CN114746546A - 工程化红细胞用于治疗痛风和高尿酸血症 - Google Patents
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Abstract
本发明提供包含尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体;尿酸转运蛋白1(URAT1)或其功能变体;或UOX或其功能变体和URAT1或其功能变体的工程化红细胞。本发明也提供所述工程化红细胞在治疗高尿酸血症相关疾病中的应用。
Description
发明领域
本公开涉及工程化红细胞,并且具体地涉及工程化改造以携带URAT1和/或UOX的红细胞。本公开还涉及用于治疗高尿酸血症相关疾病的方法。
背景技术
痛风是成人,尤其是成年男性中最常见的炎症性关节炎,全球流行率为1%至4%[1,2]。当单钠尿酸盐晶体(MSU)沉积在组织中时,会引起炎症和痛风发作的剧烈疼痛。痛风的生物学前兆是血清尿酸(UA)水平升高(即,高尿酸血症)。尽管高尿酸血症是痛风发展的最强单一危险因素,并且普遍存在于痛风患者中,但并非所有高尿酸血症患者都会发展为痛风。最近的工作强调了先天免疫反应的重要性[2]。
常规的降尿酸药物,如抗炎药(秋水仙碱)、黄嘌呤氧化酶抑制剂(别嘌醇、非布索坦)或促尿酸***药物(丙磺舒、苯溴马隆),诱导非常缓慢的尿酸沉积物的减少,痛风患者的痛风石无法快速消退,故此疗法只能用于疾病早期的治疗[3]。
尿酸氧化酶(UOX,尿酸酶)是一种肝脏酶,可将尿酸盐代谢为尿囊素(allantoin),这是一种水溶性更强的化合物,很容易被肾脏***[2,3]。除人类和某些灵长类动物外,所有其他哺乳动物都会产生UOX。事实上,在进化过程中,UOX在人类中的失活主要是由于编码这种酶的基因中的错义和移码突变[2,4]。当不能使用常规的降尿酸药物时,尿酸酶无疑是慢性痛风石性痛风的一种有价值的治疗选择。
拉布立酶(Rasburicase)是一种重组黄曲霉(A.flavus)UOX,于2001年被EMEA批准并于2002年被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于肿瘤溶解综合征[5,6]。该药物显著降低血清尿酸盐水平,并且比别嘌醇作用更快。儿童和成人的推荐剂量为0.2mg/kg[7,8]。但其生物学半衰期短——仅21h,因此拉布立酶每天输注一次,持续≤7天[7]。此外,最近的研究表明,重复注射UOX会引起过敏性反应,产生中和UOX酶活性的抗体[9]。
Pegloticase,是一种改良的聚乙二醇化的重组猪狒蛋白UOX,被开发为第一个用于治疗难治性痛风的高尿酸血症的非免疫原性生物制剂,已被FDA批准用于慢性痛风患者[3,10]。一项相对于安慰剂的为期6个月的研究表明,pegloticase(每2周输注8mg)导致约40%患者的血浆显著降低(伴有痛风石溶解趋势)[3]。然而,大部分患者无反应,这与中和UOX的抗体的形成与输注反应有关[3]。超过10%的受试者出现了肾结石、关节痛、贫血、肌肉痉挛、呼吸困难、头痛、恶心和发烧等不良事件[7]。
重组UOX(rasburicase,pegloticase)药物是有效降尿酸药剂。然而,目前的疗法存在一些局限性。首先,UOX具有显著的免疫原性,会引起严重的过敏反应[11]。将治疗性酶与PEG缀合可降低患者的免疫反应。然而,研究表明,许多用PEG缀合酶治疗的患者还会产生抗PEG抗体,特别是在重复和连续治疗时,PEG会影响酶活性及药效[12,13]。其次,由于半衰期短、生物利用度有限和/或与血浆蛋白的相互作用,这些治疗性酶可能在体内失活或被清除[14]。第三,酶的生产和纯化往往很耗时,因此酶替代疗法的治疗成本非常高。rasburicase的治疗费用(按年计算)估计约为7200欧元,pegloticase为41,240欧元[3]。因此,我们需要更有效、更安全的新痛风疗法。
工程化红细胞(erRBC)是引入新治疗剂的有吸引力的载体,具有以下优点:(1)红细胞是血液中最丰富的细胞,占人体细胞的四分之一,通过循环广泛分布于人体;(2)红细胞寿命长(人:约120天,小鼠:约50天)。此外,衰老或受损的红细胞可以在肝脏和脾脏中由巨噬细胞清除,此过程中不引起免疫反应;(3)红细胞具有良好的生物相容性,尤其是在使用自体红细胞的情况下;(4)成熟的红细胞没有细胞核、线粒体等其他细胞器。因此,对红系前体细胞进行基因改造,不会导致修饰后的成熟红细胞在体内循环过程中发生畸变或产生致瘤性;(5)红细胞可以保护药物免于过早失活和/或降解、以及保护机体免受药物的毒性作用[15-17]。
人体中的主要尿酸盐由肾脏***,由于尿酸的***量比肾小球的过滤量少,因此尿酸向血液中的重吸收占主导。尿酸通道蛋白(urate transporter,URAT1)是一种尿酸盐阴离子交换剂,可以从尿腔中重吸收尿酸盐[2,18]。
显著降低UOX的免疫原性、延长UOX的半衰期,快速消融痛风石,是开发新痛风疗法的关键目标。
发明概述
一方面,本公开提供一种工程化红细胞(eRBC),其包含:
尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体;
尿酸转运蛋白1(URAT1)或其功能变体;或者
UOX或其功能变体和URAT1或其功能变体。
在一些实施方案中,URAT1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中,UOX包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
另一方面,本公开提供一种生产工程化红细胞的方法,包括:
