JP2024077544A - 細胞シート作製装置及び細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路 - Google Patents

Abstract

【課題】自動的な操作によって細胞シートを作成することができる小型の細胞シート作製装置及びそれに用いる細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路を提供する。【解決手段】細胞シート作製装置１は、細胞シート８０を作製するための細胞付着用平面基材を含むシート化液槽が設けられたシート化容器１５と、シート化容器１５に細胞を懸濁した細胞懸濁液を注入するための第１配管６８と、培地交換用の培養液を注入するための第２配管６６ａ，６７と、不要な液体成分を排出する第３配管７２と、を備えた細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００が装着され、細胞懸濁液を濃縮する濃縮部（遠心分離機１１）を備えて細胞懸濁液を濃縮し、濃縮された細胞懸濁液をシート化容器１５に注入して細胞を細胞付着用平面基材上に３，０００個／ｍｍ２以上の細胞播種密度で播種し、細胞付着用平面基材上に細胞シートを作製する。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞シート作製装置及び細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路に関する。

加齢黄斑変性には滲出型と委縮型があり、軽度の滲出型の治療には、抗血管新生療法、光線力学的療法、レーザー光凝固術等の方法がある。しかし、網膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium:ＲＰＥ）の高度の萎縮や欠損に至るまで進行した滲出型や萎縮型の場合、上記の手段では治療の有効性を得ることができない場合がある。その場合の有効な治療方法として、患者自身のｉＰＳ細胞由来のＲＰＥ細胞のシートを移植する方法が開発されている。

この治療のための細胞シートの作成は、安全キャビネットや高度なクリーンルームを有する細胞処理施設（Cell Processing Center:ＣＰＣ）、あるいはアイソレータシステムのような専用設備等で、専門技術者による手作業で行われる。

特許文献１には、コラーゲンゲル上にＲＰＥ細胞を播種、培養し、ＲＰＥ細胞で構成された細胞シートを形成し、次にコラーゲンゲルをコラゲナーゼで分解し、ＲＰＥ細胞で構成された細胞シートを剥離する、ＲＰＥ細胞シートの製造方法が開示されている。

特許文献２には、細胞シートの製造方法が開示されている。

国際公開第２０１２／１１５２４４号 特許第５８６７９２６号公報

ＣＰＣで細胞シート作成を行う場合、ＣＰＣの安全キャビネットやクリーンルームは開放系であり、いかにクリーンルームの清浄度をあげても、細胞に菌が接触する等のコンタミネーションが起こる可能性がある。また、細胞培養や細胞シートの作成は全て手作業であるため、品質にばらつきが起こりやすく、悪い場合には細胞シートの作成そのものを失敗する場合もある。

アイソレータシステムで細胞シートを作成する場合、アイソレータシステムは閉鎖系であり、自動化されているものもあるが、自動化には高額な費用が必要になる。また、患者自身の細胞を用いて細胞シートをつくるためには、患者ごとに個別に自動化装置の配管洗浄や段替えを行う必要があり、非効率的である。

そして、いずれの場合でも施設や設備が大型であるため、細胞の分離・移植を行う場所とは別の場所で細胞シートの作成を行う必要がある。この場合、作成した細胞シートを、移植治療を行う場所まで運送することになるが、この運送過程で受ける振動や衝撃等外的要因や時間経過により、細胞シートが損傷を受ける可能性がある。

このため、特殊な技能や設備を必要とせずに小型で安価な装置によって簡易に細胞を培養し、シート化ないしは３次元組織培養形成までを自動で行うことが求められている。

そこで、本発明は、原材料となる細胞懸濁液や培養液等の混合、分離やそれらの分注、播種等の工程を、手作業を伴わずに最適な条件のもとで自動的に操作して、細胞シートを作成することができる小型の細胞シート作製装置と、それに用いられる細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路を提供することを目的とする。

本発明の細胞シート作製装置は、細胞シートを作製するための細胞付着用平面基材を含むシート化液槽が設けられたシート化容器と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に細胞を懸濁してなる細胞懸濁液を注入するための第１配管と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に培地交換用の培養液を注入するための第２配管と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器の内部の不要な液体成分を排出する第３配管と、を備えた細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路が装着され、前記シート化容器に接続され、前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部を備え、前記濃縮部において前記細胞懸濁液の濃度を濃縮し、濃縮された前記細胞懸濁液を前記第１配管より前記シート化容器に注入して前記細胞を前記細胞付着用平面基材上に３，０００個／ｍｍ^２以上の細胞播種密度で播種し、前記第３配管からの前記不要な液体成分の排出と、前記第２配管からの前記培地交換用の培養液の注入とを行い、前記細胞付着用平面基材上に細胞シートを作製する。

また、本発明の細胞シート作製装置は、細胞シートを作製するための細胞付着用平面基材を含むシート化液槽が設けられたシート化容器と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に細胞を懸濁してなる細胞懸濁液を注入するための第１配管と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に培地交換用の培養液を注入するための第２配管と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器の内部の不要な液体成分を排出する第３配管と、を備えた細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路が装着され、前記シート化容器に接続され、前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部と、前記第１配管、前記第２配管、及び前記第３配管を含む前記シート化容器に接続する配管に設けられた複数個の切替え弁と、前記切替え弁の切替えを制御するとともに、無菌フィルターを介して前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路の内部の圧力を調整し、前記圧力の差により前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路の内部の液体を移送する送液機構と、を備え、前記濃縮部において前記細胞懸濁液の濃度を濃縮し、濃縮された前記細胞懸濁液を前記第１配管より前記シート化容器に注入して前記細胞を前記細胞付着用平面基材上に３，０００個／ｍｍ^２以上の細胞播種密度で播種し、前記第３配管からの前記不要な液体成分の排出と、前記第２配管からの前記培地交換用の培養液の注入とを行い、前記細胞付着用平面基材上に細胞シートを作製する。

また、本発明の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路は、細胞シートを作製するための細胞付着用平面基材を含むシート化液槽が設けられたシート化容器と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に細胞を懸濁してなる細胞懸濁液を注入するための第１配管と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に培地交換用の培養液を注入するための第２配管と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器の内部の不要な液体成分を排出する第３配管と、を備え、前記シート化容器に前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部が接続され、前記濃縮部において前記細胞懸濁液の濃度が濃縮され、濃縮された前記細胞懸濁液が前記第１配管より前記シート化容器に注入されて前記細胞が前記細胞付着用平面基材上に３，０００個／ｍｍ^２以上の細胞播種密度で播種され、前記第３配管からの前記不要な液体成分の排出と、前記第２配管からの前記培地交換用の培養液の注入とが行われ、前記細胞付着用平面基材上に細胞シートが作製される。

また、本発明の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路は、細胞シート作製装置に装着されて細胞シートが作製される細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路であって、細胞シートを作製するための細胞付着用平面基材を含むシート化液槽が設けられたシート化容器と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に細胞を懸濁してなる細胞懸濁液を注入するための第１配管と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に培地交換用の培養液を注入するための第２配管と、前記シート化容器に接続され、前記シート化容器の内部の不要な液体成分を排出する第３配管と、を備え、前記シート化容器に前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部が接続され、前記第１配管、前記第２配管、及び前記第３配管を含む前記シート化容器に接続する配管に複数個の切替え弁が設けられ、前記切替え弁の切替えを制御するとともに、無菌フィルターを介して前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路の内部の圧力を調整し、前記圧力の差により前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路の内部の液体を移送する送液機構が備えられ、前記濃縮部において前記細胞懸濁液の濃度が濃縮され、濃縮された前記細胞懸濁液が前記第１配管より前記シート化容器に注入されて前記細胞が前記細胞付着用平面基材上に３，０００個／ｍｍ^２以上の細胞播種密度で播種され、前記第３配管からの前記不要な液体成分の排出と、前記第２配管からの前記培地交換用の培養液の注入とが行われ、前記細胞付着用平面基材上に細胞シートが作製される。

本発明の細胞シート作製装置によれば、自動的な操作によって細胞シートを作成することができる小型の細胞シート作製装置を提供することができる。

本発明の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路によれば、自動的な操作によって細胞シートを作成することができる小型の細胞シート作製装置の使用に適した回路を提供することができる。

