JP6279597B2 - 細胞培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養する細胞培養装置と送液装置に関するものである。

自分の細胞もしくは他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療では、生体から採取した細胞を、しばしば培養して細胞数を増やす、あるいはしかるべき形に組織を形成させて移植治療に用いられる。治療に用いる細胞の培養は、細胞プロセシングセンタ（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に準拠して行わなければならない。ここでの課題は、細胞培養は技術者の手によって行われるために、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという点と、手動で操作することによる生物学的汚染リスクがあるという点である。

これらの課題を解決する手段として、閉鎖系で細胞培養工程を自動化する装置が開発されてきた。これは、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器と、送液系統と送気系統すべてで菌体、ウィルスの進入を防いだ密閉状態の元で行われることで、細胞培養工程の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成されるものである。

他方、細胞には、増殖させる過程においてフィーダー細胞という栄養細胞から産生される成長因子を必要とする細胞種と必要としない細胞種がある。再生医療において注目されている、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ）細胞やｉＰＳ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ）細胞、および皮膚上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞といった細胞種は、しばしばフィーダー細胞が必要である。培養した細胞を治療に用いる場合、フィーダー細胞と治療に用いられる細胞は分離された状態で培養することが望ましく、２層の培養層を有する細胞培養容器にて細胞培養することが望ましい。この課題を解決する手段としては、特許文献１に示すような培養装置が提案されている。ここでは２層の培養層を有する細胞培養容器を用い、細胞や培地を供給または排出する流路を備えることで、ＥＳ細胞などの細胞種を閉鎖系で自動培養することが可能である。
また、増殖過程においてフィーダー細胞を必要としない細胞種の自動培養を実現する装置として、特許文献２に示すような培養装置が提案されている。ここでは幹細胞を主とした細胞を１層の培養層で培養する自動培養装置が開示されている。

特開２０１１-１０５９９号公報 特開２００７-２２２１２０号公報

特許文献１記載の細胞培養容器は、培地保持部が２層構造となっていて、それぞれに送液管と廃液管を備えて液体移動がなされ、ガス透過膜と物質透過膜で構成されることにより、所定の湿度、ガス組成で培養される。一方で特許文献２記載の自動培養装置においては、培養容器は気密に維持されており、換気（ガス交換）の工程は送液に利用したチューブを利用して、培養容器に送気している。

外面にガス透過膜を設けない培養容器において２層培養を考えた時、特許文献２記載の方法に準じれば、第１の容器と第２の容器のそれぞれに送液用配管と排出用配管を設け、さらに換気とガス交換専用の配管が一つ設けられた構成が考えられる。培養容器の内部の気相は繋がっているから換気用配管は共通として一つで良い。このように５本の配管を準備して培養容器を構成することは当該業社にとっては容易である。

しかしながら、送液の制御部分と培養容器との接続距離が長くなるほど、配管の本数は少ないほうが部品コストとして削減できるため有利である。加えて培養容器を複数備えて並列処理が出来ることが自動化の目的であり、配管の本数を少なくすることは培養容器の複数化を実現するうえでも重要となる。

本発明者らはさらに検討を進めた結果、第１の容器に送液を実施するときは、第２の容器の送液管が換気用の配管として利用でき、逆に第２の容器の送液時には、第１の容器の送液管が換気用の配管として利用できることを見出した。即ち第１の容器と第２の容器のそれぞれに送液用配管と排出用配管を設け、最小数として４本の配管を設ければよい。

しかしながら、このような構成を採用した場合、後で説明するように、液体培地を送液した送液管には、容器まで到達しなかった液体培地が残留し、その後の気相の移動により液体培地は排出管に移動して、設置されたフィルタに到達し、フィルタの目詰まりを発生させる可能性があり、フィルタが目詰まりすれば、フィルタが圧力抵抗、または圧力損失となって排気管や培養容器の内圧が変化し、液体やガスの流れが不安定化するという課題がある。また、導通するガスに含まれる水蒸気がフィルタに到達し、フィルタ目詰まりを発生させ、その結果、上記と同様の現象が発生するという課題がある。

本発明の目的は、上記の課題を解決し、配管の本数を多くすることなく培養容器の複数化を実現し、培養容器の内圧を常圧に保つことが出来る細胞培養装置を提供することにある。

本発明においては、上記課題を解決するために、細胞培養装置であって、培養容器と、液体またはガスを培養容器内に供給する第一の供給口と、培養容器内のガスを排出する第一の排出口と、第一の排出口から排出されたガスを大気圧の外気へ排出するための流路と、
流路上に設けられたフィルタと、流路上の第一の排出口とフィルタとの間に、排出されたガスの水分を捕集する捕集部と、を備える構成の細胞培養装置を提供する。

本発明の細胞培養装置によれば、培養容器の内圧を常圧に保つことができる。

実施例１の細胞培養装置の構成例を示す図である。 細胞培養装置の送液装置の構成において送液時の状態を説明する図である。 細胞培養装置の送液装置の構成において排出時の状態を説明する図である。 細胞培養装置の送液装置の構成においてガス換気時の状態を説明する図である。 実施例１の細胞培養装置の送液装置の送液時の状態を示す図である。 実施例１の細胞培養装置の送液装置のガス換気時の状態を示す図である。 実施例１の細胞培養装置の自動培養装置の制御フローを示す図である。 実施例１の細胞培養装置の制御フローチャートを示す図である。 実施例２の細胞培養装置の液体を移動して貯留する状態を説明する図である。

以下、本発明の実施の形態を説明するが、それに先立ち細胞培養装置において、配管の本数を多くすることなく培養容器の複数化を実現することを検討した際に明らかとなった課題を、図２−図４を用いて説明する。

図２は細胞培養装置において、２層培養を行う培養容器への送液と排出手段の概略図である。同図において、恒温槽３２内に、第１容器２、第２容器３から構成される、２層培養を実施可能な培養容器１を設置する。そして、第１容器へ液体培地を添加する送液管４と、第１容器から液体培地を排出するときの排出管５を設置し、容器側の開口端は、容器の底面近傍に設ける。同様に第２容器３に関しても、送液管６、排出管７が設けられる。第１容器２へ液体培地を添加する送液管４は、第１ポンプ８と液体開閉弁１６を介して、第１容器２へ送液すべき液体培地を保持する液体ボトル９に接続される。第２容器３へ液体培地を添加する送液管６は、第２ポンプ１０を介して、第２容器３へ送液すべき液体培地を保持する液体ボトル９に接続される。このうち送液管６は第２ポンプ１０と培養容器１の管の途中で２分岐され、排気管１３として、排気開閉弁１４および大気連通フィルタ１５を介して大気に開放されている。

第１容器２から液体培地を排出する排出管５は、第３ポンプ１１を介して、図示しない回収ボトルに排液される。また第２容器３から液体培地を排出する排出管７は、第４ポンプ１２を介して、図示しない回収ボトルに排液される。

２層培養を行う培養容器への送液時には、液体開閉弁１６と排気開閉弁１４を開放して第１ポンプ８を作動すれば、液体ボトル９より、破線と矢印の向きに従って液体は移動開始し、送液管４を通過して、培養容器１における第１容器２内へ液体は到達する。培養容器１において、排出用の第３ポンプ１１および第４ポンプ１２の非稼働時は弁のように閉止されていて、排出側は気密に維持されている。このとき培養容器の気相は、送液管６を通過して破線と矢印の向きに従って連通しており、開放されている排気開閉弁１４を介して、大気に連通している。よって送液に伴う容器内の圧力は大気圧に維持される。即ち本来は送液用である第２の容器の送液管が換気用の配管として利用できるので、換気用の専用の配管は不要とでき、配管の本数を少なくすることができる。

