JP2024521989A - レンチウイルスベクターおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、レンチウイルスベクターであって、レンチウイルスベクターが、ポリヌクレオチドを含み、上記ポリヌクレオチドが、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターと、ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）とを含む転写ユニットを含むことを特徴とするレンチウイルスベクターを提供する。上記レンチウイルスベクターの組成物および使用、特にダイアモンド・ブラックファン貧血の治療のための使用も本明細書に提供される。

Description

本発明は、細胞内のＲＰＳ１９発現を救済するための組成物および方法を提供する。特に、本明細書では、ダイアモンド・ブラックファン貧血の遺伝子療法のための方法および組成物が提供される。

ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＤＢＡ）は稀な疾患であり、様々な国にわたる患者の発生率および分布を示す推定有病率は出生１００万人当たり５～７例である。ＤＢＡの特徴は大球性貧血であり、大球性貧血は、典型的には１年目に現れ、好中球減少症および血小板減少症に、場合によっては骨髄異形成症候群または急性骨髄性白血病に進展することが多い（Ｒｕｇｇｅｒｏ＆Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，２０１４）。したがって、ＤＢＡは赤芽球癆に典型的に関連するが、全身性の造血障害により、ＤＢＡは骨髄不全（ＢＭＦ）症候群と定義される。

２０個のＤＢＡ遺伝子に加えて３つの「ＤＢＡ様」遺伝子の変異がＤＢＡ患者の７０～８０％を占める。リボソームタンパク質Ｓ１９をコードする遺伝子であるＲＰＳ１９は、ＤＢＡでは最も一般的に影響を受ける（患者の２５％）（Ｄａ Ｃｏｓｔａ，Ｎａｒｌａ，＆Ｍｏｈａｎｄａｓ，２０１８）。これらの患者は、この遺伝子について典型的にハプロ不全であり（一方の遺伝子は影響を受けず、他方は不活性化される）、機能的リボソームの産生の実質的な減少がもたらされる。

コルチコステロイドは、ＤＢＡ患者の第１の治療選択肢を構成する。患者の約８０％がコルチコステロイドに最初に応答し、貧血が改善するかまたは完全に寛解する。しかし、長期のコルチコステロイド治療は多くの患者では限られた有効性を示しており、そのため、約４０％のみが長期間コルチコステロイドを投与されたままであり、全体として、ＤＢＡ患者の少なくとも４０％が輸血依存性であることが暗示されている。今日まで、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）は、ＤＢＡ患者にとって唯一利用可能な治癒的処置である。共通認識は、兄弟ドナー、または完全一致（１０／１０）の非血縁ドナーを使用することであるが、好適なドナーを利用可能であるのは患者の少数のみである。さらに、１０歳以降に代替ドナーを用いて移植されたＤＢＡ患者の臨床転帰は極めて不良である。さらに、ファンコニ貧血（ＦＡ）患者で既に実証されているように、ＤＢＡは、癌になりやすい疾患として目下特定されており、これらの患者における癌発生率は、骨髄破壊的移植前治療および移植後にさらに増加する可能性がある。

造血幹細胞における遺伝子変異を修正することを目的とする遺伝子療法は、この遺伝的障害に対する潜在的な治療戦略である。ガンマレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを介した遺伝子療法は、ウイルスが細胞に侵入し、遺伝物質を細胞に送達する天然の能力のために魅力的である。特に、レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、比較的安全であると考えられ、広範囲の***しているおよび***していない哺乳動物細胞型のゲノムＤＮＡに安定に組み込むことができるため、遺伝子送達に適したビヒクルである。ゲノムに安定に組み込まれる能力により、ＬＶは、遺伝子療法、特にＤＢＡなどの遺伝性障害を修正および治療するための独特かつ理想的なツールになる。

したがって、ＤＢＡのための効果的な治療レジメンに対する重大な必要性が依然として存在し、本発明は、ＲＰＳ１９タンパク質の発現を回復することができるだけでなく、リボソーム生合成プロセスの変化を修正することもできるＬＶを提供する。

生成された治療用ベクターの概略図：ａ）ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびｂ）ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊。５’ ＬＴＲ：５’長末端反復；ＰＢＳ：プライマー結合部位；Ψ：ｐｓｉパッケージングシグナル；ΔＧＡＧ：切断型Ｇａｇ配列；ＳＡ：スプライシングアクセプター；ＲＲＥ：Ｒｅｖ応答エレメント（Ｒｅｖ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＲＲＥ）；ｃＰＰＴ：ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ＤＮＡ ｆｌａｐ ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）；ＰＧＫ：ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター；ＥＦ１α（ｓ）：その短縮バージョンの伸長因子１α（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １α ｉｎ ｉｔｓ ｓｈｏｒｔ ｖｅｒｓｉｏｎ）；ＣｏＲＰＳ１９：ＲＰＳ１９タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列；Ｗｐｒｅ＊：変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｍｕｔａｔｅｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）；３’ ＬＴＲ：３’長末端反復；ポリＡ：ポリアデニル化シグナル配列。 ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＤＢＡ）患者の骨髄内のＣＤ３４^＋細胞の数の決定：ａ）ＤＢＡ患者（ＤＢＡ）、対照としてのファンコニ貧血患者（ＦＡ）および健常ドナー（ＨＤ）から抽出した全骨髄細胞内のＣＤ３４^＋細胞の割合。ｂ）骨髄の細胞充実性。ｃ）骨髄内のＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－細胞の割合。マン・ホイットニー検定を使用して有意度を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１）。グラフは、９０：１０パーセンタイルとともに、中央値および四分位範囲を示す。 ＤＢＡ患者および健常ドナーの骨髄内の造血前駆細胞の様々な亜集団の割合の定量。ａ）ＨＳＣ（造血幹細胞：Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ９０^＋ＣＤ４５ＲＡ^－）。ｂ）ＭＰＰ（多能性前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－Ｔｈｙ－１^－ＣＤ４５ＲＡ^－Ｆｌｔ３^＋ＣＤ７^－ＣＤ１０^－）。ｃ）ＭＬＰ（多能性リンパ球性前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－Ｔｈｙ－１^ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ^－Ｆｌｔ３^＋ＣＤ７^－／＋ＣＤ１０^－）。ｄ）ＣＭＰ（骨髄系共通前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋Ｔｈｙ－１^－ＣＤ４５ＲＡ^－，Ｆｌｔ３^＋ＣＤ７^－ＣＤ１０^－）。ｅ）ＭＥＰ（巨核球前駆細胞および赤血球前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋Ｔｈｙ^－１^－ＣＤ４５ＲＡ^－Ｆｌｔ３^－ＣＤ７^－ＣＤ１０^－）およびｆ）ＧＭＰ（顆粒球系－単球系前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋Ｔｈｙ－１^－ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｆｌｔ３^＋ＣＤ７^－ＣＤ１０^－）。マン・ホイットニー検定を使用して有意度を決定した。グラフは、９０：１０パーセンタイルとともに、中央値および四分位範囲を示す。ＨＤ：健常ドナー；ＤＢＡ：ＤＢＡ患者。 骨髄内の造血前駆細胞コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の数の決定：ａ）各１０^５個の播種した単核細胞（ＭＮＣ）に関する顆粒球－マクロファージ前駆細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ－ＧＭ）の数。ｂ）各１０^５個の播種したＭＮＣに関するバースト形成単位－赤血球前駆細胞（ＢＦＵ－Ｅ）の数。マン・ホイットニー検定を使用して有意度を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１）。グラフは、９０：１０パーセンタイルとともに、中央値および四分位範囲を示す。ＢＭ：骨髄；ＨＤ：健常ドナー；ＤＢＡ：ＤＢＡ患者；ＦＡ：ファンコニ貧血患者。 免疫不全ＮＳＧマウスにおける健常ドナーおよびＤＢＡ患者由来のＣＤ３４^＋細胞の再構成能の決定：ａ）３つの異なる時点（移植後（ｄｐｔ）３０、６０および９０日）でマウス骨髄に移植されたヒトＣＤ４５^＋（ｈＣＤ４５^＋）細胞の割合。ｂ）様々な系統への分化。ＣＤ３３^＋：骨髄系、ＣＤ１９^＋：リンパ球性、およびＣＤ３４^＋：造血幹細胞（ＨＳＣ）。マン・ホイットニー検定によって有意度を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１）。グラフは、９０：１０パーセンタイルとともに、中央値および四分位範囲を示す。ＨＤ：健常ドナー、ＤＢＡ：ＤＢＡ患者。 ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターによって後に修正した、疾患モデル細胞株におけるＲＰＳ１９遺伝子の内因性発現の試験（ＲＰＳ１９遺伝子では、ベクターＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９およびＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｅ ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ｓｈＲＰＳ１９によってＫ５６２に干渉した）：ａ）左パネル：ベクターＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９（ＳｈＲＰＳ１９－ＬＶ）によるＲＰＳ１９の内因性発現の減少；右パネル：治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９－ＬＶ）およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＥＦ１α．ＣｏＲＰＳ１９－ＬＶ）に存在するＣｏＲＰＳ１９配列のその後の検出。ｂ）左パネル：ベクターＬＶ－ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｅ ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ｓｈＲＰＳ１９（ＳｈＲＰＳ１９－ＬＶ）によるＲＰＳ１９の内因性発現の減少；右パネル：治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９－ＬＶ）およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９－ＬＶ）に存在するＣｏＲＰＳ１９配列のその後の検出。検定によって有意度を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１）。グラフは、平均および標準偏差を示す。左パネルの破線は、干渉されていないＫ５６２対照細胞（モック）内のＲＰＳ１９基礎内因性発現を示す。 ＲＰＳ１９遺伝子について干渉し、ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターによって後に修正したＫ５６２細胞株内のリボソーム生合成の分析：ａ）左パネル：干渉ベクターＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９によって干渉し、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９－ＬＶ）またはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＥＦ１α．ＣｏＲＰＳ１９－ＬＶ）によって後に形質導入した細胞内のノーザンブロットによるプレ２１Ｓ ／ ２１Ｃ ｒＲＮＡ（アスタリスク、２１Ｓ／２１Ｓ－Ｃ）のレベルの）の検出；右パネル：干渉ベクターＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９によって干渉し、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊またはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって後に形質導入した細胞内のノーザンブロットによって検出されたプレ２１Ｓ ｒＲＮＡと２１Ｃ ｒＲＮＡとの比（プレｒＲＮＡ ２１Ｓ／２１Ｓ－Ｃ）の定量を示すグラフ。ｂ）左パネル：干渉ベクターＬＶ－ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｅ ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ｓｈＲＰＳ１９によって干渉し、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ ＊によって後に形質導入した細胞内のノーザンブロットによる２１ＳプレｒＲＮＡおよび２１ＣプレｒＲＮＡレベル（アスタリスク）の検出；右パネル：干渉ベクターＬＶ－ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｅ ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ｓｈＲＰＳ１９によって干渉し、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊またはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって後に形質導入した細胞内のノーザンブロットによって検出されたプレ２１Ｓ ｒＲＮＡとプレ２１Ｃ ｒＲＮＡとの比（プレｒＲＮＡ ２１Ｓ／２１Ｓ－Ｃ）の定量を示すグラフ。ＡＮＯＶＡ検定、および群分析によるその群によって有意度を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１）。グラフは、３つの実験の平均および標準偏差を示す。１．モック：形質導入していない細胞；２．ＳＣＲＢ：ＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈスクランブルによって形質導入した細胞。１．モックおよび２．ＳＣＲＢを陰性対照として含める。ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクターによって形質導入した条件；ＥＦ１α．ＣｏＲＰＳ１９：ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクターによって形質導入した条件；Ｓｈ＋ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９：ａ）ＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９およびｂ）ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｅ ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ｓｈＲＰＳ１９における干渉ベクター、およびＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクターによって同時形質導入した条件、ならびにＳｈ＋ＥＦ１α．ＣｏＲＰＳ１９：ａ）ＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９およびｂ）ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｅ ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ｓｈＲＰＳ１９における干渉ベクター、およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ ＬＶによって同時形質導入した条件。 ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターもしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターによって、またはＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクターによって形質導入した、ＤＢＡ患者のＣＤ３４^＋細胞によって生成された造血前駆細胞コロニーの数の決定：ａ）播種した単核（ＭＮＣ）細胞１０^５個当たりのＣＦＵ－ＧＭコロニーの数。ｂ）播種したＭＮＣ細胞１０^５個当たりのＢＦＵ－Ｅコロニーの数。ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊ベクター（ＰＧＫ ＥＧＦＰ）によって形質導入した細胞を用いて行った実験の数はＮ＝３であり、ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター（ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９）によって形質導入した細胞を用いて行った実験の数はＮ＝５であり、ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター（ＥＦ１α．ＣｏＲＰＳ１９）によって形質導入した細胞を用いて行った実験の数はＮ＝５であった。 ＤＢＡ患者のＣＤ３４^＋細胞におけるＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターによる効率的な修正およびゼロ毒性：ａ）ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９）治療用ベクターもしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＥＦ１α．ＣｏＲＰＳ１９）治療用ベクターまたはＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター（ＰＧＫ ＥＧＦＰ）による、ＤＢＡ患者の造血前駆細胞における形質導入の割合。ｂ）液体培養物中で維持された細胞に組み込まれたベクターコピーの数（ＶＣＮ）、ならびにｃ）ＣＦＣに組み込まれたベクターコピーの数（ＶＣＮ）。マン・ホイットニー検定によって有意度を決定した。条件に対して行った実験の数：ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊ベクター：Ｎ＝４、ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．ＷｐｒｅベクターＮ＝５、およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊：Ｎ＝３。グラフは、対応する標準偏差とともに、５例の異なる患者由来のＣＤ３４^＋細胞の形質導入に対応する平均値を表す。 ＤＢＡ患者の造血前駆細胞の液体培養物におけるエクスビボ拡大増殖に対する治療用ベクター形質導入の効果の分析。ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９）治療用ベクターまたはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＥＦ１α．ＣｏＲＰＳ１９）治療用ベクターによる形質導入が成功した、ＤＢＡ患者由来の骨髄造血前駆細胞の数。ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊ベクター（ＰＧＫ ＥＧＦＰ）を対照として使用した。形質導入前の０日目（Ｄ０）、および形質導入後の２つの異なる時点（Ｄ７およびＤ１４、７および１４日後）に、細胞数を測定した。 治療用ベクターによって修正した、ＤＢＡ患者由来の細胞の赤血球分化過程の分析：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９）治療用ベクターもしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（ＥＦ１α．ＣｏＲＰＳ１９）治療用ベクターまたはＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター（ＰＧＫ．ＥＧＦＰ）によって形質導入したＢＭ ＣＤ３４^＋ＤＢＡ細胞におけるＣＤ７１^＋／ＣＤ２３５ａ^＋細胞集団およびＣＤ７１^－／ＣＤ２３５ａ^＋（ＣＤ７１／ＣＤ２３５ａ）細胞集団の割合の定量。この図は、ａ）患者３例（ＤＢ－３１、ＤＢ－２５、およびＤＢ－３６）の個々の分析、およびｂ）バルク分析を示す。マン・ホイットニー検定によって有意度を決定した。グラフは、平均および標準偏差を示す。 ＮＳＧ免疫不全マウスに移植された、ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターもしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクターによって形質導入したＤＢＡ患者細胞の再構成能の分析：細胞移植後の３つの異なる時点（３０日間（Ｄ３０）、６０日間（Ｄ６０）および９０日間（Ｄ９０））に治療用ベクターによって修正した、ＤＢＡ患者由来のＢＭ ＣＤ３４＋細胞の生着レベル（ｈＣＤ４５＋細胞の割合）、ならびに骨髄系細胞（ＣＤ３３^＋）、リンパ球性細胞（ＣＤ１９^＋）およびＨＳＣ（ＣＤ３４^＋）における分化の多系列能の決定。マン・ホイットニー検定を使用して有意度を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１；ｎｓ：有意でない）。グラフは、平均および標準偏差を示す。ＭＯＣＫ ＥＧＦＰ：ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター；ＰＧＫ ＣｏＲＰＳ１９：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター；ＥＦ．ＣｏＲＰＳ１９，ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター。 治療用ベクターまたはＥＧＦＰベクター対照によって形質導入し、ＮＳＧレシピエントマウスに生着させたＤＢＡ患者細胞における移植後９０日目のベクターコピー数（ＶＣＮ）の定量。マン・ホイットニー検定を使用して統計的有意性を決定した（Ｐ値＜０．０５）。 ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターもしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクターによって形質導入した健常ドナー臍帯ＣＤ３４^＋細胞から生成されたコロニーの数の定量：ａ）播種した単核細胞（ＭＮＣ）１０^５個当たりの顆粒球－マクロファージ前駆細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ－ＧＭ）の数。ｂ）播種したＭＮＣ１０^５個当たりのＢＦＵ－Ｅの数。マン・ホイットニー検定を使用して有意度を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１）。グラフは、５つの実験の平均および標準偏差を示す。ＰＧＫ．ＥＧＦＰ：ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター；ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター；ＥＦ１α．ＣｏＲＰＳ１９：ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター。 ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターもしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクターによって形質導入した健常ドナーＣＤ３４^＋細胞のコロニーおよび液体培養物におけるＶＣＮ／細胞、形質導入の割合、およびＣｏＲＰＳ１９導入遺伝子の発現レベルの決定：ａ）ＣＤ３４^＋細胞におけるコロニー内のベクターコピー数（ＶＣＮ）／細胞、および形質導入の割合の決定。ｂ）液体培養物（ＬＣ）中のＶＣＮ／細胞の決定。ｃ）ＶＣＮ／細胞に対して正規化したＣｏＲＰＳ１９の発現。マン・ホイットニー検定を使用して統計的有意性を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１０５）。パネルａ）のグラフは５つの実験の平均および標準偏差を示し、パネルｂ）のグラフは４つの実験の平均および標準偏差を示し、パネルｃ）のグラフは３つの実験の平均および標準偏差を示す。ＰＧＫ ＥＧＦＰ：ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター；ＰＧＫ ＣｏＲＰＳ１９：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター；ＥＦ１α ＣｏＲＰＳ１９：ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター。 ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターおよびＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクターによって形質導入した健常ドナー臍帯ＣＤ３４^＋細胞の増殖曲線。マン・ホイットニー検定によって有意度を決定したＰ値＜０．０５）。グラフは、５つの実験の平均および標準偏差を示す（Ｎ＝５）。Ｄ、日数；ＰＧＫ ＥＧＦＰ：ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター；ＰＧＫ ＣｏＲＰＳ１９：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター；ＥＦ ＣｏＲＰＳ１９：ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター。 ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターもしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクターによって形質導入した健常ドナーＣＤ３４^＋細胞の再増殖および分化能の分析：ａ）一次および二次レシピエントにおけるｈＣＤ４５^＋細胞の割合を定量することによって、再増殖能を決定した。ｂ）一次および二次レシピエントにおける骨髄系（ＣＤ３３^＋）細胞、リンパ球性（ＣＤ１９^＋）細胞およびＨＳＣ（ＣＤ３４^＋）細胞の分布。マン・ホイットニー検定を使用して統計的有意性を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１０５）。グラフは、健常ドナーの臍帯血由来のＣＤ３４^＋を形質導入し、ＮＳＧマウスの造血をインビボで再増殖させた後に行った２つの安全性実験の平均と平均値の標準誤差とを示す。Ｄ、日数；ＰＧＫ ＥＧＦＰ：ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター；ＰＧＫ ＣｏＲＰＳ１９：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター；ＥＦ ＣｏＲＰＳ１９：ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター。 ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターもしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクターによって形質導入し、一次レシピエントとしてのＮＳＧマウスに移植した健常ドナーＣＤ３４＋細胞におけるＶＣＮ定量。マン・ホイットニー検定を使用して統計的有意性を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１）。グラフは、臍帯血由来の健常ドナーＣＤ３４^＋を形質導入し、ＮＳＧマウスに移植した後の治療用ベクターのインビボでの安全性および毒性作用を分析するために行った２つの異なる実験の平均と平均値の標準誤差とを示す。ＰＧＫ ＥＧＦＰ：ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター；ＰＧＫ ＣｏＲＰＳ１９：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター；ＥＦ ＣｏＲＰＳ１９：ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター。 ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターおよびＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクターによって形質導入した健常ドナーＣＤ３４^＋細胞を移植したＮＳＧマウスの体重の決定。マン・ホイットニー検定を使用して統計的有意性を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１０５）。グラフは、臍帯血由来の健常ドナーＣＤ３４^＋を形質導入し、ＮＳＧマウスに移植した後の治療用ベクターのインビボでの安全性および毒性作用を分析するために行った２つの異なる実験の平均と平均値の標準誤差とを示す。Ｄ、日数；ＰＧＫ ＥＧＦＰ：ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター；ＰＧＫ ＣｏＲＰＳ１９：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター；ＥＦ ＣｏＲＰＳ１９：ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター。 ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターもしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターまたはＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクターによって形質導入した健常ドナーＣＤ３４^＋細胞を移植したＮＳＧマウスにおける血液学的パラメータの決定：ａ）赤血球、ｂ）白血球、ｃ）血小板およびｄ）好中球。マン・ホイットニー検定を使用して統計的有意性を決定した（Ｐ値；＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００１；＊＊＊＊≦０．０００１０５）。グラフは、臍帯血由来の健常ドナーＣＤ３４^＋を形質導入し、ＮＳＧマウスに移植した後の治療用ベクターのインビボでの安全性および毒性作用を分析するために行った２つの異なる実験の平均と平均値の標準誤差とを示す。Ｄ、日数；ＰＧＫ ＥＧＦＰ：ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊対照ベクター；ＰＧＫ ＣｏＲＰＳ１９：ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター；ＥＦ ＣｏＲＰＳ１９：ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ベクター。