1)从血液样本中收集谱系阴性细胞(Lin-细胞)或从骨髓样本中收集Lin-CD34+细胞,
2)扩增Lin-或Lin-CD34+细胞;
3)培养扩增的Lin-或Lin-CD34+细胞以诱导其分化成红系细胞(erythroidcells);并且,在分化的同时,将一种或多种外源核酸引入扩增的Lin-细胞或Lin-CD34+细胞;
4)培养红系细胞以诱导去核,
其中所述一种或多种外源核酸包含编码尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体的第一多核苷酸序列、编码尿酸转运蛋白1(URAT1)或其功能变体的第二多核苷酸序列;或第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列两者。
在一些实施方案中,URAT1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中,UOX包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方案中,血液样本是外周血样本、脐带血样本或胎儿血样本。
在一些实施方案中,血液样本是人外周血样本。
在一些实施方案中,Lin-细胞是Lin-CD34-细胞。
在一些实施方案中,步骤1)包括从外周血样本中分离外周血单个核细胞(PBMC)和从PBMC中分离Lin-CD34-细胞。
在一些实施方案中,步骤1)包括通过使用谱系细胞去除试剂盒,从外周血样本中去除谱系阳性(Lin+)细胞。
在一些实施方案中,步骤2)包括在补充有细胞因子组合的造血干细胞扩增培养基中培养Lin-细胞,所述细胞因子组合包含fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、干细胞因子(SCF))、白介素3(IL-3)和白介素6(IL-6)。
在一些实施方案中,所述细胞因子组合包含50ng/mL人Flt3L,50ng/mL人SCF,10ng/mL人IL-3,和10ng/mL人IL-6。
在一些实施方案中,造血干细胞扩增培养基是StemSpanTM SFEM无血清扩增培养基。
在一些实施方案中,步骤2)包括在37℃、5%CO2下培养Lin-细胞约5天。
在一些实施方案中,步骤3)包括在补充有与红系发育相关的细胞因子的第一分化培养基中培养扩增的Lin-细胞。
在一些实施方案中,第一分化培养基是含有胎牛血清(FBS)或人血清、人血浆、谷氨酰胺、BSA、转铁蛋白、胰岛素、青霉素-链霉素、IL-3、EPO和SCF的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
在一些实施方案中,第一分化培养基是含有:10-15%FBS或人血清、5-10%人血浆、1-4mM谷氨酰胺、1-2%BSA、300-600μg/mL人转铁蛋白、8-13μg/mL人胰岛素、2%青霉素-链霉素、3-5ng/mL人IL-3、4-7U/mL人EPO和100ng/mL人SCF的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
在一些实施方案中,其中步骤3)包括在37℃、5%CO2下培养扩增的Lin-CD34-细胞约9天。
在一些实施方案中,步骤4)包括在第二分化培养基中培养红系细胞,其中第二分化培养基是含有FBS或人血清、人血浆、谷氨酰胺、BSA、转铁蛋白、胰岛素、青霉素-链霉素和EPO的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
在一些实施方案中,第二分化培养基是含有15%FBS或人血清、5-10%人血浆、1-4mM谷氨酰胺、1-2%BSA、300-600μg/mL人转铁蛋白、8-13μg/mL人胰岛素、2%青霉素-链霉素和1-5U/mL人EPO的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
在一些实施方案中,步骤4)包括在37℃、5%CO2下培养红系细胞约7天。
在一些实施方案中,在步骤3)中,将一种或多种外源核酸引入到扩增的Lin-细胞中,是在第一分化培养基中培养扩增的Lin-细胞的第一天进行的。
在一些实施方案中,外源核酸是表达载体。
在一些实施方案中,外源核酸是慢病毒表达载体。
另一方面,本公开提供一种药物组合物,其包含工程化红细胞和生理学上可接受的赋形剂。
另一方面,本公开提供工程化红细胞在制备用于治疗与升高的血清尿酸水平相关的病症的药物中的用途。
在一些实施方案中,所述病症是痛风或高尿酸血症。
另一方面,本公开提供一种用于治疗受试者中与升高的血清尿酸水平相关的病症的方法,其包括:
a)从受试者采集血液样本或骨髓样本,
b)使用上述方法产生工程化红细胞;和
c)将治疗有效量的工程化红细胞输注到受试者体内。
在一些实施方案中,所述病症是痛风或高尿酸血症。
另一方面,本公开提供一种用于治疗受试者中与升高的血清尿酸水平相关的病症的方法,其包括将治疗有效量的工程化红细胞输注到受试者中。
在一些实施方案中,该方法还包括在输注之前进行血型鉴定以确保受试者与工程化红细胞相容。
附图简述
图1显示,用于痛风和高尿酸血症治疗的RBC工程化策略。
图2显示,对造血干细胞和/或祖细胞进行基因改造以表达URAT1和UOX,并随后在体外培养将该工程化造血干细胞和/或祖细胞分化成携带两种功能蛋白的成熟红细胞的实验方案。
图3显示,可用于体外测试表达URAT1和UOX的工程化红细胞(eRBC)的功能、以及在已建立的痛风动物模型中测试其体内功能的代表性分析。