続いて、図３により、図２の構成において、２層培養を行う培養容器からの排出時の方法を示す。排出時には排気開閉弁１４を開放して第３ポンプ１１を作動すれば、培養容器１における第１容器より、破線と矢印の向きに従って液体は移動開始し、排出管５を通過して、図示しない回収ボトルに排液は到達する。培養容器１において送液用の第１ポンプ８および排出用の第４ポンプ１２の非稼働時は弁のように閉止されていて、気密に維持されている。よって、培養容器内の気相は大気の開放口より大気連通フィルタ１５、開放されている排気開閉弁１４を介して、破線と矢印の向きに従って送液管６が大気に連通しているので、送液に伴う容器内の圧力は大気圧に維持される。即ち本来は送液用である第２の容器の送液管が換気用の配管として利用できるので、排出時の換気用の専用の配管は不要となる。

次いで、図４により、図２、図３の構成において、２層培養を行う培養容器における換気方法を示す。ＣＯ_２とＯ_２含む混合ガスボンベ１７は、加湿ボトル１９に接続されている。細胞培養中の液体培地はｐＨ値が径時的に変化することを防止するため、定期的に前記のガスで液体培地の表面よりガス交換を行う必要がある。加えて液体培地の蒸発による液体培地成分の濃縮を防止する必要がある。ボンベ１７より導出したＣＯ_２ガスは加湿ボトル１９内の純水１８内を潜らせることにより、ガスは最適湿度に加湿され待機される。ガスは第１ガス開閉弁２０と第１ポンプ８をバイパスするガス管２１に設けられた第２ガス開閉弁２２を介して、送液管４を経由して培養容器１に到達するので、容器内のガス交換と湿度維持が可能となる。

２層培養を行う培養容器へのガス換気時には、排気開閉弁１４を開放し、次いで第２ガス開閉弁２２、第１ガス開閉弁２０を開放すれば、加湿ボトル１８より、破線と矢印の向きに従って加湿されたガスは移動開始し、ガス管２１と送液管４を通過して、培養容器１における気相に到達する。培養容器１において、前述と同様に開放されている排気開閉弁１４を介して、送液管６が大気に連通しているので、培養容器１内の気相はガスと置換されて大気に放出され、送気に伴う容器内は調圧された圧力に維持される。即ち本来は送液用である第２の容器の送液管４が換気用の送気配管として利用でき、また第１の容器の送液管６が換気用の排出配管として利用できるので、ガス換気時の換気用の専用の配管は不要といえる。

先に概説したように、以上の構成にあっては、液体培地を送液した送液管には、容器まで到達しなかった液体培地が残留し、その後の気相の移動により液体培地は排出管に移動して、大気連通フィルタに到達し、フィルタの目詰まりを発生させる可能性がある。フィルタが目詰まりすれば、フィルタが圧力抵抗、または圧力損失となって排気管や培養容器の内圧が変化し、液体やガスの流れが不安定化する。

一例として培養容器の内圧が大気圧より高くなった場合は、排出管５および排出管７は液体培地に接しているから、液体培地は排出管に侵入して本来は容器１あるいは容器２上で保持すべき液体培地が減量することとなる。内圧が大気圧より低くなった場合は、排出管５および排出管７は液体培地に接しているから、排出管内の気相が小気泡となって液体培地に残留する。本来、容器１あるいは容器２に保持した液体培地および細胞には気泡が無いことが望ましい。さらに大気連通フィルタが閉塞した状態で送液が継続すれば、容器まで到達しなかった液体培地は排出管内に蓄積を始め、管自体が閉塞して圧力抵抗となって、培養容器への所定量の送液量の再現性が維持できなくなる。

更に、導通するガスに含まれる水蒸気が大気連通フィルタに到達し、フィルタ目詰まりを発生させる場合がある。その結果生じる現象は上記と同様である。

本発明は、以上説明した課題を解決可能とするものであり、添付図面を参照して、その実施例について詳述する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。

図５を参照しながら、細胞培養装置の第１の実施例を説明する。図５は、図２で説明した２層培養を行う培養容器への送液と排出手段の概略図に対し、水分等の液体を捕集する捕集部としてトラップボトルを設置した構成を示す図である。培養容器１への送液手段は上述した構成と同じであるので、培養容器１から廃棄開閉弁１４までの説明は省略する。トラップボトル２４はふた２８によって気密に保持され、ふたには容器側開口２６と大気側開口２７が貫通して設けられている。容器側開口２６は排気開閉弁１４を介して排気管１３に接続され、大気側開口２７は大気連通フィルタ２９を介して大気に開放されている。

２層培養を行う培養容器への送液時には、排気開閉弁１４を開放して第１ポンプ８を作動すれば、液体ボトルより破線と矢印の向きに従って液体は移動開始し、送液管４を通過して、培養容器１における第１容器２内へ液体は到達する。培養容器１において、排出用の第３ポンプ１１および第４ポンプ１２の非稼働時は弁のように閉止されていて、排出側は気密に維持されている。このとき培養容器の気相は、送液管６を通過して破線と矢印の向きに従って連通しており、開放されている排気開閉弁１４を介して、トラップボトル２４を通過して大気に連通している。よって送液に伴う容器内の圧力は大気圧に維持される。

次いで、液体培地を送液した送液管には、容器まで到達しなかった液体培地が残留し、その後の気相の移動により残留した液体培地は移動して、トラップボトル２４に到達する。送液管の内部を伝わって到達した液体は、容器側開口２６において凝集し、やがてボトル内底部に滴下する。気相はボトル内で連なった大気側開口２８を通過して、大気連通フィルタ２９に到達し大気に放出される。

次に、２層培養を行う培養容器１における換気方法を示す。ＣＯ_２とＯ_２含む混合ガスボンベ１７が、加湿ボトル１９に接続されている。ボンベ１７より導出したＣＯ_２ガスは加湿ボトル１９内の純水１８内を潜らせることにより、ガスは最適湿度に加湿され待機される。ガスは第１ガス開閉弁２０と第１ポンプ８をバイパスするガス管２１に設けられた第２ガス開閉弁２２を介して、送液管４を経由して培養容器１に到達する。

図６に示すように、２層培養を行う培養容器へのガス換気時には、排気開閉弁１４を開放し、次いで第２ガス開閉弁２２、第１ガス開閉弁２０を開放すれば、加湿ボトル１８より、破線と矢印の向きに従って加湿されたガスは移動開始し、ガス管２１と送液管４を通過して、培養容器１における気相に到達する。このとき培養容器の気相は、送液管６を通過して破線と矢印の向きに従って連通しており、開放されている排気開閉弁１４を介して、大気に連通している。よってガスの換気に伴う容器内の圧力は大気圧に維持される。

また導通するガスに含まれる水蒸気が、ガスの水分を捕集する捕集部として機能するトラップボトル２４を通過する際に、液相と気相に分離されるので、液相が大気連通フィルタ２９に到達することを防ぎ、フィルタ目詰まりを防止することができる。

トラップボトル２４の構成は、耐圧であって、環境温度によって変形しない素材がよい。また細胞培養における使用前滅菌が必要であり、これにはガラスやポリカーボネート樹脂等が好適である。トラップボトルを使用前に滅菌してあれば内部に培地を保持しても、目的外の菌増殖を防ぐことが可能であり、これに連なる流路の無菌状態を維持できる。理想的には、トラップボトルの使用後は流路と共に取り外して単回使用とすれば、洗浄滅菌の手間が省略できる。さらにトラップボトルが透明素材で有れば、内部の液体の貯留状態を確認できるので尚良い。

ふたに貫通して設けられた容器側開口２６と大気側開口２７は、それぞれの開口端の位置高さは、容器側開口２６を大気側開口２７より低い位置とする方が望ましい。それは移動してきた液体培地、または凝集した水蒸気の液滴は通常容器側開口２６より自然落下するので、大気側開口２７は容器側開口２６より上方にあれば、液滴は大気側開口２７に到達することを防止できる。