一般的な定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに異なる指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。さらに、別段の指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の要素のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、常用的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明に包含されることが意図されている。

用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、本明細書では、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、およそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、約（ａｒｏｕｎｄ）、または、の範囲内（ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ）を意味するために使用される。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用される場合、記載された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲が修飾される。一般に、用語「約」は、本明細書では、記載された値の上および下の数値を１０％上または下（さらに高いまたはさらに低い）の分散によって修飾するために使用される。

本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素間の接続的用語「および／または」は、個々の選択肢および組み合わせた選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「および／または」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素を伴わない第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素を伴わない第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素の一緒の適用可能性を指す。これらの選択肢のいずれか１つは、その意味の範囲内にあり、したがって、本明細書で使用される用語「および／または」の要件を満たすと理解される。選択肢のうちの複数の同時適用可能性も、その意味の範囲内にあり、したがって、用語「および／または」の要件を満たすと理解される。

本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形例は、記載された整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含むが、任意の他の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を除外しないことを意味すると理解される。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」によって置き換えることができるか、または時には、本明細書で使用される場合、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」によって置き換えることができる。前述の用語（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、有する（ｈａｖｉｎｇ））のいずれも、本発明の態様または実施形態に関連して本明細書で使用される場合はいつでも、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」によって置き換えられ得るが、あまり好ましくない。

本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲の要素で指定されていない要素、工程または成分を除外する。

タンパク質またはヌクレオチド「から本質的になる」タンパク質またはヌクレオチドは、指定されたタンパク質またはヌクレオチドとかなり同じアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有するタンパク質またはヌクレオチドである。

それぞれタンパク質またはヌクレオチドとして「本質的に同じアミノ酸配列またはヌクレオチド配列」を有するタンパク質またはヌクレオチドは、このタンパク質またはヌクレオチドと９０％を超えるアミノ酸同一性またはヌクレオチド同一性を典型的に有する。この定義には、保存的アミノ酸置換が含まれる。

本発明の目的のための用語「単離された」は、その元の環境（それが自然に存在する環境）から除去された生物学的材料（細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体）を示す。

本明細書で使用される「富む」とは、ＣＤ３４^＋細胞などの細胞の特定の集団の純度または割合が、組成物に含まれる全細胞に対して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％増加していることを意味する。細胞の特定の集団を富ませる方法は、例えば、陰性選択または陽性選択を使用する特定のキットを使用することによって、当技術分野で公知である。

「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、区別なく使用され、リボヌクレオシドのリン酸エステルポリマー形態（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）、またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、またはホスホロチオアートおよびチオエステルなど、一本鎖形態もしくは二本鎖ヘリックスのいずれかのそれらの任意のホスホエステル類似体を指す。核酸分子、特にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次構造および二次構造のみを指し、それを特定の三次形態に限定するものではない。したがって、この用語は、とりわけ、線状ＤＮＡ分子または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイル状ＤＮＡおよび染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。

「コドン最適化」とは、本明細書では、野生型で表されたコドンをさらに従来安定なコドンによって置換して機能的および活性なタンパク質を得る機会を最大化することによって発現を増強することを指す。

「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。

本明細書で使用される「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を導き、それによって、ＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち、転写を導くのに十分な最小配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は遍在性であり得、これは、広範囲の細胞、組織および種において、または細胞型特異的、組織特異的もしくは種特異的に活性であることを意味する。プロモーター配列は、ＤＮＡ配列に近接して局在し、リンカーまたはスペーサーによって分離され得る様々なプロモーター断片（異なるまたは同じ断片のいずれか）から構成され得る。このようなプロモーターは、キメラプロモーターと呼ばれる。

本明細書で使用される「エンハンサー」は、隣接遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用性エレメントを包含する。転写を阻害するエンハンサーは、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、コード配列からおよび転写領域の下流の位置から数キロベースペア（ｋｂ）までの距離にわたって、いずれかの方向で機能することができる（すなわち、コード配列と関連付けられ得る）。

用語「下流」は、単数または複数の参照ヌクレオチド配列の３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。

用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド領域の５’領域に位置する配列に関する。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子調節領域」または「調節領域」は、コード領域の上流（５’配列）、コード領域内、またはコード領域の下流（３’配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含み得る。コード領域が真核細胞内での発現を目的とする場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、コード配列の３’側に通常位置する。

用語「転写後調節エレメント」は、転写されると、タンパク質の発現を増強または阻害する三次構造を作り出すＤＮＡ配列を指す。

「転写制御配列」は、宿主細胞内でコード配列を発現させるプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのようなＤＮＡ調節配列を指す。

本出願で使用される用語「治療」および「療法」は、健康問題を改善するために疾患および／または症状を治癒させるおよび／または緩和することを意図して使用される一連の衛生的、薬理学的、外科的および／または物理的手段を指す。用語「治療」および「療法」は、いずれも個体または動物の健康の維持および／または再確立に関するため、予防的および治癒的方法を含む。症状、疾患および障害の原因にかかわらず、健康問題を緩和するおよび／または治癒させるための好適な医薬品の投与は、本出願の文脈内の治療または療法の形態として解釈されるべきである。

用語「治療有効量」は、治療効果を有し、ＤＢＡを治療することができる、物質の量を指す。

用語「個体」、「患者」または「対象」は、本出願では区別なく使用され、決して限定することを意味するものではない。「個体」、「患者」または「対象」は、任意の年齢、性別および健康状態のものであり得る。

本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、ベクターによって形質導入、感染、トランスフェクトまたは形質転換された細胞を指す。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどであり得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかであろう。用語「宿主細胞」は、元の形質導入、感染、トランスフェクトまたは形質転換された細胞およびその子孫を指すことが理解される。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される希釈剤」は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を意味する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、本発明の範囲を限定するものではないが、追加の緩衝剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；生分解性ポリマー、例えば、ポリエステル；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、多価糖アルコール；アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸およびトレオニン；有機糖または糖アルコール、例えば、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］－モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン；ならびに親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンを含む。

本明細書で使用される場合、句「それを必要とする対象」には、例えば、遺伝的欠陥を修正するために、タンパク質の欠陥機能を修正するために、または恒常性を改善するために、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子、ポリペプチドまたはベクターの投与から利点を得るであろう哺乳動物対象などの対象が含まれる。

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列に関する用語「最適化」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指し、ポリヌクレオチド配列は、そのポリヌクレオチド配列の特性を増強するように変異している。

用語「レンチウイルス」は、ヒト細胞に感染し、ヒト細胞内で複製し、ヒトおよび他の哺乳動物種に疾患を引き起こすことができるレトロウイルスの属を指す。「ベクター」は、外来遺伝物質を細胞内に人工的に運ぶために使用され得る任意のビヒクルである。したがって、「レンチウイルスベクター」は、ポリヌクレオチドを細胞内に運ぶ組換えレンチウイルスを指す。該用語は、他に必要とされる場合を除いて、あらゆるサブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。用語「ＬＶ」は、レンチウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」または「コード配列」は、遺伝子産物をコードするインビトロまたはインビボのヌクレオチド配列を指す。いくつかの例では、遺伝子は、コード配列、すなわち、遺伝子産物をコードする配列からなるか、または本質的になる。

本明細書で使用される「転写ユニット」とは、５’から３’に、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、またはその短縮バージョンの伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）（ＥＦ１α（ｓ））と、ＲＰＳ１９タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣｏＲＰＳ１９）と、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）、好ましくは変異Ｗｐｒｅと、少なくともポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列とを含む、本発明のＬＶベクターに含まれるヌクレオチド配列を意味し、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターまたは伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）、Ｗｐｒｅおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列は、ＣｏＲＰＳ１９に作動可能に連結され、ＣｏＲＰＳ１９の発現を調節する。

概要
上記のように、ＤＢＡ患者は、典型的には、ＲＰＳ１９遺伝子についてハプロ不全である。これは、ＲＰＳ１９遺伝子の対立遺伝子のうちの１つは影響を受けず、機能的であるが、ＲＰＳ１９タンパク質が十分に発現せず、これにより、機能不全リボソーム、および疾患の発症が最終的にもたらされることを意味する。

以前の試験では、さらに高い発現レベルのＲＰＳ１９タンパク質を得ることを目的として、ＲＰＳ１９遺伝子が強力なウイルスプロモーターの制御下に置かれるレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用することによってＲＰＳ１９タンパク質の発現を修正しようとするために遺伝子療法（ＧＴ）が使用されていた。しかし、ＰＧＫまたはＥＦ１αなどのヒトプロモーターは、強力なウイルスプロモーターよりも安全であることが知られているが、ＰＧＫまたはＥＦ１αは、タンパク質（ＲＰＳ１９）が大量に必要とされる特定の疾患（常染色体優性遺伝疾患、すなわち、ＤＢＡなど）に関連して、上記タンパク質の発現を促進するのに十分に強力ではない可能性がある。

本発明者らは、ヒトプロモーターを含むレンチウイルスベクターが、リボソーム生合成の変化を修正するのに十分な量のＲＰＳ１９タンパク質を発現させることができることを本明細書に示す。特に、２つの異なるヒトプロモーター、すなわち、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターと、その短縮バージョンの伸長因子１α（ＥＦ１α（ｓ））プロモーターとを有する２つの自己不活性化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ－ＬＶ）が開発されている。図７に示すように、両ＬＶは、コドン最適化ＲＰＳ１９タンパク質（ＣｏＲＰＳ１９と呼ばれる）を発現し、Ｋ５６２細胞株のリボソーム生合成の変化を修正することができ、ＲＰＳ１９遺伝子のその発現は、干渉ＲＮＡによってサイレンシングされていた。ＲＰＳ１９が欠損している患者の骨髄由来のＣＤ３４^＋細胞では、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の遺伝子を有する非治療用ベクターによって形質導入された対照群、グラニュロマクロファージ（ｇｒａｎｕｌｏｍａｃｒｏｐｈａｇｉｃ）（ＣＦＵ－ＧＭ）コロニーおよび赤血球（ＢＦＵ－Ｅ）コロニーの数と比較して、これらのＬＶベクターがそれぞれ１．５倍および３．９倍増加したことも本明細書に示される。したがって、予想外に、ヒトＰＧＫプロモーターがＲＰＳ１９の発現を１．５倍しか増加させることができなかったとしても、この増加は、ＤＢＡの重症モデル；ＲＰＳ１９の発現がほぼ完全に抑止されたＫ５６２細胞株では、リボソーム生合成の修正を達成するのに十分であることが判明したことが見出された。

さらに、治療用ベクターは、ＤＢＡ患者由来の赤血球前駆細胞の特徴的な赤血球分化欠陥を逆転させ、成熟ＣＤ７１^－／ＣＤ２３５ａ^＋赤血球細胞の産生を２．５倍増加させた。同様に、免疫不全ＮＳＧマウスでは、これらの前駆細胞の形質導入がこれらの細胞の再増殖能を保存し、ＤＢＡ患者の造血幹細胞のこの能力は重度に影響を受けないことが示唆されたことも本明細書に示される。毒性試験では、健常ドナー由来の細胞内のＲＰＳ１９遺伝子の最適化バージョンの過剰発現が毒性ではないことが示された。

結論として、これらの結果は、この疾患に罹患している患者におけるＲＰＳ１９タンパク質発現欠損を修正する可能性を実証しているため、ＤＢＡ療法のためのこれらのＬＶベクターの使用への道を開く。特に、これらの結果は、ＰＧＫプロモーターの制御下でＲＰＳ１９タンパク質を発現するレンチウイルスベクターをＤＢＡの治療に使用する可能性を示す。

したがって、第１の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）であって、ポリヌクレオチドが転写ユニットを含むことを特徴とし、転写ユニットが、５’から３’に、ホスホグリセリン酸キナーゼ（以下、ＰＧＫと呼ばれる）プロモーターもしくは伸長因子１アルファ（以下、ＥＦ１αと呼ばれる）プロモーターまたはその機能的変異体からなる群から選択されるプロモーターと、ヒトＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、好ましくはヒトＲＰＳ１９タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（以下、ＣｏＲＰＳ１９と呼ばれる）またはその機能的変異体と、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（以下、Ｗｐｒｅと呼ばれる）、好ましくは変異Ｗｐｒｅ、またはその機能的変異体とを含むと本明細書で定義され、ＰＧＫプロモーターまたはＥＦ１αプロモーターおよびＷｐｒｅが、ＲＰＳ１９またはＣｏＲＰＳ１９に作動可能に連結され、ＲＰＳ１９またはＣｏＲＰＳ１９の発現を調節するレンチウイルスベクター（ＬＶ）を提供する。コード配列および遺伝子発現制御配列は、コード配列の発現または転写および／もしくは翻訳を遺伝子発現制御配列の影響または制御下に置くように連結されている場合、作動可能に連結されていると言われる。例えば、ＰＧＫプロモーターまたはＥＦ１αプロモーターおよびＷｐｒｅは、ＣｏＲＰＳ１９の発現レベルが該プロモーターおよびＷｐｒｅのうちの１つによって調節されるように、ＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。

一実施形態では、第１の態様によるＬＶベクターに含まれるポリヌクレオチドは、ＬＶがその機能を行う（細胞に感染し、ウイルスゲノムに組み込まれて細胞内で持続する）ために必要なタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＬＶがその機能を行うために必要な調節配列をコードするポリヌクレオチドとして定義される１つ以上のレンチウイルス骨格エレメントをさらに含む。

したがって、第１の態様のＬＶベクターは、ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、１）転写ユニットおよび２）１つ以上のＬＶベクター骨格エレメントまたはそれらの組合せを含むことを特徴とする。これらの２つの成分およびそれらのポリヌクレオチドの各々は、以下で詳細に特徴付けられる：

１）転写ユニット
上記で定義されたように、転写ユニットとは、本明細書では、５’から３’に、ＰＧＫまたはＥＦ１αからなる群から選択されるプロモーターと、ＲＰＳ１９タンパク質、好ましくはＣｏＲＰＳ１９をコードするヌクレオチド配列と、Ｗｐｒｅエレメント、好ましくは変異Ｗｐｒｅとを含む、本発明のＬＶベクターのポリヌクレオチドに含まれるポリヌクレオチド配列であって、ＰＧＫプロモーターまたはＥＦ１αプロモーターおよびＷｐｒｅが、ＲＰＳ１９またはＣｏＲＰＳ１９に作動可能に連結され、ＲＰＳ１９またはＣｏＲＰＳ１９の発現を調節するポリヌクレオチド配列を指す。

・プロモーター
上記のように、転写ユニットに含まれるプロモーターは、ＰＧＫプロモーターまたはＥＦ１αプロモーターからなる群から選択される。上記プロモーターは、レンチウイルスベクターゲノムが標的細胞に組み込まれた後、ＲＰＳ１９、好ましくはＣｏＲＰＳ１９の発現をもたらす。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクター内のプロモーターは、標的細胞内のＲＰＳ１９、好ましくはＣｏＲＰＳ１９タンパク質の発現を選択的に増強する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチド分子は、標的細胞または標的組織のゲノム、例えば、造血幹細胞および造血前駆細胞のゲノムに安定に組み込まれる。

好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターのポリヌクレオチドに含まれるプロモーターは、ＰＧＫプロモーターである。一実施形態では、ＰＧＫプロモーターはヒトＰＧＫプロモーターである。好ましくは、上記ＰＧＫプロモーターは、配列番号１０、もしくは配列番号１０と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＰＧＫプロモーターは、配列番号１０を含むか、配列番号１０からなるか、または配列番号１０から本質的になる。