图4显示,从小鼠胚胎生成eRBC的工作流程。在胚胎14.5天,从胎肝中分离小鼠红系祖细胞。然后用MSCV-URAT1/UOX-copGFP感染细胞,然后诱导成表达URAT1或UTRA1和UOX的终末分化小鼠红细胞。
图5显示,表达URAT1和/或UOX的eRBC已经历正常的红系分化。在此显示,在体外分化的第8天,对产生自痛风患者的Lin-PBMC的eRBC进行FACS分析的示例。以下是FACS分析中使用的标志物:CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP(指示URAT1和/或UOX表达的报告基因)。CD235a、CD117和CD71用于跟踪红系发育的进展。Hoechst33342染色DNA,并因此,Hoechst 33342阴性细胞是去核细胞。用于检测相应信号的通道:Y585-PE:PI;B525-FITC:GFP;R660-APC:CD235a;B650-PC5.5:CD71;UV450:Hoechst33342。(A).体外红系分化第8天的eRBC-URAT1;(B).体外红系分化第8天的eRBC-URAT1+UOX。
图6显示,自痛风患者的Lin-PBMC产生的eRBC-URAT1和eRBC-URAT1+UOX均在体外有效地降低了尿酸盐浓度。(A).培养eRBC的培养基的尿酸盐浓度。将105个eRBCs、eRBC-URAT1或eRBC-URAT1+UOX在具有465μM尿酸盐(模拟痛风患者的尿酸盐浓度)的培养基中培养24小时。孵育后,培养基中的尿酸盐浓度通过偶联的酶反应(Abcam)测定。(B).根据图6A的结果计算eRBC-URAT1和eRBC-UOX+URAT1对尿酸盐的消耗速率。
图7显示,通过活体成像,NSG小鼠中工程化RBC的组织分布。通过静脉注射将DIR标记的RBC注射到NSG小鼠体内;并在注射红细胞后1小时、5小时、48小时和5天,通过体内成像,检查标记的红细胞的后续分布。小鼠#1:无处理;小鼠#2:仅2μM DIR(在PBS中);小鼠#3:在体外从PBMC分化的并用2μM DIR标记的1x108个人红细胞;小鼠#4:在体外从PBMCs分化的、用2μM DIR标记的、仅感染了载体的1x10 8个人红细胞;小鼠#5:在体外从PBMCs分化的、用2μM DIR标记的、用编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的慢病毒载体转导的1x10 8个人红细胞;小鼠#6:在体外从PBMCs分化的、用2μM DIR标记的、用编码乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)的慢病毒载体转导的5x10 7个人红细胞。
图8显示,在注射红细胞之后,组织样本的图像示例。将DIR染色的红细胞静脉内注射到每只小鼠中。注射后7天,处死小鼠,对组织样本进行成像。小鼠#1:无处理;小鼠#2:仅2μM DIR(在PBS中);小鼠#4:在体外从PBMCs分化的、用2μM DIR标记的、仅感染了载体的1x108个人红细胞;小鼠#5:在体外从PBMCs分化的、用2μM DIR标记的、用编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的慢病毒载体转导的1x10 8个人红细胞;小鼠#6:在体外从PBMCs分化的、用2μM DIR标记的、用编码乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)的慢病毒载体转导的5x10 7个人红细胞。
图9显示,工程化小鼠eRBC-URAT1+UOX降低了高尿酸血症和痛风小鼠模型中的尿酸盐浓度。小鼠eRBC-URAT1和eRBC-UOX+URAT1在体内的代表性功能测定。(A).以250mg/kg的剂量腹膜内注射MSU晶体悬液诱发高尿酸血症,采用偶联酶反应法分析血清尿酸盐浓度;(B).将2x108个eRBC-URAT1或eRBC-URAT1+UOX细胞或PBS(空白)静脉内注射到小鼠体内3天后,诱导高尿酸血症。测量血清中的尿酸盐浓度以评估eRBC的治疗效果。
发明详述
除非另有定义,否则本文使用的技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。与本文所述相似或等同的任何方法、装置和材料都可以用于实施本发明。提供以下定义是为了便于理解本文中频繁使用的某些术语,并不旨在限制本公开的范围。
冠词“a”和“an”在本文中用于指,一个或多于一个(即,至少一个)冠词的语法对象。举例来说,“an”元素是指一个元素或多于一个元素。
如本文所用,术语“谱系阴性细胞”或“Lin-细胞”是指,基本上无谱系标志物的细胞。谱系标志物是细胞谱系的特征。示例性谱系标志物是CD1c、CD3、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD20、CD41、CD56、CD203c、CD235a和/或BDCA2。事实上,谱系阴性细胞基本上不被谱系抗体染色。谱系阴性细胞包括干细胞和祖细胞。因此,谱系阴性细胞也显示出干细胞和祖细胞活性。可以通过富集基本上不含谱系标志物的血细胞群,来纯化Lin-细胞或富含谱系阴性细胞的血细胞群。例如,谱系阴性细胞可以通过去除选自以下的至少一个谱系标志物呈阳性的细胞来纯化:CD1c、CD3、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD20、CD41、CD56、CD203c、CD235a、和/或BDCA2。在某些情况下,可以使用谱系细胞去除试剂盒进行纯化。相反,谱系阳性(Lin+)细胞是表达成熟细胞谱系标志物的所有细胞的混合物。谱系阳性细胞的例子包括T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红系细胞和它们的定向前体细胞。
