JP2023544410A - タンパク質を濃縮するための方法 - Google Patents
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Abstract
フェドバッチ設定を使用するバッチ様方式による限外濾過によって、大量の抗体供給原料を濃縮して濃縮原薬を生成するための最適化方法を本明細書において提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年10月5日申請の米国特許仮出願第63/087,719号の優先的利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
本出願は、2020年10月5日申請の米国特許仮出願第63/087,719号の優先的利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
開示の背景
抗体療法は、大きな患者利便性および患者コンプライアンスのために皮下形式による送達に移行しつつある。皮下送達を可能とするために、治療用タンパク質、例えば、抗体は、高用量で低容量の注射を介して送達しなければならず、これにより高濃度の最終製剤に製剤化することが必要となる。タンパク質製造プロセスでは、高濃度原薬生成の負荷は主に、限外濾過/透析濾過(UF/DF)工程にかかり、ここで、精製タンパク質供給流は典型的に、第1の限外濾過工程において中等濃度に濃縮され、バッファーを目的の製剤に交換して、第2の限外濾過工程において高い最終濃度に濃縮される。これにより、剪断および界面応力への長期曝露下で濃縮による溶液粘度ならびにタンパク質の凝集傾向が著しく上昇するため、特有の課題が提起される。粘度が高いとシステム圧力が高くなり、これによって、システム圧力に対する安全性に関連する制約のため、達成可能な最大タンパク質濃度が制限される。粘度の上昇は、透過液流動の著しい低下と相関する可能性を有し、この低下によりプロセス時間が長くなり、このためタンパク質凝集のリスクが増幅し得る。高濃度物質の生成により充填物質の容量が著しく減少し、これによって設備の適合性および収容能力の課題が提起されるだけでなく、剪断および界面応力への長期曝露に起因する凝集の課題も増幅し得る。
抗体療法は、大きな患者利便性および患者コンプライアンスのために皮下形式による送達に移行しつつある。皮下送達を可能とするために、治療用タンパク質、例えば、抗体は、高用量で低容量の注射を介して送達しなければならず、これにより高濃度の最終製剤に製剤化することが必要となる。タンパク質製造プロセスでは、高濃度原薬生成の負荷は主に、限外濾過/透析濾過(UF/DF)工程にかかり、ここで、精製タンパク質供給流は典型的に、第1の限外濾過工程において中等濃度に濃縮され、バッファーを目的の製剤に交換して、第2の限外濾過工程において高い最終濃度に濃縮される。これにより、剪断および界面応力への長期曝露下で濃縮による溶液粘度ならびにタンパク質の凝集傾向が著しく上昇するため、特有の課題が提起される。粘度が高いとシステム圧力が高くなり、これによって、システム圧力に対する安全性に関連する制約のため、達成可能な最大タンパク質濃度が制限される。粘度の上昇は、透過液流動の著しい低下と相関する可能性を有し、この低下によりプロセス時間が長くなり、このためタンパク質凝集のリスクが増幅し得る。高濃度物質の生成により充填物質の容量が著しく減少し、これによって設備の適合性および収容能力の課題が提起されるだけでなく、剪断および界面応力への長期曝露に起因する凝集の課題も増幅し得る。
高濃度原薬を生成するための改善方法の必要性が存在する。
開示の概要
本開示は、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(「保持液」)により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法であって、この供給タンクが、主要リザーバー(「保持液」)タンクから分離している、方法に関する。また、本開示は、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(「保持液」)により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法であって、この供給タンクが、主要リザーバー(「保持液」)タンクから分離している、方法に関する。一部の態様では、供給タンクは、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物をさらに含む。一部の態様では、初期タンパク質混合物および保持液を混合する。一部の態様では、タンパク質混合物および/または保持液をフィルターにより濾過する。一部の態様では、濾過したタンパク質混合物および保持液(「保持液」)を供給タンクに充填する。一部の態様では、充填を、目的のタンパク質が、少なくとも約1mg/mL、少なくとも約10mg/mL、少なくとも約20mg/mL、少なくとも約30mg/mL、少なくとも約40mg/mL、少なくとも約50mg/mL、少なくとも約60mg/mL、少なくとも約70mg/mLまたは少なくとも約80mg/mLに濃縮されるまで継続する。一部の態様では、充填を、目的のタンパク質が、約1mg/mL~80mg/mL、約5mg/mL~70mg/mL、約10mg/mL~60mg/mL、約10mg/mL~50mg/mL、約10mg/mL~40mg/mL、約10mg/mL~30mg/mL、約10mg/mL~20mg/mL、約20mg/mL~70mg/mL、約20mg/mL~60mg/mL、約20mg/mL~50mg/mL、約20mg/mL~40mg/mL、または約20mg/mL~30mg/mLに濃縮されるまで継続する。一部の態様では、保持液の充填を少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも20回、少なくとも30回、少なくとも40回、少なくとも50回、少なくとも60回、少なくとも70回、少なくとも80回、少なくとも90回、少なくとも100回、少なくとも110回、少なくとも120回、少なくとも130回、少なくとも140回、少なくとも150回、少なくとも160回、少なくとも170回、少なくとも180回、少なくとも190回、少なくとも200回、少なくとも210回、少なくとも220回、少なくとも230回、少なくとも240回、少なくとも250回、少なくとも260回、少なくとも270回、少なくとも280回、少なくとも290回、または少なくとも300回繰り返す。一部の態様では、方法は、供給タンクへの保持液の充填を停止することをさらに含む。一部の態様では、方法は、保持液をリザーバータンクに方向づけることをさらに含む。
本開示は、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(「保持液」)により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法であって、この供給タンクが、主要リザーバー(「保持液」)タンクから分離している、方法に関する。また、本開示は、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(「保持液」)により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法であって、この供給タンクが、主要リザーバー(「保持液」)タンクから分離している、方法に関する。一部の態様では、供給タンクは、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物をさらに含む。一部の態様では、初期タンパク質混合物および保持液を混合する。一部の態様では、タンパク質混合物および/または保持液をフィルターにより濾過する。一部の態様では、濾過したタンパク質混合物および保持液(「保持液」)を供給タンクに充填する。一部の態様では、充填を、目的のタンパク質が、少なくとも約1mg/mL、少なくとも約10mg/mL、少なくとも約20mg/mL、少なくとも約30mg/mL、少なくとも約40mg/mL、少なくとも約50mg/mL、少なくとも約60mg/mL、少なくとも約70mg/mLまたは少なくとも約80mg/mLに濃縮されるまで継続する。一部の態様では、充填を、目的のタンパク質が、約1mg/mL~80mg/mL、約5mg/mL~70mg/mL、約10mg/mL~60mg/mL、約10mg/mL~50mg/mL、約10mg/mL~40mg/mL、約10mg/mL~30mg/mL、約10mg/mL~20mg/mL、約20mg/mL~70mg/mL、約20mg/mL~60mg/mL、約20mg/mL~50mg/mL、約20mg/mL~40mg/mL、または約20mg/mL~30mg/mLに濃縮されるまで継続する。一部の態様では、保持液の充填を少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも20回、少なくとも30回、少なくとも40回、少なくとも50回、少なくとも60回、少なくとも70回、少なくとも80回、少なくとも90回、少なくとも100回、少なくとも110回、少なくとも120回、少なくとも130回、少なくとも140回、少なくとも150回、少なくとも160回、少なくとも170回、少なくとも180回、少なくとも190回、少なくとも200回、少なくとも210回、少なくとも220回、少なくとも230回、少なくとも240回、少なくとも250回、少なくとも260回、少なくとも270回、少なくとも280回、少なくとも290回、または少なくとも300回繰り返す。一部の態様では、方法は、供給タンクへの保持液の充填を停止することをさらに含む。一部の態様では、方法は、保持液をリザーバータンクに方向づけることをさらに含む。
また、本開示は、供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法に関する。また、本開示は、供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法に関する。一部の態様では、リザーバータンク弁は、目的のタンパク質が十分に濃縮されるまで閉じている。一部の態様では、方法は、タンパク質混合物を供給タンクに頻繁に加えることをさらに含む。一部の態様では、タンパク質混合物を供給タンクからリザーバータンクへ方向づける。一部の態様では、リザーバータンクをフィルターに接続する。一部の態様では、フィルターは、インライン濾過膜を含む。一部の態様では、インライン濾過膜は、限外濾過膜である。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド-ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである。一部の態様では、濾過膜は、約50kD~約5kD、約50kD、約40kD、約30kD、約20kD、約10kDまたは約5kD未満の分子量カットオフ(MWCO)を有する。一部の態様では、MWCOは、約5kD未満である。
一部の態様では、混合物を所望の濾過タンパク質濃度に達するまで流動させる。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約10mg/mL~約300mg/mL、例えば、約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約110mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL、約140mg/mL、約150mg/mL、約160mg/mL、約170mg/mL、約180mg/mL、約190mg/mL、約200mg/mL、約250mg/mL、または約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約150mg/mLである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約0cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約20cP~約60cPである。一部の態様では、供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比は、約1:2~約10:1、約1:2~約1:1、約1:1~約1:2、約1:1 約1:3、約1:1~約1:4、約1:1~約1:5、約1:1~約1:6、約1:1~約1:7、約1:1~約1:8、約1:1~約1:9、または約1:1~約1:10である。一部の態様では、供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比は、約1:1、約2:1または約5:1である。一部の態様では、タンパク質混合物をダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプを使用してリザーバータンクおよび/またはフィルターに方向づける。
一部の態様では、方法は、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(「保持液」)による供給タンクの持続的充填の前に、1回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物を供給タンクに充填することをさらに含む。一部の態様では、初期タンパク質混合物を約1mg/mL~約30mg/mLの濃度で供給タンクに加える。一部の態様では、初期タンパク質混合物を約5mg/mLの濃度で供給タンクに加える。
一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約1%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%または約50%削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約40%削減される。
一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約0.2時間、約0.4時間、約0.5時間、約0.6時間、約0.8時間または約1.0時間削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約0.5時間削減される。
一部の態様では、1~2μmの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約10%、約20%、約30%、約40%または約50%減少する。一部の態様では、5~10μmの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約10%、約20%、約30%、約40%または約50%減少する。一部の態様では、10~25μmの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約10%、約20%、約30%、約40%または約50%減少する。
一部の態様では、タンパク質混合物は、抗体、抗体断片、抗原結合断片、融合タンパク質、天然に存在するタンパク質、キメラタンパク質またはこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、タンパク質混合物は、IgM、IgA、IgE、IgDおよびIgGから選択される抗体を含む。一部の態様では、タンパク質混合物は抗体を含み、この抗体はIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選択されるIgG抗体である。一部の態様では、抗体は、二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む。一部の態様では、抗体は、三価抗体を含む。一部の態様では、抗体または抗体断片は、抗PD-1抗体、抗PD-Ll抗体、抗CTLA4抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗NKG2a抗体、抗ICOS抗体、抗CD137抗体、抗KIR抗体、抗TGFβ抗体、抗IL-10抗体、抗B7-H4抗体、抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗IL-8抗体またはこれらの抗体断片を含む。
一部の態様では、タンパク質混合物は、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞培養物に由来する。一部の態様では、哺乳動物細胞培養物は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞培養物である。
一部の態様では、タンパク質混合物は、バッチ細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物は、フェドバッチ細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物をバイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を使い捨てバイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物は、灌流細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物を灌流またはTFF灌流バイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を約1日間~約60日間存続する細胞培養物により生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を約25日間存続する細胞培養物により生成する。
一部の態様では、タンパク質混合物は、ローディングバッファーとともに供給タンクに加える。一部の態様では、ローディングバッファーは、アミノ酸、弱酸、弱塩基および/または糖を含む。
一部の態様では、方法は、タンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む。一部の態様では、タンパク質は、本明細書に開示の方法により調製する。一部の態様では、医薬組成物は、本明細書において調製したタンパク質を含む。
また、本開示は、本明細書に開示の医薬組成物を投与する方法に関する。また、本開示は、医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または症状を治療する方法に関する。
また、本開示は、
(a)供給タンク、
(b)第1の流体経路により供給タンクに接続するリザーバータンク、