一実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターのポリヌクレオチドに含まれるプロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。好ましい実施形態では、ＥＦ１αプロモーターは、Ｓｈｕｂｈｒａｎｓｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１７（Ｓｈｕｂｈｒａｎｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｃｏｒｒｅｃｔ Ａｎｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｅｔｈａｌ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｉａｍｏｎｄ－Ｂｌａｃｋｆａｎ Ａｎｅｍｉａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２５，Ｉｓｓｕｅ ８，２０１７，Ｐａｇｅｓ １８０５－１８１４，ＩＳＳＮ １５２５－００１６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０４．００２）に記載されているようなＥＦ１αプロモーターの短縮バージョンである。一実施形態では、ＥＦ１αプロモーターはヒトＥＦ１αプロモーターである。好ましくは、上記短縮ＥＦ１αプロモーターは、配列番号１１、もしくは配列番号１１と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、短縮ＥＦ１αプロモーターは、配列番号１１を含むか、配列番号１１からなるか、または配列番号１１から本質的になる。

・ＲＰＳ１９タンパク質、好ましくはコドン最適化ＲＰＳ１９タンパク質（ＣｏＲＰＳ１９）をコードするヌクレオチド配列。
本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、転写ユニットに、ヒトＲＰＳ１９タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、転写ユニットは、ヒトＲＰＳ１９遺伝子のコドン最適化バージョン（以下、ＣｏＲＰＳ１９と呼ばれる）を含む。一実施形態では、ＲＰＳ１９またはＣｏＲＰＳ１９は、プロモーターおよび転写後エレメントを含む少なくとも１つ、好ましくは２つの発現制御配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＲＰＳ１９と同様の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含むレンチウイルスベクターを提供する。

好ましくは、ＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードする上記コドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１２、もしくは配列番号１２と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１２を含むか、配列番号１２からなるか、または配列番号１２から本質的になる。

・ＷＨＶ（ウッドチャック肝炎ウイルス）転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）
本明細書に提供されるレンチウイルスベクターはまた、転写ユニットに、ＲＰＳ１９、好ましくはＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つの転写後調節エレメントを含む。一実施形態では、上記転写後調節エレメントは、ＷＨＶ（ウッドチャック肝炎ウイルス）転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）である。一実施形態では、ベクターの安全性を高めるために、転写後調節エレメントは変異させられる（Ｗｐｒｅ＊とも呼ばれる）。好ましい実施形態では、変異Ｗｐｒｅは、遺伝子Ｘフレームの変異を含有する。

好ましい実施形態では、ＷＨＶ（ウッドチャック肝炎ウイルス）転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）を含むヌクレオチド配列は変異Ｗｐｒｅエレメントである。好ましくは、変異Ｗｐｒｅを含む上記ヌクレオチドは、配列番号１３、もしくは配列番号１３と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、変異Ｗｐｒｅを含むヌクレオチド配列は、配列番号１３を含むか、配列番号１３からなるか、または配列番号１３から本質的になる。

転写ユニット（ＰＧＫプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター、ＲＰＳ１９、好ましくはＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびＷｐｒｅエレメント、好ましくはＷｐｒｅ＊）の様々なエレメントについて上述したあらゆる実施形態を互いに組み合わせることができることを理解されたい。

好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターのポリヌクレオチドに含まれる転写ユニットは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターまたは伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターからなる群から選択されるプロモーターと、ＲＰＳ１９タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列と、変異ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）とからなり、プロモーターおよびＷｐｒｅエレメントは、ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を調節する。

好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターのポリヌクレオチドに含まれる転写ユニットは、配列番号１０と全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有するホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターと、配列番号１２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、ＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列と、配列番号１３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する変異ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）とからなり、ＰＧＫプロモーターおよび変異Ｗｐｒｅエレメントは、ＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、ＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を調節する。

好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターのポリヌクレオチドに含まれる転写ユニットは、配列番号１１と全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターと、配列番号１２の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、ＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列と、配列番号１３の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する変異ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）とからなり、ＥＦ１αプロモーターおよび変異Ｗｐｒｅエレメントは、ＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、ＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を調節する。

２）レンチウイルスベクター骨格エレメント
上記で定義されたように、レンチウイルスベクター骨格エレメントは、ＬＶがその機能を行う（細胞に感染し、ウイルスゲノムに組み込まれて細胞内で持続する）ために必要なポリヌクレオチド配列として定義される。

レンチウイルスには、ウシレンチウイルス群、ウマレンチウイルス群、ネコレンチウイルス群、オビンカプリン（ｏｖｉｎｅｃａｐｒｉｎｅ）レンチウイルス群および霊長類レンチウイルス群のメンバーが含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子送達ベクターは自己限定的なＬＶである。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは「第３世代」レンチウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、用語「第３世代」レンチウイルスベクターは、第２世代ベクター系の特徴を有し、ｔａｔ遺伝子が欠失または不活性化されているものなど、機能的なｔａｔ遺伝子をさらに欠くレンチウイルスパッケージング系を指す。典型的には、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別個の発現構築物上に提供される。本明細書で使用される場合、「第２世代」レンチウイルスベクター系とは、アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失または不活性化されているものなど、機能的アクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージング系を指す。本明細書で使用される場合、「パッケージング系」は、組換えウイルスのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む一連のウイルス構築物を指す。典型的には、パッケージング系の構築物は、パッケージング細胞に最終的に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される第３世代レンチウイルスベクターは自己不活性化レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターはＶＳＶ．Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターである。

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、***細胞および非***細胞に感染することができる組換えレンチウイルスのベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、造血幹細胞、長期造血幹細胞、短期造血幹細胞、多能性前駆細胞、造血ＣＤ３４＋細胞、およびＣＤ３４＋集団内の任意のクラスター分化亜集団に感染することができるベクターである。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、レトロウイルスに見られる３つの遺伝子、すなわち、２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列に隣接しているｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを典型的に有する。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリックス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードする。ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードする。ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’ ＬＴＲおよび３’ ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するように機能する。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他のあらゆるシス作用性配列を含有する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２および／またはＳＩＶでは）ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｔおよびｖｐｘを含む追加の遺伝子を有する。

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、***細胞および非***細胞を形質導入するベクターの能力を損なうことなく、ＨＩＶ病原性遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させる。

ある特定の実施形態では、遺伝子移入カセットは、１つ以上の追加のエレメント、例えば、５’ＬＴＲ、プライマー結合部位、ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト、Ｒｅｖ応答エレメント、コード配列、例えば、切断型ｇａｇ配列、パッケージングシグナル、３’ＬＴＲおよび／またはポリＡシグナルから選択される１つ以上のエレメントを含む。

上記で定義されたように、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、先に定義された転写ユニットを含む。一実施形態では、レンチウイルスベクターに含まれる上記ポリヌクレオチドは、上流、すなわち上記で定義された転写ユニットの５’領域に、５’から３’の順で、以下のポリヌクレオチド配列、すなわち、ａ）キメラサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む５’長末端反復（５’ ＬＴＲ）、ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）、ｃ）ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、ｄ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、およびｅ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）またはそれらの任意の組合せのうちの少なくとも１つ以上をさらに含む。

別の実施形態では、レンチウイルスベクターに含まれる上記ポリヌクレオチドは、下流、すなわち、上記で定義された転写ユニットの３’領域に、ｉ）３’長末端反復（ＬＴＲ）、および場合により、ｊ）３’ ＬＴＲの後に位置するポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、５’ ＬＴＲおよび／または３’ ＬＴＲのＵ３領域の欠失を含む。ＬＴＲのＵ３領域の欠失は、完全欠失または部分的な欠失であり得る。野生型ＬＴＲのＵ３配列の欠如は、レンチウイルスベクター構築物がＴａｔ非依存性であり、したがって、レンチウイルスベクター構築物が第３世代で産生されることを伴う。

ヌクレオチドａ）～ｅ）ならびにｉ）およびｊ）の可能な任意の組合せは、上記の節に記載される転写ユニットと組み合わせて、本発明に含まれることを理解されたい。したがって、レンチウイルスベクターは、上記で定義された転写ユニットと組み合わせて、ａ）～ｅ）ならびにｉ）およびｊ）から選択される１つのみ、２つ、３つまたはそれ以上のエレメントを含み得る。ヌクレオチドａ）～ｅ）、およびｉ）およびｊ）の各々、ならびにそれらの好ましい実施形態は、以下にさらに定義される。

５’ ＬＴＲヌクレオチド配列は、レンチウイルスベクター産生中にプロウイルス転写を担う。本明細書に提供されるレンチウイルスベクター構築物では、５’ ＬＴＲは、ＣＭＶプロモーターのキメラ形態を含むか、またはそれからなる。さらに、本明細書に提供されるレンチウイルスベクター構築物では、５’ ＬＴＲはまた、ＲＵ５と呼ばれる野生型ＨＩＶ－１ ５’ ＬＴＲの一部を含み得る。好ましい実施形態では、５’ ＬＴＲは、ＣＭＶプロモーターのキメラ形態、およびＲＵ５エレメントと呼ばれる野生型ＨＩＶ－１ ５’ ＬＴＲの一部を含むか、またはそれからなる。キメラＣＭＶプロモーターは、レンチウイルスベクター産生中にプロウイルスの転写をもたらす。一実施形態では、キメラＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー（以下、ＣＭＶエンハンサーと呼ばれる）およびＣＭＶプロモーター（以下、ＣＭＶプロモーターと呼ぶ）を含むか、またはそれからなる。

好ましい実施形態では、ＣＭＶエンハンサーを含むヌクレオチド配列は、配列番号３、もしくは配列番号３と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＣＭＶエンハンサーを含むヌクレオチド配列は、配列番号３を含むか、配列番号３からなるか、または配列番号３から本質的になる。

好ましい実施形態では、ＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号４、もしくは配列番号４と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号４を含むか、配列番号４からなるか、または配列番号４から本質的になる。

好ましい実施形態では、キメラＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号２、もしくは配列番号２と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、キメラＣＭＶプロモーターを含むヌクレオチド配列は、配列番号２を含むか、配列番号２からなるか、または配列番号２から本質的になる。

上記のように、５’ ＬＴＲヌクレオチドは、ＲＵ５エレメントを含むヌクレオチド配列をさらに含む。この配列は、プロウイルスゲノムの逆転写、および形質導入された細胞へのプロウイルスゲノムの組込みに必要である。好ましい実施形態では、ＲＵ５エレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号５、もしくは配列番号５と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＲＵ５エレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号５を含むか、配列番号５からなるか、または配列番号５から本質的になる。

好ましい実施形態では、５’ ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号１、もしくは配列番号１と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、５’ ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号１を含むか、配列番号１からなるか、または配列番号１から本質的になる。

５’ ＬＴＲに隣接して、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なカプシド形成（Ｐｓｉ部位）に必要な配列が存在し得る。カプシド形成（または感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠失している場合があり、シス欠損はゲノムＲＮＡのカプシド形成を妨げる。ただし、得られた変異型は、あらゆるビリオンタンパク質の合成を依然として導くことができる。

一実施形態では、５’ ＬＴＲの下流には、ｔＲＮＡプライマー結合部位（以下、ＰＢＳまたはＰＢＳ ＳＬ２３と呼ばれる）である、ゲノムの逆転写に必要な配列がある。したがって、一実施形態では、５’ ＬＴＲヌクレオチドの下流には、プライマー結合部位ＳＬ１２３ヌクレオチドがある。このＰＢＳエレメントでは、ｔＲＮＡは、標的細胞形質導入後および細胞ゲノムへの組込み前のプロウイルスゲノムの逆転写中にＰＢＳエレメントに融合される。好ましい実施形態では、ＰＢＳ ＳＬ１２３を含むヌクレオチド配列は、配列番号６、もしくは配列番号６と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＰＢＳ ＳＬ１２３を含むヌクレオチド配列は、配列番号６を含むか、配列番号６からなるか、または配列番号６から本質的になる。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、ウイルスＲＮＡを粒子に効率的にカプセル化するための、ｐｓｉ部位とも呼ばれる少なくともｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナルを含む。ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナルは、ＰＢＳ ＳＬ１２３の下流に位置し得る。好ましい実施形態では、ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナルを含むヌクレオチド配列は、配列番号７、もしくは配列番号７と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナルを含むヌクレオチド配列は、配列番号７を含むか、配列番号７からなるか、または配列番号７から本質的になる。

本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、上記で定義されるように、レトロウイルスゲノムをウイルスカプシドにパッケージングすることに関与するパッケージングシグナル（Ψ）を含有し得る。ＬＶベクターは、この領域に約３００ｂｐのＧａｇ遺伝子を必要とすると考えられた。現在、このＧａｇ配列は、わずか４０ｂｐに減少している。したがって、一実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナルの下流に位置する、切断型Ｇａｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

一実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクター転写物内のこの配列に融合して、レンチウイルスベクター産生中のプロウイルスの核外輸送を助けるＲｅｖ応答エレメント（以下、ＲＲＥと呼ばれる）をさらに含む。一実施形態では、ＲＲＥエレメントは、ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナルの下流に位置する。好ましい実施形態では、ＲＲＥエレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号８、もしくは配列番号８と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＲＲＥエレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号８を含むか、配列番号８からなるか、または配列番号８から本質的になる。

一実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、標的細胞の形質導入後のレンチウイルスベクターの逆転写中に陽性ＤＮＡ鎖転写のためのプライマーとして作用するセントラルポリプリントラクト（以下、ｃＰＰＴと呼ばれる）をさらに含む。ｃＰＰＴはまた、プロウイルスＤＮＡの核内取込み、したがって、レンチウイルスベクターの形質導入効果を増加させる。さらに、ｃＰＰＴは、レンチウイルスベクタータイトル（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｉｔｌｅ）を増加させる。一実施形態では、ｃＰＰＴエレメントは、ＲＲＥエレメントの下流に位置する。好ましい実施形態では、ｃＰＰＴエレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号９、もしくは配列番号９と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＲＲＥエレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号９を含むか、配列番号９からなるか、または配列番号９から本質的になる。

上記で定義された骨格エレメントは、転写ユニットの上流に（すなわち、レンチウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドの５’領域に向かって）見出すことができる。ただし、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターはまた、転写ユニットの下流に（すなわち、レンチウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドの３’領域に向かって）他の骨格エレメントを有し得る。一実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドは、３’ ＬＴＲと、場合によりポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列とをさらに含む。３’ ＬＴＲは、レンチウイルスベクター産生中のｍＲＮＡポリアデニル化に関与する。一実施形態では、組み込まれたウイルスゲノムは、ウイルスプロモーター領域（Ｕ３）に欠失を含有し、形質導入された細胞内の潜在的にパッケージング可能なウイルスゲノムの転写不活性化をもたらす。

一実施形態では、３’ ＬＴＲは、切断型Ｕ３エレメントを含む。一実施形態では、３’ ＬＴＲは、野生型ＨＩＶ－１由来のエレメントＲおよびＵ５を含む。一実施形態では、３’ ＬＴＲは、ポリアデニル化シグナル配列を含む。好ましい実施形態では、３’ ＬＴＲは、切断型Ｕ３エレメント（以下、ΔＵ３エレメントと呼ばれる）、ならびに野生型ＨＩＶ－１由来のエレメントＲおよびＵ５（以下、ＲＵ５エレメントと呼ばれる）を含むか、またはそれからなる。

好ましい実施形態では、３’ ＬＴＲヌクレオチドに含まれるΔＵ３エレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号１５、もしくは配列番号１５と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ΔＵ３エレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号１５を含むか、配列番号１５からなるか、または配列番号１５から本質的になる。

好ましい実施形態では、３’ ＬＴＲヌクレオチドに含まれるＲＵ５エレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号１６、もしくは配列番号１６と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＲＵ５エレメントを含むヌクレオチド配列は、配列番号１６を含むか、配列番号１６からなるか、または配列番号１６から本質的になる。

一実施形態では、３’ ＬＴＲの下流には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列（以下、ポリＡと呼ばれる）が存在する。一実施形態では、ポリＡシグナル配列は、サル空胞化ウイルス４０ウイルスに由来する。好ましくは、３’ ＬＴＲヌクレオチドの下流に位置するポリＡを含むヌクレオチド配列は、配列番号３３、もしくは配列番号３３と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ポリＡを含むヌクレオチド配列は、配列番号３３を含むか、配列番号３３からなるか、または配列番号３３から本質的になる。

好ましい実施形態では、３’ ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号１４、もしくは配列番号１４と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、３’ ＬＴＲを含むヌクレオチド配列は、配列番号１４を含むか、配列番号１４からなるか、または配列番号１４から本質的になる。

さらに好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、５’から３’に、
ａ）キメラサイトメガロウイルスプロモーターを含む５’長末端反復（５’ ＬＴＲ）、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）、
ｃ）ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、
ｄ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
ｅ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、
ｆ）ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）または伸長因子アルファ短縮プロモーター（ＥＦ１α（ｓ））からなる群から選択されるプロモーター、
ｇ）ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
ｈ）変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）
ｉ）３’長末端反復（３’ ＬＴＲ）を含むことを特徴とし、
５’ ＬＴＲ領域および３’ ＬＴＲ領域は、ＬＴＲのＵ３領域内の完全または部分的な欠失によって実質的に転写的に不活性にされており、ｆ）およびｈ）は、ｇ）に作動可能に連結され、ｇ）の発現を調節する。

さらに好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、５’から３’に、
ａ）キメラサイトメガロウイルスプロモーターを含む５’長末端反復（５’ ＬＴＲ）、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）、
ｃ）ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、
ｄ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
ｅ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、
ｆ）ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、
ｇ）ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
ｈ）変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）
ｉ）３’長末端反復（３’ ＬＴＲ）を含むことを特徴とし、
５’ ＬＴＲ領域および３’ ＬＴＲ領域は、ＬＴＲのＵ３領域内の完全または部分的な欠失によって実質的に転写的に不活性にされており、ｆ）およびｈ）は、ｇ）に作動可能に連結され、ｇ）の発現を調節する。

