JP2023528204A - 多選択性タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、例えばＣＤ４０及びＦＡＲなどの異なる標的に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む、多選択性タンパク質に関する。加えて、本発明は、このような多選択性タンパク質、医薬組成物をコードする核酸、このような多選択性タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びこのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌などの疾患を処置又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１４日に欧州特許庁に出願された欧州特許出願第２０１７４８４７号、及び２０２０年６月２２日に欧州特許庁に出願された欧州特許出願第２０１８１４９８号の利益及び優先権を主張する。欧州特許出願公開第２０１７４８４７号及び同第２０１８１４９８号の内容は、全ての表、図、及び特許請求の範囲を含む、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、例えばＣＤ４０及びＦＡＰなどの異なる標的に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む、多選択性タンパク質に関する。加えて、本発明は、このような多選択性タンパク質、医薬組成物をコードする核酸、このような多選択性タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びこのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌などの疾患を処置又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。
腫瘍壊死因子受容体（Tumor necrosis factor receptor：ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーＣＤ４０は、重要な共刺激受容体であり、そのリガンド（ＣＤ４０Ｌ）又はアゴニスト抗体によって係合される場合、細胞性及び体液性の適応免疫の開始及び進行を含む広範囲の分子及び細胞プロセスの調節に関与する。例えば、樹状細胞の表面上でのＣＤ４０係合は、それらのサイトカイン生成を促進し、それらの表面上の共刺激分子の発現を誘導し、かつ抗原の提示を促進することが実証されている。全体として、ＣＤ４０シグナル伝達の影響は、樹状細胞が成熟し、Ｔ細胞の活性化及び分化を効果的に誘発するために必要な特性の全てを達成することを「許可」する。Ｂ細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達は、胚中心形成、免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプスイッチング、抗原に対する親和性を増強するためのＩｇの体細胞高頻度変異、最後に長寿命形質細胞及びメモリーＢ細胞の形成を促進する。更に、ＣＤ４０経路は、正常条件及び炎症条件下において、胚中心Ｂ細胞、樹状細胞、及び内皮細胞を含む多くの細胞型の生存に重要であることが示されている。ＣＤ４０シグナル伝達の調節解除は様々な自己免疫疾患において観察されている。合わせて、この広範な機能は、獲得免疫応答の産生のためのＣＤ４０受容体の重要性を強調している。
ＣＤ４０は、最初にＢ細胞上で特徴付けられ、樹状細胞、単球、血小板、及びマクロファージ、並びに筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞、及び内皮細胞などの非造血細胞上にもまた発現される。ＣＤ１５４又はＣＤ４０Ｌとして知られるＣＤ４０のリガンドは、主に活性化Ｔ細胞、並びに活性化Ｂ細胞及び血小板によって発現され、炎症条件下においては、単球細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、及び好塩基球においてもまた誘導される。
ＣＤ４０は自然免疫系及び適応免疫系の両方を活性化することができるため、腫瘍免疫療法の好適な標的として認識されている。いくつかの報告では、ＣＤ４０刺激が樹状細胞成熟によって抗腫瘍免疫応答を増強し得ることが確認されている。ＣＤ４０のアゴニストによる樹状細胞の活性化は、それらの生存、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、及びマクロファージ炎症性タンパク質－１αの分泌の増加をもたらす。加えて、ＣＤ４０活性化は、ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＦＡ－３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６などの共刺激分子の上方制御を誘導し、それぞれ、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の抗原提示、プライミング、及びクロスプライミングを促進する。ＣＤ４０に対するアゴニスト抗体は、前臨床マウス腫瘍モデルにおいて有効であることが証明されている。しかしながら、臨床におけるそれらの使用はいくらかの抗腫瘍有効性を示しているが、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体の臨床開発は、用量制限毒性及び結果として生じる低い有効性によって妨げられている可能性が高い。
したがって、新規のＣＤ４０特異的結合タンパク質、並びに癌を含む疾患の治療及び特徴付けのための処置的及び診断的アプローチが依然として必要であり、ＣＤ４０特異的結合及び活性化に有益である。特に、望ましくない副作用を回避しながらＣＤ４０に効果的に係合し得る新世代のアゴニストが必要とされている。
本明細書で提供される開示に基づいて、当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図される。
Ｅ１．線維芽細胞活性化タンパク質（fibroblast activation protein：ＦＡＰ）に特異的に結合する第１のアンキリン反復ドメインと、ＣＤ４０に特異的に結合する第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換えタンパク質。
Ｅ２．ＣＤ４０に特異的に結合する第３のアンキリン反復ドメインを更に含む、Ｅ１に記載の組換えタンパク質。
Ｅ３．当該アンキリン反復ドメインが、以下の式：（ＦＡＰ結合ドメイン）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（ＣＤ４０結合ドメイン）に従って、Ｎ末端からＣ末端に配置される、Ｅ２に記載の組換えタンパク質。
Ｅ４ 半減期延長部分を更に含む、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ５．当該半減期延長部分が、血清アルブミンに特異的に結合する第４のアンキリン反復ドメインを含む、Ｅ４に記載の組換えタンパク質。
Ｅ６．当該アンキリン反復ドメインが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：以下の式：（血清アルブミン結合ドメイン）－（ＦＡＰ結合ドメイン）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（ＣＤ４０結合ドメイン）に従って配置される、Ｅ５に記載の組換えタンパク質。
Ｅ７．当該ＦＡＰ結合ドメインのいずれか、当該ＣＤ４０結合ドメイン（複数可）、及び当該半減期延長部分のうちいずれかの間にリンカーを更に含む、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８．Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（ＦＡＰ結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）を含む、Ｅ１～Ｅ７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ９．Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（血清アルブミン結合ドメイン）－（リンカー）－（ＦＡＰ結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）を含む、Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１０．当該半減期延長部分が、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、Ｅ４に記載の組換えタンパク質。
Ｅ１１．当該免疫グロブリンドメインが、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４免疫グロブリンのＦｃドメインである、Ｅ１０に記載の組換えタンパク質。
Ｅ１２．当該Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃドメインである、Ｅ１１に記載の組換えタンパク質。
Ｅ１３．当該Ｆｃドメインが、エフェクター機能を低減するための修飾である、Ｅ１２に記載の組換えタンパク質。
Ｅ１４．当該ＦＡＰが、ヒトＦＡＰである、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１５．当該ＣＤ４０が、ヒトＣＤ４０である、Ｅ１～Ｅ１４のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１６．当該血清アルブミンが、ヒト血清アルブミン（human serum albumin：ＨＳＡ）である、Ｅ５～Ｅ１９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１７．当該免疫グロブリン重鎖定常ドメインが、ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインである、Ｅ１０～Ｅ１３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１８．当該組換えタンパク質のＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロテアーゼ活性を、２５％超、２０％超、１５％超、１０％超、又は５％超低下させない、Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１９．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、配列番号２の最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は配列番号２の最後の位置のＡがＮで置換されている、Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ２０．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、Ｅ１９に記載の組換えタンパク質。
Ｅ２１．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、配列番号２の最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は配列番号８の最後の位置のＡがＮで置換されている、Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ２２．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、Ｅ２１に記載の組換えタンパク質。
Ｅ２３．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号９及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ２４．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号９及び２８～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、Ｅ２３に記載の組換えタンパク質。
Ｅ２５．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号９、２８～３１及び３８のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている、Ｅ２３に記載の組換えタンパク質。
Ｅ２６．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２８と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている、Ｅ２５に記載の組換えタンパク質。
Ｅ２７．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号３２～３７のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＬがＡで置換されており、及び／又は最後の位置のＮがＡで置換されている、Ｅ２３に記載の組換えタンパク質。
Ｅ２８．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＬがＡで置換されており、及び／又は最後の位置のＮがＡで置換されている、Ｅ２７に記載の組換えタンパク質。
Ｅ２９．当該ＦＡＰ結合ドメインが、（ｉ）配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む、Ｅ１～Ｅ２８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ３０．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む、Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ３１．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、配列番号３の最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は配列番号３の最後の位置のＡがＮで置換されている、Ｅ１～Ｅ３０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ３２．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ３３．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号１０及び４３～５０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ３０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ３４．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、配列番号１０及び４３～５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ３０及びＥ３３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ３５．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号１０、４３、４４、及び４８～５０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている、Ｅ１～Ｅ３０及びＥ３３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ３６．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号４３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている、Ｅ３５に記載の組換えタンパク質。
Ｅ３７．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号４５～４７のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＬがＡで置換されており、及び／又は最後の位置のＮがＡで置換されている、Ｅ１～Ｅ３０及びＥ３３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ３８．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号４７と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＬがＡで置換されており、及び／又は最後の位置のＮがＡで置換されている、Ｅ３７に記載の組換えタンパク質。
Ｅ３９．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、（ｉ）配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ４０．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む、Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ４１．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、ここで、当該位置番号が、配列番号３の位置と対応する、Ｅ１～Ｅ４０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ４２．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び１４７位にＱを含み、ここで、当該位置番号が、配列番号３の位置と対応する、Ｅ１～Ｅ４１のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ４３．
（ａ）当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端が、任意選択に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、最後から２番目の位置がＬ又はＡであってもよく、最後の位置がＮ又はＡであってもよく、
（ｂ）当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端が、任意選択に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、最後から２番目の位置がＬ又はＡであってもよく、最後の位置がＮ又はＡであってもよい、Ｅ１～Ｅ４２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ４４．
（ａ）当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端が、任意選択に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、最後から２番目の位置がＬ又はＡであってもよく、最後の位置がＮ又はＡであってもよく、
（ｂ）当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端が、任意選択に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、最後から２番目の位置がＬ又はＡであってもよく、最後の位置がＮ又はＡであってもよい、Ｅ４３に記載の組換えタンパク質。
Ｅ４５．
（ａ）当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端が、任意選択に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、最後から２番目の位置がＬ又はＡであってもよく、最後の位置がＮ又はＡであってもよく、
（ｂ）当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端が、任意選択に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、最後から２番目の位置がＬ又はＡであってもよく、最後の位置がＮ又はＡであってもよい、Ｅ４３に記載の組換えタンパク質。
Ｅ４６．
（ａ）当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そのＮ末端が、任意選択に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、最後から２番目の位置がＬ又はＡであってもよく、最後の位置がＮ又はＡであってもよく、
（ｂ）当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そのＮ末端が、任意選択に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、最後から２番目の位置がＬ又はＡであってもよく、最後の位置がＮ又はＡであってもよい、Ｅ４３に記載の組換えタンパク質。
Ｅ４７．当該血清アルブミン結合ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている、Ｅ５～Ｅ９、Ｅ１４～Ｅ１６、及びＥ１８～Ｅ４６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ４８．当該血清アルブミン結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｅ５～Ｅ９、Ｅ１４～Ｅ１６、及びＥ１８～Ｅ４７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ４９．当該血清アルブミン結合ドメインが、配列番号３９～４２のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、配列番号３９～４０のいずれか１つの最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は配列番号３９～４０及び４２のいずれか１つの最後の位置のＡがＮで置換されており、任意選択で、配列番号４１の最後から２番目の位置のＬがＡで置換されており、及び／又は配列番号４１の最後の位置のＮがＡで置換されている、Ｅ５～Ｅ９、Ｅ１４～Ｅ１６、及びＥ１８～Ｅ４６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ５０．当該血清アルブミン結合ドメインが、配列番号３９～４２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、Ｅ５～Ｅ９、Ｅ１４～Ｅ１６、Ｅ１８～Ｅ４５、及びＥ４９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ５１．当該血清アルブミン結合ドメインが、（ｉ）配列番号１及び３９～４１のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、又は（ｉｉ）配列番号４２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む、Ｅ５～Ｅ９、Ｅ１４～Ｅ１６、及びＥ１８～Ｅ５０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ５２．当該血清アルブミン結合ドメインが、配列番号１及び３９～４１のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、又は（ｉｉ）配列番号４２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む、Ｅ５～Ｅ９、Ｅ１４～Ｅ１６、及びＥ１８～Ｅ５１のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ５３．当該血清アルブミン結合ドメインが、（ｉ）配列番号１及び３９～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、又は（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む、Ｅ５～Ｅ９、Ｅ１４～Ｅ１６、及びＥ１８～Ｅ５２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ５４．当該リンカーが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、Ｅ８～Ｅ５３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ５５．当該タンパク質が、正確に４つのアンキリン反復ドメインを含む、Ｅ１～Ｅ５４のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ５６．組換えタンパク質であって、配列番号５又は配列番号６又は配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、配列番号と少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、当該タンパク質が、ＦＡＰ及びＣＤ４０に特異的に結合する、組換えタンパク質。
Ｅ５７．当該組換えタンパク質が、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ５６に記載の組換えタンパク質。
Ｅ５８．当該タンパク質が、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ５６～Ｅ５７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ５９．当該タンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、Ｅ５６～Ｅ５８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ６０．当該タンパク質が、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ５６に記載の組換えタンパク質。
Ｅ６１．当該タンパク質が、配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ５６又はＥ６０に記載の組換えタンパク質。
Ｅ６２．当該タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、Ｅ５６及びＥ６０～Ｅ６１のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ６３．当該ＦＡＰが、ヒトＦＡＰである、Ｅ５６～Ｅ６２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ６４．当該ＣＤ４０が、ヒトＣＤ４０である、Ｅ５６～Ｅ６３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ６５．当該ＦＡＰ結合ドメインが、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１４０ｐＭ、１３０ｐＭ、又は１２０ｐＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１～Ｅ６４のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ６６．当該ＦＡＰ結合ドメインが、１００ｎＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１～Ｅ６５のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ６７．当該ＦＡＰ結合ドメインが、１ｎＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１～Ｅ６６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ６８．当該ＦＡＰ結合ドメインが、１２０ｐＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１～Ｅ６７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ６９．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、又は７５ｎＭ以下のＫＤ値でヒトＣＤ４０に結合する、Ｅ１～Ｅ６８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７０．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、１００ｎＭ以下のＫＤ値でヒトＣＤ４０に結合する、Ｅ１～Ｅ６９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７１．当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、７５ｎＭ以下のＫＤ値でヒトＣＤ４０に結合する、Ｅ１～Ｅ７０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７２．当該血清アルブミン結合ドメインが、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、又は３５ｎＭ以下のＫＤ値を有するヒト血清アルブミンに結合する、Ｅ１～Ｅ７１のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７３．当該血清アルブミン結合ドメインが、１００ｎＭ以下のＫＤ値を有するヒト血清アルブミンに結合する、Ｅ１～Ｅ７２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７４．当該血清アルブミン結合ドメインが、５０ｎＭ以下のＫＤ値を有するヒト血清アルブミンに結合する、Ｅ１～Ｅ７３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７５．当該血清アルブミン結合ドメインが、３５ｎＭ以下のＫＤ値を有するヒト血清アルブミンに結合する、Ｅ１～Ｅ７４のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７６．当該組換えタンパク質が、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、又は３００ｐＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１～Ｅ７５のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７７．当該組換えタンパク質が、１００ｎＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１～Ｅ７６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７８．当該組換えタンパク質が、１ｎＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１～Ｅ７７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ７９．当該組換えタンパク質が、５００ｐＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１～Ｅ７８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８０．当該組換えタンパク質が、３００ｐＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１～Ｅ７９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８１．当該組換えタンパク質が、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１４０ｐＭ、１３０ｐＭ、１２０ｐＭ、１１５ｐＭ、１１０ｐＭ、１０５ｐＭ、又は１００ｐＭ以下のＫＤ値でヒトＣＤ４０に結合する、Ｅ１～Ｅ８０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８２．当該組換えタンパク質が、１００ｎＭ以下のＫＤ値でヒトＣＤ４０に結合する、Ｅ１～Ｅ８１のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８３．当該組換えタンパク質が、１ｎＭ以下のＫＤ値でヒトＣＤ４０に結合する、Ｅ１～Ｅ８２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８４．当該組換えタンパク質が、５００ｐＭ以下のＫＤ値でヒトＣＤ４０に結合する、Ｅ１～Ｅ８３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８５．当該組換えタンパク質が、１００ｐＭ以下のＫＤ値でヒトＣＤ４０に結合する、Ｅ１～Ｅ８４のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８６．当該組換えタンパク質が、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、又は５０ｎＭ以下のＫＤ値でヒト血清アルブミンに結合する、Ｅ１～Ｅ８５のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８７．当該組換えタンパク質が、１００ｎＭ以下のＫＤ値でヒト血清アルブミンに結合する、Ｅ１～Ｅ８６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８８．当該組換えタンパク質が、７５ｎＭ以下のＫＤ値でヒト血清アルブミンに結合する、Ｅ１～Ｅ８７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ８９．当該組換えタンパク質が、５０ｎＭ以下のＫＤ値でヒト血清アルブミンに結合する、Ｅ１～Ｅ８８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ９０．当該ＫＤが、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance：ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で測定される、Ｅ６５～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ９１．当該ＫＤが、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を用いて測定される、Ｅ９０に記載の組換えタンパク質。
Ｅ９２．当該ＫＤが、バイオレイヤー干渉法（bio-layer interferometry：ＢＬＩ）によって測定される、Ｅ６５～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ９３．当該ＫＤが、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ機器を使用して測定される、Ｅ９２に記載の組換えタンパク質。