なお、以上説明した液体開閉弁１６などに使用する弁機構は、電磁弁が好適である。いわゆる電磁弁は電磁石の動作作用により開閉する部品にゴムチューブを挟み込む（接続の意）ことにより、電磁弁のＯＮＯＦＦによりゴムチューブを弾性変形させて管部を絞ったり、開放させたりする機構である。以下、弁なるものは電磁弁を意味する。以上説明したポンプには、一般のローラーポンプが好適である。いわゆるローラーポンプはモータ軸に取り付けたローラーにゴムチューブを巻きつけ（接続の意）て、モータ回転によってゴムチューブを弾性変形させて内部の気体や液体を送液する機構である。以下ポンプはローラーポンプを意味する。以上説明したフィルタは流路の外部から気体を取り込むまたは排出して、流路内部の気圧を調整するものであり、例えば０．２２μｍ以上の粒子、菌体、ウィルスを通さない品質のものを使用する。以下フィルタは同様のものを意味する。

＜自動細胞培養装置の構成＞
図１は、第１の実施例における水分等の液体の捕集部であるトラップボトルを備えた自動培養装置の構成を示す一例である。以下、細胞培養容器への液体培地の供給または排出する送液制御手段を備えた自動細胞培養装置３１の実施例の構成、動作を説明する。恒温槽３２は、細胞培養に最適な培養温度で以下詳述する細胞培養容器を保持する。冷蔵庫３３は、冷温保持する必要があるものを保持する。コントローラ３０は、以上の機械要素、および以下の機械要素を、プログラムされたシーケンスに沿って制御する。なお、図１において、培養容器５５、５７が図５、６の培養容器１に、トラップボトル１０５がトラップボトル２４に、第１ポンプ４８、第２ポンプ７２、第３ポンプ８２、第４ポンプ８９が第１ポンプ８、第２ポンプ１０、第３ポンプ１１、第４ポンプ１２に対応する。

第１の細胞懸濁液を保持する第１細胞ボトル３４は、ふたにより内部を気密に保持できる液体ボトルである。第１細胞ボトル３４は、ふたに設けた気圧調整のための管路３５を備え、その開口端に設けられたフィルタ３６により恒温槽３２内に開放される。また、ふたに設けられた供給管３７の一端は、第１細胞ボトル３４の内部に開口端を持ち、細胞懸濁液に接して液体排出口となる。供給管３７は分岐点３８を介して２分岐され、一方は第１気体導入弁３９に接続され、もう一方の供給管３７は第１細胞開閉弁４０に接続される。分岐点３８は第１細胞ボトル３４に保持される液体の液面より上方に設けられる。供給管３７の開口端にフィルタ４１が設けられ、恒温槽３２内に開放している。

分岐点３８で分岐された供給管３７は第１細胞開閉弁４０で２分岐されて、一方は共通管４２に接続され、もう一方は第１ガス開閉弁４３へと通じる２分岐に接続される。なお、共通管４２については後述する。第１ガス開閉弁４３には加湿ボトル４４が接続され、加湿ボトル４４にはフィルタ４５が接続され、さらに圧力制御弁４６を介してＣＯ_２とＯ_２含む混合ガスボンベ４７が接続されている。細胞培養中の液体培地はｐＨ値が径時的に変化することを防止するため、定期的にＣＯ_２ガスで液体培地の表面よりガス交換を行う必要がある。加えて液体培地の蒸発による液体培地成分の濃縮を防止する必要がある。ボンベ４７より導出したＣＯ_２ガスは加湿ボトルにおいて最適湿度に加湿され待機される。

第１ガス開閉弁４３へと通じる２分岐のもう一方の供給管３７は、第１ポンプ４８における吸引口と第２ガス開閉弁４９に２分岐される。第１ポンプ４８における吐出口と第２ガス開閉弁４９は統合されて送液管５０となる。即ち第２ガス開閉弁４９は、第１ポンプ４８のバイパスの役割である。ここで、ポンプの吸引口から細胞ボトルの間の送液用の管は供給管とし、ポンプの吐出口から細胞培養を行う培養容器の間の送液用の管は送液管とする。

送液管５０の２分岐された一端は、排気管１３と第１排気開閉弁５１を介して捕集部であるトラップボトル１０５が接続される。トラップボトル１０５はふた１０６によって気密に保持され、ふた１０６には容器側開口１０７と大気側開口１０８が貫通して設けられている。トラップボトル１０５自体は冷蔵庫３３の内部に保持し、大気側開口１０８は大気連通フィルタ５２を介して大気に開放されている。

更に、送液管５０は多分岐部５４で分岐され、第１培養容器５５用の第１容器開閉弁５６と、第２培養容器５７用の第１容器開閉弁５８に接続される。第１培養容器５５と第２培養容器５７の両者は同じ構成であり、図５、６の培養容器１に対応するので、以下、第１培養容器５５を用いて説明する。なお、本実施例の細胞培養装置で並置される培養容器は２個に限らず、３個以上であっても良いことは言うまでもない。

第１培養容器５５は、外観が本体部５９とふた部６０からなる気密な容器であり、内観は本体部５９の内底部に細胞を保持して培養可能な第２容器６１と、細胞を保持して培養可能な第１容器６２を保持できる。第１培養容器５５は、第１容器６２の培養面は物質透過膜からなり、第２容器６１で培養する栄養細胞から産生される成長因子のみを透過して、第１容器で培養する細胞の成育を促進させる培養方法、いわゆる共培養を実施する培養容器である。ふた部６０には４つの貫通するポート、すなわち第１容器６２に液体を添加する第１ポート６３、第１容器６２の底面近傍に接し液体を排出する第２ポート６４、第２容器６１に液体を添加する第３ポート６５、第２容器６１の底面近傍に接し液体を排出する第４ポート６６が配置される。後で詳述するように、本実施例において、この第１ポート６３、第３ポート６５はそれぞれ第１容器６２、第２容器６１に液体またはガスを供給する第１の供給口として機能する。更に、この第１ポート６３、第３ポート６５は培養容器５５内のガスを排出する第１の排出口としても機能する。

送液管５０は、第１容器開閉弁５６を介して第１ポート６３に接続されており、第１細胞ボトル３４の細胞懸濁液は、第１ポンプ４８の作用によって、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第１容器６２に送液される。

また、第２の細胞ボトル６７は、第２の細胞懸濁液を保持する液体ボトルである。ふた、気圧調整のための管路、フィルタおよび供給管６８は、第１細胞ボトル３４と同じであり説明は省略する。同様に、供給管６８と分岐点６９、第２気体導入弁７０、フィルタ、第２細胞開閉弁７１の接続構成も同様である。

第２細胞開閉弁７１を介して供給管６８は２分岐されて、一方は共通管４２に接続され、もう一方は第２ポンプ７２における吸引口に接続される。第２ポンプ７２の吐出口より延長する送液管７３は２分岐され、一方は排気管１３と第２排気開閉弁７４を介して前記したトラップボトル１０５が接続される。

次いで送液管７３は多分岐部７６で分岐され、第１培養容器５５用の第２容器開閉弁７７と、第２培養容器５７用の第２容器開閉弁７８に接続される。第２容器開閉弁７７は第２容器６１に液体を添加する第３ポート６５に接続される。即ち第２細胞ボトル６７の細胞懸濁液は第２ポンプ７２の作用によって、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第２容器６１に送液される配管の構成である。

本実施例の培地ボトル９５は交換用の液体培地を保持する液体ボトルとして機能するものであり、冷蔵庫３３内に保持される。ふた、気圧調整のための管路、フィルタおよび供給管９６は、第１細胞ボトル３４と同様のものである。同様に、供給管９６と分岐点９７、第３気体導入弁９８およびフィルタの接続構成も同様である。また、第５ポンプ９９の吸引口は供給管９６と接続されている。更に、培地予熱ボトル１００は交換用の液体培地を必要量だけ保持する液体ボトルであり、第５ポンプ９９の吐出口と、分岐を介して、供給管１０１によって接続される。培地予熱ボトル１００は恒温槽３２の内部に保持される。即ち培地ボトル９５の液体培地は第５ポンプ９９の作用によって、培地予熱ボトル１００に送液される配管の構成である。