さらに好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、５’から３’に、
ａ）キメラサイトメガロウイルスプロモーターを含む５’長末端反復（５’ ＬＴＲ）、
ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）、
ｃ）ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、
ｄ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
ｅ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、
ｆ）ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、
ｇ）ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
ｈ）変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）
ｉ）３’長末端反復（３’ ＬＴＲ）、および
ｊ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含むことを特徴とし、
５’ ＬＴＲ領域および３’ ＬＴＲ領域は、ＬＴＲのＵ３領域内の完全または部分的な欠失によって実質的に転写的に不活性にされており、ｆ）およびｈ）は、ｇ）に作動可能に連結され、ｇ）の発現を調節する。

さらに好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、５’から３’に、
ａ）キメラサイトメガロウイルスプロモーターを含む５’長末端反復（５’ ＬＴＲ）であって、５’ ＬＴＲが、配列番号１と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する５’長末端反復（５’ ＬＴＲ）、
ｂ）配列番号６と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するプライマー結合部位（ＰＢＳ）、
ｃ）配列番号７と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、
ｄ）配列番号８と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
ｅ）配列番号９と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、
ｆ）配列番号１０と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、
ｇ）配列番号１２と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、好ましくはＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列
ｈ）配列番号１３と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）、および
ｉ）配列番号１４と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する３’長末端反復（３’ ＬＴＲ）を含むことを特徴とし、
５’ ＬＴＲ領域および３’ ＬＴＲ領域は、ＬＴＲのＵ３領域内の完全または部分的な欠失によって実質的に転写的に不活性にされており、ｆ）およびｈ）は、ｇ）に作動可能に連結され、ｇ）の発現を調節する。

さらに好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、５’から３’に、
ａ）キメラサイトメガロウイルスプロモーターを含む５’長末端反復（５’ ＬＴＲ）であって、５’ ＬＴＲが、配列番号１と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する５’長末端反復（５’ ＬＴＲ）、
ｂ）配列番号６と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するプライマー結合部位（ＰＢＳ）、
ｃ）配列番号７と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するｐｓｉパッケージングシグナル、
ｄ）配列番号８と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
ｅ）配列番号９と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、
ｆ）配列番号１０と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、
ｇ）配列番号１２と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、好ましくはＣｏＲＰＳ１９タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列
ｈ）配列番号１３と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）、
ｉ）配列番号１４と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する３’長末端反復（３’ ＬＴＲ）、および
ｊ）配列番号３３と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含むことを特徴とし、
５’ ＬＴＲ領域および３’ ＬＴＲ領域は、ＬＴＲのＵ３領域内の完全または部分的な欠失によって実質的に転写的に不活性にされており、ｆ）およびｈ）は、ｇ）に作動可能に連結され、ｇ）の発現を調節する。

さらに、当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドカセットは、限定するものではないが、特定の遺伝子発現ベクターのクローニングを容易にするための制限部位、および特定の遺伝子発現ベクターの調節エレメントを含む他のエレメントを場合により含有し得る。

好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターに含まれる全長ポリヌクレオチドは、配列番号１７（本明細書では、ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊－ＬＶ配列とも呼ばれる）、もしくは配列番号１７と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターに含まれる全長ヌクレオチドは、配列番号１７を含むか、配列番号１７からなるか、または配列番号１７から本質的になる。

好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターに含まれる全長ポリヌクレオチドは、配列番号１８（本明細書では、ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊－ＬＶ配列）、もしくは配列番号１８と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。好ましい実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターに含まれる全長ヌクレオチドは、配列番号１８を含むか、配列番号１８からなるか、または配列番号１８から本質的になる。

一実施形態では、ウイルス粒子の脂質コートは、宿主細胞の表面上に以前に存在していた膜結合ポリペプチドを含むことができる。

一実施形態では、本発明によるレンチウイルスベクター、またはその実施形態のいずれかは、ＤＢＡを有するヒトに続いて移植され得るヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を形質導入するために使用される。したがって、第２の態様では、本発明は、第１の態様、またはその実施形態のいずれかで定義されるレンチウイルスベクターを含む宿主細胞（例えば、ＣＤ３４^＋造血細胞）または細胞の集団（例えば、形質導入された）に関する。

他の実施形態では、細胞は、第１の態様、またはその実施形態のいずれかのレンチウイルスベクターによってコードされる遺伝子産物を対象に提供するために対象に送達される細胞である。一実施形態では、単数または複数の宿主細胞のゲノムは、第１の態様、またはその実施形態のいずれかのレンチウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドを完全にまたは部分的に含む。一実施形態では、単数または複数の宿主細胞のゲノムは、上記で定義された転写ユニットを少なくとも含む。一実施形態では、単数または複数の宿主細胞は、それらのゲノム内に、第１の態様、またはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクターのポリヌクレオチドを完全にまたは部分的に含む。ある特定の実施形態では、細胞は、治療される対象にとって自己由来であるか、または治療される対象から得られた。他の実施形態では、細胞は、治療される対象にとって同種異系であるか、または治療される対象以外のドナーから得られた。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。特定の実施形態では、細胞は、本明細書に開示される遺伝子送達ベクターによって細胞が形質導入された後に細胞によって治療される対象から得られたＣＤ３４^＋細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ＤＢＡと診断された対象から得られたＣＤ３４^＋細胞である。

好ましい実施形態では、細胞は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞およびＣＤ３４^＋造血前駆細胞に富む。好ましい実施形態では、細胞は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞およびＣＤ３４^＋造血前駆細胞に富み、富むとは、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または１００％がＣＤ３４^＋であることを意味する。第２の態様の一実施形態では、宿主細胞または細胞集団は、ＣＤ３４^＋造血細胞に富む集団を含むか、またはＣＤ３４^＋造血細胞に富む集団からなる。一実施形態では、ＣＤ３４^＋造血幹細胞およびＣＤ３４^＋造血前駆細胞に富む上記集団は、それらのゲノム内に、第１の態様、またはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクターを含む。

別の実施形態では、宿主細胞は、ＬＶベクターゲノムが安定に維持されパッケージングされている宿主細胞またはプロデューサー細胞内でＬＶ ｒｅｐ遺伝子およびＬＶ ｃａｐ遺伝子が安定に維持されているパッケージング細胞でもあり得る。例示的なパッケージング細胞およびプロデューサー細胞は、ＳＦ－９細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＬＶベクターは、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して、精製および製剤化される。別の実施形態では、単数または複数の宿主細胞は、ウイルス遺伝子送達ベクターを産生するために使用される。

特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は血球である。いくつかの実施形態では、細胞は赤血球細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄細胞、例えば、系統枯渇骨髄細胞（ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ）である。特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞またはＣＤ３４^＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、好ましい細胞はＣＤ３４^＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、好ましい細胞は委任造血赤血球前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）である。第２の態様の一実施形態では、宿主細胞または細胞集団は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞およびＣＤ３４^＋造血前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞、長期造血幹細胞、短期造血幹細胞、多能性前駆細胞、造血ＣＤ３４^＋細胞、およびＣＤ３４^＋集団内の任意のクラスター分化亜集団からなる群から選択される。一実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞は、骨髄試料から得られるか、または採取される。いくつかの実施形態では、骨髄試料は、ＣＤ１６^＋白血球を枯渇させている。別の実施形態では、ＨＳＣは、末梢血から得られる。一実施形態では、末梢血試料は、赤血球を枯渇させている。いくつかの実施形態では、血液試料は、ＣＤ１６^＋白血球を枯渇させている。ＣＤ３４^＋細胞の選択方法は、陽性選択、陰性選択またはそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの実施形態では、選択は、別個にまたは組み合わせて、これらのマーカー、すなわち、ＣＤ３４^＋、ＣＤ５９^＋、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１^＋、ＣＤ３８^{ｌｏｗ／－}、ｃ－Ｋｉｔ^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ１６^＋およびＬｉｎ^－のいずれかの発現に基づき得る。特定の実施形態では、好ましい細胞は、本明細書に開示される遺伝子送達ベクターによって細胞が形質導入された後に細胞によって治療される対象から得られたＣＤ３４^＋細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ＤＢＡと診断された対象から得られたＣＤ３４^＋ＤＢＡ細胞である。別の実施形態では、単数または複数の宿主細胞は、確立された細胞株に由来してもよいか、または一次細胞であってよく、「一次細胞」、「一次細胞株」および「一次培養物」は、本明細書では区別なく使用されるか、または対象に由来し、限定されたもしくは無制限の数の継代、すなわち、培養物の分割のためにインビトロで増殖させられた細胞および細胞培養物を指す。例えば、一次培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回または１５回継代されていてもよいが、危機段階を十分な回数経ない培養物である。典型的には、本発明の一次細胞株は、インビトロで１０継代未満にわたって維持される。本発明の実施形態は、ウイルス送達ベクター、例えば、ヒトＲＰＳ１９遺伝子、好ましくはＣｏＲＰＳ１９を含有するＬＶベクターによって、好ましくはヒトＰＧＫプロモーターの制御下で形質導入された哺乳動物細胞（例えば、ＣＤ３４^＋細胞）を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるベクターによって細胞を形質導入する場合、細胞は、ベクターと約３０分間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約２時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３６時間、約８時間、約６０時間接触させられる。いくつかの実施形態では、細胞は、６０時間未満、４８時間未満、３６時間未満または２４時間未満にわたって形質導入される。

第３の態様では、本発明は、第１の態様、またはその実施形態のいずれかで定義されたレンチウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドを含む単離された核酸に関する。

医薬組成物
第４の態様では、本発明は、第１の態様、もしくはその実施形態のいずれかで定義されるレンチウイルスベクター、第２の態様、もしくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞もしくは細胞集団、および／または第３の態様、もしくはその実施形態のいずれかで定義されるポリヌクレオチド、ならびに薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、第１の態様、もしくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクターによって形質導入されたＣＤ３４^＋造血幹細胞およびＣＤ３４^＋造血前駆細胞に富む細胞の集団と、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤とを含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２の態様、もしくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞もしくは細胞集団、または第４の態様、もしくはその実施形態のいずれかの医薬組成物は、インビボ、インビトロまたはエクスビボのいずれかで、第１の態様、もしくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクターと接触させられるか、または第１の態様、もしくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクターによって形質導入される。好ましくは、レンチウイルスベクターの投与はエクスビボである。

本明細書に記載の医薬組成物はまた、他の物質を含有し得る。これらの物質には、限定するものではないが、凍結保護物質、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、界面活性剤、増量剤、酸化防止剤および安定化剤が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥され得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、生理食塩水を含む。

本明細書で使用される用語「凍結保護物質」は、レンチウイルスベクターの表面から優先的に排除されることによって、凍結誘発ストレスに対してレンチウイルスベクターに安定性をもたらす薬剤を含む。凍結保護物質はまた、一次および二次乾燥ならびに長期製品保存中の保護を提供し得る。凍結保護物質の非限定的な例には、糖、例えば、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、マンノースおよびラクトース；ポリマー、例えば、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンおよびポリエチレングリコール；界面活性剤、例えば、ポリソルバート（例えば、ＰＳ－２０またはＰＳ－８０）；ならびにアミノ酸、例えば、グリシン、アルギニン、ロイシンおよびセリンが挙げられる。生体系において低い毒性を示す凍結保護物質が一般に使用される。

一実施形態では、凍結乾燥保護剤が、本明細書に記載される医薬組成物に添加される。本明細書で使用される用語「凍結乾燥保護剤」は、非晶質ガラス状マトリックスを提供し、水素結合によってレンチウイルスベクターの表面と結合し、乾燥プロセス中に除去される水分子を置換することによって、凍結乾燥プロセスまたは脱水プロセス（一次および二次凍結乾燥サイクル）中にレンチウイルスベクターに安定性をもたらす薬剤を含む。これは、凍結乾燥サイクル中の生成物分解を最小限に抑え、長期生成物安定性を改善するのに役立つ。凍結乾燥保護剤の非限定的な例には、糖、例えば、スクロースまたはトレハロース；アミノ酸、例えば、グルタミン酸一ナトリウム、非結晶グリシンまたは非結晶ヒスチジン；メチルアミン、例えば、ベタイン；リオトロピック塩、例えば、硫酸マグネシウム；ポリオール、例えば、３価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック（登録商標）；ならびにそれらの組合せが挙げられる。医薬組成物に添加される凍結乾燥保護剤の量は、一般に、医薬組成物が凍結乾燥される際に、系統の許容できない量の分解をもたらさない量である。

いくつかの実施形態では、増量剤が医薬組成物に含まれる。本明細書で使用される用語「増量剤」は、医薬品と直接相互作用することなく、凍結乾燥生成物の構造を提供する薬剤を含む。薬学的に洗練されたケーキを提供することに加えて、増量剤はまた、崩壊温度の改変、凍結融解保護の提供、および長期保存にわたる系統安定性の向上に関して有用な品質を付与し得る。増量剤の非限定的な例には、マンニトール、グリシン、ラクトースおよびスクロースが挙げられる。増量剤は、結晶性（グリシン、マンニトールまたは塩化ナトリウムなど）または非晶質（デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンなど）であってよく、一般に、０．５％～１０％の量で製剤に使用される。

他の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されるものが、医薬組成物の所望の特性に悪影響を及ぼさない限り、本明細書に記載の医薬組成物に含まれてもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を意味する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、追加の緩衝剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；生分解性ポリマー、例えば、ポリエステル；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、多価糖アルコール；アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸およびトレオニン；有機糖または糖アルコール、例えば、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］－モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン；ならびに親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンを含む。

医薬組成物は、経口、舌下、頬側、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、結膜、直腸、経皮、髄腔内、局所および／または吸入媒介投与のために調製され得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、結膜、経皮、腹腔内および／または皮下投与に適した溶液であり得る。別の実施形態では、医薬組成物は、舌下、頬側および／または吸入媒介投与経路に適した溶液であり得る。代替的な実施形態では、医薬組成物は、髄腔内投与に適したゲルまたは溶液であり得る。代替的な実施形態では、医薬組成物は、吸入媒介投与に適したエアロゾルであり得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、髄腔内投与のために調製され得る。

医薬組成物は、最新技術で公知の一般的な賦形剤および担体をさらに含み得る。固体医薬組成物の場合、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む従来の非毒性固体担体を使用してもよい。注射用溶液の場合、医薬組成物は、凍結保護物質、凍結乾燥保護剤、界面活性剤、増量剤、酸化防止剤、安定化剤および薬学的に許容される担体をさらに含み得る。エアロゾル投与の場合、医薬組成物は、界面活性剤および噴射剤とともに細かく分割された形態で一般に供給される。界面活性剤は、当然ながら非毒性でなければならず、一般に噴射剤に可溶である。そのような薬剤の代表は、６～２２個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合エステル、例えば、混合グリセリドまたは天然グリセリドを使用してもよい。所望により、例えば、鼻腔内送達用のレシチンと同様に、担体を含めることもできる。坐剤の場合、従来の結合剤および担体には、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ得る。好ましい実施形態では、担体はナノ粒子である。さらに好ましい実施形態では、ナノ粒子は、本発明のレンチウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのビヒクルとして作用する。

したがって、注射に適した医薬組成物は、緩衝剤（例えば、アセタート緩衝剤、ホスファート緩衝剤またはシトラート緩衝剤）、界面活性剤（例えば、ポリソルバート）、場合により、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができるが、本明細書の教示に適合する他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、有害な細胞集団の部位、すなわち、肝細胞に直接送達され、それによって、治療剤への疾患組織の曝露を増加させることができる。

本明細書に提供されるレンチウイルスベクターは、場合により、治療を必要とする障害または状態を治療するのに有効な他の薬剤（例えば、予防的または治療的）と組み合わせて投与され得る。補助療法と併せたまたは組み合わせた、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターの投与とは、治療および開示されるポリペプチドの連続的な、同時の（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、同一の広がりを持つ、同時の（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）、付随する、または同時に起こる投与または適用を意味する。

医学的使用ならびに投与のスケジュール、経路および用量
第５の態様では、本発明は、医薬品として使用するための、第１の態様、もしくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクター、第２の態様、もしくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞もしくは細胞集団、第３の態様、もしくはその実施形態のいずれかによる単離された核酸、または第４の態様、もしくはその実施形態のいずれかの医薬組成物を提供する。第６の態様では、本発明は、ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＤＢＡ）の治療に使用するための、第１の態様、もしくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクター、第２の態様、もしくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞もしくは細胞集団、第３の態様、もしくはその実施形態のいずれかによる単離された核酸、または第４の態様、もしくはその実施形態のいずれかの医薬組成物を提供し、その使用は、上記レンチウイルスベクター、上記宿主細胞もしくは細胞集団、または上記組成物を対象に投与することを含む。好ましい実施形態では、配列番号１７と全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＤＢＡ）の治療に使用される。したがって、本開示の方法および組成物は、例えば、ダイアモンド・ブラックファン貧血の治療に使用される。

本発明はまた、第１の態様、もしくはその実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクター、第２の態様、もしくはその実施形態のいずれかによる宿主細胞もしくは細胞集団、第３の態様、もしくはその実施形態のいずれかの単離された核酸、または第４の態様、もしくはその実施形態のいずれかの医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象のＤＢＡ障害を治療、予防または改善する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、ＤＢＡを治療するために使用され、ウイルスベクターは、ＲＰＳ１９遺伝子ｃＤＮＡまたはコード配列に作動可能に連結されたヒトＰＧＫプロモーターを含む、本明細書に開示される発現構築物と、本明細書に開示される変異Ｗｐｒｅとを含むＬＶである。

別の実施形態では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクター、宿主細胞もしくは細胞集団または組成物の投与は、対象において免疫応答を誘導しないか、または上記対象において極めて低い免疫応答を誘導する。

いくつかの実施形態では、本発明のレンチウイルスベクター、宿主細胞もしくは細胞集団または組成物は、単回用量または複数回用量として投与される。いくつかの実施形態では、本発明のレンチウイルスベクター、宿主細胞もしくは細胞集団または組成物の用量は、一度に投与されるか、または複数のサブ用量、例えば、２つのサブ用量、３つのサブ用量、４つのサブ用量、５つのサブ用量、６つのサブ用量、もしくは６つを超えるサブ用量に分割される。いくつかの実施形態では、複数のレンチウイルスベクターが投与される。最も好ましくは、本発明のレンチウイルスベクター、宿主細胞もしくは細胞集団または組成物は、単回用量として投与される。

いくつかの実施形態では、本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞もしくは細胞集団、または医薬組成物の用量は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回繰り返して投与される。

本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞もしくは細胞集団、または医薬組成物は、局所的または全身的に投与され得る。一実施形態では、レンチウイルスベクターの投与経路は非経口である。本明細書で使用される非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与を含む。一実施形態では、上記レンチウイルスベクターは、静脈内、皮下、筋肉内投与され得るか、または任意の粘膜表面を介して、例えば、経口、舌下、頬側、経鼻、直腸、膣内投与され得るか、または肺経路を介して投与され得る。静脈内形態の非経口投与が好ましい。一実施形態では、投与のための形態は、注射、特に静脈内もしくは動脈内注射、または点滴のための溶液である。

