JP2019533434A - ファンコニ貧血患者に対する遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、FANCA遺伝子産物が減少または消失した細胞においてFANCA発現を回復するための組成物および方法を提供する。特に、ファンコニ貧血の遺伝子療法のための方法および組成物が開示される。

Description

関連出願
本願は、2016年9月8日に出願された米国仮出願番号62/385185および2016年10月24日に出願された米国仮出願62/412.028からの優先権および恩典を主張し、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。

発明の分野
本発明は、概して、1つまたは複数のFANCAコードタンパク質からのタンパク質活性が減少または消失した細胞への遺伝子移入に関する。

配列表に関する宣言
本願に付属する配列表は、紙面の複製物に代えてテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み入れられる。配列を含むテキストファイルの名前は、ROPA_002_01WO_ST25.txtである。このテキストファイルは46KBであり、2017年9月8日に作成され、EFS-WEBを通じて電子的に提出される。

発明の背景
ファンコニ貧血（FA）は、患者の生存率の中央値がおよそ24歳である、常染色体劣性疾患である（X連鎖である相補群FA-Bを除く）（Butturini A, et al. (1994) Blood 84: 1650-1655（非特許文献1）; Kutler DI, et al. (2003) Blood 101: 1249-1256（非特許文献2））。出生時、これらの患者の血球数は一般に正常である。大赤血球症が、多くの場合、これらの患者において検出される最初の血液学的異常である。これは通常、血小板減少症、貧血および汎血球減少症と共に発展する。通常、これらの患者において5〜10歳以降に骨髄不全（BMF）が観察され、血液学的疾患発症の平均年齢は7歳である。FA患者の約80％は、その生涯の最初の10年でBMFの兆候を示すであろう。今日までの疫学的研究に基づき、形成不全前に悪性エピソードが現れない場合、実質的にすべてのFA患者が40歳までにBMFを発症すると考えられ（Butturini A, et al. (1994) Blood 84: 1650-1655（非特許文献1）; Kutler DI, et al. (2003) Blood 101: 1249-1256（非特許文献2））、これはこれらの患者における一番の死因である。

FAの臨床的症状は複合的であるため、これらの患者の管理は主として以下の症候群の改善に焦点を合わせている：骨髄不全（BMF）、骨髄性白血病および固形腫瘍。

現在の処置は、アンドロゲン、例えばフルオキシメステロン、オキシメソロンまたはスタノゾロールから構成されるもの、を含む。最近Dufourらによってレビューされたように（Dufour, C. and Svahn, J. (2008). Bone Marrow Transplant 41 Suppl 2: S90-95（非特許文献3））、FA患者は、アンドロゲンに対して、この処置が疾患の非常に進行した段階で開始されない限り、一定の応答を示し得る。患者の約75％が、アンドロゲンに応答する。2 mg/kg/日のプレドニゾロンとの併用は、肝臓毒性の危険を低下させる。一般に、アンドロゲンは、適切な骨髄ドナーが不在のときに、確定的な長期的処置としてではなく、一定の造血能が残存している場合の代替処置として考慮され得る。

Tischkowitzらは、この疾患の早期段階においてFA患者はアンドロゲンに応答し得るものの、大多数のFA患者は長期的にはこれらの処置に対して不応性であると述べた（Tischkowitz, M. and Dokal, I. (2004). Br J Haematol 126: 176-191（非特許文献4））。

FAの処置において造血成長因子の具体的適応はない。しかし、FAの特定の兆候（貧血および好中球減少症）への適応を有する2つの薬理学的グループの薬物が判明している：1）エリスロポエチンおよび2）顆粒球・コロニー刺激因子（G-CSF）。様々なエリスロポエチン（例えば、Aranesp、Nespo、Exjade）が、貧血の処置に関して承認されており、G-CSF（例えば、G-CSFアナログ、例えばフィルグラスチム、バイオガストリン、ニューラスタ）が、好中球減少症の処置に関して承認されている。造血成長因子、例えばエリスロポエチンおよび顆粒球・コロニー刺激因子は、限られた数のFA患者においてしか試験されていないものの、応答は部分的かつ一過的であった（Dufour et al., 2008（非特許文献3））。現在、これらの処置は、良い長期的オプションではない。好中球減少症患者の短期的処置として、G-CSFは、末梢好中球数を増加させ、抗生物質の効果を高めるために急性感染症に対して使用され得る。しかし、これらの薬物処置は、FA患者に対する確定的な管理とは程遠い。

現在、この疾患の血液学的症状の唯一の治癒的処置は、同種造血細胞移植に基づく。HLA同一の同胞ドナー由来の移植片を移植されたFA患者の結果は概ね満足のいくものであるが、HLA同一の同胞を有するのはFA患者の約20％のみである。同胞ドナーを有さないFA患者の相当数は、代替ドナーからの移植を受けることができるが、これらの移植は高い発病率および死亡率を伴う。残りのFA患者においては、現時点で代替の治療を受けることができない。

したがって、FAに対する効果的な処置法に対する要望は依然として大きい。本発明は、この要望およびそれ以上に応えるものである。

Butturini A, et al. (1994) Blood 84: 1650-1655 Kutler DI, et al. (2003) Blood 101: 1249-1256 Dufour, C. and Svahn, J. (2008). Bone Marrow Transplant 41 Suppl 2: S90-95 Tischkowitz, M. and Dokal, I. (2004). Br J Haematol 126: 176-191

本発明の態様は、FANCAの発現増加のためのポリヌクレオチドカセットを含む。いくつかの態様において、このポリヌクレオチドカセットは、転写時のmRNA安定性を向上させるコドン最適化ヒトFANCA cDNAをコードする配列を含む。

1つの態様において、本発明は、5'から3'の順に以下：（a）ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター配列またはその機能的ホモログもしくは変種と、（b）ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列と、（c）ウッドチャック肝炎ウイルス調節エレメント（WPRE）RNA輸送シグナル配列またはその機能的変種もしくはフラグメントとを含むポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列が、PGKプロモーター配列に機能的に連結されている発現カセット、を含む。具体的な態様において、FANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種は、SEQ ID NO:25に示される配列を含み；FANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列は、SEQ ID NO:8に示される配列を含み；PGKプロモーターは、SEQ ID NO:7のヌクレオチド配列を含み；および／またはWPREエレメントは、SEQ ID NO:23のヌクレオチド配列を含む。具体的な態様において、このカセットは、SEQ ID NO:24のヌクレオチド配列の一領域を含む。ある態様において、このカセットはさらに、1つまたは複数のエンハンサー配列、ポリプリントラクト（PPT）またはポリアデニル化（ポリA)シグナル配列、パッケージングシグナル配列、短縮型Gag配列、Rev応答エレメント（RRE）、セントラルポリプリントラクト（cPPT）、セントラルターミナル配列（CTS）および／または上流配列エレメント（USE）、任意でサルウイルス40由来（SV40-USE）、を含む。

1つの態様において、本発明は、a）プロモーター配列と、b）ポリペプチドをコードする配列と、c）リボ核酸（RNA）輸送シグナルとを含むポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、プロモーター配列がFANCAポリペプチド（SEQ ID NO:25）をコードする配列に機能的に連結されており、任意で、a）〜c）が発現カセット内で5'〜3'の順に存在する、発現カセットを提供する。ある態様において、プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターである。ある態様において、ポリペプチドをコードする配列は、コドン最適化されている。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードする配列は、SEQ ID NO:8に対して少なくとも85％の同一性を有するヒトFANCA cDNAのコドン最適化版である。具体的な態様において、RNA輸送シグナルは、ウッドチャック肝炎ウイルスの変異型転写後調節エレメント（wPRE）である。

ある態様において、変異型wPREは、SEQ ID NO:23との少なくとも80％の同一性を有する配列を含むキメラwPREである。いくつかの態様において、発現カセットは、1個または複数個のエンハンサー配列をさらに含む。いくつかの態様において、発現カセットは、ポリプリントラクト（PPT）またはポリアデニル化（ポリA）シグナル配列をさらに含む。いくつかの態様において、発現カセットは、以下の配列のうちの1つまたは複数をさらに含む：（i）パッキングシグナル配列；（ii）短縮型Gag配列；（iii）Rev応答エレメント（RRE）；（iv）セントラルポリプリントラクト（cPPT）；（v）セントラルターミナル配列（CTS）；および（vi）上流配列エレメント（USE）、任意で、サルウイルス40由来（SV40-USE）。いくつかの態様において、発現カセットは、5'および3'の長い末端反復（LTR）配列をさらに含む。

関連する態様において、本発明は、本明細書中に開示された発現カセットを含む組換え遺伝子送達ベクターを提供する。ある態様において、組換え遺伝子送達ベクターは、ウイルスまたはウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスまたはウイルスベクターは、レンチウイルス（LV）である。

もう一つの関連する態様において、本発明は、本明細書中に開示された発現カセットまたは遺伝子送達ベクターを含む細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は、血液細胞である。いくつかの態様において、細胞は、赤血球細胞である。いくつかの態様において、細胞は、骨髄細胞、例えば、系統枯渇（lineage depleted）骨髄細胞である。具体的な態様において、細胞は、造血幹細胞またはCD34⁺細胞である。いくつかの態様において、細胞は、造血幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は、CD34+造血幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は、運命付けられた（committed）造血赤血球前駆細胞である。

関連する態様において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤および本明細書に開示される組換え遺伝子送達ベクターまたは細胞を含む薬学的組成物を提供する。本発明の特定の局面において、本発明のポリヌクレオチドカセットおよび薬学的賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。他の態様において、薬学的組成物は、本発明の遺伝子送達ベクターおよび薬学的賦形剤を含む。

動物および特にヒトにおける疾患、障害および機能不全の中枢および標的化遺伝子療法に有用な医薬の製造において使用される、これらの遺伝子発現カセットを含む、遺伝子療法ベクター組成物、例えばウイルスベクターの使用のための方法および組成物が提供される。

別の態様において、本発明は、その必要がある対象において疾患または障害を処置または予防する方法であって、本明細書に開示される発現カセット、遺伝子送達ベクターまたは薬学的組成物を対象に提供する工程を含む方法を提供する。

別の態様において、本発明は、その必要がある対象においてファンコニ貧血を処置する方法であって、本明細書に開示される薬学的組成物を対象に提供する工程を含む方法を含む。

関連する態様において、本発明は、その必要がある対象においてファンコニ貧血を処置するための方法であって、発現カセットを含むCD34⁺細胞を対象に提供する工程を含み、発現カセットは、5'から3'の順に以下：（a）ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター配列またはその機能的ホモログもしくは変種と、（b）ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列と、（c）ウッドチャック肝炎ウイルス調節エレメント（WPRE）RNA輸送シグナル配列またはその機能的変種もしくはフラグメントとを含むポリヌクレオチド配列を含み、ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列が、PGKプロモーター配列に機能的に連結されている、方法、を含む。ある態様において、CD34⁺細胞は、対象から得られた。具体的な態様において、CD34+細胞は、対象を（i）G-CSFまたはフィルグラスチムおよび（ii）プレリキサホルの組み合わせで処置した後に、対象から得られた。具体的な態様において、CD34⁺細胞は、前記発現カセットを含む組換え遺伝子送達ベクターを用いて形質導入された。1つの態様において、CD34⁺細胞は、CD34⁺細胞と前記組換え遺伝子送達ベクターを約24時間接触させることによって形質導入された。

別の態様において、本発明は、その必要がある対象においてファンコニ貧血を処置するための方法であって、（a）対象に（i）G-CSFまたはフィルグラスチムおよび（ii）プレリキサホルの組み合わせを提供し、対象においてCD34+細胞を動員する工程、（b）対象からCD34⁺細胞を含む生物学的サンプルを入手する工程であって、生物学的サンプルが任意で末梢血または骨髄である、工程、（c）該生物学的サンプルからCD34+細胞が濃縮された細胞集団を調製する工程、（d）5'から3'の順に以下：（i）プロモーター配列またはその機能的ホモログもしくは変種と、（ii）ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列とを含むポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む組換え遺伝子送達ベクターを用いて、CD34+細胞が濃縮された細胞集団に形質導入する工程であって、ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列が、PGKプロモーター配列に機能的に連結されており、該形質導入が、CD34⁺細胞が濃縮された細胞集団とレンチウイルスベクターを約24時間接触させることを含む、工程、ならびに（e）工程（d）に起因するレンチウイルスベクターを用いて形質導入された細胞集団を対象に提供する工程を含む、方法、を提供する。ある態様において、前記細胞集団を調製する工程は、赤血球を除去する工程および／または陽性選択、陰性選択もしくはそれらの組み合わせによりCD34⁺細胞を濃縮する工程を含む。具体的な態様において、この方法は、対象におけるファンコニ貧血の発症を阻害する、ファンコニ貧血の進行を停止させる、および／またはファンコニ貧血の血液学的症状の進行を逆転させる。具体的な態様において、ファンコニ貧血の血液学的症状は、BMF、血小板減少症、白血球減少症、汎血球減少症、好中球減少症および貧血のうちの1つまたは複数から選択される。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなり、かつそれらに包含される。

例示的な構築物PGK-FANCA.WPRE^*LVの概要図である。 図2Aは、異なる内部プロモーターの制御下でFANCAを発現するLVの概要図である。図2Bは、パネルAに示されるベクターを用いて形質導入されたFA-A細胞におけるFANCAのウェスタンブロット分析を示す。遺伝子療法に供されたFA-Aマウス由来の造血前駆体のMMC高感受性の矯正を示す。FA-A骨髄（BM）細胞にPGK_FANCA-WPRE^*または対照SF1-EGFP LVを用いて形質導入し、照射したFA-Aマウスに移植した。移植から7ヵ月後に、BMサンプルを収集し、漸増濃度のマイトマイシンC（MMC）の存在下、メチルセルロース中で培養した。 図3は、異なる内部プロモーターの制御下でFANCAを発現するレンチウイルスベクターの機能分析を示すデータを表す。図3Aは、LVを用いて形質導入されたFA-Aリンパ芽球細胞株（LCL）細胞のMMC感受性の逆転を示す。3回の異なる実験の平均値が示されている。図3Bは、ベクターを用いて形質導入され、マイトマイシンC（MMC)に暴露されたFA-A LCLにおける核内FANCD2フォーカスの形成回復を示す。 図4は、PGK-FANCA.Wpre^* LVを用いたFA遺伝子療法のインビボ効果および安全性を示すデータを表す。図4Aは、その構築物を示す。図4Bは、FA-Aマウス由来の骨髄（BM）細胞にFANCA LVを用いて形質導入し、次いで照射したFA-Aレシピエントマウスに移植する方法を示す。図4Cは、移植されたFA-Aマウス由来のBMサンプルを、MMCの非存在下および存在下、メチルセルロース中で培養したことを示す。 図5は、PGKプロモーターの制御下に治療用FANCA遺伝子を有するレンチウイルスベクターを用いて事前に形質導入された同系骨髄細胞を移植されたFANCA^-/-マウスにおけるプロウイルスコピー数を示す。PB=末梢血；BM=骨髄。 図6は、この医療用品を用いる遺伝子療法に供されたFAAマウス由来の造血前駆体のMMC高感受性の矯正を示すデータを表す。FA-A骨髄（BM）細胞に、PGK_FANCA-Wpre^*またはSF1-EGFP LVを用いて形質導入し、照射したFA−Aマウスに移植した。移植から7ヵ月後に、BMサンプルを収集し、漸増濃度のMMCの存在下、メチルセルロース中で培養した。 図7は、3名のファンコニ貧血患者由来の凍結保存された骨髄前駆体の改善された形質導入効率を示す。サンプルを、2時間の静的プレロード後の1回の形質導入サイクル（16時間）からなる標準的な形質導入（白色バー；1xS）またはレンチウイルスベクターを用いた3回の形質導入サイクル（2時間＋2時間＋12時間）からなる改善された形質導入（灰色バー；3xD）に供した。 図8は、PGKプロモーターの制御下でFANCAを発現するレンチウイルスベクターの機能的特性に対するWPRE配列の関連性を示す。図8A：PGK-FANCAおよびPGK-FANCA-WPRE LVを用いて形質導入されたFA-A LCLの（MMC）感受性の逆転。3回の異なる実験の平均値が示されている。図8B：SFFV-FANCA LVおよびPGK-FANCA LV（「Expt 1」）ならびにPGK-FANCAおよびPGK-FANCA-WPRE LV（「Expt 2」）を用いて形質導入されたFA-A造血前駆体（コロニー形成細胞、CFC）のMMC感受性の逆転。白色バー＝MMCなし；黒色バー＝10 nM MMC。MMC=マイトマイシンC。 図9は、EGFP-LVを用いてファンコニ貧血患者の骨髄由来の造血前駆体に形質導入する上でのGALV-TRおよびVSV-G偽型レンチウイルスベクターの効果を示す。 図10は、hPGKプロモーターを有するレンチウイルスベクターの低いインビトロ形質転換能を示す。図10A：ベクターの概要。図10B：再プレーティング回数／コピー数で測定される形質転換能。 図11は、例示的な造血幹細胞（HSC）収集およびFA-A患者の遺伝子療法試験の概要である。 図12は、実施例に記載される研究における動員された患者の血液学的パラメータを示す。図12Aは、ヘモグロビンについての結果を示す。図12Bは、好中球についての結果を示す。図12Cは、血小板についての結果を示す。図12Dは、CD34+細胞についての結果を示す。 図13は、ファンコニ貧血患者におけるプレリキサホル（モゾビル）およびフィルグラスチム（G-CSFとしても公知）（ニューポジーン）処置後のCD34+細胞の動員および収集の安全性および効果の評価を目的とするFancostemプロトコル第II相研究を示す。患者数は10名である。 図14は、FA-A患者におけるCD34+細胞のG-CSF/プレリキサホルを通じた動員を示す。 図15は、FA-A患者におけるCFCのG-CSF/プレリキサホルを通じた動員を示す。 図16は、G-CSF/プレリキサホル動員されたFA-A患者において収集されたCD34+細胞の概要である。図16Aは、FANCOSTEMにおけるCD34+細胞の収集を示し、図16Bは、以前の研究との比較を示す。 図17は、骨髄（BM）における推定CD34+細胞数と動員末梢血（mPB）における実数の間の比較を示すチャートである。 図18は、動員末梢血（mPB）FA-A CD34+細胞の収集および精製のチャートである。 図19は、健常ドナー（HD）およびFA患者からの動員末梢血（mPB）CD34+細胞の免疫選択前および後のCD34発現を示す。 図20は、患者FA 02005がFANCOSTEMおよびFANCOLENの両研究の基準に適合することを示す。図20Aは、細胞計測数を示す。図20Bは、造血幹細胞（HSC）量 対 年齢を示す。 図21（A〜E）は、遺伝子療法前の患者FA-02005のFA診断を示す試験結果を表す。 図22は、FA-A患者02005のための細胞製造プロセスのフォローアップパラメータを示す。 図23は、患者FA-02005における遺伝子療法前および遺伝子療法から2週間、4週間、6週間、2ヵ月、3ヵ月、4カ月および5ヵ月後のベクターコピー数を示すグラフである。 図24は、ヘモグロビン量によって測定される、遺伝子療法前および後の第1の未調整FA-A患者（FA-02005）のフォローアップを表す。 図25は、好中球量によって測定される、遺伝子療法前および後の第1の未調整FA-A患者（FA-02005）のフォローアップを表す。 図26は、血小板量によって測定される、遺伝子療法前および後の第1の未調整FA-A患者（FA-02005）のフォローアップを表す。 図27は、患者FA-A02002の血液学的評価のチャートである。 図28は、非モザイク；ホモ接合型FANCA c.239 C>T p.Gln99^*MMC高感受性；FANCにより補完、としてのFA 02002の診断を示す。 図29は、患者FA-A02002における細胞製造プロセスを示す。 図30は、健常ドナー（HD）および患者FA 02002におけるLV形質導入に必要とされる異なる工程の間のFA動員末梢血（mPB）におけるCD34発現の分析を表す。 図31は、患者FA 02002における遺伝子療法前および後のベクターコピー数を示すグラフである。 図32は、ヘモグロビン量によって測定される、凍結保存細胞を輸注された患者FA-A 02002のフォローアップのデータを表す。 図33は、好中球量によって測定される、凍結保存細胞を輸注された患者FA-A 02002のフォローアップのデータを表す。 図34は、血小板量によって測定される、凍結保存細胞を輸注された患者FA-A 02005のフォローアップのデータを表す。 図35は、検証された条件を用いたFA-A患者由来の新しい動員末梢血（mPB）CD34+細胞の形質導入を示す。図35Aは、そのプロトコルを表す。図35Bは、患者02002からの結果のグラフを示す。図35Cは、患者02003からの結果のグラフを示す。図35Dは、患者02004からの結果のグラフを示す。 図36は、NSGマウスにおける矯正されたFA-A mPB CD34+細胞の生着のデータを示す。図36Aは、そのプロトコルを示す。図36Bは、患者02002からの結果のグラフを示す。パネルCは、患者02003からの結果のグラフを示す。図36Dは、患者02004からの結果のグラフを示す。mPB＝動員末梢血。 図37は、NODスキッドガンマ（NSG）マウスにおける患者02002からの矯正されたFA HPCのインビボ選択を示す。図37Aは、そのプロトコルを示す。図37Bは、移植前のCFCのグラフを示す。図37Cは、移植後30日のhCFCのグラフである。 図38は、CMVプロモーターの制御下でVSVのエンベロープG糖タンパク質をコードし、選択の目的でカナマイシン耐性遺伝子を有する5.7 kbプラスミドのマップである。 図39は、CMVプロモーターの制御下でHIV-1 rev遺伝子をコードし、選択の目的でカナマイシン耐性遺伝子を有する3.5 kbプラスミドのマップである。 図40は、CMVプロモーターの制御下でHIV-1構造および酵素タンパク質をコードするHIV-1 gagおよびpol遺伝子を含む8.8 kbプラスミドのマップである。それは、ヒトベータグロビンのイントロン2（HBB2）、HIV-1 Rev応答エレメント（RRE）およびカナマイシン耐性遺伝子を含む。 図41は、11621塩基対の移入カセットpCCL-SIN-cPPT/CTS-hPGK-hFANCA-WPREのマップである。 図42は、FA造血幹細胞（HSC）におけるFANCA-LV挿入部位のLAM-PCR分析を表す。 図43は、FANCA-LV処置細胞の追跡に関するLAM-PCR結果を示す。図43Aはそのプロトコルを示し、図43Bはそのデータのチャートである。 図44は、LV矯正HSCを移植されたFanca -/-レシピエントのクローン多様性を示す。図44Aはそのプロトコルを示し、図44Bはそのデータのグラフである。