図１は、実施形態に係る細胞シート作製装置の構成を模式的に示す図である。 図２は、図１の細胞シート作製装置の、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路と原料容器並びにそれらを接続する配管を除く構成を模式的に示す図である。 図３は、図１の細胞シート作製装置の、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路と原料容器並びにそれらを接続する配管の構成を模式的に示す図である。 図４は、図１の細胞シート作製装置に装着される細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路の構成を模式的に示す図である。 図５は、図１の細胞シート作製装置に組み込まれる原料容器の構成を模式的に示す図である。 図６Ａは、図１の細胞シート作製装置に組み込まれるシート化容器の上面図である。 図６Ｂは、図６Ａのシート化容器の側面図である。 図７は、図１の細胞シート作製装置に組み込まれるシート化容器の一部の断面図である。 図８Ａは、図１の細胞シート作製装置のシート化容器が振とう装置に装着された構成の上面図である。 図８Ｂは、図８Ａのシート化容器が振とう装置に装着された構成の側面図である。 図９は、細胞シートの表面に細胞外マトリックスより構成された膜が形成される様子を説明する模式図である。 図１０は、第１実施例に係るシート化容器の構成を模式的に示す図である。 図１１は、第２実施例に係る原料容器の構成を模式的に示す図である。 図１２は、第３実施例に係る原料容器の構成を模式的に示す図である。 図１３は、第４実施例に係る原料容器の構成を模式的に示す図である。 図１４は、第６実施例に係る加速度の時間変化を示す図である。 図１５は、比較例に係る加速度の時間変化を示す図である。 図１６は、第６実施例に係る角度の時間変化を示す図である。 図１７は、比較例に係る角度の時間変化を示す図である。 図１８は、第７実施例に係る細胞シート作製装置の、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路と原料容器並びにそれらを接続する配管の構成を模式的に示す図である。

以下、本発明の実施形態について説明する。以下に説明する形態はあくまで例示であり、当業者にとって自明な範囲で適宜修正することができる。

＜実施形態＞
（細胞シート作製装置の構成）
図１は、本実施形態の細胞シート作製装置１の模式的構成図である。図１に示すように、細胞シート作製装置１は、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００が装着されて構成される。以下に、細胞シート作製装置１について、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００と原料容器並びにそれらを接続する配管を含む構成と、それを除いた構成とに分けて説明する。

図２は、図１の細胞シート作製装置１の、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００と原料容器並びにそれらを接続する配管を除く構成を模式的に示す図である。図２に示すように、細胞シート作製装置１の、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００と原料容器並びにそれらを接続する配管を除く構成は、恒温槽１０、遠心分離機１１、振とう装置１２、検査部１８、原料保管庫２０、解凍装置３０、局所加温機構４０、及び表示部５１が設けられた制御部５０を有する。

図３は、図１の細胞シート作製装置１の、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００と原料容器並びにそれらを接続する配管の構成を模式的に示す図である。図３に示すように、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００と原料容器並びにそれらを接続する配管の構成は、洗浄容器１３、活性化容器１４、シート化容器１５、廃液容器１６、培養液Ａを収容する原料容器２１、培養液Ｂを収容する原料容器２２、培養液Ｃを収容する原料容器２３、培養液Ｄを収容する原料容器２４、培養液Ｅを収容する原料容器２５、及び培養液Ｆを収容する原料容器２６を有する。さらに、細胞シート作製装置１の使用時には、凍結細胞を収容する凍結細胞保存容器３１が組み込まれるが、図面上は凍結細胞保存容器３１が組み込まれた状態を示す。

原料容器２１と凍結細胞保存容器３１とは無菌コネクタ８１を介して配管６１により接続されている。凍結細胞保存容器３１と洗浄容器１３とは無菌コネクタ８２を介して配管６２により接続されている。原料容器２２は無菌コネクタ８３を介して配管６３が接続されており、配管６３は配管６３ａ及び配管６３ｂの２つに分岐しており、配管６３ａは洗浄容器１３に接続し、配管６３ｂは活性化容器１４に接続されている。原料容器２３と活性化容器１４とは無菌コネクタ８４を介して配管６４により接続されている。原料容器２４と活性化容器１４とは無菌コネクタ８５を介して配管６５及び配管６５ａにより接続されている。原料容器２５とシート化容器１５とは無菌コネクタ８６を介して配管６６及び配管６６ａにより接続されている。ここで、配管６５及び配管６５ａと、配管６６及び配管６６ａとは配管ｂにより接続されており、原料容器２４は配管６５、配管ｂ、及び配管６６ａを介してシート化容器１５に接続され、また、原料容器２５は配管６６、配管ｂ、及び配管６５ａを介して活性化容器１４に接続された構成となっている。原料容器２６とシート化容器１５とは無菌コネクタ８７を介して配管６７により接続されている。無菌コネクタ８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７は、図面上、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００の装着後においてそれぞれ接続された状態を示している。細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００の装着前においては、無菌コネクタ８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７はそれぞれ未接続の状態となっている。

細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００は、使用前において、洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５と、これらを接続する各配管及び廃液容器１６とは、閉鎖系を保っており、予め滅菌処理が施されている。

また、洗浄容器１３とシート化容器１５とは配管６８により接続されている。洗浄容器１３と活性化容器１４とは、配管６９と配管７０によりそれぞれ接続されている。活性化容器１４とシート化容器１５とは配管７１により接続されている。洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５は、配管７２により廃液容器１６に接続されており、洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５の内部の不要な液体成分が排出可能な構成となっている。

上記の構成において、活性化容器１４とシート化容器１５とを接続する配管７１は、シート化容器１５に細胞を懸濁してなる細胞懸濁液を注入するための配管である。また、原料容器２４とシート化容器１５とを接続する配管６５、配管ｂ、及び配管６６ａ、原料容器２５とシート化容器１５とを接続する配管６６及び配管６６ａ、及び、原料容器２６とシート化容器１５とを接続する配管６７は、それぞれ、シート化容器１５に培地交換用の培養液を注入するための配管である。シート化容器１５と廃液容器１６とを接続する配管７２は、シート化容器１５の内部の不要な液体成分を排出する配管である。上記のシート化容器１５に接続された各配管は、互いに独立して設けられていてもよく、また、切替え部が設けられて切替え可能とすることで他の機能を有する配管と一部又は全部を共有することができる。

シート化容器１５は、無菌フィルターが装着された給気管７３を介して直接的にあるいはその他のチューブを介して間接的に空気供給部１９に接続されている。空気供給部１９からの細胞シートの作製に必要な空気が、直接的あるいは間接的にシート化容器１５に注入可能になっている。給気管７３に無菌フィルターが装着されており、恒温槽１０内の培養用空気の無菌環境を維持することができる。

上記の各配管は、例えば内径φ１～１０ｍｍである。洗浄容器１３は、例えば５～１００ｍｌの容量である。活性化容器１４は、例えば５０～１０００ｍｌの容量である。

図１に示すように、洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５は、恒温槽１０に収容される。恒温槽１０は、例えば３４～４０℃の範囲で温度を一定に保温するように設けられている。洗浄容器１３は例えば遠心管であり、遠心分離機１１等に装着される。活性化容器１４及びシート化容器１５は、振とう装置１２に装着される。図面上、遠心分離機１１及び振とう装置１２は恒温槽１０に内包されるように示しているが、これに限るものではなく、内包されていなくてもよい。

本実施形態においては洗浄容器１３と活性化容器１４とは個別の容器であるが、洗浄活性化容器として一体にしてもよい。洗浄活性化容器は、遠心分離機及び振とう装置に適宜装着される。

原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６は、原料保管庫２０に保管される。原料保管庫２０は、例えば２～１０℃の範囲で温度を一定に保つように設けられている。

凍結細胞保存容器３１は、細胞シート作製装置１の使用時に解凍装置３０に装着される。解凍装置３０は、例えば３４～４０℃の範囲の温度で凍結細胞を解凍するように設けられている。

凍結細胞保存容器３１に保存された凍結細胞から細胞懸濁液が得られ、本実施形態の細胞シート作製装置１によりシート化される。培養される細胞は、培養により細胞集合体を形成可能であれば特に限定されず、例えば接着性を有する細胞等が挙げられる。接着性を有する細胞として、ＲＰＥ細胞、肝臓癌細胞、肝芽腫細胞、ヘパトーマ細胞、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞等の内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞等の表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞等の神経細胞、軟骨細胞、骨細胞、又は幹細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）等が挙げられる。幹細胞は、例えば骨髄未分化間葉幹細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、脂肪幹細胞、皮膚幹細胞、歯周組織幹細胞、毛様体幹細胞、角膜輪部幹細胞、内臓幹細胞等である。細胞懸濁液に含有される細胞は、１種類のみでもよく、また、複数種類を含んでいてもよい。複数種類の細胞を含有する細胞懸濁液は、例えば複数の凍結細胞を準備してそれぞれ解凍し、それらを混合することで得ることができる。