ＤＢＡの治療のための、本明細書に提供される組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態、対象がヒトまたは動物であるか、投与される他の薬品、および治療が予防的または治療的であるかを含む多くの異なる要因に応じて変動する。通常、対象はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療することができる。治療投与量は、安全性および有効性を最適化するために当業者に公知の常用的な方法を用いて滴定され得る。一実施形態では、対象には、限定するものではないが、ＤＢＡを有する個体が含まれる。いくつかの実施形態では、対象は小児対象であるが、他の態様では、対象は成人対象である。

本発明のレンチウイルスベクター、宿主細胞もしくは細胞集団または医薬組成物は、連続的に、または特定の時間間隔で投与され得る。単回投与間の間隔は、連日、毎週、毎月または毎年であり得る。間隔はまた、疾患の発症、または上記レンチウイルスベクターの治療効果に応じて不規則であり得る。形質導入された細胞は、形質導入プロセスが完了した直後に注入され得る。有効量の用量および／または用量レジメンは、前臨床アッセイから、安全性試験ならびに漸増および用量範囲試験、個々の臨床医と患者との関係から経験的に容易に決定され得る。インビトロまたはインビボアッセイを使用して、投与のための最適な用量範囲および／またはスケジュールを決定することができる。さらに、有効用量は、動物モデルから得られた用量反応曲線から外挿され得る。

好ましい実施形態では、本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞もしくは細胞集団、または医薬組成物は、少なくとも１×１０^９ベクターゲノム／Ｋｇ体重、好ましくは１×１０^１０、１×１０^１１または１×１０^１２ベクターゲノム／Ｋｇ体重の用量で投与される。さらに好ましくは、少なくともまたは約４．６×１０^１２ベクターゲノム／Ｋｇ体重が投与される。

典型的には、ＤＢＡ患者の変化を達成するための有効量は、約１×１０^８ベクターゲノム以上、場合によっては１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２または１×１０^１３ベクターゲノム以上、ある特定の場合には１×１０^１４ベクターゲノム以上である。場合によっては、送達されるベクターゲノムの量は、最大で約１×１０^１５ベクターゲノム、例えば、１×１０^１４ベクターゲノム以下、例えば、１×１０^１３、１×１０^１２、１×１０^１１、１×１０^１０または１×１０^９ベクターゲノム以下、ある特定の場合には１×１０^８ベクターゲノム、典型的には１×１０^８ベクターゲノム以上である。場合によっては、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０^１０～１×１０^１１ベクターゲノムである。場合によっては、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０^１０～３×１０^１２ベクターゲノムである。場合によっては、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０^９～３×１０^１３ベクターゲノムである。場合によっては、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０^８～３×１０^１４ベクターゲノムである。

一実施形態では、レンチウイルスベクターは、１０^８ベクターゲノム／ｍｌ以上、例えば、５×１０^８ベクターゲノム／ｍＬ；１０^９ベクターゲノム／ｍＬ；５×１０^９ベクターゲノム／ｍＬ、１０^１０ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^１０ベクターゲノム／ｍＬ；１０^１１ベクターゲノム／ｍＬ；５×１０^１１ベクターゲノム／ｍＬ；１０^１２ベクターゲノム／ｍＬ；５×１０^１２ベクターゲノム／ｍＬ；１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；１．５×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；３×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；５×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；７．５×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；９×１０^１３ベクターゲノム／ｍＬ；１×１０^１４ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０^１４ベクターゲノム／ｍＬ以上であるが、典型的には１×１０^１５ベクターゲノム／ｍＬ以下の濃度で投与され得る。

場合によっては、本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞もしくは細胞集団、または投与される医薬組成物は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定され得る。場合によっては、ＭＯＩとは、核酸が送達され得る細胞に対するベクターまたはウイルスゲノムの比または倍数を指し得る。場合によっては、ＭＯＩは１×１０^６であり得る。場合によっては、ＭＯＩは１×１０^５～１×１０^７であり得る。場合によっては、ＭＯＩは１×１０^４～１×１０^８であり得る。場合によっては、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７および１×１０^１８ＭＯＩである。いくつかの実施形態では、範囲は、約２０～約４００ＭＯＩである。場合によっては、本開示の組換えウイルスは、１×１０^８～３×１０^１４ＭＯＩである。場合によっては、本開示の組換えウイルスは、最大で約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３である。いくつかの実施形態では、患者が注入によって投与される細胞の用量は、形質導入プロセスから得られる用量である。様々な好ましい実施形態では、少なくとも約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８個またはそれ以上のＣＤ３４^＋細胞／ＫＧ患者体重が患者に注入される。いくつかの実施形態では、１×１０^６～４×１０^６個のＣＤ３４^＋細胞／ＫＧ患者体重が患者に注入される。他の実施形態では、３×１０^５および４×１０^６個のＣＤ３４^＋細胞／ＫＧ患者体重が患者に注入される。

いくつかの実施形態では、医薬組成物の量は、約１×１０^８～約１×１０^１５個の組換えウイルス、約１×１０^９～約１×１０^１４個の組換えウイルス、約１×１０^１０～約１×１０^１３個の組換えウイルス、または約１×１０^１１～約３×１０^１２個の組換えウイルスを含む。

上記範囲の中間の用量も本発明の範囲内であることが意図される。

ＤＢＡに対して遺伝子療法の成功を達成するためには、対象から「十分」な数の造血幹細胞（ＨＳＣ）を採取することが有益である。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＳＣは、動員後に対象から得られる。動員は、骨髄から血液への幹細胞の移動を引き起こす薬物または化合物によって対象を治療することによって達成され得る。幹細胞を採取し、保存することができる。いくつかの実施形態では、動員は、Ｇ－ＣＳＦ（フィルグラスチン（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｎ）によって対象を治療することによって達成される。他の実施形態では、動員は、プレリキサフォルによって対象を治療することによって達成される。さらに他の実施形態では、動員は、フィルグラスチムとプレリキサフォルとの組合せによって対象を治療することによって達成される。

本発明のレンチウイルスベクター、本発明の宿主細胞もしくは細胞集団、または医薬組成物の投与量および投与頻度は、治療が予防的または治療的であるかに応じて変動し得る。予防的適用では、本明細書に提供されるレンチウイルスベクターを含有する組成物は、対象の耐性を増強するかまたは疾患の影響を最小限に抑えるために、まだ疾患状態にない対象に投与される。このような量を「予防有効用量」と定義する。比較的低い投与量が、長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与される。一部の対象は、生涯にわたって治療を受け続け得る。

いくつかの実施形態では、細胞を本発明によるレンチウイルス、ポリヌクレオチドまたは組成物と接触させる方法が提供される。上記のように、接触は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで行うことができる。さらに、本発明は、細胞を遺伝子送達ベクター、例えば、本明細書に開示される、または本明細書に記載される転写ユニットを含むＬＶベクターと接触させることを含む、哺乳動物細胞、例えば、ヒト造血幹細胞、または本明細書に記載の他の細胞を形質導入する方法を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、治療される対象から、または別のドナーから予め得られた。特定の実施形態では、対象はＤＢＡと診断され、細胞は、ヒトＲＰＳ１９遺伝子またはヒトＲＰＳ１９ ｃＤＮＡをコードする発現カセットを含むＬＶによって形質導入される。開示される方法、例えば、ＲＰＳ１９ ｃＤＮＡ配列を使用して、対象にＲＰＳ１９遺伝子産物を送達するために使用される方法はまた、ＤＢＡを治療するために使用され得ることが理解される。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、形質導入された後に該細胞によって治療される、ＤＢＡを有する対象から得られた細胞の集団である。細胞は、骨髄または血液から得られてもよい。ある特定の実施形態では、ＤＢＡを有する対象が、幹細胞を動員するための薬剤によって治療され、次いで、血液が対象から採取され、赤血球が除去され、ＣＤ３４^＋細胞が選択される。選択後、細胞が形質導入される。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、使用前に保存または凍結されるが、ある特定の実施形態では、形質導入された直後、または形質導入されて程なく、例えば、１時間、２時間または４時間以内に対象に提供される。

本発明の他の実施形態は、本明細書の考察、および本明細書に開示される本発明の実施から当業者には明らかであろう。本明細書および例は、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および趣旨とともに、例示的なものとしてのみ考慮されることが意図される。

例
例１－材料および方法
１．レンチウイルスベクター構築
ＲＰＳ１９ハプロ不全患者を対象とした臨床使用に適した２つの治療用レンチウイルスベクターが開発されている。これらの２つのベクターは、ヒトＲＰＳ１９遺伝子（ＤＢＡ患者の２５％で変異）のコドン最適化バージョンを有する。これらのＬＶでは、ＲＰＳ１９の発現は、ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ ＬＶ）ではヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）によって、またはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ ＬＶ）ではヒト伸長因子－１アルファプロモーターの短縮バージョン（ＥＦ－１アルファ短縮またはＥＦ１α（ｓ））によって促進される。さらに、両ベクターは、そのｍＲＮＡを安定化することによって目的のタンパク質の産生を増加させる変異Ｗｐｒｅ配列（Ｗｐｒｅ＊）を有する（図１を参照）。

２つの異なるプロモーターを選択した理由は、それらが目的の導入遺伝子の発現を導くことができた強度であった。一方で、本発明者らは、目的の遺伝子の安定な発現を示すＰＧＫプロモーターを有する。第２に、ＥＦ１αプロモーターをそのさらに大きな活性のために選択した。

これらのベクターは自己不活性化レンチウイルスベクターである。それらを、本発明者らの研究室で開発され、ＰＫＬＲ遺伝子のコドン最適化バージョンを有するレンチウイルスベクターから作製し、Ｄｒ．Ｎａｌｄｉｎｉの研究室（ＨＳＲＴＩＧＥＴ，Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｔｅｌｅｔｈｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｖｉｔａ Ｓａｌｕｔｅ Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）によって構築および提供されたベクターｐＣＣＬ．ｓｉｎ．ｐｐｔ．ｈＰＧＫ．ＥＧＦＰＹ．Ｗｐｒｅ＊から開発した。このベクターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを有した。ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊治療用ベクターの開発における第１の工程は、ＰＫＬＲ遺伝子を抽出すること、ならびに目的の導入遺伝子の配列に対して、設計中に化学合成によって導入した制限標的ＸｂａＩおよびＳａｌＩを使用して、ＲＰＳ１９遺伝子の最適化バージョンを導入することからなっていた。

第２の治療用レンチウイルスベクター（ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ ＬＶ）は、その異なるエレメントとして、その短縮バージョン（ＥＦ１α（ｓ））のヒト伸長因子アルファ（伸長因子１アルファのＥＦ１α）のプロモーターを有する。この場合、ＰＧＫプロモーターをＥＦ１α（ｓ）によって置換するために、ｐ’ＨＲ．ＥＦ１αＳ．ｅＧＦＰ．Ｗｐｒｅ（Ｄｒ．Ａｄｒｉａｎ Ｔｒａｓｈｅｒの研究室によって提供；ＵＣＬ Ｇｒｅａｔ Ｏｒｍｏｎｄ Ｓｔｒｅｅｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ）をテンプレートベクターとして使用して、ＥＦ１α（ｓ）配列をＰＣＲによって増幅した。ＥＦ１α（ｓ）プロモーターを用いて得られた配列にＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩ制限酵素配列標的を導入するために、使用したオリゴの３’末端および５’末端に２つのヌクレオチド塩基（ＥｃｏＲＶ－ＡＴおよび－ＴＣ－ＳａｌＩ）とともに、それらの配列標的を含めた。得られた断片を単離し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ系を使用してクローニングした。ＥＦ１α（ｓ）プロモーターをクローニングした後、ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩ制限酵素標的を使用してこれを単離し、第１の治療用ベクターの骨格からＰＧＫプロモーターを予め抽出することによってクローニングし、こうして、第２の治療用レンチウイルスベクターＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ ＊を作製した。

したがって、本発明の一態様では、コドン最適化ＲＰＳ１９遺伝子（ＣｏＲＰＳ１９）を含有する自己不活性化レンチウイルスベクターによって形質導入された、自己由来ＣＤ３４^＋に富む細胞からなる、ＤＢＡを治療するための遺伝子療法手法が提案される。

１）自己不活性化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ－ＬＶ）は、ガンマレトロウイルスベクターよりも堅牢な発現を提供し、転写サイレンシングの影響を受けにくい（Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２）。それらはまた、はるかに安全な組込みプロファイルを示し（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２００３）、それらが３’ ＬＴＲ配列に有する４００塩基対（ｂｐ）の欠失のために（Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９８）、導入遺伝子発現が内部プロモーターによって調節され、ＬＶに基づく遺伝子改変の安全性が高められる。

２）ベクター配列はまた、標的細胞内の導入遺伝子発現および安全性を改善するためのいくつかの改変を含む：
・患者に対する遺伝子修正ＨＳＣの再注入後のインビボでのその安定な長期発現、および遺伝子療法で使用される他のプロモーターと比較して改善された安全性特性によって既に特徴付けられた、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの使用（Ｂｉｆｆｉ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｍｏｄｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｍｏｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＰＧＫは、導入遺伝子のさらに生理学的な発現と、転写サイレンシングに対するさらに低い感受性とをもたらす（Ｇａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００８）。

・転写時にｍＲＮＡ安定性を増加させるためのＲＰＳ１９タンパク質（ＣｏＲＰＳ１９）をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化バージョン。最適化のために、転写サイレンシングを回避し、したがって、導入遺伝子発現を増加させるために、ＧＣ含有量を増加させ、潜在的スプライス部位を除去するＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ソフトウェアが使用されている。ＣｏＲＰＳ１９最適化配列は、ヒトＲＰＳ１９遺伝子との８１％の相同性を示し、タンパク質のアミノ酸配列に変化はなかった。
・治療用遺伝子の発現レベルおよび安定性を改善するために、いかなる残留オープンリーディングフレームも欠く、ウッドチャック肝炎ウイルスの変異転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ＊）も含める。

１．１ 配列：
１．１．１ エレメント配列
５’ ＬＴＲまたは長末端反復（配列番号１）：レンチウイルスベクター産生中にプロウイルス転写を担う。このレンチウイルスベクター構築物では、５’ ＬＴＲは、キメラ形態のＣＭＶプロモーターと、野生型ＨＩＶ－１ ５’ ＬＴＲ、ＲＵ５の一部とから構成される。野生型５’ ＬＴＲのＵ３配列の欠如は、このレンチウイルスベクター構築物がＴａｔ非依存性であり、したがって、レンチウイルスベクター構築物が第３世代で産生されることを伴う。

・キメラＣＭＶプロモーター（配列番号２）：この配列は、レンチウイルスベクター産生中にプロウイルスの転写をもたらす。これは、２つの異なる配列によって構成され、一方はエンハンサー活性を有し、他方はプロモーター活性を有する。

・ＣＭＶエンハンサー（配列番号３）：

・ＣＭＶプロモーター（配列番号４）：

・ＲＵ５：ＲＵ３を有しない切断型５’ ＬＴＲ（配列番号５）：この配列は、プロウイルスゲノムの逆転写、および形質導入された細胞へのプロウイルスゲノムの組込みに必要である。

ＰＢＳ ＳＬ１２３（プライマー結合部位）（配列番号６）：ｔＲＮＡは、標的細胞形質導入後および細胞ゲノムへの組込み前のプロウイルスゲノムの逆転写中にＰＢＳエレメントに融合される。

Ψ（パッケージングシグナル）（配列番号７）：このエレメントは、レンチウイルスベクター粒子の二量体化およびパッケージングを担う。

ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号８）：Ｒｅｖは、レンチウイルスベクター転写物内のこの配列に融合して、レンチウイルスベクター産生中のプロウイルスの核外輸送を助ける。

ｃＰＰＴ（セントラルポリプリントラクト）（配列番号９）：このエレメントは、標的細胞の形質導入後のレンチウイルスベクターの逆転写中に陽性ＤＮＡ鎖転写のためのプライマーとして作用する。これはまた、プロウイルスＤＮＡの核内取込み、したがって、レンチウイルスベクターの形質導入効果を増加させる。さらに、ｃＰＰＴは、レンチウイルスベクタータイトル（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｉｔｌｅ）を増加させる。

１．１．２。真核生物内部プロモーター（１つまたは別のいずれか）：
・ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）（配列番号１０）：

・その短縮バージョンの伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１α（ｓ））（配列番号１１）：

ＲＰＳ１９のコドン最適化バージョン（ＣｏＲＰＳ１９）（配列番号１２）：

変異Ｗｐｒｅ（ＷＨＶ（ウッドチャック肝炎ウイルス）転写後調節エレメント）（Ｗｐｒｅ＊）（配列番号１３）：ポリアデニル化、核からのＲＮＡ輸送、およびタンパク質合成の改善により、形質導入された細胞内の導入遺伝子発現を増加させる。これは、安全性を高めるために遺伝子Ｘフレームに変異を含有する。

３’ ＬＴＲ：ＤＲ３ＲＵ５（配列番号１４）：３’ ＬＴＲは、レンチウイルスベクター産生中のｍＲＮＡポリアデニル化に関与する。この場合、３’ ＬＴＲは、切断型Ｕ３エレメントと、野生型ＨＩＶ－１由来のエレメントＲおよびＵ５とから構成され、自己不活性化レンチウイルスベクターである。組み込まれたウイルスゲノムは、ウイルスプロモーター領域（Ｕ３）に欠失を含有し、形質導入された細胞内の潜在的にパッケージング可能なウイルスゲノムの転写不活性化をもたらす。

・ΔＵ３（配列番号１５）：

・ＲＵ５（配列番号１６）：

ＳＶ４０ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（配列番号３３）：

１．１．３ 全ＦＡＳＴＡベクター配列
Ａ）ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊－ＬＶ配列（配列番号１７）：





Ｂ）ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊－ＬＶ配列（配列番号１８）

２。レンチウイルス産生
ＨＥＫ２９３Ｔ株をパッケージング細胞として設定した第３世代を使用して、レンチウイルスを作製した。ＣａＣｌ２ ＤＮＡ沈殿法によって必要とされる様々なプラスミドを移入する６０～７０％の細胞コンフルエンスを用いて、１５０ｍｍディッシュ（ｐ１５０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で産生を行った。