Ｅ９４．当該組換えタンパク質が、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約６５ｎＭ以下、約５５ｎＭ以下、約４５ｎＭ以下、約３５ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭ、又は約０．１ｎＭ以下、約０．０１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０７ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約５ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約１ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約０．０７ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．１ｎＭ～約０．９ｎＭ、約０．１ｎＭ～約０．８５ｎＭ、約０．１８ｎＭ～約０．８５ｎＭの半数効果濃度（ＥＣ50）を有する、Ｅ１～Ｅ９３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ９５．当該組換えタンパク質が、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、Ｅ１～Ｅ９４のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ９６．当該組換えタンパク質が、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約１ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、Ｅ１～Ｅ９５のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ９７．当該組換えタンパク質が、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約０．１ｎＭ～約１ｎＭ、好ましくは約０．１８ｎＭ～約０．８５ｎＭのＥＣ５０を有する、Ｅ１～Ｅ９６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ９８．当該組換えタンパク質が、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ、好ましくは約０．０４ｎＭ～約０．０７ｎＭのＥＣ５０を有する、Ｅ１～Ｅ９７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ９９．当該Ｂ細胞活性化アッセイが、ヒトＢ細胞活性化アッセイである、Ｅ９４～Ｅ９８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１００．当該ＥＣ50が、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．１．２）を用いて測定される、Ｅ９４～Ｅ９９のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１０１．組換えタンパク質であって、
血清アルブミンに特異的に結合する第１のアンキリン反復ドメイン、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する第２のアンキリン反復ドメイン、ＣＤ４０に特異的に結合する第３のアンキリン反復ドメイン、及びＣＤ４０に特異的に結合する第４のアンキリン反復ドメインを含み、
ここで、当該アンキリン反復ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下：（血清アルブミン結合ドメイン）－（ＦＡＰ結合ドメイン）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（ＣＤ４０結合ドメイン）に従って配置される、組換えタンパク質。
Ｅ１０２．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１００ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下、より好ましくは１２０ｐＭ以下のＫD値でヒトＦＡＰに結合する、Ｅ１０１に記載の組換えタンパク質。
Ｅ１０３．当該ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０１又はＥ１０２に記載の組換えタンパク質。
Ｅ１０４．当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１００ｎＭ以下、好ましくは７５ｎＭ以下のＫD値でヒトＣＤ４０に結合する、Ｅ１０１～Ｅ１０３のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１０５．当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、ここで、当該位置番号が、配列番号３の位置と対応し、好ましくは当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び１４７位にＱを含み、当該位置番号が、配列番号３の位置と対応する、Ｅ１０１～Ｅ１０４のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１０６．当該ＣＤ４０結合ドメインの各々が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０１～Ｅ１０５のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１０７．当該血清アルブミン結合ドメインが、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは３５ｎＭ以下のＫD値でヒト血清アルブミンに結合する、Ｅ１０１～Ｅ１０６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１０８．血清アルブミンドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０１～Ｅ１０７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１０９．Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（血清アルブミン結合ドメイン）－（リンカー）－（ＦＡＰ結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）を含み、ここで、当該リンカーが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０１～Ｅ１０８のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１１０．当該タンパク質が、正確に４つのアンキリン反復ドメインを含む、Ｅ１０１～Ｅ１１０のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１１１．配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
Ｅ１１２．配列番号５のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
Ｅ１１３．配列番号６のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
Ｅ１１４．配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む組換えタンパク質であって、１００ｎＭ以下のＫD値でヒトＦＡＰ、ヒトＣＤ４０、及びヒト血清アルブミンに結合する、組換えタンパク質。
Ｅ１１５．当該タンパク質が、ＣＤ４０、ＦＡＰ、及び血清アルブミンに、同時に結合することができる、Ｅ５～Ｅ１１４のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１１６．当該タンパク質が、インビトロヒトＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約０．１ｎＭ～約５ｎＭの半数効果濃度（ＥＣ５０）を有する、Ｅ１～Ｅ１１５のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１１７．ＦＡＰへの当該タンパク質の結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％より大きく阻害しない、Ｅ１～Ｅ１１６のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１１７ａ．当該組換えタンパク質が、ＣＤ４０受容体のＮ末端システインリッチドメイン１（ＣＲＤ１）（配列番号５１のアミノ酸２３～５９）に特異的に結合する、Ｅ１～Ｅ１１７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１１８．Ｅ１～Ｅ１１７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、又はＥ１～Ｅ１１７のいずれか１つに定義されるアンキリン反復ドメインをコードする核酸。
Ｅ１１９．配列番号５８のヌクレオチド配列を含む、Ｅ１１８に記載の核酸。
Ｅ１２０．配列番号５８のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
Ｅ１２１．配列番号５８の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
Ｅ１２２．非常にストリンジェントな条件下において配列番号５８のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
Ｅ１２３．Ｅ１１８又はＥ１１９に記載の核酸を含む、ベクター。
Ｅ１２４．Ｅ１１８又はＥ１１９に記載の核酸を含む、宿主細胞。
Ｅ１２５．Ｅ１２３のベクターを含む、宿主細胞。
Ｅ１２６．当該細胞が、細菌細胞である、Ｅ１２４又はＥ１２５に記載の宿主細胞。
Ｅ１２７．当該宿主細胞が、大腸菌である、Ｅ１２４～Ｅ１２６のいずれか１つに記載の宿主細胞。
Ｅ１２８．当該細胞が、真核細胞である、Ｅ１２４又はＥ１２５に記載の宿主細胞。
Ｅ１２９．当該組換えタンパク質が発現される条件下において、Ｅ１２４～Ｅ１２８のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｅ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質を生成する方法。
Ｅ１３０．当該組換えタンパク質を単離することを更に含む、Ｅ１２９に記載の方法。
Ｅ１３１．Ｅ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質又はＥ１１８若しくはＥ１１９記載の核酸と、任意選択的には薬学的に許容される担体又は賦形剤と、を含む、医薬組成物。
Ｅ１３２．ヒトを含む哺乳動物におけるＣＤ４０発現細胞でのＣＤ４０の局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物へとＥ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質を投与するステップ、Ｅ１１８若しくはＥ１１９に記載の核酸、又はＥ１３１に記載の医薬組成物を含む、方法。
Ｅ１３３．当該ＣＤ４０発現細胞が、腫瘍、好ましくは固形腫瘍に位置する、Ｅ１３２に記載の方法。
Ｅ１３４．当該腫瘍が、ＦＡＰを発現する細胞を含む、Ｅ１３３に記載の方法。
Ｅ１３５．医学的状態を処置する方法であって、医学的状態を処置する方法を必要とする対象に、治療有効量のＥ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、Ｅ１１８若しくはＥ１１９に記載の核酸、又はＥ１３１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
Ｅ１３６．当該対象がヒトである、Ｅ１３４に記載の方法。
Ｅ１３７．当該医学的状態が、癌である、Ｅ１３４又はＥ１３５に記載の方法。
Ｅ１３８．当該癌が、固形腫瘍である、Ｅ１３６に記載の方法。
Ｅ１３９．当該癌が、ＦＡＰを発現する細胞を含む、Ｅ１３６又はＥ１３７に記載の方法。
Ｅ１４０．当該癌が、脳癌、膀胱癌、乳癌、明細胞腎癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、胃癌、頭頚部癌、頭頸部扁平上皮癌、***癌、口腔癌、肝臓癌、子宮頸部癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非黒色腫皮膚癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、肉腫、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頚部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、三重陰性乳癌、又は甲状腺癌である、Ｅ１３７～Ｅ１３９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４１．当該癌が、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、癌腫、軟骨肉腫、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞性腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎腫瘍、神経芽腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫（ＮＲＳＴＳ）、骨肉腫、傍脊柱肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、又はウィルムス腫瘍である、Ｅ１３７～Ｅ１４０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４２．当該癌が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、Ｅ１３７に記載の方法。
Ｅ１４３．癌が、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、又は小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である、Ｅ１３７に記載の方法。
Ｅ１４４．当該組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物が、静脈内投与される、Ｅ１３２～Ｅ１４３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４５．当該組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物が、皮下投与される、Ｅ１３２～Ｅ１４４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４６．当該組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物が、週に約２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、月に２回、月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、又は４ヶ月に１回投与される、Ｅ１３２～Ｅ１４５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４７．薬剤として使用するための、Ｅ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、Ｅ１１８若しくはＥ１１９に記載の核酸、又はＥ１３１に記載の医薬組成物。
Ｅ１４８．対象における医学的状態の処置に使用するための、Ｅ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、又はＥ１１８若しくはＥ１１９に記載の核酸、又はＥ１３１に記載の医薬組成物。
Ｅ１４９．当該医学的状態が、癌である、Ｅ１４８に記載の使用のための組換えタンパク質。
Ｅ１５０．対象における癌の処置のための薬剤の製造における、Ｅ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、Ｅ１１８若しくはＥ１１９に記載の核酸、又はＥ１３１に記載の医薬組成物の使用。
Ｅ１５１．対象における医学的状態を処置するための、Ｅ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、Ｅ１１８若しくはＥ１１９に記載の核酸、又はＥ１３１に記載の医薬組成物の使用。
Ｅ１５２．当該医学的状態が、癌である、Ｅ１５１に記載の方法。
Ｅ１５３．容器と、Ｅ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質、又はＥ１１８若しくはＥ１１９に記載の核酸、又はＥ１３１に記載の医薬組成物を備える容器内の組成物と、処置を必要とする患者を処置するための治療有効量の組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物を投与するための指示書を収容する添付文書と、を備える、キット。
Ｅ１５４．ヒトを含む哺乳動物における抗腫瘍免疫記憶を誘導する方法であって、当該哺乳動物へとＥ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質を投与するステップ、Ｅ１１８若しくはＥ１１９に記載の核酸、又はＥ１３１に記載の医薬組成物を含む、方法。
Ｅ１５５．当該免疫記憶が、ＦＡＰ関連抗原に限定されない、Ｅ１５４に記載の方法。
Ｅ１５６．当該組換えタンパク質が、ヒトを含む哺乳動物での腫瘍における優先的な局在化及び／又は蓄積が可能である、Ｅ１～Ｅ１１７及びＥ１２０～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１５７．当該腫瘍が、ＦＡＰを発現する細胞を含む、Ｅ１５６に記載の組換えタンパク質。
Ｅ１５８．当該組換えタンパク質が、ヒトを含む哺乳動物において抗腫瘍免疫記憶を誘導することが可能である、Ｅ１～Ｅ１１７、Ｅ１２０～Ｅ１２２、及びＥ１５６～Ｅ１５７のいずれか１つに記載の組換えタンパク質。
Ｅ１５９．当該免疫記憶が、ＦＡＰ関連抗原に限定されない、Ｅ１５８に記載の組換えタンパク質。
本明細書のセクション見出しの使用は、単に読むことの便宜のためであり、限定することを意図するものではない。文書全体は、統一された開示と見なされることを意図しており、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。
インビトロＢ細胞活性化アッセイを示すイラスト。アッセイは、精製された初代ヒトＢ細胞及びＦＡＰ発現（＋ＦＡＰ）又は非ＦＡＰ発現（－ＦＡＰ）ＣＨＯ細胞を用いて行った。 ＭＦＩと、及びＣＤ８６陽性細胞との割合を測定するために使用されるゲーティング戦略の概要。以下の設定を使用した：ＦＳＣ：２００；ＳＳＣ：４００；取得：２００ｕＬ／分、１００．０００イベント。略語：ＦＭＯ＝蛍光マイナス１、ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱、ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積（Forward scatter area）、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱高さ。 ＭＦＩと、及びＣＤ８６陽性細胞との割合を測定するために使用されるゲーティング戦略の概要。以下の設定を使用した：ＦＳＣ：２００；ＳＳＣ：４００；取得：２００ｕＬ／分、１００．０００イベント。略語：ＦＭＯ＝蛍光マイナス１、ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱、ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積（Forward scatter area）、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱高さ。 ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）は、二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０アンキリン反復結合タンパク質の効力及び有効性を損なう。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞（黒塗り記号）の存在下において共培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ０８７（下向きの三角形）、ＳＭＡ０９５（菱形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、６００μＭのＨＳＡの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（mean fluorescence intensity：ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）は、二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０アンキリン反復結合タンパク質の効力及び有効性を損なう。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞（黒塗り記号）の存在下において共培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ０８７（下向きの三角形）、ＳＭＡ０９５（菱形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、６００μＭのＨＳＡの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（mean fluorescence intensity：ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 ＣＤ４０二価性は、二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０アンキリン反復結合タンパク質の効力及び有効性を強く増加させる。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ１０４（下向きの三角形）、ＳＭＡ１０５（菱形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、ＨＳＡの非存在下におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 ＣＤ４０二価性はＨＳＡ結合ドメインによって誘導される阻害効果を救済する。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ１０４（下向きの三角形）、ＳＭＡ０９１（丸）、ＳＭＡ０９９（菱形）、ＡＳ５７９（六角形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、ＨＳＡの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 ＣＤ４０二価性はＨＳＡ結合ドメインによって誘導される阻害効果を救済する。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ１０４（下向きの三角形）、ＳＭＡ０９１（丸）、ＳＭＡ０９９（菱形）、ＡＳ５７９（六角形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、ＨＳＡの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography：ＳＥＣ）及び多角度光散乱（multiangle light scattering：ＭＡＬＳ）による、タンパク質＃５（ＳＭＡ１３６とも称される）の分析。グラフは経時的なモル質量としてＳＥＣプロファイルを示す。タンパク質＃５の決定された分子量が示される。 ヒトＣＤ４０（Ａ）、ヒトＦＡＰ（Ｂ）、及びヒト血清アルブミン（Ｃ）に対するタンパク質＃５（ＳＭＡ１３６とも称される）の結合を示す、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレース。決定されたＫD値が示される。 ｈＣＤ４０、ｈＦＡＰ、及びＨＳＡへのタンパク質＃５の同時結合を示す、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレース。縦線（１、２、及び３）は３回の注入を示す：（１）固定化されたｂｉｏ－ｈＣＤ４０へのタンパク質＃５の結合；（２）ｂｉｏ－ｈＣＤ４０／タンパク質＃５複合体へのｈＦＡＰ（菱形◆、三角形▲、及び丸●の記号）又はタンパク質＃５（対照；クロス×の記号）の結合；（３）ｂｉｏ－ｈＣＤ４０／タンパク質＃５／ｈＦＡＰ複合体へのＨＳＡ（菱形◆、三角形▲の記号）又はｈＦＡＰ（対照；丸●の記号）の結合、その後の６００秒間の解離期。注入スキームを、同じ記号を用いて表８に示す。ｈＣＤ４０／タンパク質＃５／ｈＦＡＰ／ＨＳＡの同時結合を、２つの異なるレーン（菱形及び三角形の記号）で二重に測定する。 タンパク質＃５は、インビトロでＣＤ４０を介してヒトＢ細胞を活性化する。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において培養し、漸増濃度のタンパク質＃５（丸の記号）及び抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形の記号）により処置した。ヒトＢ細胞の活性化を、ＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御（平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されたデータは１３個の独立した実験を表す。エラーバーは±ＳＥＭを示す。描かれた表は、タンパク質＃５（左列）及び抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（右列）についてのＥＣ５０及び有効性値を示す。 タンパク質＃５は、インビトロでＣＤ４０を介してヒトＢ細胞を活性化する。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において培養し、漸増濃度のタンパク質＃５（丸の記号）及び抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形の記号）により処置した。ヒトＢ細胞の活性化を、ＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御（平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されたデータは１３個の独立した実験を表す。エラーバーは±ＳＥＭを示す。描かれた表は、タンパク質＃５（左列）及び抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（右列）についてのＥＣ５０及び有効性値を示す。 インビトロでのタンパク質＃５によるヒトＢ細胞の活性化は、ＦＡＰ依存的である。データは、タンパク質＃５が、インビトロでＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の非存在下においてヒトＢ細胞でＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御を誘導しないことを示す。実験及びデータプロットを、図９に記載されるように、すなわち、タンパク質＃５（丸の記号）及び抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形の記号）を用いて行ったが、ＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において行った。示されたデータは１３個の独立した実験を表す。エラーバーは±ＳＥＭを示す。示された表は、抗ＣＤ４０ ｍＡｂのみについてのＥＣ５０及び有効性値を示す。 インビトロでのタンパク質＃５によるヒトＢ細胞の活性化は、ＦＡＰ依存的である。データは、タンパク質＃５が、インビトロでＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の非存在下においてヒトＢ細胞でＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御を誘導しないことを示す。実験及びデータプロットを、図９に記載されるように、すなわち、タンパク質＃５（丸の記号）及び抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形の記号）を用いて行ったが、ＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において行った。示されたデータは１３個の独立した実験を表す。エラーバーは±ＳＥＭを示す。示された表は、抗ＣＤ４０ ｍＡｂのみについてのＥＣ５０及び有効性値を示す。 インビトロ分化ＭＤＤＣ及び照射されたＦＡＰ発現（＋ＦＡＰ）ＣＨＯ細胞又は非ＦＡＰ発現（－ＦＡＰ）ＣＨＯ細胞を用いる、ヒト単球由来樹状細胞（monocyte-derived dendritic cell：ＭＤＤＣ）活性化アッセイの概略図。 インビボでの抗腫瘍有効性研究の実験設計の概略図。マウスへＭＣ３８－ＦＡＰ結腸癌細胞を０日目に皮下接種した。マウスを、それぞれの研究について図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、腫瘍サイズ及び日程に基づいて処置群へ無作為化した。異なるスケジュールを用いた４つの異なる研究を行った：（Ａ）早期の時点での終了：マウスを最初の処置から４日後に屠殺し、腫瘍をＦＡＣＳ分析によって分析した（研究ＰＤ１０３３及びＰＤ１０３８）；（Ｂ）後期の時点での終了：最初の処置から１０～１１日後にマウスを安楽死させ、抗腫瘍有効性評価のために腫瘍サイズを経時的に測定し、終期にＦＡＣＳ分析によって腫瘍を調査した（研究ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３５）。マウスを、指示された時点で、ＡＳ５９８、ＡＳ６０８、又は抗ＣＤ４０抗体によりｉ．ｐ．処置した。 インビボでの抗腫瘍有効性研究の実験設計の概略図。マウスへＭＣ３８－ＦＡＰ結腸癌細胞を０日目に皮下接種した。マウスを、それぞれの研究について図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、腫瘍サイズ及び日程に基づいて処置群へ無作為化した。異なるスケジュールを用いた４つの異なる研究を行った：（Ａ）早期の時点での終了：マウスを最初の処置から４日後に屠殺し、腫瘍をＦＡＣＳ分析によって分析した（研究ＰＤ１０３３及びＰＤ１０３８）；（Ｂ）後期の時点での終了：最初の処置から１０～１１日後にマウスを安楽死させ、抗腫瘍有効性評価のために腫瘍サイズを経時的に測定し、終期にＦＡＣＳ分析によって腫瘍を調査した（研究ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３５）。マウスを、指示された時点で、ＡＳ５９８、ＡＳ６０８、又は抗ＣＤ４０抗体によりｉ．ｐ．処置した。 抗腫瘍有効性研究中のマウス体重。マウスを図１２に記載されるように処置した。研究ＰＤ１０３２（Ａ）及び研究ＰＤ１０３５（Ｂ）について、処置群当たりの平均体重（±ＳＥＭ、ｎ＝１０）を示す。点線は無作為化の時点及び処置の開始を示す。統計分析は、ビヒクルと多重比較して、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓを用いて行った。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１***ｐ＜０．００１の場合、結果を有意とみなした。 抗腫瘍有効性研究中の平均腫瘍増殖体積。マウスを図１２に記載されるように処置し、腫瘍体積を３～４日毎に測定した。研究ＰＤ１０３２（Ａ）及び研究ＰＤ１０３５（Ｂ）について、処置群当たりの平均腫瘍体積（±ＳＥＭ、ｎ＝１０）を示す。点線は無作為化の時点及び処置の開始を示す。矢印は処置の時点を示す。Ｋｒｕｓｋａｌｌ－Ｗａｌｌｉｓを用いて、ビヒクルと、又は終了時の陰性対照ＡＳ６０８（括弧内）と多重比較して統計分析を行った。**ｐ＜０．０１***ｐ＜０．００１****ｐ＜０．０００１の場合、結果を有意とみなした。 様々なＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質の存在下における平均ＦＡＰ活性。組換えヒトＦＡＰによる基質Ｚ－ＧＬＹ－ＰＲＯ－ＡＭＣの蛍光生成物への変換を、種々の組換えタンパク質の存在下又は非存在下において測定した。９５分間のインキュベーション後のＦＡＰ活性を示す。試験分子の非存在下におけるＦＡＰ活性（第１の対照：ｈＦＡＰ及び基質）と比較して、ＦＡＰ結合ドメインを含有する試験された全ての組換えタンパク質（分子１～４）は、ＦＡＰ酵素活性に対する阻害効果を何ら示さなかった。ＦＡＰ活性の部分的な阻害が分子番号５について認められた（アッセイ対照として使用された）。平均ＦＡＰ活性及び標準偏差を四重項測定から示す。 （Ａ）インジウム－１１１標識タンパク質＃７を注入した９６時間後の、ＭＣ３８－ＦＡＰ担腫瘍マウスの代表的なＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像。正規化された強度設定を用いて産生された最大値投影（Maximum intensity projection：ＭＩＰ）を示す。標識タンパク質＃７は、腫瘍に局在化し、優先的に蓄積した。（Ｂ）注入２４時間後のＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍における免疫組織化学（immunohistochemistry：ＩＨＣ）によるタンパク質＃７（上の画像）又は対照ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質（下の画像）の検出。サイズバーを画像の右下の隅に示す。（Ｃ）インジウム－１１１標識ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子の組織分布の時間経過対照ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子（実線のバー）及びタンパク質＃７（縞模様のバー）の組織分布を、示された時点で腫瘍（左のグラフ）及び筋肉（右のグラフ）において分析した。データは、組織のグラム当たりＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子の注入用量の割合（％ＩＤ／ｇ）で得られ、平均±ＳＤとして表される。各時点当たりマウスＮ＝４匹。 （Ａ）インビボでの抗腫瘍有効性研究の実験設計の概略図。（Ｂ）抗腫瘍有効性研究中の平均腫瘍増殖体積。マウスを処置し、腫瘍体積を図１７Ａ及び実施例９に記載のように測定した。処置群当たりの平均腫瘍体積（±ＳＥＭ、ｎ＝１０）を、ビヒクル（三角形の記号）、ＡＳ５９８（丸の記号）、及び抗ＣＤ４０抗体（正方形の記号）について示す。矢印は処置の開始を示す。 抗腫瘍有効性研究における長期効果。ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍を保有するマウスを、実施例１０に記載されるようにビヒクル（三角形の記号）、ＡＳ５９８（正方形の記号）、及びＡＳ６０８（陰性対照）（丸の記号）により処置し、腫瘍体積を３～４日毎に測定した。処置群当たりの平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）を（Ａ）に示し、カプラン・マイヤー生存曲線を（Ｂ）に示す。矢印は治療時点を表す。 抗腫瘍免疫記憶の誘導。（Ａ）図１８Ａに示される実験をより長い期間にわたって追跡し、ビヒクル（上塗りの上向き三角形）、ＡＳ５９８（上塗りの丸）、及びＡＳ６０８（陰性対照）（上塗りの下向き三角上塗りの）により処置されるＭＣ３８－ＦＡＰ担腫瘍マウスについて示される平均腫瘍増殖曲線を伴った。短い矢印は処置時点を表す。約１２０日目に、ＡＳ５９８で以前に処置した腫瘍なしマウスへ、ＭＣ３８－ＷＴ（下向きの実線の三角形）又はＭＣ３８－ＦＡＰ（上向きの実線の三角形）腫瘍細胞を再チャレンジし、２００日目までモニターした。群当たり８匹のマウスの平均腫瘍増殖曲線を示す。（Ｂ）ナイーブな対照マウスに、ＭＣ３８－ＷＴ（下向きの三角形）又はＭＣ３８－ＦＡＰ（上向きの三角形）腫瘍細胞を約１２０日間チャレンジした。群当たり５匹のマウスの平均腫瘍増殖曲線を示す。 毒性評価。（Ａ）ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍を保有するマウスを、ビヒクル（ｎ＝１０）（上向きの三角形）、ＡＳ６０８（陰性対照）（ｎ＝５）（下向きの三角形）、ＡＳ５９８（タンパク質＃７）（ｎ＝１０）（丸）、又は抗ｍＣＤ４０抗体（ｎ＝１０）（正方形）で１回処置し、２４時間後に血清サイトカインを測定した。２つの独立した実験から試料を回収し、一緒に分析した。（Ｂ）ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍を保有するマウスを、ビヒクル（上向きの三角形）、ＡＳ６０８（陰性対照）（下向きの三角形）、ＡＳ５９８（タンパク質＃７）（丸）、又は抗ｍＣＤ４０抗体（正方形）で１回処置し（群当たりマウス５匹）、２４時間後に血清アスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransferase：ＡＳＴ）及びアラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase：ＡＬＴ）を測定した。２つの独立した実験から試料を回収し、一緒に分析した。（Ｃ）ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍を保有するマウスを、ビヒクル、ＡＳ６０８（陰性対照）（図示せず）、ＡＳ５９８（タンパク質＃７）、又は抗ｍＣＤ４０抗体（ｎ＝５～１０）で１回処置し、２４時間後、肝臓を採取し、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって組織損傷について分析した。異なる処置の代表的な写真を示す。ＮＥＣ、壊死；ＩＣＩ、免疫細胞浸潤。サイズバーは写真の右下の角に示す。 配列番号３のアミノ酸配列を持つ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質と複合体を形成したヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５（ｈＣＤ４０）のＸ線結晶学の構造解析による構造決定。