(c)第2の流体経路によりリザーバータンクに接続する濾過膜、および
(d)第3の流体経路により濾過膜に接続し、第4の流体経路によりリザーバータンクに接続し、第5の流体経路により供給タンクに接続する、三方弁
を含む、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムであって、
リザーバータンクが、第1の流体経路を介して供給タンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領し、
濾過膜が、第2の流体経路を介してリザーバータンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領して、タンパク質混合物を濾過し、
三方弁が、第3の流体経路を介してフィルターから保持液を受領して、保持液を第4の流体経路を介してリザーバータンク、または第5の流体経路を介して供給タンクのいずれかに方向づける、システムに関する。
(a)供給タンク、
(b)第1の流体経路により供給タンクに接続するリザーバータンク、
(c)第2の流体経路によりリザーバータンクに接続する濾過膜、および
(d)第3の流体経路により濾過膜に接続し、第4の流体経路によりリザーバータンクに接続し、第5の流体経路により供給タンクに接続する、三方弁
を含む、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムであって、
リザーバータンクが、第1の流体経路を介して供給タンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領し、
濾過膜が、第2の流体経路を介してリザーバータンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領して、タンパク質混合物を濾過し、
三方弁が、第3の流体経路を介してフィルターから保持液を受領して、保持液を第4の流体経路を介してリザーバータンク、または第5の流体経路を介して供給タンクのいずれかに方向づける、システムに関する。
一部の態様では、三方弁は、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力未満である場合、保持液をリザーバータンクに方向づけ、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力よりも大きい場合、保持液を供給タンクに方向づける。
一部の態様では、システムは、システム内のタンパク質混合物の全容量および/または濃度を判定するように構成されたセンサーをさらに含み、ここで、三方弁は、センサーからのフィードバックに基づいて、保持液をリザーバータンクまたは供給タンクのいずれかに自動的に方向づける。一部の態様では、システムは、1つまたは複数のダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプをさらに含む。一部の態様では、フィルターは、インライン濾過膜を含む。一部の態様では、インライン濾過膜は、限外濾過膜である。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド-ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである。
開示の詳細な説明
本開示は、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法を対象とする。また、本開示は、目的のタンパク質を濃縮する方法に関する。
本開示は、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法を対象とする。また、本開示は、目的のタンパク質を濃縮する方法に関する。
I.定義
本開示をより容易に理解可能とするために、特定の用語を最初に定義する。本明細書において使用する場合、本明細書において他に明示的に提示するものを除いて、次の用語のそれぞれは、以下に記載の意味を有するものとする。さらなる定義は、本明細書を通じて記載する。
本開示をより容易に理解可能とするために、特定の用語を最初に定義する。本明細書において使用する場合、本明細書において他に明示的に提示するものを除いて、次の用語のそれぞれは、以下に記載の意味を有するものとする。さらなる定義は、本明細書を通じて記載する。
「a」または「an」の用語が、その実体の1つまたは複数を指すことに留意されたい。例えば、「ヌクレオチド配列」は、1つまたは複数のヌクレオチド配列を表すことが理解される。したがって、「a」(または「an」)、「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」の用語は、本明細書において互換的に使用することができる。
本明細書において使用する「および/または」の用語は、特定する2つの特徴または成分のそれぞれを、他方の有無にかかわらず詳細に開示することとして解釈すべきである。したがって、「および/または」の用語は、本明細書において「Aおよび/またはB」のような句により使用する場合、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(単独)および「B」(単独)を含むことを意図する。同様に、「および/または」の用語は、「A、Bおよび/またはC」のような句により使用する場合、次の態様:A、BおよびC;A、BまたはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(単独);B(単独);ならびにC(単独)のそれぞれを包含することを意図する。
本明細書において態様を「comprising(含む)」の言葉により記載する場合はいつでも、「consisting of(からなる)」および/または「consisting essentially of(から本質的になる)」の用語により記載する類似の態様をも提示することが理解される。
他に定義しない場合、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressによって、本開示において使用する多くの用語の一般的辞典が、当業者に提供される。
単位、接頭辞および記号は、これらの国際単位系(Systeme International de Unites、SI)により認められた形態において表す。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。本明細書において提示する見出しは、本開示の種々の態様の制限ではなく、本明細書を全体として参照することにより有し得る。したがって、直下に定義する用語は、本明細書をその全体において参照することにより、さらに十分に定義される。
選択肢(例えば、「または」)の使用は、選択肢のいずれか1つ、両方またはそれらの任意の組合せを意味することを理解すべきである。本明細書において使用する場合、「a」または「an」の不定冠詞は、列挙または数え上げた任意の成分の「1つまたは複数」を指すことを理解すべきである。
「約」または「から本質的になる」の用語は、当業者により決定される、特定の値または組成物の許容される誤差の範囲内の値または組成物を指し、これは部分的に、値または組成物の測定または決定方法、すなわち、測定システムの制限に依存する。例えば、「約」または「から本質的になる」は、当技術分野における実践1回あたり1以上の標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」または「から本質的になる」は、最大20%の範囲を意味し得る。その上、特に、生物学的システムまたはプロセスに関して、用語は、最大一桁または最大5倍の値を意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値または組成物が提示される場合、他に述べない限り、「約」または「から本質的になる」の意味は、この特定の値または組成物の許容される誤差の範囲内であると想定すべきである。
本明細書において記載する場合、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、他に指示しない限り、列挙する範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、これらの分率(例えば、整数の10分の1および100分の1)を含むことを理解すべきである。
「限外濾過」の用語は、例えば、溶液中の分子をサイズに基づいて分離する、膜に基づく分離プロセスを指し、これにより異分子の分離が達成されるか、または同分子の濃縮が達成され得る。
「接線流濾過」の用語は、溶質含有溶液が限外濾過膜を接線方向に通過し、加圧により低分子量の溶質に膜を通過させる、特定の濾過方法を指す。限外濾過膜を接線方向に通過する高分子量溶質含有溶液は、保持されるため、この溶液を本明細書において「保持液」と呼ぶ。限外濾過膜を通過する低分子量溶質は、本明細書において「透過液」と呼ぶ。したがって、保持液は、圧力下で限外濾過膜の表面を、例えば、接線方向に流れることにより濃縮される。限外濾過膜は、特定のカットオフ値による孔径を有する。一部の態様では、カットオフ値は、約50kDa以下、例えば、50kDa、40kDa、30kDa、20kDaまたは10Daである。一部の態様では、カットオフ値は、30kDa以下である。
「透析濾過」または「DF」の用語は、例えば、限外濾過膜を使用してタンパク質、ペプチド、核酸または他の生体分子を含む溶液または混合物からソルベント、バッファーおよび/または塩の濃度を除去、置換または低下させることを指す。
「フェドバッチ」、「フェドバッチ濾過」または「フェドバッチ濾過プロセス」の用語は、本明細書において使用する場合、目的のタンパク質を含む供給原料を供給タンクに充填し、その後、リザーバータンク内に方向づける、接線流濾過の濾過(例えば、限外濾過)方法を指し、ここで、供給原料は、TFFにおいて濃縮し、保持液は、保持液タンク内に戻るように方向づける。「バッチ」、「バッチ濾過」または「バッチ濾過プロセス」の用語は、タンパク質混合物をリザーバータンクに充填して、ここから保持液を生成し、この保持液をリザーバータンク内に戻るように方向づける一方、透過液を排液管に方向づけて廃棄する濾過(例えば、限外濾過)構成を指す。
本明細書において互換的に使用する「ポリペプチド」または「タンパク質」の用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖または分枝鎖状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により分断されていてもよい。また、この用語は、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または他の修飾操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾したアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、アミノ酸(例えば、非天然アミノ酸等を含む)の1つまたは複数の類似体を含むポリペプチドならびに当技術分野において公知の他の修飾も定義に含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」の用語は、本明細書において使用する場合、抗体およびFcドメイン含有ポリペプチド(例えば、イムノアドヘシン)を特に包含する。
本明細書において使用する場合、「目的のタンパク質」の用語は、精製することが望まれる混合物に存在する任意のタンパク質(天然または組換えのいずれか)を含むように使用する。このような目的のタンパク質は、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン(例えば、抗体)および/または融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。一部の態様では、目的のタンパク質は、本明細書に記載の接線流濾過(TFF)方法を使用して精製および/または濃縮可能な任意のタンパク質を指す。一部の態様では、目的のタンパク質は、抗体である。一部の態様では、目的のタンパク質は、組換えタンパク質である。
「フェドバッチ培養」または「フェドバッチ培養プロセス」の用語は、本明細書において使用する場合、培養プロセス開始後のある時点で、さらなる成分を培養物に提供する、細胞を培養する方法を指す。フェドバッチ培養は、基本培地を使用して開始することができる。培養プロセス開始後のある時点でさらなる成分を培養物に提供する培養培地は、フィード培地である。フェドバッチ培養は典型的に、ある時点で停止させ、培地中の細胞および/または成分を回収して適宜精製する。
本明細書において使用する場合、「灌流」または「灌流培養」または「灌流培養プロセス」は、細胞集団の中または上を通じた安定速度による生理学的栄養液の持続流を指す。灌流システムは、培養単位における細胞の保持を一般に含むため、灌流培養は、比較的高い細胞密度を特性的に有するが、培養条件の維持および調節が困難である。加えて、細胞が増殖して、培養単位において高密度で保持されるため、増殖率は典型的に、時間とともに持続的に低下し、これにより細胞増殖の対数期または静止期までもが遅くなる。この持続培養戦略は一般に、持続細胞培養システムの生成段階において目的のポリペプチドおよび/またはウイルスを発現する哺乳動物細胞、例えば、非足場依存性細胞の培養を含む。
本明細書において使用する場合、「設定点」は、他に指示しない限り、TFFシステムまたはタンパク質生成物の濃縮および/もしくは生成に使用する他の上流処理容器における条件の初期設定を指す。設定点は、本明細書に記載のUF/DFプロセスの開始時に確立する。TFFにおいてUF/DF条件が変動するため、設定点後のUF/DFにおける条件は、引き続いて変化し得る。例えば、設定点は、質量設定点であり得る。一部の態様では、設定点は、温度設定点である。一部の態様では、設定点は、細胞培養方法を通じて維持することができる。他の態様では、設定点は、異なる設定点を設定するまで維持することができる。他の態様では、設定点は、別の設定点に変えることができる。
「抗体」(Ab)は、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む、糖タンパク質免疫グロブリンを含むが、これらに限定されないものとする。各H鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてVHとして省略する)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つの定常ドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてVLとして省略する)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つの定常ドメイン、CLを含む。VHおよびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性領域にさらに細分され、これは、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存された領域が組み込まれ得る。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRを含み、これは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1成分(C1q)を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。重鎖は、C末端リジンを有しても有しなくてもよい。一部の態様では、抗体は、完全長抗体である。
免疫グロブリンは、IgA、分泌型IgA、IgG、IgD、IgEおよびIgMを含むが、これらに限定されない一般に公知のアイソタイプのいずれかに由来し得る。また、IgGサブクラスは、当業者に周知であり、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むが、これらに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる、抗体クラスまたはサブクラス(例えば、IgMまたはIgG1)を指す。「抗体」の用語は、例として、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、ヒトまたは非ヒト抗体、完全合成抗体ならびに一本鎖抗体を含む。非ヒト抗体は、組換え方法によりヒト化して、ヒトにおけるその免疫原性を低下させ得る。「抗体」の用語は、3つ以上の抗原に結合可能な多価抗体(例えば、三価抗体)を含み得る。三価抗体は、第3の非対称性Fabサイズ結合分子1つに可動性リンカーペプチドを介して融合する2つの左右対称のFabアームから構成されるIgG型二重特異性抗体である。この第3の分子は、IgG Fc領域に代わり、「ノブ」変異を有するCH3に融合する重鎖の可変領域、および適合する「ホール」を有するCH3に融合する軽鎖の可変領域からなる。ヒンジ領域は、第3の結合部位への抗原の接触を容易とするジスルフィド結合を含まない。明示的に述べない場合および文脈上他に指示しない限り、「抗体」の用語は、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体ならびに一本鎖抗体を含む。
抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」の用語は、本明細書において使用する場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により実施可能であることがわかっている。抗体の「抗原結合断片」の用語に包含される結合断片の例としては、(i)Fab断片(パパイン切断による断片)またはVL、VH、LCおよびCH1ドメインからなる類似の一価断片、(ii)F(ab’)2断片(ペプシン切断による断片)またはヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合する2つのFab断片を含む類似の二価断片、(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)、(vi)単離相補性決定領域(CDR)、ならびに(vii)合成リンカーにより適宜結合する2つ以上の単離CDRの組合せが挙げられる。その上、Fv断片の2つのドメイン、VLおよびVHは別々の遺伝子によりコードされるが、これらは、組換え方法を使用して、VLおよびVH領域が対となり一価分子を形成する単一のタンパク質鎖とすることが可能な合成リンカーにより結合させることができる(一本鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照)。また、このような一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」の用語に包含することを意図する。このような抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体として同一の方法により有用性についてスクリーニングする。抗原結合部分は、組換えDNA技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、種々の抗原に対する特異性を有する2つの抗原結合部位が生じる、2つの異なる重/軽鎖対を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab’断片の結合を含む多様な方法により生成することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990);Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照されたい。
「融合」または「キメラ」タンパク質は、本来、天然には結合しない第2のアミノ酸配列に結合する第1のアミノ酸配列を含む。別々のタンパク質に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにまとめることができるか、または同一タンパク質に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの新たな配列に配置することができ、例えば、IgFcドメインを有するこの開示の第VIII因子ドメインの融合が挙げられる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドの生成および翻訳によって生成する。キメラタンパク質は、共有、非ペプチド結合または非共有結合により第1のアミノ酸配列と関連する第2のアミノ酸配列をさらに含み得る。
「投与」は、当業者に公知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用する、対象への治療薬を含む組成物の物理的導入を指す。本明細書に開示の製剤の投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、または例えば、注射もしくは注入による他の非経口的投与経路を含む。「非経口的投与」の句は、本明細書において使用する場合、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、通常、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入ならびにインビボ(in vivo)でのエレクトロポレーションを含むが、これらに制限されない。一部の実施形態では、製剤は、非経口経路以外の経路を介して投与し、一部の実施形態では、経口経路を介して投与する。他の非経口経路以外の経路としては、局所、上皮または粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下または局所投与が挙げられる。また、投与は、例えば、1回、複数回および/または1期間もしくは複数期間の長期間にわたって実施することができる。
対象の「治療」または「療法」は、症候、合併症もしくは症状または疾患と関連する生物化学的指標の進行、発症、重症度または再発を回復、緩和、寛解、阻害、遅延させる目的で、対象に対して実施する任意の種類の介入もしくはプロセスまたは活性剤の投与を指す。固形腫瘍における奏効評価基準(RECIST)は、治療有効性の指標であり、治療の間に腫瘍が奏効、安定または増悪する場合を定義するように確立された規定である。RECIST1.1は、成人および小児のがん臨床試験における使用についての、腫瘍サイズにおける変化の客観的評価のための、固形腫瘍の測定および定義に対する現在のガイドラインである。米国東海岸癌臨床試験グループ(ECOG)パフォーマンスステータスは、患者を登録する医師らが一律に再現することができるように、試験において調査する患者集団を定義するために使用する番号付けの尺度である。小児患者では、Lanskyパフォーマンススケールが、子供における機能状態を説明するための方法である。これは、小児がん患者を対象に、療法に対する奏効および全身状態を評価するために導きだされ、内部的に検証されたものである。
本明細書に記載するように、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、他に指示しない限り、列挙する範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、これらの分率(例えば、整数の10分の1および100分の1)を含むことを理解すべきである。
「所望の最終タンパク質濃度」の用語は、本明細書において使用する場合、本明細書に記載の接線流濾過方法を使用して濃縮された目的のタンパク質のタンパク質濃度を指す。例えば、目的のタンパク質の所望の最終タンパク質濃度は、目的のタンパク質を含む混合物を、本明細書に記載のUF1、DFおよびUF2工程に供することにより達成する。一部の態様では、所望の最終タンパク質濃度は、最大300mg/mLである。
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、薬理学的に活性な薬剤の媒体を指す。担体により、薬剤の機能を遮ることなく、標的部位への活性剤の送達が容易となる。担体の適する形態の非限定的な例としては、溶液、クリーム、ゲル、ゲルエマルジョン、ゼリー、ペースト、ローション、塗布薬(salve)、スプレー、軟膏、粉末、固形混合物、エアロゾル、エマルジョン(例えば、油中水または水中油)、ゲル水溶液、水溶液、懸濁液、リニメント、チンキおよび局所投与に適するパッチが挙げられる。
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される組成物」(または「医薬組成物」)の句は、例えば、ヒトへの薬学的投与に許容される組成物を指す。このような組成物は、薬学的投与に許容されるレベルを越えないレベル(このようなレベルは、このような不純物が存在しない場合を含む)で不純物を有する物質を含むことができ、例えば、投与し易いようにこのような組成物を製剤化するために、薬学的に許容される賦形剤、媒体、担体および他の不活性成分を、任意の活性剤(複数可)に加えて含むことができる。例えば、薬学的に許容される抗PD1抗体組成物は、ヒトへの投与に許容されるレベルである限り、DNAを含むことができる。
II.限外濾過方法
本開示では、最終タンパク質収集物を高度に濃縮することが可能となるタンパク質精製方法を提供する。一部の態様では、本開示の方法により、供給原料が大量の減少し、初期容量が十分大きいためフェドバッチ方式での初期操作を必要とするタンパク質精製プロセスにおいて、第1の限外濾過工程(例えば、第1の限外濾過工程、透析濾過および第2の限外濾過工程を含むか、またはこれらからなるプロセスにおける)に必要とされるプロセス時間が削減される。
本開示では、最終タンパク質収集物を高度に濃縮することが可能となるタンパク質精製方法を提供する。一部の態様では、本開示の方法により、供給原料が大量の減少し、初期容量が十分大きいためフェドバッチ方式での初期操作を必要とするタンパク質精製プロセスにおいて、第1の限外濾過工程(例えば、第1の限外濾過工程、透析濾過および第2の限外濾過工程を含むか、またはこれらからなるプロセスにおける)に必要とされるプロセス時間が削減される。
一部の態様では、本開示の方法により、限外濾過による高濃度原薬(例えば、目的のタンパク質)の生成に関連する間接的課題が軽減される。例えば、高濃度物質(例えば、およそ150~300g/L)の生成により充填物質の容量が著しく減少し、これによって設備の適合性および収容能力の課題が提起されるだけでなく、剪断および界面応力への長期曝露に起因する凝集の課題も増幅し得る。限外濾過中に、試料容量は著しく減少するが(例えば、典型的には10分の1以下)、保持液容器およびシステム貯蔵容量は固定されて、プロセスにおいてシステム規模(例えば、保持液容器およびシステム貯蔵容量)と試料容量との間に大きな不適合が存在する時点が生じる。容器の下部を含むシステム流路が、濾過プロセスを通じて液体で満たされたままでいなければならないため、最終濃度の原薬(例えば、目的のタンパク質)容量は、保持液容器形状と相まって、システムの最小可動容量を決定づける。最小可動容量は容器サイズとともに増加するため、最終原薬によって保持液容器サイズの上限が設定される。この上限は、充填容量未満である。したがって、充填物質の一部は、フェドバッチ充填を使用して保持液容器に供給する必要を有する。フェドバッチ充填により供給しなければならない初期充填容量の百分率は、設備適合性、例えば、利用可能な容器サイズおよびシステム貯蔵容量の関数である。
フェドバッチ充填により大量の充填処理が可能となるが、この充填戦略は、バッチ操作と比較してプロセス時間のペナルティーを課す。バッチプロセスでは、試料の液体(バッファー)容量が、全タンパク質量(例えば、保持液容器中のすべて)中で均一に分配されるが、フェドバッチプロセスでは、充填容器(例えば、供給タンク)の希釈物質と保持液容器の濃縮タンパク質との間で分割されるため、所与の量の残存試料容量では、保持液タンパク質濃度は、バッチプロセスよりもフェドバッチプロセスの方が高い。結果として、フェドバッチ透過流動は、保持液濃度が高いために低くなる。したがって、システムでは、フェドバッチ方式の第1の限外濾過工程の大部分においてバッチ方式と比較して高濃度および低流動で操作するためプロセス時間が長くなり、次いで、これにより剪断および界面応力により誘導される凝集のリスクが増大する。
製造規模設定では、高濃度原薬を生成するための第1の限外濾過工程の操作方式は典型的に、完全バッチでもフェドバッチでもない。代わりに、限外濾過工程では、保持液容器への充填物質の供給においてフェドバッチ方式により操作し、次いで、充填物質が保持液容器に十分に含まれるとバッチ方式に切り換える。この混合方式による限外濾過工程は、以後「ハイブリッド」方式と呼ぶ。ハイブリッド方式では、第1の限外濾過工程のプロセス時間が、完全なバッチ方式またはフェドバッチ方式で操作する場合に予想されるプロセス時間以内となり、これは、システム操作がフェドバッチ方式からバッチ方式に切り換わる交差点に依存する。交差点およびハイブリッドプロセス時間を説明する式は、実施例1に記載する。次いで、交差点に対応する濃度は、相対的充填量およびシステム容量の関数であり、これによりプロセス時間が、設備適合性の強力な関数となる。
技術移行において相対的充填量およびシステム容量の差が考慮されていない場合、実験室規模で開発されたプロセスパラメーターの規格によって製造規模において予想外に長いプロセス時間が引き起こされ得るため、この依存性によってプロセス開発および技術移行の課題が生まれる。対照的に、バッチプロセスのプロセス時間は膜充填のみに依存するため、プロセスは、十分に拡張可能となる。
第1の限外濾過工程におけるハイブリッド操作方式により生じる、プロセス時間のペナルティーまたは設備適合依存性に取り組むための体系的手法は、開発されていない。このような課題を軽減するために、本明細書においてシュードバッチ操作方式と呼ぶ、フェドバッチ様設定を使用する限外濾過工程のバッチ様操作が可能となる、本明細書に開示の方法を開発した。
本開示では、フェドバッチ設定を使用するバッチ様方式による限外濾過によって、大量のタンパク質供給原料を濃縮して濃縮原薬を生成するための最適化方法を提供する。また、本開示は、高度に濃縮されたタンパク質を含む溶液を接線流濾過(TFF)により生成するための方法に関する。本明細書に開示の方法では、供給原量が大量の減少し、初期容量が十分大きいためフェドバッチ方式での初期操作を必要とするプロセスにおいて、第1の限外濾過工程(例えば、第1の限外濾過工程、透析濾過および第2の限外濾過工程を含むか、またはこれらからなるプロセスにおける)に必要とされるプロセス時間が削減される。一部の態様では、プロセス時間が短いために限外濾過工程において生成される粒子および不純物負荷によって定量する場合、方法により生成物の品質が向上する。一部の態様では、方法により、フェドバッチ方式により操作する場合、実験室、例えば、開発と製造との規模間の機器設定において観察されるプロセス時間の可変性が排除される。一部の態様では、規模間で生じるプロセス時間における一貫性の向上により、規模縮小限外濾過/透析濾過(UF/DF)モデルの正確性が向上する可能性を有し、これにより、さらに効率的な規模拡大および技術移行キャンペーンがもたらされる。
本開示は、一部の態様では、フェドバッチ設定(例えば、供給タンクおよび保持液容器を使用する)をバッチ様操作(例えば、供給タンクと保持液容器とを本明細書に記載のように接続して、接線流濾過(TFF)再循環ループにおいて単一容器として機能させる)に転換して目的のタンパク質を濃縮することにより、フェドバッチ充填と関連する時間ペナルティーが軽減し得る、UF/DFのためのシュードバッチ構成を対象とする。
接線流濾過は、限外濾過膜による低分子の遊走を駆動すると同時に高分子を保持する(例えば、「保持液」)、流圧の使用に依存する限外濾過手順である。一般には、保持されるタンパク質の分子量の3~6分の1の大きさである、分子量カットオフ(MWCO)を有する膜を選択する。当業者に公知の他の因子、例えば、流量、処理時間、膜間差圧、分子形状または構造、溶質濃度、他の溶質の存在およびイオン条件も、適切なMWCOの選択に影響し得る。
伝統的フェドバッチTFF構成は、図1Aに示す。ここでは、充填物質を保持する供給タンクは、供給ポンプにより保持液容器(例えば、リザーバー)に接続し、保持液容器は、TFF膜装置および再循環ポンプとともに再循環ループに別々に組み込む。
一部の態様では、TFFにより目的のタンパク質について濃縮し、および/または濾過時間を削減する方法は、第1の限外濾過工程(UFI)、透析濾過(DF)および第2の限外濾過工程(UF2)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のシュードバッチ構成において、流路は、再循環ループに供給タンクを組み込むように変更する(図1B)。三方弁は、TFFフィルターモジュールの保持液ポートの後に配置して、保持液流を第1の限外濾過工程の状況に応じて供給タンクまたは保持液容器のいずれかに方向づける。一部の態様では、撹拌機は、供給タンクとリザーバー(例えば、保持液)タンクとの両方に使用する。
一部の態様では、UF1の初期充填段階において、三方弁は、保持液流を供給タンクに方向づけ、保持液容器への流れを遮断するように設定する。充填物質は、供給ポンプにより供給タンクから保持液容器に供給するが、TFFフィルターモジュールからの保持液は、供給タンクに戻し、残存充填物質と混合する。この新たな充填物質混合物は、ここで、わずかにさらに濃縮して保持液容器に供給し、サイクルを繰り返す。一部の態様では、保持液は次第にさらに濃縮されるが、充填物質は初期希釈濃度に固定されたままであるフェドバッチ充填とは異なり、供給タンクおよび保持液容器の両方のタンパク質溶液は、同一の比率で濃縮される。この構成では、バッチ設定と同様に、供給タンクは、保持液容器の拡張として効率的に作用し、この2つは、再循環ループにおける単一リザーバーとして作用する(図1C)。本明細書に記載のシュードバッチ構成では、別のハイブリッド方式のプロセスをバッチ様プロセスに転換することにより、第1の限外濾過工程のフェドバッチ充填部の時間ペナルティーならびにプロセス時間の設備適合依存性が軽減される。一部の態様では、充填工程において、保持液タンクの液体容量は、全充填容量に対して低容量により一定に維持する。一部の態様では、液体容量は、充填工程において全初期充填容量の約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%または約40%に一定に維持する。一部の態様では、液体容量は、充填工程において全初期充填容量の約5%~約10%、約5%~約15%、約5%~約20%、約5%~約25%、約5%~約30%、約10%~約15%、約10%~約20%、約10%~約25%、約10%~約30%、約15%~約20%、約15%~約25%、約15%~約30%、約20%~約30%または約25%~約30%に一定に維持する。一部の態様では、液体容量は、充填工程において全初期充填容量の約10%に一定に維持する。一部の態様では、液体容量は、充填工程において全初期充填容量の約20%に一定に維持する。
一部の態様では、充填工程が完了する場合(例えば、全タンパク質溶液容量が保持液容器容量未満に減少した場合)、三方弁が作動して、保持液流が保持液容器に再度向けられ、供給タンクへの流れが遮断されて、再循環ループから供給タンクが効率的に排除され、TFF設定が実質的バッチ構成に転換される。一部の態様では、供給ポンプをさらなる時間操作して、充填物質の回収を最大化するために2つの容器間の接続チューブにおける残留物質の空気による追出し(例えば、保持液容器への)を実行することができる。
濃縮用のTFF膜は、濃縮する試料に対する拒絶特性に基づいて選択することができる。一般的規定として、完全な保持を保証するために、膜の分子量カットオフ(MWCO)は、保持される分子(例えば、目的のタンパク質)の分子量の1/3~1/6であるべきである。MWCOが試料のそれに近いほど、濃縮における一部の生成物損失のリスクは大きい。相対的損失が、生成される濾液の全容量に依存するため、透析濾過をも使用する場合、リスクは増大する。膜流動速度(膜の単位面積あたりの濾過流量)は、孔径と関連する。孔が小さいほど、同一加圧における流動速度は低い。したがって、濃縮/透析濾過用の膜を選択する場合、時間因子に対する生成物の回収率を考慮しなければならない。プロセス時間は、使用する膜面積の量を増大させることにより削減することができる。
透析濾過は、濾過膜(例えば、限外濾過膜)を使用して、タンパク質、ペプチド、核酸および他の生体分子を含む溶液から塩またはソルベントを完全に除去、置換または濃度を低下させる技術である。DFでは、透過性(例えば、多孔性)膜フィルターを選択的に利用して、成分の分子サイズに基づいて溶液および懸濁液の成分を分離する。限外濾過膜は、膜孔よりも大型の分子は保持するが、小型の分子、例えば、100%透過性の塩、ソルベントおよび水は、膜を自由に通過させる。DFは、濃度を最終的に変えることなく、保持液中の小型の分子は膜を通して洗い流し、大型の分子(例えば、目的のタンパク質)は保持する分画プロセスである。