使用したプラスミドは、Ｄｒ．Ｌ．Ｎａｌｄｉｎｉ（ＨＳＲ－ＴＩＧＥＴ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）の厚意により提供され、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｆａｃｔｏｒｙによって産生された。使用したプラスミドは、移入プラスミド（目的の導入遺伝子；３７μｇ／ｐ１５０）、ｒｅｖプラスミド（ｐＲＳＶ－ＲＥＶ；９μｇ／ｐ１５０）、ｇａｇおよびｐｏｌプラスミド（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ；２３．５μｇ／ｐ１５０）ならびにＶＳＶエンベローププラスミド（ｐＭＤ２－ＶＳＶＧ；１２．３μｇ／ｐ１５０）であった。プラスミドを４５７μｌ／ｐ１５０のＣａＣｌ２ ２．５Ｍ、および３．２ｍｌ／ｐ１５０の水と混合した。その後、３．６ｍｌ／ｐ１５０のＨＢＳ ２×（２８１ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７）を混合物に滴下して、Ｃａ２＋／ＤＮＡ－沈殿物を生成し、この溶液をＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物に添加した。

５～６時間後、培地を除去し、新鮮な回収培地（５％ＨｙＣｌｏｎｅを補充したＩＭＤＭ）を添加した。上清をトランスフェクションの４８時間後に採取し、遠心分離し（４５０ｇ、７分）、濾過して（０．２２μｍ、ＰＥＳ、Ｍｅｒｃｋ）、細胞残留物を除去した。Ｕｌｔｒａ－ｃｌｅａｒチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した超遠心分離（７００００ｇ、２時間、２０℃；Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００ ＸＰ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｕｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって上清を濃縮した。１００～３００μＬの生理食塩水（ＮａＣｌ ０．９％）を用いてウイルスペレットを再構成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（マルチプルウェルプレートサイズ２４で１５０～１８０，０００細胞／ウェル；ＦＡＬＣＯＮ）に対するベクターの段階希釈（１０－２～１０－６）によって、ウイルスを滴定した。ＧＦＰ標識ベクターの場合、形質導入後４８～７２時間のフローサイトメトリー測定値に基づいて、以下の式を適用して形質導入単位（ＴＵ）を計算した。

３。レンチウイルスベクター滴定
ＨＥＫ２９３Ｔに対してＰＧＫ－ＣｏＲＰＳ１９ ＬＶ滴定を行った。ＬＶ滴定のために、５×１０^４個の細胞を２４ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、細胞に培養培地中のＬＶの段階希釈物を形質導入し、０日目の細胞数を決定した。形質導入の１４日後、細胞を採取し、製造者の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ（登録商標））を使用してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。

ｑＰＣＲによって、形質導入された細胞に組み込まれたレンチウイルスベクターゲノムの数（ＶＣＮ）を決定した。レンチウイルスベクターゲノムのコピーを分析するために、レンチウイルスベクターのψ配列に対して設計されたプライマー（（配列番号１９）Ｆｗ：5’-CAGGACTCGGCTTGCTGAAG-3’；（配列番号２０）Ｒｖ：5’-TCCCCCGCTTAATACTGACG-3’）およびプローブ（（配列番号２１）5’-CGCACGGCAAGAGGCGAGG-3’）（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。内因性ＤＮＡの量を決定するために、ヒトアルブミン遺伝子に対するプライマー（（配列番号２２）Ｆｗ：5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTG-3’；（配列番号２３）Ｒｖ：5’-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3’）およびプローブ（（配列番号２４）5’-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3’）（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。また、標準曲線を使用して、１試料当たりのψ ＬＶ特異的配列のコピー数と２倍体ゲノム数とを決定し、これにより、細胞１個当たりのＬＶコピー数を計算することができる（ＶＣＮ＝ψのコピー数／２倍体ゲノム数）。最後に、このパラメータに基づいて、以下の式を用いて、１ミリリットル当たりの形質導入単位の数として定義されるＬＶタイトルを計算した：

ψおよびヒトアルブミン配列を含有するＤＮＡ断片の段階希釈物を使用して、ｑＰＣＲデータを外挿するための標準曲線を行った。反応はいずれも、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））で二連で行った。

４。実験動物
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）免疫不全Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス（ＮＳＧ）に、ヒトＣＤ３４^＋細胞を移植した。この系統は、ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪの遺伝的背景に、１つは重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）を引き起こし、もう１つはＩＬ２受容体共通ガンマ鎖の完全な欠如（ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ）を誘発する２つの変異を有する。ｓｃｉｄ変異は、ＤＮＡ修復複合体をコードするＰｒｋｄｃ遺伝子で起こり、Ｂ細胞およびＴ細胞の欠損を引き起こす。ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ変異は、複数の受容体を介したサイトカインシグナル伝達を妨げ、ＮＫ細胞機能不全を引き起こす。重症免疫不全は、ヒトＣＤ３４^＋細胞、患者由来異種移植片、または成体幹細胞および成体組織の生着によってマウスをヒト化することを可能にする。

実験手順はいずれも、当該分野の欧州およびスペインの規制、実験および他の科学的目的で使用される脊椎哺乳動物の使用および保護に関する欧州条約ＥＴＳ １２３、Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ２０１０／６３／ＵＥ、ならびに科学研究における動物の保護および使用に関するスペイン法６／２０１３およびＲｅａｌ Ｄｅｃｒｅｔｏ（Ｒ．Ｄ．）５３／２０１３に従って行った。

５。動物手順
適切な欧州およびスペインの規制：Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ２００９／４１／ＣＥ、ならびにスペイン法９／２００３およびＲ．Ｄ．１７８／２００４に従って、遺伝子改変生物を伴う手順を行った。手順は、あらゆる外部および内部の生物安全性および生物倫理ガイドラインに従ってＣＩＥＭＡＴ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、スペイン政府によって以前に認可された（Ｃｏｄｅ ＰＲＯＥＸ ＃０７０－１５＃染色体不安定性を有する稀な疾患に対する細胞および遺伝子療法）。

ＣＩＥＭＡＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（登録番号ＥＳ２８０７９００００１８３）にマウスを収容し、そこで飼育し、Ｓｐａｎｉｓｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＥＣＡＬ）およびＦｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ（ＦＥＬＡＳＡ、Ｔｏｍｗｏｒｔｈ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の勧告に従って病原体についてルーチンにスクリーニングしたが、病原体は見出されなかった。

制御された環境条件下で、マウスに食物（２５ＫＧｙのガンマ線を照射したＴＥＫＬＡＤ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔ ２９１８）および水（酸性化およびオートクレーブ処理）を自由に与えた。実験プロトコル中、個別に換気されたケージＩＩＬ型のマイクロインシュレーターにマウスを収容し、エアケージを１時間当たり２５回交換した。各ケージに最大６匹のマウスを収容した。室内照明を１３／１１時間の明暗サイクルで制御し、温度および湿度をそれぞれ２０±２℃および５５±１０％に調節した。全室内にＨＥＰＡエアフィルターが存在していた。

マウスを標準食下で（水および食物を自由に摂取させた）維持し、全プロトコルを欧州およびスペインの法律および規制（実験および他の科学的目的で使用される脊椎哺乳動物の使用および保護に関する欧州条約ＥＴＳ １２３、ならびにスペイン法ＲＤ ５３／２０１３）に従って行った。

６。健常ドナーおよびＤＢＡ患者由来のヒト試料
提示した結果に使用したヒト試料は、健常ドナーおよびＤＢＡ患者の両方から得られた末梢血および骨髄、ならびにインフォームドコンセントの下で採取した健常ドナー由来の臍帯血であった。

全試料は、ＣＩＢＥＲＥＲ－ＩＳＣＩＩＩ－Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ ｅｎ Ｒｅｄ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓの資金提供を受け、２０１８年５月８日にＪｉｍｅｎｅｚ Ｄｉａｚ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの倫理委員会によって承認されたプロジェクト「レンチウイルスベクターを用いた、ダイアモンド・ブラックファン貧血に対するエクスビボ遺伝子療法手法の有効性および安全性を実証するための前臨床試験」に関連して使用されている。この評価には、以下が記載されている：
・この試験は、現在の法律（ＣＡＭのＲｏｙａｌ Ｄｅｃｒｅｅ １０９０／２０１５およびＤｅｃｒｅｅ ３９／９４）で定められた要件を満たしている。
・この種の試験における施設の標準的な倫理基準を満たしている。
・ＳＡＳ Ｏｒｄｅｒ ３４７０／２００９およびＤｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに定められた倫理規範を遵守している。

予備希釈モードで１２０μｌの末梢血または骨髄から、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－１０００（商標）血液学的分析装置（Ｓｙｓｍｅｘ，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＤＢＡ患者および健常ドナー由来の試料からの血液学的分析を行った。

７。ＬＶ注射マウスにおけるＶＣＮの決定
動物の殺処分後、様々な組織を採取し（肝臓、脾臓、肺、骨髄、リンパ節、脳、精巣、膵臓および腎臓）、－８０℃で保存した。これらの組織に組み込まれたＬＶゲノムを決定するために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を用いて、製造者の説明書に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。

ｑＰＣＲによって、注射したマウス組織内の組み込まれたレンチウイルスベクターゲノムの数（ＶＣＮ）を決定した。組み込まれたプロウイルスのコピー数を分析するために、レンチウイルスベクターのψ配列に対して設計されたプライマー（（配列番号２５）Ｆｗ：5’ CAGGACTCGGCTTGCTGAAG 3’；（配列番号２６）Ｒｖ：5’ TCCCCCGCTTAATACTGACG 3’）およびプローブ（（配列番号２７）5’-CGCACGGCAAGAGGCGAGG-3’）（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。内因性ＤＮＡの量を決定するために、マウスチチン遺伝子に対するプライマー（（配列番号２８）Ｆｗ：5’ AAAACGAGCAGTGACGTGAGC 3’；（配列番号２９）Ｒｖ：5’ TTCAGTCATGCTGCTAGCGC 3’）およびプローブ（（配列番号３０）5’-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3’）を使用した。１試料当たりのＬＶコピー数および２倍体ゲノム数を決定した後、ＶＣＮを計算した（ＶＣＮ＝ψのコピー数／２倍体ゲノム数）。

ψ配列およびチチン配列を含有するＤＮＡ断片の段階希釈を使用して、標準曲線を行った。反応はいずれも、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））で二連で行った。

８。ＣｏＲＰＳ１９発現の決定
Ｑ－ＰＣＲによって、治療用ベクターによって組み込まれたＣｏＲＰＳ１９導入遺伝子およびその非最適化生理学的バージョンＲＰＳ１９の発現の決定を行った。ＲＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ ＧＭＢＨ）を使用して細胞からＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｖｉｌｏキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して逆転写プロセスを行った。ｃＤＮＡを得た後、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発現分析を行った。内因性ＲＰＳ１９遺伝子および最適化バージョンＣｏＲＰＳ１９の発現を計算するために、Ｌｉｖａｋ（２ΔＣｔ）２０９の相対定量法の変形例を使用した。このために、目的の遺伝子（ｈＲＰＳ１９およびＣｏＲＰＳ１９）および参照遺伝子ｈＧＡＰＤＨの増幅効率を最初に計算した。増幅における１００％の効率を仮定した後、参照遺伝子、この場合はＧＡＰＤＨを用いて、以下の式を使用して、目的の遺伝子の相対発現を正規化する：
ＲＰＳ１９の相対発現＝２^{（ＣＴ ＧＡＰＤＨ）－（ＣＴ ＲＰＳ１９）}
ＣｏＲＰＳ１９の相対発現＝２^{（ＣＴ ＧＡＰＤＨ）－（ＣＴ ＣｏＲＰＳ１９）}

９。プレｒＲＮＡプロセシングのノーザンブロッティングおよびプライマー伸長分析。
ＴＲＩ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出した５μｇの全ＲＮＡを変性アガロースゲル上で分解し、ノーザンブロッティングのために処理した。ノーザンブロットをＦｕｊｉイメージングプレート（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）に曝露し、ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、ｖ ３．１）を使用してホスフォイメージャー（ＦＬＡ－７０００；Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて定量を行った。

１０。フローサイトメトリー
１０．１ ＤＢＡ患者の造血特性評価
表２に明示される６つの異なるパネルを使用して、フローサイトメトリーによって、ＤＢＡ患者および健常ドナーの免疫表現型を分析した。抗体を添加し（表２に示す）、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＡ（０．２％アジ化ナトリウム、Ｍｅｒｃｋ、および１％ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａを含むＰＢＳ）を用いて洗浄した。パネル１および２については、末梢血試料をそれぞれ１：４００および１：１０の比でＰＢＡに予備希釈した。抗体インキュベーション後、塩化アンモニウム緩衝剤（０．１５５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．０１Ｍ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；室温での１０分間のインキュベーション）を用いた溶解工程をパネル３、４、５および６に対して行って、赤血球画分を除去した。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を１μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加して死細胞を同定した。Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてイベントを取得および記録し、細胞数測定データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ）によって分析した。

１０．２ マルチステム分析
表３に反映される抗体の組合せを使用して、フローサイトメトリーによって、ＤＢＡ患者および健常ドナーの骨髄における様々な造血前駆細胞の決定を行った。標識プロトコルは、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＲＳＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得した患者および健常ドナーの試料の免疫表現型決定に使用したものと同様であった。様々な分析を正しく評価するために、分析した細胞の最小数は１×１０^６個であった。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ）によって細胞数測定結果を分析した。

１０．３ 赤血球分化の免疫表現型
表４に明示される抗体の組合せを使用して、フローサイトメトリーによって、赤血球系統に分化した造血前駆細胞の免疫表現型を分析した。

細胞を１００μｌの最終体積に希釈し、４℃で３０分間標識し、ＰＢＡを用いて洗浄した。ＤＡＰＩ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を添加し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてイベントを記録した。結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。

１１。細胞株培養
イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ）、ＨｙＣｌｏｎｅ（１０％；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１％；Ｇｉｂｃｏ）中で、Ｋ５６２細胞株（慢性骨髄性白血病；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－２４３）を増殖させた。細胞を１×１０^５～１×１０^６細胞／ｍｌの濃度で維持した。

イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ）、ＨｙＣｌｏｎｅ（１０％；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１％；Ｇｉｂｃｏ）中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＳＶ４０ Ｔ抗原を有するベクターを複製するのに適したヒト胎児由来腎臓細胞；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－３２１９）を増殖させた。細胞を５×１０^５細胞／ｍｌの濃度で維持した。

インキュベーション条件は、使用した全細胞株について同じであった：３７℃、５％ＣＯ２および９５％相対湿度。

１２。造血前駆細胞および造血幹細胞機能アッセイ
特性評価およびレンチウイルス修正試験ではＤＢＡ患者および健常ドナー由来の末梢血および骨髄試料から、ならびに安全性試験では健常ドナー由来の臍帯血から、ＣＤ３４^＋細胞を得た。最初に、製造者の説明書に従って、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、全血または骨髄のいずれかを密度勾配に供した。次いで、単核細胞バンドを採取し、本明細書ではＰＢＥと呼ばれるＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、Ｓｉｇｍａ）；Ｈｙｃｌｏｎｅ ２％、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭ ＥＤＴＡを用いて洗浄した。単核細胞バンドを得た後、カラムならびにＱｕａｄｒｏＭＡＣＳおよびＯｃｔｏＭＡＣＳ磁気分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに市販のＣＤ３４^＋マイクロビーズキット（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＤ３４^＋細胞画分を分離した。ＣＤ３４^＋細胞を得た後、フローサイトメトリー分析を行って、試料の純度を決定した。このために、アリコートを収集し、４℃で３０分間にわたって抗ＣＤ３４ ＰＥ抗体によって標識し、ＰＢＡを用いて洗浄し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣＤ３４^＋細胞の割合を分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ）によって細胞数測定データを分析した。

低酸素条件下（３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２および９５％相対湿度）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦおよびｈＦｌｔ３、２０ｎｇ／ｍｌ ｈＴＰＯおよびｈＩＬ３（いずれもＥｕｒｏＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｍ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＸ－ＶＩＶＯ ２０培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で細胞を培養した。

３つの異なる手段を使用して、ヒト造血前駆細胞は赤血球系統に分化した（図１１）。第１の培地（１～７日目）は、ｈＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；ＥｕｒｏＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ｈＦｌｔ３－リガンド（１６．７ｎｇ／ｍｌ；ＥｕｒｏＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４、６．７ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ヒトインターロイキン３（ｈＩＬ－３、６．７ｎｇ／ｍｌ；ＥｕｒｏＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒトインターロイキン１１（ｈＩＬ－１１、６．７ｎｇ／ｍｌ；ＥｕｒｏＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）およびヒトエリスロポエチン（ｈ－ＥＰＯ、１．３Ｕ／ｍｌ；Ａｍｇｅｎ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ Ｉ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に基づいた。拡大増殖の７日目に、細胞を、グルタミン（ＩＭＤＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ；Ｇｉｂｃｏを補充；ギブコ）を補充し、ＢＳＡ（１％；Ｓｉｇｍａ）、インスリン（０．０１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ヒトトランスフェリン（０．２ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、β－メルカプトエタノール（９１μＭ；Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％；Ｇｉｂｃｏ）、ｌｉｐｉｄ ｍｉｘ １（１倍；Ｓｉｇｍａ）、エタノールアミン（０．００４％、Ｓｉｇｍａ）、ｈＳＣＦ（５ｎｇ／ｍｌ；ＥｕｒｏＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ｈＩＬ－３（６．７ｎｇ／ｍｌ；ＥｕｒｏＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ｈＩＬ－１１（６．７ｎｇ／ｍｌ；ＥｕｒｏＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ｈＥＰＯ（１．３Ｕ／ｍｌ；Ａｍｇｅｎ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１、２０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびヒドロコルチゾン（１μＭ；Ｓｉｇｍａ）を富化したＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）から構成される第２の培地に移し、１４日目まで培養した。１４日目の後、２日間にわたって、ＢＳＡ（１％；Ｓｉｇｍａ）、インスリン（０．０１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）、トランスフェリンヒト（０．２ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）、β－メルカプトエタノール（９１μＭ；Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％；Ｇｉｂｃｏ）、ｌｉｐｉｄ ｍｉｘ １（１倍；Ｓｉｇｍａ）、エタノールアミン（０．００４％；Ｓｉｇｍａ）およびｈＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ Ａｍｇｅｎ）を補充したＩＭＤＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｇｉｂｃｏ）に基づく第３の培地に細胞を移した。