１．概要
ＦＡＰ及びＣＤ４０に対する結合特異性を有する、設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質が、本明細書に開示される。結合タンパク質をコードする核酸、結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及び結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を使用する方法も開示される。一態様では、本開示の材料及び方法は、腫瘍関連間質におけるＦＡＰの発現を利用し、例えば、腫瘍におけるＣＤ４０発現細胞の特異的標的化及びそれらのＣＤ４０発現細胞におけるＣＤ４０の選択的活性化を可能にする。
ＣＤ４０アゴニスト抗体は前臨床マウス腫瘍モデルにおいて有効性を実証しており、臨床におけるそれらの使用はまた、いくらかの抗腫瘍有効性を示している。しかしながら、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体の臨床開発は、用量制限毒性及び結果として生じる低い有効性によって妨げられている可能性が高い。
本明細書に記載の多選択性組換えタンパク質は、ＣＤ４０の癌標的媒介及び腫瘍局在クラスター化を促進し、それによって、以前の治療的アプローチに関連する課題に対処する。自然環境では、ＣＤ４０のクラスター化は、ある特定の細胞、例えば活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上の膜分子として発現される三量体ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）に結合することによって達成される。例えばＣＤ４０Ｌによって標的化される細胞の細胞膜におけるＣＤ４０クラスター化は、そのシグナル伝達経路の活性化のための前提条件である。本明細書に開示される本発明の多選択性組換えタンパク質は、このクラスター化効果を利用し、ＣＤ４０の活性化は、腫瘍抗原ＦＡＰの発現に関連する。
線維芽細胞活性化タンパク質αＦＡＰ（セプラーゼとしても知られる）は、癌関連線維芽細胞によって多くの固形腫瘍の間質において豊富に発現されるＩＩ型膜結合糖タンパク質である。ＦＡＰは、肺、結腸直腸、膀胱、卵巣及び乳癌を含む、上皮悪性腫瘍（原発性及び転移性）の９０％超の反応性間質線維芽細胞において、並びに骨及び軟部組織肉腫の悪性間葉系細胞において選択的に発現されるが、正常な成体組織には一般に存在しない（（Ｂｒｅｎｎｅｎら、「Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．」、第１１：第２５７～２６６頁（２０１２年）；Ｇａｒｉｎ－Ｃｈｅｓａら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」、第８７巻第７２３５～７２３９頁（１９９０年）；Ｒｅｔｔｉｇら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」、第５３：３３２７－３３３５（１９９３）；Ｒｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，３１１０－３ １１４（１９８８））。ＦＡＰはまた、特定の悪性腫瘍細胞上で発現される。
特定の理論に拘束されることを望まないが、腫瘍抗原ＦＡＰ（正常、非悪性、非癌関連細胞）の非存在下において、ＣＤ４０の最小限のクラスター化が起こり、免疫活性化が制限されるであろう。対照的に、癌関連線維芽細胞においてＦＡＰは高度に発現され、したがって、ＦＡＰ結合を介して、本発明の多選択性タンパク質は、例えばＢ細胞及び抗原提示細胞などのＣＤ４０発現免疫細胞におけるＣＤ４０クラスター化及び活性化を促進する。この戦略の利点は、以下の２つ、つまり、活性化はＦＡＰを発現する組織にほぼ限定されるため、全身毒性が制限されるはずであること、及び、腫瘍媒介性ＣＤ４０クラスター化は強力なアゴニスト作用を駆動するはずであることである。
２．定義
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質並びに核酸化学及びハイブリダイゼーションの技術に関連して使用される命名法は、技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
「含む（comprising）」、「有する」、「含む（including）」、及び「含有する（containing）」という用語は、特に明記しない限り、非限定的用語として解釈されるべきである。本発明の態様で、ある特徴について、「～を含む」と説明されている場合、実施形態では、その特徴について「～からなる」又は「～から本質的になる」も考えられる。本明細書で提供されるありとあらゆる例、又は例示を意味する文言（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図するものであり、別段の請求がない限り、本開示の範囲に制限を課さない。本明細書におけるいかなる文言も、特許請求されていない任意の要素を本開示の実施に不可欠なものとして示すものとして解釈されるべきではない。実施されている例以外、又は別段の指示がない限り、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語が当業者によって解釈されるように、その用語によって修飾されると理解されるべきである。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値及び各エンドポイントを個々に指す簡略法として役立つことを単に意図しており、各別個の値及びエンドポイントは、本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して結合した、複数の、すなわち２個以上のアミノ酸からなる１つ以上の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。
用語「タンパク質」は、ポリペプチドを含む分子であって、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内で及び／又は複数のポリペプチド鎖間で二次、三次、及び／又は四次構造を形成することにより、明確な三次元配置を有する、又は、とることができる、分子を指す。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合していてもよく、例えば、２つのポリペプチド鎖間のジスルフィド結合により、結合していてもよい。二次及び／又は三次構造を形成することにより、明確な三次元配置を個々に有する、又は、とることができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
特許出願第２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒら、２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６）は、リピートタンパク質、反復ドメイン及び反復モジュールの特徴、技術、及び応用の一般的な説明を含む。
用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインはまた、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールも含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９－５０３，２００３、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ，、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１２／０６９６５５号）、高ロイシン反復ドメイン（交際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７－５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の例から当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。
用語「アンキリン反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続するアンキリン反復モジュールを含む反復ドメインを指し、当該アンキリン反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。
用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じるリピートタンパク質の反復単位に由来する、設計された反復ドメインの反復されたアミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在するリピートタンパク質のファミリー又はサブファミリー、好ましくは、アンキリンリピートタンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。したがって、用語「アンキリン反復モジュール」は、元々天然に存在するアンキリンリピートタンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリンリピートタンパク質は、当業者に周知である。例えば、国際特許公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号、同第ＷＯ２０１０／０６０７４８号、同第ＷＯ２０１１／１３５０６７号、同第ＷＯ２０１２／０６９６５４号、同第ＷＯ２０１２／０６９６５５号、同第ＷＯ２０１４／００１４４２号、同第ＷＯ２０１４／１９１５７４号、同第ＷＯ２０１４／０８３２０８号、同第ＷＯ２０１６／１５６５９６号、及び同第ＷＯ２０１８／０５４９７１号を参照されたい。
アンキリン反復ドメインは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、任意選択で半減期延長ドメインと共に、本開示によるより大きなアンキリン反復タンパク質にモジュール式に組み立てられてもよい（例えば、Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６，２００３、国際特許公開第ＷＯ２０１２／０６９６５５、同第ＷＯ２００２／０２０５６５を参照されたい）。
設計されたリピートタンパク質、設計された反復ドメイン、設計されたアンキリン反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計された」は、そのようなリピートタンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工的であり、自然界では生じないという特性を指す。
組換えタンパク質、組換え結合タンパク質、組換えポリペプチドなどにおいて使用される用語「組換え」は、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって生産されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって生産される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを生産することができる。それに応じて生産されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。
本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、この結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。
用語「結合ドメイン」は、標的に対する結合特異性を呈するタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、この結合ドメインは、組換え結合ドメインである。
用語「標的」は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又はそのような個々の分子のいずれかの部分を含むいずれかの他の天然に存在する分子などの個々の分子、或いはそのような分子の２個以上からなる複合体、或いは細胞全体の試料又は組織試料、或いはいずれかの非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド若しくはタンパク質である。例えば、配列番号３９～４２からなる設計されたアンキリン反復ドメインの各々の標的は、血清アルブミンである。
用語「標的に対する結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合すること」、「高い特異性で標的に結合すること」、「標的に特異的である」、又は「標的特異性」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、代替の標的（例えば、細胞又は物質）と反応又は結合するよりも、特定の標的（例えば、細胞又は物質）と、より頻繁に、より迅速に、より長い期間で、及び／又はより高い親和性で反応又は結合することを意味する。例えば、ＦＡＰに特異的に結合する結合ドメインは、ＰＢＳにおいて、大腸菌マルトース結合タンパク質（maltose binding protein：ＭＢＰ）などの無関係なタンパク質に結合するよりも、低い解離定数でＦＡＰに結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）結合ドメインとして定義される場合がある。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「ＫD」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数よりも、少なくとも１０2倍、より好ましくは少なくとも１０3倍、更により好ましくは少なくとも１０4倍、又は最も好ましくは少なくとも１０5倍低い。タンパク質－タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用のＫDの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、ＫD値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。また、この定義を読むことにより、例えば、第１の標的に特異的に結合するアンキリン反復ドメインが、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的結合」は、排他的な結合を必ずしも必要としない（しかし、それを含むことができる）。一般に、アンキリン反復ドメインは、指定されたアッセイ条件下で特定の標的分子に優先的に結合し、試験試料中に存在する他の成分に有意な量で結合しない。
様々なアッセイ形式を使用して、目的の分子に特異的に結合するアンキリン反復ドメインを選択又は特徴付けることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（カリフォルニア州メンローパーク、ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）及びウエスタンブロット分析は、標的と特異的に反応するアンキリン反復ドメインを同定するために使用され得る多くのアッセイの一部である。典型的には、特異的又は選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナル又はノイズ、より典型的には１０倍超のバックグラウンドである。更により具体的には、アンキリン反復ドメインは、平衡解離定数（ＫD）値が＜１μＭ、例えば、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１００ｐＭ、＜１０ｐＭ、又は＜１ｐＭである場合、標的に「特異的に結合する」と言われる。
ＫD値は、しばしば結合親和性と呼ばれる。結合親和性は、１つの結合パートナー（例えば、本明細書に開示されるＦＡＰ又はＣＤ４０結合ドメイン）の接触残基とその結合パートナー（例えば、ＦＡＰ又はＣＤ４０）の接触残基との間の非共有相互作用の合計の強度を測定する。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、結合親和性は、結合対又は結合パートナーのメンバー間の１：１の相互作用を反映する結合親和性を指す。１つの結合パートナーに対して２つの結合ドメインを含む結合タンパク質の場合、結合親和性は、結合タンパク質と結合パートナーとの間の１：２の相互作用を反映する結合親和性を指してもよい。
結合親和性を測定する様々な方法は、技術分野で周知であり、それらのいずれも、本発明の目的のために使用することができる。例えば、本明細書に例示されるように、結合親和性は、特定のアンキリン反復ドメイン及びその結合標的の解離速度を指すＫD値として表すことができる。ＫDは、「オフレート（Ｋoff）」とも呼ばれる解離速度と、結合速度又は「オンレート（Ｋon）」の比率である。したがって、ＫDはＫoff／Ｋonに等しく、モル濃度（Ｍ）として表され、ＫDが小さいほど、結合の親和性が強くなる。
ＫD値は、任意の適切な方法を使用して決定することができる。ＫDを測定するための１つの例示的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１５ Ｍａｙ ５；１５（５）：１０４８１－５１０を参照されたい）。ＫD値は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用するＳＰＲによって測定されてもよい。ＢＩＡｃｏｒｅ動力学分析は、それらの表面上の固定化分子（例えば、エピトープ結合ドメインを含む分子）を有するチップからの抗原の結合及び解離を分析することを含む。タンパク質のＫDを決定するための別の方法は、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙを使用することである（例えば、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４；（８４）：５１３８３）。ＫD値は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）テクノロジー（Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定することができる。代替的に又は追加的に、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄ．）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（動的排除アッセイ）アッセイを使用することもできる。２つの結合パートナー間の結合親和性を評価するのに好適な任意の方法が本明細書に包含される。好ましくは、ＫD値は、例えば実施例２に記載されるように、ＳＰＲによってＰＢＳ中で決定される。
用語「ポリペプチドタグ」は、ポリペプチド／タンパク質に結合したアミノ酸配列であって、当該アミノ酸配列が、当該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくはターゲティングに有用であり、又は、当該アミノ酸配列が、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善する、アミノ酸配列、又は、当該アミノ酸配列がエフェクター機能を有する、アミノ酸配列を指す。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグ、部分及び／又はドメインは、互いに直接的に又はポリペプチドリンカーを介して結合していてもよい。これらのポリペプチドタグは、技術分野で全て周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小さなポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓ（例えば、配列番号５７からなるＨｉｓタグ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼなどの酵素）であって、当該ポリペプチド／タンパク質の検出ができる酵素、又はターゲティングに使用することができる部分（免疫グロブリン又はその断片など）及び／若しくはエフェクター分子として使用することができる部分である。
用語「ポリペプチドリンカー」は、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインとポリエチレングリコールなどの非ポリペプチド部分、又は２つのポリペプチドタグを結合させることができるアミノ酸配列を指す。そのような更なるドメイン、タグ、非ポリペプチド部分及びリンカーは、関連分野の当業者に公知である。そのようなポリペプチドリンカーの例は、配列番号４及び５６からなるリンカーである。
用語「核酸」又は「核酸分子」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかのリボ核酸（ＲＮＡ）分子又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であることができるポリヌクレオチド分子を指し、ＤＮＡ又はＲＮＡの修飾形態及び人工形態を含む。核酸分子は、単離された形態で存在するか、又は組換え核酸分子又はベクターに含まれているかのいずれかであることができる。
本発明の文脈において、用語「医学的状態」、「疾患」、及び「障害」は、相互交換可能に使用され、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症（特に増殖性網膜症）、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患を含むが、これらに限定されない。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、過剰増殖状態である場合がある。医学的状態は、腫瘍性疾患である場合がある。用語「腫瘍性疾患」は、本明細書で使用する場合、急速に増殖する細胞増殖又は腫瘍を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態（state or condition）を指す。医学的状態は、悪性腫瘍性疾患である場合がある。医学的状態は、癌である場合がある。用語「癌」及び「癌性」は、本明細書では、典型的には、調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記載するために使用される。癌は、固形腫瘍及び液性腫瘍、並びに原発性腫瘍及び転移性を包含する。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。固形腫瘍は、典型的には、腫瘍間質も含む。癌の例としては、原発癌及び転移癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、骨髄腫黒色腫及び白血病、並びにいずれかの他の上皮悪性腫瘍及び血球系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより特定の例としては、脳癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、腎癌、大腸癌、胃癌、頭頚部癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、癌腫、扁平上皮細胞癌、明細胞腎癌、頭頚部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、三重陰性乳癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、頭頚部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、悪性中皮腫、脂肪肉腫、神経芽腫、又は滑膜肉腫が挙げられる。
「治療する」という用語、並びにそれに関連する単語は、必ずしも１００％又は完全な治癒を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有するものとして認識する治療の程度は様々である。この点で、本開示の癌を治療する方法は、任意の量又は任意のレベルの治療を提供することができる。更に、本開示の方法によって提供される治療は、１つ又は複数の病態又は症状の治療（すなわち、緩和する）を含むことができる。また、本開示の方法によって提供される治療は、癌の進行を遅延させることを包含することができる。例えば、方法は、Ｔ細胞活性又は癌に対する免疫応答を増強し、腫瘍又は癌の増殖又は新しい病変の出現を減少させ、腫瘍細胞の転移を減少させ、腫瘍又は癌細胞の細胞死を増加させ、腫瘍又は癌細胞の生存を阻害することなどによって、癌を治療することができる。例示的な態様では、方法は、癌の発症又は再発を１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１５日、３０日、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年、２年、４年、又はそれ以上遅延させることによって治療する。例示的な態様では、方法は、対象の生存を増加させることによって治療する。「治療」という用語はまた、予防的治療を含む。
任意の所与の疾患又は状態における治療応答は、その疾患又は状態に特異的な標準化された応答基準によって決定することができる。腫瘍応答は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線造影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、骨スキャン、超音波検査、腫瘍生検サンプリング、循環中の腫瘍細胞の計数、及び／又は腫瘍抗原（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及び／又はアルファ・フェトプロテイン（ＡＦＰ））の測定などのスクリーニング技術を用いて評価することができる。これらの治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
用語「処置」又は「処置すること」は、治療手段と、予防手段又は防止手段とをいずれも指す。処置を必要とするものとしては、既に障害に罹患しているもの、及び障害が防止されるべきものが挙げられる。
用語「治療有効量」は、対象において所望の生物学的、薬理学的、又は治療上の結果を誘導するのに十分な量を指す。本発明の文脈における治療有効量は、いずれかの医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で疾患又は障害を処置又は予防するための結合タンパク質の十分量を意味する。
処置の目的のための用語「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農場動物、非ヒト霊長類、並びに、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの、動物園動物、競技用動物、又はペット動物を含む、哺乳動物として分類されるいずれかの動物を指す。
一実施形態では、用語「インキュベーション」は、ｐＨ７．４でのインキュベーションを指す。一実施形態では、当該ｐＨ７．４でのインキュベーションは、ＰＢＳ中でのインキュベーションを指す。
用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。
用語改善された薬物動態特性は、増加した曲線下面積、低減したクリアランス、又は延長した終末相半減期を指す。これらの薬物動態特性のパラメータ及びパラメータを測定する方法は、技術分野において周知である（例えば、Ｍａｈｍｏｏｄ，Ｉ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌ」（２００９年）、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｄｔｅｃ．２００８．１２．００１）。
本発明の文脈において、用語「いずれかのアミノ酸」は、好ましくは、最も多く自然界に存在する２０個のアミノ酸、すなわちアラニン（ａｌａ、Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ，Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、バリン（ｖａｌ、Ｖ）を意味する。
３．ＦＡＰ及びＣＤ４０を標的とする多選択性分子
ＦＡＰ及びＣＤ４０を標的とする多選択性分子が本明細書に開示される。分子は、例えば、癌の治療に有用である。本発明によれば、ＦＡＰ及びＣＤ４０を標的とする本明細書において提供される多選択性分子は、好ましくは設計された反復タンパク質、より好ましくは設計されたアンキリン反復タンパク質である。
３．１．アンキリン反復ドメイン及びアンキリン反復タンパク質
設計されたアンキリンリピートタンパク質は、モノクローナル抗体の限界を克服する可能性を有する結合分子のクラスであり、したがって新規な治療的アプローチを可能にする。このようなアンキリンリピートタンパク質は、単一の設計されたアンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は２個、３個、４個、５個若しくはそれより多数の設計された、同一又は異なる標的特異性を有するアンキリン反復ドメインの組み合わせを含んでもよい（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８；米国特許第９，４５８，２１１号）。単一の設計されたアンキリン反復ドメインのみを含むアンキリンリピートタンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質に結合するように選択され得る小タンパク質（１４ｋＤａ）である。これらの特徴、及び１個のタンパク質における２個、３個、４個、５個又はそれより多数の設計されたアンキリン反復ドメインを組み合わせる可能性は、設計されたアンキリンリピートタンパク質を理想的なアゴニスト薬、アンタゴニスト薬及び／又は阻害薬の候補とする。更に、そのようなアンキリンリピートタンパク質は、様々なエフェクター機能、例えば細胞傷害性剤又は半減期延長剤を担持し、完全に新しい薬物フォーマットを可能にするように操作することができる。まとめると、設計されたアンキリンリピートタンパク質は、既存の抗体薬物を超える可能性を有するタンパク質治療薬の次世代の例である。
本明細書中に記載される設計されたアンキリン反復ドメインは、一般に、１つ以上の設計された反復モジュール、好ましくはアンキリン反復モジュールを構造単位（その後、構造反復又は反復ユニットとも称される）として含み、当該反復モジュール、好ましくは当該アンキリン反復モジュールは、構造的相同性及び配列相同性を有する。アンキリン反復モジュールは、概して、２つの逆平行αヘリックス、続いてベータバルジ及びこれを次の反復単位に接続するベータヘアピン含有ループからなり、その各々が約２８～３３残基を有する。
設計されたアンキリン反復モジュールを含む組換えタンパク質又はその設計された結合ドメインは、本明細書ではＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質とも呼ばれる。Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．」第１０巻（第２号）：第１５３～９頁（２００７年）；及び、Ｂｉｎｚら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．」第２２巻（第５号）：５７５－５８２（２００４）を参照されたい。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、標的タンパク質に対して高い特異性及び高い結合親和性を有する抗体模倣体と見なすことができる。一般に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、少なくとも１つのアンキリン反復モジュール、例えば、少なくとも２、３、又はそれ以上のアンキリン反復モジュールを含む。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって所有される商標である。
本明細書に記載のアンキリン反復ドメインは、一般に、構造を提供するコア足場、及び標的に結合する標的結合残基を含む。構造コアは、保存されたアミノ酸残基を含み、標的結合表面は、標的に応じて異なるアミノ酸残基を含む。例えば、アンキリン反復モジュールは、以下の配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘＩＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号２３）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示し、好ましくは式中、「ｘ」は、システイン、グリシン、又はプロリンではない。他の例として、アンキリン反復モジュールは、配列番号２４～２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリー（国際公開第２００２／０２０５６５号，Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」第２２巻第５７５～５８２頁、２００４年；Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ」第１３巻第６９５～７０１頁、２００８年）を含む設計された反復タンパク質ライブラリーは、高い親和性で標的に結合する標的特異的に設計された反復ドメインの選択／スクリーニングに使用することができる。このような標的特異的に設計された反復ドメインは、ひいては疾患の処置のための組換え結合タンパク質の有益な構成要素として使用することができる。そのようなライブラリーを作製する方法は、当業者に公知である（国際公開第２００２／０２０５６５号）。
複数のアンキリン反復ドメインを（共有結合又は非共有結合のいずれかを介して）連結して、二重特異性又は多選択性特異的分子を形成することができる。１つのＦＡＰ結合ドメインと２つのＣＤ４０結合ドメインとが連結されている分子を含めて、そのような多選択性特異的分子が本明細書中に開示される。そのような分子はまた、Ｎ末端に半減期延長部分を含み得る。