発明の詳細な説明
本発明は、概して、分子生物学およびウイルス学の分野、特に、遺伝子発現カセットならびに（例えば、ペプチド、ポリペプチド、リボザイムおよび触媒性RNA分子を含む）選択された治療用構築物をコードする核酸セグメントを脊椎動物の選択された細胞および組織に送達するのに有用なそれらを含むベクターに関する。特に、これらの遺伝子構築物は、FANCA遺伝子産物の機能不全に関連する哺乳動物、特にヒトの疾患、障害および機能不全を処置するための遺伝子療法に有用である。

ある態様において、本発明は、ファンコニ貧血（FA）を有する対象の遺伝子療法処置のための組成物および方法を提供する。特に、FANCA遺伝子発現を回復させるための組成物および方法が提供される。本明細書に開示される具体的方法は、ヒトFANCAをFA、特にFA-Aを有する対象の造血前駆細胞に送達するためのレンチウイルスの使用に関連する。

定義
それ以外の定義がなされていない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施には、本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料が使用され得るが、以下では適当な方法および材料について記載する。本明細書中で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、明示的に、それらの全体が参照により組み入れられる。相反する場合、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、本明細書に記載される材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。

「ベクター」とは、本明細書中で使用されるように、ポリヌクレオチドを含むかまたはポリヌクレオチドと会合し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る高分子または高分子が会合したものをさす。例示的なベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター）、リポソーム、およびその他の遺伝子送達媒体が含まれる。

「LV」という用語は、レンチウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその誘導体をさすために使用され得る。この用語は、そうでないことが必要とされる場合を除き、全ての亜型をカバーし、天然に存在する型および組換え型の両方をカバーする。

本明細書中で使用されるように、「遺伝子」または「コード配列」という用語は、遺伝子産物をコードするインビトロまたはインビボのヌクレオチド配列をさす。いくつかの場合において、遺伝子は、コード配列、即ち、遺伝子産物をコードする配列からなるか、または本質的になる。他の場合において、遺伝子は、付加的な非コード配列を含む。例えば、遺伝子は、コード領域に先行する領域および後続する領域、例えば、5'非翻訳（5'UTR）または「リーダー」配列および3'UTRまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでいてもよいし、または含んでいなくてもよい。

本明細書中で使用されるように、「治療用遺伝子」とは、発現された時、それが存在する細胞もしくは組織に対して、またはその遺伝子が発現される哺乳動物に対して、有益な効果を付与する遺伝子をさす。有益な効果の例には、状態もしくは疾患の兆候もしくは症状の改善、状態もしくは疾患の防止もしくは阻害、または所望の特徴の付与が含まれる。治療用遺伝子には、細胞または哺乳動物における遺伝子欠損を矯正する遺伝子が含まれる。

本明細書中で使用されるように、トランスジーンとは、ベクターによって細胞へ送達される遺伝子である。

本明細書中で使用されるように、「遺伝子産物」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、または低分子干渉RNA（siRNA）、miRNA、もしくは低分子ヘアピン型RNA（shRNA）を含む干渉RNAのような、ポリヌクレオチド配列の所望の発現産物をさす。

本明細書中で使用されるように、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをさす。これらの用語には、修飾されたアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションも包含される。

「含む」とは、例えば、組成物、方法、キット等において、明記された要素が必要とされるが、特許請求の範囲の範囲内で、例えば、組成物、方法、キット等を形成するため、他の要素が含まれていてもよいことを意味する。例えば、プロモーターに機能的に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットとは、遺伝子およびプロモーターに加えて、他のエレメント、例えば、ポリアデニル化配列、エンハンサーエレメント、その他の遺伝子、リンカードメイン等を含んでいてもよい発現カセットである。

「から本質的になる」とは、記載された、例えば、組成物、方法、キット等の範囲が、例えば、組成物、方法、キット等の基本的な新規の特徴に実質的に影響しない明示された材料または工程に限定されることを意味する。例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列に機能的に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子「から本質的になる」発現カセットは、遺伝子の転写または翻訳に実質的に影響しない限り、付加的な配列、例えば、リンカー配列を含んでいてもよい。もう一つの例として、明記された配列「から本質的になる」バリアントまたは変異体、ポリペプチド断片は、それが由来した全長未処理ポリペプチドに基づく配列の境界において、約10個のアミノ酸残基が付加されたまたは除去された、明記された配列のアミノ酸配列を有し、例えば、明記された境界アミノ酸残基より10残基、9残基、8残基、7残基、6残基、5残基、4残基、3残基、2残基、または1残基少ないか、または明記された境界アミノ酸残基より1残基、2残基、3残基、4残基、5残基、6残基、7残基、8残基、9残基、または10残基多い。

「からなる」とは、特許請求の範囲において明示されていない要素、工程、または成分が、組成物、方法、またはキットから排除されることを意味する。例えば、プロモーターに機能的に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子および転写後制御エレメント「からなる」発現カセットとは、プロモーター、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および転写後制御エレメントからのみなる。もう一つの例として、「明記された配列からなる」ポリペプチドは、明記された配列のみを含有している。

「発現ベクター」には、本明細書中で使用されるように、関心対象の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含み、意図された標的細胞における遺伝子産物の発現の達成のために使用される、前述のまたは当技術分野において公知のベクター、例えば、プラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソーム等が包含される。発現ベクターは、標的における遺伝子産物の発現を容易にするためにコード領域に効果的に連結された調節エレメントも含む。調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、UTR、miRNAターゲティング配列等と、発現のために機能的に連結されている遺伝子との組み合わせは、時に、「発現カセット」と呼ばれる。多くのそのような調節エレメントは、当技術分野において公知であり入手可能であるか、または当技術分野において入手可能な成分から容易に構築され得る。

「プロモーター」には、本明細書中で使用されるように、RNAポリメラーゼとの結合を指図し、それによって、RNA合成を促進するDNA配列、即ち、転写を指図するのに十分な最小配列が包含される。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は、偏在性、即ち、広範囲の細胞、組織、および種において強い活性を有するものであってもよいし、または細胞型特異的、組織特異的、もしくは種特異的であってもよい。プロモーターは、「構成性」、即ち、絶えず活性を有するものであってもよいし、または「誘導性」、即ち、生物要因もしくは非生物要因の存在もしくは欠如によって活性化されるかもしくは不活化されるものであってもよい。プロモーター配列に近接していてもよいしまたは近接していなくてもよいエンハンサー配列も、本発明の核酸構築物またはベクターに含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性の遺伝子発現に影響を及ぼし、ネイティブ遺伝子の5'または3'の領域に位置していてよい。

「エンハンサー」には、本明細書中で使用されるように、隣接している遺伝子の転写を刺激するかまたは阻害するシス作用性エレメントが包含される。転写を阻害するエンハンサーは、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、コード配列および転写される領域の下流の位置から数キロ塩基対（Kb）までの距離において、いずれかの方向に機能することができる（即ち、コード配列に関連していてよい）。

「終結シグナル配列」には、本明細書中で使用されるように、例えば、ポリアデニル化シグナル配列のような、RNAポリメラーゼの転写の終結を引き起こす遺伝子エレメントが包含される。

本明細書中で使用されるように、「効果的に連結された」または「機能的に連結された」という用語は、エレメントが期待された様式で機能することを可能にする関係にある、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル配列、ポリアデニル化配列等の並置をさす。例えば、プロモーターが、コード配列の転写の開始を助ける場合、そのプロモーターは、そのコード領域に効果的に連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在する残基が存在してもよい。

本明細書中で使用されるように、「異種」という用語は、それが比較されているエンティティの残りのものと遺伝子型が異なるエンティティに由来することを意味する。例えば、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに遺伝子工学技術によって導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。もう一つの例として、ネイティブコード配列から除去され、天然には連結されていることが見出されないコード配列に効果的に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。従って、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むLVベクターは、天然に存在する野生型LVに通常含まれない核酸を含むLVベクターであり、コードされた異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型LVによって通常コードされない遺伝子産物である。

ヌクレオチド分子または遺伝子産物に関して、本明細書中で使用されるように、「内在性」という用語は、宿主ウイルスもしくは宿主細胞に天然に存在するかまたは宿主ウイルスもしくは宿主細胞に関連している核酸配列、例えば、遺伝子もしくは遺伝子エレメント、または遺伝子産物、例えば、RNA、タンパク質をさす。

「ネイティブ」という用語は、本明細書中で使用されるように、野生型ウイルスまたは野生型細胞に存在するヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、または遺伝子産物、例えば、RNA、タンパク質をさす。

「バリアント」という用語は、本明細書中で使用されるように、参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列、例えば、ネイティブポリヌクレオチド配列またはネイティブポリペプチド配列の変異体、即ち、参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列との100％未満の配列同一性を有するものをさす。換言すると、バリアントは、参照ポリヌクレオチド配列、例えば、ネイティブポリヌクレオチド配列またはネイティブポリペプチド配列と比べて、少なくとも1個のアミノ酸の違い（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。例えば、バリアントは、全長ネイティブポリヌクレオチド配列との70％以上の配列同一性、例えば、全長ネイティブポリヌクレオチド配列との75％または80％またはそれ以上、例えば、85％、90％、または95％、またはそれ以上の同一性、例えば、98％または99％の同一性を有するポリヌクレオチドであり得る。もう一つの例として、バリアントは、全長ネイティブポリペプチド配列との70％以上の配列同一性、例えば、全長ネイティブポリペプチド配列との75％または80％またはそれ以上、例えば、85％、90％、または95％、またはそれ以上の同一性、例えば、98％または99％の同一性を有するポリペプチドであり得る。バリアントには、参照配列、例えば、ネイティブ配列の断片との70％以上の配列同一性、例えば、ネイティブ配列との75％または80％またはそれ以上、例えば、85％、90％、または95％、またはそれ以上の同一性、例えば、98％または99％の同一性を共有している、参照配列、例えば、ネイティブ配列のバリアント断片も含まれ得る。

本明細書中で使用されるように、「生物学的活性」および「生物学的活性を有する」という用語は、細胞における特定の生物学的要素に起因する活性をさす。例えば、「免疫グロブリン」、「抗体」、またはその断片もしくはバリアントの「生物学的活性」とは、抗原決定基に結合し、それによって、免疫学的機能を容易にする能力をさす。もう一つの例として、ポリペプチドまたはその機能性の断片もしくはバリアントの生物学的活性とは、ポリペプチドまたはその機能性の断片もしくはバリアントの、ネイティブの機能、例えば、結合、酵素活性等を実施する能力をさす。第三の例として、遺伝子制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、コザック配列等の生物学的活性とは、制御エレメントまたはその機能性の断片もしくはバリアントの、機能的に連結されている遺伝子の発現を制御する能力、即ち、それぞれ、その翻訳を促進するか、増強するか、または活性化する能力をさす。

「投与」または「導入」という用語は、本明細書中で使用されるように、組換えタンパク質発現のためのベクターの、細胞、対象の細胞および/もしくは器官、または対象への送達をさす。そのような投与または導入は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行われ得る。遺伝子産物の発現のためのベクターは、典型的には、物理的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、電気穿孔、微量注入、もしくはリポフェクション）による細胞への異種DNAの挿入を意味するトランスフェクション；典型的には、感染媒介物、即ち、ウイルスによる導入をさす感染；または、典型的には、ウイルスによる細胞の安定的感染、もしくはウイルス性媒介物（例えば、バクテリオファージ）による微生物から微生物への遺伝材料の転移を意味する形質導入によって、細胞へ導入され得る。

「形質転換」とは、典型的には、異種DNAを含む細菌、または、腫瘍細胞のような、癌遺伝子を発現し、従って、持続的な増殖モードに変換されている細胞をさすために使用される。細胞を「形質転換する」ために使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、またはその他の媒体であり得る。

典型的には、細胞は、異種DNA（即ち、ベクター）の細胞への投与、導入、または挿入のために使用される手段に依って、「形質導入される」、「感染させられる」、「トランスフェクトされる」、または「形質転換される」と呼ばれる。「形質導入される」、「トランスフェクトされる」、および「形質転換される」という用語は、異種DNAの導入の方法に関わらず、本明細書中で交換可能に使用され得る。

「宿主細胞」という用語は、本明細書中で使用されるように、ベクターを用いて形質導入された、感染させた、トランスフェクトされた、または形質転換された細胞をさす。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等であり得る。温度、pH等のような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で従来使用されているものであり、当業者には明らかであろう。「宿主細胞」という用語は、最初の形質導入された、感染させられた、トランスフェクトされた、もしくは形質転換された細胞、およびそれらの子孫をさすことが理解されるであろう。

「処置」、「処置する」等の用語は、一般に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果の入手を意味するために本明細書中で使用される。効果は、疾患もしくはその症状の完全もしくは部分的な防止、例えば、対象において疾患もしくはその症状が発生する可能性の低下という点で予防的であってもよいし、かつ/または疾患および/もしくは疾患に起因する有害効果の部分的もしくは完全な治療という点で治療的であってもよい。「処置」には、本明細書中で使用されるように、哺乳動物における疾患の処置をカバーし、（a）疾患の素因を有するが、未だそれを有すると診断されていない対象における疾患の発生の防止；（b）疾患の阻害、即ち、その発症の阻害；または（c）疾患の軽減、即ち、疾患の退縮の誘導：が含まれる。治療剤は、疾患または損傷の発症の前、途中、または後に投与され得る。進行中の疾患の処置は、処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化するかまたは低下させる場合、特に重要である。そのような処置は、望ましくは、影響された組織における機能の完全な喪失の前に実施される。本発明の治療は、望ましくは、疾患の症候期に投与され、いくつかのケースにおいては、疾患の症候期の後に投与されるであろう。

「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サルおよびヒト；哺乳類競技動物（例えば、ウマ）；哺乳類家畜（例えば、ヒツジ、ヤギ等）；哺乳類ペット（イヌ、ネコ等）；ならびに齧歯類（例えば、マウス、ラット等）を含むが、これらに限定されるわけではない、哺乳動物をさす。本明細書中で使用される用語法は、具体的な態様を記載するためのものに過ぎず、本発明を限定するためのものではない。本明細書中で使用されるように、単数形「（a）」、「（an）」、および「（the）」には、前後関係がそうでないことを明白に示さない限り、複数形も含まれるものとする。さらに、「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「含む（with）」という用語、またはそれらの変化形が、詳細な説明および/または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される場合、そのような用語は、「含む（comprising）」という用語と同様に包括的であるものとする。