透析濾過は、持続的または非持続的であり得る。持続的透析濾過では、透析濾過溶液(例えば、バッファー)を、濾液が生成された場合と同一の速度で試料供給リザーバーに加える。この方法では、試料リザーバーの容量は一定のままであるが、膜を自由に透過可能な小型の分子(例えば、塩)は洗い流される。例として除塩を使用すると、それぞれのさらなる透析濾過容量(DV)により、塩濃度がさらに低下する。(DVは、DF工程において実施された洗い流しの程度の基準である。これは、保持液容量と比較した導入透析濾過バッファーの容量に基づく。一定容量のDFでは、保持液容量は、一定に維持され、透過液が出るのと同じ速度でDFバッファーが入る。例えば、ある透析濾過容量は、システムにおける生成物の容量と等しいバッファー容量を供給リザーバーに加え、次いで、濃縮して出発容量に戻すことに等しい。例えば、出発試料200mLの第1の透析濾過容量(DV1)は、200mLに等しい。)第2の透析濾過容量(DV2)では、持続的透析濾過によりイオン強度が約99%低下する。非持続的透析濾過では、溶液は最初に希釈され、次いで、濃縮されて出発容量に戻る。次いで、プロセスは、リザーバーに残存する低分子(例えば、塩)が必要とされる濃度に達するまで繰り返す。さらなるDVのそれぞれにより、塩濃度がさらに低下する。持続的透析濾過では、非持続的透析濾過と同程度の減塩を達成するのに、濾液容量はそれほど必要とされない。試料を最初に濃縮することにより、特定のイオン強度を達成するのに必要とされる透析濾過溶液の量は、実質的に減少する。
一部の態様では、DF供給ポンプは、保持液容器質量が保持液容器質量設定点未満である場合、DFまたは回収方式においてのみ実行する。一部の態様では、この質量は、調節システムによって2秒毎に確認される。一部の態様では、DF質量を設定し、DF終点までDFポンプを維持する。一部の態様では、DFポンプは、容器質量が入力した設定点未満に下がる場合、作動する。DF終点に達した後、システムは濃縮工程に進む。一部の態様では、DF終点の選択は、調節システムのグラフィカルユーザーインターフェースから選択する。一部の態様では、デフォルト終点の選択は、配線内に空気である。一部の態様では、DF質量設定点は、全保持液容器質量である。
本開示では、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(例えば、保持液)により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法であって、供給タンクが、主要リザーバー(例えば、保持液)タンクから分離している、方法を提供する。一部の態様では、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法は、供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む。
また、本開示では、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(例えば、保持液)により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法であって、供給タンクが、主要リザーバー(例えば、保持液)タンクから分離している、方法を提供する。一部の態様では、目的のタンパク質を濃縮する方法は、供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む。
一部の態様では、供給タンクは、少なくとも1回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物をさらに含み、ここで、初期タンパク質混合物および保持液を混合する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、フィルター(例えば、限外濾過フィルター)により濾過する。一部の態様では、濾過したタンパク質混合物および保持液は、供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、少なくとも約1mg/mL、少なくとも約10mg/mL、少なくとも約20mg/mL、少なくとも約30mg/mL、少なくとも約40mg/mL、少なくとも約50mg/mL、少なくとも約60mg/mL、少なくとも約70mg/mLまたは少なくとも約80mg/mLに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、少なくとも約1mg/mL、少なくとも約5mg/mL、少なくとも約10mg/mL、少なくとも約11mg/mL、少なくとも約12mg/mL、少なくとも約13mg/mL、少なくとも約14mg/mL、少なくとも約15mg/mL、少なくとも約16mg/mL、少なくとも約17mg/mL、少なくとも約18mg/mL、少なくとも約19mg/mL、少なくとも約20mg/mLに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、少なくとも約21mg/mL、少なくとも約22mg/mL、少なくとも約23mg/mL、少なくとも約24mg/mL、少なくとも約25mg/mL、少なくとも約26mg/mL、少なくとも約27mg/mL、少なくとも約28mg/mL、少なくとも約29mg/mL、または少なくとも約30mg/mLに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、少なくとも約31mg/mL、少なくとも約32mg/mL、少なくとも約33mg/mL、少なくとも約34mg/mL、少なくとも約35mg/mL、少なくとも約36mg/mL、少なくとも約37mg/mL、少なくとも約38mg/mL、少なくとも約39mg/mL、少なくとも約40mg/mL、少なくとも約45mg/mL、少なくとも約50mg/mL、少なくとも約55mg/mL、少なくとも約60mg/mL、少なくとも約65mg/mL、少なくとも約70mg/mL、少なくとも約75mg/mL、または少なくとも約80mg/mL、少なくとも約85mg/mL、または少なくとも約90mg/mLに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、約1mg/mL~80mg/mL、約5mg/mL~70mg/mL、約10mg/mL~60mg/mL、約10mg/mL~50mg/mL、約10mg/mL~40mg/mL、約10mg/mL~30mg/mL、約10mg/mL~20mg/mL、約20mg/mL~70mg/mL、約20mg/mL~60mg/mL、約20mg/mL~50mg/mL、約20mg/mL~40mg/mL、または約20mg/mL~30mg/mLに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、約1mg/mL~10mg/mL、約10mg/mL~20mg/mL、約20mg/mL~30mg/mL、約30mg/mL~40mg/mL、約40mg/mL~50mg/mL、約50mg/mL~60mg/mL、約60mg/mL~70mg/mL、または約70mg/mL~80mg/mLに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。
一部の態様では、保持液の充填は、本明細書に記載のシュードバッチ流路により再循環させる。一部の態様では、保持液の充填は、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも20回、少なくとも30回、少なくとも40回、少なくとも50回、少なくとも60回、少なくとも70回、少なくとも80回、少なくとも90回、少なくとも100回、少なくとも110回、少なくとも120回、少なくとも130回、少なくとも140回、少なくとも150回、少なくとも160回、少なくとも170回、少なくとも180回、少なくとも190回、少なくとも200回、少なくとも210回、少なくとも220回、少なくとも230回、少なくとも240回、少なくとも250回、少なくとも260回、少なくとも270回、少なくとも280回、少なくとも290回、または少なくとも300回繰り返す。
一部の態様では、方法は、供給タンクへの保持液の充填を停止することをさらに含む。一部の態様では、方法は、保持液をリザーバータンクに方向づけることをさらに含む。一部の態様では、リザーバータンク弁は、目的のタンパク質が十分に濃縮されるまで閉じている。一部の態様では、方法は、タンパク質混合物を供給タンクに頻繁に加えることをさらに含む。一部の態様では、タンパク質混合物を供給タンクからリザーバータンクへ方向づける。
一部の態様では、リザーバータンクをフィルターに接続する。一部の態様では、フィルターは、インライン濾過膜を含む。一部の態様では、インライン濾過膜は、限外濾過膜である。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド-ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリエーテルスルホンである。一部の態様では、インライン濾過膜は、セルロースである。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリエーテルスルホンとセルロースとの組合せである。一部の態様では、濾過膜は、約50kD~約5kD未満の分子量カットオフ(MWCO)を有する。一部の態様では、濾過膜は、約5kD未満のMWCOを有する。
一部の態様では、混合物は、所望の濾過タンパク質濃度に達するまで流す(例えば、再循環させる)。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約10mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約20mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約30mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約40mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約50mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約60mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約70mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約80mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約90mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約100mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約110mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約120mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約130mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約140mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約150mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約160~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約170mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約180mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約190mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約200mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約210mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約220mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約230mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約240mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約250mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約260mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約270mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約280mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約290mg/mL~約300mg/mLである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、150mg/mLである。
一部の態様では、タンパク質粘度は、約0cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約20cP~約60cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約10cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約20cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約30cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約40cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約50cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約60cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約70cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約80cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約90cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約100cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約100cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約120cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約130cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約140cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約150cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約160cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約170cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約180cP~約200cPである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約190cP~約200cPである。
一部の態様では、供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比は、約1:2~約10:1、約1:2~約1:1、約1:1~約1:2、約1:1 約1:3、約1:1~約1:4、約1:1~約1:5、約1:1~約1:6、約1:1~約1:7、約1:1~約1:8、約1:1~約1:9、または約1:1~約1:10である。一部の態様では、供給タンク容量とリザーバータンク容量との間の容量比は、約1:1、約2:1または約5:1である。
一部の態様では、タンパク質混合物をダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプを使用してリザーバータンクおよび/またはフィルターに方向づける。一部の態様では、タンパク質混合物を、ダイヤフラムポンプを使用してリザーバータンクおよび/またはフィルターに方向づける。一部の態様では、タンパク質混合物を、蠕動ポンプを使用してリザーバータンクおよび/またはフィルターに方向づける。
一部の態様では、目的のタンパク質を濃縮し、および/または目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法は、少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(「保持液」)による供給タンクの持続的充填の前に、少なくとも1回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物を供給タンクに充填することを含む。一部の態様では、初期タンパク質混合物を約1mg/mL~約30mg/mLの濃度で供給タンクに加える。一部の態様では、初期タンパク質混合物を約5mg/mLの濃度で供給タンクに加える。
一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約1%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%または約50%削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約40%削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約0.2時間、約0.4時間、約0.5時間、約0.6時間、約0.8時間または約1.0時間削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約0.5時間削減される。