３．２．Ｎ末端及びＣ末端キャッピングモジュール
本明細書中に開示される組換えタンパク質の反復ドメイン、好ましくはアンキリン反復ドメインは、好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュール（その後、キャッピング反復又はキャッピング単位とも称される）を含む。キャッピングモジュールはアンキリン反復ドメインのＮ末端及び／又はＣ末端に位置し、典型的には、アンキリン反復モジュール（複数可）との間に密な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、アンキリン反復ドメインの疎水性コアを溶媒への曝露から側方で遮蔽するキャップを提供する。
Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールは、キャッピング単位、又は反復単位に隣接する天然に存在する反復タンパク質中に見出される他の構造単位に由来してもよい。キャッピング配列の例は、国際特許公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号及び同第ＷＯ２０１２／０６９６５５号、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０２９６２２１、並びにＩｎｔｅｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｊａｎ １８；３７５（３）：８３７－５４に記載されている。Ｎ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｎ末端キャッピング反復）の例は、配列番号１１～１６であり、Ｃ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｃ末端キャッピング反復）の例は、配列番号１８～２１である。
例示的な実施形態では、Ｎ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列ＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＬＡＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１４）又はＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１５）を含み、式中、配列番号１４又は配列番号１５の、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、任意選択的に、任意のアミノ酸によって交換され、式中、配列番号１４又は配列番号１５は、任意選択的に、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含み得る。例示的な実施形態では、Ｃ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列ＱＤＩＦＧＫＴＰＡＤＩＡＡＤＡＧＨＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡ（配列番号１９）又はＱＤＫＳＧＫＴＰＡＤＬＡＡＤＡＧＨＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡ（配列番号２０）を含み、式中、配列番号１９又は配列番号２０の、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、任意選択的に、任意のアミノ酸によって交換される。
有利には、いくつかの実施形態では、本明細書の設計されたアンキリン反復ドメインのＮ末端キャッピングモジュール及び／又はＣ末端キャッピングモジュール中のある特定のアミノ酸残基を変化させることにより、設計されたアンキリン反復ドメインの、及び設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質の終末相半減期の長期化を含む、薬物動態特性の改善が得られることが発見された。変化したアミノ酸残基は、ほとんど表面に露出した残基である。好ましくは、変化されたアミノ酸残基は、Ｎ末端キャッピングモジュールの８位及び１５位におけるアミノ酸残基であり、ここで、位置番号は、配列番号１１の位置、Ｃ末端キャッピングモジュールの１４位及び１８位におけるアミノ酸残基に対応し、ここで、位置番号は、配列番号１８の位置に対応する。
好ましい一実施形態では、本明細書で提供される設計されたアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列を有する、Ｎ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、８位のアミノ酸はＱであり、及び／又は１５位のアミノ酸はＬである。そのようなＮ末端キャッピングモジュールの例は、配列番号１１、１２、及び１３である。一実施形態では、当該設計されたアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、４位のアミノ酸はＳであり、８位のアミノ酸はＱであり、１５位のアミノ酸はＬであり、１７位のアミノ酸がＴであり、２０位のアミノ酸がＴであり、及び／又は２３位のアミノ酸がＱである。そのようなＮ末端キャッピングモジュールの例は、配列番号１６である。好ましい実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、３０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。更に好ましい実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、３０アミノ酸からなるアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｎ末端キャッピングモジュールの位置の当該位置番号は、配列番号１１の位置番号を用いて配列番号１１にアラインメントすることによって測定する。好ましくは、当該アラインメントは、アミノ酸ギャップを含まない。配列アラインメント生成は、当技術分野で周知の手順である。当該Ｎ末端キャッピングモジュールのいずれか１つは、任意選択的に、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含み得る。
例えば、変化されたアミノ酸残基を有するＮ末端キャッピングモジュールは、以下の配列：ＤＬＧｘｘＬＬＱＡＡｘｘＧＱＬＤｘＶＲｘＬｘｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号１７）を含むことができ、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。
例示的な実施形態では、Ｎ末端キャッピング配列は、ＤＬＧＫＫＬＬＱＡＡＲＡＧＱＬＤＥＶＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１１）、ＤＬＧＫＫＬＬＱＡＡＲＡＧＱＬＤＥＶＲＩＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１２）、又はＤＬＧＫＫＬＬＱＡＡＲＡＧＱＬＤＥＶＲＩＬＬＡＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１３）を含み、式中、８位及び１５位以外の位置の、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３の、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、位置の１３は、任意のアミノ酸によって任意選択的に交換され、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３は、任意選択的に、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含み得る。したがって、一実施形態では、本発明の設計された反復ドメイン、好ましくはアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列ＤＬＧＫＫＬＬＱＡＡＲＡＧＱＬＤＥＶＲＥＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１１）を有するＮ末端キャッピングモジュールを含み、式中、８位及び１５位以外の位置の、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３の、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、任意のアミノ酸によって任意選択的に交換され、式中、配列番号１１は、任意選択的に、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含み得る。
別の例示的な実施形態では、Ｎ末端キャッピング配列は、ＤＬＧＳＫＬＬＱＡＡＲＡＧＱＬＤＴＶＲＴＬＬＱＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１６）を含み、式中、４位、８位、１５位、１７位、２０位、及び２３位以外の位置の、配列番号１６の、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、任意のアミノ酸によって任意選択的に交換され、式中、配列番号１６は、任意選択的に、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含み得る。
更に好ましい実施形態では、本明細書で提供される設計された反復ドメイン、好ましくはアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列を有するＣ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、１４位のアミノ酸はＲであり、及び／又は１８位のアミノ酸はＱである。そのようなＣ末端キャッピングモジュールの例は、配列番号１８及び１９である。一実施形態では、当該設計されたアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列を有するＣ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、３位のアミノ酸はＴであり、４位のアミノ酸はＱであり、６位のアミノ酸はＴであり、１４位のアミノ酸はＲであり、１８位のアミノ酸はＱであり、１９位のアミノ酸がＱであり、２２位のアミノ酸はＳであり、及び／又は２６位のアミノ酸はＱである。そのようなＣ末端キャッピングモジュールの例は、配列番号２１である。好ましい実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、２８アミノ酸のアミノ酸配列を含む。更に好ましい実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、２８アミノ酸からなるアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｃ末端キャッピングモジュールの位置の当該位置番号は、配列番号１８の位置番号を用いて配列番号１８にアラインメントすることによって測定する。好ましくは、当該アラインメントは、アミノ酸ギャップを含まない。
例えば、変化されたアミノ酸残基を有するＣ末端キャッピングモジュールは、以下の配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＡＤｘＡＡＲｘＧＨＱｘＩＡｘＶＬＱｘＡＡ（配列番号２２）を含むことができ、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。
例示的な実施形態では、Ｃ末端キャッピング配列は、ＱＤＫＳＧＫＴＰＡＤＬＡＡＲＡＧＨＱＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡ（配列番号１８）を含み、式中、１４位及び１８位以外の位置の配列番号１８の、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、任意選択的に、任意のアミノ酸によって交換される。
別の例示的な実施形態では、Ｃ末端キャッピング配列は、ＱＤＴＱＧＴＴＰＡＤＬＡＡＲＡＧＨＱＱＩＡＳＶＬＱＱＡＡ（配列番号２１）を含み、式中、３位、４位、６位、１４位、１８位、１９位、２２位、及び２６位以外の位置の配列番号２１の、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、任意選択的に、任意のアミノ酸によって交換される。
３．３．ＦＡＰ結合ドメイン
１つの魅力的な間質細胞標的は、実質的に全ての上皮癌の癌関連間質細胞において高度に発現される膜貫通セリンプロテアーゼである線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。ＦＡＰはまた、胚発生中、治癒中の創傷の組織、並びに肝硬変及び特発性肺線維症などの慢性炎症性及び線維性疾患において発現される。しかしながら、ＦＡＰは、良性腫瘍においても、ほとんどの正常な静止状態の成体間質細胞においても免疫組織化学によって検出されていない。
本明細書に記載の組換えタンパク質は、本明細書では「ＦＡＰ結合ドメイン」とも呼ばれる、ＦＡＰに特異的に結合するアンキリン反復ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２８～３８のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２８～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２の配列に対して、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２の配列に対して、５個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２の配列に対して、４個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２の配列に対して、３個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２の配列に対して、２個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２の配列に対して、１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、置換（複数可）は、配列番号２の配列を含むタンパク質のＫD値と比較して、ＫD値を１０００倍超、１００倍超、又は１０倍超変化させない。いくつかの実施形態では、配列番号８の配列に対して、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号８の配列に対して、５個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号８の配列に対して、４個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号８の配列に対して、３個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号８の配列に対して、２個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号８の配列に対して、１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、置換（複数可）は、配列番号８の配列を含むタンパク質のＫD値と比較して、ＫD値を１０００倍超、１００倍超、又は１０倍超変化させない。特定の実施形態では、置換は、表１による保存的置換である。特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側、例えば、アルファヘリックスを接続するベータループ内で行われる。特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基内で行われる。例えば、アンキリンドメインは、コンセンサス配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘＩＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号２３）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、好ましくはシステイン、グリシン、若しくはプロリンではない任意のアミノ酸を表し、又はｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫｚＧＡＤＶＮＡ（配列番号２４）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、好ましくはシステイン、グリシン、若しくはプロリンではない任意のアミノ酸を表し、「ｚ」は、アスパラギン、ヒスチジン、又はチロシンからなる群から選択される。一実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基に対して行われる。別の実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基の外側で行われる。
加えて、最後から２番目の位置は、「Ａ」（例えば、配列番号２、８、９、２８～３１、及び３８を参照されたい）、又は「Ｌ」（例えば、配列番号３２～３７を参照されたい）であってもよく、及び／又は最後の位置は、「Ａ」（例えば、配列番号２、８、９、２８－３１、及び３８）、又は「Ｎ」（例えば、配列番号３２～３７）であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２、８、９、２８～３１、及び３８のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２、８、９、２８～３１、及び３８のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡはＮで置換されている。いくつかの実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。好ましい実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡはＮで置換されている。いくつかの実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号９、２８～３１、及び３８のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号９、２８～３１、及び３８のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。別の例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号９、２８～３１、及び３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡはＮで置換されている。いくつかの実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号３２～３７のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＬがＡで置換されており、及び／又は最後の位置のＮがＡで置換されている。例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号３２～３７のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＬがＡで置換されており、及び／又は最後の位置のＮがＡで置換されている。別の例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号３２～３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＬがＡで置換されており、及び／又は最後の位置のＮがＡで置換されている。配列は、任意選択で、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを含んでもよい（以下を参照されたい）。
加えて、ＦＡＰ結合ドメインは、任意選択で、そのＮ末端で「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含んでもよい（例えば、配列番号２と比較した配列番号３８を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＦＡＰ結合ドメインは、（ｉ）配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２、８、９、及び２８～３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。またしたがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＦＡＰ結合ドメインは、配列番号３８と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号３８の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
したがって、特に好ましい一実施形態では、本明細書に記載のＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、そのＮ末端は、任意選択で、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡは、Ｌで置換されており、及び／又は最後の位置のＡは、Ｎで置換されている。
特定の実施形態では、ＦＡＰ結合ドメイン又はＦＡＰ結合ドメインを含む組換えタンパク質とその標的（すなわち、ＦＡＰ）との間における親和性が、ＫDに関して記載される。例示的な実施形態では、ＫDは、約１０-1Ｍ以下、約１０-2Ｍ以下、約１０-3Ｍ以下、約１０-4Ｍ以下、約１０-5Ｍ以下、約１０-6Ｍ以下、約１０-7Ｍ以下、約１０-8Ｍ以下、約１０-9Ｍ以下、約１０-10Ｍ以下、約１０-11Ｍ以下、約１０-12Ｍ以下、約１０-13Ｍ以下、約１０-14Ｍ以下、約１０-5Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-5Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-5Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-13Ｍ、又は約１０-10Ｍ～約１０-13Ｍである。
例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７５ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は約１ｐＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合し、好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１４０ｐＭ、１３０ｐＭ、又は１２０ｐＭ以下のＫＤ値でヒトＦＡＰに結合する。例示的な一実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、約１００ｎＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合する。別の例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、約１０ｎＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合する。別の例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、約１ｎＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合する。好ましい一実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、約１２０ｐＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合する。好ましくは、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインを含む組換えタンパク質は、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７５ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は約１ｐＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合し、好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、又は３００ｐＭ以下のＫＤ値でＦＡＰに結合する。例示的な一実施形態では、組換えタンパク質は、約１００ｎＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合する。別の例示的な実施形態では、ＦＡＰ結合ドメインは、約１０ｎＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合する。別の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、約１ｎＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合する。別の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、約５００ｐＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合する。好ましい一実施形態では、組換えタンパク質は、約３００ｐＭ以下のＫD値でＦＡＰに結合する。好ましくは、組換えタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態では、ＦＡＰは、ヒトＦＡＰ（配列番号５２）である。
Figure 2023528204000001
３．４．ＣＤ４０結合ドメイン
本明細書に開示される組換えタンパク質はまた、ＣＤ４０によって誘導される免疫細胞共刺激活性を利用する。
本明細書に記載の組換えタンパク質は、本明細書では「ＣＤ４０結合ドメイン」とも呼ばれる、ＣＤ４０に特異的に結合するアンキリン反復ドメインを含む。ＣＤ４０アゴニスト抗体と同様に、ＣＤ４０結合ドメインは、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達経路を活性化する。本明細書に記載の組換えタンパク質はまた、２つ以上のＣＤ４０結合ドメイン、例えば、２つ又は３つ以上のＣＤ４０結合ドメインを含んでもよい。したがって、本明細書に記載の組換えタンパク質は、第１及び第２のＣＤ４０結合ドメイン、又は第１、第２、及び第３のＣＤ４０結合ドメインを含んでもよい。以下に提供される実施形態は、そのような第１のＣＤ４０結合ドメイン、第２のＣＤ４０結合ドメイン、及び／又は第３のＣＤ４０結合ドメインを記載する。好ましくは、本明細書に記載の組換えタンパク質は、２つのＣＤ４０結合ドメイン、すなわち、第１のＣＤ４０結合ドメイン及び第２のＣＤ４０結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号４３～５０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号４３～５０のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号４３～５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号３の配列に対して、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号３の配列に対して、５個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号３の配列に対して、４個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号３の配列に対して、３個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号３の配列に対して、２個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号３の配列に対して、１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、置換（複数可）は、配列番号３の配列を含むタンパク質のＫD値と比較して、ＫD値を１０００倍超、１００倍超、又は１０倍超変化させない。特定の実施形態では、置換は、表１による保存的置換である。特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側、例えば、アルファヘリックスを接続するベータループ内で行われる。特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基内で行われる。例えば、アンキリンドメイン又はアンキリン結合ドメインの各々は、コンセンサス配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘＩＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号２３）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、好ましくはシステイン、グリシン、若しくはプロリンではない任意のアミノ酸を表し、又はｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫｚＧＡＤＶＮＡ（配列番号２４）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、好ましくはシステイン、グリシン、若しくはプロリンではない任意のアミノ酸を表し、「ｚ」は、アスパラギン、ヒスチジン、又はチロシンからなる群から選択される。一実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基に対して行われる。別の実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基の外側で行われる。
加えて、最後から２番目の位置は、「Ａ」（例えば、配列番号３、１０、４３、４４、及び４８～５０を参照されたい）、又は「Ｌ」（例えば、配列番号４５～４７を参照されたい）であってもよく、及び／又は最後の位置は、「Ａ」（例えば、配列番号：配列番号３、１０、４３、４４、及び４８～５０を参照されたい）、又は「Ｎ」（例えば、配列番号４５～４７を参照されたい）であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号３、１０、４３、４４、及び４８～５０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号３、１０、４３、４４、及び４８～５０のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡはＮで置換されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。好ましい実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡはＮで置換されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号１０、４３、４４、及び４８～５０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号１０、４３、４４、及び４８～５０のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。別の例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号１０、４３、４４、及び４８～５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。配列は、任意選択で、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを含んでもよい（以下を参照されたい）。
加えて、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、任意選択で、そのＮ末端で「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含んでもよい（例えば、配列番号３と比較した配列番号５０を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、（ｉ）配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、配列番号３、１０、及び４３～４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。またしたがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、配列番号５０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号５０の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
したがって、特に好ましい一実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、そのＮ末端は、任意選択で、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡは、Ｌで置換されており、及び／又は最後の位置のＡは、Ｎで置換されている。
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメインの１つのいずれかは、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、（１）８位にＱ、及び（２）１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、（１）１５位にＬ、及び（２）１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、（１）８位にＱ及び１５位にＬ、並びに（２）１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。またしたがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、（１）８位にＱ及び／又は１５位にＬ、並びに（２）１４３位にＲを含み、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、（１）８位にＱ及び／又は１５位にＬ、並びに（２）１４７位にＱを含み、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、（１）８位にＱ及び／又は１５位にＬ、並びに（２）１４３位にＲ及び１４７位にＱを含み、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。いくつかのより好ましい実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び１４７位にＱを含み、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。