术语“功能变体”是指,包含对UOX或URAT1的一个或几个到多数个氨基酸的取代、缺失或添加的任何变体,只要该变体基本上保留与UOX或URAT1相同的功能。
如本文所用,术语“培养”是指,将细胞在培养基中保持任何时间段,无论有无细胞扩增或分化。
如本文所用,术语“分化”是指,特化程度较低的细胞(例如干细胞)发育或成熟以具有更独特的形式和功能、同时伴随潜力丧失的过程。通过在本领域已知的特定条件或特定培养基中培养细胞,可将特化程度较低的细胞分化成特化程度较高的细胞。
如本文所用,术语“药学上可接受的赋形剂”是指,药学上可接受的材料、组合物或溶媒,例如液体或固体填充剂、稀释剂、载体、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁)、溶剂或包封材料,其参与携带或运输治疗性化合物以施用于受试者。在与制剂的其他成分相容且对受试者无害的意义上,每种赋形剂应该是“可接受的”。
fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)或FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3配体),又称FL、Flt3L和FLT3LG,是一种可促进HSCs分化为各种造血谱系细胞的蛋白质。FLT3LG在结构上与干细胞因子(SCF)和集落刺激因子1(CSF-1)同源。FLT3LG通过活化造血祖细胞,增加细胞数量。
干细胞因子(SCF)或Kit配体(KITLG),也称为干细胞因子(SCF),属于SCF家族的I型跨膜糖蛋白。KITLG是受体型蛋白酪氨酸激酶KIT的配体。SCF在调节细胞存活和增殖、造血、干细胞维持、细胞发育、迁移和功能方面,发挥着重要作用。
白介素3(rhIL-3)是一种糖蛋白,属于造血生长因子家族,在临床前体外和体内研究中表现出多谱系活性。造血祖细胞在IL-3蛋白的帮助下可增殖和分化为成熟红细胞、肥大细胞、巨核细胞和粒细胞。
白介素6(rhIL-6)是一种多功能细胞因子,可调节免疫反应、造血功能、急性期反应和炎症反应。与IL-3协同促进造血细胞增殖。
红细胞生成素(Epo)是一种主要的红细胞生成素,可与多种其他生长因子(IL-3、IL-6、糖皮质激素和SCF)相互作用,由此从多能祖细胞发展出红系谱系。红系爆式形成单位(BFU-E)细胞开始表达红细胞生成素受体并对红细胞生成素敏感。它是一种重要的红系造血细胞因子。
Holo人转铁蛋白是血浆中的主要铁蛋白,与铁离子形成复合物,用于在红细胞中血红蛋白的产生。
CD235a,也称为血型糖蛋白A,是一种主要在成熟红细胞和红系前体细胞的表面上表达的单次跨膜糖蛋白,是红细胞的谱系特异性标志物。
CD117是肥大细胞/干细胞生长因子受体,在造血干细胞和其他细胞表面表达。
CD71,也称为转铁蛋白受体1,是由两个二硫键连接的两个单体组成的跨膜糖蛋白。每个单体都与完整的转铁蛋白分子结合,产生铁-转铁蛋白-转铁蛋白受体复合物,该复合物通过内吞作用进入细胞。
碘化丙啶(PI)与双链DNA结合。PI不能穿过完整的质膜,因此只会存在于质膜受损/透化的细胞的DNA中。
Hoechst33342是一种用于活细胞DNA染色的荧光染料。
copGFP是一种绿色荧光蛋白,是一种常用的荧光报告分子。
我们已经建立了体外RBC再生培养技术,该技术可以增加红系祖细胞的增殖,允许有效并稳定地产生去核RBC。正常人RBC可以在培养中从造血干细胞和祖细胞产生,但造血干细胞的来源,例如骨髓(BM)抽吸物、动员的外周血和脐带血(UCB),限制了临床应用。我们产生了一系列新方法,利用谱系阴性CD34阴性外周血单个核细胞(Lin-CD34-PBMCs)或谱系阴性CD34阳性造血干细胞(Lin-CD34+HSCs),以诱导红系细胞增殖和分化,这为eRBC治疗奠定了坚实的基础。
通过设计同时表达URAT1和UOX的eRBC,我们使用RBC作为新的载体向患者递送UOX,这可以提高尿酸盐消耗速率并进一步提高尿酸盐的消耗效率(图1和图2)。已经进行了一系列实验,确认携带URAT1或同时携带URAT1和UOX的eRBC的体外和体内功能(图3)。
实施例
实施例1.慢病毒制备
设计质粒MSCV-URAT1-copGFP和MSCV-UOX-copGFP:URAT1(Genbank,AY358183.1)和UOX(Genbank,X61765.1)的cDNA序列显示如下。将这些基因的合成DNA克隆到慢病毒载体MSCV中。
URAT1的DNA序列:(SEQ ID NO:1)
atggcattttctgaactcctggacctcgtgggtggcctgggcaggttccaggttctccagacgatggctctgatggtctccatcatgtggctgtgtacccagagcatgctggagaacttctcggccgccgtgcccagccaccgctgctgggcacccctcctggacaacagcacggctcaggccagcatcctagggagcttgagtcctgaggccctcctggctatttccatcccgccgggccccaaccagaggccccatcagtgccgccgcttccgccagccacagtggcagctcttggaccccaatgccacggccaccagctggagcgaggccgacacggagccgtgtgtggatggctgggtctatgaccgcagcatcttcacctccacaatcgtggccaagtggaacctcgtgtgtgactctcacgctctgaagcccatggcccagtccatctacctggctgggattctggtgggagctgctgcgtgcggccctgcctcagacaggtggctggcagagtcggcacgatggctcctcaccacaggcaggctggattggggcctgcaggagctgtggagggtggctgccatcaacggaaagggggcagtgcaggacaccctgacccctgaggtcttgctttcagccatgcgggaggagctgagcatgggccagcctcctgccagcctgggcaccctgctccgcatgcccggactgcgcttccggacctgtatctccacgttgtgctggttcgcctttggcttcaccttcttcggcctggccctggacctgcaggccctgggcagcaacatcttcctgctccaaatgttcattggtgtcgtggacatcccagccaagatgggcgccctgctgctgctgagccacctgggccgccgccccacgctggccgcatccctgttgctggcggggctctgcattctggccaacacgctggtgccccacgaaatgggggctctgcgctcagccttggccgtgctggggctgggcggggtgggggctgccttcacctacatcaccatctacagcagcgagctcttccccactgtgctcaggatgacggcagtgggcttgggccagatggcagcccgtggaggagccatcctggggcctctggtccggctgctgggtgtccatggcccctggctgcccttgctggtgtatgggacggtgccagtgctgagtggcctggccgcactgcttctgcccgagacccagagcttgccgctgcccgacaccatccaagatgtgcagaaccaggcagtaaagaaggcaacacatggcacgctggggaactctgtcctaaaatccacacagttttag
URAT1的氨基酸序列:(SEQ ID NO:2)
MASDVGGGRVTMAMVSMWCTSMNSAAVSHRCWADNSTAASGSSAASGNRHCRRRWDNATATSWSADTCVDGWVYDRSTSTVAKWNVCDSHAKMASYAGVGAAACGASDRWASARWTTGRDWGWRVAANGKGAVDTTVSAMRSMGASGTRMGRRTCSTCWAGTGADAGSNMGVVDAKMGASHGRRTAASAGCANTVHMGARSAAVGGGVGAATYTYSSTVRMTAVGGMAARGGAGVRGVHGWVYGTVVSGAATSDTDVNAVKKATHGTGNSVKST
UOX的DNA序列:(SEQ ID NO:3)
ATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACGGCAAGGACAATGTCCGCGTCTACAAGGTTCACAAGGACGAGAAGACCGGTGTCCAGACGGTGTACGAGATGACCGTCTGTGTGCTTCTGGAGGGTGAGATTGAGACCTCTTACACCAAGGCCGACAACAGCGTCATTGTCGCAACCGACTCCATTAAGAACACCATTTACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTTACTCCTCCCGAGCTGTTCGGCTCCATCCTGGGCACACACTTCATTGAGAAGTACAACCACATCCATGCCGCTCACGTCAACATTGTCTGCCACCGCTGGACCCGGATGGACATTGACGGCAAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCGCGACAGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGACGTGGTCGAGGGCAAGGGCATCGATATCAAGTCGTCTCTGTCCGGCCTGACCGTGCTGAAGAGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGCTTCCTGCGTGACGAGTACACCACACTTAAGGAGACCTGGGACCGTATCCTGAGCACCGACGTCGATGCCACTTGGCAGTGGAAGAATTTCAGTGGACTCCAGGAGGTCCGCTCGCACGTGCCTAAGTTCGATGCTACCTGGGCCACTGCTCGCGAGGTCACTCTGAAGACTTTTGCTGAAGATAACAGTGCCAGCGTGCAGGCCACTATGTACAAGATGGCAGAGCAAATCCTGGCGCGCCAGCAGCTGATCGAGACTGTCGAGTACTCGTTGCCTAACAAGCACTATTTCGAAATCGACCTGAGCTGGCACAAGGGCCTCCAAAACACCGGCAAGAACGCCGAGGTCTTCGCTCCTCAGTCGGACCCCAACGGTCTGATCAAGTGTACCGTCGGCCGGTCCTCTCTGAAGTCTAAATTGTAA
UOX的氨基酸序列:(SEQ ID NO:4)
MSAVKAARYGKDNVRVYKVHKDKTGVTVYMTVCVGTSYTKADNSVVATDSKNTYTAKNVTGSGTHKYNHHAAHVNVCHRWTRMDDGKHHSRDSKRNVVDVVGKGDKSSSGTVKSTNSWGRDYTTKTWDRSTDVDATWWKNSGVRSHVKDATWATARVTKTADNSASVATMYKMAARTVYSNKHYDSWHKGNTGKNAVASDNGKCTVGRSSKSK