細胞懸濁液は、遠心分離機１１等により濃縮される。単位体積当たりの細胞数を、「細胞濃度」あるいは「細胞懸濁液濃度」と称する。細胞懸濁液は、細胞濃度が５．０×１０^５個/ｍＬよりも高濃度となるように濃縮されるのが好ましい。細胞濃度は、光学的検査を行う検査部１８により監視される。

遠心分離機１１は、細胞懸濁液の細胞密度を濃縮する濃縮部として用いられている。濃縮部は遠心分離機に限定されず、中空糸フィルターを用いた濃縮部であってもよく、その他の構成の濃縮部であってもよい。

濃縮された細胞懸濁液は、シート化容器１５に移送され、細胞懸濁液に含有される細胞は、シート化容器１５の内部に備えられた細胞付着用平面基材上に沈殿して播種される。単位面積当たりの細胞数を、「細胞密度」あるいは「細胞播種密度」と称する。細胞懸濁液濃度が高いほど細胞播種密度が高くなる。細胞は、高密度に播種されたものが細胞シートの作製に用いられる。上記の「高密度」とは、調製した細胞が由来する正常組織において観察される細胞密度以上の密度をいう。細胞密度の上限は、当業者であれば適宜決定することが可能であるが、例えば細胞同士の密着による死滅を誘発しない程度の密度である。正常組織において観察される細胞密度は、組織の種類によって異なるが、例えば角膜内皮では３，０００個／ｍｍ^２程度、網膜色素上皮細胞では４，０００個／ｍｍ^２程度である。上記の高密度に濃縮された細胞密度は、正常組織において観察される細胞密度に対して、例えば１～１００倍、好ましくは１．２～５０倍、より好ましくは２．５～３０倍、特に好ましくは５～１０倍程度である。例えば、角膜内皮の場合で３，０００個／ｍｍ^２以上であり、網膜色素上皮細胞の場合で４，０００個／ｍｍ^２以上であり、いずれの場合でも、好ましくは５，０００個／ｍｍ^２以上２００，０００個／ｍｍ^２以下であり、より好ましくは１０，０００個／ｍｍ^２以上１２０，０００個／ｍｍ^２以下であり、特に好ましくは２０，０００個／ｍｍ^２以上４０，０００個／ｍｍ^２以下である。正常組織において観察される細胞密度が角膜内皮あるいは網膜色素上皮細胞より小さい種類の場合は、上記の細胞密度よりも小さい範囲を適用することが可能である。正常組織において観察される細胞密度が角膜内皮あるいは網膜色素上皮細胞より大きい種類の場合は、上記の細胞密度よりも大きい範囲を適用することが可能である。

局所加温機構４０は、例えば配管６３，６３ａ，６３ｂ，６４，６５，６５ａ，６６，６６ａ，６７，ｂの少なくとも一部を加温する。局所加温機構４０は、例えば３４～４０℃の範囲で温度を一定に保つように設けられている。

制御部５０は、例えば恒温槽１０、原料保管庫２０、解凍装置３０、及び局所加温機構４０の温度を制御する。恒温槽１０、原料保管庫２０、解凍装置３０、及び局所加温機構４０の温度の設定値及び実測値等が表示部５１に表示される。

また、原料保管庫２０の原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６あるいはそれらに接続する各配管にチューブ（ベリスタ）ポンプが設けられており、制御部５０は、原料保管庫２０の原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６から培養液等の各原料を供給する流量やタイミング等を制御可能に設けられている。各原料を供給する流量やタイミングの設定値等が表示部５１に表示される。例えば、培養液Ａの凍結細胞保存容器３１あるいは洗浄容器１３への供給、培養液Ｂの洗浄容器１３あるいは活性化容器１４への供給、培養液Ｃの活性化容器１４への供給、培養液Ｄの活性化容器１４あるいはシート化容器１５への供給、培養液Ｅの活性化容器１４あるいはシート化容器１５への供給、及び培養液Ｆのシート化容器１５への供給について、流量やタイミングが、細胞懸濁液の作製、細胞懸濁液の移送、及び細胞シートの作製のタイミングとともに制御される。

凍結細胞保存容器３１、洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５あるいはそれらに接続する各配管にチューブ（ベリスタ）ポンプが設けられており、制御部５０は、各容器間での培養液あるいは細胞懸濁液の移送を制御可能に設けられている。

また、部品点数の削減と、閉鎖系回路の細胞シート作製装置１の本体への着脱作業を簡便にするために、原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６、凍結細胞保存容器３１、洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５の各容器に圧力制御部を接続して、各容器間に圧力差を発生させ、送液する構成としてもよい。圧力制御部は、空気の供給による加圧と、吸引による減圧とを行う。原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６、凍結細胞保存容器３１、洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５の各容器と、圧力制御部とは、例えば無菌フィルターを装着した配管で接続されている。各容器に接続する各配管には、切替え弁、例えばピンチバルブが設けられている。圧力制御部は、切替え弁の切替え、例えばピンチバルブの開閉を制御するとともに、原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６、凍結細胞保存容器３１、洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５の各容器、及びこれらに接続する各配管の内部の圧力を調整可能に設けられている。各容器及び各配管の内部の圧力の調整は、例えば空気の供給による加圧、あるいは、吸引による減圧により行われる。切替え弁の切替え及び各容器及び各配管の内部の圧力を調整することにより、特定の容器間に圧力差を発生させ、各容器間での培養液あるいは細胞懸濁液の送液を行う。圧力制御部は、制御部５０が兼ねて設けられていてもよく、あるいは制御部５０とは別に設けられていてもよい。

また、細胞シート作製装置１には、廃液用の配管７２にも移送装置が設けられ、洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５から廃液容器１６へ排出されるように構成されている。

本実施形態においては、シート化容器１５に細胞懸濁液が注入された後、培養液Ｄ等の培養液が注入されるように制御されている。

また、洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５の洗浄や乾燥防止のために、原料容器２２，２３，２５，２６から培養液を好ましいタイミングで洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５に供給するようにしてもよい。

また、制御部５０は遠心分離機１１及び振とう装置１２に接続され遠心分離機１１の駆動及び振とう装置による振とう動作を制御する。遠心分離機１１の駆動の設定値及び振とう装置による振とう動作の設定値等が表示部５１に表示される。

図４は、図１の細胞シート作製装置１に装着される細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００の構成を模式的に示す図である。細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００は、洗浄容器１３、活性化容器１４、シート化容器１５、及び廃液容器１６を有し、これらに接続する配管６２，６３，６３ａ，６３ｂ，６４，６５，６５ａ，６６，６６ａ，ｂ，６７，６８，６９，７０，７１，７２が設けられている。図４の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００は細胞シート作製装置１に装着する前の状態を示し、無菌コネクタ８２，８３，８４，８５，８６，８７をそれぞれ構成する無菌コネクタ８２ｂ，８３ｂ，８４ｂ，８５ｂ，８６ｂ，８７ｂは、未接続の状態であることを示す。

シート化容器１５内で作製された細胞シートを容器から工具なしで容易に脱着することが可能なように構成されている。例えば、シート化容器１５の側面外周に深さ０．１～０．５ｍｍの溝部が設けられており、この溝の上部と下部で分離させる方向に手で力を加えることで、完成した細胞シートを工具なしで容易に脱着することができるように構成されている。

細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００の閉鎖系を保ったまま、無菌閉鎖系回路を分離して運搬可能とするように、洗浄容器１３に接続する配管６２，６３，６４，６５，６６，６７，７２は熱溶着で切断可能に構成されていてもよいし、無菌切断コネクタを予め装着しておいてもよい。

図５は、図１の細胞シート作製装置１に組み込まれる原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６の構成を模式的に示す図である。例えば、培養液Ａを収容する原料容器２１、培養液Ｂを収容する原料容器２２、培養液Ｃを収容する原料容器２３、培養液Ｄを収容する原料容器２４、培養液Ｅを収容する原料容器２５、及び培養液Ｆを収容する原料容器２６が、それぞれ別体で設けられている。図５の原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６は細胞シート作製装置１に装着する前の状態を示し、無菌コネクタ８１，８３，８４，８５，８６，８７をそれぞれ構成する無菌コネクタ８１ａ，８３ａ，８４ａ，８５ａ，８６ａ，８７ａは、未接続の状態であることを示す。