使用前に、全培地を０．２２μｍフィルターに通して濾過した。細胞の計数およびフローサイトメトリー分析を３、５、７、１０および１４日目に行った。赤血球分化中、細胞を４×１０^５～４×１０^６細胞／ｍｌの濃度に維持した。インキュベーション条件はまた、３７℃、５％ＣＯ_２および９５％相対湿度であった。

ＤＢＡ患者の末梢血中および骨髄内の造血前駆細胞の数を以下のプロトコルに従って評価した：単核造血細胞および／またはＣＤ３４^＋細胞をＸ－ｖｉｖｏ培地に再懸濁し、２５ｍｍ２培養プレート内で末梢血については３×１０^５有核細胞／ｍｌ、骨髄については５×１０^４有核細胞／ｍｌの濃度で、半固体メチルセルロース培地（３０％ウシ胎児血清、１％ＢＳＡ、２ｍＭグルタミン、２－メルカプトエタノール０．１ｎＭ、ＳＣＦ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ－ＣＳＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇ－ＣＳＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－３ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－６ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＥＰＯ ３Ｕ／ｍｌ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉを補充したＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＨＳＣ－ＣＦＵ）に播種した。各試料について、各複製物に１ｍｌを使用して三連にした。低酸素（３７℃、５％Ｏ_２および５％ＣＯ_２、９８％相対湿度）中で１４日間インキュベートした後、位相差Ｎｉｋｏｎ ＥＬＷＤ ０．３倒立顕微鏡を使用して、形成されたコロニーを計数した。結果は、播種した１０^５個の細胞ごとのコロニーの総数の平均として表した。

１３。ＮＳＧマウスに対するヒト造血細胞の移植
単核細胞画分をＤＢＡ患者および健常ドナーの骨髄から得、製造者の説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、密度勾配によって分離した。安全性試験の場合、同じプロセスを使用して臍帯血からＭＮＣを得た。カラムならびにＱｕａｄｒｏＭＡＣＳおよびＯｃｔｏＭＡＣＳ磁気分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに市販のＣＤ３４^＋マイクロビーズキット（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する免疫磁気分離によって、ＣＤ３４^＋画分を得た。生着前に、ＮＳＧマウスに骨髄破壊以下の線量（１．５Ｇｙ）を照射し、２×１０^５個のマウス精製ＣＤ３４^＋細胞を移植した。３０、６０および９０日目に、安全性試験の場合には注入後１２０日目まで、フローサイトメトリーによって、末梢血中および骨髄内のＮＳＧマウスの造血移植片を分析した。ヒト造血移植片のレベルを評価するために、細胞を移植後４、８および１２週目に大腿骨骨髄吸引によって採取し、製造者の説明書に従ってｈＣＤ４５ ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって標識した。製造者の説明書に従ってＤ４５ ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３４ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３３ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１９ ＰＥ－Ｃｙ７およびＣＤ３ ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、多系列移植片分析を行った。対になった蛍光色素アイソタイプを対照として使用した。陽性４’６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）細胞を分析から除外した。フローサイトメトリー分析はいずれも、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行い、ＦｌｏｗＪｏ ｖ７．６．５ソフトウェアを用いて分析した。二次移植を行うために、一次ＮＳＧレシピエントを麻酔し、採血して血液学的結果を得た。麻酔後、それらを頸椎脱臼によって殺処分し、各マウスの後肢から大腿骨および脛骨を取り出した。大腿骨および脛骨の骨髄を各骨を灌流することによって得た。骨髄細胞を得た後、フローサイトメトリーによる細胞分離によってヒトＣＤ４５＋細胞を選択した。精製後、細胞を免疫不全の１．５Ｇｙ照射ＮＳＧマウスに移植して戻した。移植後３０、６０、９０および１２０日目に分析を行った。

１４。組込み部位分析（ＩＳＡ）
インビトロで１４日間拡大増殖させた細胞、ならびに両実験の一次および二次ＮＳＧレシピエントに移植した細胞に対して、これらの組込みの分析を行った。Ｇｅｎｅｗｅｒｋによって分析が行われた。Ｇｅｎｅｗｅｒｋによって使用される技術は、組み込まれたベクターＤＮＡに隣接する未知の領域を増幅および配列決定するＳ－ＥＰＴＳ ／ ＬＭ－ＰＣＲ（剪断伸長第１タグ選択ライゲーション媒介ＰＣＲ（ｓｈｅａｒｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｆｉｒｓｔ ｔａｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ））に基づく。ＤＮＡ試料を、超音波処理によって５００塩基対の断片に断片化し、次いで、組み込まれたベクターのＬＴＲ配列に特異的なビオチン化プライマーを使用してＰＣＲによって増幅する。増幅後、ビオチン化生成物を精製し、生成物を分子標識（バーコード）を含むカセットにライゲーションし、ＭｉＳｅｑ技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用した配列決定を可能にする、プライマーを用いたＰＣＲ増幅の第２の工程に供する。ＩＳ分析のために、１０個の最も高頻度の組込み部位を使用した。

１５。統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、Ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン７．０を用いて統計分析を行った。カラムの統計分析を使用し、Ｄ’ＡｇｏｓｔｉｎｏおよびＰｅａｒｓｏｎ正規性検定、Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ正規性検定ならびにＫＳ正規性検定を適用して、データが正規分布に従っているかどうかを確認するために前もって統計試験を行った。様々な分析における分布を試験した後、マン・ホイットニー統計検定、スチューデントのｔ検定、およびＡＮＯＶＡ検定である最も適切な検定を適用した。Ｐ＜０．０５の場合、差を有意と考えた。

結果を以下の例２～４に記載する。

例２：骨髄ＤＢＡ患者由来の骨髄ＣＭＨの集団の特性評価
一部のファンコニ貧血（ＦＡ）患者では既に観察されているように、ＤＢＡではＨＳＣの数がこれらの細胞の採取をどの程度制限し得るかは依然として不確かであったため、本発明者らは、健常ドナーおよびＦＡ患者と比較して、ＤＢＡ患者由来の骨髄（ＢＭ）試料を最初に特性評価した。

２．１ ＤＢＡ患者由来の骨髄ＨＳＣの集団の決定
この試験で得られた結果から、健常ドナー由来の試料と比較した場合、ＣＤ３４^＋細胞のレベル、およびＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－前駆細胞のさらに原始的な集団が、ＤＢＡ患者由来の骨髄試料では減少しないことが示された。これらの結果（図２を参照）から、患者がＣＤ３４^＋細胞の数の著しい低下を示すＦＡなどの他の疾患で起こることとは対照的に、ＤＢＡ患者を対象にこれらの細胞を得ることは、遺伝子療法試験で使用される、ＤＢＡ患者における臨床的に重要な数のＨＳＣの採取に対する制限を構成しないことを示す。

２．２ ＤＢＡ患者の骨髄内のマルチステムＣＤ３４^＋造血前駆細胞の分析
ＭＨＣ集団は影響を受けているようには見えなかったが、いくつかの試験では、ＤＢＡ患者における赤血球前駆細胞の数の減少、さらには場合によっては疾患の経過中の好中球減少症および血小板減少症が記載されている（Ｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｓａｎｔｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｔｓａｉ，Ａｒｋｉｎ，ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ １９８９）。ＤＢＡ患者を対象として造血前駆細胞をさらに試験するために、中間造血前駆体の集団（Ｄｏｕｌａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１２）を分析した。本発明者らの結果は、これらの集団のいずれにも有意な減少がないことを示した（図３を参照：ａ）、ＨＳＣ（造血幹細胞：Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－）、ｂ）ＭＰＰ（多能性前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－Ｔｈｙ－１^－ＣＤ４５ＲＡ^－Ｆｌｔ３^＋ＣＤ７^－ＣＤ１０^－）、ｃ）ＭＬＰ（多能性リンパ球性前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－Ｔｈｙ１^ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ^－Ｆｌｔ３^＋ＣＤ７^－／＋ＣＤ１０^－）、ｄ）ＣＭＰ（骨髄系共通前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋Ｔｈｙ－１^－ＣＤ４５ＲＡ^－Ｆｌｔ３^＋ＣＤ７^－ＣＤ１０^－）、ｅ）ＭＥＰ（赤血球前駆細胞および巨核球前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋Ｔｈｙ^－１^－ＣＤ４５ＲＡ^－Ｆｌｔ３^－ＣＤ７^－ＣＤ１０^－）およびｆ）ＧＭＰ（顆粒球系－単球系前駆細胞：ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^＋Ｔｈｙ－１^－ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｆｌｔ３^＋ＣＤ７^－ＣＤ１０^－））。

２．３ ＤＢＡ患者の骨髄内の委任造血前駆細胞の分析
ＣＤ３４^＋細胞の数がＤＢＡ患者の骨髄内で有意に影響を受けないことを確認した後、次に評価する点は、インビトロクローン形成アッセイによるその機能性であった。様々な試験により、ＤＢＡ患者由来のＣＤ３４^＋細胞が赤血球前駆細胞を生成する能力が低下することが観察されている（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｉｓｋａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｒｕｇｇｅｒｏ ａｎｄ Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ２０１４）。赤血球前駆細胞数（ＢＦＵ－Ｅ、バースト形成単位－赤血球前駆細胞）の極めて有意な減少があるため（図４ｂ）、本発明者らの結果はこの観察結果と一致した（図４）。骨髄系統の前駆細胞に関して（ＣＦＵ－ＧＭ、顆粒球－マクロファージ前駆細胞コロニー形成単位）（図４ａ）、結果は、健常ドナーと比較して減少を示したが、ＢＦＵ－Ｅに観察されたものよりもはるかに顕著ではなかった。

２．４ ＤＢＡ患者由来のＨＳＣの生着および分化能の分析
ＤＢＡ患者を治療するための成功した遺伝子療法プロトコルは、修正された細胞の生着を必要とすることを考慮することが重要である。したがって、本発明者らは、材料および方法のセクションで詳述されているように、免疫不全ＮＳＧマウスを対象として、これらの細胞の集団化能力を最初に評価した。本発明者らの結果は、ＤＢＡ患者由来の骨髄由来細胞と健常ドナー由来の骨髄由来細胞との間に移植後最初の６０日間に有意差はなかったが、９０日目に実験終了に達した際に、ＤＢＡ患者の細胞の生着レベルで有意な減少が観察され（図５ａ）、これにより、これらの患者の方がＭＨＣの長期再増殖能が低いことが示され得ることを示した。再増殖能は移植後９０日で低下を示したが、分化能では同じことは起こらなかった。図５ｂは、ヒトＣＤ４５^＋細胞内で生成された様々な系統の割合を示し、ＤＢＡ患者由来の細胞と健常ドナー由来の細胞との間に有意差がないことを示している。これらの結果は、移植されたＤＢＡ患者のＣＤ３４^＋集団の分化能が健常ドナーに観察されたものと同様のままであることを示した。

結論として、この節で得られた結果は、ＨＳＣの採取がＤＢＡ患者では顕著な制限を構成するはずがないことを予測することを可能にする。原則として、試験した試料では、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－細胞の含有量、または特定の系統に委任された未成熟前駆細胞の含有量の減少はない。ただし、造血前駆細胞の数が減少していないにもかかわらず、主にＣＦＵ－ＧＭおよびＢＦＵ－Ｅのレベルでのクローン形成能の低下から、この集団の赤血球形成能の低下を見て取ることができる。これに伴い、高度に不良な再増殖能が観察されている、ＦＡ患者由来の細胞とは異なり、形質導入されていないＤＢＡ患者由来の細胞は、免疫不全マウスでは高い再増殖能を維持することに留意すべきである（Ｒｉｏ ｅｔ ａｌ．２０１９）。

例３：治療的に臨床的に適用可能なレンチウイルスベクター（ＬＶ）の作製：Ｋ５６２細胞株、およびＤＢＡ患者由来のＲＰＳ１９－ハプロ不全ＣＤ３４^＋細胞を対象とした有効性試験
遺伝子療法プロトコルを使用して修正され得る、ＤＢＡ患者から機能的ＨＳＣを採取するという現実的な実現可能性によって裏付けられて、本発明者らは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、またはその短縮バージョンの伸長因子アルファ（ＥＦ１α（ｓ））の制御下で、ＲＰＳ１９遺伝子のコドン最適化バージョンを使用して、２つの臨床的に適用可能なレンチウイルスベクター（ＬＶ）を開発することを決定した。

３．１ ＲＰＳ１９について干渉されたＫ５６２細胞株を対象とした治療用ベクターの機能性の分析
最初に、最適化コドンバージョンのＲＰＳ１９遺伝子（ＣｏＲＰＳ１９；最適化コドンＲＰＳ１９）からなる治療用ベクターによって目的の導入遺伝子を発現する能力を確認した。これを行うために、Ｋ５６２細胞に、ＲＰＳ１９発現に干渉する２つの特異的ｓｈＲＮＡ配列を有する２つのレンチウイルスベクター（ＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９およびＬＶ－ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｅ ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ｓｈＲＰＳ１９）を最初に形質導入し、このようにしてＤＢＡモデルを作製した。その後、ＲＰＳ１９の発現が影響を受けたこれらの細胞を治療用ベクターによって修正した。

ＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９ベクターによる干渉は、図６ａに示すように、５０～６０％のレベルでＲＰＳ１９遺伝子のｍＲＮＡレベルを弱めることができることを示した。この結果と併せて、治療用ベクター（導入遺伝子ＣｏＲＰＳ１９）の発現は、干渉細胞では、干渉しないが治療用ベクターによって形質導入された対照条件、および治療用ベクターによって干渉され、その後修正された条件の両方で確認された（図６ａ）。

この同じ試験を第２のベクターＬＶ－ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｅ ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ｓｈＲＰＳ１９について行ったところ、ＲＰＳ１９遺伝子の９５％のｍＲＮＡサイレンシングを示すさらに高い干渉能が確認された（図６ｂ）。ただし、目的の遺伝子に干渉するこの能力を以ってしても、最適化バージョンのＣｏＲＰＳ１９の分析は以前の実験と同じ結果を示し、治療用ベクターによって形質導入された条件下でＣｏＲＰＳ１９配列の発現のみが観察された（図６ｂ）。

３．１．１ ＲＰＳ１９遺伝子において干渉され、治療用ベクターによって修正されたＫ５６２株を対象としたリボソーム生合成プロセスの分析
ブラックファン・ダイアモンド貧血患者の細胞は、リボソーム生合成プロセスの欠損を特徴とするため、まず、ＲＰＳ１９の発現が干渉されたＫ５６２細胞におけるこのプロセスの関与の程度を試験した。このために、本発明者らは、作製した２つの干渉ベクターによって形質導入されたＫ５６２細胞の試験を続行した。並行して、Ｋ５６２干渉細胞を治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって修正する場合に、効果の逆転の可能性を分析した。

これらの試料の分析により、干渉を受けた細胞では、２１ＳプレｒＲＮＡの蓄積があることが明らかにされた。干渉ベクターＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９は、非特異的ヘアピン（スクランブル）を形質導入するかまたはそれに干渉することなく、対照Ｋ５６２細胞に観察されるものよりも顕著に大きい２１ＳプレｒＲＮＡの蓄積を生成する。Ｋ５６２細胞が、干渉されたか否かにかかわらず、２つの治療用ベクターのいずれかによって形質導入された場合、プレ２１Ｓ ｒＲＮＡのレベルは、対照条件で観察されたレベルと同様のレベルを示した（図７ａ）。

ＬＶ－ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｅ ＴｕｒｂｏＧＦＰ（商標）ｓｈＲＰＳ１９干渉ベクターによって細胞に干渉した場合、干渉細胞内の２１Ｓ ／ ２１Ｃ プレｒＲＮＡの蓄積は、ベクターＬＶ－ＴＨＭ．ｓｈＲＰＳ１９によって細胞に干渉した場合に観察されたものの２倍超であった。これらの条件下であっても、細胞を治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入した場合、２１ＳプレｒＲＮＡレベルが条件対照と同様の値を示し（図７ｂ）、ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊がベクターＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊よりも顕著な回復を常に示したことは注目に値する。

３．２ ＤＢＡ患者の細胞に対するレンチウイルス遺伝子療法の有効性試験
細胞株におけるＰＧＫ治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊の機能性が決定された後、次の工程は、ＤＢＡ患者の一次細胞を対象としてこれらの試験を継続することであった。様々なＤＢＡ患者の骨髄細胞に対してこれらの試験を行った。これらの実験の目的は、１）ＤＢＡ患者の造血前駆細胞を形質導入する可能性を評価すること、２）治療用ベクターが造血前駆細胞内で毒性を有するかどうかを確認すること、３）これらの細胞の表現型の逆転の程度を評価すること、および４）修正された細胞がインビボ異種移植モデルに生着することができたかどうかを評価することであった。

３．２．１ 治療用ベクターによって形質導入された、ＤＢＡ患者の造血前駆細胞のクローン形成能（ＣＦＣ）の分析
ＤＢＡ患者の造血前駆細胞に対する形質導入の効果を評価するために、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ならびに対照ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって、ＤＢＡ患者由来のＢＭ ＣＤ３４^＋細胞を形質導入した。次いで、クローン形成アッセイを行って、異なる治療用ベクターによる形質導入がＣＤ３４^＋細胞のクローン形成能を改変したかどうかを確認した。ＤＢＡ患者のＣＤ３４^＋細胞によって生成されたコロニーの数は、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって翻訳した場合に減少しなかったという事実は、これらのベクターによって媒介される毒性が存在しないことを示した（図８）。形成されたコロニーの総数の決定により、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊による形質導入が、対照ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された細胞と比較してコロニーの数を増加させ、ベクターＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された試料中のＢＦＵ－Ｅコロニー数の差が顕著であったことが明らかにされた（図８ｂ）。

３．２．２ 治療用ベクターによる形質導入後のＤＢＡ患者の造血前駆細胞におけるプロウイルスのコピー数（ＶＣＮ）、および形質導入の割合の決定
初代ＣＤ３４^＋細胞、特に骨髄不全を有する患者の細胞の形質導入における本発明者らの実験室の経験は、ＤＢＡ患者由来のこれらの細胞の形質導入の最適化されたプロトコルの使用を可能にした。ＤＢＡ患者の造血前駆細胞におけるこのプロトコルの効率を決定するために、Ｑ－ＰＣＲプロウイルスパッケージングシグナル（Ψ）を検出することによって、形質導入された細胞内の組み込まれたベクターのコピー数（ＶＣＮ）を決定した。これらの分析は、１４日間にわたる液体培養物中のＣＤ３４^＋形質導入^＋拡大増殖細胞のセット、およびクローン形成アッセイで得られた個々のコロニーの両方に対して行った。これらのコロニーから、形質導入の割合を決定し、総数と対比して、プロウイルスに対して陽性のコロニーの数を定量した。