更に、なおより好ましい実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び１４７位にＱを含み、位置番号は、配列番号３の位置と対応し、結果として、それぞれＱ、Ｌ、Ｒ、及びＱとは異なる８位、１５位、１４３位、及び１４７位のアミノ酸を除き同一のアミノ酸配列を有するＣＤ４０結合ドメインと比較して、当該ＣＤ４０結合ドメインの薬物動態特性の改善をもたらし、式中、位置番号は、配列番号３の位置に対応する。
特定の実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン若しくは当該ＣＤ４０結合ドメインの各々、又はＣＤ４０結合ドメイン（複数可）を含む組換えタンパク質と、その標的（すなわち、ＣＤ４０）との間の親和性は、ＫDに関して記載される。例示的な実施形態では、ＫDは、約１０-1Ｍ以下、約１０-2Ｍ以下、約１０-3Ｍ以下、約１０-4Ｍ以下、約１０-5Ｍ以下、約１０-6Ｍ以下、約１０-7Ｍ以下、約１０-8Ｍ以下、約１０-9Ｍ以下、約１０-10Ｍ以下、約１０-11Ｍ以下、約１０-12Ｍ以下、約１０-13Ｍ以下、約１０-14Ｍ以下、約１０-5Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-5Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-5Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-13Ｍ、又は約１０-10Ｍ～約１０-13Ｍである。
例示的な実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７５ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は約１ｐＭ以下のＫD値でＣＤ４０に結合し、好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、又は７５ｎＭ以下のＫＤ値でＣＤ４０に結合する。例示的な一実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、約１００ｎＭ以下のＫD値でＣＤ４０に結合する。好ましい一実施形態では、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、約７５ｎＭ以下のＫD値でＣＤ４０に結合する。好ましくは、ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。
例示的な実施形態では、２つのＣＤ４０結合ドメインを含む組換えタンパク質は、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７５ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は約１ｐＭ以下のＫD値でＣＤ４０に結合し、好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１４０ｐＭ、１３０ｐＭ、１２０ｐＭ、１１５ｐＭ、１１０ｐＭ、１０５ｐＭ、又は１００ｐＭ以下のＫＤ値でＣＤ４０に結合する。例示的な一実施形態では、組換えタンパク質は、約１００ｎＭ以下のＫD値でＣＤ４０に結合する。別の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、約１ｎＭ以下のＫD値でＣＤ４０に結合する。別の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、約５００ｐＭ以下のＫD値でＣＤ４０に結合する。好ましい一実施形態では、組換えタンパク質は、約１００ｐＭ以下のＫD値でＣＤ４０に結合する。好ましくは、組換えタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、２つ以上のＣＤ４０結合ドメインが、ＣＤ４０クラスター化及び免疫細胞共刺激を更に促進するために好ましい。ＣＤ４０リガンドは、免疫細胞上のＣＤ４０に三量体として結合することが報告されている。しかしながら、三量体化単独ではＣＤ４０シグナル伝達経路を活性化するのに十分ではない。ＣＤ４０のより高次のクラスター化がその活性化のために必要とされる。本明細書に記載されているように、ＦＡＰ結合を介して、多選択性分子は腫瘍環境におけるＣＤ４０クラスター化を既に促進している。ＣＤ４０クラスター化を更に促進するために、２つ以上のＣＤ４０結合ドメインを使用して、細胞表面に「架橋」効果を生じることができる。例えば、図４に示されているように、一価のＣＤ４０結合剤（ＦＣ）は、ＣＤ４０経路を活性化するのに十分であった。より高い効力は、２つのＣＤ４０結合ドメイン（ＦＣＣ）、又は３つのＣＤ４０結合ドメイン（ＦＣＣＣ）を用いることによって達成することができる。図４はまた、２つのＣＤ４０結合ドメインが、高い効力でＣＤ４０経路を活性化するのに十分であり、効率的なＣＤ４０クラスター化のために３つのＣＤ４０結合ドメインを有する必要がないことを示す。
特定の実施形態では、ＣＤ４０は、ヒトＣＤ４０（配列番号５１）である。
３．５．半減期延長部分
「半減期延長部分」は、半減期延長部分を有さない同じタンパク質と比較して、本明細書に記載の組換えタンパク質のインビボでの血清半減期を延長する。半減期延長部分の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え多選択性タンパク質は、本明細書では「血清アルブミン結合ドメイン」とも呼ばれる、血清アルブミンに特異的に結合するアンキリン反復ドメインを含む。本明細書に記載の組換えタンパク質はまた、２つ以上の血清アルブミン結合ドメイン、例えば、２つ又は３つ以上の血清アルブミン結合ドメインを含んでもよい。したがって、本明細書に記載の組換えタンパク質は、第１及び第２の血清アルブミン結合ドメイン、又は第１、第２、及び第３の血清アルブミン結合ドメインを含んでもよい。以下に提供される実施形態は、そのような第１の血清アルブミン結合ドメイン、第２の血清アルブミン結合ドメイン、及び／又は第３の血清アルブミン結合ドメインを記載する。好ましくは、本明細書に記載の組換えタンパク質は、ただ１つの血清アルブミン結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本明細書に記載の血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血清アルブミン結合ドメインは、配列番号３９～４２のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の血清アルブミン結合ドメインは、配列番号３９～４２のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態では、本明細書に記載の血清アルブミン結合ドメインは、配列番号３９～４２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して、５個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して、４個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して、３個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して、２個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して、１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、置換（複数可）は、配列番号１の配列を含むタンパク質のＫD値と比較して、ＫD値を１０００倍超、１００倍超、又は１０倍超変化させない。特定の実施形態では、置換は、表１による保存的置換である。特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側、例えば、アルファヘリックスを接続するベータループ内で行われる。特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基内で行われる。例えば、アンキリンドメインは、コンセンサス配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘＩＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号２３）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、好ましくはシステイン、グリシン、若しくはプロリンではない任意のアミノ酸を表し、又はｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫｚＧＡＤＶＮＡ（配列番号２４）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、好ましくはシステイン、グリシン、若しくはプロリンではない任意のアミノ酸を表し、「ｚ」は、アスパラギン、ヒスチジン、又はチロシンからなる群から選択される。一実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基に対して行われる。別の実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基の外側で行われる。
加えて、最後から２番目の位置は、「Ａ」（例えば、配列番号１、３９、４０、及び４２を参照されたい）、又は「Ｌ」（例えば、配列番号４１を参照されたい）であってもよく、及び／又は最後の位置は、「Ａ」（例えば、配列番号：１、３９、４０、及び４２を参照されたい）、又は「Ｎ」（例えば、配列番号１）であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１、３９、４０、及び４２のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１、３９、４０、及び４２のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡはＮで置換されている。いくつかの実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。好ましい実施形態では、本明細書に記載の血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡはＮで置換されている。いくつかの実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号３９、４０、及び４２のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号３９、４０、及び４２のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。別の例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号３９、４０、及び４２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、及び／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。配列は、任意選択で、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを含んでもよい（以下を参照されたい）。
加えて、血清アルブミン結合ドメインは、任意選択で、そのＮ末端で「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含んでもよい（例えば、配列番号４２と比較した配列番号１を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される血清アルブミン結合ドメインは、（ｉ）配列番号４２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号４２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号４２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。またしたがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１、及び３９～４１のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、式中、配列番号１、及び３９～４１のいずれか１つの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１、３０及び３１のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、式中、配列番号１、及び３９～４１のいずれか１つの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
したがって、特に好ましい一実施形態では、本明細書に記載の血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落しており、任意選択で、最後から２番目の位置のＡは、Ｌで置換されており、及び／又は最後の位置のＡは、Ｎで置換されている。
特定の実施形態では、血清アルブミン結合ドメイン又は血清アルブミン結合ドメインを含む組換えタンパク質とその標的（すなわち、血清アルブミン）との間における親和性が、ＫDに関して記載される。例示的な実施形態では、ＫDは、約１０-1Ｍ以下、約１０-2Ｍ以下、約１０-3Ｍ以下、約１０-4Ｍ以下、約１０-5Ｍ以下、約１０-6Ｍ以下、約１０-7Ｍ以下、約１０-8Ｍ以下、約１０-9Ｍ以下、約１０-10Ｍ以下、約１０-11Ｍ以下、約１０-12Ｍ以下、約１０-13Ｍ以下、約１０-14Ｍ以下、約１０-5Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-5Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-5Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-6Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-13Ｍ、又は約１０-10Ｍ～約１０-13Ｍである。
例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７５ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は約１ｐＭ以下のＫD値で血清アルブミンに結合し、好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、又は３５ｎＭ以下のＫＤ値で血清アルブミンに結合する。例示的な一実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、約１００ｎＭ以下のＫD値で血清アルブミンに結合する。別の例示的な実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、約５０ｎＭ以下のＫD値で血清アルブミンに結合する。好ましい一実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、約３５ｐＭ以下のＫD値で血清アルブミンに結合する。好ましくは、血清アルブミン結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
例示的な実施形態では、血清アルブミンドメインを含む組換えタンパク質は、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７５ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は約１ｐＭ以下のＫD値で血清アルブミンに結合し、好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、又は５０ｎＭ以下のＫＤ値で血清アルブミンに結合する。例示的な一実施形態では、組換えタンパク質は、約１００ｎＭ以下のＫD値で血清アルブミンに結合する。別の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、約７５ｎＭ以下のＫD値で血清アルブミンに結合する。好ましい一実施形態では、組換えタンパク質は、約５０ｎＭ以下のＫD値で血清アルブミンに結合する。好ましくは、組換えタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（配列番号５３）である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンドメインは、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、既知の重鎖アイソタイプであるＩｇＧ（γ）、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＥ（ε）、又はＩｇＡ（α）のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、既知の重鎖アイソタイプ又はサブタイプであるＩｇＧ1（γ１）、ＩｇＧ2（γ２）、ＩｇＧ3（γ３）、ＩｇＧ4（γ４）、ＩｇＡ1（α１）、ＩｇＡ2（α２）のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ1のＦｃドメインである。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの中断されていない天然配列（すなわち、野生型配列）を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、変化した生物学的活性をもたらす変異体Ｆｃドメインを含む。例えば、少なくとも１つの点変異又は欠失は、エフェクター活性を低減又は排除するために（例えば、国際特許公開第ＷＯ２００５／０６３８１５号）、及び／又は組換えタンパク質の生成中に均質性を増加させるために、Ｆｃドメインに導入されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ1のＦｃドメインであり、以下のエフェクターヌル置換であるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ（Ｅｕ番号付け）の１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＣ末端位置（すなわち、Ｅｕ番号付けによるＫ４４７）に位置するリジンを含まない。リジンを含まないことは、組換えタンパク質の生成中に均質性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｃ末端位置（Ｋ４４７、Ｅｕ番号付け）に位置するリジンを含む。
３．６．リンカー
本明細書に記載の組換えタンパク質は、リンカーを含んでもよい。「リンカー」は、２つの別個の実体（例えば、ＦＡＰ結合ドメイン及びＣＤ４０結合ドメイン）に互いに結合し、それらが、例えば、それらのそれぞれの標的（例えば、ＦＡＰ及びＣＤ４０）に特異的に結合する立体配座を達成することができるように、２つの実体間の間隔及び柔軟性を提供することができる分子又は分子群である。タンパク質リンカーが特に好ましく、技術分野で周知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、組換えタンパク質の成分として発現することができる。
アンキリン反復ドメインは、例えば、ジスルフィド結合、ポリペプチド結合又は架橋剤による共有結合、或いは非共有結合のいずれかで連結され、ヘテロ二量体タンパク質を生成することができる。組換えタンパク質は、ＦＡＰとＣＤ４０結合ドメインを含む任意の結合ドメインのいずれかとの間、並びに任意の結合ドメインと任意の半減期延長部分（それ自体もまた結合ドメインであり得る）との間に、リンカーを含み得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチジルリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、約１～３０個のアミノ酸残基を含む。例示的なリンカーとしては、例えば、グリシンリッチペプチド；グリシン及びセリンを含むペプチド；配列［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］nを有し、式中、ｎが１、２、３、４、５又は６であるペプチド；又は配列［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］n（配列番号５６）を有し、式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６であるペプチドが挙げられる。グリシンリッチペプチドリンカーはペプチドリンカーを含み、残基の少なくとも２５％はグリシンである。グリシンリッチペプチドリンカーは、技術分野において周知である（例えば、Ｃｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３年２月；２２（２）：第１５３～１６７頁）。
いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカーである。例示的な実施形態では、リンカーは、配列番号４のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカーである。
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
３．７．ＦＡＰ／ＣＤ４０二重標的化二重特異性又は多選択性分子
本発明の多選択性分子は、本明細書に記載の結合ドメインと任意選択的にリンカーとの任意の種類の組合せを含む。すなわち、上記のセクション３．３～３．６に記載されたドメイン及びリンカーのいずれか１つを本発明の多選択性分子中で組み合わせることができる。更に、本発明の多選択性分子の結合ドメインは、上記のセクション３．２に記載されたＮ末端キャッピングモジュール及び／又はＣ末端キャッピングモジュールのいずれかを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ））血清アルブミンに特異的に結合する第１のアンキリン反復ドメイン、（ｉｉ）ＦＡＰに特異的に結合する第２のアンキリン反復ドメイン、（ｉｉｉ）ＣＤ４０に特異的に結合する第３のアンキリン反復ドメイン、及び（ｉｖ）ＣＤ４０に特異的に結合する第４のアンキリン反復ドメインを含む。当該第１のアンキリン反復ドメインは、上記セクション３．５に記載の血清アルブミン結合ドメインのいずれか１つであってもよく、当該第２のアンキリン反復ドメインは、上記セクション３．３に記載のＦＡＰ結合ドメインのいずれか１つであってもよく、かつ当該第３及び第４のアンキリン反復ドメインは、上記セクション３．４に記載のＣＤ４０結合ドメインのいずれか１つであってもよい。第３及び第４のアンキリン反復ドメインは、同一の配列を有してもよく、又は異なる配列を有してもよい。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（血清アルブミン結合ドメイン）－（リンカー）－（ＦＡＰ結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）を含み、ここで、リンカーは、好ましくは配列番号４のアミノ配列を含む。
特定の実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましい一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、配列番号５の４つの結合ドメインのいずれか１つに対して、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号５の４つの結合ドメインのいずれか１つに対して、１０個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号５の４つの結合ドメインのいずれか１つに対して、５個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号５の４つの結合ドメインのいずれか１つに対して、４個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号５の４つの結合ドメインのいずれか１つに対して、３個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号５の４つの結合ドメインのいずれか１つに対して、２個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号５の４つの結合ドメインのいずれか１つに対して、１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、置換（複数可）は、配列番号５の配列を含むタンパク質のＫD値と比較して、ＦＡＰ結合若しくはＣＤ４０結合又は血清アルブミン結合のＫD値を１０００倍超、１００倍超、又は１０倍超変化させない。特定の実施形態では、置換は、表１による保存的置換である。
特定の実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、３×１０-10Ｍ未満、又は２×１０-10Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。好ましい一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＦＡＰに、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、又は３×１０-10Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。好ましい一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＦＡＰに、１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに、１０-7Ｍ未満、７×１０-8Ｍ未満、又は５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。好ましい一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、３×１０-10Ｍ、若しくは２×１０-10の解離定数（ＫD）値でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、及び／又は組換えタンパク質は、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、若しくは３×１０-10Ｍ未満の解離定数（ＫD）値でＰＢＳ中のヒトＦＡＰに結合する。好ましい一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に、１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合し、組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＦＡＰに、１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。
特定の実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、３×１０-10Ｍ、若しくは２×１０-10の解離定数（ＫD）値でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、及び／又は組換えタンパク質は、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、若しくは３×１０-10Ｍ未満の解離定数（ＫD）値でＰＢＳ中のヒトＦＡＰに結合し、及び／又は組換えタンパク質は、１０-7Ｍ未満、７ｘ１０-8Ｍ未満、若しくは５ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）値でＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに結合する。好ましい一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に、１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合し、組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＦＡＰに、１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。より好ましい一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合し、組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＦＡＰに１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合し、組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。
特定の好ましい実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、結合ＦＡＰ、ＣＤ４０、及び血清アルブミンに同時に結合し、好ましくは、当該同時結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、更に好ましくは、実施例３に記載されるように測定される。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、ＦＡＰ及びＣＤ４０に結合するとＢ細胞を活性化を誘導する。特定の実施形態では、Ｂ細胞は、ヒトＢ細胞である。特定の実施形態では、多選択性組換えタンパク質の生物学的活性は、ＣＤ８６及びＣＤ６９などの共刺激分子の発現を測定するインビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価される。Ｂ細胞におけるこれらの共刺激分子（ＣＤ８６及びＣＤ６９）の発現増加は、ＣＤ４０活性化を示すことが報告されている。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において、ＣＤ４０発現Ｂ細胞中でヒトＣＤ４０を約１０-8Ｍ以下、又は約１０-9Ｍ以下のＥＣ５０値で活性化する。
特定の実施形態では、多選択性組換えタンパク質は、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約６５ｎＭ以下、約５５ｎＭ以下、約４５ｎＭ以下、約３５ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭ、又は約０．１ｎＭ以下、約０．０１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０７ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約５ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約１ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約０．０７ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．１ｎＭ～約０．９ｎＭ、約０．１ｎＭ～約０．８５ｎＭ、約０．１８ｎＭ～約０．８５ｎＭの半数効果濃度（ＥＣ50）を有する。
例示的な実施形態では、多選択性組換えタンパク質は、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。別の例示的な実施形態では、多選択性組換えタンパク質は、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約１ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。別の例示的な実施形態では、多選択性組換えタンパク質は、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約０．０１ｎＭ～約１０ｎＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～約１．０ｎＭ、又は約０．１８ｎＭ～約０．８５ｎＭのＥＣ５０を有する。別の例示的な実施形態では、多選択性組換えタンパク質は、インビトロＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ、好ましくは約０．０４ｎＭ～約０．０７ｎＭのＥＣ５０を有する。
特定の実施形態では、Ｂ細胞活性化アッセイは、ヒトＢ細胞活性化アッセイである。例示的な実施形態では、ＥＣ50は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．１．２）を製造者の指示に従って用いて測定される。例示的な実施形態では、ＥＣ50値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック適合モデルでデータを適合させることによって決定される。例示的な実施形態では、ＥＣ50値は、実施例に記載の方法を用いて決定される。
特定の実施形態では、多選択性組換えタンパク質は、マウスモデルにおいて、少なくとも１０時間、少なくとも２０時間、少なくとも３０時間、少なくとも４０時間、又は約４４時間の終末相半減期を有する。特定の実施形態では、多選択性組換えタンパク質は、カニクイザルモデルにおいて、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、又は約２．８日、又は約４．５日の終末相半減期を有する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、ＦＡＰ発現ＭＣ３８結腸癌マウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害することができる。一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、ＦＡＰ発現ＭＣ３８結腸癌マウスモデルにおける腫瘍増殖を、実施例６に記載されるような処置条件で阻害することができる。
特定の実施形態では、多選択性組換えタンパク質は、ＦＡＰプロテアーゼ活性を阻害しない。特定の実施形態では、多選択性組換えタンパク質の存在下で、ＦＡＰプロテアーゼ活性は、対照と比較して、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、又は２％以下低下する（対照は、多選択性組換えタンパク質の非存在下でのＦＡＰプロテアーゼ活性であってもよい）。例示的な実施形態では、ＦＡＰ活性は、実施例７に例示される方法を用いて測定される。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、２つのＣＤ４０結合ドメインを含み、ここで、当該ＣＤ４０結合ドメイン又は当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、ここで、当該位置番号は、配列番号３の位置と対応する。好ましい一実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、２つのＣＤ４０結合ドメインを含み、ここで、当該ＣＤ４０結合ドメインの各々は、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び１４７位にＱを含み、ここで、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。
