAのクローン化と発現（Cloning and Expression of Hu
man Tissuetype Plasminogen Activator cDNA in E．co
li）」Nature 301 pp.214-21（1983）。MFα1分泌リー
ダーとの正しい融合遺伝子を与えるために、我々は、リ
ジン−アルギニン連結部に相当するMFα1の位置に都合
のよいBglII部位を導入した。以下の構成系におけるMF
α1/TPA融合点の構造は次のようなものである。

MFα1 TPA 我々は第９図に示されたように、MFα1プロモーター
と分泌リーダーを有するBglII断片を先に構築したベク
ターpPAY4の唯一のBglII部位に挿入した。この方法で、
PHO5のプロモーターと分泌リーダーがMFα1プロモータ
ーと分泌リーダーによって置き換えられた。我々は第９
図に示されたように、PHO5とMFα1プロモーターをACTプ
ロモーターによって置換することにより、その結果得ら
れた発現ベクター、pMF-TPAをさらに修飾し、発現ベク
ターpACT-MF-TPAを得た。双方のTPA構成系に存在するPH
O5プロモーターは通常の（高リン酸）生産培地中で抑制
される。よって、以下に述べられた発現の結果はMFα1
プロモーターの活性によるものである。なぜなら、試験
は通常の（高リン酸）培地中で行われたからである。

我々は上に述べられたように、BJ1991種の酵母細胞を
形質転換するために各プラスミド、pACT-MF-TPA及びpMF
-TPAを使用し、Leu⁺の原栄養株を選択した。我々は形質
転換体をSD培地中で選択的に生育させた。我々はYPD培
地を含む振とうフラスコにそのSD培養物を接種し（終容
積の10％）、30℃で培養した。培養途中の適当な時期
に、我々は実施例４においてすでに述べられたように細
胞抽出物を調製した。我々は、エー・グラネリーピペル
ノとイー・ライヒ（A.Granelli-Piperno and E.Reich）
「生物学的液体中のプロテアーゼ及びプロテアーゼ−阻
害剤複合体の研究（A Study of Proteases and Proteas
e-Inhibitor Complexes in Biological Fluids）」J.Ex
p.Med.148 pp.223-34（1978）において述べられたよう
に、フィブリノーゲン−プラスミノーゲン寒天平板上で
のハロー形成によって細胞分画中のTPA活性を測定し
た。表４に示された結果は、ACTプロモーターによるMF
α1プロモーターの置換は、アルファ配偶因子融合遺伝
子を使用する酵母による異種起原蛋白質の分泌を得るの
に有利であることを示した。

表４において示されたように、生産されたTPAの大部
分が細胞に付随し、生産された全TPAのわずか５％だけ
が培地中に出現した。しかしながら、以下の証拠は酵母
のTPAが分泌経路に入っていたことを示唆した。

（１） 発現されたTPAは生物学的に活性があり、この
ことは正しい折りたたみが行われていることを示してい
た。分泌シグナル配列を用いないで酵母中でTPAを発現
させる試みは不活性なTPAを生産した。また、 （２） 細胞に付随したTPAは配糖化されていた。少な
くとも小胞体のルーメンへの分泌は配糖化が起るために
は必要である。

熟練した経験者にとっては、本発明の精神あるいは範
囲から外れることなく本発明において種々の異なる表現
形式が可能で、また我々の基本的な構成は本発明の過程
及び構成物を利用する他の実施態様を提供するために変
更され得ることは明らかである。従って、本発明の範囲
は実施例として述べられた特定の実施態様に基づいてで
はなく、この文書に添付された請求の範囲に基づいて定
められなければならないことが正しく認識されるだろ
う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） ） (56)参考文献 特開 昭59−132892（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，77〔1980〕Ｐ．2546 −2550 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，251 〔1976〕Ｐ．6320−6326 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，81〔1984〕Ｐ．4642 −4646 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，81〔1984〕Ｐ．5330 −5334