培養液Ａ、培養液Ｂ、培養液Ｃ、培養液Ｅ、及び培養液Ｆは、細胞の育成に用いられる栄養分を含み、細胞の生育環境を提供する。培養液は、細胞を培養するために通常使用される培養液を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定できる。例えば、無機塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、タンパク質、ペプチド、コラーゲン、脂肪酸、脂質、血清等を、緩衝溶液中に含有させたものである。具体的には、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地)を用いることができる。培養液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｆは、同じ組成の培養液であってもよく、異なる組成の培養液であってもよい。

培養液Ｄは、他の培養液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｆとは組成が異なる培養液である。例えば、培養液Ｄは、血清、タンパク阻害剤、増殖因子、あるいはその他の成分を含有しており、この点で、他の培養液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｆとは組成が異なる。

培養液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆは、細胞培養の培地として用いられ、あるいは、培地交換用に用いられる。

図６Ａは、図１の細胞シート作製装置１に組み込まれるシート化容器１５の上面図である。図６Ｂは、図６Ａのシート化容器１５の側面図である。シート化容器１５は、基体１５ａに複数個（図面上は３×４個）のシート化部１５ｂがマトリクス状に並べられて設けられている。図６Ａに示すシート化容器１５では、シート化容器１５に設けられるシート化部１５ｂの個数が１２個であることを示しているが、シート化部１５ｂの個数は特に限定されない。

図７は、図１の細胞シート作製装置１に組み込まれるシート化部１５ｂの一部の断面図である。シート化液槽ＩＳの数は、１つ以上複数個設けられていてもよい。図７に示すシート化部１５ｂでは、複数個（例えば２×２個）のシート化液槽ＩＳが設けられており、図面上は２個のシート化液槽ＩＳの断面を示している。シート化液槽ＩＳは市販のインサート（製品名：トランズウェル３４７０）により構成され、底面に細胞付着用平面基材Ｍが設けられている。シート化液槽ＩＳには細胞懸濁液Ｃ及び培養液Ｓ１が供給されるように構成されている。ここで培養液Ｓ１は血清等を含む培養液と含まない培養液とが適宜選択されて供給可能に構成されている。図７に示すシート化部１５ｂは４個のシート化液槽ＩＳが設けられており、図面上は２個のシート化液槽の断面を示しているが、シート化液槽ＩＳの個数は特に限定されず、また、シート化部１５ｂの個数も特に限定されない。

シート化液槽ＩＳの下部にはレシーバー槽Ｒが設けられている。レシーバー槽Ｒには培養液Ｓ２が供給されるように構成されている。レシーバー槽Ｒへ培養液Ｓ２を供給する流量が制御可能に設けられ、細胞シートを作製する際に、レシーバー槽Ｒの内部の培養液を交換するように構成されている。

シート化液槽ＩＳとレシーバー槽Ｒとの間に窓部が設けられ、後述の振とう動作あるいは排出動作によりシート化液槽ＩＳの内部の不要な液体成分がレシーバー槽Ｒへ排出されるオーバーフローＦ１が発生可能となっている。さらに、レシーバー槽Ｒは外周側に窓部が設けられ、後述の振とう動作あるいは排出動作によりレシーバー槽Ｒの内部の不要な液体成分が排出されるオーバーフローＦ２が発生可能となっている。レシーバー槽Ｒから排出された不要な液体成分は、ドレイン配管ＤＲを介してシート化部１５ｂから外部へ排出される。

シート化部１５ｂには、二酸化炭素を含む空気Ｇが供給される配管が設けられている。空気Ｇの二酸化炭素濃度は、例えば４～６％であり、二酸化炭素を含む空気が収容されたボンベ等の空気供給部１９から供給される。二酸化炭素を含む空気Ｇの供給により、シート化液槽ＩＳに入った細胞懸濁液中の細胞の活性化が促進される。例えば、シート化部１５ｂに供給される気体は、予め二酸化炭素濃度が４～６％程度に調整された空気でもよいし、シート化液槽ＩＳ内で細胞の活性化に適した環境となれば、１００％の二酸化炭素ガスでもよいし、水蒸気等のその他のガス成分でもよい。

例えば、二酸化炭素を含む空気Ｇの供給経路中に、細菌の侵入を防止するフィルターが設けられている。

図８Ａは、図１の細胞シート作製装置１のシート化容器１５が振とう装置１２に装着された構成の上面図である。図８Ｂは、図８Ａのシート化容器１５が振とう装置１２に装着された構成の側面図である。シート化容器１５が振とう装置１２に固定されるようにして、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００は細胞シート作製装置１に装着される。振とう装置１２は、例えば、シート化容器１５に衝撃を与える往復動作１２ａ、叩き動作１２ｂ、水平方向の往復回転動作１２ｃ、シート化容器１５を傾ける傾け動作１２ｄ，１２ｅを含む振とう動作が可能に構成されている。

例えば、振とう装置１２は、シート化容器１５を水平面に対する前後方向と左右方向のどちらかまたは両方向に対して５～４５度の角度で０．１～１秒／回の間隔で傾ける傾け部と、シート化容器１５に加速度１．０～３０Ｇ、１～５秒／回の衝撃を与える叩き部とを有する。

また、例えば、傾け部は、シート化容器１５の内部の不要な液体成分の排出のために、シート化容器１５を水平面に対して１５～６０度の角度で傾けることが可能に構成されている。これにより、シート化容器１５を傾け、シート化液槽ＩＳの内部の不要な液体成分がレシーバー槽Ｒへ排出されるオーバーフローＦ１及びレシーバー槽Ｒの内部の不要な液体成分が排出されるオーバーフローＦ２が発生可能となっている。

上記の細胞シート作製装置１において、各配管の接続ミスや、漏れの有無を確認するために、各配管にポンプやピンチバルブ及び圧力センサが設けられていて、配管内に所定の圧力の空気を送ることで、所定の内圧に達しない状態を検知する機構を設けてもよい。

（細胞シートの作製方法）
本実施形態の細胞シートの作製方法について図１を参照して説明する。まず、細胞シート作製装置１に、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００を装着する。即ち、洗浄容器１３を遠心分離機１１に、活性化容器１４及びシート化容器１５を振とう装置１２に装着する。洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５と、これらを接続する各配管及び廃液容器１６とは、閉鎖系を保っており、使用前に予め滅菌処理が施されている。また、原料保管庫２０に原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６を装着し、凍結細胞保存容器３１を解凍装置３０に装着する。また、無菌コネクタ８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７により各配管を無菌状態で接続する。洗浄容器１３、活性化容器１４、及びシート化容器１５と、これらを接続する各配管及び廃液容器１６とは、パネル等を用いて固定配置するようにしてもよい。また、各配管の接続箇所を記号化あるいは色分け等を施して、装着の際に接続作業が簡便となるようにしてもよい。

細胞シート作製装置１への細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００、原料容器２１，２２，２３，２４，２５，２６、凍結細胞保存容器３１の装着、及び各配管の接続の後、各配管に設けられたポンプ機構やピンチバルブにより、また、各配管に加圧減圧機構が設けられている場合には、各配管の加圧減圧により、各配管の接続ミス、及び漏れの有無等を確認する。

次に、解凍装置３０において凍結細胞保存容器３１中の凍結細胞を解凍する。ここで、凍結細胞は、患者から採取された細胞を凍結したものである。

解凍装置３０では、例えば凍結細胞保存容器３１ごと加温し、保存されていた凍結細胞を解凍する。解凍温度は、例えば４～３７℃である。その後、凍結細胞保存容器３１の中へ原料容器２１から配管６１によって培養液を注入し、解凍した細胞と共に洗浄容器１３へ移送する。

次に、洗浄容器１３において、細胞に添加された凍結保護剤を取り除く。例えば、洗浄容器１３へ移送された細胞および培養液に対して、洗浄容器１３が装着された遠心分離機１１の回転子を回転させることで遠心分離を行い、細胞と、凍結保護剤を含んだ培養液とに分離させる。細胞を移送用の培養液とともに配管６９により活性化容器１４へ移送する。凍結保護剤を含んだ培養液を、移送装置により廃液容器１６へ排出する。

次に、細胞の活性化を行う。ここでの細胞の活性化は前培養とも称する。例えば、活性化容器１４へ移送された細胞を、原料容器２３から配管６４により注入される活性化用の培養液で希釈し、細胞が活性化するまで静置する。活性化処理の温度は３４～４０℃である。この時、細胞の活性化を促進させるために、活性化容器１４を振とう装置１２により振とうさせてもよい。活性化処理がなされる時間は、例えば３～５日間程度である。