一実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、以下の特性のいずれか１つ又は任意の組合せを更に有する：（ｉ）組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、３×１０-10Ｍ未満、又は２×１０-10Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する；（ｉｉ）組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＦＡＰに、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、又は３×１０-10Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する；（ｉｉｉ）組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに、１０-7Ｍ未満、７×１０-8Ｍ未満、又は５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する；（ｉｖ）組換えタンパク質は、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下においてＣＤ４０発現Ｂ細胞中のヒトＣＤ４０を、約１０-8Ｍ以下又は約１０-9Ｍ以下のＥＣ５０値で活性化する；（ｖ）組換え結合タンパク質は、ＦＡＰ、ＣＤ４０、及び血清アルブミンと同時に結合することができる；（ｖｉ）組換えタンパク質がＦＡＰプロテアーゼ活性を阻害しないか、又は、組換えタンパク質の存在下においてＦＡＰプロテアーゼ活性の低下が２５％以下、２０％以下、１５％以下、若しくは１０％以下である；（ｖｉｉ）組換えタンパク質は、マウスモデルにおいて、少なくとも１０時間、少なくとも２０時間、少なくとも３０時間、少なくとも４０時間、又は約４４時間の終末相半減期を有する；（ｖｉｉｉ）組換えタンパク質は、カニクイザルモデルにおいて、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、又は約２．８日間、又は約４．５日間の終末相半減期を有する；（ｉｘ）組換えタンパク質は、ＦＡＰ発現ＭＣ３８結腸癌マウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害することができる；（ｘ）当該２つのＣＤ４０結合ドメインの一方又は当該２つのＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、ここで、位置番号は、配列番号３に対応し、又は、より好ましくは、当該２つのＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び１４７位にＱを含み、位置番号が、配列番号３の位置と対応する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に、１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合し、及び／又はＰＢＳ中のヒトＦＡＰに、１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合し、ＰＢＳ中のヒトＦＡＰに１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合し、ＰＢＳに中のヒト血清アルブミンに１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において、ＣＤ４０発現Ｂ細胞中でヒトＣＤ４０を約１０-8Ｍ以下、又は約１０-9Ｍ以下のＥＣ５０値で活性化する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ヒトＣＤ４０、ヒトＦＡＰ、及びヒト血清アルブミンに同時に結合し、好ましくは、当該同時結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、更に好ましくは、実施例３に記載されるように測定される。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該組換えタンパク質はＦＡＰプロテアーゼ活性を阻害せず、又は組換えタンパク質の存在下におけるＦＡＰプロテアーゼ活性の低下は、２５％以下、２０％以下、１５％以下、若しくは１０％以下である。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、マウスモデルにおいて、少なくとも１０時間、少なくとも２０時間、少なくとも３０時間、少なくとも４０時間、又は約４４時間の終末相半減期を有する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、カニクイザルモデルにおいて、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、又は約２．８日、又は約４．５日の終末相半減期を有する。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該組換えタンパク質は、ＦＡＰ発現ＭＣ３８結腸癌マウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害することができ、好ましくは当該腫瘍阻害は、実施例６に記載されるように測定される。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、２つのＣＤ４０結合ドメインの１つ又は当該２つのＣＤ４０結合ドメイン各々は、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、ここで、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。特定の好ましい実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該２つのＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び１４７位にＱを含み、当該位置番号が、配列番号３の位置と対応する。
一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該組換えタンパク質は、１００ｎＭ以下のＫD値でヒトＦＡＰ、ヒトＣＤ４０、及びヒト血清アルブミンに結合し、当該組換えタンパク質は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、又は約２．８日、又は約４．５日のカニクイザルモデルにおける終末相半減期を有する。
一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該組換えタンパク質は、１００ｎＭ以下のＫD値でヒトＦＡＰ、ヒトＣＤ４０、及びヒト血清アルブミンに結合し、当該組換えタンパク質の存在下で、ＦＡＰプロテアーゼ活性は、対照と比較して、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、又は２％以下低減され、典型的及び好ましくは、当該対照は、組換えタンパク質の非存在下でのＦＡＰプロテアーゼ活性であり、更に典型的及び好ましくは、当該ＦＡＰプロテアーゼ活性は、実施例７に記載されるように測定される。
一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該組換えタンパク質は、１００ｎＭ以下のＫD値でヒトＦＡＰ、ヒトＣＤ４０、及びヒト血清アルブミンに結合し、当該組換えタンパク質は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、又は約２．８日、又は約４．５日のカニクイザルモデルにおける終末相半減期を有し、当該組換えタンパク質の存在下で、ＦＡＰプロテアーゼ活性は、対照と比較して、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、又は２％以下低減され、典型的及び好ましくは、当該対照は、組換えタンパク質の非存在下でのＦＡＰプロテアーゼ活性であり、更に典型的及び好ましくは、当該ＦＡＰプロテアーゼ活性は、実施例７に記載されるように測定される。
特定の実施形態では、本発明の多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該タンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合し、当該タンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＦＡＰに、１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合し、当該タンパク質は、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下においてＣＤ４０発現Ｂ細胞中のヒトＣＤ４０を約１０-8Ｍ以下のＥＣ５０値で活性化し、当該タンパク質は、ＦＡＰ及びＣＤ４０に同時に結合することができ、当該タンパク質がＦＡＰプロテアーゼ活性を阻害しないか、又は、当該組換えタンパク質の存在下においてＦＡＰプロテアーゼ活性の低下が２５％以下であり、当該タンパク質は、少なくとも１０時間のマウスモデルにおける終末相半減期を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組換えタンパク質は、血清アルブミンに特異的に結合する第１のアンキリン反復ドメイン、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する第２のアンキリン反復ドメイン、ＣＤ４０に特異的に結合する第３のアンキリン反復ドメイン、及びＣＤ４０に特異的に結合する第４のアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、以下：（血清アルブミン結合ドメイン）－（リンカー）－（ＦＡＰ結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（ＣＤ４０結合ドメイン）の式にしたがって、Ｎ末端からＣ末端へと配置され、当該組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＦＡＰに１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で特異的に結合し、当該組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０と１０-9Ｍ未満の解離定数（ＫD）で特異的に結合し、当該組換えタンパク質は、ＰＢＳ中のヒト血清アルブミンと１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）で特異的に結合し、当該ＦＡＰ結合ドメインは、セクション３．３に記載されるＦＡＰ結合ドメインのいずれか１つであり、当該２つのＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、セクション３．４に記載されるＣＤ４０結合ドメインのいずれか１つであり、当該血清アルブミン結合ドメインは、セクション３．５に記載される血清アルブミン結合ドメインのいずれか１つであり、リンカーは、セクション３．６に記載のリンカーのいずれか１つである。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質は、ヒトＣＤ４０、ヒトＦＡＰ及びヒト血清アルブミンに同時に結合し、好ましくは、当該同時結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、更に好ましくは、実施例３に記載されるように測定される。特定の実施形態では、組換えタンパク質は、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下においてＣＤ４０発現Ｂ細胞中のヒトＣＤ４０を、約１０-8Ｍ以下のＥＣ５０値で活性化する。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質はＦＡＰプロテアーゼ活性を阻害せず、又は組換えタンパク質の存在下におけるＦＡＰプロテアーゼ活性の低下は、２５％以下である。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質は、マウスモデルにおいて少なくとも２０時間の終末相半減期を有する。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質当該タンパク質は、カニクイザルモデルにおいて少なくとも３日間の終末相半減期を有する。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質は、ＦＡＰ発現ＭＣ３８結腸癌マウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害することができ、当該腫瘍増殖阻害は、好ましくは実施例６に記載されるように測定される。特定の実施形態では、当該２つのＣＤ４０結合ドメインの１つ又は当該多選択性組換えタンパク質の当該２つのＣＤ４０結合ドメインの各々は、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び／又は１４７位にＱを含み、ここで、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質の当該２つのＣＤ４０結合ドメインの各々は、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び１４７位にＱを含み、ここで、位置番号は、配列番号３の位置と対応する。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質は、ポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、当該多選択性組換えタンパク質は、ポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。
３．８．核酸、及び多選択性タンパク質を生成する方法
本開示はまた、本明細書に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを生成する方法を提供する。本開示はまた、当該方法によって得られた組換えタンパク質を提供する。ポリヌクレオチドは、技術分野で周知の手順によって産生及び発現することができる。
一態様では、本開示は、組換え多選択性タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む組成物を提供し、くすんだタンパク質は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する第１のアンキリン反復ドメイン、及びＣＤ４０に特異的に結合する第２のアンキリン反復ドメイン、及び任意選択で半減期延長部分を含む。
一態様では、本開示は、配列番号１、２、３、及び／又は４を含む組換えタンパク質をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一態様では、本開示は、配列番号５及び／又は６を含む組換えタンパク質をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号５８の核酸配列を含む核酸を提供する。
別の態様では、本開示は、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びその変異体を提供し、このような変異体ポリヌクレオチドは、配列番号５８の核酸配列を含む核酸などの、本明細書に開示される任意の核酸と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を共有する。
別の態様では、本開示は、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びその変異体を提供し、そのような変異体ポリヌクレオチドは、非常にストリンジェントな条件下で配列番号５８の配列にハイブリダイズすることができる。「非常にストリンジェントな条件」には、（１）洗浄に低イオン強度及び高温、例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用すること、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５と７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で使用すること、又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ***ＤＮＡ（５０ｐｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、４２℃の０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５５℃の５０％ホルムアミド中で洗浄し、続いてＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を５５℃で行うことが含まれる。
任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本開示に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード又はアンチセンス）又は二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（組換え、ｃＤＮＡ、又は合成）又はＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含み、１対１の方法でＤＮＡ分子に対応するｈｎＲＮＡ分子、及びイントロンを含まないｍＲＮＡ分子を含む。追加のコード配列又は非コード配列は、本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、存在する必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子及び／又は支持材料に連結されてもよいが、連結される必要はない。
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質（又はその個々のドメイン）をコードする多くのヌクレオチド配列があることが当業者には理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。コドン使用の違いによって変化するポリヌクレオチドは、本開示によって具体的に企図される。
本開示はまた、コドン最適化ポリヌクレオチドを含み、核酸配列は、特定の細胞における発現を最大化するように最適化されている。一般に、コドン最適化とは、元のアミノ酸配列を維持しながら、元の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、又はそれ以上のコドン）を、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置換することによって、目的の宿主細胞における発現を増強するために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用の違い）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞における選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用量表は容易に入手可能であり、これらの表は、多くの方法で適合させることができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００））。Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）など、特定の宿主細胞での発現のために特定の配列を最適化するコドンのためのコンピュータアルゴリズムもまた、利用可能である。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質をコードする配列中の１つ又は複数のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、又はそれ以上、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
好適なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築されてもよく、又は技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択されてもよい。選択されたクローニングベクターは、使用されることが意図される宿主細胞に従って変化してもよいが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに単一の標的を有してもよく、及び／又はベクターを含むクローンを選択する際に使用することができるマーカーの遺伝子を保有してもよい。好適な例としては、プラスミド及び細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプト（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）及びその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、並びにｐＳＡ３及びｐＡＴ２８などのシャトルベクターが挙げられる。これら及び多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業用ベンダーから入手可能である。
発現ベクターが更に提供される。発現ベクターは、一般に、本開示によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソーム又は染色体ＤＮＡの一体部分としてのいずれかで、宿主細胞において複製可能でなければならないことが示唆されている。好適な発現ベクターとしては、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、及びＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ベクター成分は、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、好適な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー及びターミネーター）の１つ又は複数を含んでもよいが、これらに限定されない。発現（すなわち、翻訳）について、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、及び停止コドンなどの１つ又は複数の翻訳制御エレメントもまた、通常必要とされる。
目的のポリヌクレオチドを含有するベクター及び／又はポリヌクレオチド自体は、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、又は他の物質を使用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、及び感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染因子である）を含むいくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。導入ベクター又はポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特徴に依存することが多い。
例示的な宿主細胞としては、大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、技術分野で周知の多くの細胞の中でも、大腸菌細胞、ＣＨＯ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、又はＳｐ２．０細胞が挙げられる。
４．治療方法
本明細書に記載の組換えタンパク質は、例えば、癌などの医学的状態を有する対象を例えば治療するために使用することができる。
本開示は、医学的状態を治療する方法を提供し、治療を必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載の組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、対象はヒトである。好ましい実施形態では、医学的状態は癌である。ある特定の実施形態では、癌は固形腫瘍である。特定の実施形態では、癌細胞はＦＡＰを発現する。特定の実施形態では、腫瘍間質細胞はＦＡＰを発現する。
いくつかの実施形態では、癌は、脳癌、膀胱癌、乳癌、明細胞腎癌、子宮頸癌、結腸癌及び直腸癌、子宮内膜癌、胃癌、頭頚部癌、頭頸部扁平上皮癌、***癌、口腔癌、肝臓癌、子宮頸部癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非黒色腫皮膚癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、肉腫、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頚部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、三重陰性乳癌、又は甲状腺癌である。
いくつかの実施形態では、癌は、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、細胞腫、軟骨肉腫、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞性腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎腫瘍、神経芽細胞腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫（ＮＲＳＴＳ）、骨肉腫、傍脊柱肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、又はウィルムス腫瘍である。
いくつかの実施形態では、癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。
いくつかの実施形態では、癌は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、又は小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である。
実際、治療することができる癌としては、胞巣状横紋筋肉腫、骨癌、肛門癌、肛門管癌、又は肛門直腸癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部癌、胆嚢癌又は胸膜の癌、鼻、鼻腔又は中耳癌、口腔の癌、外陰部の癌、食道癌、消化管カルチノイド腫瘍、下咽頭癌、喉頭癌、鼻咽頭癌、腹膜、網及び腸間膜の癌、咽頭癌、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、尿管癌及び膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の態様では、癌は、頭頸部、卵巣、子宮頸部、膀胱、及び食道の癌、膵臓癌、胃腸癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌及び結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、膀胱癌、肺癌、及び細気管支肺胞上皮癌からなる群から選択される。
特定の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部癌、腎癌、三種陰性乳癌、又は胃癌である。特定の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部癌、腎癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、胃癌、リンパ腫、又は白血病である。特定の実施形態では、癌は、脳癌である。
本明細書に記載の組換えタンパク質は、腫瘍を除去するための手術の前又は後に使用されてもよく、放射線療法の前、最中、又は後に使用されてもよい。組換えタンパク質は、触診によって、又はＭＲＩ、超音波、又はＣＡＴスキャンなどの技術分野で周知の画像化技術によって見出されるのに十分に大きい腫瘍を治療するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、少なくとも約２００ｍｍ3、３００ｍｍ3、４００ｍｍ3、５００ｍｍ3、７５０ｍｍ3、又は最大１０００ｍｍ3の寸法を有する進行期腫瘍を治療するために使用される。
５．医薬組成物及び投与
別の態様では、本開示はまた、本明細書に記載の組換え多選択性タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含んでもよい。標準的な医薬担体としては、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水又は水／油エマルジョンなどのエマルジョン、及び様々な種類の湿潤剤が挙げられる。
医薬組成物は、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル推進剤、空気置換剤、アルカリ化剤、抗硬化剤、抗凝固剤、抗菌防腐剤、抗酸化剤、消毒剤、基材、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗剤、希釈剤、消毒薬、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、皮膚軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、フィルム形成剤、調味料、香味料、フローエンハンサー、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、パステル基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶剤、安定剤、坐剤基剤、界面活性剤、界面活性物質、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、張性剤、毒性剤、増粘剤、吸水性剤、水混和性共溶媒、軟水剤、又は湿潤剤を含む、任意の薬学的に許容される成分を含むことができる。例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、２０００年）を参照されたい。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０年）。
医薬組成物は、生理学的に適合性のあるｐＨを達成するように製剤化することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、例えば、約４又は約５～約８．０、又は約４．５～約７．５、又は約５．０～約７．５であり得る。例示的な実施形態では、医薬組成物のｐＨは、５．５～７．５である。
本明細書に記載の組換え多選択性タンパク質は、非経口、経鼻、経口、肺、局所、膣、又は直腸投与などの任意の好適な投与経路を介して対象に投与することができる。非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。詳細については、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６））を参照されたい。
治療レジメンの過程にわたって投与される本開示の活性剤の用量は、投与時から臨床的に許容される時間枠（例えば、１～４週間又はそれ以上（例えば、５～２０週間又は以上））で癌を治療するのに十分であるべきである。特定の実施形態では、期間は更に長くなり得る。用量は、特定の活性剤の有効性及び動物（例えば、ヒト）の状態、並びに時には、治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。特定の用量の投与時に癌が治療される程度は、例えば、活性剤の細胞傷害性又は活性剤で達成された腫瘍退縮の程度によって表すことができる。組換え多選択性タンパク質の細胞傷害性を測定する方法及び腫瘍退縮をアッセイする方法は、技術分野で周知である。例として、本開示を限定することを意図するものではないが、本開示の活性剤の用量は、約０．０００１～約１ｇ／治療される対象の体重ｋｇ／日、約０．０００１～０．００１ｇ／体重ｋｇ／日、又は約０．０１ｍｇ～約１ｇ／体重ｋｇ／日であってもよい。投与単位はまた、体表面積１平方メートル当たりのミリグラムでの量を指すｒａｇ／ｍ2で表されてもよい。
本明細書に記載の組換え多選択性タンパク質は、別の抗癌剤などの別の治療剤と組み合わせて使用することができる。各治療剤は、同時に（例えば、同じ薬剤で、又は同時に）、並行して（すなわち、任意の順序で一方が他方の直後に投与される別個の薬剤中で）、又は任意の順序で逐次的に投与されてもよい。逐次投与は、併用療法における治療剤が異なる剤形（例えば、１つの薬剤が錠剤又はカプセルであり、別の薬剤が滅菌液体である）である場合、及び／又は異なる投与スケジュールで投与される場合、例えば、少なくとも毎日投与される化学療法剤と、及び週に１回、２週間に１回、３週間に１回などの少ない頻度で投与される生物療法剤の場合に有効である。
実施例１－多選択性結合タンパク質の設計
様々なフォーマットの多選択性結合タンパク質を産生し、それらのＦＡＰ特異性、有効性、及びＣＤ４０活性化の効力を決定した。これらの多選択性タンパク質は全て、ＦＡＰ特異的結合ドメイン及びＣＤ４０特異的結合ドメインを含んだ。（ｉ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン（複数可）を添加すること、（ｉｉ）更なるＣＤ４０結合ドメイン（複数可）を添加することによって結合価を増加させること、及び（ｉｉｉ）タンパク質内の結合ドメインの順序を変更することによる影響を評価した。
異なるフォーマットを比較するために、ＣＤ４０誘発時にヒトＢ細胞上に発現される、共刺激受容体ＣＤ８６の上方制御を測定するインビトロアッセイを設定した。この細胞アッセイは、ＦＡＰ発現細胞の存在下又は非存在下において初代ヒトＢ細胞を使用した。ＣＤ８６共刺激分子の上方制御をＢ細胞活性化のマーカーとして評価した。その作用機序がＦＡＰ媒介架橋から独立している抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を、参照材料として使用した。
異なるフォーマットの多選択性タンパク質。表２に概説したように、１つのＦＡＰ特異的結合ドメイン及び１つのＣＤ４０特異的結合ドメイン、いくつかの多選択性タンパク質フォーマットを含む、親分子による開始（配列番号５９；ＳＭＡ０１４）によって、いくつかの多選択性タンパク質フォーマットが産生された。
Figure 2023528204000002
表２中の「Ｃ」、「Ｆ」、及び「Ｈ」は、それぞれ、ＣＤ４０、ＦＡＰ、及びＨＳＡと特異的に結合するアンキリン反復ドメインを示す。表２に示される異なるドメインの順序は、タンパク質の分子構造におけるＮ末端からＣ末端までのドメインの実際の配列を反映する。全てのタンパク質は更に、Ｈｉｓタグ（配列番号５７）を、Ｎ末端で精製を容易にするために有する。
材料及び方法
参照として、ＣＤ４０モノクローナル抗体を使用した。このＣＤ４０ ｍＡｂ（ＩｇＧ２ ｍＡｂ）のＣＤ４０への結合は、ＦＡＰとは無関係に抗原提示細胞の活性化をもたらす。抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、米国特許出願第７，３３８，６６０Ｂ２号の配列２１．４．１に対応する。
ＣＨＯ細胞を、５％ＣＯ2で１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中において３７℃にて培養し、アキュターゼを用いて２～３日毎に分割して、細胞を分離した。
ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞株は、細胞表面にヒトＦＡＰを発現する安定にトランスフェクトされたクローン細胞株である。ヒトＦＡＰのＯＲＦのＧＦＰ融合を含むプラスミドは、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（＃ＲＧ２０４６９２）から入手した。ヒトＦＡＰ（ＧＦＰなし）をコードするｃＤＮＡは、標準的な分子生物学技術を使用してサブクローニングした。次いで、このプラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトして、リポフェクタミンを使用してヒトＦＡＰを過剰発現する安定したトランスフェクタントを生成した。異なる濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ－４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ８０９１）を使用して選択圧力をかけた。ＦＡＰの発現を、ＥＳＣ１１に対応する抗ＦＡＰ抗体を用いるフローサイトメトリーによって分析した（国際公開第２０１１／０４０９７２号）。条件１．９ｍｇ／ｍＬのＧ－４１８からのＦＡＰ－ＣＨＯトランスフェクタントの集団（ＦＡＰ－ＣＨＯ－１．９）はより低いＦＡＰ発現レベルを示し、条件１．７ｍｇ／ｍＬからの集団（ＦＡＰ－ＣＨＯ－１．７）はより高いＦＡＰ発現レベルを示した。この実施例におけるデータを、ＦＡＰ－ＣＨＯ－１．７を用いて産生した。
インビトロＢ細胞活性化アッセイ。インビトロＢ細胞活性化アッセイの設計を、図１に概略的に示す。バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手し、ＰＢＳで希釈した。次いで、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブを使用した密度遠心分離によって単離した。数回の洗浄ステップ後、製造業者の推奨に従い、陽性選択（ヒトＣＤ１９ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓキット）を用いて、ＣＤ１９+Ｂ細胞をＰＢＭＣから濃縮した。１×１０5／ウェルのＣＤ１９+Ｂ細胞及び５×１０4細胞／ウェルのＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞又はＣＨＯ野生型（ＷＴ－ＣＨＯ）細胞を、示された分子の用量滴定（４００、２００、４０、８、５、１．６、０．３、０ｎＭ）と共に、６００μＭのＨＳＡを含む又は含まないＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ中で一緒に９６ウェルプレートへと播種した。培養物を３７℃で５％のＣＯ２にて２４時間インキュベートし、ＣＤ２０+Ｂ細胞上のＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御を、ＡｔｔｕｎｅＮｘＴを用いたフローサイトメトリーによって評価した。
ＦＡＣＳ染色、フローサイトメーター設定、及び抗体希釈。細胞を、最初に１５０μＬのＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中で希釈した（１：１００）１００μＬのＢＤヒトＦｃ－Ｂｌｏｃｋと共に室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。Ｆｃブロッキングインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した１００μＬの直接標識抗体（希釈因子については以下の表３を参照）と共にインキュベートし、暗所で４℃にて更に２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中で希釈した１００μＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（１：１０００）に再懸濁し、暗所で４℃にて２０分間インキュベートした。ＦＢＳ反応を含有するＦＡＣＳ緩衝液１００μＬを添加して、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色反応を停止させた。細胞を、ＰＢＳで再度洗浄し、製造業者の推奨に従って水中で希釈したＢＤ細胞固定溶液（１：１０）を用いて固定した。抗体の希釈及びＦＡＣＳ設定を以下の表３に概説する。ＦＡＣＳ機械の補償は、製造業者の推奨に従って補償ビーズにより行った（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；ＡｂＣ（商標）Ｔｏｔａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ）。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．０．３）を用いて、Ｒａｗ＿ｆｃｓファイルを分析した。細胞を、Ｌｉｖｅ－Ｄｅａｄ識別色素を用いて生細胞でゲーティングした後、ＣＤ８６について図２に示すように、ＣＤ２０陽性細胞でゲーティングした。ＣＤ８６のＭＦＩ及び陽性細胞の割合をエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン８．１．２を用いてプロットした。
Figure 2023528204000003
ＥＣ５０決定。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０２を使用して、ｌｏｇモードでｘ値（濃度）を変換し、ＥＣ５０値を決定するための可変勾配（３パラメータ）の方程式で非線形モードｌｏｇ（アゴニスト）対応答に適合させることによって決定した。
有効性決定。有効性値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０２を用いて、最高濃度（４００ｎＭ）でのＭＦＩ値についての重複の平均を計算することによって決定した。
結果
ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）は、二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０アンキリン反復結合タンパク質（Ｆ－Ｃフォーマット）の効力及び有効性を損なう。Ｆ－Ｃフォーマットの二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子であるＳＭＡ０１４を、１つ（Ｈ－Ｆ－Ｃ、ＳＭＡ０８７）又は２つ（Ｈ－Ｆ－Ｃ－Ｈ、ＳＭＡ０９５）のＨＳＡ結合アンキリン反復ドメインを付加する異なるフォーマットでクローニングし、インビトロＢ細胞活性化アッセイで試験した。図３に示されるように、ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）は、Ｆ－Ｃフォーマットにおける元の二重特異性結合タンパク質の効力及び有効性の両方を損ない、障害のレベルは、結合タンパク質に付加されたＨＳＡ結合ドメインの数と相関した。重要なことに、阻害は、ヒト血清中のアルブミンの生理学的濃度を模倣する６００μＭのアルブミンの存在下においてより顕著であった。複合体ＨＳＡ結合剤／アルブミンは、ＣＤ４０ドメイン及び／又はＦＡＰドメイン（複数可）の結合、したがって活性についての立体障害であり得ると仮定することはもっともらしい。予想されたように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質及び抗ＣＤ４０ ｍＡｂは用量依存的様式でＣＤ８６を上方制御し、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質はＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下においてのみ活性であった（図３）。ＨＳＡの非存在下及び存在下において、ＨＳＡ結合ドメインは、ＦＡＰ特異的な作用様式に影響を及ぼさなかった。予想されるように、アゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、ＦＡＰ発現とは無関係にヒトＢ細胞の活性化を誘導し、ＦＡＰ－ＣＨＯ細胞又はＷＴ－ＣＨＯ細胞のいずれかの存在下においてＢ細胞を活性化した。２つの独立した実験のＥＣ５０（効力）平均値及び最大ＭＦＩ（有効性）平均値を、ＦＡＰ－ＣＨＯについては表４及び表５に、ＷＴ－ＣＨＯについては表６にそれぞれ概説する。
要約すると、半減期延長ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）の付加は、二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０結合タンパク質（Ｆ－Ｃフォーマット）の機能性を損ない、阻害は付加されたＨＳＡ結合ドメインの数と共に増加し、阻害は生理学的濃度のアルブミンの存在下においてより顕著であった。
ＣＤ４０の二価性は、効力及び有効性を増加させ、ＨＳＡ結合ドメインによって誘導される阻害効果を救済する。次いで、本出願人は、ＣＤ４０価が二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子の性能にどのように影響するかを調査した。Ｆ－Ｃフォーマットの二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子であるＳＭＡ０１４を、１つ（Ｆ－Ｃ－Ｃ、ＳＭＡ１０４）又は２つ（Ｆ－Ｃ－Ｃ－Ｃ、ＳＭＡ１０５）のＣＤ４０結合ＤＡＲＰｉｎドメインを付加する異なるフォーマットでクローニングし、インビトロＢ細胞活性化アッセイで試験した。図４に示すように、二価及び三価フォーマットはＣＤ８６のより強い上方制御を誘導し、このことは、結合価が分子の性能に有利に寄与することを示している。具体的には、ＣＤ４０二価性（ＳＭＡ１０４）は、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における分子の効力（２０倍）及び効力（２倍）を強く増大させた。ＣＤ４０三価（ＳＭＡ１０５）は、ＣＤ４０二価と比較して分子の効力をわずかに増加させただけであり、効力に更なる影響を及ぼさなかった。ＦＡＰの非存在下では、二価ＣＤ４０フォーマット（ＳＭＡ１０４）はヒトＢ細胞上のＣＤ８６の上方制御を誘導しなかったが、三価ＣＤ４０フォーマット（ＳＭＡ１０５）は、ＦＡＰの非存在下でもわずかな活性化を最高濃度で示し、三価ＣＤ４０結合剤によって誘導されるＦＡＰ非依存的活性化の可能性を示唆した。これらの結果を考慮して、二価ＣＤ４０フォーマットを更なる特徴付けのために選択した。特に、本出願人は、ＣＤ４０二価がＨＳＡ結合ドメインの阻害効果を救済することができるかどうかを試験した。この問題に対処するために、二価ＣＤ４０構築物ＳＭＡ１０４を、異なる位置において追加のＨＳＡ結合ドメイン（複数可）と共にクローニングした（クローンＳＭＡ０９１、ＳＭＡ０９９、及びＡＳ５７９；これらのドメインフォーマットの情報については上記の表２を参照されたい）。全ての試験したフォーマットは、ＳＭＡ０１４と比較して改善された効力及び有効性を示した（図５Ａ）。重要なことに、ＨＳＡの存在下におけるより生理学的な条件においては、ＨＳＡ結合ドメインを有する全てのフォーマットの活性は低下したが、ＳＭＡ０９１は、ＳＭＡ０１４と比較して依然として改善された活性を示した（図５Ｂ）。アンキリン反復結合タンパク質はいずれも、最高濃度のＦＡＰの非存在下においてさえもＢ細胞上のＣＤ８６の発現を増強しなかった（図５Ａ及び図５Ｂ）。予想されるように、アゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、ＦＡＰ発現とは無関係にヒトＢ細胞の活性化を誘導し、ＦＡＰ－ＣＨＯ又はＷＴ－ＣＨＯのいずれかによりＢ細胞を活性化した。２つの独立した実験のＥＣ５０（効力）平均値及び最大ＭＦＩ（有効性）平均値を、ＦＡＰ－ＣＨＯについては表４及び表５に、ＷＴ－ＣＨＯについては表６にそれぞれ概説する。
Figure 2023528204000004
Figure 2023528204000005
Figure 2023528204000006
結論：Ｆ－Ｃフォーマットの二重特異性ＦＡＰｘＣＤ４０アンキリン反復タンパク質は、機能的細胞アッセイにおける良好な生物学的活性、及び良好な物理的特性を示した。しかしながら、この結合タンパク質は、その臨床開発を可能にするために半減期延長ドメインを必要とし得る。したがって、異なるフォーマットを分析して、半減期延長ＨＳＡ結合ドメインの数及び位置が分子の活性に影響を及ぼすかどうか、及びどのように影響を及ぼすかを決定した。半減期延長ドメインは分子の活性に有害な影響を及ぼし、この影響は、半延長ドメインの数及びＨＳＡの存在と共に増加することが観察された。更に、驚くべきことに、（２つのＣＤ４０結合ドメインを有することによる）ＣＤ４０二価は、結合タンパク質の効力（２０倍）及び有効性（２倍）を強く増加させ、かつストリンジェントなＦＡＰ特異的作用機序を維持したが、（３つのＣＤ４０結合ドメインを有することによる）ＣＤ４０三価は、ＣＤ４０二価と比較して効力をほんのわずかしか増加させず、有効性に更なる影響を示さなかったことが見出された。加えて、三価ＣＤ４０結合タンパク質は、ＦＡＰの非存在下においてもまた、わずかな活性化を最高濃度で示し、ＦＡＰ特異的な作用様式の部分的喪失を示唆した。ＣＤ４０二価は、結合タンパク質の効力及び有効性を増加させることによって、１つの半減期延長ドメインの阻害効果を救済することができることが更に見出された。具体的には、生理学的濃度のＨＳＡにおいて、Ｈ－Ｆ－Ｃ－Ｃフォーマットの結合タンパク質は、Ｆ－Ｃフォーマットの結合タンパク質に匹敵する活性及びＦＡＰ特異性を保持した。結論として、第２のＣＤ４０結合ドメインを付加することによって、本発明者らは、ＨＳＡ結合半減期延長ドメインの有害な影響を防止し、かつＦ－Ｃフォーマットの親結合タンパク質と同様の機能的特性を有するが、その臨床開発を促進する半減期延長ドメインを備えた分子を産生することができた。これら全ての理由から、更なる調査のためにＨ－Ｆ－Ｃ－Ｃドメインフォーマットを選択した。このフォーマットは、以下の実施例に記載されている、配列番号５（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５又は単に「タンパク質＃５」）、配列番号６（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６又は単に「タンパク質＃６」）、配列番号７（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７又は単に「タンパク質＃７」）のアミノ酸配列を含む本発明の結合タンパク質で使用される。
実施例２－本発明の多選択性結合タンパク質の生物物理学的特性、結合親和性、及び結合特異性
この実施例は、本発明の多選択性結合タンパク質の（１）凝集体形成などの生物物理学的特性と、（２）様々な標的タンパク質（すなわち、ＦＡＰ、ＣＤ４０及び血清アルブミン）に対する結合親和性及び種交差反応性とを決定するために行われた実験を記載する。
凝集体形成
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び多角度光散乱（ＭＡＬＳ）による、タンパク質＃５（本明細書のＳＭＡ１３６ともまた称されることもある）を分析した。図６はこの分析の結果を示す。このＳＥＣプロファイルは、タンパク質＃５が溶液中で単量体及び単分散性であり、かつ凝集体を形成しないことを実証している。
標的タンパク質に対する結合親和性
概要。ヒト、カニクイザル、及びマウス由来のＣＤ４０、ＦＡＰ、及び血清アルブミンに対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５（「タンパク質＃５」）の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析した。結果は、タンパク質＃５が、（ｉ）ヒト及びカニクイザル由来のＣＤ４０、（ｉｉ）ヒト、マウス、及びカニクイザル由来の血清アルブミン、並びに（ｉｉｉ）ヒト及びカニクイザル由来のＦＡＰに特異的に結合することを示した。マウスＣＤ４０及びマウスＦＡＰに対する特異的結合は検出されなかった。タンパク質＃５の動力学的パラメータを表７に概説する。ヒトＣＤ４０、ヒトＦＡＰ、及びヒト血清アルブミンに対するタンパク質＃５の結合のＳＰＲトレースを図７に示す。
Figure 2023528204000007
 *値は、二重測定の平均を表す。
**値は、三連測定の平均を表す。
†Ｃｈｉ2／Ｒｍａｘ＞１０％が不正確な適合として定義される
！タンパク質＃５上のＭＳＡ結合のＫDは、チップ上のＭＳＡの強い非特異的結合のために過大評価される
未検出：複製が行われなかったために決定されなかった標準偏差
材料及び方法
全てのＳＰＲ測定を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（ＢｉｏＲａｄ）及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４の泳動用緩衝液を用いて行った。１：１ラングミュアモデルをＳＰＲトレースのフィッティングに使用した。
異なる種のＣＤ４０に結合するタンパク質＃５のＰｒｏｔｅＯｎセットアップ：異なる種（ヒト、カニクイザル、マウス）のＣＤ４０タンパク質（AcroBio system）を、当分野で周知の標準的な方法でビオチン化し、ｂｉｏ－ｈＣＤ４０、ｂｉｏ－ｃＣＤ４０、及びｂｉｏ－ｍＣＤ４０タンパク質を得た。ｂｉｏ－ｈＣＤ４０、ｂｉｏ－ｃＣＤ４０、及びｂｉｏ－ｍＣＤ４０タンパク質を、それぞれ、３００ＲＵ、２５０ＲＵ、及び３００ＲＵのレベルまでＮＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に固定化した。ＣＤ４０へのタンパク質＃５の相互作用を、１００μＬ／分の一定流を用いて、１２０秒の会合及び９００秒の解離で、３、１．５、０．７５、０．３８、及び０．１９ｎＭの段階希釈でタンパク質＃５を注入することによって測定した。測定を２回又は３回繰り返し、１００μＬ／分の流量で１８秒間にわたり１０ｍＭグリシンｐＨ２を用いて、個々の測定の間に標的を再生した。シグナルを、泳動用緩衝液（ＰＢＳＴ）処理された対照レーンに対して二重参照した。
異なる種の血清アルブミンに結合するタンパク質＃５のＰｒｏｔｅＯｎセットアップ。まず、ヒトＦＡＰ（ｈＦＡＰ）をＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上において７００ＲＵのレベルまでコートした後、５０ｎＭタンパク質＃５を、分析物として１２０秒間（０秒の解離）にわたり１００μＬ／分の一定流量で１２０ＲＵのレベルまで固定化した。タンパク質＃５への血清アルブミンの結合を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣＳＡ）、及びマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を１００、３３、１１、及び３．７ｎＭの段階希釈で、１００μＬ／分の一定流量で１２０秒の会合及び６００秒の解離と共に注入することによって測定した。ＨＳＡ、ＣＳＡ、及びＭＳＡ結合を連続的に測定し、ｈＦＡＰ／タンパク質＃５複合体を、１００μＬ／分の流量で１８秒間にわたり１０ｍＭグリシンｐＨ２で毎回再生した。したがって、タンパク質＃５は、各再生ステップ後にｈＦＡＰ上で再固定化されなければならなかった。シグナルは対照レーンに対して二重参照した（（ａ）ＰＢＳＴ泳動用緩衝液；（ｂ）タンパク質＃５が結合しない非関連標的でコート覆）。解離の最初の３００秒間で動力学を計算した。
異なる種のＦＡＰに結合するタンパク質＃５についてのＰｒｏｔｅＯｎ設定。ｈＦＡＰ、カニクイザルＦＡＰ（ｃＦＡＰ）、及びマウスＦＡＰ（ｍＦＡＰ）を、それぞれ、１２００ＲＵ、８００ＲＵ、及び２０００ＲＵのレベルまで１０ｍＭの酢酸Ｎａ緩衝液ｐＨ５．３におけるＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）に固定化した。ＦＡＰ及びタンパク質＃５の相互作用を、１００μＬ／分の一定流を用いて、１２０秒の会合及び１８００秒の解離で、５０、２５、１２、６．５、及び３．１３ｎＭの段階希釈でタンパク質＃５を適用することによって測定した。標的を、１０ｍＭグリシンｐＨ２及び１２４ｍＭ Ｈ3Ｐ０4を使用して再生した。シグナルをＰＢＳＴ処理された対照レーンに対して二重参照した。
結果及び結論
表面プラズモン共鳴測定は、タンパク質＃５が、それぞれ、１０３±１２ｐＭ及び１０１±１１ｐＭの本質的に同一の結合親和性（ＫD）により、ヒト及びカニクイザルＣＤ４０にしっかりと結合することを示した。タンパク質＃５は、潜在的には、わずか５７．５％である細胞外ドメインの低い配列同一性のため、マウスＣＤ４０に対して交差反応性ではない。タンパク質＃５は、５０ｎＭの結合親和性（ＫD）でヒト血清アルブミンへの結合を示した。更には、タンパク質＃５は、ヒトＦＡＰ及びカニクイザルＦＡＰに対する結合を示し、類似する結合親和性（ＫD）がそれぞれ０．３０７ｎＭ及び０．３３９ｎＭであったが、一方でマウスＦＡＰについては交差反応性を検出することができなかった。
実施例３－表面プラズモン共鳴によって分析されたＣＤ４０、ＦＡＰ、及び血清アルブミンへのタンパク質＃５の同時結合
以下の実験は、配列番号５を含む多選択性特異的タンパク質のヒトＣＤ４０、ヒトＦＡＰ、及びヒト血清アルブミンへのそれぞれの同時結合を分析するために行われた表面プラズモン共鳴実験を記載している。
材料及び方法。ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＳＰＲ測定を行った。泳動用緩衝液は、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ）であった。ビオチン化ヒトＣＤ４０（ｂｉｏ－ｈＣＤ４０－Ｆｃ）を、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコートＮＬＣセンサーチップ上に５５０ＲＵのレベルまで固定化した。第１の分析物ステップ（分析物１）において、２５ｎＭのタンパク質＃５を、１２０秒の会合及び０秒の解離でｂｉｏ－ｈＣＤ４０に固定化した。この第１のステップの直後に、ＰＢＳＴ、２５ｎＭタンパク質＃５、又は５０ｎＭ ｈＦＡＰのいずれかを１２０秒の会合及び０秒の解離で注入する、第２の分析物ステップ（分析物２）を行った。第３のステップ（分析物３）では、ＰＢＳＴ、５０ｎＭｈＦＡＰ、又は５０ｎＭＨＳＡのいずれかを、１２０秒の会合及び６００秒の解離で適用した（注入スキーム：表８参照）。実験全体を１００μＬ／分の一定流量で行った。この設定は、タンパク質＃５（分析物１）が既にＣＤ４０に結合している（チップ上に固定化されている）場合にのみ、ｈＦＡＰ及びＨＳＡの結合を可能にした。シグナルを、Ｌ６及びＡ６のＰＢＳＴ処理された対照レーンに対して二重参照した。
Figure 2023528204000008
結果。ｈＣＤ４０、ｈＦＡＰ、及びＨＳＡへのタンパク質＃５の同時結合のＳＰＲトレースを図８に示す。簡潔には、５５０ＲＵのビオチン化ヒトＣＤ４０をニュートラアビジンチップ上に固定化した。第１の会合ステップにおいて、タンパク質＃５をｈＣＤ４０に飽和に結合させ、図８の注入１に示されるように２００ＲＵの総シグナルに達した。第２の会合ステップ（図８、注入２）において、ｈＦＡＰを複合体タンパク質＃５／ＣＤ４０に結合させ、２００ＲＵの増加をもたらした。タンパク質＃５は、注入１と注入２との間の時間間隔の間に、既にｈＣＤ４０から解離し始めたことに留意しなければならない（７５ＲＵの喪失）。第３の会合ステップ（図８、注入３）は、複合体ｈＣＤ４０／タンパク質＃５／ｈＦＡＰへのヒト血清アルブミンの結合をもたらし（８０ＲＵの増加）、３つ全ての標的へのタンパク質＃５の同時結合が起こったことを示した。
結論として、表面プラズモン共鳴研究の結果は、タンパク質＃５が、ＣＤ４０、ＦＡＰ、及び血清アルブミンへ同時に結合することができることを示す。
実施例４－ＣＤ４０を介したヒトＢ細胞の活性化
この研究の目的は、多選択性結合タンパク質、配列番号５を含むタンパク質＃５、及び配列番号６を含むタンパク質＃６の生物学的活性及びＦＡＰ特異的な作用機序を評価することであった。タンパク質＃５及びタンパク質＃６を、ＦＡＰ発現細胞の存在下又は非存在下において、初代ヒトＢ細胞を用いる細胞アッセイで試験した。共刺激分子、特にＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御を、ＣＤ４０シグナル伝達によって媒介されるＢ細胞活性化のマーカーとして評価した。作用機序がＦＡＰ媒介架橋から独立している抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を、参照材料として使用した。タンパク質＃５又はタンパク質＃６の効力、有効性、及びＦＡＰ特異性を、参照材料と比較して評価した。
ヒトＢ細胞活性化アッセイで得られたインビトロデータは、タンパク質＃５及びタンパク質＃６が、ＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御によって反映されるようにＣＤ４０活性化を介してＢ細胞を活性化することができること、並びにタンパク質＃５及びタンパク質＃６が、ＦＡＰ陽性細胞の存在下においてのみＢ細胞を活性化することができるが、ＦＡＰ陰性細胞の存在下では活性化することができないことを示し、これにより、ＦＡＰ媒介性架橋に厳密に依存する作用機序が確認された。
材料及び方法
インビトロＢ細胞活性化アッセイ、ＦＡＣＳ染色、フローサイトメーター設定及び抗体希釈、ＥＣ５０決定及び有効性決定を、本質的に実施例１に記載のように行った。
参照として使用される抗ＣＤ４０抗体並びにＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞及びＦＡＰ非発現ＣＨＯ細胞は、実施例１において記載されるようなものであった。
結果
タンパク質＃５及びタンパク質＃６は、ＦＡＰ依存的な作用機序により、ヒトＢ細胞における共刺激分子の上方制御を誘導する。タンパク質＃５及びタンパク質＃６を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において、ＣＤ４０を介してヒトＢ細胞を活性化するそれらの能力について評価した。タンパク質＃５は、０．０４ｎＭ～０．０７ｎＭのＥＣ５０である、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞と共培養されたヒトＢ細胞における共刺激分子ＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御を誘導した（図９）。逆に、タンパク質＃５は、非ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞、野生型（ＷＴ）－ＣＨＯ細胞の存在下においてヒトＢ細胞を活性化しなかった（図１０）。予想されるように、アゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、ＦＡＰ発現とは無関係にヒトＢ細胞の活性化を誘導し、ＦＡＰ－ＣＨＯ又はＷＴ－ＣＨＯのいずれかによりＢ細胞を活性化した。タンパク質＃５についての結果と同様の結果がタンパク質＃６について得られた。
結論
タンパク質＃５及びタンパク質＃６は、ＦＡＰ陽性ＣＨＯ細胞の存在下でのみ、初代ヒトＢ細胞での２つの異なる共刺激分子、ＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御を誘導したが、ＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下では誘導せず、これによりＦＡＰ媒介性架橋に厳密に依存する作用機序が確認された。ＦＡＰの存在下におけるタンパク質＃５は、比較抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と同様の効力及び有効性を示した。タンパク質＃５は、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において、０．０４ｎＭ～０．０７ｎＭのＥＣ５０で用量依存的様式にて共刺激分子の上方制御を誘導した。同様の結果がタンパク質＃６について得られた。
実施例５－ＣＤ４０を介したヒト樹状細胞の活性化
ヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）を用いて、実施例４のＢ細胞について記載されるものと概念的に同様の研究を行った（図１１の概略図を参照のこと）。
この研究の目的は、多選択性結合タンパク質、配列番号５を含むタンパク質＃５、及び配列番号６を含むタンパク質＃６の生物学的活性及びＦＡＰ特異的な作用機序を評価することであった。タンパク質＃５及びタンパク質＃６を、ＦＡＰ発現細胞の存在下又は非存在下において、ヒトＭＤＤＣを用いる細胞アッセイで試験した。共刺激分子、特にＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＣＤ８０、並びにＩＬ－１２の分泌の上方制御を、ＣＤ４０シグナル伝達によって媒介されるＭＤＤＣ活性化のマーカーとして評価した。作用機序がＦＡＰ媒介架橋から独立している抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を、参照材料として使用した。タンパク質＃５又はタンパク質＃６の効力、有効性、及びＦＡＰ特異性を、参照材料と比較して評価した。
ヒトＭＤＤＣ活性化アッセイで得られたインビトロデータは、タンパク質＃５及びタンパク質＃６が、共刺激分子及びＩＬ－１２の分泌の上方制御によって反映されるようにＣＤ４０活性化を介してＭＤＤＣを活性化することができること、並びにタンパク質＃５及びタンパク質＃６が、ＦＡＰ陽性細胞の存在下においてのみＭＤＤＣを活性化することができるが、ＦＡＰ陰性細胞の存在下では活性化することができないことを示し、これにより、ＦＡＰ媒介性架橋に厳密に依存する作用機序が確認された。タンパク質＃５は、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下では、それぞれ０．０３ｎＭ～７．６７ｎＭ及び０．８３ｎＭ～７．６３ｎＭのＥＣ５０により、用量依存的様式で共刺激分子の上方制御及びＩＬ－１２の分泌を誘導することができたが、ＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下では誘導することができなかった。同様の結果がタンパク質＃６で得られた。
結論として、この研究は、タンパク質＃５及びタンパク質＃６が、ＦＡＰ依存的様式で、インビトロにてＣＤ４０を介してヒトＭＤＤＣを活性化することができることを示した。
実施例６－タンパク質＃７はインビボで抗腫瘍活性を実証した
以下の実施例では、マウスＭＣ３８結腸癌モデルにおいて、多選択性結合タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７の反復用量の用量依存的インビボ有効性を評価した。タンパク質＃７は、マウスＦＡＰに結合するＦＡＰ結合ドメインと、マウスＣＤ４０に結合するＣＤ４０結合ドメインとを含む、タンパク質＃５又はタンパク質＃６のマウス代用物である。ＭＣ３８癌腫モデルはＣＤ４０アゴニスト処置を受けやすいことが以前に示されている。ＭＣ３８などの同系マウス腫瘍は、一般に、ヒト腫瘍間質と比較して非常に低レベルの間質ＦＡＰを発現することが見出されているので、ＭＣ３８細胞株を、ＦＡＰを発現するようにトランスフェクトし、それにより、ヒト腫瘍において観察されるＦＡＰ発現をより良好に模倣した。
記載された研究では、ＰＤ１０３２、ＰＤ１０３３、ＰＤ１０３５、及びＰＤ１０３８では、タンパク質＃７（Ｎ末端Ｈｉｓ－タグ（配列番号５７）；ＡＳ５９８とも称される）は、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で試験され、研究ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３３では、１２．５ｍｇ／ｋｇの用量でもまた試験された。マウスＣＤ４０に結合する市販の抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ４５；ＢｉｏＸｅｌｌ）を陽性対照として使用した。タンパク質＃７の非ＦＡＰ結合変異体（ＡＳ６０８と称される；Ｎ末端Ｈｉｓ－タグを有する配列番号６７（配列番号５７）これは、ＦＡＰ結合ドメインが非結合アンキリン反復ドメインによって置き換えられている）を、ｍＦＡＰへの結合に対するタンパク質＃７の薬理学的活性の依存性を実証するための陰性対照分子として使用した。
本発明の多選択性結合タンパク質、例えば、タンパク質＃７などは、全身毒性を低下させるために腫瘍組織において局所的にＣＤ４０を活性化することが意図される。したがって、タンパク質＃７の安全性プロファイルを評価するために、肝臓毒性を誘導することが知られている抗ｍＣＤ４０抗体と比較して、体重減少、血清サイトカイン、及びアミノ基転移酵素上昇、並びに肝組織損傷を含む全身毒性のいくつかのパラメータを腫瘍増殖及び阻害に加えて決定した。
材料及び方法：
腫瘍実験：腫瘍実験は、図１２で概略的に示すように行った。同系マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊ）の右側腹部領域へＭＣ３８－ｍＦＡＰポリクローナル腫瘍細胞を皮下接種した（０日目）。マウスを処置群に無作為化し、同日に処置した（２５日目にＰＤ１０３２、３９日目にＰＤ１０３３、２６日目にＰＤ１０３５、３７日目にＰＤ１０３８）。次いで、表９に示されるように、所定のレジメンに従って、試験物質（ＡＳ５９８、ＡＳ６０８、ＦＧＫ４５）を担腫瘍マウスに投与した（図１２もまた参照されたい）。腫瘍増殖を、接種後それぞれ、３６、４３、３６、及び４０日目まで、ノギス測定によって３～４日毎にモニターした。実験の３６日目（ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３５）に、マウスを屠殺し、腫瘍を除去し、フローサイトメトリーによって免疫表現型決定を行った。実験の４３日目（ＰＤ１０３３）及び４０日目（ＰＤ１０３８）に、マウスを屠殺し、腫瘍を除去し、フローサイトメトリーによって免疫表現型決定を行った。
ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３５は抗腫瘍有効性の２つの独立した主研究であったが、ＰＤ１０３３及びＰＤ１０３８はＦＡＣＳによる腫瘍環境分析のための２つの隣接研究であった。主な試験では、ＡＳ５９８を、２．５ｍｇ／ｋｇ（研究ＰＤ１０３２、ＰＤ１０３５）及び１２．５ｍｇ／ｋｇ（研究ＰＤ１０３２）の用量で４日毎に３回投与した。非ＦＡＰ標的化対照ＡＳ６０８を２．５ｍｇ／ｋｇで４日毎に３回投与した（研究ＰＤ１０３５）。ＦＡＣＳ分析のための早期終了試験では、ＡＳ５９８を、２．５ｍｇ／ｋｇ（研究ＰＤ１０３３、ＰＤ１０３８）及び１２．５ｍｇ／ｋｇ（研究ＰＤ１０３３）の用量により３日の間隔を空けて２回投与した。非ＦＡＰ標的化対照のＡＳ６０８を、同様に、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で３日の間隔を空けて２回投与した（研究ＰＤ１０３８）。抗ＣＤ４０抗体ＦＧＫ４５を全ての研究において陽性対照として使用し、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質と同じスケジュールで５ｍｇ／ｋｇ（２．５ｍｇ／ｋｇのＡＳ５９８と等しいモル用量）で投与した。
Figure 2023528204000009
 注：Ｎ：動物数；ＰＤ１００３３におけるマウス数／群は、ＰＤ１０３８とは異なった（Ｎ／Ｎ）
腫瘍接種：標準的なイソフルラン麻酔下において、９０匹（ＰＤ１０３２＋ＰＤ１０３３）又は１０５匹（ＰＤ１０３５＋ＰＤ１０３８）の雌Ｃ５７ＢＬ６マウスの右後側腹部／背部領域に、腫瘍発生のために０．２ｍＬのＰＢＳ中のＭＣ３８－ｍＦＡＰポリクローナル腫瘍細胞（９×１０6）を皮下接種した。
腫瘍測定：腫瘍接種後、１５日目（ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３３）又は１４日目（ＰＤ１０３５及びＰＤ１０３８）から週に２回腫瘍測定を行った。腫瘍の長さ及び幅をノギスで測定した。腫瘍体積を以下の式で計算した：（長さｘ（幅）2ｘπ）／６
無作為化：腫瘍体積に基づく群無作為化を、腫瘍接種後２５、３９、２６、及び３７日目に行った。腫瘍を移植した元の９０匹（ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３３）のマウスから、腫瘍接種の２５日後に、４０匹をそれぞれ１０匹の動物の４つのサブグループに無作為化した（ＰＤ１０３２）。残った５０匹のマウスを、それぞれ、腫瘍接種の３９日後に５匹の動物の４つのサブグループに無作為化した（ＰＤ１０３３）。腫瘍を移植した元の１０５匹（ＰＤ１０３５及びＰＤ１０３８）のマウスから、腫瘍接種の２６日後に、４０匹をそれぞれ１０匹の動物の４つのサブグループに無作為化した（ＰＤ１０３５）。残った６５匹のマウスを、それぞれ、腫瘍接種の３７日後に６匹の動物の４つのサブグループに無作為化した（ＰＤ１０３８）。