細胞予熱ボトル１００のふた、気圧調整のための管路、フィルタおよび供給管１０１は、第１細胞ボトル３４と同じであり説明は省略する。同様に、供給管１０１と分岐点１０２、第４気体導入弁１０３、フィルタ、培地開閉弁１０４の接続構成も同様である。供給管１０１は培地開閉弁１０４を介して共通管４２に接続されて分岐され、一方は第１細胞ボトル３４から延長する供給管３７と第１細胞開閉弁４０を介して接続され、もう一方は第２細胞ボトル６７から延長する供給管６８と第２細胞開閉弁７１を介して接続される。

即ち、共通管４２は第１細胞開閉弁４０と第２細胞開閉弁７１と培地開閉弁１０４の３つの開閉弁に接続されている。第１ポンプ４８が作用するとき、第１細胞開閉弁４０だけが開放されていれば、第１細胞ボトル３４の液体を、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第１容器６２に送液し、第２ポンプが作用するとき、第２細胞開閉弁７１だけが開放されていれば、第２細胞ボトル６７の液体を、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第２容器６１に送液し、第１ポンプ４８が作用するとき、培地開閉弁１０４だけが開放されていれば、培地予熱ボトル１００に保持された液体培地を、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第１容器６２に送液し、第２ポンプが作用するとき培地開閉弁１０４だけが開放されていれば、培地予熱ボトル１００に保持された液体培地を、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第２容器６１に送液する配管の構成である。

次に、第１培養容器５５または第２培養容器５７より、保持されている液体を排出する構成を説明する。第１排液ボトル７９には、排液管８０が気密に接続されている。排液管８０は第１排出弁８１を介して第３ポンプ８２の吐出口に接続されている。第３ポンプ８２の吸引口には多分岐部８３によって分岐され、第１培養容器５５用の第１容器排出弁８４と、第２培養容器５７用の第１容器排出弁８５に接続される。第１容器排出弁８４は第１培養容器５５における第２ポート６４に接続される。即ち第１排液ボトル７９は第３ポンプ８２の作用によって、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第１容器６２より液体が排出される配管の構成である。

一方、第２排液ボトル８６には、排液管８７が気密に接続されている。排液管８７は第２排出弁８８を介して第４ポンプ８９の吐出口に接続されている。第４ポンプ８９の吸引口には多分岐部９０によって分岐され、第１培養容器５５用の第２容器排出弁９１と、第２培養容器５７用の第２容器排出弁９２に接続される。第２容器排出弁９１は第１培養容器５５における第４ポート６６に接続される。即ち第２排液ボトル８６は第４ポンプ８９の作用によって、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第２容器となる本体部５９より液体が排出される配管の構成である。

＜細胞培養の操作、観察操作＞
図７は、コントローラ３０で制御される、本実施例の細胞培養装置３１における細胞培養、観察の全体的な操作のフローチャートを示している。まず、培養容器の第１容器６２に細胞播種（第１細胞添加）を行い（Ｓ０１）、第２容器６１に細胞播種（第２細胞添加）を行う（Ｓ０２）。複数の細胞培養を行うときは、上記の操作を繰り返す。さらに、細胞培養容器にＣＯ_２ガスを充填したのち（Ｓ０３）、培養・静置し（Ｓ０４）、図示を省略した顕微鏡による観察を行い（Ｓ０５）、液体培地の交換を開始するかの判定を行う（Ｓ０６）。

液体培地の交換に当たっては、培地予熱ボトルへの送液（Ｓ０７）の後、第１容器培地排出（Ｓ０８）、第１容器培地添加（Ｓ０９）、第２容器培地排出（Ｓ１０）、第２容器培地添加（Ｓ１１）を行い、さらに、細胞培養容器にＣＯ_２ガスを充填したのち（Ｓ１２）、複数の細胞培養を行うときは、上記の操作を繰り返す。次いで培養・静置し（Ｓ１３）、顕微鏡による観察を行い（Ｓ１４）、細胞培養が終了したか否かの判定を行う（Ｓ１５）。細胞培養が終了したら、培養した細胞の取り出しを行う（Ｓ１６）。

図８は、コントローラ３０で制御される、本実施例の細胞培養装置３１の第１培養容器５５における送液・送気のタイムチャートを表している。横軸は図７のステップＳ０１〜Ｓ０４、Ｓ０７〜Ｓ１１に対応した操作項目と時間軸を示し、縦方向には図１に示した第１気体導入弁３９〜培地開閉弁１０４の１７台の電磁弁、および第１ポンプ４８〜第５ポンプ９９の５台のローラーポンプの動作タイミングを示している。初期状態では全ての弁がＯＦＦであるので閉止であり、全てのポンプがＯＦＦであるので、送液停止の状態である。

最初に細胞培養容器５５内の第１容器６２に細胞播種を行うとき（図７のＳ０１）は、第１細胞添加の動作に従う。初期状態から第１細胞開閉弁４０と、第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第２排気開閉弁７４をＯＮとし、これらの弁を開放すると、第１細胞ボトル３４から第１細胞開閉弁４０と第１容器開閉弁５６が通じて、第１ポート６３までの流路が通じる。また外気に連通する大気連通フィルタ５２から第２排気開閉弁７４と第２容器開閉弁７７が通じて、外気と接続されたフィルタから第３ポート６５までの管路が通じる。

次いで第１ポンプ４８を所定時間の間ＯＮすると、第１細胞ボトル３４から細胞懸濁液の送液が開始される。ポンプを作動させる所定時間は、第１容器の保持すべき目的の送液量に第１細胞ボトル３４から分岐点３８までの管の内体積を合わせた液量を予め求め、ポンプの流量仕様から計算して求めることが出来る。所定時間の後第１ポンプ４８の送液が停止し、第１気体導入弁３９を開放すると、分岐点３８から第１細胞ボトル３４までの液体は、落差によってボトルに引き戻される結果、供給管３７内に後端が分岐点３８で先端が送液の開始点となる定量された細胞液懸濁液が作成される。

続いて第１ポンプ４８を稼働すると、フィルタ４１より清浄化した空気が順次供給され、第１容器開閉弁５６を通じて細胞培養容器５５の第１ポート６３より、細胞液懸濁液が送液される。このとき第３ポート６５は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。すなわち、ステップＳ０１において、第１ポート６３と第３ポート６５はそれぞれ、第１の供給口、第１の排出口として機能する。所定量の注入が為された後、第１ポンプ４８を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。このように本送液手段では送液の終了時点で、管路の内部に液体を保持しておらず、培地が乾燥や変質して管路を閉塞することを防いでいる。

細胞培養容器が複数ある時は、予め第１細胞ボトル３４には複数の細胞培養容器に分配できる量の細胞懸濁液を保持し、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図１における第１容器開閉弁５８を開放し、第２容器開閉弁７７を閉止して、図１における第２容器開閉弁７８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７の第１容器６２に細胞液懸濁液が同量送液される。

次いで、細胞培養容器５５内の第２容器６１に細胞播種を行うとき（図７のＳ０２）は、第２細胞添加の動作に従う。初期状態から第２細胞開閉弁７１と、第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第１排気開閉弁５１をＯＮとし、これらの弁を開放すると、第２細胞ボトル６７から第２細胞開閉弁７１と第２容器開閉弁７７が通じて、第３ポート６５までの流路が通じる。また外気に連通する大気連通フィルタ５２から第１排気開閉弁５１と第１容器開閉弁５６が通じて、外気と接続されたフィルタから第１ポート６３までの管路が通じる。