細胞が接着細胞の場合は、活性化すると容器に付着するため、トリプシン等の分散液を加えて細胞を容器から剥離する。その後、トリプシンを不活性化させるために、原料容器２４及び原料容器２５から、配管６５，６５ａ，６６，ｂにより、血清入りの培養液等を追加する。活性化した細胞を含んだ培養液を配管７０により洗浄容器１３に移送し、遠心分離により細胞と培養液とに分離する。得られた活性化された細胞を懸濁用の培養液で懸濁して細胞懸濁液を得て、配管６８によりシート化容器１５に移送する。

本実施形態においては洗浄容器１３と活性化容器１４とは個別の容器として用いているが、洗浄活性化容器として一体化したものを用いてもよい。この場合は、上記の洗浄容器１３と活性化容器１４との間の移送が省略されて工程は簡便となる。

上記の洗浄工程と活性工程において、必要に応じて、洗浄及び活性化を複数回繰り返してもよい。この場合には、活性化容器１４において、活性化された細胞を懸濁用の培養液で懸濁して細胞懸濁液を得て、配管７１によりシート化容器１５に移送するようにしてもよい。

シート化容器１５へ移送される細胞懸濁液に対して、検査部１８により光学的検査を行い、細胞密度が上記の高密度の範囲、例えば３，０００個／ｍｍ^２以上相当に制御されているか検査する。細胞密度が上記の範囲から外れている場合には、培養液の排出や追加を行い、細胞濃度を調整する。

次に、活性化した高濃度の細胞をシート化容器１５の中の平面基材上に一定期間、静置させて、自動で細胞シート８０を作成する。細胞のシート化処理の温度は３４～４０℃である。この時、シート化を促進させるために、シート化容器１５を振とう装置１２により振とうさせてもよい。細胞のシート化処理がなされる時間は、例えば５日間程度である。

細胞シート８０は、平坦な形状であるが、積層される細胞シートの縦方向の厚みがある場合、立体的な細胞塊としてもよい。

振とう動作においては、例えば、振とう装置１２の傾け部の駆動で、シート化容器１５を水平面に対する前後方向と左右方向のどちらかまたは両方向に対して５～４５度の角度で０．１～１秒／回の間隔で傾ける。また、振とう装置１２の叩き部の駆動で、シート化容器１５に衝撃を与える。

また、シート化容器１５の内部の不要な液体成分を排出するために、シート化容器１５を水平面に対して５～１００度の角度で傾けるようにしてもよい。

次にシート化容器１５内で手術に適した状態にまで作製された細胞シートを、該シート化容器１５から工具な容易に脱着することが可能なように、シート化容器１５の側面外周に深さ０．１～０．５ｍｍの溝部が設けられており、この溝の上部と下部で分離させる方向に手で力を加えることで、シート化容器１５から細胞シートを脱着するのに十分な空間を出現させ、完成した細胞シートをシート化容器１５から取り出して、移植手術に用いる。

上記のシート化容器１５の取り外しとしては、シート化容器１５を含む細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００の切断に適した任意の箇所で配管を無菌状態で切断することで取り外すことが可能である。配管の切断は、無菌切断機によって行ってもよく、配管の熱溶着での切断で行ってもよい。

細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００とこれに含まれる配管等はディスポーザブルで、使用毎に新規なものに交換する。

（細胞シート作製装置の作用・効果）
本実施形態の細胞シート作製装置１によれば、自動的な操作によって細胞シートを作成することができ、ＣＰＣやアイソレータシステムより小型化された装置によって細胞シートを作製できる。

特に、本実施形態の細胞シート作製装置１によれば、細胞シートが作製される細胞付着用平面基材Ｍと反対側における細胞シートの表面に細胞外マトリックスにより構成された膜（例えばブルッフ膜）を形成することができる。細胞外マトリックスにより構成された膜が形成された細胞シートを移植する場合、細胞シートを裏返すことなく移植することが可能であり、移植手術に有利である。

図９は、細胞付着用平面基材Ｍと反対側における細胞シートＣＳの表面に細胞外マトリックスにより構成された膜ＢＭが形成される様子を説明する模式図である。シート化液槽ＩＳは底面に細胞付着用平面基材Ｍが設けられている。シート化液槽ＩＳに細胞懸濁液、培養液を含む混合液Ｓが収容され、細胞培養がなされて細胞付着用平面基材Ｍ上に細胞シートＣＳが作製される。このとき、細胞付着用平面基材Ｍと反対側における細胞シートＣＳの表面に細胞外マトリックスにより構成された膜ＢＭが形成される。

細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００には、細胞懸濁液をシート化容器１５に移送する配管と血清等を供給する配管とが個別に設けられており、細胞懸濁液および血清の供給量およびタイミング等を個別に制御できる。これらのタイミング制御により、細胞外マトリックスにより構成された膜の形成安定性が向上する。

細胞シートを作成することのできる小型の自動装置を用いることによって、手作業の技量に頼らず、自動で細胞シートを作成することができる。この細胞シート作製装置に用いられる細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路は、一度使用するごとに新しい回路に交換することが可能で、患者ごとの細胞シートをコンタミネーションのリスクを避けて効率的に作成することができる。また、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路は、細胞シート作製装置１台に対し１回路としてもよいし、同装置１台に対し複数回路を設置してもよい。

また、細胞シート作製装置は閉鎖系であるため、細胞シート作製装置の設置場所はクリーンルームである必要はなく、小型なので移植治療を行う場所に設置してもよい。これにより、細胞シートを運送する必要が無くなり、細胞シートが損傷するリスクを下げることができる。

上記の本実施形態の細胞シート作製装置１により、特に加齢黄斑変性症等の細胞組織移植以外では治癒が困難な治療行為等を支援することができる。

（第１実施例）
図１０は、第１実施例に係るシート化容器の構成を模式的に示す図である。細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００Ｘは、シート化容器１５Ｘ、及び廃液容器１６Ｘを有し、これらに接続する配管６５Ｘ，６６Ｘ，６６Ｘａ，６７Ｘ，６８Ｘ，７２Ｘが設けられている。配管６６Ｘには無菌コネクタ８８Ｘｂが設けられ、無菌コネクタ８８Ｘａを接続することで原料細胞懸濁液１７Ｘがシート化容器１５Ｘに注入可能となっている。配管６５Ｘには無菌コネクタ８５Ｘｂが設けられ、無菌コネクタ８５Ｘａを接続することで原料容器２４Ｘから培養液Ｄがシート化容器１５Ｘに注入可能となっている。配管６６Ｘには無菌コネクタ８６Ｘｂが設けられ、無菌コネクタ８６Ｘａを接続することで原料容器２５Ｘから培養液Ｅがシート化容器１５Ｘに注入可能となっている。配管６７Ｘには無菌コネクタ８７Ｘｂが設けられ、無菌コネクタ８７Ｘａを接続することで原料容器２６Ｘから培養液Ｆがシート化容器１５Ｘに注入可能となっている。シート化容器１５Ｘは、無菌フィルターが装着された給気管７３Ｘを介して直接的にあるいはその他のチューブを介して間接的に空気供給部１９Ｘに接続されている。空気供給部１９Ｘからの細胞シートの作製に必要な空気が、直接的あるいは間接的にシート化容器１５Ｘに注入可能になっている。給気管７３Ｘに無菌フィルターが装着されており、恒温槽１０内の培養用空気の無菌環境を維持することができる。

本実施例の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００Ｘは、実施形態の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００から洗浄容器１３及び活性化容器１４並びにこれらに接続する配管を除去し、細胞懸濁液を外部から供給可能とするように配管６８Ｘを設けたものである。上記を除いては実施形態と同様である。

本実施例の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００Ｘは、上記の実施形態の細胞シート作製装置１で用いることができ、自動的な操作によって細胞シートを作成することができ、ＣＰＣやアイソレータシステムより小型化された装置によって細胞シートを作製できる。

本実施例の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００Ｘを細胞シート作製装置１で用いる場合、洗浄容器１３及び活性化容器１４に相当する容器を別途用いる。細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路１００Ｘは最初から洗浄容器１３及び活性化容器１４を含んでいないので、細胞シートの作成後のシート化容器１５Ｘの取り外しが容易になる。

（第２実施例）
図１１は、第２実施例に係る原料容器の構成を模式的に示す図である。例えば、培養液Ａを収容する原料容器２１ａ、培養液Ｂを収容する原料容器２２ａ、培養液Ｃを収容する原料容器２３ａ、培養液Ｄを収容する原料容器２４ａ、培養液Ｅを収容する原料容器２５ａ、及び培養液Ｆを収容する原料容器２６ａが、それぞれ別体で設けられている。各原料容器２１ａ，２２ａ、２３ａ，２４ａ，２５ａ，２６ａは、一回の細胞シート作成に適した量を収容する大きさとなっており、ディスポーザブルで使用毎に新規なものに交換する形態とすることができる。