Claims (22)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ） ACTおよびCYC1プロモーターより
   なる群から選択される酵母プロモーター；および、 （ｂ） 前記プロモーターに機能的に連結された異種起
   源酵母分泌シグナル配列からなる、多コピー発現ベクタ
   ーに組み込まれるDNA配列。
2. 【請求項２】前記分泌シグナル配列がMFα１分泌シグナ
   ル配列である請求の範囲第１項に記載のDNA配列。
3. 【請求項３】前記分泌シグナル配列に機能的に連結され
   た所望の蛋白質をコードするDNA配列をさらに含む請求
   の範囲第１項または第２項に記載のDNA配列。
4. 【請求項４】前記所望の蛋白質が微生物あるいは細胞に
   よって分泌されうる請求の範囲第３項に記載のDNA配
   列。
5. 【請求項５】前記所望の蛋白質が血清蛋白質、鎮痛性ポ
   リペプチド、β−エンドルフィン、ソマトスタチン、SM
   C、インシュリン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモ
   ン、黄体形成ホルモン、ACTH、膵臓ポリペプチド蛋白質
   前駆体、TPA、TNF、プレプロインシュリン、プロインシ
   ュリン、インシュリンのＡ鎖およびインシュリンのＢ鎖
   よりなる群から選択される請求の範囲第３項または第４
   項に記載のDNA配列。
6. 【請求項６】（ａ） ACTおよびCYC1プロモーターより
   なる群から選択される酵母プロモーター；および、 （ｂ） 前記プロモーターに機能的に連結された異種起
   源酵母分泌シグナル配列よりなるDNA配列からなる多コ
   ピー発現ベクター。
7. 【請求項７】前記分泌シグナル配列がMFα１分泌シグナ
   ル配列である請求の範囲第６項に記載の多コピー発現ベ
   クター。
8. 【請求項８】前記分泌シグナル配列に機能的に連結され
   た所望の蛋白質をコードするDNA配列をさらに含む請求
   の範囲第６項または第７項に記載の多コピー発現ベクタ
   ー。
9. 【請求項９】前記所望の蛋白質が微生物あるいは細胞に
   よって分泌されうる請求の範囲第８項に記載の多コピー
   発現ベクター。
10. 【請求項１０】前記所望の蛋白質が血清蛋白質、鎮痛性
    ポリペプチド、β−エンドルフィン、ソマトスタチン、
    SMC、インシュリン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホル
    モン、黄体形成ホルモン、ACTH、膵臓ポリペプチド蛋白
    質前駆体、TPA、TNF、プレプロインシュリン、プロイン
    シュリン、インシュリンのＡ鎖およびインシュリンのＢ
    鎖よりなる群から選択される請求の範囲第８項または第
    ９項に記載の多コピー発現ベクター。
11. 【請求項１１】前記多コピー発現ベクターがプラスミド
    および多コピーファージよりなる群から選択される請求
    の範囲第６項または第７項に記載の多コピー発現ベクタ
    ー。
12. 【請求項１２】（ａ） ACTおよびCYC1プロモーターよ
    りなる群から選択される酵母プロモーター；および、 （ｂ） 前記プロモーターに機能的に連結された異種起
    源酵母分泌シグナル配列よりなるDNA配列からなる多コ
    ピー発現ベクターにより形質転換された酵母宿主。
13. 【請求項１３】前記分泌シグナル配列がMFα１分泌シグ
    ナル配列である請求の範囲第12項に記載の酵母宿主。
14. 【請求項１４】前記DNA配列が前記分泌シグナル配列に
    機能的に連結された所望の蛋白質をコードするDNA配列
    をさらに含む請求の範囲第12項または第13項に記載の酵
    母宿主。
15. 【請求項１５】前記所望の蛋白質が微生物あるいは細胞
    によって分泌されうる請求の範囲第14項に記載の酵母宿
    主。
16. 【請求項１６】前記所望の蛋白質が血清蛋白質、鎮痛性
    ポリペプチド、β−エンドルフィン、ソマトスタチン、
    SMC、インシュリン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホル
    モン、黄体形成ホルモン、ACTH、膵臓ポリペプチド蛋白
    質前駆体、TPA、TNF、プレプロインシュリン、プロイン
    シュリン、インシュリンのＡ鎖およびインシュリンのＢ
    鎖よりなる群から選択される請求の範囲第14項または第
    15項に記載の酵母宿主。
17. 【請求項１７】前記多コピー発現ベクターがプラスミド
    および多コピーファージよりなる群から選択される請求
    の範囲第12項乃至第16項のいずれかに記載の酵母宿主。
18. 【請求項１８】前記多コピー発現ベクターがARS型プラ
    スミド、２μ型プラスミド、Co1E1型プラスミド、pBR32
    2、RP4プラスミド、M13ファージおよびラムダファージ
    よりなる群から選択される請求の範囲第12項乃至第17項
    のいずれかに記載の酵母宿主。
19. 【請求項１９】前記プロモーターが前記宿主中の前記多
    コピー発現ベクターのコピー数を実質的に減らさない請
    求の範囲第12項乃至第18項のいずれかに記載の酵母宿
    主。
20. 【請求項２０】前記プロモーターが前記宿主内の全mRNA
    の0.3％未満を産生させる請求の範囲第12項乃至第18項
    のいずれかに記載の酵母宿主。
21. 【請求項２１】前記プロモーターが前記宿主内の全mRNA
    を最高で0.15％産生させる請求の範囲第20項に記載の酵
    母宿主。
22. 【請求項２２】前記宿主がS.cerevisiaeである請求の範
    囲第12項乃至第21項のいずれかに記載の酵母宿主。