「約」または「およそ」という用語は、値が測定されるかまたは決定される方法、即ち、測定系の限界に一部分依存する、当業者によって決定される特定の値についての許容される誤差の範囲内を意味する。例えば、「約」とは、当技術分野における実務に従い、1標準偏差内または1標準偏差超を意味することができる。あるいは、「約」とは、所定の値の20％まで、好ましくは、10％まで、より好ましくは、5％まで、さらに好ましくは、1％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に、生物学的な系または過程に関して、その用語は、ある値の1桁以内、好ましくは、5倍以内、より好ましくは、2倍以内を意味することができる。特定の値が本願および特許請求の範囲において記載される場合、そうでないことが記述されない限り、「約」という用語は、特定の値の許容される誤差の範囲内を意味すると想定されるべきである。

本発明の実施は、そうでないことが示されない限り、当業者の範囲内にある細胞生物学、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を利用する。そのような技術は、参照によって各々明示的に本明細書に組み入れられる、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition(Sambrook et al, 1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait, ed., 1984)；"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney, ed., 1987)；"Methods in Enzymology"(Academic Press, Inc.)；"Handbook of Experimental Immunology"(D.M.Weir & C.C.Blackwell, eds.)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(J.M.Miller & M.P.Calos, eds., 1987)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel et al, eds., 1987)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)；および"Current Protocols in Immunology"(J.E.Coligan et al., eds., 1991)のような文献において完全に説明されている。

本発明の様々な局面が、例示のための実施例を参照しつつ以下に記載されている。多くの具体的な詳細、関係および方法は本発明の完全な理解を提供するために示されていることが理解されるべきである。しかし、関連分野の通常の知識を有する者は、本発明が、それらの具体的な詳細の1つもしくは複数なしでまたは他の方法により実施され得ることを直ちに理解するであろう。本発明は、示されている行為または事象の順序によって限定されず、いくつかの行為は異なる順でおよび／または他の行為もしくは事象と同時に行われ得る。さらに、本発明にしたがう方法を実施するためにすべての示されている行為または事象が必要とされるわけではない。

それ以外のことが示されていない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、それらが当業者に理解されているのと同じ意味を有し、本発明の実施には、当業者が知っている微生物学および組換えDNA技術の従来技術が用いられる。

ある態様において、本開示は、細胞内で遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドカセットおよび発現ベクターを提供する。例えば障害の処置または予防のために、細胞内、例えば個体内での遺伝子の発現を促進するための薬学的組成物および上記組成物のいずれかの使用方法も提供される。本発明のこれらおよび他の目的、利点および特徴は、以下でより十分に説明されている組成物および方法の詳細を読むことで当業者に明らかとなるであろう。

ある態様において、動物、特にヒトにおける疾患、障害および機能不全の中枢および標的化遺伝子療法において有用な医薬の製造において使用するための、これらの遺伝子発現カセットを含む遺伝子療法用ベクター組成物、例えばウイルスベクターを製造するための方法および組成物が提供される。

いくつかの態様において、本発明は、FANCA cDNAの発現を誘導するhPGK真核生物プロモーターを有するLVベクターに基づくファンコニ貧血のための遺伝子療法を提供する。この治療用ベクターは、ヒト造血幹細胞（HSC）に形質導入するために使用され得、該細胞はその後、ファンコニ貧血を有するヒトに移植され得る。

ある態様において、本発明は、ファンコニ貧血の遺伝的矯正のためのFANCA LVベクターを提供する。全体として、結果は、臨床用に設計されたLVを用いたFAの遺伝子療法の実現可能性を実証している。

開示される組成物は、様々なヒト疾患の予防および処置を含む、様々な調査、診断および治療計画において利用され得る。本発明の様々な組成物および方法が、以下に記載されている。

具体的な組成物および方法が本明細書で例示されているが、任意の多くの代替組成物および方法が適用可能であり、本発明を実施する上での使用に適することが理解される。本発明の発現構築物および方法の評価は当技術分野の標準的な方法を用いて実施され得ることも理解されるであろう。

ファンコニ貧血
ファンコニ貧血（FA）は、主として骨髄不全（BMF）および癌体質により特徴づけられる稀な遺伝性染色体不安定症候群である（Butturini A et al. Blood. 1994; 84; 1650-1655; Kutler DI et al. Blood. 2003; 101: 1249-1256）。FAの有病率は、100万人あたり1〜5人であり、ヘテロ接合型キャリアの頻度は、300人に1人と見積もられている（Tamary H et al. Eur J Haematol. 2004; 72: 330-335）。

FAは、遺伝的にも表現型的にも不均一である。今日まで、対応する13のファンコニ貧血相補群（FANC）遺伝子：FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1/BRCA2、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG/XRCC9、FANCI、BRIP1/FNACJ、FANCL、FANCM/HefおよびFANCN/PABLB2における変異に関連する13の相補群が報告されている（FA-A、B、C、D1、D2、E、F、G、I、J、L、MおよびN）（Wang W. Nat Rev Genet. 2007; 8: 735-748）。FA-B患者の例を除いて（FANCBはX染色体に位置する）、FAは常染色体劣性である。

FA遺伝子によってコードされるタンパク質は、FA/BRCA経路として公知の生化学的経路に関与する（Wang W. Nat Rev Genet. 2007; 8: 735-748を参照のこと）。FA経路において13のFAタンパク質が同定されており、それらは各々、現時点でこの経路において特徴づけられている3つのFAタンパク質複合体のうちの1つに関与する。その上流複合体であるFAコア複合体は、8つのFAタンパク質（FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FANCM）ならびに2つのFA関連タンパク質（FAAP24およびFAAP100）によって構成される。第2の複合体は、ともにFA-ID複合体において機能するFANCD2およびFANCIによって形成される。FAコア複合体のE3リガーゼ活性（FANCL）により、FANCD2およびFANCIは、モノユビキチン化され得、その後にクロマチンにロードされ得、DNA損傷または複製の停止に応答して大きな核内フォーカスを形成し得る。最後に、モノユビキチン化FANCD2/FANCIは、BRCA1およびRAD51等の相同組換え修復（HDR）に関与するタンパク質と安定な複合体を形成する下流のFAタンパク質、例えばFANCJ/BRIP1、FANCN/PALB2およびFANCD1/BRCA2と相互作用する。

FA-Aは、最も多いFA相補群であり、FA患者の約50％〜80％がこの相補群に相当する（Casado JA et al. J Med Genet. 2007; 44: 241-249; Levitus M et al. Blood. 2004; 103: 2498-2503; Taniguchi T, D'andrea AD. Blood. 2006; 107: 4223-4233）。FANCAの欠如またはヌル発現の結果として、FAコア複合体は、形成され得ない。これは、ID複合体の活性化を妨げ、その結果として、これらのタンパク質がクロマチンに移動するのを妨げ、それによってFA細胞の特徴的な表現型を生じる。

D'Andreaら（Blood. 1997; 90: 1725-1736）によってレビューされているように、FA細胞は、主に細胞生存、DNA修復およびゲノム安定性の欠如に関連する異なる細胞表現型によって特徴づけられる。

FAは主として、先天性異常、骨髄不全の発症ならびに急性骨髄性白血病および特定の固形腫瘍を発症する危険の高さによって特徴づけられる。平均して、FA患者の70％は先天性異常を有する。骨格異常（橈側列、臀部、脊柱側弯症、肋骨）および全身皮膚色素過剰であるカフェオレ斑点が、FA患者の60〜70％で見られる。大部分の患者は、小人症を有し、彼らのおよそ3分の1は、小眼球症および腎臓異常を有する。FA患者の約30％では、明白な先天性異常が観察されない（Tischkowitz M, Dokal I. Br J Haematol. 2004; 126: 176-191）。

FA患者の最も重要な臨床的特徴は、血液学である。骨髄不全（BMF）は、この疾患の主たる特徴である。それは一般に、5歳〜10歳の間に発症する。15歳の患者の80％はBMFを発症し、BMFの保険数理上の危険は40歳で90％を超える（Butturini et al., 1994, Kutler et al., 2003）。典型的に、血小板減少症または白血球減少症が貧血の前に発症する。汎血球減少症は一般に、時間と共に悪化する。好中球減少症は、感染の危険の増加を伴う。

FA患者はまた、癌、主として急性骨髄性白血病（AML）および骨髄異形成症候群（MDS）を発症しやすい。FAに関連する腫瘍の大部分は、13歳以降に発症し、その平均年齢は23歳である。AMLの相対的危険は785倍増加し、AMLを発症するFA患者の年齢の中央値は14歳であり、血液学的悪性腫瘍の累積発生率は40歳までに30〜55％である（Kutler et al., 2003; Rosenberg PS et al. Blood. 2003; 101: 822-826）。より高年齢のFA患者もまた、固形腫瘍、主として扁平上皮癌（SCC）を発症する高い危険を有する。これらの患者が固形腫瘍を発症する年齢の中央値は26歳であり、固形腫瘍の累積発生率は40歳までに30％である（Kutler et al., 2003, Rosenberg et al., 2003）。

FAの複合的な臨床的症状のために、これらの患者の管理は主として骨髄不全（BMF）、骨髄性白血病および固形腫瘍の症状の減少に焦点を合わせている。FA患者の対する現在の治療法の各々の制約は、CIEMAT/CIBER on Rare Diseaseがそのスポンサーである、FANCA遺伝子を有するレンチウイルスベクターに関する希少疾病用医薬品文書で報告されている（Bueren, J. (2010). Center for Biomedical Network Research on Rare Diseases Ref EU/3/10/822）。

ある態様において、動物および特にヒトにおける疾患、障害および機能不全の中枢および標的化遺伝子療法に有用な医薬の製造において使用される、これらの遺伝子発現カセットを含む、遺伝子療法ベクター組成物、例えばウイルスベクターの製造のための方法および組成物が提供される。

いくつかの態様において、本発明は、FANCA cDNAの発現を誘導するhPGK真核生物プロモーターを有するLVベクターに基づくファンコニ貧血のための遺伝子療法を提供する。この治療用ベクターは、ヒト造血幹細胞（HSC）に形質導入するために使用され得、該細胞はその後、ファンコニ貧血を有するヒトに移植され得る。

ある態様において、本発明は、ファンコニ貧血の遺伝的矯正のためのFANCA LVベクターを提供する。全体として、結果は、臨床用に設計されたLVを用いたFAの遺伝子療法の実現可能性を実証している。

本開示は、遺伝子発現カセット（例えば、治療用カセット）、該遺伝子発現カセットを含む遺伝子移入カセット（例えば、組み込みカセット）、該遺伝子移入カセットを含むプラスミド、および該遺伝子移入カセットを含む遺伝子送達ベクターを含む。プロモーター配列に機能的に連結された治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセット、遺伝子移入カセット、プラスミドおよび遺伝子送達ベクター。ある態様において、ポリヌクレオチド配列は、DNAまたはRNAである。ある態様において、遺伝子発現カセットはポリヌクレオチドであり、遺伝子移入カセットはポリヌクレオチドであり、ベクターはウイルス、例えばレンチウイルスである。

ある態様において、治療用遺伝子産物は、FANCAタンパク質またはその機能的フラグメントもしくは変種、任意で野生型ヒトFANCAタンパク質である。

具体的な態様において、遺伝子発現カセットは、プロモーター領域、コード配列および転写後調節エレメントを含む。ある態様において、プロモーター領域は、プロモーター配列またはその機能的フラグメントを含む。1つの態様において、プロモーターは、ヒトPGKプロモーターである。いくつかの態様において、発現カセットはまた、RNA輸送シグナルを含む。RNA輸送シグナルは、wPRE配列を含み得る。いくつかの態様において、治療用遺伝子の発現レベルおよび安定性を改善するよう、いかなる残存オープンリーディングフレームも有さない変異wPRE（Schambach, Bohne et al. 2006）が含まれる。

本発明のいくつかの態様は、FANCA遺伝子産物の発現の増強のための遺伝子発現カセットを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドカセットは、転写時のmRNAの安定性を増加させるため、野生型FANCA cDNAコード配列、または、ヒトFANCA cDNAのコドン最適化バージョンを含む。最適化のため、転写サイレンシングを回避し、従って、トランスジーン発現を増加させるため、GC含量を増加させ、潜在性のスプライス部位を除去する、GeneArt（登録商標）ソフトウェアを使用することができる。あるいは、当技術分野において公知の任意の最適化方法が使用されてもよい。

本発明のいくつかの局面において、本発明の遺伝子送達ベクターと薬学的賦形剤とを含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、本発明の遺伝子送達ベクターと薬学的賦形剤とを含む。

本発明のいくつかの局面において、哺乳動物細胞においてトランスジーンを発現させる方法が提供される。いくつかの態様において、本方法は、1個または複数個の哺乳動物細胞を、有効量の本発明のポリヌクレオチドカセットまたは本発明の遺伝子送達ベクターと接触させる工程を含み、1個または複数個の哺乳動物細胞において検出可能なレベルでトランスジーンが発現される。いくつかの態様において、本方法は、1個または複数個の哺乳動物細胞を有効量の本発明のポリヌクレオチドカセットまたは本発明の遺伝子送達ベクターと接触させる工程を含み、1個または複数個の哺乳動物細胞において治療レベルでトランスジーンが発現される。いくつかの態様において、本方法は、インビトロである。他の態様において、本方法は、インビボである。

本発明のいくつかの局面において、疾患または障害の処置または予防の必要のある哺乳動物における疾患または障害の処置または予防の方法が提供される。いくつかの態様において、本方法は、コード配列が治療用遺伝子産物をコードする本発明の薬学的組成物を、有効量、哺乳動物へ投与する工程を含む。

組成物
本開示のいくつかの局面において、真核生物細胞内でのFANCAトランスジーンの発現のための組成物が提供される。ある態様において、真核生物細胞は、哺乳動物細胞である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、造血幹細胞（HSC）である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、造血前駆体である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、CD34+である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。具体的な態様において、細胞は、本明細書に開示される遺伝子送達によって形質導入された後にそのCD34+細胞によって処置されるべきFAと診断された対象由来であり、開示される遺伝子発現カセットを含むヒトCD34+細胞である。

1つの特定の態様において、本開示は、治療用FANCAタンパク質またはその機能的フラグメントもしくは変種をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含むレンチウイルスベクターを包含する。本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的変種は、参照配列と比較して1つまたは複数のアミノ酸または核酸の欠失、付加または置換を含み、かつ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的活性の少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％を保持している。本明細書で使用される場合、機能的フラグメントは、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのフラグメントであり、かつ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的活性の少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％を保持している。

1つの態様において、レンチウイルスベクターの骨格は、医薬品「ウィスコット・オルドリッチ症候群タンパク質含有レンチウイルスベクター（WASP-LV）」（Ref141/2000）に対応するものと同じであるが、FA処置のために、プロモーターが、遺伝子療法においてすでに使用されている他のプロモーターとの比較でインビボでのその安定的な活性および改善された安全性により特徴づけられるヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（hPGK）プロモーターである（Modlich U, Navarro S, Zychlinski D et al. Insertional Transformationof Hematopoietic Cells by Self-Inactivating Lentivirus And Gammaretroviral Vectors. Mol Ther. 2009; 17: 1919-1928; Montini E, Cesana D, Schmidt M et al. Hematopoietic Stem Cell Gene Transfer in a Tumor prone Mouse Model Uncovers Low Genotoxicity Of Lentiviral Vector Integration. Nat Biotechnol. 2006; 24: 687-696）。

本開示のいくつかの態様において、組成物は、ポリヌクレオチドカセットを含む。「ポリヌクレオチドカセット」とは、典型的には、相互に機能的に連結されている、2種以上の機能性ポリヌクレオチド配列、例えば、制御エレメント、翻訳開始配列、コード配列、終結配列等を含むポリヌクレオチド配列を意味する。同様に、「哺乳動物細胞におけるトランスジーンの発現のためのポリヌクレオチドカセット」とは、細胞におけるトランスジーンの発現を促進する、2種以上の機能性ポリヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、5'UTR、翻訳開始配列、コード配列、終結配列等の組み合わせを意味する。遺伝子発現カセットおよび遺伝子移入カセットは、ポリヌクレオチドカセットの例である。

いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチドカセットは、哺乳動物細胞におけるトランスジーンの発現の増強を提供する。本開示の実施例によって証明されるように、本発明者らは、個々にかつ共同的に哺乳動物細胞におけるトランスジーンの発現の増強を提供する多数のポリヌクレオチドエレメント、即ち、当技術分野において公知のものと比較して改善されたエレメントを発見した。ある態様において、本開示のポリヌクレオチドカセット内の2種以上の機能性ポリヌクレオチド配列の配置は、哺乳動物細胞におけるトランスジーンの発現の増強を提供する。「増強」とは、例えば、当技術分野において公知であるような比較可能な制御エレメントに機能的に連結されたトランスジーンを保持する細胞と比べて、本開示のポリヌクレオチドカセットを保持する細胞において、トランスジーンの発現が増加するか、強化されるか、またはより強力であることを意味する。換言すると、本開示の1種または複数種の最適化されたエレメントを含まないポリヌクレオチドカセット、即ち、参照対照からの発現と比べて、本開示のポリヌクレオチドカセットからのトランスジーンの発現は、増加するか、強化されるか、またはより強力である。ある態様において、発現の増強は、1種または複数種の所望の細胞型に特異的であるかまたは限定される。

例えば、トランスジーンの発現は、例えば、当技術分野において公知であるような異なるプロモーターに機能的に連結されたトランスジーンを保持する細胞より、本明細書中に開示されたプロモーターを含むポリヌクレオチドカセットを含む細胞において、増強されるか、または強化されるか、またはより強力であり得る。もう一つの例として、トランスジーンの発現は、異なるエンハンサー配列に機能的に連結されたトランスジーンを保持する細胞より、本明細書中に開示されたエンハンサー配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む細胞において、増強されるか、または増加するか、強化されるか、またはより強力であり得る。

理論によって拘束されることは望まないが、細胞におけるトランスジーンの発現の増強は、細胞における遺伝子産物のより速い組み立てまたは細胞におけるより安定的な遺伝子産物によると考えられる。従って、本開示のポリヌクレオチドカセットによるトランスジーンの発現の増強は、多数の方式で観察され得る。例えば、発現の増強は、ポリヌクレオチドカセットの細胞との接触の後に、例えば、当技術分野において公知であるような比較可能な制御エレメントにトランスジーンが機能的に連結されている場合に発現が検出されるより早く、例えば、2日早く、7日早く、2週間早く、3週間早く、4週間早く、8週間早く、12週間早く、またはそれ以前に、トランスジーンの発現を検出することによって観察され得る。発現の増強は、1細胞当たりの遺伝子産物の量の増加としても観察され得る。例えば、哺乳動物細胞1個当たりの遺伝子産物の量の2倍以上の増加、例えば、3倍以上の増加、4倍以上の増加、5倍以上の増加、または10倍以上の増加が存在し得る。発現の増強は、ポリヌクレオチドカセットによって保持されたトランスジーンを検出可能なレベルで発現する哺乳動物細胞の数の増加としても観察され得る。例えば、検出可能なレベルのトランスジーンを発現する哺乳動物細胞の数の2倍以上の増加、例えば、3倍以上の増加、4倍以上の増加、5倍以上の増加、または10倍以上の増加が存在し得る。