（第３実施例）
図１２は、第３実施例に係る原料容器の構成を模式的に示す図である。培養液Ａを収容する原料容器２１ｂ、培養液Ｂを収容する原料容器２２ｂ、培養液Ｃを収容する原料容器２３ｂ、培養液Ｄを収容する原料容器２４ｂ、培養液Ｅを収容する原料容器２５ｂ、及び培養液Ｆを収容する原料容器２６ｂが、１つのパッケージ２７ｂにまとめられて設けられている。各原料容器２１ｂ，２２ｂ，２３ｂ，２４ｂ，２５ｂ，２６ｂは、パッケージ２７ｂ内部では隔てられていて原料が混合してしまうことはなく、原料容器の並び順が固定されるので、原料容器の誤装着を防止できる。

（第４実施例）
図１３は、第４実施例に係る原料容器の構成を模式的に示す図である。培養液Ａを収容する原料容器２１ｃ、培養液Ｂを収容する原料容器２２ｃ、培養液Ｃを収容する原料容器２３ｃ、培養液Ｄを収容する原料容器２４ｃ、培養液Ｅを収容する原料容器２５ｃ、及び培養液Ｆを収容する原料容器２６ｃが、１つのパッケージ２７ｂにまとめられて設けられている。さらに、原料容器２１ｃ及び原料容器２２ｃには無菌コネクタ付の接続口２１ｄが設けられている。接続口２１ｄから気体を吹き込み、原料容器２１ｃ及び原料容器２２ｃの内部の原料を押し出して使用でき、原料を無駄なく最後まで使用することができる。接続口２１ｄは原料容器２１ｃ，２２ｃ，２３ｃ，２４ｃ，２５ｃ，２６ｃの一部又は全部に設けられている。

（第５実施例）
眼球から採取した網膜色素上皮細胞の冷凍細胞の試料を上記の実施形態に記載の細胞シート作製装置１で解凍及び活性化処理を行い、０．１％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで５分間処理を行って得られたＲＰＥ細胞を遠心分離で濃縮する。得られた細胞懸濁液の細胞数を計測して、シート化容器（４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ））に１００万個、２００万個ずつ（細胞密度はそれぞれ５，０００個／ｍｍ^２、１０，０００個／ｍｍ^２）播種し、培養する。その結果、細胞付着用平面基材上にヒト網膜色素上皮細胞の細胞シートを形成できる。

得られた細胞シートに対して免疫染色を行う。免疫染色はシートを４％パラフォルムアルデヒドにて固定後、ホールマウントによるか冷凍またはパラフィン切片を作成して、エラスチン、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩ、アクチン、サイトケラチン、オクルディン、ＺＯ－１など目的とするタンパク質に対する一次抗体を用いて、酵素抗体法または蛍光抗体法にて染色を行い、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で観察を行う。アクチンに関しては、蛍光標識したファロイジンによっても染色し観察可能である。かかる免疫染色の結果、細胞間接着および平滑筋アクチンの発現が、播種１日後に確認できる。その後、細胞外マトリックスにより構成された膜（ブルッフ膜）のコンポーネントであるエラスチンおよびコラーゲンＩＶの発現がＲＰＥ細胞の血清接触表面に確認できる。

また、前記の免疫染色は、別途下記のとおりに行うことでも同様の結果が得られる。作成したヒト網膜色素上皮細胞の細胞シートを１Ｍリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラフォルムアルデヒドを含有する０．２ＭＰＢＳ中で１５分間固定を行う。固定後、細胞シートをＴｗｅｅｎ２０含有Ｔｒｉｓ－バッファー生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）で５回洗浄する。次いで、細胞シートをタンパク質ブロッキングバッファーでブロッキングの後、細胞シートを１次抗体で４℃、一晩培養する。用いられる１次抗体としては、抗オクルディンヤギポリクローナル抗体（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗エラスチンウサギポリクローナル抗体（１：１００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いる。細胞シートをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、二次抗体で３０分間、室温にて培養する。次いで、細胞シートをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、乾燥後、ＤＡＰＩと共にｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄで封入する。各切片は、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡（ＡＸ－７０； Ｏｌｙｍｐｕｓ ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）で観察できる。

（第６実施例）
上記の実施形態に記載の細胞シート作製装置１の振とう装置１２を用いて、図１４に示す５～６秒間のしっかりした叩き動作と同時に、図１６に示す角度と加速度でシート化容器にしっかりした上下左右の傾け角度をもって傾け動作がなされることで、所定の細胞濃度に調整したシート化容器内の細胞が、細胞付着用平面基材上に均等に播種されて、均質な細胞シートが作製される。

比較例として、図１５に示す３秒間程度の短く弱い叩き動作、及び、図１７に示す３秒間程度の短く弱い傾け動作の場合には、所定の細胞濃度に調整したシート化容器内の細胞が、細胞付着用平面基材上に均等に播種されず、均質な細胞シートが作製されない。

上記のように、本実施例によれば、上記の実施形態に記載の細胞シート作製装置１を用いることで、手作業に比較して安定した強い振とう動作を行うことができ、手作業の技量に頼らずに品質のばらつきを抑えて細胞シートを作成できる。

（第７実施例）
図１８は、第７実施例に係る細胞シート作製装置の、細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路と原料容器並びにそれらを接続する配管の構成を模式的に示す図である。本実施例の細胞シートの作製装置は、各配管にチューブ（ベリスタ）ポンプが設けられている代わりに、原料容器２１Ｙ，２２Ｙ，２３Ｙ，２４Ｙ，２５Ｙ，２６Ｙ、凍結細胞保存容器３１Ｙ、洗浄容器１３Ｙ、活性化容器１４Ｙ、及びシート化容器１５Ｙの各容器に圧力制御部９０Ｙが接続されている。圧力制御部９０Ｙにより、各容器間に圧力差を発生させ、送液する構成となっている。圧力制御部９０Ｙは、空気の供給による加圧と、吸引による減圧とを行う。配管９１Ｙは加圧配管であり、配管９２Ｙは減圧配管である。配管９１Ｙは、原料容器２１Ｙ，２２Ｙ，２３Ｙ，２４Ｙ，２５Ｙ，２６Ｙに無菌フィルターを装着して接続されている。配管９２Ｙは、シート化容器１５Ｙ及び廃液容器１６Ｙに無菌フィルターを装着して接続されている。各容器に接続する各配管にはピンチバルブＶ１～Ｖ６，Ｖ８～Ｖ１８が設けられている。圧力制御部９０Ｙは、ピンチバルブＶ１～Ｖ６，Ｖ８～Ｖ１８の開閉を制御するとともに、原料容器２１Ｙ，２２Ｙ，２３Ｙ，２４Ｙ，２５Ｙ，２６Ｙ、凍結細胞保存容器３１Ｙ、洗浄容器１３Ｙ、活性化容器１４Ｙ、及びシート化容器１５Ｙの各容器、及びこれらに接続する各配管の内部の圧力を調整可能に設けられている。ピンチバルブＶ１～Ｖ６，Ｖ８～Ｖ１８の開閉及び原料容器２１Ｙ，２２Ｙ，２３Ｙ，２４Ｙ，２５Ｙ，２６Ｙ、凍結細胞保存容器３１Ｙ、洗浄容器１３Ｙ、活性化容器１４Ｙ、及びシート化容器１５Ｙの各容器、及びこれらに接続する各配管の内部の圧力を調整することにより、特定の容器間に圧力差を発生させ、各容器間での培養液あるいは細胞懸濁液の送液を行う。圧力制御部９０Ｙは、恒温槽１０の温度制御や振とう動作の制御を行う制御部が兼ねていてもよいが、本実施例では制御部とは別に設けられている。

本実施例の細胞シート作製装置において、選択した容器間での液体の移送のために開放するピンチバルブと、加圧と減圧の制御を表１に示す。表１は、移送元の容器、移送先の容器、開放ピンチバルブ、配管９１Ｙへの加圧及び配管９２Ｙへの減圧の制御（圧力制御）、を示す。

原料容器２１Ｙから凍結細胞保存容器３１Ｙ及び洗浄容器１３Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ１を開放し、配管９１Ｙを加圧する。

洗浄容器１３Ｙから廃液容器１６Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ１５，Ｖ１６を開放し、配管９２Ｙを減圧する。