使用MSCV-URAT1-copGFP(或MSCV-UOX-copGFP)、pSPAX2、VSVG,以2:1:1的比例,制备表达URAT1和UOX基因的慢病毒。以6孔板为例,2μg MSCV-URAT1-copGFP(或MSCV-UOX-copGFP)、1μg pSPAX2和1μg VSVG通过使用磷酸钙转染到HEK 293T细胞中以产生病毒。转染后12小时,用含有10%FBS的新鲜DMEM培养基替换磷酸钙。在转染后48小时和72小时,收集上清液并通过0.45μm过滤器过滤。
将过滤的上清液进行超速离心并在4℃的温度下,以70000RCF的速度浓缩2小时。离心后,去除上清液并使用分化1培养基(见下文描述)重悬含有病毒颗粒的沉淀。采用p24ELISA试剂盒定量病毒滴度,并-80℃保存。
实施例2.工程化表达URAT1和UOX的人红细胞
成熟的红细胞从源自造血干细胞的早期红系祖细胞分化。然而,由于难以获得来自人骨髓的造血干细胞,我们开发了一种体外人红系分化培养***,利用Lin-CD34+HSCs或Lin-CD34-外周血单个核细胞(PBMCs)产生成熟的人红细胞。详细步骤如下。
1)来自痛风患者或血型匹配的健康受试者的外周血或脐带血,用磷酸盐缓冲液1:1稀释,用淋巴细胞分离液(LymphoprepTM,STEMCELL Technologies)以1200×g离心15分钟分离PBMCs或预富集HSCs。
2)使用Human Lineage Cell Depletion Set-DM试剂盒(BD Biosciences)分离来自外周血的Lin-CD34-PBMC;使用EasySepTM Human Cord Blood CD34 Positive SelectionKit II(Stemcell Technologies)分离来自脐带血样本的Lin-CD34+HSC。
3)将分离的Lin-CD34-PBMCs或Lin-CD34+HSCs细胞培养在造血干细胞扩增培养基(StemSpanTM SFEM,STEMCELL Technologies)中,所述培养基补充有青霉素-链霉素(Gibco)和细胞因子组合(含有50ng/ml重组人fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、50ng/ml重组人干细胞因子(SCF)、10ng/ml重组人白介素3(IL-3)、10ng/ml重组人白介素6(IL-6)或StemSpanTMCC100(STEMCELL Technologies))。细胞在37℃、5%CO 2下培养。
4)在培养的第5天,将培养的细胞更换到分化1期培养基中,所述分化1期培养基由如下成分组成:IMDM(Iscove改良Dulbecco培养基,Sigma-Aldrich)、10-15%胎牛血清(FBS,Gibco)或人血清、5-10%人血浆、1-4mM谷氨酰胺、1-2%BSA(牛血清白蛋白)、300-600μg/mL人转铁蛋白(Holo人转铁蛋白,Sigma-Aldrich)、8-13μg/mL重组人胰岛素(Sigma-Aldrich)、2%青霉素-链霉素(Gibco)、3-5ng/mL重组人白介素III(rhIL-3,Peprotech)、4-7U/mL重组人红细胞生成素(rhEpo,Amgen),100ng/mL重组人干细胞因子(rhSCF,Peprotech)。细胞在37℃、5%CO 2下培养。
5)在培养的第6天,细胞用表达URAT1或URAT1和UOX的慢病毒感染。将培养的细胞以1x 10 6/mL的密度重悬于分化1期培养基中,并以5×10 7TU/ml至5×10 8TU/ml浓度的病毒和Polybrene(Merck,10ng/mL)感染。使用水平转子离心机以500×g的速度和32℃进行离心感染90分钟。
6)感染后12小时,在37℃和5%CO2下,将培养基更换为新鲜的分化2期培养基。分化2期培养基由如下成分组成:IMDM(Iscove改良Dulbecco培养基,Sigma-Aldrich)、15%胎牛血清(FBS、Gibco)或15%自体血清、5-10%人血浆(Plasma)、1-4mM谷氨酰胺、1-2%BSA(牛血清白蛋白)、300-600μg/mL人转铁蛋白(Holo人转铁蛋白,Sigma-Aldrich),8-13μg/mL重组人胰岛素(Sigma-Aldrich),2%青霉素-链霉素(Gibco),1-5U/mL重组人红细胞生成素(rhEpo,Amgen)。细胞再培养7天,在此期间每2天更换一次新鲜的分化2期培养基。流式细胞术测定体外最终分化过程中细胞上CD235a、CD117、CD71、Hoechst 33342的表达。
在培养过程中,对CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP(指示URAT1和/或UOX表达的报告基因)进行FACS分析。代表性结果如图5所示。
实施例3.分析URAT1和UOX在工程化RBC上的表达
根据制造商的方案,使用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN),从10 6eRBC-URAT1+UOX和eRBC-对照中分离总RNA。使用gDNA Eraser(Takara)和Oligo(dT)引物,使用PrimeScriptRT试剂盒合成cDNA。使用Terra TM qPCR Direct TB Green(Takara)进行qRT-PCR。以下是用于qRT-PCR的引物序列:
URAT1正向引物:5’-TCCAGACGGTGTACGAGATG-3’(SEQ ID NO:5)