次いで第２ポンプ７２を所定時間ＯＮすると、第２細胞ボトル６７から細胞懸濁液の送液が開始される。ポンプを作動させる所定時間は、第２容器の保持すべき目的の送液量に第２細胞ボトル６７から分岐点６９までの管の内体積を合わせた液量を予め求め、ポンプの流量仕様から計算して求めることが出来る。所定時間の後第２ポンプ７２の送液が停止し、第２気体導入弁７０を開放すると、供給管６８内に後端が分岐点６９で先端が送液の開始点となる定量された細胞液懸濁液が作成される。

続いて第２ポンプ７２を稼働すると、フィルタより清浄化した空気が順次供給され、第２容器開閉弁７７を通じて細胞培養容器５５の第３ポート６５より、細胞液懸濁液が送液される。このとき第１ポート６３は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。すなわち、ステップＳ０２において、第１ポート６３は第１の排出口として機能し、一方、第３ポート６５は、第１の供給口として機能する。所定量の注入が為された後、第２ポンプ７２を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。

このとき、第１ポート６３から第１排気開閉弁５１まで通じた管路では、第１細胞添加の動作後の状態であるので、内部に若干の液体培地の残留液と気相が混じりあってトラップボトル１０５へと移動する。送液管の内部を伝わって到達した液体は、容器側開口１０７において凝集し、やがてトラップボトル内底部に滴下する。気相はボトル内で連なった大気側開口１０８を通過して、大気連通フィルタ５２に到達し大気に放出される。

細胞培養容器が複数ある時は、予め第２細胞ボトル６７には複数の細胞培養容器に分配できる量の細胞懸濁液を保持し、上記の操作において第２容器開閉弁７７を閉止して、図１における第２容器開閉弁７８を開放し、第１容器開閉弁５６を閉止して、図１における第２容器開閉弁５８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７の第２容器６１に細胞液懸濁液が同量送液される。

次に細胞培養容器５５の内部をＣＯ_２ガスで満たすとき（Ｓ０３）は、ＣＯ_２ガス充填の操作に従う。初期状態から第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第２ガス開閉弁４９と第２排気開閉弁７４をＯＮとして各弁を開放すると、第１ガス開閉弁４３と第１容器開閉弁５６が通じて第１ポート６３までの流路が通じる。また大気連通フィルタ５２からトラップボトル１０５と第２排気開閉弁７４と第１容器開閉弁７７が通じて、第３ポート６５までの流路が通じる。次いで第１ガス開閉弁４３を所定時間ＯＮすると、ボンベ４７より加湿ボトル４４を通じて、第１容器開閉弁５６から第１ポート６３を経て細胞培養容器５５に最適に加湿されたＣＯ_２ガスが到達する。

細胞培養容器５５は密閉されているが、第３ポート６５から外気に通じる大気連通フィルタ５２までが開放されているので、細胞容器の内部の圧力は外気圧と調整された圧となる。また加湿されたＣＯ_２ガスはトラップボトル１０５において、液相と気相に分離されるので、液相が大気連通フィルタ２９に到達することを防ぎ、フィルタ目詰まりを防止することができる。所定量のＣＯ_２ガスの注入が為された後、まず第１ガス開閉弁４３を閉止し、次いで第２ガス開閉弁４９を閉止し、培養容器内の圧力が大気圧と同等となった時、他の弁を閉止する。このように加圧されたガスの流れを停止制御するときは、ガスの流れの上流に相応する弁より順番に時間差を与えて閉止する方法によれば、細胞容器の内圧を大気圧に近い値に制御することが出来るので望ましい。

細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において第２容器開閉弁７７を閉止して、図５における第２容器開閉弁７８を開放し、第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第２容器開閉弁５８を開放して上記動作を行えば、細胞培養容器５７にＣＯ_２ガスが充填される。

細胞培養は、第１細胞懸濁液が第１容器６２に保持され、第２細胞懸濁液が第２容器６１に保持され、細胞培養容器５５の内部空間が最適に加湿されたＣＯ_２ガスで保持され、細胞培養容器５５が最適な培養温度に保持されているので、所定時間静置して保持することによって細胞培養が継続される（Ｓ０４）。なお、細胞懸濁液の細胞は第１容器６２の物質透過膜の上部、あるいは第２容器６１の内底面に接着して増殖するので、培養に伴い成分変化した液体培地は細胞と分離して排出できる。

細胞培養中の細胞観察（Ｓ０５）は、培養静置の操作中に図示しない顕微観察ユニットを用いて実施する。顕微観察には位相差顕微鏡が好適であるが、倒立型などの光学顕微鏡であってもよい。撮像機能があればより培養中の細胞観察経過を記録でき細胞培養をより好適に実施できる。

次に、細胞培養容器より液体培地の交換を行うとき（Ｓ０６）は、図７の動作タイムチャートにおける、培地予熱の送液と第１容器培地排出と第１容器培地培地添加、第２容器培地排出、第２容器培地添加の操作に従う。

液体培地を予熱するための培地予熱の送液を行うとき（Ｓ０７）は、初期状態において第５ポンプ９９を介して培地ボトルから培地予熱ボトル１００は通じている。培地予熱ボトル１００はふたから外気に通じるフィルタが接続されている。よって第５ポンプ９９を目的量および分岐点９７から培地ボトル９５における供給管９６の体積を加えた総送液量に相応するポンプ稼働時間を与えて送液を開始する。所定時間経過後、第３気体導入弁９８を開放すると、分岐点９７より下流の液体培地は培地ボトル９５に戻り、供給管９６内に後端が分岐点９７、先端が培地予熱ボトル１００となる定量された液体培地が作成される。続いて第５ポンプ９９の送液を開始すると、培地予熱ボトル１００内に液体培地が送液される。このとき培地予熱ボトル１００は外気に通じているので、培地予熱ボトル１００の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の注入が為された後、第５ポンプ９９を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。予熱に要する時間は４℃で５０ｍＬの液量のものは約１時間で恒温槽内の温度から低い温度まで上昇する。

細胞培養容器が複数ある時は、予め培地予熱ボトル１００には複数の細胞培養容器に分配できる量の液体培地を保持するように、ポンプの送液量を調整する。また、細胞培養における培地の交換回数が複数予定されているときは、細胞培養容器が複数あるときに必要な液体培地量に培地の交換回数を掛け合わせた液体培地を送液できる量の液体培地を培地ボトルに保持しておけば、複数の細胞培養容器に、複数の培地の交換が可能である。

細胞培養容器５５内の第１容器６２より培地排出を行うとき（Ｓ０８）は、図７の動作タイムチャートにおける第１容器培地排出動作に従う。初期状態から第１容器開閉弁５６と第１排気開閉弁５１をＯＮと、第１容器排出弁８４と第１排出弁８１とこれらの弁を開放すると、外気に連通する大気連通フィルタ５２からトラップボトル１０５と第１排気開閉弁５１と第１容器開閉弁５６が通じて、外気と接続されたフィルタから第１ポート６３までの管路が通じる。また第１排液ボトル７９から第１排出弁８１と第１容器排出弁８４が第３ポンプ８２を介して第２ポート６４までの流路が通じる。

次いで第３ポンプ８２を細胞培養容器５５の第１容器６２に保持された液体量を排出するための排出時間を与えて所定時間ＯＮすると、第１容器６２から液体培地を吸引し送液が開始され、第１排液ボトル７９に到達する。このとき第１ポート６３はトラップボトル１０５を介して外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の排出が為された後、第３ポンプ８２を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。

細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第１容器開閉弁５８を開放し、第１容器排出弁８４を閉止して、図５における第１容器排出弁８５を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７における第１容器６１より液体培地が排液される。