一部の態様では、1~2μmの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約10%、約20%、約30%、約40%または約50%減少する。一部の態様では、5~10μmの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約10%、約20%、約30%、約40%または約50%減少する。一部の態様では、10~25μmの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約10%、約20%、約30%、約40%または約50%減少する。
一部の態様では、タンパク質混合物は、ローディングバッファーとともに供給タンクに加える。一部の態様では、ローディングバッファーは、アミノ酸、弱酸、弱塩基および/または糖を含む。
III.目的のタンパク質
一部の態様では、本明細書に開示の方法は、任意のタンパク質生成物(例えば、目的のタンパク質)に適用することができる。一部の態様では、タンパク質生成物は、治療用タンパク質である。一部の態様では、治療用タンパク質は、抗体またはこの抗原結合断片、Fc融合タンパク質、抗凝固剤、血液凝固因子、骨形態形成タンパク質、改変タンパク質足場、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキンおよび血栓溶解剤から選択される。一部の態様では、タンパク質生成物は、抗体またはこの抗原結合断片である。一部の態様では、タンパク質は、組換えタンパク質である。
一部の態様では、本明細書に開示の方法は、任意のタンパク質生成物(例えば、目的のタンパク質)に適用することができる。一部の態様では、タンパク質生成物は、治療用タンパク質である。一部の態様では、治療用タンパク質は、抗体またはこの抗原結合断片、Fc融合タンパク質、抗凝固剤、血液凝固因子、骨形態形成タンパク質、改変タンパク質足場、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキンおよび血栓溶解剤から選択される。一部の態様では、タンパク質生成物は、抗体またはこの抗原結合断片である。一部の態様では、タンパク質は、組換えタンパク質である。
一部の態様では、タンパク質生成物は、抗体またはこの抗原結合断片である。一部の態様では、タンパク質生成物は、抗体の抗原結合断片を含むキメラポリペプチドである。一部の態様では、タンパク質生成物は、モノクローナル抗体またはこの抗原結合断片(「mAb」)である。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。一部の態様では、タンパク質生成物は、二重特異性抗体である。
一部の態様では、タンパク質生成物および夾雑物を含む混合物は、前の精製工程の生成物を含む。一部の態様では、混合物は、前の精製工程の原生成物である。一部の態様では、混合物は、前の精製工程の原生成物およびバッファー、例えば、開始バッファーを含む溶液である。一部の態様では、混合物は、開始バッファー中に再構成した前の精製工程の原生成物を含む。
一部の態様では、タンパク質生成物の原料は、バルクタンパク質である。一部の態様では、タンパク質生成物の供給源は、タンパク質生成物および非タンパク質成分を含む組成物である。非タンパク質成分は、DNAおよび他の夾雑物を含み得る。
一部の態様では、タンパク質生成物の供給源は、動物由来である。一部の態様では、動物は、哺乳動物、例えば、非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等)または霊長類(例えば、サルまたはヒト)である。一部の態様では、供給源は、ヒト由来の組織または細胞である。特定の態様では、このような用語は、非ヒト動物(例えば、ブタ、ウマ、ウシ、ネコまたはイヌのような非ヒト動物)を指す。一部の態様では、このような用語は、ペットまたは家畜を指す。一部の態様では、このような用語は、ヒトを指す。
一部の態様では、本明細書に記載の方法により精製したタンパク質生成物は、融合タンパク質である。「融合」または「融合タンパク質」は、本来、天然には結合しない第2のアミノ酸配列にインフレームで結合する第1のアミノ酸配列を含む。別々のタンパク質に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにまとめることができるか、または同一タンパク質に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにおいて新たな配列に配置することができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関連性によりコードされるポリヌクレオチドに生成および翻訳されることによって生成する。融合タンパク質は、共有、非ペプチド結合または非共有結合により第1のアミノ酸配列と結合する第2のアミノ酸配列をさらに含み得る。転写/翻訳時に、単一タンパク質が生成される。この方法では、複数のタンパク質またはこれらの断片は、単一ポリペプチドに組み込まれ得る。「動作可能に結合する」は、2つ以上のエレメント間の機能的結合を意味することを意図する。例えば、2つのポリペプチド間の動作可能な結合により、両ポリペプチドがインフレームで融合されて、単一ポリペプチド融合タンパク質が生成される。特定の態様では、融合タンパク質は、以下にさらに詳細に考察するように、リンカー配列を含み得る、第3のポリペプチドをさらに含む。
一部の態様では、本明細書に記載の方法により精製したタンパク質は、抗体である。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換えにより生成した抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、2つの重鎖および2つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖-抗体重鎖対、イントラボディ、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体または一本鎖Fv(scFv)、ラクダ化抗体、アフィボディ、Fab断片、F(ab’)2断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、抗-抗Id抗体を含む)および上記のいずれかの抗原結合断片を含み得る。一部の態様では、本明細書に記載の抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、任意の型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAもしくはIgY)、任意のクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1もしくはIgA2)または任意のサブクラス(例えば、IgG2aもしくはIgG2b)の免疫グロブリン分子であり得る。一部の態様では、本明細書に記載の抗体は、IgG抗体、あるいはクラス(例えば、ヒトIgG1もしくはIgG4)またはサブクラスのIgG抗体である。ある態様では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。一部の態様では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり、これは好ましくは、免疫グロブリンである。一部の態様では、本明細書に記載の抗体は、IgG1またはIgG4抗体である。
一部の態様では、タンパク質は、抗LAG3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗NKG2a抗体、抗ICOS抗体、抗CD137抗体、抗KIR抗体、抗TGFβ抗体、抗IL-10抗体、抗B7-H4抗体、抗Fasリガンド抗体、抗メソテリン抗体、抗CD27抗体、抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IL8抗体またはこれらの任意の組合せである。一部の態様では、タンパク質は、アバタセプトNGPである。他の態様では、タンパク質は、ベラタセプトNGPである。
一部の態様では、タンパク質は、抗PD-1抗体である。
当技術分野において公知の抗PD-1抗体を、ここに記載の組成物および方法において使用することができる。高親和性でPD-1に特異的に結合する種々のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第8,008,449号に記載されている。米国特許第8,008,449号に開示の抗PD-1ヒト抗体は、(a)Biacoreバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴により決定した場合、1×10-7M以下のKDでヒトPD-1に結合し、(b)ヒトCD28、CTLA-4またはICOSに実質的に結合せず、(c)混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいてT細胞増殖が増加し、(d)MLRアッセイにおいてインターフェロンγ産生が増加し、(e)MLRアッセイにおいてIL-2分泌が増加し、(f)ヒトPD-1およびカニクイザルPD-1に結合し、(g)PD-1へのPD-L1および/またはPD-L2の結合を阻害し、(h)抗原特異的メモリー応答を刺激し、(i)抗体応答を刺激し、(j)インビボで腫瘍細胞増殖を阻害する特性の1つまたは複数を示すことが実証されている。本開示において使用可能な抗PD-1抗体としては、ヒトPD-1に特異的に結合し、前述の特性の少なくとも1つ、一部の態様では、少なくとも5つを示すモノクローナル抗体が挙げられる。
他の抗PD-1モノクローナル抗体は、例えば、米国特許第6,808,710号、第7,488,802号、第8,168,757号および第8,354,509号、米国特許出願公開第2016/0272708号、ならびにPCT国際公開WO2012/145493号、WO2008/156712、WO2015/112900、WO2012/145493、WO2015/112800、WO2014/206107、WO2015/35606、WO2015/085847、WO2014/179664、WO2017/020291、WO2017/020858、WO2016/197367、WO2017/024515、WO2017/025051、WO2017/123557、WO2016/106159、WO2014/194302、WO2017/040790、WO2017/133540、WO2017/132827、WO2017/024465、WO2017/025016、WO2017/106061、WO2017/19846、WO2017/024465、WO2017/025016、WO2017/132825およびWO2017/133540号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体を参照により本明細書に組み込む。
一部の態様では、抗PD-1抗体は、ニボルマブ(OPDIVO(登録商標)、5C4、BMS-936558、MDX-1106およびONO-4538としても知られる)、ペムブロリズマブ(Merck社;KEYTRUDA(登録商標)、ラムブロリズマブおよびMK-3475としても知られる;WO2008/156712号を参照)、PDR001(Novartis社;WO2015/112900号を参照)、MEDI-0680(AstraZeneca社;AMP-514としても知られる;WO2012/145493号を参照)、セミプリマブ(Regeneron社;REGN-2810としても知られる;WO2015/112800号を参照)、JS001(TAIZHOU JUNSHI PHARMA社;トリパリマブ(toripalimab)としても知られる;Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照)、BGB-A317(Beigene社;チスレリズマブ(Tislelizumab)としても知られる;WO2015/35606号および米国特許出願公開第2015/0079109号を参照)、INCSHR1210(JiangsuHengruiMedicine社;SHR-1210としても知られる;WO2015/085847号;Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照)、TSR-042(TesaroBiopharmaceutical社;ANB011としても知られる;WO2014/179664号を参照)、GLS-010(Wuxi/HarbinGloriaPharmaceuticals社;WBP3055としても知られる;Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照)、AM-0001(Armo社)、STI-1110(SorrentoTherapeutics社;WO2014/194302号を参照)、AGEN2034(Agenus社;WO2017/040790号を参照)、MGA012(Macrogenics社、WO2017/19846号を参照)、BCD-100(Biocad社;Kaplon et al., mAbs 10(2):183-203 (2018)、ならびにIBI308(Innovent社;WO2017/024465号、WO2017/025016号、WO2017/132825号およびWO2017/133540号を参照)からなる群から選択される。
一部の態様では、タンパク質は、抗PD-L1抗体である。当技術分野において公知の抗PD-L1抗体を、本開示の組成物および方法において使用することができる。本開示の組成物および方法において有用な抗PD-L1抗体の例としては、米国特許第9,580,507号に開示の抗体が挙げられる。米国特許第9,580,507号に開示の抗PD-L1ヒトモノクローナル抗体は、(a)Biacoreバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴により決定した場合、1×10-7M以下のKDでヒトPD-L1に結合し、(b)混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいてT細胞増殖が増加し、(c)MLRアッセイにおいてインターフェロンγ産生が増加し、(d)MLRアッセイにおいてIL-2分泌が増加し、(e)抗体応答を刺激し、(f)T細胞エフェクター細胞および/または樹状細胞に対する制御性T細胞の作用を回復させる特性の1つまたは複数を示すことが実証されている。本開示において使用可能な抗PD-L1抗体としては、ヒトPD-L1に特異的に結合し、前述の特徴の少なくとも1つ、一部の態様では、少なくとも5つを示すモノクローナル抗体が挙げられる。
特定の態様では、抗PD-L1抗体は、BMS-936559(12A4、MDX-1105としても知られる;例えば、米国特許第7,943,743号およびWO2013/173223号を参照)、アテゾリズマブ(Roche社;TECENTRIQ(登録商標);MPDL3280A、RG7446としても知られる;米国特許第8,217,149号を参照;Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(suppl):3000も参照)、デュルバルマブ(AstraZeneca社;IMFINZI(商標)、MEDI-4736としても知られる;WO2011/066389号を参照)、アベルマブ(Pfizer社;BAVENCIO(登録商標)、MSB-0010718Cとしても知られる;WO2013/079174号を参照)、STI-1014(Sorrento社;WO2013/181634号を参照)、CX-072(Cytomx社;WO2016/149201号を参照)、KN035(3D Med/Alphamab社;Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017)を参照)、LY3300054(EliLillyCo.社;例えば、WO2017/034916号を参照)、BGB-A333(BeiGene社;Desai et al., JCO 36 (15suppl):TPS3113 (2018)を参照)、ならびにCK-301(CheckpointTherapeutics社;Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)を参照)からなる群から選択される。
一部の態様では、タンパク質は、抗GITR(グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連遺伝子)抗体である。一部の態様では、抗GITR抗体は、6C8のCDR配列を有し、例えば、WO2006/105021号に記載の6C8のCDRを有するヒト化抗体、WO2011/028683号に記載の抗GITR抗体のCDRを含む抗体;JP特開2008278814号に記載の抗GITR抗体のCDRを含む抗体、WO2015/031667号、WO2015/187835号、WO2015/184099号、WO2016/054638号、WO2016/057841号、WO2016/057846号、WO2018/013818号に記載の抗GITR抗体または本明細書に記載もしくは言及する他の抗GITR抗体のCDRを含む抗体等が挙げられ、これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。
他の態様では、タンパク質は、抗LAG3抗体である。LAG-3としても知られるリンパ球活性化遺伝子3は、ヒトにおいてLAG3遺伝子によりコードされるタンパク質である。1990年に発見されたLAG3は、T細胞機能に対する多様な生物学的作用を有する細胞表面分子である。これは、免疫チェックポイント受容体であり、このため、がんおよび自己免疫障害のための新たな治療を開発しようと努力する製薬会社による、種々の薬物開発プログラムの標的である。可溶性形態では、これは、それ自体でがん薬物としても開発されている。抗LAG3抗体の例としては、WO2017/087901号A2、WO2016/028672号A1、WO2017/106129号A1、WO2017/198741号A1、米国特許出願公開第2017/0097333号A1、米国特許出願公開第2017/0290914号A1および米国特許出願公開第2017/0267759号A1の抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。