URAT1反向引物:5’-GGATGTCCACGACACCAATGA-3’(SEQ ID NO:6)
UOX正向引物:5’-CGGTGTCCAGACGGTGTACG-3’(SEQ ID NO:7)
URAT1反向引物:5’-GGTCCAGCGGTGGCAGACAAT-3’(SEQ ID NO:8)
18s正向引物:5’-GCTTAATTTGACTCAACACGGGA-3’(SEQ ID NO:9)
18s反向引物:5’-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC-3’(SEQ ID NO:10)。
实施例4.体外分析eRBC-URAT1或URAT1+UOX的功能
eRBC与痛风患者的血清一起孵育。在不同时间点测量患者血清中尿酸盐的含量,以确定体外工程化红细胞对尿酸盐的消耗速率。结果如图6所示。
实施例5.人eRBC在NSG小鼠中的组织分布和寿命
通过静脉注射,将DIR标记的eRBCs注射到免疫缺陷的NSG小鼠体内,并通过活体成像、流式细胞术、免疫组织化学等方法,分析标记的eRBCs细胞在小鼠体内的组织分布和存活情况。一些结果显示在图7和图8中。
实施例6.分析eRBC-URAT1或URAT1+UOX在体内消耗尿酸盐的功能
工程化小鼠红细胞以表达URAT1和UOX(图4)
1.如前所述[19],从E13.5-14.5天的胚胎中分离小鼠胎肝细胞(FLC)。
3.用移液器上下吹吸,收集单细胞悬液,随后用25μm滤网(BD Falcon 35-2235)过滤。
4.将细胞以1500RPM离心5分钟,然后用红细胞裂解缓冲液(来自Stemcell的氯化铵溶液)在4℃下重悬10分钟。
5.再次以1500RPM离心细胞5分钟。去除裂解缓冲液并用10mL PBS-2%FBS重新悬浮细胞。
6.加入50μL/小鼠的ChromPure Rat IgG(Jackson ImmunoResearch,#012-000-003),与细胞在4℃孵育5分钟。
7.以1μL/1×106个细胞,向细胞中加入生物素化抗小鼠TER119抗体(BDPharmingen,#553672),4℃孵育15分钟。
8.将Ms Lineage Panel(BD Pharmigen,#559971),以2μL/1×10 6个细胞的浓度,添加到细胞中,并在4℃下孵育15分钟。
9.细胞用10倍体积的PBS洗涤,4℃1500RPM离心5分钟。
10.将Streptavidin Particles Plus-DM(磁珠)(BD Pharmigen,#557812)(5μL/1×10 6个细胞)添加到细胞中,并在4℃下孵育30分钟。之后,使用磁性支架去除链霉亲和素包被的磁珠。
11.将剩余的细胞,即谱系阴性小鼠细胞,转移到新的试管中。
14. 37℃将细胞以2×10 5/mL的浓度接种到24孔板中。如前所述,细胞用慢病毒感染。
15.感染后,将细胞在分化培养基中培养44-48小时,以使其成熟。
高尿酸血症小鼠模型
如[20]所述,通过腹腔注射250mg/kg MSU晶体悬液,诱导了高尿酸血症模型。在0、2、5、8、24小时从尾静脉采血,分析其血清尿酸盐浓度。
小鼠eRBC-URAT1+UOX在高尿酸血症小鼠中的作用
将2x108eRBCs静脉注射到小鼠体内。注射后3天,小鼠腹膜内注射250mg/kg的MSU晶体悬液诱发高尿酸血症,在0、2、5、8、24、48小时分析其血清尿酸盐浓度。
在此,我们评估了eRBC-URAT1+UOX在我们的高尿酸血症小鼠模型中的治疗功能。在MSU注射前3天,静脉注射2×108eRBCs-URAT1+UOX。eRBCs-URAT1+UOX显著缓解了小鼠模型中升高的血清尿酸盐(图9)。
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Claims (32)
1.一种工程化红细胞(eRBC),其包含:
尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体;
尿酸转运蛋白1(URAT1)或其功能变体;或
UOX或其功能变体和URAT1或其功能变体。
2.根据权利要求1所述的工程化红细胞,其中所述URAT1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的工程化红细胞,其中所述UOX包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
4.一种生产工程化红细胞的方法,包括:
1)从血液样本中收集谱系阴性细胞(Lin-细胞)或从骨髓样本中收集Lin-CD34+细胞,
2)扩增该Lin-细胞或Lin-CD34+细胞;
3)培养该扩增的Lin-细胞或Lin-CD34+细胞以诱导其分化为红系细胞;并且,在分化同时,将一种或多种外源核酸引入扩增的Lin-细胞或Lin-CD34+细胞;和
4)培养该红系细胞以诱导去核,