第１容器６２に液体培地の添加を行うとき（Ｓ０９）は、第１容器培地添加の動作に従う。初期状態から培地開閉弁１０４と、第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第２排気開閉弁７４をＯＮとし、これらの弁を開放すると、培地予熱ボトル１００から培地開閉弁１０４と第１容器開閉弁５６が通じて、第１ポート６３までの流路が通じる。また外気に連通する大気連通フィルタ５２から第２排気開閉弁７４と第２容器開閉弁７７が通じて、外気と接続されたフィルタから第３ポート６５までの管路が通じる。次いで第１ポンプ４８を所定時間の間ＯＮすると、予熱ボトル１００から液体培地の送液が開始される。ポンプを作動させる所定時間は、第１容器の保持すべき目的の送液量に予熱ボトル１００から分岐点１０２までの管の内体積を合わせた液量を予め求め、ポンプの流量仕様から計算して求めることが出来る。所定時間の後第１ポンプ４８の送液が停止し、第４気体導入弁１０３を開放すると、供給管１０１内に後端が分岐点１０２で先端が送液の開始点となる定量された液体培地が作成される。

続いて第１ポンプ４８を稼働すると、フィルタより清浄化した空気が順次供給され、第１容器開閉弁５６を通じて細胞培養容器５５の第１ポート６３より、液体培地が送液される。このとき第３ポート６５は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。すなわち、ステップＳ０９において、第１ポート６３と第３ポート６５はそれぞれ、第１の供給口、第１の排出口として機能する。所定量の注入が為された後、第１ポンプ４８を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。

細胞培養容器が複数ある時は、予め培地予熱ボトル１００には複数の細胞培養容器に分配できる量の液体培地を保持し、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図１における第１容器開閉弁５８を開放し、第２容器開閉弁７７を閉止して、図１における第２容器開閉弁７８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７における第１容器６２に液体培地が同量送液される。

細胞培養容器５５内の第２容器６１より培地排出を行うとき（Ｓ１０）は、図７の動作タイムチャートにおける第２容器培地排出動作に従う。初期状態から第１容器開閉弁５６と第１排気開閉弁５１をＯＮと、第２容器排出弁８８と第２排出弁９１とこれらの弁を開放すると、外気に連通する大気連通フィルタ５２から第１排気開閉弁５１と第１容器開閉弁５６が通じて、外気と接続されたフィルタから第１ポート６３までの管路が通じる。また第２排液ボトル８６から第２排出弁８８と第２容器排出弁９１が第４ポンプ８９を介して第３ポート６６までの流路が通じる。

次いで第４ポンプ８９を細胞培養容器５５の第２容器６１に保持された液体量を排出するための排出時間を与えて所定時間ＯＮすると、第２容器６１から液体培地を吸引し送液が開始され、第２排液ボトル８６に到達する。このとき第１ポート６３は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の排出が為された後、第４ポンプ８９を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。

細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図１における第１容器開閉弁５８を開放し、第２容器排出弁９１を閉止して、図１における第２容器排出弁９２を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７における第２容器６１より液体培地が排液される。

第２容器６１に液体培地の添加を行うとき（Ｓ１１）は、第２容器培地添加の動作に従う。初期状態から培地開閉弁１０４と、第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第１排気開閉弁５１をＯＮとし、これらの弁を開放すると、培地予熱ボトル１００から培地開閉弁１０４と第２容器開閉弁７７が通じて、第３ポート６５までの流路が通じる。また外気に連通する大気連通フィルタ５２から第１排気開閉弁５１と第１容器開閉弁５６が通じて、外気と接続されたフィルタから第１ポート６３までの管路が通じる。

次いで第２ポンプ７２を所定時間ＯＮすると、予熱ボトル１００から液体培地の送液が開始される。ポンプを作動させる所定時間は、第２容器の保持すべき目的の送液量に予熱ボトル１００から分岐点１０２までの管の内体積を合わせた液量を予め求め、ポンプの流量仕様から計算して求めることが出来る。所定時間の後第２ポンプ７２の送液が停止し、第４気体導入弁１０３を開放すると、供給管１０２内に後端が分岐点１０２で先端が送液の開始点となる定量された液体培地が作成される。続いて第２ポンプ７２を稼働すると、フィルタより清浄化した空気が順次供給され、第２容器開閉弁７７を通じて細胞培養容器５５の第３ポート６５より、液体培地が送液される。このとき第１ポート６３は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。すなわち、ステップＳ１１において、第１ポート６３は第１の排出口として機能し、一方、第３ポート６５は、第１の供給口として機能している。所定量の注入が為された後、第２ポンプ７２を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。

細胞培養容器が複数ある時は、予め培地予熱ボトル１００には複数の細胞培養容器に分配できる量の液体培地を保持し、上記の操作において第２容器開閉弁７７を閉止して、図１における第２容器開閉弁７８を開放し、第１容器開閉弁５６を閉止して、図１における第１容器開閉弁５８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７における第２容器６２に液体培地が同量送液される。次いで、細胞培養容器５５には大気が満たされているので、ＣＯ_２ガスで満たすために、ＣＯ_２ガス充填の操作（Ｓ１２）を上記と同様に行う。

細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図１における第１容器開閉弁５８を開放し、第２容器開閉弁７７を閉止して、図１における第２容器開閉弁７８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７にＣＯ_２ガスが充填される。

以下に第１の実施例の細胞培養装置を用いた、角膜上皮細胞培養による角膜上皮組織作製方法の具体例、およびその結果について説明する。

＜細胞培養装置および送液装置の構成＞
図１に示した細胞培養容器のうち本体部５９、ふた部６０、第１ポート６３〜第４ポート６６はポリカーボネートを材料として射出成形により作製した。第１容器には、セルカルチャインサート（６ウェル）型番 ３５３０９０，ＢＤ社を使用し、物質透過膜９に温度応答性高分子モノマーであるＮ-イソプロピルアクリルアミドを電子線重合させることで、温度応答性培養表面を作製した。第２容器には３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ、型番４３０１６５、コーニング社を使用した。

恒温槽には恒温培養器（東洋製作所社、型番ＴＶＨＡ６０ＷＡ１２Ａ）を使用し、庫内温度を３７°Ｃで運用し、冷蔵部には電子冷熱低温恒温器（東洋製作所社、型番ＴＨＳ０３０ＰＡ）を使用し、庫内温度を４°Ｃで運用した。

電磁弁にはピンチバルブ（流体圧力０．１５ ＭＰａ，高砂電気工業社，型番ＰＳＫ−１６１５ＮＣ−９）を使用した。本電磁弁に対応する供給管にはシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ，外径１／８インチ サンゴバン社，型番３３５０）を使用した。各ポンプにはチューブポンプ（吐出/吸入圧力 ＋／−０．１ＭＰａ, ウェルコ社，型番ＤＳＷ２−Ｓ１ＡＡ−ＷＰ）としごき用チューブとしてシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ，外径１／８インチ サンゴバン社，型番３３５５Ｌ）を組み合わせて使用した。本品はローラー部が本体のモータ部から着脱可能であるので、１３ｃｍ長のシリコンゴムチューブをローラー部に巻きつけた状態で滅菌操作が可能である。本ポンプの流量は、ＤＣ１２Ｖ入力において、実測より０．１５ｍＬ/秒であった。

細胞ボトルおよび培地予熱ボトルにはクローズドシステム 遠沈管（容量５０ｍＬ、コーニング社，型番＃１１７０５）を使用した。本品は予め滅菌された、容器部とふた部と、ふた部に設けられた気圧調整のための管路とフィルタから成る。培地ボトルにはクローズドシステム三角フラスコ（容量１Ｌ、コーニング社，型番＃１１４４０）を採用した。本品は予め滅菌された、供給管（内径１／８インチ）、容器部とふた部と、ふた部に設けられた気圧調整のための管路とフィルタから成る。

排液ボトルにはＦｌｅｘｂｏｙバッグ（容量１Ｌ，ザルトリウス社，型番＃ＦＦＢ１０３５４７）を使用した。加湿ボトルには，ガス洗浄瓶（容量５００ ｍＬ，アズワン社，型番６−１２９−０２）と、ガス交換部にはケラミフィルタ（フィルタサイズ１５×１５ｍｍ，アズワン社，型番２−５５４−１０）を組み合わせて使用した。