もう一つの例として、本発明のポリヌクレオチドは、従来のポリヌクレオチドカセットと比較して、より大きい百分率の細胞において検出可能なレベルのトランスジーンを促進することができ；例えば、従来のカセットが、例えば、ある領域における細胞の5％未満において検出可能なレベルのトランスジーン発現を促進する場合、本発明のポリヌクレオチドは、その領域における細胞の5％以上において検出可能なレベルの発現を促進し；例えば、接触させられた細胞の10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、または45％以上、いくつかの場合において、50％以上、55％以上；60％以上、65％以上、70％以上、または75％以上、例えば、80％以上、85％以上、90％以上、または95％以上が、検出可能なレベルの遺伝子産物を発現するであろう。発現の増強は、細胞の生存度および/または機能の変更としても観察され得る。

本開示のポリヌクレオチドカセットは、典型的には、プロモーター領域を含む。プロモーター領域が真核細胞におけるコード配列の発現を促進する限り、任意の適当なプロモーター領域またはその中のプロモーター配列が、本発明のポリヌクレオチドカセットにおいて使用され得る。ある態様において、プロモーター領域は、哺乳動物細胞におけるコード配列の発現を促進する。いくつかの場合において、プロモーターは、偏在性プロモーター、即ち、広範囲の細胞、組織、および種において活性を有するプロモーターである。他の場合において、プロモーターは、ヒトPGKプロモーターである。

プロモーターおよびエンハンサーのエレメントは、組織特異的または段階特異的であり得る。例えば、組織特異的なプロモーターまたはエンハンサーは、1種または複数種の特定の細胞型において優先的に発現（またはより高いレベルの発現）を駆動する。細胞型の例には、造血幹細胞、長期造血幹細胞、短期造血幹細胞、多能性前駆細胞、造血CD34+細胞、およびCD34+集団内のクラスタ分化亜集団が含まれるが、これらに限定されるわけではない。段階特異的なプロモーターまたはエンハンサーは、細胞周期または発達の1種または複数種の特定の段階において優先的に発現（またはより高いレベルの発現）を駆動する。これらには、βグロビン遺伝子座調節領域、スペクトリンプロモーター、および赤血球特異的プロモーターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、1種または複数種のエンハンサーを含む。エンハンサーは、転写を増強することが当技術分野において公知の核酸エレメントであり、それらが制御する遺伝子と会合して任意の場所に、例えば、上流、下流、イントロン内等に位置していてよい。プロモーターと組み合わせて使用された時に遺伝子の発現を増強する限り、任意のエンハンサーエレメントが、本開示のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子療法ベクターにおいて使用され得る。

細胞において発現されるコード配列は、任意のポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはcDNA、またはRNAに基づく治療薬（siRNA、アンチセンス、リボザイム、shRNA等）であり得る。コード配列は、機能的に連結されたプロモーター配列に対して異種、即ち、天然には機能的に会合していないものであってよい。あるいは、コード配列は、機能的に連結されたプロモーター配列に対して内在性、即ち、自然界においてそのプロモーターと会合しているものであってもよい。遺伝子産物は、哺乳動物細胞において内因的に作用してもよいし、または外因的に作用してもよく、例えば、分泌されてもよい。例えば、トランスジーンが治療用遺伝子である時、コード配列は、疾患または障害を処置するための治療薬として使用され得る所望の遺伝子産物またはその機能性断片もしくはバリアントをコードする遺伝子であり得る。様々な好ましい態様において、トランスジーンは、ヒトFANCA、すなわちSEQ ID NO: 25をコードする。

本発明の一つの態様において、トランスジーンをコードする配列は、低頻度に提示されるコドンを、より高頻度に提示されるコドンに交換することによって、発現を増強するため、改変されるか、または「コドン最適化」される。コード配列とは、翻訳のためのアミノ酸をコードするmRNA配列の部分である。翻訳においては、61種のトリヌクレオチドコドンの各々が、20種のアミノ酸のうちの1種へ翻訳されるため、遺伝暗号の縮重または重複がもたらされる。しかしながら、異なる細胞型および異なる動物種は、同じアミノ酸をコードする（各々アンチコドンを保持している）tRNAを異なる頻度で利用する。遺伝子配列が、対応するtRNAによって低頻度に提示されるコドンを含有している時、リボソーム翻訳機構は、遅くなり、効率的な翻訳が妨害され得る。特定の種のための「コドン最適化」を介して発現を改善することができ、ここでコード配列は、同じタンパク質配列をコードするが、高度に提示されかつ/または高度に発現されたヒトタンパク質によって利用されるコドンを利用するように、変更される（Cid-Arregui et al, 2003；J.Virol.77:4928）。本発明の一つの局面において、トランスジーンのコード配列は、哺乳動物または霊長類において低頻度に発現されるコドンを、霊長類において高頻度に発現されるコドンに交換するように、改変される。例えば、いくつかの態様において、トランスジーンによってコードされたコード配列は、コード配列の少なくとも1個のコドンが、前記または本明細書中に開示された配列における対応するコドンより高いtRNA頻度をヒトにおいて有する、前記または本明細書中に開示された配列によってコードされたポリペプチドとの少なくとも85％の配列同一性、例えば、少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも98％の同一性、少なくとも99％の同一性を有するポリペプチドをコードする。

本発明の付加的な態様において、トランスジーンをコードする配列は、所望のトランスジーンをコードしないオープンリーディングフレーム（ORF）の終結または除去によって、発現を増強するために改変される。オープンリーディングフレーム（ORF）とは、開始コドンに後続し、終止コドンを含有していない核酸配列である。ORFは、順方向にあってもよいしまたは逆方向にあってもよく、関心対象の遺伝子と比較して「インフレーム」にあってもよいしまたは「アウトオブフレーム」にあってもよい。そのようなオープンリーディングフレームは、関心対象の遺伝子と並んで発現カセットにおいて発現される可能性を有し、不要な有害効果をもたらし得る。本発明の一つの局面において、トランスジーンのコード配列は、コドン使用をさらに変更することによって、オープンリーディングフレームを除去するように改変されている。これは、アミノ酸配列を保存し、関心対象の遺伝子において高度に利用されるコドンを維持しながら（即ち、＜20％の頻度を有するコドンを回避しながら）、開始コドン（ATG）を排除し、逆方向またはアウトオブフレームのORFに終止コドン（TAG、TAA、またはTGA）を導入することによって行われた。本発明において、トランスジーンをコードする配列は、コドン最適化および非トランスジーンORFの除去のいずれかによって、または両方の技術を使用して、最適化され得る。当業者に明らかであるように、コドン最適化において導入されたORFを除去するため、コドン最適化の後に非トランスジーンORFを除去するかまたは最小化することが好ましい。

いくつかの態様において、ポリヌクレオチドカセットは、
（i）ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター配列またはその機能的変種もしくはフラグメント、
（ii）ヒトFANCAタンパク質またはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列、および
（iii）ウッドチャック肝炎ウイルス配列の転写後調節エレメント（WPRE）
を含む。

いくつかの態様において、ポリヌクレオチドカセットは、
（i）ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター配列、
（ii）ヒトFANCAタンパク質をコードする配列、および
（iii）変異WPRE配列
を含む。

いくつかの態様において、ポリヌクレオチドカセットは、
a）5'LTR、任意で改変5'LTR、
b）cPPT配列、
c）PGKプロモーター配列、任意でヒトPGKプロモーター配列、
d）ヒトFANCAタンパク質をコードする配列、任意でcDNA配列またはコドン最適化配列、
e）変異wPRE配列、および
f）3'LTR、任意で改変3'LTR
を含む。

1つの態様において、改変WPREは、WPRE^*と称される。WPRE^*は、オープンリーディングフレームを欠く改変WPREである（例えば、Schambach et al, 2006 Gene Ther. 13: 641-645を参照のこと）。

ある態様において、遺伝子移入カセットは、1つまたは複数の追加エレメント、例えば、以下から選択される1つまたは複数のエレメントを含む：5'LTR、3'LTR、cPPT、CTS、RRE、エンハンサー配列およびパッケージングシグナル。

RRE配列は、遺伝子移入の効率を改善する。本明細書に記載される任意の発現カセットおよび遺伝子送達ベクターの具体的な態様において、RRE配列は、以下の配列または以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列のいずれかを含むかまたはそれからなる：

；または
SEQ ID NO:24のヌクレオチド2649〜2882を含むかもしくはそれからなる配列。

レトロウイルスリーダー領域は、レトロウイルスゲノムをウイルスカプシドにパッケージングするのに関与するパッケージングシグナル（ψ）を含む。LVベクターは、この領域におよそ300 bpのGag遺伝子を必要とすると考えられていた。現在、このGag配列は、わずか40 bpに削減されている（図65）。本明細書に記載される任意の発現カセットおよび遺伝子送達ベクターの具体的な態様において、ψ配列はHIV-1ψ配列であるか、またはψ配列は以下の配列もしくは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列のいずれかを含むかまたはそれからなる：

；または
SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド2031〜2156を含むかもしくはそれからなる配列。

本明細書に記載される任意の発現カセットおよび遺伝子送達ベクターの具体的な態様において、短縮HIV-1 5'LTRは、以下の配列または以下の配列のいずれかに対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列のいずれかを含むかまたはそれからなる：

；または
SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド1586〜9495を含むかもしくはそれからなる配列。

本明細書に記載される任意の発現カセットおよび遺伝子送達ベクターの具体的な態様において、HIV-1自己不活性化3'LTRは、以下の配列または以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列のいずれかを含むかまたはそれからなる：

；または
SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド9262〜9495を含むかもしくはそれからなる配列。

本明細書に記載される任意の発現カセットおよび遺伝子送達ベクターの具体的な態様において、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期プロモーターは、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列のいずれかに対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列のいずれかを含むかまたはそれからなる：

；または
SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド1586〜1789を含むかもしくはそれからなる配列。

組み込まれる前の複合体の核移行を促進するcPPTは、逆転写酵素の分離に関与するCTSと共に、ウイルス力価を向上させることが確認されている（Zennou, et al. 2000; Follenzi et al. 2000）。本明細書に記載される任意の発現カセットおよび遺伝子送達ベクターの具体的な態様において、HIV-1のセントラルポリプリントラクトおよびセントラルターミナル配列（cPPT/CTS）は、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列のいずれかに対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列のいずれかを含むかまたはそれからなる：

；または
SEQ ID NO:24のヌクレオチド3378〜3495を含むかもしくはそれからなる配列。

本明細書に記載される任意の発現カセットおよび遺伝子送達ベクターの具体的な態様において、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ1（hPGK）プロモーターは、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列いずれかに対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列のいずれかを含むかまたはそれからなる：

；または
SEQ ID NO:24のヌクレオチド3541〜4051を含むかもしくはそれからなる配列。

大部分のFA患者はFA-A相補群に属するので（Casado et al., 2007, Levitus et al., 2004, Taniguchi et al., 2006）、具体的な態様において、コードされる治療用遺伝子産物はFANCAであるが、本開示は、他の相補群のFAタンパク質も送達され得ること、したがってそれが例えばFANCAに代わって本明細書に開示される発現カセットにおいてコードされ得ることも想定している。

本明細書に記載される任意の発現カセットおよび遺伝子送達ベクターの具体的な態様において、FANCAをコードするポリヌクレオチド配列は、以下の配列、またはその機能的フラグメント、または以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなるヒトFANCA cDNA配列である：

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本開示は、本明細書に記載される発現カセットまたは移入カセットを含むプラスミドを含む。具体的な態様において、プラスミドは、pCCL-PGK-FANCA-WPRE^*（図41；SEQ ID NO:24）である。

ある態様において、本開示は、本明細書に開示されるプラスミドを含む細胞、例えばパッケージング細胞またはパッケージング細胞株、例えば293細胞を含む。具体的な態様において、細胞は、図38〜41に示されるプラスミドを含む。

ある態様において、本明細書に開示される移入カセットまたはプラスミドはさらに、1つまたは複数の追加エレメント、例えばCMVプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、SV40ポリA配列、複製起点、例えばSV40 ori配列、または本明細書に開示される任意のエレメントを含む。

本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターの具体的な態様において、ヒトCMVエンハンサーは、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターの具体的な態様において、サルウイルス40（SV40）ポリ（A）シグナルは、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターの具体的な態様において、SV40複製起点は、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターのいくつかの態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在するdNEFシグナルは、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターの具体的な態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在するKanR配列は、以下の配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターのいくつかの態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在するrrnGターミネーター（大腸菌（E.coli）リボソームRNA rrnGオペロン由来の転写ターミネーター（Albrechtsen et al, 1991））は、以下の配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターのいくつかの態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在するori(高コピー数ColE1/pMB1/pBR322/pUC複製起点)は、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターのいくつかの態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在するCAP結合部位は、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターのいくつかの態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在する大腸菌lacプロモーターは、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターのいくつかの態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在するlacオペレーターは、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターのいくつかの態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在するT3プロモーター（バクテリオファージT3 RNAポリメラーゼのプロモーター）は、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターのいくつかの態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在するT7プロモーター（バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼのプロモーター）は、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書に記載される任意の移入カセット、プラスミドまたはベクターのいくつかの態様において、本明細書に記載される任意の発現カセットまたは遺伝子送達ベクターに存在するf1 ori（f1バクテリオファージ複製起点）は、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる：

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本明細書で議論されているように、本発明のポリヌクレオチドカセットは、RNA輸送シグナルを含み得る。例示的なRNA輸送配列は、wPREを含むがこれに限定されない。wPREは、トランスジーン、プロモーターおよびベクターに非依存的な様式でRNAの安定性を向上させることによって標的細胞内でのトランスジーンの発現を有意に増加させる（Zuffrey et al, 1999）。しかし、それは、肝臓癌に関与するWHV X遺伝子由来の短縮型60アミノ酸タンパク質を発現し得る（Kingsman et al, 2005）。したがって、大部分の前臨床プロトコルおよび臨床試験は、変異版のwPREエレメントを含む（Zanta-Boussif et al, 2009）。他方、転写上の読み取りを抑制する上で、SIN-LVベクターにおける2つのSV40-USEエレメントの使用がwPRE配列よりも効果的であることが確認された（Schambach et al, 2007）。より詳細に、本明細書に開示されるwPREは、Axel Schambachによってなされた改変WPRE由来の589ヌクレオチド（ヌクレオチド1〜589）（WO 2008136670A2; [5]）および元のwPRE由来の88（ヌクレオチド590〜677）（Zuffrey et al, 1999）を有するキメラwPREである。本明細書に開示されるデータは、このキメラwPREが元のwPREよりも良好に機能することを示している。このキメラwPRE配列は、以下の配列、その機能的フラグメントまたは以下の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含む：

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具体的な態様において、変異WPRE配列は、SEQ ID NO:24のヌクレオチド8502〜9178に対応するまたはSEQ ID NO:24のこの領域に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有するWPRE^*を含むかまたはそれからなる。

本明細書中に開示されたまたは当技術分野において公知の両方のエレメントの他の組み合わせは、当業者によって容易に理解されるであろう。

さらに、当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドカセットは、クローニングを容易にするための制限部位および特定の遺伝子発現ベクターのための制御エレメントを含むが、これらに限定されるわけではない、他のエレメントを任意で含有していてもよい。

本発明のいくつかの局面において、本発明のポリヌクレオチドカセットは、例えば、遺伝子が細胞の生存度および/または機能に対して及ぼす効果を決定するため、細胞障害を処置するため、等のため、細胞へ遺伝子を送達するために使用される。様々な態様において、形質導入による細胞へのウイルスベクターの送達は、インビトロ、エクスビボ、またはインビトロで起こり得る。従って、本発明のいくつかの局面において、哺乳動物細胞におけるトランスジーンの発現を提供する組成物は、本開示のポリヌクレオチドカセット、例えば遺伝子移入カセットを含む、遺伝子送達ベクターである。

ポリヌクレオチド配列を哺乳動物細胞へ送達するために有用な任意の便利な遺伝子送達ベクターが、本開示の遺伝子送達ベクターに包含される。例えば、ベクターは、一本鎖または二本鎖の核酸、例えば、一本鎖または二本鎖のDNAを含み得る。例えば、遺伝子送達ベクターは、DNA、例えば、裸のDNA、例えば、プラスミド、ミニサークル等であり得る。ベクターは、RNAの修飾型を含む一本鎖または二本鎖のRNAを含んでいてもよい。もう一つの例において、遺伝子送達ベクターは、RNA、例えば、mRNAまたは修飾型mRNAであり得る。

もう一つの例として、遺伝子送達ベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス（LV）、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、またはレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（M-MuLV）、モロニーマウス肉腫ウイルス（MoMSV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、ネコ白血病ウイルス（FLV）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、またはラウス肉腫ウイルス（RSV）に由来するウイルスベクターであり得る。LVの使用を包含する態様が、より詳細に以下に記載されるが、当技術分野における類似の知識および技術を非LV遺伝子療法ベクターに向けてもよいことを、当業者は理解するであろうと期待される。

いくつかの態様において、遺伝子送達ベクターは、自己制限性LVである。本明細書に記載される任意の発現カセットおよび遺伝子送達ベクターの特定の態様において、移入カセットは、以下の配列またはSEQ ID NO:24に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる本開示のpCCL-SIN-cPPT/CTS-hPGK-hFANCA-WPRE（図41）である。SEQ ID NO:24は、図41のpCCL-PGK-FANCA-WPRE^*プラスミドに対応する。

1つの態様において、FANCA遺伝子は、レンチウイルスベクター（LV）を通じて送達される。本明細書に記載されるFANCA LVは、自己不活性化レンチウイルスベクター（LV）を利用する。1つの態様において、FANCA LVは、ヒトホスホグリセリン酸（PGK)遺伝子のプロモーターを含む。このベクターの安全面の特性は、強力なウイルスプロモーターを有する、すでに臨床で使用されているガンマ-レトロウイルスベクターと比較して大きく改善されている。