形質導入効率の決定により、７７．９３％のＣＦＣがＰＧＫベクターＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入されていること、および５７．７９％のＣＦＣがｖｅｃｔｏｒ ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入されていること、ＰＧＫベクター対照ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊では４８．８５％のＣＦＣが形質導入されていることが明らかにされた（図９ａ）。液体培養（図９ｂ）および採取されたコロニー（図９ｃ）の両方におけるレンチウイルスベクターのコピー数の検出は、全条件下で細胞１個当たり約２コピーのプロウイルスの存在を示した。各患者の個々のＣＤ３４^＋細胞形質導入結果を表５に列挙する。

３．２．３ ＤＢＡ患者における造血前駆細胞の増殖に対する形質導入の効果の分析
これらの実験では、治療用ベクターによる相補性が、修正されていないものよりも修正された造血前駆細胞のインビトロ増殖上の利点を生じたかどうかを分析した。ＰＧＫ治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊の両方、ならびにベクター対照ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によってＣＤ３４^＋細胞を形質導入した後、これを１４日間液体培養で維持した。増殖曲線分析により、ＰＧＫ治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ならびにベクター対照ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された造血前駆細胞の細胞増殖に経時的な有意差はないことが明らかにされた（図１０）。

３．２．４ 治療用ベクターによって修正された、ＤＢＡ患者の造血前駆細胞における赤血球分化の分析
ＤＢＡ患者由来の細胞の赤血球分化の過程は、比較的少数の赤血球を生成する赤血球前駆細胞の成熟段階における妨害を示す。したがって、治療用ベクターが、修正されていない細胞と比較して赤血球分化の妨害を逆転させることができるかどうかを分析した。

この過程を決定するために、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ならびに対照ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって、ＤＢＡ患者由来の骨髄由来ＣＤ３４^＋細胞を形質導入した。形質導入後、赤血球分化を促進する培地中で細胞を増殖させ、赤血球分化過程に特徴的な以前に記載されたマーカーＣＤ４５、ＣＤ３６、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）およびＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ；ＧＰＡ）を使用してフローサイトメトリーを使用して、赤血球分化過程の異なる段階を分析した。

以下の戦略、すなわち、第１の選択では赤血球系統に分化している細胞であるＣ３６^＋／ＣＤ４５^－を使用して、細胞数測定分析を行った。細胞群Ｃ３６^＋／ＣＤ４５^－内では、第１のウィンドウが赤血球前駆細胞に対応する事象ＣＤ７１^＋／ＣＤ２３５ａ^＋を収集し、第２のウィンドウが網状赤血球および成熟赤血球に対応する事象ＣＤ７１^－／ＣＤ２３５ａ^＋を収集する２つのウィンドウを選択する（図１１）。

ＤＢＡ患者の造血前駆細胞における赤血球分化過程の決定により、２つの観察結果が明らかにされた。治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された試料は、対照ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された条件よりも高い割合の成熟赤血球（ウィンドウＣＤ７１^－／ＣＤ２３５ａ^＋）を有する（図１１）。この事実は、ＣＤ７１^＋／ＣＤ２３５^＋相とＣＤ７１^－／ＣＤ２３５^＋ａ相との間の赤血球前駆細胞の成熟の妨害が、治療用ベクターによる形質導入によって逆転されることを示唆している。

３．３。治療用ベクターによって形質導入され、免疫不全ＮＳＧマウスに移植された、ＤＢＡ患者の造血前駆細胞の血液学的表現型の分析。
治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊またはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊による形質導入のプロセスが、ＲＰＳ１９についてハプロ不全を有する患者のＣＭＨの再増殖能に影響を及ぼすかどうかを試験するため、ＮＳＧ免疫不全マウスに対して形質導入細胞移植を行った。

３．３．１ 治療用ベクターによって形質導入された、ＤＢＡ患者のＣＤ３４^＋骨髄細胞の再構成能の分析
これらの実験のために、ＤＢＡ患者由来のＣＤ３４^＋細胞を、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ならびに対照ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入し、ＮＳＧ免疫不全マウスに移植した。３０日目および６０日目に、大腿骨穿刺によって骨髄試料を得、９０日目にマウスを屠殺した。

移植マウスの骨髄内のヒトＣＤ４５＋細胞の割合^＋の試験により、これらの修正された細胞の再増殖能が明らかにされ、移植後９０日目まで、治療用ベクターを補充した試料とＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入した試料との間に有意差は観察されなかった（図１２を参照）。治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ならびにベクター対照ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって修正された造血前駆細胞が異なる系統を生成する能力も調査した。図１２は、ＣＤ３４^＋の多能性能、および骨髄系細胞（ＣＤ３３^＋）またはｂリンパ球性（ＣＤ１９^＋）を生成する能力が、形質導入された細胞の全群で類似していたことを示す。

３．３．２ ＮＳＧマウスにおける形質導入された細胞および移植されたＤＢＡ患者細胞を対象としたベクターコピー数分析
以下のプロセスによって、前の節で得られた移植片が本発明者らの治療的に形質導入された細胞に対応することの確認を得た。移植後９０日目にマウスを殺処分した後、選別（フローサイトメトリーによる目的の集団の選択）によって移植マウスのヒト骨髄ＣＤ４５^＋集団を選択した。移植されたヒト細胞を得た後、ＶＣＮをＱ－ＰＣＲによって決定した（図１３）。治療用ベクターによって形質導入され、ＮＳＧマウスに移植された、患者の細胞におけるＶＣＮの測定により、移植後９０日目に、治療用ベクターの組込みが、ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊については平均して細胞１個当たり約２コピー、ベクターＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊については細胞１個当たり１コピーのレベルで観察されることが明らかにされた。

例４：ＤＢＡ患者に対するＨＣＭ遺伝子療法に関連する安全性試験
４．１ インビトロ安全性試験
本発明者らがレンチウイルスベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊を用いてＤＢＡ患者由来のＭＨＣの形質導入の安全性を評価することを可能にする試験を行うために、健常ドナー由来の臍帯血から得られたＣＤ３４^＋細胞の形質導入の実験を最初に行った。

４．１．１ 治療用ベクターを用いた健常ドナーおよび形質導入ドナーの造血前駆細胞のクローン形成分析
両治療用ベクターによる形質導入が健常ドナーの造血前駆細胞に対して毒性作用を示したかどうかを分析するために、２つの治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊もしくはＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊または対照ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によってＣＤ３４^＋細胞を形質導入した。

形質導入された細胞から生成されたコロニーの数の決定は、ＣＦＵ－ＧＭの数（図１４ａ）が全ベクターと同様であることを示した。ただし、ベクターＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された細胞では、ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された細胞と比較して、ＢＦＵ－Ｅの数に２０．３２％の有意な減少が観察された（図１４ｂ）。

４．１．２。健常ドナー由来のＣＤ３４^＋細胞のコロニーおよび形質導入後液体培養物におけるプロウイルスのコピー数およびＣｏＲＰＳ１９の発現レベルの分析。
形質導入レベルが異なる条件間で同等であることを検証するために、コロニーおよび液体培養物を対象に、細胞コピー数当たりのベクターを分析した。以前の実験から採取された個々のコロニーから作成された細胞１個当たりのＶＣＮの決定は、陽性コロニーとして細胞１個当たり０．３コピーを超える値を有するものを取ると、ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊を用いたコロニーの形質導入効率は８５．９％であり、ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊の有効性は７７．０３％であることを示した。ベクターＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊では、その形質導入効率は６７．８３％であり、これは、対照ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊および治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって示されるものよりも有意に低かった（図１５ａ）。

液体培養物の分析で観察された平均コピー数は、条件ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊では細胞１個当たり３．４０±０．９１コピー、条件ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊では５．８０±１．８０コピー、条件ＥＦα（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊では２．００±０．４９コピーであり、これは先の２つのベクターに示されたものよりも有意に低かった（図１５ｂ）。

以下の３つの実験では、対照ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊を参照として、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊による形質導入に基づいて、ＣｏＲＰＳ１９導入遺伝子の発現を決定した。図１５ｃに見ることができるように、ＲＰＳ１９遺伝子の最適化バージョンに対応するｍＲＮＡの発現は、治療用ベクターによって形質導入された細胞にのみ観察される。さらに、組み込まれたコピー数の関数として、各ベクターのＣｏＲＰＳ１９導入遺伝子の発現を決定した。図１５ｃは、治療用ベクターによって誘導されたＣｏＲＰＳ１９発現レベルが類似していたことを示す。

４．１．３。治療用ベクターおよび対照ベクターによって形質導入された、健常ドナー由来のＣＤ３４^＋細胞の細胞増殖の分析
これらの実験では、本発明者らは、治療用ベクターによる形質導入後のＣＤ３４^＋細胞の増殖を調査した。このために、形質導入されたＣＤ３４^＋細胞を培養し、３週間にわたって１週間に１回、液体培養物中の細胞数を定量した。

図１６に示すように、治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊ならびに対照ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された細胞の増殖は、有意差を示さなかった。

４．２ インビボ安全性試験
４．２．１。治療用ベクターによって形質導入された、健常ドナー由来のＣＤ３４^＋細胞の再増殖能の分析
形質導入された健常ドナーＭＨＣの再増殖能を分析するために、これらの細胞を免疫不全ＮＳＧマウスに移植した。移植後３０、６０、９０および１２０日目に、一次レシピエントに移植されたヒトＣＤ４５^＋細胞の割合を決定した。同様に、これらの一次レシピエント由来の骨髄細胞を二次レシピエントに移植して戻して、長期再増殖能を試験した（二次移植後３０および１２０日）。

図１７ａに示すように、異なる実験群間で一次レシピエントの移植片レベルに有意差は観察されなかった。二次レセプター分析により、対照ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された細胞では、ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された細胞と比較して、二次移植後１２０日目の時点で生着レベルが有意に低いことが明らかにされた。おそらく、観察された有意差は、ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊によって得られた高い不均一性と比較して、ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された細胞群における結果の均一性に起因する。

以前の分析と併せて、移植された細胞によって生成された様々な系統の定量を行ったが、一次レセプターでも二次レセプターでも分化能の有意差は観察されなかった（図１７ｂ）。

４．２．２。治療用ベクターによって形質導入された、健常ドナー由来のＣＤ３４^＋細胞を移植したＮＳＧマウスを対象としたプロウイルスコピー数分析
以前の実験のＮＳＧマウスを殺処分した後、骨髄を得、細胞１個当たりのＶＣＮを決定して、移植された細胞が治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊およびＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊のプロウイルス配列を有することを確認した。

図１８に見ることができるように、ＶＣＮＶＣＮ／細胞の決定は、対照ベクターＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊（２．６±１．８７コピー）によって形質導入された細胞で検出されたプロウイルスのコピー数と、ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（５．９±１．８コピー）によって形質導入された細胞で検出されたプロウイルスのコピー数との間に有意差を示したが、これらの差は、ベクターＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊（５．６５±３．６７）では観察されなかった（図１８）。

４．２．３。健常ドナーの臍帯に由来し、治療用ベクターによって形質導入されたＣＤ３４^＋細胞を移植したＮＳＧマウスにおける体重および血液学の変動の分析。
移植された動物の健康状態を評価するために、一次レシピエントでは殺処分日まで３０日ごとに、二次レシピエントでは３０および１２０日目に、移植されたＮＳＧマウスの体重および血液学を評価した。

形質導入された細胞を移植されたＮＳＧマウスの体重の決定により、図１９に示すように、異なる条件間に有意差がないことが明らかにされた。

一次および二次ＮＳＧレセプターで決定された血液学的パラメータは、赤血球、血小板、白血球または好中球の一次レセプターに有意差がないことを示した（図２０）。ただし、二次レセプターの分析は、対照群ＰＧＫ．ＥＧＦＰ．Ｗｐｒｅ＊とベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊に対応する群との間で赤血球数およびヘモグロビン濃度の有意なわずかな増加を示した。これにもかかわらず、赤血球系統に対応する他のパラメータ（ＨＣＴ、ＭＣＶ）のいずれも、群間で有意差を示さなかった。

４．３ 遺伝毒性試験：ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された、健常ドナー由来の造血細胞のゲノムに対するプロウイルスの組込みの分析。
治療用ベクターＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入され、前の節に示したＮＳＧマウスに移植された、健常ドナー由来のＣＤ３４^＋細胞を対象として、ベクター組込み部位の分析を行った。Ｇｅｎｅｗｅｒｋは、可能性のある腫瘍形成事象またはクローン優性事象を評価するために、最も一般的な組込み部位の分析を行った。２つの試料タイプ、すなわち、移植前液体培養で維持された細胞、および移植マウスに存在するヒトＣＤ４５^＋細胞に対して試験を行った。分析のために、各試料の１０個の最も一般的な組込み部位（各々の上位１０個を決定するために使用した１１４個の遺伝子のリスト）を参照した。

ＮＳＧマウスを対象とした移植前安全性実験から得られた液体培養試料を用いて、最初の組込み部位分析試験を行った。これらの液体培養試料では、組込み部位の最も高い寄与は上位１として４．３７％に相当し、クローン優性の徴候は示されなかった。移植された一次および二次レシピエントに存在するヒト＋細胞から第２の分析を行った。一次レシピエントについては、組込み部位分析により、最も高い寄与が全体の５．００９％を占めることが明らかにされた。二次レシピエントについては、最大の寄与は３２．３３％であった。

一般的な組込み部位（ＣＩＳ）の分析により、１０個の主なシス領域に関して多様な組成が明らかにされ、１０個の主なシス領域のいずれも、クローン増殖または発癌プロセスなどの有害事象に関連しなかった。これに伴い、近くの遺伝子への特異的な組込みもなく、他の遺伝子療法試験（ＣＣＮＤ２、ＬＭＯ２、ＭＤＳ１／ＥＶＩ１（ＭＥＣＯＭ）、ＭＮ１）に記載されている有害作用に関与する特異的な組込みもなかった。

要約すると、ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊によって形質導入された試料（液体培養で維持された試料、およびＮＳＧマウスに移植された試料の両方）は、ポリクローナル組込みパターンを示し、安全性実験３の二次レシピエントに移植された試料のうちの２つではさらに強力なクローン増殖が観察され、ＩＳ上位１の相対的寄与は３２．３３６％に達した。

配列表２ ＜２２３＞キメラＣＭＶプロモーター
配列表３ ＜２２３＞ＣＭＶエンハンサー
配列表４ ＜２２３＞ＣＭＶプロモーター
配列表５ ＜２２３＞ＲＵ３を有しないＲＵ５．切断型５’ ＬＴＲ
配列表６ ＜２２３＞ＰＢＳ ＳＬ１２３（プライマー結合部位）
配列表７ ＜２２３＞パッケージングシグナル
配列表１０ ＜２２３＞ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターＰＧＫ
配列表１１ ＜２２３＞伸長因子アルファ短縮プロモーター（ＥＦ１α（ｓ））
配列表１２ ＜２２３＞ＲＰＳ１９のコドン最適化バージョン（ＣｏＲＰＳ１９）
配列表１３ ＜２２３＞変異Ｗｐｒｅ（Ｗｐｒｅ＊）
配列表１７ ＜２２３＞ＰＧＫ．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊－ＬＶ配列
配列表１８ ＜２２３＞ＥＦ１α（ｓ）．ＣｏＲＰＳ１９．Ｗｐｒｅ＊－ＬＶ配列
配列表１９ ＜２２３＞フォワード
配列表２０ ＜２２３＞リバース
配列表２１ ＜２２３＞プローブ
配列表２２ ＜２２３＞フォワード
配列表２３ ＜２２３＞リバース
配列表２４ ＜２２３＞プローブ
配列表２５ ＜２２３＞フォワード
配列表２６ ＜２２３＞リバース
配列表２７ ＜２２３＞プローブ
配列表２８ ＜２２３＞フォワード
配列表２９ ＜２２３＞リバース
配列表３０ ＜２２３＞プローブ
配列表３３ ＜２２３＞ＳＶ４０ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列

Claims (15)

1. レンチウイルスベクターであって、前記レンチウイルスベクターが、ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、５’から３’に、以下のヌクレオチド、すなわち、
   ａ）キメラサイトメガロウイルスプロモーターを含む５’長末端反復（５’ ＬＴＲ）、
   ｂ）プライマー結合部位（ＰＢＳ）、
   ｃ）ｐｓｉパッケージングシグナル、
   ｄ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
   ｅ）ＤＮＡフラップセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、
   ｆ）ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、
   ｇ）ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
   ｈ）変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）、および
   ｉ）３’長末端反復（３’ ＬＴＲ）を含むことを特徴とし、
   ５’ ＬＴＲ領域および３’ ＬＴＲ領域が、ＬＴＲのＵ３領域内の完全または部分的な欠失によって実質的に転写的に不活性にされており、ｆ）およびｈ）が、ｇ）に作動可能に連結され、ｇ）の発現を調節するレンチウイルスベクター。
2. 前記ヒトＰＧＫプロモーターが、配列番号１１の全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、請求項１に記載のレンチウイルスベクター。
3. 前記ＲＰＳ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有するコドン最適化ヌクレオチド配列である、請求項１および２のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
4. 前記変異最適化ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｐｒｅ）が、配列番号１３と全長にわたって少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
5. 前記レンチウイルスベクターに含まれる前記ポリヌクレオチドが、前記３’ ＬＴＲの後に位置するポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
6. 前記レンチウイルスベクターの全長ポリヌクレオチドが、配列番号１７と少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列同一性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
7. 前記配列番号１７との配列同一性が１００％である、請求項６に記載のレンチウイルスベクター。
8. 請求項１～７のいずれか一項に定義されるレンチウイルスベクターによって形質導入された細胞の集団。
9. 前記細胞が、ＣＤ３４^＋造血幹細胞およびＣＤ３４^＋造血前駆細胞に富む、請求項８に記載の細胞の集団。
10. 前記細胞が、前記対象にとって自己由来である、請求項８および９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
11. 請求項１～７のいずれか一項に定義されるレンチウイルスベクター、または請求項８～１０のいずれか一項に定義される細胞の集団、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
12. 医薬品として使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター、請求項８～１０のいずれか一項に記載の細胞の集団、または請求項１１に記載の医薬組成物。
13. それを必要とする対象のダイアモンド・ブラックファン貧血の治療に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター、請求項８～１０のいずれか一項に記載の細胞の集団、または請求項１１に記載の医薬組成物。
14. それを必要とする対象のダイアモンド・ブラックファン貧血の治療に使用するための、請求項６および７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
15. 前記それを必要とする対象がヒトである、請求項１３および１４のいずれか一項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター。

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