気体導入弁あるいは加湿ボトルの外気に接するフィルタにはミディザルト２０００（メッシュサイズ０．２２μｍ、ザルトリウス社，型番＃１７８０５−Ｅ）を使用した。

電磁弁およびポンプ部以外のチューブには塩化ビニル製であるタイゴンＳ−５０−ＨＬ（内径１／１６インチ，外径１／８インチ、サンゴバン社，型番６３０１０−３９０）を使用した。チューブの分岐、および接合部にはＳＭＣカップリング（ＣＰＣ社）シリーズを使用した。詳細には２分岐接合にＹ Ｆｉｔｔｉｎｇ（接合径１／１６インチ、型番＃ＨＹ２９１）、直線連結にはＳｔｒａｉｇｈｔ Ｆｉｔｔｉｎｇ（接合径１／１６インチ、型番＃ＨＳ２９１）を使用した。

本実施例における送液装置の構成については、細胞培養容器における容器１への細胞懸濁液の送液工程より説明する。第１細胞ボトル３４には１０ｃｍ長の供給管（内径３．７ｍｍ）が設けられており、この供給管と分岐点３８の間は、２０ｃｍ長のシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ、１．５８ｍｍとする。以下同じ）で接続した。分岐点３８と第１ポンプ４８の吸引口までは１５ｃｍ長のシリコンゴムチューブで接続し、第１ポンプ４８内のしごき用チューブは１３ｃｍ長のシリコンゴムチューブで接続した。第１ポンプ４８の吐出口より多分岐部５４までは８０ｃｍ長のタイゴンＳ−５０−ＨＬチューブで接続し、多分岐部５４より、第１ポート６３までは１．５ｍ長のタイゴンＳ−５０−ＨＬチューブで接続した。トラップボトルには、透明ポリカーボネート製の強化ボトル（２５０ｍＬ容量、ナルジェヌンク社）およびコネクタ付きスクリューキャップの組み合わせを使用した。

上記の細胞懸濁液１．５ｍＬの送液量は以下のように定めた。供給管と分岐点３８の間の管内体積は気体導入時に、液体ボトルに戻る最大液量である。これは実測から求めた結果１.０８８ｍＬであった。この戻り量と送液量の合計量から求められるポンプ作動時間は１７．３秒であった。気体導入後に容器までの送液時間としてさらに６０秒を与え、実際に送液量を測定したところ、１．４８ｍＬ±０．０８ｍＬ（１０回繰返し偏差）であった。複数の細胞培養容器に対し、容器１と容器２に対し交互に送液実験をしたところ同等の再現性であった。このことは、本実施例に係る細胞培養装置およびトラップボトルによよって、液体培地を送液した送液管には、容器まで到達しなかった液体培地が残留し、その後の気相の移動により液体培地は送液管を移動してトラップボトルを通過する。このときトラップボトル内で液相と気相に分離されるので液相が大気連通フィルタに到達することを防ぎ、フィルタ目詰まりを防止して、培養容器の内圧を常圧に保つことが出来ることができたといえる。

なお、水分などの液体の捕集部としてのトラプボトルの構成において、気相から液相の分離効率を上げる手段には、前記したように、トラップボトル自体を冷蔵庫に保持することでここを通過する気体を低温化すれば凝縮反応を促進して液化を促すことが出来る。また、更にトラップボトルの内部に合成ゼオライト等の吸着剤を保持することによって、水分吸着作用を促進し利用することも可能である。

角膜上皮細胞を細胞懸濁液とし、第１細胞ボトル３４に保持し、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２×１０^４／ｃｍ^２となるように培地で懸濁して、第２細胞ボトル６７に保持し、交換用培地はＫＣＭ培地５００ｍＬを培地ボトル９５に保持し、冷蔵庫３３に設置した。

また、細胞培養装置３１内部を３７°Ｃに恒温保持し、細胞培養容器を１０個設置し自動培養操作を開始した。上層への送液量は１．５ｍＬ、下層への送液量は２.０ｍＬである。培地の送液量もこれと同様である。排出時は全量排出する目的から、上層からの排出量は３ｍＬ相当量、下層からの排出量は４ｍＬ相当量のポンプ稼働時間とした。ＣＯ_２ガスは湿度９５％Ｈに制御し、その送気量は送気流量０.１Ｌ／分であり、細胞培養容器の内容積２０ｃｍ^３より、過剰に注入することとし電磁弁開放時間を１分（１００ｍＬ）とした。以上の動作タイムチャートは図７の概要に従った。

培地の交換は、培養開始日より５日目、７日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目に各１回実施した。ＣＯ_２ガスの送気は１日に６回、４時間ごとに実施した。顕微鏡観察は５日目より、毎日１回、各細胞培養容器の第１細胞と第２細胞を各々１０エリア取得し、細胞育成状態の判断データとした。

培養１６日目において培地交換操作の後、細胞培養を終了し１０個の細胞培養容器を取り出した。安全キャビネット内に細胞培養容器を置き、室温（約２５°Ｃ）で３０分静置した。上記に従って第１容器を取り出し、その後、支持膜として、ドーナツ状にカットした親水性ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）を用いて、シート状の細胞を物質透過膜の表面より剥離回収した。その結果、本実施例の細胞培養装置で作製した角膜上皮組織は、１０個のシート状細胞とも同等の大きさ、厚みを有しており、安定した剥離回収が可能であった。育成過程の顕微鏡画像の比較においても、１０個の細胞の育成に有意差はなかった。

以上詳述した実施例１の細胞培養装置のトラップボトルを、培養過程で生じた余剰の液体を一時貯留したり、或いは管路を洗浄する目的で導通した液体を一時貯留する液体ボトル等として利用する構成を実施例２として説明する。

例えば、図１における培地交換の工程では、培地予熱ボトル１００には培地交換の１回分の液体培地を保持するように、培地ボトル９５から移動する送液量を調整している。通常、１回の培地交換の必要量は１培養期間中では一定量であるが、送液量のばらつきに備えて多めの移動量を培地予熱ボトル１００に保持する。ここで課題となるのは１回の培地交換工程が終了したとき、培地予熱ボトル１００には使われなかった液体培地が保持されているが、次回の培地交換において培地ボトル９５から液体培地を送液した時に２つの温度履歴の異なった液体培地が混合することとなる。また別の課題は、そのまま培地交換工程が進行すると、培地交換ごとに毎回温度履歴の異なった液体培地を使用していることとなり、細胞培養工程の再現性を保証できない。

通常の手操作による細胞培養では、少量小分けして予熱した培地は培地交換で使われなかったものは廃棄して、再度新規な小分けのボトルを準備して、次の培地交換に備えている。実施例２では通常の細胞培養の工程に準じて、培地予熱ボトルから使われなかった余分な液体培地を移動して空にすることで、培地交換の毎回の再現性を保証することが出来る。具体的には液体培地は送液ポンプによって細胞培養容器を通過せず、トラップボトルに一時的に貯留することによって、培地予熱ボトルを空にすることができる。

図９は、図５、６で示した実施例１の細胞培養装置と装置構成は同じであるが、液体ボトル９から直接的にトラップボトル２４への一時的な貯留する場合を示している。排気開閉弁１４を開放して他の弁は閉止して、第２ポンプ１０を作動すれば、液体ボトル９より破線と矢印の向きに従って液体は移動開始する。送液管６より先方は、培養容器１における送液管４を介して培養容器１に連なっているが、第１ポンプ８、排出用の第３ポンプ１１および第４ポンプ１２の非稼働時は弁のように閉止されていて、排出側は気密に維持されている。よって、液体ボトル９からの液体は培養容器を通過せずに、排気管１３と排気開閉弁１４を通過して、トラップボトル２４に到達する。液体ボトル９が空となる相当時間第２ポンプ１０を稼働した後、すべての弁を閉止する。