ある態様において、レンチウイルスベクターは、SEQ ID NO:24で開示される配列を含む図1に示される遺伝子移入カセットを含むPGK-FANCA.WPRE^*LVである。PGK-FANCA-WPRE^*LV遺伝子発現カセット部分は、ヒトPGKプロモーター、FANCA cDNAのコード配列およびWPRE^*を含み、SEQ ID NO:24のヌクレオチド3541〜9178に対応する。PGK-FANCA-WPRE^*LV移入カセット部分は、図41に示される配列のおおよそ5'LTR（U5）からおおよそ3'LTR（U5)を含む。SEQ ID NO:24に関して、SEQ ID NO:24のヌクレオチド1586〜1789は、ヒトCMV最初期プロモーターを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド2031〜2156は、HIV1 psiパッケージングシグナルを含む。SEQ ID NO:24の2649〜2882は、HIV1 RREエレメントを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド3378〜3495は、HIV cPPT/CTSエレメントを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド3541〜4051は、hPGKプロモーターを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド4078〜8445は、ヒトFANCA-A cDNAを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド8502〜9178は、変異WPREエレメントを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド9262〜9495は、HIVデルタU3'LTRを含む。

さらに別の態様において、レンチウイルスベクターは、以下の配列を含む：
（i）初期pCCLsin-cppt-hPGK-eGFP-WPRE由来のレンチウイルスベクターの骨格（Dull et al, 1998; J. Virol 72(11), 9873-9880）。pCCL骨格は、プロデューサー細胞において高レベルのウイルスRNA転写を行うために異種CMV-HIV 5'LTRを利用する。そのような異種LTRは、rHIV粒子の産生のためにHIV Tatタンパク質を使用する必要性から構築物を解放し、したがってそれは安全な特徴である。3'LTRのU3領域は、そのベクターに自己不活性化特性を付与する（Zufferey et al J Virol, 1998）に記載される400 bp欠失を含む；
（ii）ヒトPGKプロモーターの制御下でFANCAタンパク質（1455 AA）をコードする（4368 bp GeneBankアクセッション番号：X_99226または本明細書に開示される）ヒトFANCA遺伝子のcDNA。このプロモーターは、遺伝子療法においてすでに使用されている他のプロモーターとの比較で、インビボでのその安定的な活性によっておよび改善された安全面の特性によってすでに特徴づけられている；および
（iii）Schambachら（Gene therapy, 2006; 13, 641-645）によって記載されるXタンパク質をコードする配列の3'領域および任意の残留するORFを含まない変異版のウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）またはWPRE^*。

本開示のポリヌクレオチドカセットを被包している遺伝子療法ベクターは、標準的な方法論を使用して作製され得る。例えば、LVビリオンのケースにおいては、本発明によるLV発現ベクターが、産生細胞へ導入され、続いて、LVヘルパー構築物が導入される。ヘルパー構築物は、産生細胞において発現されることができ、LVベクターに存在しないLVヘルパー機能を補完するLVコード領域を含む。その後、効率的なLVウイルス作製を支持することができる補助機能を提供するヘルパーウイルスおよび/または付加的なベクターが、産生細胞へ導入される。次いで、産生細胞は、LVを作製するために培養される。これらの工程は、標準的な方法論を使用して実施される。具体的な態様において、遺伝子送達ベクターを作製するために、図38〜41に示すプラスミドが使用される。

以下の実施例に記載されるものを含むが、それらに限定されるわけではない任意の適当な方法を、本発明のポリヌクレオチドカセットの送達のためのウイルス粒子を作製するために使用することができる。哺乳動物細胞に効率的に形質導入するために適当なウイルス粒子の濃度を、インビトロまたはインビボで哺乳動物細胞を接触させるために調製することができる。例えば、ウイルス粒子は、1ml当たり10⁸ベクターゲノム以上、例えば、1ml当たり5×10⁸ベクターゲノム；1ml当たり10⁹ベクターゲノム；1ml当たり5×10⁹ベクターゲノム、1ml当たり10¹⁰ベクターゲノム、1ml当たり5×10¹⁰ベクターゲノム；1ml当たり10¹¹ベクターゲノム；1ml当たり5×10¹¹ベクターゲノム；1ml当たり10¹²ベクターゲノム；1ml当たり5×10¹²ベクターゲノム；1ml当たり10¹³ベクターゲノム；1ml当たり1.5×10¹³ベクターゲノム；1ml当たり3×10¹³ベクターゲノム；1ml当たり5×10¹³ベクターゲノム；1ml当たり7.5×10¹³ベクターゲノム；1ml当たり9×10¹³ベクターゲノム；1ml当たり1×10¹⁴ベクターゲノム、1ml当たり5×10¹⁴ベクターゲノム、またはそれ以上、典型的には、1ml当たり1×10¹⁵ベクターゲノム以下の濃度で製剤化され得る。

本発明のLV組成物の調製において、例えば、哺乳動物細胞（例えば、293細胞）、昆虫細胞（例えば、SF9細胞）、微生物、および酵母を含む任意の宿主細胞を、LVビリオンを作製するために利用することができる。宿主細胞は、LVのrep遺伝子およびgap遺伝子が宿主細胞において安定的に維持されているパッケージング細胞、またはLVベクターゲノムが安定的に維持されパッケージングされている産生細胞であってもよい。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、SF-9細胞、293細胞、A549細胞、またはHeLa細胞に由来する。LVベクターは、当技術分野において公知の標準的な技術を使用して、精製され、製剤化される。

ある態様において、本発明は、本明細書中に開示された、遺伝子発現カセット、遺伝子移入カセット、または遺伝子送達ベクターを含む細胞を含む。関連する態様において、細胞は、本明細書中に開示された発現カセットを含む遺伝子送達ベクターによって形質導入されるか、または細胞のゲノムに組み込まれた本明細書中に開示された発現カセットを有する。

ある態様において、細胞は、ウイルス遺伝子送達ベクターを作製するために使用される細胞、例えばパッケージング細胞である。

他の態様において、細胞は、発現カセットによってコードされた遺伝子産物を対象へ提供するために対象へ送達される細胞である。従って、ある態様において、細胞は、処置される対象に対して自己であるか、または処置される対象から入手された。他の態様において、細胞は、処置される対象に対して同種であるか、または処置される対象以外のドナーから入手された。具体的な態様において、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。ある態様において、細胞は、血液細胞、赤血球、造血前駆細胞、骨髄細胞、例えば、系統枯渇骨髄細胞、造血幹細胞（例えば、CD34+）、または運命付けられた造血赤血球前駆細胞である。具体的な態様において、細胞は、本明細書中に開示された遺伝子送達ベクターによって形質導入された後に、CD34+細胞で処置される対象から入手されたCD34+細胞である。具体的な態様において、細胞は、FAを有すると診断された対象から入手されたCD34+ FA細胞である。

本発明は、本明細書中に記載されたポリヌクレオチドカセット、遺伝子送達ベクター、または細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む薬学的組成物を含む。本発明のポリヌクレオチドカセット、遺伝子送達ベクター、または細胞は、一般に、安全で、無毒で、望ましく、霊長類において使用するために許容される賦形剤を含む、製剤の調製において有用な薬学的に許容される担体、希釈剤、および試薬と組み合わせられ得る。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体であってよく、または、エアロゾル組成物のケースにおいて、気体であってよい。そのような賦形剤、担体、または希釈剤の例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および5％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。補足的な活性化合物が、製剤へ組み入れられてもよい。製剤のために使用される溶液または懸濁液は、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（EDTA）のようなキレート化合物；酢酸、クエン酸、またはリン酸のような緩衝剤；凝集を防止するTween 20のような界面活性剤；ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースのような浸透圧の調整のための化合物を含んでいてよい。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調整され得る。具体的な態様において、薬学的組成物は、無菌である。

本発明において使用するために適当な薬学的組成物には、無菌の水性溶液または分散液、ならびに無菌の注射可能溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末がさらに含まれる。

無菌溶液は、必要とされた量の活性化合物を、前掲の成分のうちの一つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒に組み入れ、続いて、ろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、基本的な分散媒および前掲のものからの必要とされる他の成分を含有している無菌媒体へ、活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末のケースにおいて、調製の方法は、事前にろ過滅菌された溶液から、活性成分＋付加的な所望の成分の粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥である。

一つの態様において、組成物は、植込みおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤のような、身体からの迅速な排除から遺伝子カセットまたは発現ベクターを保護する担体によって調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製の方法は、当業者に明らかであろう。材料は、商業的に入手されてもよい。

投与が容易であり投薬量が均一であるため、投薬単位形態で、経口組成物、眼組成物、または非経口組成物を製剤化することは、特に有利である。投薬単位形態とは、本明細書中で使用されるように、処置される対象のための単位投薬量として適した物理的に不連続の単位をさし；各単位は、必要とされた薬学的担体と共同で所望の治療効果を生じるよう計算された予定された量の活性化合物を含有している。本発明の投薬単位形態についての明細は、活性化合物の独特の特徴、および達成されるべき具体的な治療効果、および個体の処置のためのそのような活性化合物の調合の分野に固有の限界によって指示され、それらに直接依存する。

薬学的組成物は、投与の説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー、例えば、注射器、例えば、予め充填された注射器に含まれていてよい。

本発明の薬学的組成物には、薬学的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与時に生物学的活性を有する代謝物質もしくはその残基を（直接的もしくは間接的に）提供することができるその他の任意の化合物が包含される。

「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩：即ち、親化合物の所望の生物学的活性を保持しており、不要な毒物学的効果を付与しない塩をさす。多様な薬学的に許容される塩が、当技術分野において公知であり、例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition, Alfonso R.Gennaro(Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985（およびより最近の版）、"Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", 3rd edition, James Swarbrick(Ed.), Informa Healthcare USA(Inc.), NY, USA, 2007、およびJ.Pharm.Sci.66:2(1977)に記載されている。適当な塩に関する概説については、Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth(Wiley-VCH, 2002)も参照すること。

薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンのような、金属またはアミンによって形成される。陽イオンとして使用される金属には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等が含まれる。アミンには、N-N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、およびプロカインが含まれる（例えば、Berge et al, "Pharmaceutical Salts, "J.Pharma Sci., 1977, 66, 119を参照すること）。酸性化合物の塩基付加塩は、従来の様式で、塩を作製するために十分な量の所望の塩基と、遊離酸型を接触させることによって調製される。遊離酸型は、従来の様式で、塩型を酸と接触させ、遊離酸を単離することによって再生され得る。遊離酸型は、極性溶媒への可溶性のような特定の物理的性質について、それぞれの塩型と多少異なるが、その他の点では、塩は、本発明の目的のため、それぞれの遊離酸と等しい。

本発明のポリヌクレオチドカセット、遺伝子送達ベクター、例えば、組換えウイルス（ビリオン）、または（例えば、本明細書中に開示された遺伝子送達ベクターによって形質導入された）細胞を、哺乳類患者、具体的には、霊長類、より具体的には、ヒトへの投与のため、薬学的組成物へ組み入れることができる。本発明のポリヌクレオチドカセット、遺伝子送達ベクター、例えば、ビリオン、または細胞は、好ましくは、3〜8の範囲、より好ましくは、6〜8の範囲のpHで、無毒の不活性の薬学的に許容される水性担体において製剤化されてよい。そのような無菌組成物は、再生時に許容されるpHを有する水性緩衝液に溶解した治療用分子をコードする核酸を含有しているベクターまたはビリオンを含むであろう。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される薬学的組成物は、薬学的に許容される担体および/または賦形剤、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸、およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝剤、保存剤、およびその他のタンパク質と混和された、本明細書中に開示された細胞、ベクター、またはビリオンを、治療的に有効な量、含む。例示的なアミノ酸、ポリマー、および糖等は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、モノステアリン酸ポリエチレングリコール化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒトの血清アルブミン、クエン酸、酢酸、リンゲル液、ハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リジン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、およびグリコールである。好ましくは、この製剤は、4℃で少なくとも6ヶ月間安定している。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される薬学的組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはリン酸ナトリウム/硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、およびGood et al.(1966)Biochemistry 5:467に記載されたもののような当業者に公知のその他の緩衝液のような緩衝液を含む。アデノウイルスベクター送達系に含有された腫瘍抑制遺伝子を含む薬学的組成物における緩衝液のpHは、6.5〜7.75、好ましくは、7〜7.5、最も好ましくは、7.2〜7.4の範囲にあり得る。

ある態様において、ウイルスベクターは、非限定的に、1×10⁸ベクターゲノム以上、例えば、1×10⁹ベクターゲノム、1×10¹⁰ベクターゲノム、1×10¹¹ベクターゲノム、1×10¹²ベクターゲノム、もしくは1×10¹³ベクターゲノム、またはそれ以上、特定の場合において、1×10¹⁴ベクターゲノム、一般的には、4×10¹⁵ベクターゲノム以下を含む、任意の適当な単位投薬量へ製剤化され得る。いくつかのケースにおいて、単位投薬量は、多くても約5×10¹⁵ベクターゲノム、例えば、1×10¹⁴ベクターゲノム以下、例えば、1×10¹³ベクターゲノム、1×10¹²ベクターゲノム、1×10¹¹ベクターゲノム、1×10¹⁰ベクターゲノム、もしくは1×10⁹ベクターゲノム、またはそれ以下、特定の場合において、1×10⁸ベクターゲノム以下、典型的には、1×10⁸ベクターゲノム以上である。いくつかのケースにおいて、単位投薬量は、1×10¹⁰〜1×10¹¹ベクターゲノムである。いくつかのケースにおいて、単位投薬量は、1×10¹⁰〜3×10¹²ベクターゲノムである。いくつかのケースにおいて、単位投薬量は、1×10⁹〜3×10¹³ベクターゲノムである。いくつかのケースにおいて、単位投薬量は、1×10⁸〜3×10¹⁴ベクターゲノムである。一つの態様において、範囲は、約5×10¹⁰〜約1×10¹¹ベクターゲノムである。いくつかの態様において、範囲は、約1×10⁹〜約1×10¹⁰ベクターゲノムである。

いくつかのケースにおいて、薬学的組成物の単位投薬量は、感染多重度（MOI）を使用して測定され得る。MOIとは、核酸が送達され得る細胞に対する、ベクターまたはウイルスゲノムの比または倍数を意味する。いくつかのケースにおいて、MOIは、1×10⁶であり得る。いくつかのケースにおいて、MOIは、1×10⁵〜1×10⁷であり得る。いくつかのケースにおいて、MOIは、1×10⁴〜1×10⁸であり得る。いくつかのケースにおいて、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷、および1×10¹⁸ MOIである。いくつかのケースにおいて、本開示の組換えウイルスは、1×10⁸〜3×10¹⁴ MOIである。いくつかのケースにおいて、本開示の組換えウイルスは、多くても1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷、および1×10¹⁸ MOIである。いくつかの態様において、範囲は、約20〜約400 MOIである。

いくつかの局面において、薬学的組成物の量は、約1×10⁸〜約1×10¹⁵組換えウイルス、約1×10⁹〜約1×10¹⁴組換えウイルス、約1×10¹⁰〜約1×10¹³組換えウイルス、または約1×10¹¹〜約3×10¹²組換えウイルスを含む。

方法
以下でより詳細に述べるように、本明細書中で集合的に「本発明の組成物」と呼ばれる本発明のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子送達ベクターは、動物、例えば哺乳動物またはヒトの細胞におけるトランスジーン、例えばFANCAの発現において、有用である。例えば、本発明の組成物は、研究において、例えば、細胞の生存度および/または機能に対して遺伝子が及ぼす効果を決定するために使用され得る。もう一つの例として、本発明の組成物は、医療において、例えば、FAなどの障害を処置するために使用され得る。従って、本発明のいくつかの局面において、細胞を本開示の組成物と接触させる工程を含む、細胞における遺伝子の発現の方法が提供される。いくつかの態様において、接触は、インビトロで行われる。いくつかの態様において、接触は、インビボで行われる、即ち、本発明の組成物が対象へ投与される。

哺乳動物細胞が、本発明のポリヌクレオチドカセットまたは本発明のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターとインビトロまたはインビボで接触させられる場合、細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、齧歯類（例えばマウス、ラット、スナネズミ、リス）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類、ヒトに由来するものであってよい。細胞は、樹立細胞株に由来してもよいし、または初代細胞であってもよく、「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養物」とは、対象に由来し、培養物の限定された数の継代、即ち、***の間、インビトロで増殖させられた細胞および細胞培養物をさすため、交換可能に本明細書中で使用される。例えば、初代培養物は、0回、1回、2回、4回、5回、10回、または15回、クライシス期を経るほど十分ではない回数、継代されていてよい培養物である。典型的には、本発明の初代細胞株は、10回未満の継代の間、インビトロで維持される。

本発明の態様は、ウイルス送達ベクター、例えば、ヒトFANCA遺伝子を含有しているLVベクターによって形質導入された哺乳動物細胞（例えば、CD34+細胞）を含む。加えて、本発明は、本明細書中に開示されたまたは本明細書中に記載された発現カセットを含む、遺伝子送達ベクター、例えばLVベクターと、細胞を接触させる工程を含む、本明細書中に記載された哺乳動物細胞、例えば、ヒト造血幹細胞またはその他の細胞に形質導入する方法を含む。ある態様において、細胞は、処置される対象または他のドナーから事前に入手された。具体的な態様において、対象は、ファンコニ貧血を有すると診断されており、細胞は、FANCAコード領域またはcDNAをコードする発現カセットを含むLVによって形質導入される。開示された方法、例えばFANCA cDNA配列を使用して、例えばFANCA遺伝子産物を対象へ送達するために使用される方法は、ファンコニ貧血を処置するためにも、使用され得ることが理解される。具体的な態様において、形質導入される細胞は、それらが形質導入された後にその細胞を用いて処置されるべきFAを有する対象から得られる細胞集団である。それらの細胞は、骨髄または血液から取得され得る。ある態様において、FAを有する対象は、幹細胞を動員する薬剤で処置され、その後に血液が対象から採取され、赤血球が除去され、CD34+細胞が選択される。選択後、細胞は形質導入される。具体的な態様において、形質導入された細胞は、使用前に保管または凍結され、一方、ある態様において、それらは、形質導入された後直ちにまたはすぐに、例えば1時間、2時間または4時間以内に、対象に提供される。

ある態様において、本明細書に開示される遺伝子送達ベクターを用いて細胞に形質導入する際、細胞は、その遺伝子送達ベクターに約30分間、約1時間、約1.5時間、約2時間、約2.5時間、約3時間、約3.5時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約12時間、約16時間、約18時間、約20時間、約24時間、約36時間、約48時間、約60時間、接触させられる。いくつかの態様において、細胞は、60時間未満、48時間未満、36時間未満または24時間未満、形質導入される。

本発明のポリヌクレオチドカセットまたは本発明のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターは、1回または複数回、例えば、1回、2回、3回、または3回超、本発明の細胞へ提供され得、細胞は、各接触イベントの後、いくらかの量の時間、例えば、16〜24時間、薬剤と共にインキュベートされ、その時間の後に、培地が新鮮な培地に交換され、細胞がさらに培養される。細胞の接触は、任意の培養培地において、細胞の生存を促進する任意の培養条件の下で行われてよい。培養物は、細胞が応答性である増殖因子を含有していてよい。増殖因子とは、本明細書中で定義されるように、膜貫通型受容体に対する特異的な効果を通して、培養物または完全組織のいずれかにおいて、細胞の生存、増殖、および/または分化を促進することができる分子である。増殖因子には、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子が含まれる。

典型的には、本ポリヌクレオチドカセットを含む本遺伝子送達ベクターまたは形質導入細胞の有効量が、細胞におけるトランスジーンの発現を生じるために、提供される。本明細書中の他の場所に記述されるように、有効量は、経験的に、例えば、トランスジーン遺伝子産物の存在またはレベルの検出、細胞の生存度または機能に対する効果の検出等によって、容易に決定され得る。典型的には、本発明のポリヌクレオチドカセットまたは本発明のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターの有効量は、当技術分野において公知の同量のポリヌクレオチドカセットより大きい、細胞におけるトランスジーンの発現を促進するであろう。典型的には、発現は、例えば、当技術分野において公知の参照ポリヌクレオチドカセットまたは対照ポリヌクレオチドカセットからの発現と比べて、2倍以上、例えば、3倍、4倍、もしくは5倍、またはそれ以上、いくつかの場合において、10倍、20倍、もしくは50倍、またはそれ以上、例えば、100倍、増強されるであろう。

細胞が、本発明のポリヌクレオチドカセットまたは本発明のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターとインビボで接触させられる場合、対象は、任意の哺乳動物、例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、または霊長類であり得る。さらなる好ましい態様において、霊長類は、ヒトである。さらなる態様において、細胞は、CD34+細胞である。

本開示の方法および組成物は、例えば、ファンコニ貧血の処置において有用である。

いくつかの態様において、本方法は、治療的利益、例えば障害の発症の阻害、障害の進行の停止、障害の進行の逆転等を提供する。例えば、1つの態様において、障害はBMFである。1つの態様において、障害は血小板減少症である。別の態様において、障害は白血球減少症である。1つの態様において、障害は汎血球減少症である。1つの態様において、障害は好中球減少症である。別の態様において、障害は貧血である。いくつかの態様において、本方法は、治療的利益が達成されたことを検出する工程を含む。当業者は、そのような治療的効果の測定が対処される個々の疾患に適用可能であることを理解し、かつ治療的効果を測定するために使用される適当な検出方法を見出すであろう。

もう一つの態様において、本発明は、細胞において治療用遺伝子産物を発現する遺伝子送達ベクター、例えば、ウイルスベクターによって形質導入された細胞の有効量を、その必要のある対象へ提供する工程を含む、該対象における疾患を処置する方法を含む。具体的な態様において、細胞は、対象に対して自己である。ある態様において、細胞は、赤血球細胞、例えば、造血幹細胞または運命付けられた造血赤血球前駆細胞である。いくつかの態様において、細胞は、骨髄細胞、例えば、系統枯渇骨髄細胞である。具体的な態様において、本方法は、FAを処置するために使用され、ウイルスベクターは、FANCA遺伝子のcDNAまたはコード配列に機能的に連結されたヒトPGKプロモーターおよび本明細書中に開示された変異型wPREを含む本明細書中に開示された発現構築物を含むLVである。具体的な態様において、細胞は、非経口的に、例えば、静脈注射を介して対象へ提供される。

もう一つの態様において、本発明は、細胞においてFANCA cDNAを発現するLVベクターによって形質導入された自己CD34+幹細胞の有効量を、その必要のある対象へ提供する工程を含む、該対象におけるFAを処置する方法を含み、LVベクターは、FANCAのcDNAまたはコード配列に機能的に連結されたヒトPGKプロモーターおよび本明細書中に開示された変異型wPRE配列を含む。具体的な態様において、細胞は、造血幹細胞または運命付けられた赤血球造血前駆細胞、例えば、骨髄細胞である。具体的な態様において、細胞は、非経口的に、例えば、静脈注射を介して、対象へ提供される。

本発明のトランスジーンを使用したトランスジーンの発現は、頑強であると期待される。従って、いくつかの場合において、例えば、遺伝子産物のレベルの測定、治療効力の測定等によって検出されるトランスジーンの発現は、本発明の組成物の投与後2ヶ月以内、例えば、投与後4週間以内、3週間以内、または2週間以内、またはそれ以前、例えば、投与後1週間以内に観察され得る。トランスジーンの発現は、経時的に持続すると期待される。従って、いくつかの場合において、例えば、遺伝子産物のレベルの測定、治療効力の測定等によって検出されるトランスジーンの発現は、本発明の組成物の投与の2ヶ月以上後、例えば、4ヶ月後、6ヶ月後、8ヶ月後、または10ヶ月後、またはそれ以降、いくつかの場合において、1年以上後、例えば、2年後、3年後、4年後、または5年後、特定の場合において、5年以上後に観察され得る。

ある態様において、本方法は、細胞または対象におけるトランスジーンの発現を検出する工程を含み、発現は、本開示の1種または複数種の改善されたエレメントを含まないポリヌクレオチドカセットからの発現と比べて増強される。典型的には、発現は、例えば、より早い検出、遺伝子産物のより高いレベル、細胞に対するより強い機能的影響等によって証拠付けられるように、例えば、当技術分野において公知の参照、即ち、対照ポリヌクレオチドカセットからの発現と比べて、2倍またはそれ以上、例えば、3倍、4倍、または5倍、またはそれ以上、いくつかの場合において、10倍、20倍、または50倍、またはそれ以上、例えば、100倍、増強されるであろう。

典型的には、本発明の組成物が、本開示のポリヌクレオチドカセットを含むLVである場合、変化を達成するための有効量は、約1×10⁸ベクターゲノム以上、いくつかのケースにおいて、1×10⁹ベクターゲノム、1×10¹⁰ベクターゲノム、1×10¹¹ベクターゲノム、1×10¹²ベクターゲノム、または1×10¹³ベクターゲノム、またはそれ以上、特定の場合において、1×10¹⁴ベクターゲノム以上、一般的には、1×10¹⁵ベクターゲノム以下であろう。いくつかのケースにおいて、送達されるベクターゲノムの量は、多くても約1×10¹⁵ベクターゲノム、例えば、1×10¹⁴ベクターゲノム以下、例えば、1×10¹³ベクターゲノム、1×10¹²ベクターゲノム、1×10¹¹ベクターゲノム、1×10¹⁰ベクターゲノム、または1×10⁹ベクターゲノム、またはそれ以下、特定の場合において、1×10⁸ベクターゲノム、典型的には、1×10⁸ベクターゲノム以上である。いくつかのケースにおいて、送達されるベクターゲノムの量は、1×10¹⁰〜1×10¹¹ベクターゲノムである。いくつかのケースにおいて、送達されるベクターゲノムの量は、1×10¹⁰〜3×10¹²ベクターゲノムである。いくつかのケースにおいて、送達されるベクターゲノムの量は、1×10⁹〜3×10¹³ベクターゲノムである。いくつかのケースにおいて、送達されるベクターゲノムの量は、1×10⁸〜3×10¹⁴ベクターゲノムである。

いくつかのケースにおいて、投与される薬学的組成物の量は、感染多重度（MOI）を使用して測定され得る。いくつかのケースにおいて、MOIは、核酸が送達される細胞に対する、ベクターまたはウイルスゲノムの比または倍数をさし得る。いくつかのケースにおいて、MOIは、1×10⁶であり得る。いくつかのケースにおいて、MOIは、1×10⁵〜1×10⁷であり得る。いくつかのケースにおいて、MOIは、1×10⁴〜1×10⁸であり得る。いくつかのケースにおいて、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷、および1×10¹⁸ MOIである。いくつかのケースにおいて、本開示の組換えウイルスは、1×10⁸〜3×10¹⁴ MOIである。いくつかのケースにおいて、本開示の組換えウイルスは、多くても約1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷、および1×10¹⁸ MOIである。

いくつかの局面において、薬学的組成物の量は、約1×10⁸〜約1×10¹⁵個の組換えウイルスの粒子、約1×10⁹〜約1×10¹⁴個の組換えウイルスの粒子、約1×10¹⁰〜約1×10¹³個の組換えウイルスの粒子、または約1×10¹¹〜約3×10¹²個の組換えウイルスの粒子を含む。

所望の効果を付与するかまたは疾患を処置するため、細胞の適切な形質導入を提供するために適当なウイルス粒子の任意の総数を、哺乳動物に投与することができる。様々な好ましい態様において、少なくとも10⁸個；5×10⁸個；10⁹個；5×10⁹個、10¹⁰個、5×10¹⁰個；10¹¹個；5×10¹¹個；10¹²個；5×10¹²個；10¹³個；1.5×10¹³個；3×10¹³個；5×10¹³個；7.5×10¹³個；9×10¹³個、1×10¹⁴個のウイルス粒子、または5×10¹⁴個のウイルス粒子、またはそれ以上、典型的には、1×10¹⁵個以下のウイルス粒子が注射される。哺乳動物または霊長類の眼へのベクターの適当な回数の投与を行うことができる。一つの態様において、本方法は、単回投与を含み；他の態様において、主治医によって適切であると見なされるように、複数回投与が経時的に行われる。いくつかの態様において、高い形質導入効率をもたらすため、少なくとも2×10⁸VG/mlまたは5×10⁵細胞/mlが、単回投与（24時間の形質導入）において必要とされる。個々の用量は、典型的には、対象に対する測定可能な効果を生じるのに必要な量以上であり、本発明の組成物またはその副産物の吸収、分布、代謝、および***（「ADME」）についての薬物動態および薬理学に基づき、従って、対象における組成物の分配に基づき、決定され得る。これは、投薬量のみならず、投与ルートの考慮も含む。用量および/または用量計画の有効量は、前臨床アッセイ、安全性および漸増および用量範囲の治験、個々の医師と患者との関係、ならびに本明細書中に記載され、実施例において例示されたもののようなインビトロおよびインビボのアッセイから経験的に容易に決定され得る。

いくつかの態様において、患者が輸注により受け取る細胞の用量は、形質導入プロセスから得られる用量である。様々な好ましい態様において、少なくとも約1x10¹、1x10²、1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸またはそれ以上のCD34+細胞／患者体重KGが、患者に輸注される。いくつかの態様において、1x10⁶〜4x10⁶の間のCD34+細胞／患者体重KGが、患者に輸注される。他の態様において、3x10⁵および4x10⁶ CD34⁺ 細胞／患者体重Kgが、患者に輸注される。いくつかの態様において、細胞は、単回用量で患者に輸注される。他の態様において、細胞は複数回用量で患者に輸注される。形質導入された細胞は、形質導入プロセスが完了した後直ちに輸注され得る。

組み込まれた後、治療用タンパク質（例えば、ヒトFANCAタンパク質）は、細胞により発現される。形質導入されたFA細胞は、遺伝的に矯正され、したがってFANCD2およびFANCIのモノユビキチン化によりFA経路を活性化することができる。これらのタンパク質は、健常な細胞において見られるように、DNA損傷領域に遊走し、他のDNA修復タンパク質と協力して、これらの細胞におけるDNAの修復を促進する。

実施例にさらに詳細に記載されているように、ヒトFA患者由来のBMサンプルを用いた前臨床インビトロデータはすでに、これらの細胞の表現型を矯正するFANCA LVの効果を示している。

したがって、本発明は、FAの血液学的症状の処置方法を提供する。1つの態様において、FAの血液学的症状は、BMF、血小板減少症、白血球減少症、汎血球減少症、好中球減少症および貧血のうちの1つまたは複数から選択される。具体的な態様において、血液学的症状は、大部分のFA患者において若年齢でみられる骨髄不全（BMF）である。1つの態様において、血液学的症状は血小板減少症である。別の態様において、血液学的症状は白血球減少症である。1つの態様において、血液学的症状は汎血球減少症である。1つの態様において、血液学的症状は好中球減少症である。別の態様において、血液学的症状は貧血である。1つの態様において、血液学的症状は、BMF、血小板減少症、白血球減少症、汎血球減少症、好中球減少症および貧血の2つ以上の組み合わせである。

FANCA LVは、この疾患のより進行した段階で発生し得る固形腫瘍を直接的に処置しない。しかし、造血遺伝子療法によって処置されたFA患者の血液学的状態の改善は、固形腫瘍の進展に対する免疫学的監視も改善し得る。したがって、FANCA LVによるFA患者の処置の結果として、間接的抗腫瘍効果も発生し得る。

FAに対する遺伝子療法を成功させるために、対象から「十分」な数の造血幹細胞（HSC）を収集することが有益である。

1つの態様において、HSCは、骨髄サンプルから取得または収集される。1つの態様において、骨髄サンプルから赤血球が除去される。いくつかの態様において、骨髄サンプルからCD16+白血球が除去される。いくつかの態様において、除去技術後に残存する細胞が洗浄される。別の態様において、洗浄された細胞に非特異的IgGが添加される。いくつかの態様において、非特異的IgGは、フレボガンマ（flebogamma）である。その後、CD34+細胞が、洗浄した細胞から選択され得る。1つの態様において、CD34+細胞が、骨髄サンプルから選択され得る。CD34+細胞の選択方法は、陽性選択、陰性選択またはそれらの組み合わせであり得る。

別の態様において、HSCは、末梢血から取得される。1つの態様において、末梢血サンプルから赤血球が除去される。いくつかの態様において、血液サンプルからCD16+白血球が除去される。いくつかの態様において、除去技術後に残存する血液細胞が洗浄される。別の態様において、洗浄された細胞に非特異的IgGが添加される。いくつかの態様において、非特異的IgGは、フレボガンマ（flebogamma）である。その後、CD34+細胞が、洗浄された細胞から選択され得る。1つの態様において、CD34+細胞が、末梢血サンプルから選択され得る。CD34+細胞の選択方法は、陽性選択、陰性選択またはそれらの組み合わせであり得る。

本発明のいくつかの態様において、HSCは、動員後の対象から取得される。動員は、幹細胞を骨髄から血液中に移動させる薬物または化合物で対象を処置することによって達成され得る。幹細胞が、収集および保存され得る。いくつかの態様において、動員は、G-CSF（フィルグラスチム）で対象を処置することによって達成される。他の態様において、動員は、プレリキサホルで対象を処置することによって達成される。さらに他の態様において、動員は、フィルグラスチムおよびプレリキサホルの組み合わせで対象を処置することによって達成され得る。（図11および図14）

1つの態様において、患者体重キログラムあたり少なくとも1〜4x10⁶のCD34⁺矯正細胞（例えば、FANCAが形質導入されたHSC）が、非調整FA患者において造血能を回復させるために投与される。いくつかの態様において、形質導入された細胞は、形質導入後直ちに患者に輸注または投与される。（図11）他の態様において、形質導入された細胞は、患者への輸注または投与の前に凍結される。（図11）

FA患者由来のHSCの遺伝子矯正、その後のこれらの細胞の自己移植（造血遺伝子療法）は、FA患者、特にHLAが一致する兄弟姉妹がいない者にとって良い代替法である。1つの態様において、造血遺伝子療法は、HLAが一致する兄弟姉妹がいない患者にとって好ましい処置計画である。別の態様において、造血遺伝子療法は、HLAが一致する兄弟姉妹がいる患者にとって好ましい処置計画である。

本明細書で言及されているすべての刊行物は、それらの刊行物に記載されている方法および／または材料を開示および説明する目的で、参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、本開示が、組み入れられる刊行物のあらゆる開示よりも優先されることが理解される。

さらに、各請求項はあらゆる任意要素を排除するよう記載されている場合があることに留意すべきである。その場合、この宣言は、各請求項の要素に関する記載に関連する「専ら（solely）」、「のみ（only）」等の排他的用語の使用または「負」の制限の使用の先行詞となることが意図されている。

本明細書で議論されている刊行物は、専ら、本願の出願日以前にそれらが開示されていたために提供されるものである。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日と異なっている場合があり、別途確認する必要がある場合がある。

FA-Aは、FA患者において最も多い相補群なので（Casado et al., 2007, Taniguchi et al., 2006）、FANCA遺伝子および／またはEGFPマーカー遺伝子を発現するベクターが実施例の中心となっているが、他のFANCA遺伝子も、他の相補体群を同じように処置するために利用され得る。

実施例1
FANCAレンチウイルスベクター
RVと比較してLVの組み込みパターンがより高い安全性を有することから（Gonzalez-Murillo et al., 2008; Modlich et al., 2009; Montini et al., 2006; Mitchell RS, Beitzel BF, Schroder AR et al. Plos Biol. 2004; 2: E234; Montini E et al. J Clin Invest. 2009; 119: 964-975; Schroder AR et al. Cell. 2002; 110-521-529）、FA細胞の表現型を矯正する治療用ベクターとしてLVを開発することを目的とした（Gonzalez-Murillo et al., 2009）。さらに、最近の研究は、強力な内部プロモーターを有するLVが隣接遺伝子もトランス活性化し得ることを示している（Modlich et al., 2009）。LVは、治療効果と隣接遺伝子のトランス活性化の危険の間の妥協の産物として臨床での使用を考慮されていた。したがって、目的は、治療遺伝子の発現を誘導するエンハンサー／プロモーターによる遺伝子のトランス活性化の危険を抑制するために、治療的であり得るFANCA発現のしきいレベルを定義することであった。FANCA LVの効果を、最初にFA-A LCLにおいてインビトロで、その後にFA-A患者由来の初代BMサンプルにおいて、最後にFA-Aのマウスモデルにおいてインビボで、検証した。

この目的のために、異なるプロモーター：vav、PGK、CMVおよびSFFVプロモーターの制御下でFANCAを発現するLVを構築した。図1は、その医療用品の概要である。図2Aは、異なる内部プロモーターの制御下でFANCAを発現するLVの概略図を示す。さらに、我々はまた、FANCAの発現レベルおよびLVの治療効果の両方に関して、転写後WPREエレメントの影響を調査した。最初に、すべてのLVを、キメラGALV-TRエンベロープでパッケージングした。1〜2x10⁶ tu/mlの力価を従来法により得、形質導入を細胞あたり1〜2 tuの推定MOIで実施した。図2Bは、形質導入されたFA-A細胞におけるFANCAのウェスタンブロット分析を示す。