原料容器２２Ｙから洗浄容器１３Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ２，Ｖ８を開放し、配管９１Ｙを加圧する。

洗浄容器１３Ｙから活性化容器１４Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ１２，Ｖ１７，Ｖ１５を開放し、配管９２Ｙを減圧する。

原料容器２２Ｙから活性化容器１４Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ２，Ｖ９，Ｖ１７，Ｖ１５を開放し、配管９１Ｙを加圧し、配管９２Ｙを減圧する。

原料容器２３Ｙから活性化容器１４Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ３，Ｖ１７，Ｖ１５を開放し、配管９１Ｙを加圧し、配管９２Ｙを減圧する。

原料容器２４Ｙから活性化容器１４Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ４，Ｖ１０，Ｖ１７，Ｖ１５を開放し、配管９１Ｙを加圧し、配管９２Ｙを減圧する。

活性化容器１４Ｙから廃液容器１６Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ１７，Ｖ１５を開放し、配管９２Ｙを減圧する。

活性化容器１４Ｙから洗浄容器１３Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ３，Ｖ１２を開放し、配管９１Ｙを加圧する。

洗浄容器１３Ｙからシート化容器１５Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ１３，Ｖ１４を開放し、配管９２Ｙを減圧する。

原料容器２４Ｙからシート化容器１５Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ４，Ｖ１１，Ｖ１４を開放し、配管９１Ｙを加圧し、配管９２Ｙを減圧する。

原料容器２５Ｙからシート化容器１５Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ５，Ｖ１１，Ｖ１４を開放し、配管９１Ｙを加圧し、配管９２Ｙを減圧する。

原料容器２６Ｙからシート化容器１５Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ６，Ｖ１４を開放し、配管９１Ｙを加圧し、配管９２Ｙを減圧する。

シート化容器１５Ｙから廃液容器１６Ｙに内部の液体を移送する場合には、ピンチバルブＶ１３，Ｖ１８，Ｖ１５を開放し、配管９２Ｙを減圧する。

（第８実施例）
第８実施例では、第７実施例に係る細胞シート作製装置を用いて、表２に示す条件下で、選択した移送元の容器から移送先の容器へ各容器に内部の液体を移送する例を示す。液体の移送量、移送に係る配管内径、及び配管長さ、配管９１Ｙあるいは配管９２Ｙへの供給圧、及び送液結果を表２に示す。

移送箇所Ｐ１では、原料容器２１Ｙから凍結細胞保存容器３１Ｙを経由して洗浄容器１３Ｙに培養液を移送する。移送量は３０ｍｌ、原料容器２１Ｙと凍結細胞保存容器３１Ｙ及び洗浄容器１３Ｙとを接続する配管の内径は１．０ｍｍ、配管長さは６０５ｍｍとする。配管９１Ｙへの供給圧が１０ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下のとき、９０秒以下の時間で全量移送できる。配管９１Ｙへの供給圧が０ｋＰａ超１０ｋＰａ未満のとき、圧力が弱すぎて移送できず、液残りがある。配管９１Ｙへの供給圧が２０ｋＰａ超のとき、圧力が高すぎて移送先の容器内で液体が勢いよく噴出してしまい、細胞へのダメージが懸念される。

移送箇所Ｐ２では、洗浄容器１３Ｙから活性化容器１４Ｙに細胞懸濁液を移送する。移送量は１０．８ｍｌ、洗浄容器１３Ｙと活性化容器１４Ｙとを接続する配管の内径は１．０ｍｍ、配管長さは４６０ｍｍとする。配管９２Ｙへの供給圧が－１８ｋＰａ以上－５ｋＰａ以下のとき、６０秒以下の時間で全量移送できる。配管９２Ｙへの供給圧が－５ｋＰａ超０ｋＰａ未満のとき、圧力が弱すぎて移送できず、液残りがある。配管９２Ｙへの供給圧が－１８ｋＰａ未満のとき、圧力が高すぎて移送先の容器内で液体が勢いよく噴出してしまい、細胞へのダメージが懸念される。

移送箇所Ｐ３では、活性化容器１４Ｙから洗浄容器１３Ｙに細胞懸濁液を移送する。移送量は２０ｍｌ、活性化容器１４Ｙと洗浄容器１３Ｙとを接続する配管の内径は１．０ｍｍ、配管長さは４６０ｍｍとする。配管９２Ｙへの供給圧が－２０ｋＰａ以上－１ｋＰａ以下のとき、６０秒以下の時間で全量移送できる。配管９２Ｙへの供給圧が－１ｋＰａ超０ｋＰａ未満のとき、圧力が弱すぎて移送できず、液残りがある。配管９２Ｙへの供給圧が－２０ｋＰａ未満のとき、圧力が高すぎて移送先の容器内で液体が勢いよく噴出してしまい、細胞へのダメージが懸念される。

移送箇所Ｐ４では、洗浄容器１３Ｙから廃液容器１６Ｙに不要な液体成分を移送する。移送量は３０ｍｌ、洗浄容器１３Ｙと廃液容器１６Ｙとを接続する配管の内径は３．２ｍｍ、配管長さは９５５ｍｍとする。配管９２Ｙへの供給圧が－４ｋＰａ以上－２ｋＰａ以下のとき、１５秒以下の時間で全量移送できる。配管９２Ｙへの供給圧が－２ｋＰａ超０ｋＰａ未満のとき、圧力が弱すぎて移送できず、液残りがある。配管９２Ｙへの供給圧が－４ｋＰａ未満のとき、圧力が高すぎて移送先の容器内で液体が勢いよく噴出する。

移送箇所Ｐ５では、原料容器２３Ｙから活性化容器１４Ｙに培養液を移送する。移送量は７０ｍｌ、原料容器２３Ｙと活性化容器１４Ｙとを接続する配管の内径は１．０ｍｍ、配管長さは５２５ｍｍとする。配管９１Ｙへの供給圧が１０ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下のとき、１２０秒以下の時間で全量移送できる。配管９１Ｙへの供給圧が０ｋＰａ超１０ｋＰａ未満のとき、圧力が弱すぎて移送できず、液残りがある。配管９１Ｙへの供給圧が２０ｋＰａ超のとき、圧力が高すぎて移送先の容器内で液体が勢いよく噴出してしまい、細胞へのダメージが懸念される。

移送箇所Ｐ６では、活性化容器１４Ｙから廃液容器１６Ｙに不要な液体成分を移送する。移送量は７０ｍｌ、活性化容器１４Ｙと廃液容器１６Ｙとを接続する配管の内径は３．２ｍｍ、配管長さは６２５ｍｍとする。配管９２Ｙへの供給圧が－５ｋＰａ以上－２．５ｋＰａ以下のとき、２５秒以下の時間で全量移送できる。配管９２Ｙへの供給圧が－２．５ｋＰａ超０ｋＰａ未満のとき、圧力が弱すぎて移送できず、液残りがある。配管９２Ｙへの供給圧が－５ｋＰａ未満のとき、圧力が高すぎて移送先の容器内で液体が勢いよく噴出する。

移送箇所Ｐ７では、洗浄容器１３Ｙからシート化容器１５Ｙに細胞懸濁液を移送する。移送量は０．８ｍｌ、洗浄容器１３Ｙとシート化容器１５Ｙとを接続する配管の内径は１．０ｍｍ、配管長さは６８０ｍｍとする。配管９２Ｙへの供給圧が－２０ｋＰａ以上－１０ｋＰａ以下のとき、１１秒以下の時間で全量移送できる。配管９２Ｙへの供給圧が－１０ｋＰａ超０ｋＰａ未満のとき、圧力が弱すぎて移送できず、液残りがある。配管９２Ｙへの供給圧が－２０ｋＰａ未満のとき、圧力が高すぎて移送先の容器内で液体が勢いよく噴出してしまい、細胞へのダメージが懸念される。

移送箇所Ｐ８では、原料容器２６Ｙからシート化容器１５Ｙに培養液を移送する。移送量は０．５ｍｌ、原料容器２６Ｙとシート化容器１５Ｙとを接続する配管の内径は１．０ｍｍ、配管長さは４８０ｍｍとする。配管９１Ｙへの供給圧が３ｋＰａ以上５ｋＰａ以下のとき、５秒以下の時間で全量移送できる。配管９１Ｙへの供給圧が０ｋＰａ超３ｋＰａ未満のとき、圧力が弱すぎて移送できず、液残りがある。配管９１Ｙへの供給圧が５ｋＰａ超のとき、圧力が高すぎて移送先の容器内で液体が勢いよく噴出してしまい、細胞へのダメージが懸念される。