其中所述一种或多种外源核酸包含编码尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体的第一多核苷酸序列、编码尿酸转运蛋白1(URAT1)的第二多核苷酸序列或其功能变体;或第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列两者。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述URAT1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其中所述UOX包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法,其中,所述血液样本是外周血样本、脐带血样本或胎儿血样本。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法,其中,所述血液样本是人外周血样本。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法,其中,所述Lin-细胞是Lin-CD34-细胞。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的方法,其中,步骤1)包括从外周血样本中分离外周血单个核细胞(PBMC)和从所述PBMC中分离Lin-CD34-细胞。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的方法,其中,步骤1)包括通过使用谱系细胞去除试剂盒,从所述外周血样本中去除谱系阳性(Lin+)细胞。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的方法,其中,步骤2)包括在补充有细胞因子组合的造血干细胞扩增培养基中培养所述Lin-细胞,其中所述细胞因子组合包括fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、干细胞因子(SCF)、白介素3(IL-3)和白介素6(IL-6)。
13.根据权利要求4-12中任一项所述的方法,其中所述细胞因子组合包括50ng/mL人Flt3L、50ng/mL人SCF、10ng/mL人IL-3和10ng/mL人IL-6。
14.根据权利要求4-13中任一项所述的方法,其中所述造血干细胞扩增培养基是StemSpanTM SFEM无血清扩增培养基。
15.根据权利要求4-14中任一项所述的方法,其中,步骤2)包括在37℃、5%CO2下培养Lin-细胞约5天。
16.根据权利要求4-15中任一项所述的方法,其中,步骤3)包括在补充有与红系发育相关的细胞因子的第一分化培养基中培养扩增的Lin-细胞。
17.根据权利要求4-16中任一项所述的方法,其中所述第一分化培养基是含有胎牛血清(FBS)或人血清、人血浆、谷氨酰胺、BSA、转铁蛋白、胰岛素、青霉素-链霉素、IL-3、EPO和SCF的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
18.根据权利要求4-17中任一项所述的方法,其中所述第一分化培养基是含有10-15%FBS或人血清、5-10%人血浆、1-4mM谷氨酰胺、1-2%BSA、300-600μg/mL人转铁蛋白、8-13μg/mL人胰岛素、2%青霉素-链霉素、3-5ng/mL人IL-3、4-7U/mL人EPO和100ng/mL人SCF的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
19.根据权利要求4-18中任一项所述的方法,其中,步骤3)包括在37℃、5%CO2下培养扩增的Lin-CD34-细胞约9天。
20.根据权利要求4-19中任一项所述的方法,其中,步骤4)包括在第二分化培养基中培养所述红系细胞,其中所述第二分化培养基是含有FBS或人血清、人血浆、谷氨酰胺、BSA、转铁蛋白、胰岛素、青霉素-链霉素和EPO的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
21.根据权利要求4-20中任一项所述的方法,其中所述第二分化培养基是含有15%FBS或人血清、5-10%人血浆、1-4mM谷氨酰胺、1-2%BSA、300-600μg/mL人转铁蛋白、8-13μg/mL人胰岛素、2%青霉素-链霉素和1-5U/mL人EPO的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
22.根据权利要求4-21中任一项所述的方法,其中,步骤4)包括在37℃、5%CO2下培养红系细胞约7天。
23.根据权利要求4-22中任一项所述的方法,其中,在步骤3)中,将所述一种或多种外源核酸引入所述扩增的Lin-细胞是在第一分化培养基中培养所述扩增的Lin-细胞的第1天进行的。
24.根据权利要求4-23中任一项所述的方法,其中,所述外源核酸是表达载体。
25.根据权利要求4-24中任一项所述的方法,其中,所述外源核酸是慢病毒表达载体。
26.一种药物组合物,其包含根据权利要求1-3中任一项所述的工程化红细胞和生理学上可接受的赋形剂。
27.权利要求1-3中任一项的工程化红细胞在制备用于治疗与升高的血清尿酸水平相关的病症的药物中的用途。
28.根据权利要求27所述的用途,其中,所述病症是痛风或高尿酸血症。
29.一种治疗受试者中与升高的血清尿酸水平相关的病症的方法,包括:
a)从受试者采集血液样本或骨髓样本,
b)通过使用根据权利要求4-24中任一项所述的方法产生工程化红细胞;
c)将治疗有效量的工程化红细胞输注到受试者体内。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述病症是痛风或高尿酸血症。
31.一种用于治疗受试者中与升高的血清尿酸水平相关的病症的方法,包括将治疗有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的工程化红细胞输注到受试者中。
32.根据权利要求31所述的方法,进一步包括,在所述输注之前,进行血型分型,以确保所述受试者与所述工程化红细胞相容。
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