各ベクターによって与えられたFANCA mRNAのレベルを決定するため、形質導入されたFA-Aリンパ芽球細胞株（LCL）を5日間、30 nM MMCを用いて選択した。選択プロセスの後、形質導入されたFA-A LCLは、細胞あたり0.81〜3.04コピーの各LVを含んでいた（表1）。EGFP-LVで形質導入された未選択のFA-A LCLおよび健常ドナー（HD)由来のLCLを対照として使用した。

総FANCA mRNAレベルおよびLVコピー数あたりの相対FANCA mRNAレベルを、異なるLVで形質導入されたLCLにおいて決定した（表1）。HD LCLにおいて観察されたFANCA mRNAレベルと比較して、同程度のレベルのFANCA mRNA/コピーが、vav-FANCAおよびPGK-FANCA LVで形質導入されたFA-A細胞において観察された。CMV-FANCAおよび、さらに大きく、SFFV-FANCA LVは、超生理学的レベルのFANCA mRNA/コピーを与えた（それぞれ、3.6および5.6倍）。WPREまたは変異WPRE^*配列（Schambach et al., 2006）を有するPGK-FANCA LVは、WPREを有さないPGK-LVと比較してFANCA mRNAレベルを2.3〜2.6倍増加させた。他の研究（Schambach et al., 2006; Zanta-Boussif MA, Charrier S, Brice-Ouzet A Et al., Validation of a Mutated Pre Sequence Allowing High and Sustained Transgene Expression While Abrogating WHV-X Protein Synthesis: Application to the Gene Therapy of WAS. Gene Ther. 2009; 16: 605-619; Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ. Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element Enhances Expression of Transgenes Delivered by Retroviral Vectors. J Virol. 1999; 73: 2886-2892）と同様、WPREまたはWPRE^*配列の挿入は、PGK-FANCA LVで形質導入された細胞においてFANCA mRNAレベルを有意に増加させた。野生型WPREエレメントはC末端短縮版の肝炎ウイルスXタンパク質をコードし、これは腫瘍形成効果を媒介し得るので（Bouchard MJ, Schneider RJ. The Enigmatic X Gene Of Hapatitis B Virus. J Virol. 2004; 78: 12725-12734. 2004; Kingsman SM, Mitrophanous K, Olsen JC. Potential Oncogene Activity of the Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element (WPRE). Gene Ther. 2005; 12: 3-4）、あらゆる残留オープンリーディングフレームを欠く変異WPRE^*配列を有するLV（Schambach et al, 2006）が、臨床用途においてより適していると考えられる。

（表１）FANCA発現レンチウイルスベクターで形質導入されたFA-A LCLにおけるFANCAの発現レベル

^*FANCAコピーあたりのFANCA mRNAおよびFANCAタンパク質のレベルを推定するため、健常ドナーLCLにおいてはゲノムFANCAが2コピーであるとみなした。

FANCA mRNA発現の相違がタンパク質レベルで確認されるかどうかを試験するため、表1に示されるサンプルを用いてウェスタンブロット分析（図2B）を実施した。FANCA mRNA決定において見られたように、FANCAタンパク質値は、タンパク質ローディング量だけでなく各々の形質導入されたFA-LCLにおいて決定されたプロウイルスコピー数にも関連した。HD-LCLにおいて決定されたFANCAレベル／コピーと比較して、SFFV-FANCA LVを除くすべての試験したFANCA-LVによって、本質的に正常なレベルのFANCA/コピーが付与された。この例において、相対FANCAレベル／コピーは、HD-LCLにおいて決定されたレベルよりも3.4倍高かった。抗FANCD2で再染色されたウェスタンブロットは、対照ベクターを用いて形質導入されたFA-A LCLはFANCD2をモノユビキチン化することができないが、FANCA-LVのいずれかのタイプを用いて形質導入されたFA-A LCLは、これらの細胞における機能的FA経路と同様、非ユビキチン化およびモノユビキチン化の両方の形態のFANCD2を発現した。

FA-A LCLにおいて異なるLVによって付与されたFANCA発現レベルを、（2コピーのFANCAを有する）健常ドナー（HD）LCLにおいて観察されたそれらと比較することにより、我々は、細胞あたり2つのLVコピーの挿入が、超生理学的レベルのFANCAを付与するSFFV-LVの例を除いて、生理学的レベルの治療タンパク質を生じ得ると結論づけた。このコピー数を達成することは、それらの患者のBMに存在する前駆体が少数であることから少なくとも50％の形質導入効率が望まれ得るFA患者の臨床試験の要求に合致し得る（Gonzalez-Murillo et al., 2009, Jacome et al., 2006, Kelly et al., 2007; Larghero J, Marolleau JP, Soulier J et al. Hematopoitic Progenitor Cell Harvest and Functionality in Fanconi Anemia Patients. Blood. 2002; 100: 3051）。

異なるFANCA発現LVの治療効果における潜在的な相違を分析するため、FA-Aリンパ芽球細胞株（LCL）のMMC高感受性を矯正する各ベクターの効果を決定した。この目的で、FA-A LCLに、異なるLVによって形質導入し（図3A）、次いで漸増濃度のMMCに暴露した。その後、形質導入細胞の生存率を決定した。図3Aに示されるように、すべての試験したFANCA-LVは、FA-A LCLの高感受性を逆転させる上で等しく効果的であった。同様に、すべてのベクターが、いずれのFANCA-LVを用いて形質導入されたFA-A細胞においても機能的であったFA経路と同様、MMC処置細胞において核内FANCD2フォーカスの生成を促進した（図3B）。

実施例2 マウスモデル研究
遺伝的に矯正されたまたはされていないいずれかのFA患者由来のBMサンプルの複製性を評価するため、複数のグループが、FA患者由来のBM細胞を免疫不全マウスに移植した。しかし、いずれの例においても、おそらくこれらの患者のBMに存在する造血前駆体およびHSCの数の少なさから、有意な生着が報告されなかった。

この医療用品のインビボ効果を評価するため、Fanca遺伝子内に欠失を含むFA-Aのマウスモデルを使用した。FA患者とは対照的に、これらの動物は、明白な血液学的障害を発症しない。にもかかわらず、それらのBM前駆細胞は、FA患者における場合と同様、MMCに対して高感受性である（Rio et al., 2002）。したがって、FANCA LV（図4A）がインビボでFA-Aマウス由来のHSCの表現型を安定的に矯正するかどうかを決定するため、FANCA LVを用いてFA-Aマウス由来のBM細胞に形質導入し、次いでそれを照射したFA-Aレシピエントに移植した（図4B）。遺伝的に矯正された細胞の移植後に造血前駆体の表現型が矯正されたかどうを評価するため、移植されたFA-Aマウス由来のBMサンプルを、メチルセルロース中、MMCの非存在下および存在下で培養した（図4C）。治療用カセットの組み込みを確認する追加のデータが、図42〜44に示されている。線形増幅型（LAM）PCRは、異なる組み込みベクターのゲノムへの組み込み部位を調査する方法である。既知配列のベクターから出発し、未知の隣接ゲノムを通じて伸長するPCR産物が生成され、ベクター組み込みのゲノム内位置を同定するために配列決定される。図42は、FA造血幹細胞（HSC)におけるFANCA-LV挿入部位のLAM-PCR分析を表す。図43は、FANCA-LV処置細胞の追跡のためのLAM-PCR結果を示す。図44は、LVで矯正されたHSCを移植されたFanca -/-レシピエントのクローン多様性を示す。

移植から1ヵ月後、正常な血球数がこれらの動物において観察され、これによりLVの明白な毒性がみられないことが示された。この時点で、細胞あたりのプロウイルスFANCAコピーの数は、0.5〜10コピー／細胞の間で様々であった（同様の結果が、移植後3および6ヵ月で観察された）（図5）。遺伝的に矯正された細胞の移植後に造血前駆体の表現型が矯正されるかどうかを評価するため、移植されたFA-Aマウス由来のBMサンプルを、メチルセルロース中、MMCの非存在下および存在下で培養した。

図6に示されるように、SF1-EGFP LV対照と比較して、FANCA LVを用いた遺伝子療法に供されたFAマウス由来の造血前駆体において、MMC高感受性の有意な矯正が観察された。FA-A骨髄（BM）細胞にPGK_FANCA-WPRE^*または対照SF1-EGFP LVを用いて形質導入し、照射したFA-Aマウスに移植した。移植後7ヵ月で、BMサンプルを収集し、メチルセルロース中、漸増濃度のマイトマインC（MMC）の存在下で培養した。

したがってこれらのデータは、FANCA LVが、インビボ移植後にFA-Aマウス由来の造血前駆体の表現型を逆転させることができることを示している。安全性の面で、事前にFANCA LVを用いて形質導入されたBM細胞を移植された30匹のマウスのいずれも、骨髄増殖性障害または白血病の症状を発症しなかった（移植後最長1年間で得られたデータ）。

実施例3. レンチウイルスベクターを用いたFA患者由来の新鮮な造血前駆体の効果的な形質導入
FA凍結保存造血幹細胞（HSC）の形質導入は新鮮な移植片の形質導入と比較して低効率であることが以前に示されているので（Jacome et al., 2009）、凍結保存FA BMサンプルの形質導入効率を最適化する試みを行った。図7に示されるように、3回の形質導入サイクルの実施が、1回の形質導入サイクル後に得られる値と比較して、FA CFCの形質導入効率を有意に増加させた（それぞれ、45.7±4.2％対13.5±5.1％）。サンプルを、2時間の静的な事前ローディングの後の1回の形質導入サイクル（16時間）からなる標準的な形質導入（白色バー；1xS）またはレンチウイルスベクターを用いた3回の形質導入サイクル（2時間＋2時間＋12時間）からなる改善された形質導入（灰色バー；3xD）に供した。

実施例4. PGK-FANCA-WPRE ^* レンチウイルスベクターはFA-A患者由来の骨髄前駆体の表現型を効果的に矯正する
FANCAをPGKプロモーターによって誘導するLVの有効性から、ならびにPGKプロモーターを有するLVの安定性（Follenzi A et al. Nat Genet. 2000; 25: 217-222）および低い遺伝毒性（Modlich et al., 2009, Montini et al., 2006, Montini et al., 2009）を示す以前の研究に基づき、いかなるWPREエレメントも含まないまたはWPREもしくはWPRE^*配列を有するPGK-FANCA LVを用いて、LCLにおいて、およびFA-A患者由来の骨髄細胞においても、さらなる実験を行った。図8Aに示されるように、これら3つのベクターはすべて、MMCに対するFA-A LCLの感受性をを同様に逆転させた。

FA-A患者由来の造血前駆体の表現型を矯正するSFFV-FANCAおよびPGK-FANCA LVの効果を比較するため、最近報告されたようにしてFA-A患者由来の赤血球除去BMサンプルに形質導入した（Jacome et al., 2009）。最近報告されたように、LV上清を事前にロードされたプレートにおいて、赤血球除去BM細胞に16時間形質導入した（Gonzalez-Murillo et al, 2009）。14日後、10 nM MMCの非存在下および存在下で成長させたコロニーの数を記録し、薬物に対して耐性となった前駆体の比率を決定した。

図8Bに示されるように、EGFP-LVを用いてサンプルに形質導入したとき、MMCの存在下でコロニーはほぼ生成しなかった。この観察に対して、SFFV-FANCAおよびPGK-FANCA LVによるFA-A BM細胞の形質導入は、MMCを含まない培養下で記録されたコロニーの26および38％の成長を実現した。WPREおよびWPRE^*配列を有するPGK-FANCA LVの効果を、WPRE非含有PGK-FANCA LVと比較した。図8Bに示されるように、3つのLVはすべて、MMCに対する高レベルかつ同等レベルの保護を提供した。転写後調節エレメントWPRE^*（Schambach et al., 2006）の挿入はPGK-FANCA LVの効果を改善する上で必要ではなかったが、このエレメントは、患者内での異所性FANCAの長期的治療レベルを維持する冗長的エレメントを提供するであろう。

まとめると、これらの研究において得られたデータは、PGK-FANCA-WPRE^* LVがFA-A患者の造血表現型を矯正するのに十分なレベルのFANCAを付与することを強く示唆している。これらの結果は、PGK-LVの安定性（Follenzi et al., 2000）および安全性の特性（Modlich et al., 2009, Montini et al., 2006, Montini et al., 2009）ならびに変異WPRE^*転写後エレメントの効果（Schambach et al., 2006）を示す以前の観察と共に、PGK-FANCA-WPRE^* LVがFA-A患者の遺伝子療法のための効果的かつ安全なベクターとなり得るという仮説を強固にする。

実施例5. FA患者由来の造血前駆体に形質導入するGALV-TRおよびVSV-Gパッケージレンチウイルスベクターの効果の分析
LVはGALV-TRおよびVSV-Gの両方のエンベロープを用いて偽型化することができるので、2つのエンベロープで偽型化されたEGFP-LVを用いて至適条件下でFA患者由来の非選択骨髄細胞に形質導入する新しい実験を実施した。

GALV-TR偽型化LVに関しては、非濃縮LV（推定力価：2x10⁵ IU/mL；推定MOI：2 IU/細胞）を用いて2回の形質導入サイクルを実施した。

VSV-G偽型化LVに関しては、濃縮および精製されたLV（推定力価：10⁸ IU/mL；推定MOI：50 IU/細胞）を用いて1回の形質導入サイクルを実施した。

図9に示されるように、両方の条件下で、FA患者由来の造血前駆体の同様の形質導入が達成され、これにより製造上の妥協がパッケージングに最適なエンベロープを決定し得ることが示された。

実施例6. 安全性研究
図10Aに示されるレンチウイルスベクターの形質転換能を、コピー数あたりの再プレーティング回数で測定した。図10Bに示されるように、PGK-FANCA-WPRE^* LV（PGK由来レンチウイルスベクター）に対応するレンチウイルスベクター骨格の形質転換能は、X1-SCIDおよびCGD臨床試験においてすでに使用されているウイルスプロモーターを有するベクターの形質転換能と比較して著しく低い。

PGK-FANCA-WPRE^* LVを用いて形質導入されたBM細胞を移植されたマウスを用いたインビボ研究に関して、30匹のマウスに移植を行い、現時点で（移植後最長1年）、移植動物のいずれも骨髄増殖性疾患または白血病の症状を発症していない。

実施例7. 医薬品
FANCAレンチウイルスベクターは、ヒトPGKプロモーターの制御下でヒトFANCA cDNAをコードし、Xタンパク質ORFを欠く変異WPREにより転写後レベルで調節される第3世代自己不活性化rHIV1由来ベクターである（図1、図41およびSEQ ID NO:24を参照のこと）。そのようなFANCAレンチウイルスベクターは、FA遺伝子療法において以前から使用されているガンマレトロウイルスベクターを凌ぐ様々な利点、特に、造血幹細胞の多分化能を保存するのに有利である、短い事前活性化プロトコルにもかかわらず細胞に形質導入する能力を示す。

治療用レンチウイルスベクターの作製のために、ベクターのパッケージングに必要とされるヘルパータンパク質のすべてを提供する3つのさらなるプラスミドでトランスフェクトされた293T細胞（図38〜40を参照のこと）は、PGK-FANCA-WPRE^*医療用品の最終パッケージ（図41）を含むであろう。

PGK-FANCA-WPRE^* LV治療用カセットは、ヒトPGKプロモーター、FANCA cDNAのコード配列およびWPRE^*エンハンサーを含み、かつSEQ ID NO:24のヌクレオチド3541〜9178を含む。ヒトCMV最初期プロモーター、HIVパッケージング配列、gaおよびRREエレメント、ヒトPGKプロモーター、FANCA cDNAのコード配列およびWPRE^*エンハンサーを含む治療用カセット、ならびにHIV自己不活性化3'LTRを含む移入カセットの領域は、SEQ ID NO:24のヌクレオチド1586〜9495によってコードされる。

SEQ ID NO:24のヌクレオチド1586〜1789は、ヒトCMV最初期プロモーターを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド2031〜2156は、HIV1 psiパッケージングシグナルを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド2649〜2882は、HIV1 RREエレメントを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド3378〜3495は、HIV cPPT/CTSエレメントを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド3541〜4051は、hPGKプロモーターを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド4078〜8445は、ヒトFANCA-A cDNAを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド8502〜9178は、変異WPREエレメントを含む。SEQ ID NO:24のヌクレオチド9262〜9495は、HIVデルタU3'LTRを含む。

実施例8. 臨床研究FANCOSTEM
米国内で、FA-AおよびFA-C患者において2つの遺伝子療法試験が実施されたが、これらは臨床効果を示さなかった（Liu, J.M., et al.(1999). Engraftment of hematopoietic progenitor cells transduced with the Fanconi anaemia group C gene (FANCC). Hum. Gene Ther. 10: 2337-2346; Kelly, P.F., et al. (2007). Stem cell collection and gene transfer in fanconi anaemia. Mol Ther 15: 211-219）。上記試験の効果は、様々な最適化を通じて大きく改善され得る。2つの臨床試験は、将来の臨床利用のために十分数のCD34⁺細胞を収集および精製するプロセスの実現可能性を決定するため（FANCOSTEM）に前後して、ならびにFA相補群A（FA-A）を有する患者における遺伝子療法の安全性および効果を評価するため（FANCOLEN）に並行して実施された。図11を参照のこと。

FANCOSTEMの主要参加基準は、ジエポキシブタンまたはマイトマインCを用いた染色体不安定性試験により確認されたAFの診断、年齢＞1歳、および以下のパラメータの少なくとも1つが以下程度に高い患者であった：1）ヘモグロビン：8.0 g/dL、2）好中球：750/mm³、3）血小板：30,000/mm³。10名の患者を参加させ、9名をスクリーンし、そのうち2名が除外された（モザイク患者）。図12は、参加患者の血液学的パラメータを示している。7名の患者を、G-CSFおよびプレリキサホルで処置した。動員処置は、G-CSF（ニューポジーン（neupogen）；12μg/Kg/12時間）およびプレリキサホル（モゾビル（mozobil）:240μg/kg体重/日）の投与を用いた。GMP条件下、短いエクスビボ形質導入プロトコルを用いて、PGK-FANCA-WPRE^* LVで動員末梢血（mPB）CD34+細胞に形質導入した（図13）。15および16歳の2名の患者は、しきいレベルの末梢血中CD34+細胞に到達しなかったが、3〜5歳の5名の患者においてアフェレーシスを実施することができた。これらの患者において、CD34+細胞数/kgの中央値は、6.6x10^6（範囲：1.6x10^6〜7.6x10^6）であった。CD34+細胞の選択後、CD34+細胞/kgの数は、2.0x10^6（範囲：8.5x10^5および5.1x10^6）であった。最長2.5年間追跡されたいずれの処置患者においても、この動員計画に関連する重度の有害事象は検出されなかった。