一部の態様では、タンパク質は、抗CXCR4抗体である。CXCR4は、G1に結合された7回膜貫通タンパク質である。CXCR4は、造血系起源の細胞上に広範に発現し、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)に対するCD4+との主要な共受容体である。Feng, Y., Broeder, C.C., Kennedy, P. E., and Berger, E. A. (1996) Science 272, 872-877を参照されたい。抗CXCR4抗体の例としては、WO2009/140124号A1、米国特許出願公開第2014/0286936号A1、WO2010/125162号A1、WO2012/047339号A2、WO2013/013025号A2、WO2015/069874号A1、WO2008/142303号A2、WO2011/121040号A1、WO2011/154580号A1、WO2013/071068号A2およびWO2012/175576号A1の抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。
一部の態様では、タンパク質は、抗CD73(エクト-5’-ヌクレオチダーゼ)抗体である。一部の態様では、抗CD73抗体は、アデノシンの形成を阻害する。AMPのアデノシンへの分解により、腫瘍微小環境内に免疫が抑制され血管新生が促進される微小環境が生成され、これにより、がんの発症および増悪が促進される。抗CD73抗体の例としては、WO2017/100670号A1、WO2018/013611号A1、WO2017/152085号A1およびWO2016/075176号A1の抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。
一部の態様では、タンパク質は、抗TIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体)抗体である。TIGITは、免疫グロブリンタンパク質のPVR(ポリオウイルス受容体)ファミリーのメンバーである。TIGITは、濾胞性BヘルパーT細胞(TFH)を含むいくつかのクラスのT細胞上に発現する。このタンパク質は、PVRに高親和性で結合することがわかっており、この結合は、TFHと樹状細胞との間の相互作用を助けて、T細胞依存的B細胞応答を制御すると考えられている。抗TIGIT抗体の例としては、WO2016/028656号A1、WO2017/030823号A2、WO2017/053748号A2、WO2018/033798号A1、WO2017/059095号A1およびWO2016/011264号A1の抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。
一部の態様では、タンパク質は、抗OX40(すなわち、CD134)抗体である。OX40は、腫瘍壊死因子(TNF)リガンドファミリーのサイトカインである。OX40は、T細胞抗原呈示細胞(APC)相互作用において機能し、活性化T細胞の内皮細胞への接着を媒介する。抗OX40抗体の例としては、WO2018/031490号A2、WO2015/153513号A1、WO2017/021912号A1、WO2017/050729号A1、WO2017/096182号A1、WO2017/134292号A1、WO2013/038191号A2、WO2017/096281号A1、WO2013/028231号A1、WO2016/057667号A1、WO2014/148895号A1、WO2016/200836号A1、WO2016/100929号A1、WO2015/153514号A1、WO2016/002820号A1およびWO2016/200835号A1が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。
一部の態様では、タンパク質は、抗IL8抗体である。IL-8は、好中球、好塩基球およびT細胞を誘引するが、単球は誘引しない走化性因子である。これは、好中球活性化にも関与する。これは、炎症性刺激に応答して、いくつかの細胞型から放出される。
一部の態様では、タンパク質は、アバタセプト(ORENCIA(登録商標)として市販されている)である。アバタセプト(本明細書においてAbaとも省略する)は、T細胞の免疫活性に干渉することにより、関節リウマチのような自己免疫疾患を治療するために使用する薬物である。アバタセプトは、CTLA-4の細胞外ドメインに融合した免疫グロブリンIgG1のFc領域からなる融合タンパク質である。T細胞を活性化して免疫応答をもたらすために、抗原呈示細胞は、2つのシグナルをT細胞に呈示しなければならない。このようなシグナルの一方は、抗原と複合した主要組織適合複合体(MHC)であり、他方のシグナルは、CD80またはCD86分子(B7-1およびB7-2としても知られる)である。
一部の態様では、タンパク質は、ベラタセプト(商品名NULOJIX(登録商標))である。ベラタセプトは、CTLA-4の細胞外ドメインに結合したヒトIgG1免疫グロブリンのFc断片からなる融合タンパク質であり、これは、T細胞共刺激の制御において重要な分子であり、T細胞活性化のプロセスを選択的に遮断する。これは、標準的免疫抑制治療計画、例えば、カルシニューリン阻害剤により生じた毒性を制限しながら、移植片生存期間を延長することを意図する。これは、わずか2つのアミノ酸によりアバタセプト(ORENCIA(登録商標))とは異なる。
一部の態様では、タンパク質混合物は、抗体、抗体断片、抗原結合断片、融合タンパク質、天然に存在するタンパク質、キメラタンパク質またはこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、タンパク質混合物は、IgM、IgA、IgE、IgDおよびIgGから選択される抗体を含む。一部の態様では、タンパク質混合物は抗体を含み、この抗体はIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選択されるIgG抗体である。一部の態様では、抗体は、二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む。一部の態様では、抗体は、三価抗体を含む。一部の態様では、抗体または抗体断片は、抗PD-1、抗PD-Ll、抗CTLA4、抗TIM3、抗LAG3、抗NKG2a、抗ICOS、抗CD137、抗KIR、抗TGFβ、抗IL-10、抗B7-H4、抗GITR、抗CXCR4、抗CD73、抗TIGIT、抗OX40、抗IL-8抗体またはこれらの抗体断片を含む。
一部の態様では、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物は、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞培養物に由来する。一部の態様では、哺乳動物細胞培養物は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞培養物である。
一部の態様では、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物は、バッチ細胞培養物から得られる。一部の態様では、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物は、フェドバッチ細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物をバイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を使い捨てバイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物は、灌流細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物をTFF灌流バイオリアクターの灌流において生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を約1日間~約60日間存続する細胞培養物により生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を約25日間存続する細胞培養物により生成する。
IV.医薬組成物
本開示の方法により生成したタンパク質は、ヒト投与に適するように、例えば、医薬組成物に、さらに製剤化することができる。組成物は、薬学的投与に許容される組成物であり、このような組成物は、薬学的投与に許容されるレベルを越えないレベル(このようなレベルは、このような不純物が存在しない場合を含む)で不純物である物質を含むことができ、例えば、投与し易いようにこのような組成物を製剤化するために、薬学的に許容される賦形剤、媒体、担体および他の不活性成分を、任意の活性剤(複数可)に加えて含むことができる。本開示の方法により調製した組成物は、多様な疾患を治療するのに有用である。
本開示の方法により生成したタンパク質は、ヒト投与に適するように、例えば、医薬組成物に、さらに製剤化することができる。組成物は、薬学的投与に許容される組成物であり、このような組成物は、薬学的投与に許容されるレベルを越えないレベル(このようなレベルは、このような不純物が存在しない場合を含む)で不純物である物質を含むことができ、例えば、投与し易いようにこのような組成物を製剤化するために、薬学的に許容される賦形剤、媒体、担体および他の不活性成分を、任意の活性剤(複数可)に加えて含むことができる。本開示の方法により調製した組成物は、多様な疾患を治療するのに有用である。
V.限外濾過システム
本開示では、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減するためのシステムを提供する。また、本開示では、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムを提供する。
本開示では、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減するためのシステムを提供する。また、本開示では、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムを提供する。
一部の態様では、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムは、供給タンク、第1の流体経路により供給タンクに接続するリザーバータンク、第2の流体経路によりリザーバータンクに接続する濾過膜、および第3の流体経路により濾過膜に接続し、第4の流体経路によりリザーバータンクに接続し、第5の流体経路により供給タンクに接続する、三方弁を含み、ここで、リザーバータンクが、第1の流体経路を介して供給タンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領し、濾過膜が、第2の流体経路を介してリザーバータンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領して、タンパク質混合物を濾過し、三方弁が、第3の流体経路を介してフィルターから保持液を受領して、保持液を第4の流体経路を介してリザーバータンク、または第5の流体経路を介して供給タンクのいずれかに方向づける。
一部の態様では、三方弁は、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力未満である場合、保持液をリザーバータンクに方向づけ、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力よりも大きい場合、保持液を供給タンクに方向づける。
一部の態様では、システムは、システム内のタンパク質混合物の全容量、質量および/または濃度を判定するように構成されたセンサーをさらに含み、ここで、三方弁が、センサーからのフィードバックに基づいて、保持液をリザーバータンクまたは供給タンクのいずれかに自動的に方向づける。一部の態様では、インラインUV可視分光光度計を使用して、タンパク質混合物のタンパク質濃度をリアルタイムで監視する。一部の態様では、レベルセンサーを使用して、供給タンクおよびリザーバータンクのいずれかまたは両方におけるタンパク質溶液の容量をリアルタイムで監視する。一部の態様では、このようなレベルセンサーは、ウェーブガイドレーダーまたは膜に基づく圧力レベルセンサーを含むが、これらに限定されない。一部の態様では、供給タンクおよびリザーバータンクのいずれかまたは両方におけるタンパク質溶液の容量は、重量測定により監視し、ここで、供給タンクおよび/またはリザーバータンクにおけるタンパク質溶液の質量は、秤を使用して測定し、質量は、溶液密度を使用して容量に変換する。一部の態様では、システムは、1つまたは複数のダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプをさらに含む。
一部の態様では、フィルターは、インライン濾過膜を含む。一部の態様では、インライン濾過膜は、限外濾過膜である。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド-ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリエーテルスルホンである。一部の態様では、インライン濾過膜は、セルロースである。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリエーテルスルホンとセルロースとの組合せである。一部の態様では、濾過膜は、約50kD~約5kD未満の分子量カットオフ(MWCO)を有する。一部の態様では、濾過膜は、約5kD未満のMWCOを有する。
実施例1
フェドバッチプロセス時間は、複数の設備適合性パラメーター、すなわち、保持液容器容量、システム貯蔵容量、充填タンパク質濃度および充填容量の関数である。
フェドバッチプロセス時間は、複数の設備適合性パラメーター、すなわち、保持液容器容量、システム貯蔵容量、充填タンパク質濃度および充填容量の関数である。
充填物質容量が、充填して保持液容器内に適合するのに大きすぎる場合、充填物質の一部を供給タンクに維持し、フェドバッチ限外濾過において保持液容器に緩徐に供給する。保持液容量が、保持液容器内に全タンパク質充填物(数グラムのタンパク質)を含むまで十分に減少した時点は、交差濃度(式1)と呼ぶ。
式中、C0およびV0は、それぞれタンパク質充填濃度および容量であり、Vresは保持液容器容量であり、Vholdupはシステム貯蔵容量である。
タンパク質をフェドバッチ方式で濃縮するのに必要とされるプロセス時間は、式2cを使用して数値的に算出することができ、この式2cは、流動式(式2a、累積透過液容量V’に関して定義する)を積分し、流動に対する濃度分極モデルを想定することにより得た(式2b)。式2c中の積分Vperm,finalの極限は、交差濃度における予想透過液容量である。フェドバッチ操作におけるタンパク質濃度は、累積透過液容量V’の関数として式3により定義することができ、式中、Vresは、保持液容器の充満容量であり、これは、フェドバッチ充填中に一定に維持する。したがって、Vperm,finalは、交差タンパク質濃度(式1)を使用して、式3をV’について解くことにより算出することができる。
このような式により、フェドバッチプロセス時間は、複数の設備適合性パラメーター、すなわち、保持液容器容量、システム貯蔵容量、充填タンパク質濃度および充填容量の関数であることが明らかとなる。
実施例2
伝統的フェドバッチTFF構成は、図1Aに例示する。ここでは、充填物質を保持する供給タンクは、供給ポンプにより保持液容器(例えば、リザーバー)に接続し、保持液容器を、TFF膜装置および再循環ポンプとともに再循環ループに別々に組み込む。
伝統的フェドバッチTFF構成は、図1Aに例示する。ここでは、充填物質を保持する供給タンクは、供給ポンプにより保持液容器(例えば、リザーバー)に接続し、保持液容器を、TFF膜装置および再循環ポンプとともに再循環ループに別々に組み込む。
本明細書に記載のシュードバッチ構成では、図1Bに例示するように、流路は、再循環ループに供給タンクを組み込むように変更する。三方弁は、以下に説明するように、TFFフィルターモジュールの保持液ポートの後に配置して、保持液流を第1の限外濾過工程の状況に応じて供給タンクまたは保持液容器のいずれかに方向づける。一部の態様では、撹拌機(図示せず)は、タンク/容器の両方に使用する。
第1の限外濾過工程の初期充填段階において、三方弁は、保持液流を充填タンク(load tank)に方向づけ、保持液容器への流れを遮断するように設定する。充填物質は基準として、供給ポンプにより供給タンクから保持液容器に供給するが、TFFフィルターモジュールからの保持液は代わりに、供給タンクに戻し、残存充填物質と混合する。この新たな充填物質は、ここで、わずかにさらに濃縮して保持液容器に供給し、サイクルを繰り返す。したがって、保持液は次第にさらに濃縮されるが、充填物質は初期希釈濃度に固定されたままであるフェドバッチ充填とは異なり、充填タンクおよび保持液容器の両方のタンパク質溶液は、同一の速度で濃縮される。この構成では、バッチ設定と同様に、供給タンクは、保持液容器の拡張として効率的に作用し、この2つは、再循環ループにおける単一リザーバーとして作用する(図1C)。したがって、シュードバッチ構成では、別のハイブリッド方式のプロセスをバッチ様プロセスに転換することにより、第1の限外濾過工程のフェドバッチ充填部の時間ペナルティーならびにプロセス時間の設備適合依存性が軽減される。
充填工程が完了する場合(例えば、全タンパク質溶液容量が保持液容器容量未満に減少した場合)、三方弁が作動して、保持液流が保持液容器に再方向づけられ、供給タンクへの流れが遮断されて、再循環ループから供給タンクが効率的に排除され、TFF設定が実質的バッチ構成に転換される。供給ポンプをさらなる時間操作して、充填物質の回収を最大化するために2つの容器間の接続チューブにおける残留物質の空気による追出し(例えば、保持液容器への)を実行することができる。