図１における自動培養装置３１の構成では、液体ボトルである培地予熱ボトル１００から直接的にトラップボトルへ１０５の一時的な貯留が可能であり、培地開閉弁１０４と第１排気開閉弁５１を開放して他の弁は閉止して、第１ポンプ４８を作動すれば、培地予熱ボトル１００より残余した液体培地は移動開始する。送液管５０より先方は、第１容器開閉弁５６と第１容器開閉弁５８は閉止されているので、液体培地は培養容器を通過せずに、容器側開口１０７と第１排気開閉弁５１を通過して、トラップボトル２４に対応するトラップボトル１０５に到達する。培地予熱ボトル１００が空となる相当時間第１ポンプ４８を稼働した後、すべての弁を閉止する。

図７における自動細胞培養の動作タイムチャートにおいて、上記の余分な液体培地の移動の工程は望ましくは培地交換の工程（Ｓ０８−Ｓ１１）が完了した後に実行した方がよい。その理由はその後のＣＯ_２ガスの交換作業において、送気されるガスによって排気管１３内に残留している液体培地を移動させ、排気管内を清浄に保持できる効果があるからである。

以上詳述したように、本発明に係る細胞培養装置によれば、液体培地を送液した送液管には、容器まで到達しなかった液体培地が残留し、その後の気相の移動により液体培地は送液管を移動してトラップボトルを通過し、このときトラップボトル内で液相と気相に分離されるので液相が大気連通フィルタに到達することを防ぎ、フィルタ目詰まりを防止して、培養容器の内圧を常圧に保つことが出来ることができる。

また送液管を導通するガスに含まれる水蒸気が、トラップボトルを通過する際に液相と気相に分離されるので、水蒸気が大気連通フィルタに到達することを防ぎ、フィルタ目詰まりを防止して、培養容器の内圧を常圧に保つことが出来ることができる。

また、トラップボトルは常温よりも低温保持すれば、液体交じりの気相から液体の凝集効率が上がるので、液相が大気連通フィルタに到達することを防ぎ、フィルタ目詰まりを防止して、培養容器の内圧を常圧に保つことが出来ることができる。

さらに、本発明の細胞培養装置のトラップボトルは装置内部に液体の一時的に貯留することに利用でき、装置の長時間に亘る継続的な運転を実現することに貢献する。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。例えば、液相と気相の分離効率を上げるため、水分などの液体の捕集部であるトラップボトルまでの途中経路を、例えば冷却管等を用いて冷却することも可能である。

１、５５、５７ 培養容器
２、６２ 第１容器
３、６１ 第２容器
４、６、５０、７３ 送液管
５、７ 排出管
８、４８ 第１ポンプ
９ 液体ボトル
１０、７２ 第２ポンプ
１１、８２ 第３ポンプ
１２、８９ 第４ポンプ
１３、５１、７４ 排気管
１４ 排気開閉弁
１５、２９、５２ 大気連通フィルタ
１６ 液体開閉弁
１７、４７ ガスボンベ
１８ 純水
１９、４４ 加湿ボトル
２０、４３ 第１ガス開閉弁
２１ ガス管
２２、４９ 第２ガス開閉弁
２４、１０５ トラップボトル
２６、１０７ 容器側開口
２７、１０８ 大気側開口
２８、１０６ ふた
３０ コントローラ
３１ 細胞培養装置
３２ 恒温槽
３３ 冷蔵庫
３４、６７ 細胞ボトル
３５ 気圧調整管路
３６、４５ フィルタ
３７、６８、９６、１０１ 供給管
３８、６９、９７、１０２ 分岐点
３９、７０、９８、１０３ 気体導入弁
４０、７１ 細胞開閉弁
４２ 共通管
４６ 圧力制御弁
５４、７６、８３、９０ 多分岐部
５６、５８ 第１容器開閉弁
５９ 本体部
６０ ふた部
６３ 第１ポート
６４ 第２ポート
６５ 第３ポート
６６ 第４ポート
７７、７８ 第２容器開閉弁
７９、８６ 排液ボトル
８０、８７ 排液管
８１ 第１排出弁
８４、８５ 第１容器排出弁
８８ 第２排出弁
９１、９２ 第２容器排出弁
９５ 培地ボトル
９９ 第５ポンプ
１００ 培地予熱ボトル
１０４ 培地開閉弁

Claims (11)

1. 細胞培養装置であって、
   細胞の接着培養を行う培養容器と、
   液体またはガスを前記培養容器内に供給する第一の供給口と、
   前記培養容器内の液体培地表面のガスを排出する第一の排出口と、
   前記第一の排出口から排出されたガスを大気圧の外気へ排出するための流路と、
   前記流路上に設けられたフィルタと、
   前記流路上の前記第一の排出口と前記フィルタとの間に、排出されたガスの水分を捕集する捕集部と、を備え、
   前記捕集部は、トラップボトルであり、
   前記第一の供給口に供給される前記液体を保持する液体ボトルを更に備え、
   前記トラップボトルは、前記培養容器を通過することなく、前記液体ボトルから供給される前記液体を貯留可能である
   ことを特徴とする細胞培養装置。
2. 請求項１記載の細胞培養装置であって、
   前記トラップボトルを低温保持する冷蔵部を、更に備える
   ことを特徴とする細胞培養装置。
3. 請求項１記載の細胞培養装置であって、
   前記トラップボトルは単回使用である
   ことを特徴とする細胞培養装置。
4. 請求項１記載の細胞培養装置であって、
   前記トラップボトルは透明である
   ことを特徴とする細胞培養装置。
5. 請求項１記載の細胞培養装置であって、
   前記トラップボトルは、大気側開口と培養容器側開口とが貫通して設けられたふたを備え、前記大気側開口の位置高さは、前記培養容器側開口の位置高さより高い
   ことを特徴とする細胞培養装置。
6. 細胞培養装置であって、
   細胞の接着培養を行う培養容器と、
   液体またはガスを前記培養容器内に供給する第一の供給口と、
   前記培養容器内の液体培地表面のガスを排出する第一の排出口と、
   前記第一の排出口から排出されたガスを大気圧の外気へ排出するための流路と、
   前記流路上に設けられたフィルタと、
   前記流路上の前記第一の排出口と前記フィルタとの間に、排出されたガスの水分を捕集する捕集部と、を備え、
   前記培養容器は、２層培養を行う、それぞれ一対のポートを備えた第１容器と第２容器とから構成され、
   前記第１容器と前記第２容器の何れか一方の前記一対のポートの一方が、当該容器に液体またはガスを供給する前記第一の供給口として機能する場合、
   前記第１容器と第２容器の他方の前記一対のポートの一方が、前記培養容器内の液体培地表面のガスを排出する前記第一の排出口として機能し、
   前記捕集部は、トラップボトルであり、
   前記第一の供給口に供給される前記液体を保持する液体ボトルを更に備え、
   前記トラップボトルは、前記培養容器を通過することなく、前記液体ボトルから供給される前記液体を貯留可能である
   ことを特徴とする細胞培養装置。
7. 請求項６記載の細胞培養装置であって、
   前記トラップボトルは、その内部に吸着剤を保持する
   ことを特徴とする細胞培養装置。
8. 請求項６記載の細胞培養装置であって、
   前記トラップボトルを低温保持する冷蔵部を、更に備える
   ことを特徴とする細胞培養装置。
9. 請求項６記載の細胞培養装置であって、
   前記トラップボトルは単回使用である
   ことを特徴とする細胞培養装置。
10. 請求項６記載の細胞培養装置であって、
    前記トラップボトルは透明である
    ことを特徴とする細胞培養装置。
11. 請求項６記載の細胞培養装置であって、
    前記トラップボトルは、大気側開口と培養容器側開口とが貫通して設けられたふたを備え、前記大気側開口の位置高さは、前記培養容器側開口の位置高さより高い
    ことを特徴とする細胞培養装置。

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