図14は、FA-A患者におけるCD34+細胞のG-SCF/プレリキサホルを通じた動員を示しており、図15は、FA-A患者におけるコロニー形成細胞（CFC）のG-SCF/プレリキサホルを通じた動員を示している。図16Aは、FANCOSTEMにおけるCD34+細胞の収集を示しており、図16Bは、以前の研究との比較を示している。

図17は、骨髄（BM）における推定CD34+細胞数と動員末梢血（mPB）における実数との間の比較を示している。図18は、G-CSF/プレリキサホル動員FA-A患者におけるCD34⁺細胞収集の要約である。選択後のCD34+の数は、第0日のBMにおけるCD34⁺細胞/μlの数に相関する。

図19は、健常ドナー（HD）およびFA患者由来のmPB CD34+細胞の免疫選択前および後のCD34発現を示している。

これらのデータから、我々は、他の臨床研究と比較して、現時点でフィルグラスチム（G-CSF）およびプレリキサホルで処置された患者において、CD34+細胞の収集に明白な改善が観察され、この疾患の早期段階のFA患者のみが臨床的に妥当な数のHSCの収集に適しているようであると結論づけた。

実施例9. 臨床研究FANCOLEN
第2の並行して行われる臨床試験（FANCOLEN）は、FA相補群A（FA-A）を有する患者における遺伝子療法の安全性および効果を評価することを目的とするものであった（FANCOLEN）。遺伝子矯正自己HSCを輸注することによってFA患者の造血能を回復させるために、最適化されたベクターおよび形質導入プロトコルを構築した。詳細に、これは、ファンコニ貧血サブタイプAを有する患者に対するFANCA遺伝子を有するレンチウイルスベクター（希少疾病用医薬品）を用いて形質導入された自己CD34+細胞の輸注の安全性および効果を評価するための第I/II相臨床試験であった。

主要参加基準は、FA-Aの診断、年齢＞1歳、および以下のパラメータの少なくとも1つが以下のしきい値を下回る患者であった：1）ヘモグロビン：8.0 g/dL、2）好中球：1,000/mm³、3）血小板：50,000/mm³。

より具体的な対象参加基準は、1）相補群FA-Aの患者、2）以下のパラメータの少なくとも1つが示されている値よりも低くなければならないこと：ヘモグロビン：8.0 g/dL、好中球：750/mm³、血小板：30.000/mm³、3）最低年齢：1歳、4）最高年齢：21歳、5）ランスキー指数＞60％、6）中等度の臓器機能障害、7）現行法にしたがいインフォームドコンセントが提供されること、8）形質導入する細胞数：少なくとも3x10⁵ 精製CD34⁺細胞／患者体重Kg、9）妊娠可能年齢の女性は基準訪問時に尿妊娠検査が陰性でなければならず、かつ本試験への参加中の有効な避妊法の使用に同意しなければならないこと、を含む。

対象除外基準は、1）HLA同一の家族ドナーを有する患者；2）骨髄異形成症候群もしくは白血病の証拠、または骨髄吸引分析におけるこれらの状態を示唆する細胞遺伝学的異常。この評価は、患者が臨床試験に入る2ヵ月前に有効な研究によって行われるべきである；3）患者が改善された血液学を示す体細胞モザイク現象の兆候を有する証拠；4）調査者の判断でその対象が本研究への参加に適さないとみなされる任意の同時進行中の疾患または状態；5）以前から存在する感覚または運動障害＞＝National Cancer Institute（NCI）の基準によるグレード2；6）妊娠または授乳中の女性、を含む。

投与経路：患者は、静脈内輸注により、治療用ベクターを用いて形質導入された細胞を投与された。

細胞の用量：輸注により患者に投与される細胞の用量は、形質導入から得られた、3x10⁵〜4x10⁶ 精製CD34⁺細胞/患者体重kgの用量であった。

3x10⁵を下回るCD34⁺細胞/Kgは、特にこの臨床試験が最初に未調整患者に対して輸注することを考慮すると、形質導入細胞から患者移植片を生成できない可能性が高い。Williams博士により実施されたファンコニ貧血患者における遺伝子療法試験（Kelly et al., 2007）において、2名の患者（FAAGT1001および1003）に輸注された細胞数は、それぞれ、4.5x10⁵および3.25x10⁵ 有核細胞/患者体重kgであった。両方の患者において、Hbおよび血小板数に一過的な改善が見られたが、関連するトランスジーンの存在を実証することができなかった。ガンマレトロウイルスベクターを用いて細胞に4日間形質導入したWilliams博士の試験と異なり、この臨床研究においては、より効果的なレンチウイルスベクターを用いて細胞に形質導入し、形質導入を最大48時間、すなわち以前のプロトコルで使用された4日間よりもずっと短い期間実施する。これに基づき、我々は、3x10⁵ 精製CD34⁺細胞/患者体重kgが、この試験における合理的な下限であるとみなした。

4x10⁶ 精製CD34⁺細胞/kgという上限は、輸注する細胞数を制限する必要性に基づくものでなく、細胞数が多いほど移植片の実現性が高まる。そうではなく、4x10⁶ 精製CD34⁺細胞/患者体重kgの限度は、それらの骨髄における減少したCD34⁺細胞数により特徴づけられるファンコニ貧血患者からこの数を超える細胞を動員および収集する困難性によるものである（Jacome et al., 2009）。

投薬計画：治療用ベクターを用いて形質導入される細胞を、単回用量で患者に輸注した。これは、2つの大きな理由のためであった：1）現在までに実施されているすべての造血遺伝子療法試験は、形質導入細胞の単回輸注を用いて行われている（Naldini, 2011）。この以前の経験にしたがい、我々はこのパラメータを変更することを考慮しなかった。2）すべての形質導入細胞の単回輸注は、分割された同じ用量の輸注と比較してより大きな移植片を生成する可能性を高める。

動員期間：患者は、3年間にわたって動員処置を受ける。サブタイプFA-Aを有する患者は、FA患者集団において最も多いので（この相補群に対応するFAを有するスペイン人患者のおよそ80％（Casado et al. (2007)））、構築される治療用ベクターは、FANCA遺伝子を有する。したがって、FA患者のうち、サブタイプFA-Aに属する患者のみが、この研究に参加することができる。この相補群の患者は、彼らが明確な参加および除外基準に合致する限り、子供であろうと大人であろうと、この研究に加えられた。

この臨床試験において評価される一次および、存在する場合、二次変数の詳細な説明は、1）主要変数：A）ファンコニ貧血サブタイプAを有する患者における治療用レンチウイルスベクターを用いて形質導入された自己CD34⁺細胞の輸注に伴う毒性を決定すること、B）ファンコニ貧血サブタイプAを有する患者における治療用レンチウイルスベクターを用いて形質導入された自己CD34⁺細胞の輸注に伴う生着の程度を決定すること、2）二次変数：ファンコニ貧血サブタイプAを有する患者における治療用レンチウイルスベクターを用いて形質導入された自己CD34⁺細胞の輸注に伴う臨床応答を決定すること、を含む。

ファンコニ貧血サブタイプA（FA-A）を有する患者由来の（新鮮なおよび／または凍結保存された）骨髄由来のおよび／または末梢血中に動員されたCD34⁺細胞に、FANCA遺伝子を有するレンチウイルスベクター（希少疾病用医薬品）を用いてエクスビボで形質導入した（図11）。細胞の形質導入の後、造血能を回復させるため、患者に、これらの遺伝的に矯正された幹細胞の輸注を行った。

評価：患者を初期処置の前に評価し、事前のインフォームドコンセントを得た。評価は、遺伝的に矯正された細胞の輸注前の月に、標準的な身体検査（体重および身長を含む）、末梢血血球数、基礎生化学ならびに骨髄吸引を通じて評価を行った。

遺伝的に矯正されたCD34+細胞の形質導入および輸注：精製されたCD34⁺細胞集団に、エクスビボで、治療用レンチウイルスベクターを用いて形質導入した。細胞の形質導入の後、生成物の品質管理評価を行い、さらなる研究のためにアリコートを凍結保存し、そして生成物を患者への輸注用に調製した。

許容される数の形質導入細胞（少なくとも7日間のインビトロ培養後に少なくとも0.3コピーのベクター/細胞が検出されるアリコートにおいて、少なくとも100万 輸注細胞/体重kg）を輸注した2名の患者で、輸注から6ヵ月後に少なくとも0.1コピーのベクター/細胞が骨髄または末梢血のいずれにおいても観察されない場合、後続の患者を、細胞輸注の前に調整プロセスに供する。

患者があらゆる種類の調整に適するようにするために、調製に伴う潜在的な骨髄形成不全および形質導入細胞の潜在的移植不良を救済する適切な方法がなければならない。救済方法は、一単位のハプロ一致ドナー由来の臍帯血または造血細胞を含む。細胞は静脈内輸注される。

輸注により患者に投与される細胞の用量は、形質導入プロセスから得られる、3x10⁵〜4x10⁶ 精製CD34⁺細胞/患者体重kgの用量であった。

細胞は、単回用量で患者に輸注する。

形質導入細胞は、形質導入プロセスが完了した後直ちに輸注する。

輸注する製品は、CIEMATのCLINISTEM GMP研究所により輸注のために滅菌袋に封入されたCD34⁺細胞の懸濁物からなる。

動員期間：1番目の患者の輸注から3年間。

フォローアップ期間：形質導入細胞の輸注から2年間。しかし、10年間、患者を臨床試験外で観察する。

形質導入細胞の生着の観察は、末梢血および骨髄サンプルにおいて行う。

輸注後最初の72時間：この期間中、8時間ごとに生命兆候を記録し、24時間ごとに重要臓器の機能を観察した（電解質プロフィール、血液学、腎臓および肝臓機能）。

その後、表2に示される以下の検査を行った。

（表２）

FAと診断された、相補群FA-Aに属する患者を、この研究に参加させる。患者は、FANCA遺伝子を有するベクターを用いた形質導入により細胞の表現型の矯正が確認されるかどうかまたはこの遺伝子内で二対立遺伝子病原性変異が確認されるかどうかを考慮される。

患者FA 02005は、図20に要約されているように、FANCOSTEMおよびFANCOLENの基準に合致する。図21は、遺伝子療法前の患者FA-02005のFA診断を示す試験を示しており、図22は、患者FA-02005についての細胞製造プロセスのフォローアップを示している。図23は、遺伝子療法前ならびに遺伝子療法から2週間、4週間、6週間、2ヵ月、3ヵ月、4ヵ月および5ヵ月後の患者FA02005におけるベクターコピー数を示している。遺伝子療法前および後の最初の非調整FA-A患者である患者FA02005（4歳）のフォローアップが、ヘモグロビン（図24）、好中球（図25）および血小板（図26）について示されている。

患者FA02002について、血液学的評価（hematological evolution）が図27に示され、診断が図28に示され、細胞製造プロセスのフォローアップが図29に示されている。図30は、患者FA-02002に対するLV形質導入に必要とされる異なる工程の間の、健常ドナーおよびFA mPBにおけるCD34発現の分析を示している。図31は、遺伝子療法前ならびに遺伝子療法から2週間、4週間、6週間後の患者FA02002におけるベクターコピー数を示している。（凍結保存された細胞を輸注された）患者FA02002のフォローアップが、ヘモグロビン（図32）、好中球（図33）および血小板（図34）について示されている。

これらの2名の患者についてのデータは、患者に有意な数の遺伝子矯正動員末梢血（mPB）CD34+細胞が輸注されたという結論を裏付けている。2名の処置された患者のいずれにおいても深刻な有害事象は観察されなかった。GTから15日〜5ヵ月後の処置患者において、およそ1〜5コピー/1000末梢血細胞の遺伝子マーキングレベルが検出され、これは時間と共に穏やかに増加する。これらのウイルスコピー数は、以前の試験においてGTから3週間後に検出された最高値（3コピー/10^5細胞；Kelly et al. 2007）と比較しておよそ100倍高い。

実施例6. FA-A患者由来の新鮮なmPB CD34 ⁺ 細胞の形質導入
G-CSF/プレリキサホル法で処置された患者由来の少量の動員末梢血（mPB）CD34+サンプルの治療用ベクターを用いた短期間形質導入は、17〜45％の形質導入効率を示した（図35）。少量のこれらのサンプルを、1.5 Gyで調整したNSGマウスに移植した。移植されたサンプルの大部分がNSGマウスに生着した（BM細胞の1〜10％がhCD45+/mCD45-であった）（図36）。さらに、生着したマウスにおいて、矯正されたCD34+ FA-A細胞の明白な選択優位性が観察された（図37）。

これらの結果は、形質導入されたFA-A mPB CD34⁺細胞がNSGマウスに生着すること、およびNSGレシピエントマウスにおいて、矯正されたヒトFA-A再増殖細胞のインビボ増幅優位性がみられることを示している。

Claims (28)

1. 5'から3'の順に以下：
   （a）ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター配列またはその機能的ホモログもしくは変種と、
   （b）ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列と、
   （c）ウッドチャック肝炎ウイルス調節エレメント（WPRE）RNA輸送シグナル配列またはその機能的変種もしくはフラグメントと
   を含むポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列が、PGKプロモーター配列に機能的に連結されている、発現カセット。
2. FANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種が、SEQ ID NO:25に示される配列を含む、請求項1記載の発現カセット。
3. FANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列が、SEQ ID NO:8に示される配列を含む、請求項1記載の発現カセット。
4. PGKプロモーターが、SEQ ID NO:7のヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の発現カセット。
5. WPREエレメントが、SEQ ID NO:23のヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の発現カセット。
6. SEQ ID NO:24のヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の発現カセット。
7. 1つまたは複数のエンハンサー配列をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の発現カセット。
8. （d）ポリプリントラクト（PPT）またはポリアデニル化（ポリA)シグナル配列
   をさらに含む、請求項1記載の発現カセット。
9. 以下の配列：
   （e）パッケージングシグナル配列、
   （f）短縮型Gag配列、
   （g）Rev応答エレメント（RRE）、
   （h）セントラルポリプリントラクト（cPPT）、
   （i）セントラルターミナル配列（CTS）、および
   （j）上流配列エレメント（USE）、任意でサルウイルス40由来（SV40-USE）
   のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1記載の発現カセット。
10. 請求項1〜9のいずれか一項記載の発現カセットを含む、組換え遺伝子送達ベクター。
11. ウイルスまたはウイルスベクターである、請求項10記載の組換え遺伝子送達ベクター。
12. ウイルスまたはウイルスベクターが、レンチウイルス（LV）である、請求項11記載の組換え遺伝子送達ベクター。
13. 請求項1記載の発現カセットまたは請求項11もしくは請求項12記載の組換え遺伝子送達ベクターを含む、細胞。
14. 造血幹細胞である、請求項13記載の細胞。
15. CD34⁺細胞である、請求項13記載の細胞。
16. 薬学的に許容される賦形剤および請求項10〜12のいずれか一項記載の組換え遺伝子送達ベクターを含む、薬学的組成物。
17. 薬学的に許容される賦形剤および請求項13〜15のいずれか一項記載の細胞を含む、薬学的組成物。
18. その必要がある対象においてファンコニ貧血を処置する方法であって、請求項17または請求項17記載の薬学的組成物を該対象に提供する工程を含む、方法。
19. その必要がある対象においてファンコニ貧血を処置するための方法であって、発現カセットを含むCD34⁺細胞を該対象に提供する工程を含み、該発現カセットは、5’から3'の順に以下：
    （a）ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター配列またはその機能的ホモログもしくは変種と、
    （b）ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列と、
    （c）ウッドチャック肝炎ウイルス調節エレメント（WPRE）RNA輸送シグナル配列またはその機能的変種もしくはフラグメントと
    を含むポリヌクレオチド配列を含み、ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列が、PGKプロモーター配列に機能的に連結されている、方法。
20. CD34⁺細胞が、前記対象から得られた、請求項19記載の方法。
21. CD34+細胞が、前記対象を（i）G-CSFまたはフィルグラスチムおよび（ii）プレリキサホルの組み合わせで処置した後に該対象から得られた、請求項20記載の方法。
22. CD34⁺細胞が、前記発現カセットを含む組換え遺伝子送達ベクターを用いて形質導入された、請求項20記載の方法。
23. CD34⁺細胞が、該CD34⁺細胞と前記組換え遺伝子送達ベクターを約24時間接触させることによって形質導入された、請求項21記載の方法。
24. その必要がある対象においてファンコニ貧血を処置するための方法であって、
    （a）該対象においてCD34+細胞を動員するために、該対象に（i）G-CSFまたはフィルグラスチムおよび（ii）プレリキサホルの組み合わせを提供する工程、
    （b）該対象からCD34⁺細胞を含む生物学的サンプルを入手する工程であって、該生物学的サンプルが任意で末梢血または骨髄である、工程、
    （c）該生物学的サンプルから、CD34+細胞が濃縮された細胞集団を調製する工程、
    （d）5'から3'の順に以下：
    （i）プロモーター配列またはその機能的ホモログもしくは変種と、
    （ii）ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列と
    を含むポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む組換え遺伝子送達ベクターを用いて、CD34+細胞が濃縮された細胞集団に形質導入する工程であって、ヒトFANCAポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくは変種をコードする配列が、PGKプロモーター配列に機能的に連結されており、該形質導入が、該CD34+細胞が濃縮された細胞集団とレンチウイルスベクターを約24時間接触させることを含む、工程、ならびに
    （e）工程（d）に起因するレンチウイルスベクターを用いて形質導入された細胞集団を該対象に提供する工程
    を含む、方法。
25. 前記細胞集団を調製する工程が、赤血球を除去する工程を含む、請求項23記載の方法。
26. 前記細胞集団を調製する工程が、陽性選択、陰性選択またはそれらの組み合わせによりCD34⁺細胞を濃縮する工程を含む、請求項23記載の方法。
27. 前記対象におけるファンコニ貧血の発症を阻害する、ファンコニ貧血の進行を停止させる、および／またはファンコニ貧血の血液学的症状の進行を逆転させる、請求項23記載の方法。
28. ファンコニ貧血の血液学的症状が、BMF、血小板減少症、白血球減少症、汎血球減少症、好中球減少症および貧血のうちの1つまたは複数から選択される、請求項26記載の方法。

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