上記のシュードバッチ構成の利点を実証する概念の証拠として、mAb Aの高濃度溶液(約180g/L)をバッチ、ハイブリッドおよびシュードバッチ構成により実験室規模で実施したTFFによって生成した。各濾過工程(第1の限外濾過(UF1)、透析濾過(DF)および第2の限外濾過(UF2))のプロセス時間ならびに回収後精製原薬(PDS)の品質特性(例えば、高分子量(HMW)種、粒子数)を、3つの構成間で比較した。HMWレベルを、モデル2487の二波長検出器(WatersCorporation社、MilfordMA USA)ならびにTSKgel SuperSW3000メインおよびガードカラム(TosohBioscience社、King ofPrussiaPA USA)を備えるAlliance2695HPLCシステムを使用する高性能液体サイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、一方、1~100μm粒子の粒子数を、MFI5200(ProteinSimple社、SanJoseCA USA)を使用するマイクロフローイメージングにより定量した。PDS濁度は、Hach 2100Q濁度計を使用して三つ組で測定し、これは、使用前に毎日較正した。
TFF実験は、Quattroflow150ポンプ(HighPurityNewEngland社、SmithfieldRI USA)および88cm2 30kDaのUltracelPellicon3D-screen膜(MilliporeSigma社、BurlingtonMA USA)を備えるPendoTECH制御およびデータ収集システム(PendoTECH社、PrincetonNJ USA)を使用して実施した。単一バッチの精製した10g/LのmAb溶液を別々の一定分量に分けて、3回の実行において同一の充填物質を生成した。ここでは、一定分量の容量は、およそ600g/m2の膜充填を達成するように定義した。シュードバッチおよびハイブリッド後成の両方では、システム貯蔵容量を加えた保持液容器に対する初期充填容量の容量比は、5に設定した。各実行では、mAbは、第1の限外濾過工程において50g/Lに濃縮され、次いで、バッファーを透析濾過容量5の透析濾過バッファーと交換した。次いで、透析濾過タンパク質溶液を、第2の限外濾過工程において180g/Lにさらに濃縮した(保持液および透過液の質量から重量測定により決定して、高濃度における溶液密度の変化を説明した)。次いで、バッファーにより貯蔵容量外に残留タンパク質溶液を追い出すことにより原薬を回収した。ここでは、使用した追出しバッファーの容量は、システム貯蔵容量の1.2倍であった。
実施例3
A.プロセス時間
プロセス時間の関数としてのおよその保持液mAb濃度(システムにおける保持液容量およびタンパク質の全質量から算出)は、3つの構成について図2Aに示す。各プロセス段階(UF1、DFおよびUF2)における対応するプロセス時間は、図2Bに示す。3回の実行において観察された対応する透過液流動は、図3に示す。
A.プロセス時間
プロセス時間の関数としてのおよその保持液mAb濃度(システムにおける保持液容量およびタンパク質の全質量から算出)は、3つの構成について図2Aに示す。各プロセス段階(UF1、DFおよびUF2)における対応するプロセス時間は、図2Bに示す。3回の実行において観察された対応する透過液流動は、図3に示す。
ハイブリッド(フェドバッチ充填)実行のUF1工程のプロセス時間は、図2Bに見られるように、バッチ実行よりも60%長かった。フェドバッチ戦略を使用した、充填工程における透過液流動(UF1の初期部)は、低くなることが観察され(図3)、これは、ハイブリッド実行の長いUF1プロセス時間にも寄与する可能性を有する。対照的に、シュードバッチ実行におけるUF1プロセス時間(図2B)および透過液流動(図3)の両方は、バッチ実行とほぼ同一であった。DFおよびUF2工程は、充填(UF1)工程におけるシステム構成とは無関係に、バッチ構成において必ず実施するため、当然、透析濾過およびUF2プロセス時間は、3回すべての実行間でほぼ同一であった(図2B)。3回の実行間における透析濾過プロセス時間の差がわずかであるのは、透析濾過工程におけるタンパク質濃度の可変性が軽度であるためであった(49~51g/L)。このような結果により、初期試料充填(UF1)工程におけるシステム構成の全プロセス時間に対する影響が例示され、UF1工程においてフェドバッチ充填と関連する時間ペナルティーを軽減するだけでなく、ハイブリッド(フェドバッチ充填)プロセスと関連するプロセス時間拡張可能性の課題を排除する、シュードバッチ構成の能力が実証される。
B.品質特性
原薬品質特性に対するシュードバッチ構成の影響を評価して、第2のポンプ(例えば、供給ポンプ)を再循環ループへ組み込むことにより、ここで、タンパク質溶液が再循環サイクル毎に1つではなく2つのポンプの通過を経るため、有害作用がもたらされるかどうかを判定した。
原薬品質特性に対するシュードバッチ構成の影響を評価して、第2のポンプ(例えば、供給ポンプ)を再循環ループへ組み込むことにより、ここで、タンパク質溶液が再循環サイクル毎に1つではなく2つのポンプの通過を経るため、有害作用がもたらされるかどうかを判定した。
mAb Aは、UF/DFにおける可溶性の高分子量(HMW)種の形成に関するポンプ剪断への曝露に対して非感受性であることが見出された。HMWレベルは、3つすべての構成戦略について、全プロセスを通じて本質的に不変のままであった(図4)。したがって、シュードバッチ構成と関連するポンプ剪断への曝露の増加によって、HMW形成に対する有害作用がもたらされるとは思われなかった。
大型の不溶性凝集物に対するシュードバッチ構成の影響を、マイクロ流体イメージング(MFI)により定量した。3つの構成を使用して生成したプロセス中のプールにおける顕微鏡下で可視の(1~100μm)粒子数を図5A~Dに示す。HMW形成において観察されたものとは異なり、mAb Aは、経時的な顕微鏡下で可視の粒子形成における著しい増加は示さず、ここで、粒子の全数および相対的粒子サイズ分布の両方は、構成間で顕著に異なる。
ハイブリッド実行では、すべての粒子サイズ範囲において、バッチ実行よりも粒子数が一貫して多く、長いプロセス時間ならびに対応する剪断および界面応力に対するタンパク質曝露の増加と一致した。対照的に、シュードバッチ実行では、50~100μmのサイズ範囲(図5D)を除いて、1~25μmのサイズ範囲(図5A~C)において、バッチ実行と同等かまたは少ない量の粒子が生成された。50~100μmのサイズ範囲における多粒子数は、他の2つの充填戦略と比較して二重のポンプを通過する結果としてUF1工程において生成される(未検出の)凝集前駆物質レベルの上昇に潜在的に起因し得る。しかし、50~100μmのサイズ範囲における全粒子数が、小型の粒子サイズ範囲における粒子数よりも桁違いに少ないことに留意することが重要である。全体的な粒子生成の観点からすれば、シュードバッチ構成は、フェドバッチ構成を超える顕著な改良であり、バッチ構成と同等品質の原薬を生成すると思われる。
興味深いことには、3つの構成間の粒子数における最も大きな差は、UF2工程が全体的プロセスのうちの最も短い部分であるという事実にもかかわらず、DV5とUF2後との間で生じる(図2B)。3つすべての構成が、DFおよびUF2の両工程において同一のプロセス時間および設定を有することを考慮すると、このような結果は、SEC/MFIにより検出されない可能性を有するが、最終原薬の品質に影響する凝集前駆物質の生成において、UF1工程の重要性を実証する。
実施例4
供給ポンプの型がシュードバッチプロセスに影響するかどうかを判定するために、ダイヤフラム供給ポンプを蠕動供給ポンプと交換した。約180g/LのmAb A溶液を、シュードバッチ充填構成を使用して、実施例3のシュードバッチ実行と同一のプロセスパラメーター(例えば、膜充填、充填濃度、透析濾過濃度、交換透析濾過容量、ポンプ供給流動およびTMP)により生成した。保持液タンク容量に対する初期充填容量の容量比は、実施例3のように、5に維持した(すなわち、充填工程における保持液タンクの液体容量を、初期全充填容量の20%と等しい一定の値に維持した)。この実行のプロセス性能を、ダイヤフラム供給ポンプを使用してシュードバッチ実行のそれと比較した。
供給ポンプの型がシュードバッチプロセスに影響するかどうかを判定するために、ダイヤフラム供給ポンプを蠕動供給ポンプと交換した。約180g/LのmAb A溶液を、シュードバッチ充填構成を使用して、実施例3のシュードバッチ実行と同一のプロセスパラメーター(例えば、膜充填、充填濃度、透析濾過濃度、交換透析濾過容量、ポンプ供給流動およびTMP)により生成した。保持液タンク容量に対する初期充填容量の容量比は、実施例3のように、5に維持した(すなわち、充填工程における保持液タンクの液体容量を、初期全充填容量の20%と等しい一定の値に維持した)。この実行のプロセス性能を、ダイヤフラム供給ポンプを使用してシュードバッチ実行のそれと比較した。
プロセス時間の関数としてのおよその保持液mAb濃度(システムにおける保持液容量およびタンパク質の全質量から算出)は、2回のシュードバッチ実行について図6Aに示す。各プロセス段階(UF1、DFおよびUF2)における対応するプロセス時間は、図6Bに示す。算出した保持液濃度の関数としての対応する透過液流動は、図7に示す。2回の実行の流動プロファイルならびにプロセス時間は、UF/DFプロセスの各段階において、ほぼ同一であり、供給ポンプのための蠕動またはダイヤフラムポンプの選択は、プロセス処理量に関するシュードバッチ充填方法の性能に対して影響を与えないことを示す。
また、原薬品質特性を評価して、シュードバッチ構成における供給ポンプ型が、シュードバッチ方法の一般的実用性における決定因子となり得る、UF/DFプロセスにおけるタンパク質安定性に著しく影響するかどうかを判定した。図8からわかるように、蠕動供給ポンプの使用によって、UF/DFにおけるHMW形成は、ダイヤフラム供給ポンプを超えて増加しなかった(アッセイ可変性の範囲内)。したがって、ダイヤフラム供給ポンプを超える、蠕動供給ポンプの使用と関連する剪断曝露の差によって、HMW形成に対する有害作用がもたらされるとは思われなかった。
大型の不溶性凝集物に対する供給ポンプ型の影響を、マイクロ流体イメージング(MFI)により定量した。複数の供給ポンプ型を使用して生成したプロセス中のプールにおける顕微鏡下で可視の(1~100μm)粒子数を図9A~9Dに示す。HMW形成において観察されたものとは異なり、粒子の全数および相対的粒子サイズ分布の両方は、ポンプ型間で顕著に異なった。蠕動供給ポンプによって、小型の粒子(<25μm)がダイヤフラムポンプと比較して著しくさらに生成されたが、大型の粒子(>50μm)は少なかった。このプロファイルは、蠕動ポンプにより、タンパク質溶液が供給ポンプを通じて循環するため、さらに高い剪断またはさらなる乱流形態が生じ、これにより大型粒子が不安定化して、小型粒子の集団が相対的に多くなることを示唆する。しかし、上記のように、粒子サイズ分布の差によって、膜流動またはプロセス処理量が影響されるとは思われない。このような粒子は、UF/DF工程後の最終的製剤化および濾過工程において除去されるため、2つのポンプ型間における粒子生成の差が、最終生成物品質の懸念となる可能性は低い。
実施例5
充填工程における保持液対全充填容量比がシュードバッチ性能に影響するかどうかを判定するために、充填工程における保持液タンクの液体容量を、全充填容量に対して低容量により一定に維持した。約180g/LのmAb A溶液を、シュードバッチ充填方法を使用して、実施例4に記載のUF/DFプロセスパラメーターおよび構成(蠕動供給ポンプ)を使用して生成した。しかし、保持液タンクの液体容量を、実施例4での20%ではなく、UF1工程の充填部分において全初期充填容量の10%に維持した。この実行のプロセス性能は、保持液タンク容量を充填工程において全初期充填容量の20%に維持したシュードバッチ実行のそれと比較した。
充填工程における保持液対全充填容量比がシュードバッチ性能に影響するかどうかを判定するために、充填工程における保持液タンクの液体容量を、全充填容量に対して低容量により一定に維持した。約180g/LのmAb A溶液を、シュードバッチ充填方法を使用して、実施例4に記載のUF/DFプロセスパラメーターおよび構成(蠕動供給ポンプ)を使用して生成した。しかし、保持液タンクの液体容量を、実施例4での20%ではなく、UF1工程の充填部分において全初期充填容量の10%に維持した。この実行のプロセス性能は、保持液タンク容量を充填工程において全初期充填容量の20%に維持したシュードバッチ実行のそれと比較した。
プロセス時間の関数としてのおよその保持液mAb濃度(システムにおける保持液容量およびタンパク質の全質量から算出)は、2回のシュードバッチ実行について図10Aに示す。各プロセス段階(UF1、DFおよびUF2)における対応するプロセス時間は、図10Bに示す。算出した保持液濃度の関数としての対応する透過液流動は、図11に示す。2回の実行の流動プロファイルならびにUF1およびUF2プロセス時間は、ほぼ同一であり、充填工程における保持液タンク対全充填容量比は、タンパク質を濃縮するのに必要とされるプロセス時間に対して影響を与えないことを示す。透析濾過時間の小さな差は、標的値50g/L付近の実際の透析濾過濃度におけるわずかな変動のためである可能性を有する。この結果は、実施例1においてこれまでに説明したように、UF1プロセス時間が、保持液タンクおよび全充填容量の相対容量比に依存する、フェドバッチ操作とは異なる。実施例4および5の充填工程における相対的保持液および充填容量比に対するUF1プロセス時間の独立性は、シュードバッチ方法の主要な原理と一致しており、ここで、UF/DF再循環ループにおいて供給タンクおよび保持液タンクを接続することにより、それらを単一リザーバーとして効率的に機能させ、充填工程をバッチプロセスに転換することが可能となる。
また、原薬品質特性を評価して、充填工程における保持液対全充填容量比が、UF/DFプロセスにおけるタンパク質安定性に影響するかどうかを判定した。図12からわかるように、保持液容量を初期充填容量の10%に維持して実施した実行では、HMWレベルは、20%の容量比により実施した実行と同一であった。同様に、MFIにより定量したUF2後の溶液の粒子サイズ分布(1~100μm)は、図13A~図13Dに見られるように、2回の実行間でほぼ同一であった。タンパク質が結果として、同一数のポンプの通過および2回の実行間の他のストレス因子の影響を受けるため、2回の実行間のHMWおよび大型粒子プロファイルの類似性は、同一のUF1プロセス時間(図10B)およびプロセス時間の関数としての濃度プロファイル(図10A)に部分的に起因し得る。
実施例6
シュードバッチ方法は、非mAbタンパク質製剤(MW=約20Da)に対して実施した。この非mAbタンパク質製剤は、充填物質として使用した。タンパク質は、伝統的フェドバッチならびにシュードバッチ方法を使用して0.7から15.5g/Lまで濃縮した。このような2回の実行において、バッファー交換は実施しなかった。他のすべてのプロセスパラメーター(膜充填、ポンプ供給流動、TMP)は、2回の実行間で一定に保持した。保持液タンクの液体容量は、両実行において充填工程を通じて全初期充填容量の30%に等しい値で一定に維持し、蠕動ポンプを供給ポンプとして使用した。
シュードバッチ方法は、非mAbタンパク質製剤(MW=約20Da)に対して実施した。この非mAbタンパク質製剤は、充填物質として使用した。タンパク質は、伝統的フェドバッチならびにシュードバッチ方法を使用して0.7から15.5g/Lまで濃縮した。このような2回の実行において、バッファー交換は実施しなかった。他のすべてのプロセスパラメーター(膜充填、ポンプ供給流動、TMP)は、2回の実行間で一定に保持した。保持液タンクの液体容量は、両実行において充填工程を通じて全初期充填容量の30%に等しい値で一定に維持し、蠕動ポンプを供給ポンプとして使用した。
プロセス時間の関数としてのおよその保持液タンパク質濃度(システムにおける保持液容量およびタンパク質の全質量から算出)は、2回の実行について図14に示す。対応するプロセス時間は、フェドバッチ実行では3.0時間およびシュードバッチ実行では2.9時間であった。算出した保持液濃度の関数としての透過液流動は、図15に示す。流動対濃度プロファイルは同一であることにより、これまでの実施例による知見と一致して、充填方法における差が本来の膜性能には影響しないことを示す。この実施例では、プロセスの充填工程は、この濃度範囲にわたって減衰する流動が本質的に無視できるものであるような、非常に狭く希薄な濃度範囲(0.7~2g/L)にわたって行い、これにより、充填工程においてほぼ同一の平均透過液流動が生じ、このため2回の実行間で同様のプロセス時間が生じる。しかし、シュードバッチ充填戦略は、この場合の差が充填工程を行う濃度範囲が非常に低いために非常に小さい(約0.1時間)としても、フェドバッチ充填方法と比較してプロセス時間を削減する利点をさらにもたらす。
また、原薬品質特性を評価して、シュードバッチ充填戦略が、タンパク質が経るポンプ通過数を増加した結果としてUF/DFにおける非mAbタンパク質の安定性に対して有害な影響を有するかどうかを判定した。図16からわかるように、シュードバッチおよびフェドバッチ方法により、同等量のHMW種が生成された。しかし、2つの方法は、MFIにより特性決定した場合のUF/DFにおいて形成された大型粒子の量および相対的サイズ分布において異なった。図17A~図17Dに見られるように、シュードバッチ充填方法により、フェドバッチ方法よりも小型の粒子(<25μm)が生成されるが、同等量の大型粒子(>50μm)が生成された。この結果は、実施例3~5のmAb Aに見られたことと一致する。シュードバッチ充填方法に固有のさらなる数のポンプ通過によって、小型粒子の形成は増加するが、大型粒子は増加しない。製造バイオプロセスが、UF/DF工程後の最終的製剤化および濾過工程を典型的に含むため、このような粒子は、最終原薬から除去されることが予想される。したがって、シュードバッチ方法により生じる小型粒子形成の増加が、最終原薬の品質に対して有害な影響を有することは予想されない。
本明細書に記載のUF/DFのためのシュードバッチ構成では、フェドバッチ設定(供給タンクおよび保持液容器を使用する)をバッチ様操作(TFF再循環ループにおいて単一容器として作用するように2つの容器を接続する)に転換することによる、フェドバッチ充填と関連する時間ペナルティーを軽減することが可能である。この転換により、ハイブリッドプロセス(例えば、フェドバッチ充填+バッチ濃縮)と関連するプロセス時間の規模依存性も排除されることにより、プロセスが十分に拡張可能となる。加えて、バッチ構成と比較して2倍のポンプ通過が生じる、再循環ループへの供給ポンプの組入れによって、HMW形成および顕微鏡下で可視の粒子数により定量した場合、生成物品質に対して顕著ないかなる有害作用も生じなかった。