上記のように、移送箇所Ｐ１～Ｐ８の結果から、配管９１Ｙ及び配管９２Ｙへの供給圧を適切に制御することで、選択した容器間での液体の移送が所定の時間内で全量移送できることが確認される。

上記の実施形態及び各実施例において、本発明の趣旨を変更しない範囲で以下のように種々の改変が可能である。

上記の実施形態及び各実施例は、適宜組み合わせ可能であり、また、発明の主旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。例えば、洗浄容器と活性化容器は一体となっていてもよく、別体であってもよく、さらに無菌閉鎖系回路に含まれるように構成されていてもよく、含まれないように構成されていてもよい。また、例えば、各原料容器は、一回の細胞シート作成に適した量を収容する大きさとなっており、さらに１つのパッケージにまとめられて設けられ、ディスポーザブルで使用毎に新規なものに交換する形態とされていてもよい。

１ 細胞シート作製装置
１０ 恒温槽
１１ 遠心分離機
１２ 振とう装置
１３ 洗浄容器
１４ 活性化容器
１５ シート化容器
１６ 廃液容器
１８ 検査部
１９ 空気供給部
２０ 原料保管庫
２１，２２，２３，２４，２５，２６ 原料容器
３０ 解凍装置
３１ 凍結細胞保存容器
４０ 局所加温機構
５０ 制御部
５１ 表示部
６１，６２，６３，６３ａ，６３ｂ，６４，６５，６５ａ，６６，６６ａ，ｂ，６７，６８，６９，７０，７１，７２ 配管
７３ 給気管
８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７ 無菌コネクタ
１００ 細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路

Claims (15)

1. 細胞シートを作製するための細胞付着用平面基材を含むシート化液槽が設けられたシート化容器と、
   前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に細胞を懸濁してなる細胞懸濁液を注入するための第１配管と、
   前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に培地交換用の培養液を注入するための第２配管と、
   前記シート化容器に接続され、前記シート化容器の内部の不要な液体成分を排出する第３配管と、
   を備えた細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路が装着され、
   前記シート化容器に接続され、前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部を備え、
   前記濃縮部において前記細胞懸濁液の濃度を濃縮し、濃縮された前記細胞懸濁液を前記第１配管より前記シート化容器に注入して前記細胞を前記細胞付着用平面基材上に３，０００個／ｍｍ^２以上の細胞播種密度で播種し、前記第３配管からの前記不要な液体成分の排出と、前記第２配管からの前記培地交換用の培養液の注入とを行い、前記細胞付着用平面基材上に細胞シートを作製する、
   細胞シート作製装置。
2. 前記細胞シート作製装置と前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路との脱着が、工具なしで可能に構成されている、
   請求項１に記載の細胞シート作製装置。
3. 前記シート化容器を水平面に対する前後方向と左右方向のどちらかまたは両方向に対して５～４５度の角度で０．１～１秒／回の間隔で傾ける傾け部と、前記シート化容器に加速度１．０～３０Ｇ、１～５回／秒の衝撃を与える叩き部と、を有する振とう装置をさらに有する、
   請求項１に記載の細胞シート作製装置。
4. 前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路は、前記細胞懸濁液を構成する前記細胞を洗浄する洗浄容器及び前記細胞を活性化する活性化容器をさらに有する、
   請求項１に記載の細胞シート作製装置。
5. 前記細胞懸濁液を構成する前記細胞を得るために凍結細胞を解凍する解凍装置をさらに有する、
   請求項１に記載の細胞シート作製装置。
6. 前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路に供給される培養液が収容される容器を保管する原料保管庫と、前記第２配管の少なくとも一部を加温する局所加温機構と、前記シート化容器を所定の温度に保温する恒温槽との少なくとも１つあるいは全部をさらに有する、
   請求項１に記載の細胞シート作製装置。
7. 前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路は、前記細胞懸濁液を構成する前記細胞を洗浄する洗浄容器及び前記細胞を活性化する活性化容器をさらに有し、前記恒温槽は、前記洗浄容器、及び前記活性化容器を前記所定の温度に保温する、
   請求項６に記載の細胞シート作製装置。
8. 前記シート化容器に注入される前記細胞懸濁液の細胞密度を検査する検査部をさらに有する、
   請求項１に記載の細胞シート作製装置。
9. 前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路に供給される培養液が収容される容器と、前記第２配管とが、無菌コネクタにより接続されている、
   請求項１に記載の細胞シート作製装置。
10. 細胞シートを作製するための細胞付着用平面基材を含むシート化液槽が設けられたシート化容器と、
    前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に細胞を懸濁してなる細胞懸濁液を注入するための第１配管と、
    前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に培地交換用の培養液を注入するための第２配管と、
    前記シート化容器に接続され、前記シート化容器の内部の不要な液体成分を排出する第３配管と、
    を備えた細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路が装着され、
    前記シート化容器に接続され、前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部と、
    前記第１配管、前記第２配管、及び前記第３配管を含む前記シート化容器に接続する配管に設けられた複数個の切替え弁と、
    前記切替え弁の切替えを制御するとともに、無菌フィルターを介して前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路の内部の圧力を調整し、前記圧力の差により前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路の内部の液体を移送する送液機構と、
    を備え、
    前記濃縮部において前記細胞懸濁液の濃度を濃縮し、濃縮された前記細胞懸濁液を前記第１配管より前記シート化容器に注入して前記細胞を前記細胞付着用平面基材上に３，０００個／ｍｍ^２以上の細胞播種密度で播種し、前記第３配管からの前記不要な液体成分の排出と、前記第２配管からの前記培地交換用の培養液の注入とを行い、前記細胞付着用平面基材上に細胞シートを作製する、
    細胞シート作製装置。
11. 細胞シートを作製するための細胞付着用平面基材を含むシート化液槽が設けられたシート化容器と、
    前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に細胞を懸濁してなる細胞懸濁液を注入するための第１配管と、
    前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に培地交換用の培養液を注入するための第２配管と、
    前記シート化容器に接続され、前記シート化容器の内部の不要な液体成分を排出する第３配管と、
    を備え、
    前記シート化容器に前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部が接続され、
    前記濃縮部において前記細胞懸濁液の濃度が濃縮され、濃縮された前記細胞懸濁液が前記第１配管より前記シート化容器に注入されて前記細胞が前記細胞付着用平面基材上に３，０００個／ｍｍ^２以上の細胞播種密度で播種され、前記第３配管からの前記不要な液体成分の排出と、前記第２配管からの前記培地交換用の培養液の注入とが行われ、前記細胞付着用平面基材上に細胞シートが作製される、
    細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路。
12. 細胞シート作製装置と前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路との脱着が、工具なしで可能に構成されている、
    請求項１１に記載の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路。
13. 前記細胞懸濁液を構成する前記細胞を洗浄する洗浄容器及び前記細胞を活性化する活性化容器をさらに有する、
    請求項１１に記載の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路。
14. 前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路に供給される培養液が収容される容器と、前記第２配管とが、無菌コネクタにより接続される、
    請求項１１に記載の細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路。
15. 細胞シート作製装置に装着されて細胞シートが作製される細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路であって、
    細胞シートを作製するための細胞付着用平面基材を含むシート化液槽が設けられたシート化容器と、
    前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に細胞を懸濁してなる細胞懸濁液を注入するための第１配管と、
    前記シート化容器に接続され、前記シート化容器に培地交換用の培養液を注入するための第２配管と、
    前記シート化容器に接続され、前記シート化容器の内部の不要な液体成分を排出する第３配管と、
    を備え、
    前記シート化容器に前記細胞懸濁液を濃縮する濃縮部が接続され、
    前記第１配管、前記第２配管、及び前記第３配管を含む前記シート化容器に接続する配管に複数個の切替え弁が設けられ、
    前記切替え弁の切替えを制御するとともに、無菌フィルターを介して前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路の内部の圧力を調整し、前記圧力の差により前記細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路の内部の液体を移送する送液機構が備えられ、
    前記濃縮部において前記細胞懸濁液の濃度が濃縮され、濃縮された前記細胞懸濁液が前記第１配管より前記シート化容器に注入されて前記細胞が前記細胞付着用平面基材上に３，０００個／ｍｍ^２以上の細胞播種密度で播種され、前記第３配管からの前記不要な液体成分の排出と、前記第２配管からの前記培地交換用の培養液の注入とが行われ、前記細胞付着用平面基材上に細胞シートが作製される、
    細胞シート作製装置用無菌閉鎖系回路。

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