高濃度原薬を生成するためのハイブリッドUF/DFプロセスは、バイオ医薬品産業が、薬物送達のために皮下形式に次第に移行するにつれて、必然的にさらに普及するようになるであろう。本明細書に記載のシュードバッチ構成を代わりに使用することにより、フェドバッチ充填と関連する時間ペナルティーを削減し、ハイブリッドプロセスから生じるプロセス時間の規模依存性を排除し、ハイブリッドプロセスと比較して生成物品質を潜在的に改良することができる。まとめると、このような利点により、プロセス処理量および収率が向上するだけでなく、実験室/開発規模から製造規模へのさらに合理化した技術移行のためのUF/DFプロセスの拡張可能性が向上し得る。
前述の特定の態様の記載によって、当業者が当技術分野内の知識を適用することにより種々の適用、例えば、特定の態様に対して、過度な実験の必要なく、本発明の一般的概念から逸脱せずに、容易に修飾および/または適応可能な本発明の一般的性質が、かなり十分に明らかとなる。したがって、このような適応および修飾は、本明細書に示す教示およびガイダンスに基づく、開示の態様の等価物の意味および範囲の内であることを意図する。本明細書の表現または用語は、制限目的のためではなく説明目的のためであり、このため本明細書の用語または表現は、教示およびガイダンスを考慮して当業者により解釈されるものであることを理解すべきである。
本明細書において言及するすべての公表文献、特許および特許出願は、個々の公表文献、特許または特許出願を参照により組み込むことを詳細かつ個別に示す場合と同等に、参照により本明細書に組み込む。
本発明の他の態様は、本明細書に開示する本発明の明細書および実践の考察から当業者に明らかとなる。明細書および実施例は、単なる例示として考えられることを意図するとともに、本発明の実質的範囲および趣旨は、次の特許請求の範囲によって示す。
Claims (70)
- 少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(「保持液」)により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法であって、前記供給タンクが、主要リザーバー(「保持液」)タンクから分離している、方法。
- 少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(「保持液」)により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法であって、前記供給タンクが、主要リザーバー(「保持液」)タンクから分離している、方法。
- 供給タンクが、少なくとも1回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 初期タンパク質混合物および保持液を混合する、請求項3に記載の方法。
- タンパク質混合物および/または保持液をフィルターにより濾過する、請求項3または4に記載の方法。
- 濾過したタンパク質混合物および保持液(「保持液」)を供給タンクに充填する、請求項5に記載の方法。
- 充填を、目的のタンパク質が、少なくとも約1mg/mL、少なくとも約10mg/mL、少なくとも約20mg/mL、少なくとも約30mg/mL、少なくとも約40mg/mL、少なくとも約50mg/mL、少なくとも約60mg/mL、少なくとも約70mg/mL、または少なくとも約80mg/mLに濃縮されるまで継続する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 充填を、目的のタンパク質が、約1mg/mL~80mg/mL、約5mg/mL~70mg/mL、約10mg/mL~60mg/mL、約10mg/mL~50mg/mL、約10mg/mL~40mg/mL、約10mg/mL~30mg/mL、約10mg/mL~20mg/mL、約20mg/mL~70mg/mL、約20mg/mL~60mg/mL、約20mg/mL~50mg/mL、約20mg/mL~40mg/mL、または約20mg/mL~30mg/mLに濃縮されるまで継続する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 保持液の充填を少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも20回、少なくとも30回、少なくとも40回、少なくとも50回、少なくとも60回、少なくとも70回、少なくとも80回、少なくとも90回、少なくとも100回、少なくとも110回、少なくとも120回、少なくとも130回、少なくとも140回、少なくとも150回、少なくとも160回、少なくとも170回、少なくとも180回、少なくとも190回、少なくとも200回、少なくとも210回、少なくとも220回、少なくとも230回、少なくとも240回、少なくとも250回、少なくとも260回、少なくとも270回、少なくとも280回、少なくとも290回、または少なくとも300回繰り返す、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 供給タンクへの保持液の充填を停止することをさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 保持液をリザーバータンクに方向づけることをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法。
- 供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法。
- リザーバータンク弁が、目的のタンパク質が十分に濃縮されるまで閉じている、請求項12または13に記載の方法。
- タンパク質混合物を供給タンクに頻繁に加えることをさらに含む、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質混合物を供給タンクからリザーバータンクへ方向づける、請求項12から15のいずれか一項に記載の方法。
- リザーバータンクをフィルターに接続する、請求項11から16のいずれか一項に記載の方法。
- フィルターが、インライン濾過膜を含む、請求項17に記載の方法。
- インライン濾過膜が、限外濾過膜である、請求項18に記載の方法。
- インライン濾過膜が、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド-ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである、請求項18または請求項19に記載の方法。
- 濾過膜が、約50kD~約5kD、約50kD、約40kD、約30kD、約20kD、約10kDまたは約5kD未満の分子量カットオフ(MWCO)を有する、請求項18から20のいずれか一項に記載の方法。
- MWCOが、約5kD未満である、請求項21に記載の方法。
- 混合物を所望の濾過タンパク質濃度に達するまで流動させる、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 所望の濾過タンパク質濃度が、約10mg/mL~約300mg/mL、例えば、約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL、約110mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL、約140mg/mL、約150mg/mL、約160mg/mL、約170mg/mL、約180mg/mL、約190mg/mL、約200mg/mL、約250mg/mL、または約300mg/mLである、請求項23に記載の方法。
- 所望の濾過タンパク質濃度が、約150mg/mLである、請求項24に記載の方法。
- タンパク質粘度が、約0cP~約200cPである、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質粘度が、約20cP~約60cPである、請求項26に記載の方法。
- 供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比が、約1:2~約10:1、約1:2~約1:1、約1:1~約1:2、約1:1 約1:3、約1:1~約1:4、約1:1~約1:5、約1:1~約1:6、約1:1~約1:7、約1:1~約1:8、約1:1~約1:9、または約1:1~約1:10である、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
- 供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比が、約1:1、約2:1または約5:1である、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質混合物をダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプを使用してリザーバータンクおよび/またはフィルターに方向づける、請求項16から29のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物(「保持液」)による供給タンクの持続的充填の前に、1回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物を供給タンクに充填することをさらに含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 初期タンパク質混合物を約1mg/mL~約30mg/mLの濃度で供給タンクに加える、請求項31に記載の方法。
- 初期タンパク質混合物を約5mg/mLの濃度で供給タンクに加える、請求項32に記載の方法。
- プロセス時間が、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約1%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%または約50%削減される、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
- プロセス時間が、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約40%削減される、請求項34に記載の方法。
- プロセス時間が、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約0.2時間、約0.4時間、約0.5時間、約0.6時間、約0.8時間または約1.0時間削減される、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
- プロセス時間が、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約0.5時間削減される、請求項36に記載の方法。
- 1~2μmの粒子数が、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約10%、約20%、約30%、約40%または約50%減少する、請求項1から37のいずれか一項に記載の方法。
- 5~10μmの粒子数が、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約10%、約20%、約30%、約40%または約50%減少する、請求項1から38のいずれか一項に記載の方法。
- 10~25μmの粒子数が、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約10%、約20%、約30%、約40%または約50%減少する、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質混合物が、抗体、抗体断片、抗原結合断片、融合タンパク質、天然に存在するタンパク質、キメラタンパク質またはこれらの任意の組合せを含む、請求項1から40のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質混合物が、IgM、IgA、IgE、IgDおよびIgGから選択される抗体を含む、請求項41に記載の方法。
- タンパク質混合物が抗体を含み、前記抗体がIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選択されるIgG抗体である、請求項42に記載の方法。
- 抗体が、二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む、請求項41から43のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、三価抗体を含む、請求項41から43のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体または抗体断片が、抗PD-1抗体、抗PD-Ll抗体、抗CTLA4抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗NKG2a抗体、抗ICOS抗体、抗CD137抗体、抗KIR抗体、抗TGFβ抗体、抗IL-10抗体、抗B7-H4抗体、抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗IL-8抗体またはこれらの抗体断片を含む、請求項41に記載の方法。
- タンパク質混合物が、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞培養物に由来する、請求項41から46のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞培養物が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞培養物である、請求項47に記載の方法。
- タンパク質混合物が、バッチ細胞培養物から得られる、請求項1から48のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質混合物が、フェドバッチ細胞培養物から得られる、請求項1から49のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質混合物をバイオリアクターにおいて生成する、請求項1から50のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質混合物を使い捨てバイオリアクターにおいて生成する、請求項51に記載の方法。
- タンパク質混合物が、灌流細胞培養物から得られる、請求項1から48のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質混合物を灌流またはTFF灌流バイオリアクターにおいて生成する、請求項53に記載の方法。
- タンパク質混合物を約1日間~約60日間存続する細胞培養物により生成する、請求項47から54のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質混合物を約25日間存続する細胞培養物により生成する、請求項55に記載の方法。
- タンパク質混合物をローディングバッファーとともに供給タンクに加える、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。
- ローディングバッファーが、アミノ酸、弱酸、弱塩基および/または糖を含む、請求項57に記載の方法。
- タンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む、請求項1から58のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から59のいずれか一項に記載の方法により調製したタンパク質。
- 請求項1から60に記載のタンパク質を含む医薬組成物。
- それを必要とする対象に請求項61に記載の医薬組成物を投与する方法。
- 請求項61に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または症状を治療する方法。
- 供給タンク、
第1の流体経路により前記供給タンクに接続するリザーバータンク、
第2の流体経路により前記リザーバータンクに接続する濾過膜、および
第3の流体経路により前記濾過膜に接続し、第4の流体経路により前記リザーバータンクに接続し、第5の流体経路により前記供給タンクに接続する、三方弁
を含む、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムであって、
前記リザーバータンクが、第1の前記流体経路を介して前記供給タンクから目的の前記タンパク質を含むタンパク質混合物を受領し、
前記濾過膜が、第2の流体経路を介して前記リザーバータンクから目的の前記タンパク質を含む前記タンパク質混合物を受領して、前記タンパク質混合物を濾過し、
前記三方弁が、第3の前記流体経路を介して前記フィルターから保持液を受領して、前記保持液を第4の前記流体経路を介して前記リザーバータンク、または第5の前記流体経路を介して前記供給タンクのいずれかに方向づける、システム。 - 三方弁が、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力未満である場合、保持液をリザーバータンクに方向づけ、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力よりも大きい場合、保持液を供給タンクに方向づける、請求項64に記載のシステム。
- 三方弁が、センサーからのフィードバックに基づいて、保持液をリザーバータンクまたは供給タンクのいずれかに自動的に方向づける、システム内のタンパク質混合物の全容量および/または濃度を判定するように構成されたセンサーをさらに含む、請求項64から65のいずれか一項に記載のシステム。
- 1つまたは複数のダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプをさらに含む、請求項64から66のいずれか一項に記載のシステム。
- フィルターが、インライン濾過膜を含む、請求項64から67のいずれか一項に記載のシステム。
- インライン濾過膜が、限外濾過膜である、請求項68に記載のシステム。
- インライン濾過膜が、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド-ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである、請求項69に記載のシステム。
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