観察及びデータ収集：群の無作為化後、動物を週に２回確認し、その間に体重及び腫瘍測定を行った。動物はまた、運動性、食物及び水の消費の視覚的推定、体重の増加／減少、目／毛のつやの減少、並びに任意の他の異常な効果などの正常な挙動に対する腫瘍増殖及び処置の任意の効果について確認した。各サブセット内の動物の数に基づいて、死亡及び観察された臨床徴候を記録した。
サンプリング：腫瘍を取り出し、秤量し、ＦＡＣＳに使用し、残りの材料をホルマリンで固定した。脾臓を取り出し、半分をＦＡＣＳに使用し、残りの半分をホルマリンで固定した。肝臓を取り出し、ホルマリンで固定した。血液試料をＭｕｌｔｉｖｅｔｔｅ ６００Ｚ Ｇｅｌ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ＃１５．１６７４）中、ＰＤ１０３２については２４、２６、及び３６日目、ＰＤ１０３３については４３日目、ＰＤ１０３５については２７及び３６日目、ＰＤ１０３８については４１日目に採取し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。血清を採取し、後の可能な分析のためにマイナス８０℃で保存した。
統計分析：統計分析は、Ｐｒｉｓｍ８．２．０ソフトウェア（GraphPad Software）を使用して行った。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定、続いてビヒクルと比較した全ての群に対するＤｕｎｎの多重比較検定を用いることによって、多重比較を伴う全ての統計を行った。差異関する２つの群間の比較のために、ノンパラメトリックマンホイットニー両側分析を行った。
肝臓酵素。マウスモデル及びヒトにおける臨床試験では、ＣＤ４０に対するアゴニスト抗体は、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）及びアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）などの肝臓酵素を、有意に、しかしながら一過性に増加させることが実証されている。ヒトでは、ＡＳＴは、肝臓、脳、膵臓、心臓、腎臓、肺、及び骨格筋を含む様々な組織に見られる。これらの組織のいずれかが損傷する場合、ＡＳＴが血流中に放出される。ＡＳＴレベルの上昇は組織損傷を示すが、肝臓自体に特異的ではない。対照的に、ＡＬＴは主に肝臓で見られる。ＡＬＴの任意の上昇は肝臓損傷の直接的な指標である。
したがって、ＡＳＴ及びＡＬＴのレベルを、肝毒性の尺度としてこれらの実験において決定した。処置後２４時間の時点で測定を行った。処置後の２４時間の時点は、文献及び社内の時間滴定実験に基づいて最も適切であった。ＡＬＴ及びＡＳＴ分析は、製造業者のガイドラインに従って、キットＭＡＫ０５２及びＭＡＫ０５５（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれ用いて行った。
サイトカインレベル。図１２に従って処置されるＭＣ３８－ＦＡＰ結腸癌腫腫瘍を保有するマウスからの血液を、１回目の注入の２４時間後（主研究＝ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３５）、２回目の注入の２４時間後（隣接研究＝ＰＤ１０３３及びＰＤ１０３８）、及び研究終了時（主研究＝ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３５）で採取した。１１種の異なるサイトカイン（ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ１２ｐ７０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１アルファ、ＭＩＰ－１ベータ、ＩＰ－１０、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、及びＩＬ－１ベータ）を、製造者の推奨に従ってＬｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。
肝臓組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析。最初の注入から２４時間後に肝臓を採取し、ＰＢＳで洗浄し、直ちにホルマリンで固定し、パラフィンブロックに包埋した。パラフィン包埋された肝臓の切片に対してヘマトキシリン／エオシン染色を実施し、病理学者が盲検様式で分析した。
結果：
全体的な健康及び体重。研究期間中、ＡＳ５９８処置によるマウスの健康への悪影響又は体重減少の徴候は観察されなかった（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。対照的に、以前の報告と一致して、ＦＧＫ４５処置は、最初の注入後に有意であるが、一過性の体重減少をもたらした（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。
腫瘍増殖：研究期間中は３～４日毎に腫瘍増殖を測定した。研究ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３５における処置は、平均腫瘍体積が３００ｍｍ3を超えた場合、それぞれ、２５及び２６日目に開始した。両研究における異なる処置群の平均腫瘍増殖曲線を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。
ＡＳ５９８は、試験した両用量にてビヒクル群と比較して、統計学的に有意な抗腫瘍有効性を実証した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。抗腫瘍有効性は、陽性対照抗ＣＤ４０抗体ＦＧＫ４５で観察されたものと同様であった。研究ＰＤ１０３５において使用された非ＦＡＰ結合対照ＡＳ６０８は、抗腫瘍有効性を何ら有しておらず、このことは、この腫瘍モデルにおいて観察された抗腫瘍有効性がＦＡＰ依存的であったことを実証した。
腫瘍体積測定に加えて、研究の終了時にマウスから腫瘍を解剖し、腫瘍重量を決定した。腫瘍重量測定からの結果及び結論は、腫瘍体積測定からの結果及び結論と一致していた（データ示さず）。
更に、研究ＰＤ１０３３及びＰＤ１０３８で得られた結果は、研究ＰＤ１０３２及びＰＤ１０３５で得られた結果と一致していた（データ示さず）。
血中サイトカインレベル。ＦＧＫ４５は、測定されたサイトカインのうちの８つ、すなわちＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ１２ｐ７０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１アルファ、ＭＩＰ－１ベータ、及びＩＰ－１０の血中レベルを有意に増加させた（図２０Ａ、及びデータ示さず）。対照的に、ＡＳ５９８（２．５ｍｇ／ｋｇ又は１２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＡＳ６０８、又はビヒクルは、測定されたサイトカインのいずれの血中レベルも増加させなかった（図２０Ａ、及びデータ示さず）。
肝臓酵素及び損傷。予想通り、ＦＧＫ４５はＡＬＴレベルの有意な増加を誘導し、これは、最初の注入の２４時間後に検出されたが、その後の注入後には検出されなかった（図２０Ｂ）。これは文献及び社内の以前の研究に従っていた。ＦＧＫ４５とは対照的に、ＡＳ５９８はＡＬＴレベルのいかなる増加も誘導しなかった（図２０Ｂ）。ＡＬＴに加えて、ＦＧＫ４５処置群では１回目の注入の２４時間後にＡＳＴもまた増加したが、ＡＳ５９８又は対照処置動物では増加しなかった（図２０Ｂ）。
肝臓組織のＩＨＣ。組織学的分析により、マウスを抗ｍＣＤ４０抗体で処置した場合、単核白血球の凝集、血栓症、及び壊死を伴う血管中心性多巣性炎症を特徴とする、広範な組織損傷が明らかにされた（図２０Ｃ）。対照的に、タンパク質＃７で処置したマウスの肝臓のＩＨＣ分析は、肝細胞毒性の証拠を示さず、ビヒクルで処置した肝臓で観察されたものと同様の組織学的プロファイルを有した（図２０Ｃ）。
総合すると、抗ｍＣＤ４０抗体とは対照的に、タンパク質＃７は、体重減少、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びＩＬ－１２ｐ７０）の上昇、アミノ基転移酵素（ＡＳＴ及びＡＬＴ）のレベル上昇、又は肝組織損傷に関して全身毒性の徴候を示さなかった。
結論：
血清アルブミンに加えて、マウスＦＡＰ及びマウスＣＤ４０に対する結合特異性を有する代理マウス特異的結合タンパク質である、タンパク質＃７を産生した。マウス細胞に基づくインビトロアッセイにおいて試験されたタンパク質＃７は、ヒト細胞に基づくインビトロアッセイ（例えば、実施例４を参照）におけるタンパク質＃５及びタンパク質＃６と同等の結果を示し、ＣＤ４０の厳密なＦＡＰ依存的活性化を示した（データ示さず）。この実施例において示されるように、タンパク質＃７（Ｎ末端Ｈｉｓ－タグを有する；ＡＳ５９８）もまた、インビボで活性であり、ＦＡＰ陽性腫瘍の進行を実質的に阻害した。更に、抗マウスＣＤ４０抗体（ＦＧＫ４５）とは対照的に、タンパク質＃７の抗腫瘍活性は、血中サイトカインレベルの上昇にも、肝毒性の試験された指標にも関連しなかった。血中サイトカインレベル及び肝毒性の上昇は、いくつかの臨床ＣＤ４０活性化抗体の用量制限毒性として現れる。提示されたデータは、インビトロ及びインビボの両方にてＣＤ４０受容体のＦＡＰ媒介架橋に依存する作用様式を支持することで、末梢又は非腫瘍臓器毒性を伴わない腫瘍局在化ＣＤ４０活性化をもたらす。
結論として、ＦＡＰ陽性腫瘍において局所的にＣＤ４０受容体を活性化し、かつ全身毒性の非存在下において実質的な抗腫瘍活性を引き起こすことができる、腫瘍標的化ＣＤ４０アゴニスト多選択性特異的ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質が産生された。
実施例７：本発明の多選択性結合タンパク質の存在下又は非存在下におけるＦＡＰのプロテアーゼ活性
この例は、内因性ＦＡＰ酵素活性が多選択性組換えタンパク質の結合の際に阻害されるかどうかを決定するために、本発明の様々な多選択性結合タンパク質の存在又は非存在において行われたＦＡＰ活性アッセイを記載する。
ＦＡＰはＩＩ型単一膜貫通セリンプロテアーゼであり、その発現は腫瘍のような組織リモデリングの部位（例えば、上皮癌の＞９０％で間質線維芽細胞の表面で発現される）、創傷治癒、胚組織及び炎症部位（例えばアテローム性動脈硬化症／関節炎）において高度にアップレギュレートされるが、ＦＡＰ発現は、非罹患成体器官において検出することが困難である。この非定型セリンプロテアーゼは、ジペプチジルペプチダーゼ（エキソペプチダーゼ）及びエンドペプチダーゼ活性の両方を有し、プロリン後の結合で基質を切断する。構造的には、ＦＡＰは、短い細胞質Ｎ末端配列（４ａａ）、単一の膜貫通ヘリックス（２１ａａ）並びに８枚羽根のβ－プロペラ及びα／β－ヒドロラーゼドメインを形成する細胞外ドメイン（７３５ａａ）からなる。ＦＡＰは、ホモ二量体として活性である。ＦＡＰプロテアーゼ活性に必須である触媒三連構造は、残基Ｓｅｒ６２４、Ａｓｐ７０２、及びＨｉｓ７３４からなる。活性部位は、ベータプロペラの中央の穴を通って、又はベータプロペラとヒドロラーゼドメインとの界面の空洞を通してのいずれかでアクセス可能である。
ＦＡＰのプロテアーゼ活性は、ニューロペプチドＹ、Ｉ型コラーゲン及びα２－抗プラスミンを含む様々な基質の切断を生じるが、エキソペプチダーゼ活性又はエンドペプチダーゼ活性の両方によって切断されて、蛍光リーダーで測定することができる産物になる基質Ｚ－ＧＬＹ－ＰＲＯ－ＡＭＣもまた生成する。
ＦＡＰ活性アッセイで試験した分子を表１０に概説する。
Figure 2023528204000010
ＦＡＰ活性アッセイ。ヒトＦＡＰ（ｒｈＦＡＰ）標的をアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、１ＭＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．５）で０．６７μｇ／ｍＬに希釈し、ウェル当たり４５μＬを９６ウェルプレートに添加した（活性アッセイにおいて０．３ｎＭの最終ｈＦＡＰ濃度がもたらされた）表１０に示すように、分子１～５を、５μＬの３μＭの分子を標的試料に添加することによって、５００倍モル過剰で適用した（最終濃度１５０ｎＭ）。最後に、５０μｌの１００μＭ Ｚ－ＧＬＹ－ＰＲＯ－ＡＭＣ基質（最終濃度５０μＭ）を添加して、各ウェルで１００μＬの総体積を得た。ＦＡＰ活性の部分的阻害を示すために、分子番号５を対照として使用した。
測定前に、プレートを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、アッセイを妨害する気泡を全て除去した。蛍光は、手動ゲインを１０５％に設定した蛍光リーダーを使用して、３８０ｎｍの励起及び４６０ｎｍの発光で９５分間にわたって５分毎に測定した。四連測定を実行し、平均及び標準偏差として示した。
結果。第１のステップでは、５０μＭの固定基質濃度で０．０１ｎＭ～最大１．２ｎＭのＦＡＰ濃度を使用して用量反応曲線を測定した。直線的な時間依存性シグナル増加が、９５分間にわたって０．３ｎＭのｒｈＦＡＰ標的濃度で観察された（０．９９９のＲ2で５分毎に測定）。ＦＡＰの酵素活性に対するタンパク質結合の影響を決定するために、ＦＡＰ飽和条件下において、ＦＡＰ（０．３ｎＭ）を超える５００倍モル（１５０ｎＭ）の過剰率でＦＡＰ結合分子（例えば、分子番号１（配列番号５））を添加して、アッセイを行った。分子番号１のこの濃度（配列番号５）の濃度は、ヒトＦＡＰに対する分子番号（配列番号５）の結合親和性の５００倍であった（Ｋｄ＝０．３ｎＭ）。
図１５に概説されているように、分子番号１～４は、内因性ジペプチジルＦＡＰ酵素活性を阻害しなかった。部分的なＦＡＰ活性阻害が、代替的なＦＡＰ結合分子（分子番号５）によって観察され、これを、アッセイ対照として使用した。
結論。本発明の多選択性結合タンパク質、例えば、分子番号１（ＨＦＣＣ）若しくは分子番号２（ＨＦ*Ｃ*Ｃ*）又はそれらのＦＡＰ結合ドメイン（Ｆ又はＦ*）などのＦＡＰへの結合は、蛍光発生基質Ｚ－ＧＬＹ－ＰＲＯ－ＡＭＣを切断するその能力によって測定されるように、ＦＡＰのプロテアーゼ活性に影響を及ぼさなかった。
実施例８：腫瘍組織における本発明の多選択性結合タンパク質の優先的局在化及び蓄積
この実施例は、本発明の多選択性結合タンパク質が、おそらくは腫瘍組織において発現されるＦＡＰへの結合を介して、腫瘍組織に優先的に局在化し、蓄積し得るかどうかを調べるために行われた実験を記載する。この目的のために、実施例６に記載される同系ＭＣ３８－ＦＡＰマウスモデルを好適な実験系として使用した。実施例６にもまた記載されるタンパク質＃７を、本発明の代表的な多選択性結合タンパク質として使用した。
３つの異なる方法論、すなわちＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像化、免疫組織化学（ＩＨＣ）、及びインビボ組織分布分析を使用して、腫瘍組織におけるタンパク質＃７の局在化及び蓄積を調査した。
材料及び方法
腫瘍接種及び処置：前述のように、マウスの右肩側腹部に、９×１０6個のＭＣ３８－ＦＡＰマウス結腸癌細胞を皮下接種した。腫瘍が５００ｍｍ3のサイズに達した場合、２．５ｍｇ／ｋｇ＝５０μｇ／マウスに対応する、およそ１５０ＫＢｑの放射性コンジュゲート化分子（対応する４つのアンキリン反復ドメイン構造を有し、ＨＳＡに結合するが、ＦＡＰ若しくはＣＤ４０には結合しないタンパク質＃７又は対照ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質）を、マウスの尾静脈に注入した。
インジウム－１１１標識：ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子を、インジウム－１１１、マレイミド－ＤＴＰＡ（Ｃｈｅｍａｔｅｃｈ、カタログ番号：Ｃ１０７）を標識するために、スルフヒドリル（ＳＨ）基に対する特異的反応性を有する二官能性キレート剤を使用して、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子のＣ末端に付加されたシステインの遊離ＳＨ基に放射性標識をコンジュゲートさせた。分子は、金属を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＰＳＩグレード）及び０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ中にて１時間にわたり室温（ＲＴ）で撹拌した。タンパク質の量を超える１０倍モル過剰のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中のマレイミド－ＤＴＰＡを添加し、室温で１時間インキュベートした。反応溶液を、限外濾過チューブ（Ａｍｉｃｏｎ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５、１０ｋＤａ分子量カットオフ）に移し、４ｍＬの金属を含まないＰＢＳを添加した。チューブを室温にて４０００×ｇで６分間にわたり遠心分離した。スピニング後、フロースルーを廃棄し、更に４ｍＬの金属を含まないＰＢＳを添加し、上記のようにチューブを再び遠心分離した。フィルター上清を低タンパク質結合エッペンドルフ反応管に移し、濃度を決定した。部位特異的コンジュゲーションを、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析（ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）を用いて決定した。最終コンジュゲート生成物を４℃で保存した。
ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像化研究：単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像を、ＮａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴＰｌｕｓカメラ（バージョン１．２、Ｂｉｏｓｃａｎ）を用いて実施した。ＳＰＥＣＴ及びＣＴの取得はソフトウェアＮｕｃｌｉｎｅ（バージョン１．０２）を用いて行った。ＣＴをソフトウェアＮｕｃｌｉｎｅで再構成したのに対して、ＳＰＥＣＴについては、ソフトウェアＨＩＳＰＥＣＴを使用した（バージョン１．４．３０４９、Ｓｃｉｖｉｓ ＧｍｂＨ）。ＳＰＥＣＴ及びＣＴデータの融合物を、ＶｉｖｏＱｕａｎｔ（商標）後処理ソフトウェア（バージョン３．５、Ｉｎｖｉｃｒｏ、ＵＳＡ）を用いて分析した。画像取得の前に、ガンマ線計数チューブで全身活動を測定した。麻酔をかけたマウスから、１１１Ｉｎ－ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子の注入の４、２４、４８、７２、９６時間後の時点で（２％イソフルオラン／酸素混合物の吸入によって）、ＳＰＥＣＴ／ＣＴインビボ画像を撮影した。注入から９６時間後に撮影した画像を図１６Ａに示す。全てのＳＰＥＣＴ投影は、フレーム当たり２０秒～６０秒を要したことで、画像当たり１５分～４５分のスキャン時間をもたらした。ＣＴスキャンは、５５ｋＶｐの管電圧及び１４５μＡの管電流、並びに投影当たり１０００ミリ秒の露光時間で行った。
ＩＨＣ研究：ホルマリン固定パラフィン包埋（Formalin-fixed paraffin embedded：ＦＦＰＥ）腫瘍組織スライドを、抗原回復ステップのために、最初に７０℃で８分間の３サイクルにより脱パラフィンし、続いてｐＨ７．４（ＥＤＴＡ系溶液、ベンタナ自動染色装置でのＣＣ１条件）で４８分間９５℃のサイクルにより脱パラフィンした。次いで、スライドをウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体コンジュゲート（自社製、作業濃度：２．０μｇ／ｍＬ）で３７℃にて２時間インキュベートした。抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体複合体を、３７℃で２０分間にわたりＯｍｎｉ Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰオートディスペンサ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてＨＲＰシステムによって検出した。最後に、スライドをヘマトキシリンで染色し、エタノールの勾配で脱水し（７０％＞９０％＞１００％及び１００％、各ステップ１分）、キシレンで２分間洗浄し、カバーガラスを細胞質封入剤でスライドに適用した。スライドをＶｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓでスキャンし、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質蓄積について定性的に評価した。
インビボ組織分布研究：ＭＣ３８－ＦＡＰ担腫瘍マウスを上記のように処置し（腫瘍接種及び処置）、注入から４、２４、４８、７２又は９６時間後に安楽死させた。目的の臓器を解剖し、重量を測定し、放射能をγカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ ＩＩ Ｇａｍｍａ Ｄ５０１０）により毎分カウント数（ＣＰＭ）として決定した。次いで、分析した臓器当たりのＣＰＭ値を、マウス当たりのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の総量を参照値として用いて、臓器当たりのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質のμｇ（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質／臓器のμｇ）へと変換した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質／臓器のμｇを、グラム組織当たりのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質のμｇ（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質／ｇ組織のμｇ）へと変換し、４匹のマウス／時点を用いて、組織のグラム当たりの注入用量の割合（ＩＤ／ｇ％）としてグラフにプロットし、平均±ＳＤとして表した。
結果
ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像化実験は、腫瘍組織における、本発明の多選択性結合タンパク質であるタンパク質＃７の優先的な局在化及び蓄積を明らかにした（図１６Ａ）。おそらくタンパク質＃７のＣＤ４０特異的ドメインによって誘導されるオンターゲット（on-target）分布のために、主に脾臓においていくらかのオフ腫瘍（off-tumor）取り込みが観察された。
ＭＣ３８－ＦＡＰ担腫瘍マウスを屠殺し、腫瘍をＩＨＣによってＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子の存在について分析した。ＩＨＣ分析は、腫瘍組織における、本発明の多選択性結合タンパク質であるタンパク質＃７の強い存在を示した（図１６Ｂ、上部パネル）。対照的に、ＦＡＰ又はＣＤ４０ではなくＨＳＡに結合する陰性対照ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子は、腫瘍組織において有意なレベルで検出されなかった（図１６Ｂ、下側パネル）。これらのデータは、タンパク質＃７の腫瘍局在化及び蓄積が、ＦＡＰ特異的結合ドメイン及び／又はＣＤ４０特異的結合ドメインによって媒介されることを確認した。陰性対照で処置した腫瘍で観察された軽微なシグナルはいずれも、腫瘍微小環境中のアルブミンの存在及びそれへの陰性対照ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子の結合によって引き起こされた可能性が高いか、又は単に分子拡散をもたらす組織透過性によるものであった。
放射性標識されたタンパク質＃７又は対照ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質をＭＣ３８－ＦＡＰ担腫瘍マウスに注入したインビボ組織分布研究では、本発明の多選択性結合タンパク質であるタンパク質＃７の蓄積が具体的には腫瘍組織（図１６Ｃ、左のパネル）において示されたが、他の臓器、例えば、筋肉（図１６Ｃ右のパネル）、骨髄、肝臓、及び腎臓などにおいては示されなかった（データ示さず）。ＳＰＥＣＴ／ＣＴ研究と一致して、いくらかの腫瘍外蓄積が脾臓においてのみ観察され、これはおそらく、このリンパ系臓器におけるＣＤ４０の発現のためであった（データ示さず）。重要なことに、ＨＳＡに結合するが、ＦＡＰにもＣＤ４０にも結合しない放射性標識陰性対照ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、腫瘍又は任意の他の組織に蓄積しなかった。これにより、ＦＡＰ及び／又はＣＤ４０特異的結合によって媒介される機序を介して、タンパク質＃７の腫瘍局在化及び蓄積が起こることが確認された。
結論
この実施例に示されるデータは、本発明の多選択性結合タンパク質がＦＡＰ及び／又はＣＤ４０依存的な様式で腫瘍組織に優先的に局在化し、かつ蓄積することができるという実験的証拠を提供する。これらの結果は、ＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインが、腫瘍発現ＦＡＰへの結合を介して腫瘍局在化及び多選択性結合タンパク質の蓄積を効果的に媒介し得るという知見と一致している。
実施例９：本発明の多選択性結合タンパク質による腫瘍阻害は、腫瘍におけるＦＡＰ発現に依存する
実施例６は、タンパク質＃７（Ｎ末端Ｈｉｓ－タグを有する；ＡＳ５９８）は、インビボで活性であり、ＦＡＰ陽性腫瘍の進行を実質的に阻害したことを示した。この実施例では、ＦＡＰ発現が低い同系マウスモデルを使用して、タンパク質＃７のＦＡＰ依存的な作用機序の更なる証拠を提供した。具体的には、インビボで非常に低い発現レベルのＦＡＰを有する腫瘍を産生する非トランスフェクトＭＣ３８－ＷＴ細胞株を、有効性研究を行うために使用した。
材料及び方法：
腫瘍実験：腫瘍実験は図１７Ａに概略的に示すように行った。雌同系マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の側腹部領域へＭＣ３８－ＷＴ結腸癌腫瘍細胞を皮下接種した（０日目）。マウスを、７日目におよそ７７ｍｍ3の腫瘍サイズに基づいて処置群に無作為化した。試験物質（タンパク質＃７（Ｎ末端Ｈｉｓ－タグを有する；ＡＳ５９８）及び抗ＣＤ４０抗体）を、表１１に示す所定のレジメンに従って担腫瘍マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）で投与した。試験物質を４日毎に、互いに等モル濃度で投与した。腫瘍増殖を、倫理的な腫瘍体積限界のために個々のマウスが死亡するまで、ノギス測定によって３～４日毎にモニターした。
Figure 2023528204000011
 Ｎ：動物番号
腫瘍接種：標準的なイソフルラン麻酔下において、マウスの脇腹に、０．１ｍＬのＰＢＳ中１×１０6個のＭＣ３８－ＷＴ腫瘍細胞を皮下接種した。
腫瘍測定：腫瘍接種後、週に２回腫瘍測定を行った。腫瘍の長さ及び幅をノギスで測定した。腫瘍体積を以下の式で計算した：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２
無作為化：７日目に、「整合分布」無作為化方法（ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔ（商標）ソフトウェア）に基づいて無作為化を行った。
観察及びデータ収集：腫瘍細胞接種後、罹患率及び死亡率について動物を毎日確認した。日常的なモニタリングの時点で、動物を、運動性、食物、及び水の消費、体重の増加／減少、並びに任意の他の異常などの挙動に対する腫瘍増殖及び処置の任意の効果について確認した。個々の動物について、死亡率及び観察された臨床徴候を記録した。
統計分析。統計分析は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定、続いてビヒクルと比較した全ての群に対するＤｕｎｎの多重比較検定を用いて行った。*ｐ＜０．０５**ｐ＜０．０１***ｐ＜０．００１の場合、結果を有意とみなした。
結果及び結論：
図１７Ｂに示されるように、タンパク質＃７は、このＦＡＰLOW腫瘍モデルにおいてビヒクルと比較して統計学的に有意な抗腫瘍有効性を何ら示さず、したがって、タンパク質＃７のＦＡＰ依存的な作用機序の更なる証拠を提供した。これとは異なり、そのインビボ活性が腫瘍微小環境におけるＦＡＰの存在に関係しない抗ＣＤ４０抗体は、予想されるように腫瘍進行を阻害し、したがって、ＭＣ３８－ＷＴ腫瘍細胞株のＣＤ４０アゴニストに対する感受性を確認した。
実施例１０：本発明の多選択性結合タンパク質の長期抗腫瘍効果
この実施例は、ＭＣ３８－ＦＡＰ担腫瘍マウスを処置し、次いで、本発明の多選択性結合タンパク質の完全な治療的可能性を更に調べるために、より長期間にわたって追跡した研究を記載する。
材料及び方法
腫瘍実験：腫瘍実験は、本質的には研究ＰＤ１０３５及び図１４Ｂの実施例６に前述したように行ったが、この場合、マウスを経時的にモニターし、政府承認の動物プロトコルで定義されている苦痛の徴候を示した場合、又は腫瘍が所定の腫瘍サイズの２０００ｍｍ3によって定義されるエンドポイントを超えた場合のいずれかでのみ、マウスを屠殺した。試験物質（タンパク質＃７（Ｎ末端Ｈｉｓ－タグを有する；ＡＳ５９８）及びタンパク質＃７の非ＦＡＰ結合変異体（ＡＳ６０８；陰性対照分子として、配列番号Ｎ末端Ｈｉｓ－タグを有する配列番号６７（配列番号５７））を、表１２に示されるように、所定のレジメンに従って、担腫瘍マウスに投与した。腫瘍増殖を、倫理的な腫瘍体積限界のために個々のマウスが死亡するまで、ノギス測定によって３～４日毎にモニターした。
Figure 2023528204000012
 Ｎ：動物番号
腫瘍接種及び無作為化：標準的なイソフルラン麻酔下において、マウスの脇腹に、０．２ｍＬのＰＢＳ中９×１０6個のＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍がおよそ３００ｍｍ3の平均サイズに達した場合、マウスを前述のように無作為化した。
腫瘍測定：腫瘍接種後、週に２回腫瘍測定を行った。腫瘍の長さ及び幅をノギスで測定した。腫瘍体積を以下の式で計算した：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ×π）／６
観察及びデータ収集：日常的なモニタリングの時点で、動物を、運動性、食物、及び水の消費、体重の増加／減少、並びに任意の他の異常などの挙動に対する腫瘍増殖及び処置の任意の効果について確認した。個々の動物について、死亡率及び観察された臨床徴候を記録した。
結果及び結論
結果は、タンパク質＃７がＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍を阻害及び排除することができ、かつ腫瘍再発に対する長期防御を付与することができたという証拠を提供する。ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍は、タンパク質＃７による最後の処置のおよそ２０日後にはもはや検出できなかった（図１８Ａ）。更に、タンパク質＃７で処置したマウスは接種後少なくとも２００日間（すなわち、全測定期間）生存し、タンパク質＃７の抗腫瘍効果が持続的かつ長期的であったことを実証した（図１８Ｂ）。対照的に、ＣＤ４０標的に結合するがＦＡＰ標的には結合しない陰性対照で処置されたＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍は、ビヒクル群と同様に進行し（図１８Ａ）、マウスは死亡したか、又はビヒクル群と同様の速度で屠殺しなければならなかった（図１８Ｂ）。これらのデータにより、インビボでのタンパク質＃７の抗腫瘍作用機序のＦＡＰ依存性が確認された。全体として、これらのデータは、本発明の多選択性結合タンパク質が、ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍マウスモデルにおいてＦＡＰ依存的様式で、強力かつ永続的な抗腫瘍活性を誘発し得るという証拠を提供した。
実施例１１：本発明の多選択性結合タンパク質による保護的抗腫瘍免疫記憶の誘導
十分に確立されたＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍を保有するマウスは、図１８に示されるように、タンパク質＃７による処置の後、検出不能なサイズまで腫瘍を除くことができた。タンパク質＃７によって誘導される抗腫瘍免疫記憶の可能性を研究するために、同じ腫瘍のないマウスにＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍細胞を再チャレンジした。
材料及び方法
腫瘍実験：腫瘍の実験及び治療は、本質的に、研究ＰＤ１０３５では実施例６及び図１４Ｂ、並びに図１８Ｂでは実施例１０に記載されているように行われ、タンパク質＃７で処置されたマウスは、ＭＣ３８－ＷＴ又はＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍細胞で再チャレンジされる前に、約１２０日間モニターされた（０、２ｍＬのＰＢＳ中、それぞれ、１又は９×１０6細胞／マウス）。並行して、ナイーブなマウスを全く同じ腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍増殖を、倫理的な腫瘍体積限界のために個々のマウスが死亡するまで、ノギス測定によって３～４日毎にモニターした。
結果及び結論
最初の弱い腫瘍増殖の後、以前にタンパク質＃７で処置された全てのマウスは、再チャレンジされたＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍を完全に排除し（図１９Ａ）、これは、免疫学的抗腫瘍記憶応答の存在が示唆した。興味深いことに、ＭＣ３８－ＷＴ腫瘍細胞で再チャレンジしたマウスにおいて同じ現象が観察され（図１９Ａ）、これは、タンパク質＃７が免疫記憶の確立に寄与したことを示唆しており、ＦＡＰ関連抗原に限定されず、より広く腫瘍抗原に向けられた、更に、ＭＣ３８－ＷＴ又はＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍細胞のいずれかを接種したナイーブな対照群は、使用した腫瘍細胞の腫瘍形成能を明らかに示し（図１９Ｂ）、したがって、図１９Ａに示される再チャレンジマウスにおける腫瘍増殖の非存在が、免疫媒介性抗腫瘍応答によるものであることが確認された。結論として、本発明の多選択性結合タンパク質は、防御的抗腫瘍免疫記憶を誘導する能力を有し、更に、この免疫記憶は、ＭＣ３８－ＦＡＰ腫瘍モデルにおけるＦＡＰ関連抗原に限定されないことを示唆する実験的証拠が得られた。
実施例１２：ＣＤ４０特異的結合タンパク質が結合したヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５（ｈＣＤ４０）の複合体のＸ線構造解析
この研究の目的は、Ｘ線結晶学を用いて本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質によって結合された、組換えｈＣＤ４０の複合体を産生及び分析することであった。この構造解析に用いたＣＤ４０特異的結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）であった。
材料及び方法
タンパク質生成。ｈＣＤ４０を、グリコシル化を阻止するためにツニカマイシンの存在下においてＨｉ５細胞中で発現させた。培養上清からのタンパク質を、ＨＩＳ－Ｔｒａｐ、ＴＨＢ消化物、陰性ＨＩＳ－Ｔｒａｐ、及びＳＥＣによって精製した。精製したｈＣＤ４０を、ＣＤ４０特異的ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質（配列番号３）と１：１．２の比で混合した。過剰なＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質を、ｈＣＤ４０：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中でＳＥＣを介してＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質複合体から除去した。試料を濃縮して３６．７ｍｇ／ｍＬを得た。この手順により、クーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥから判断して９５％を超える純度を有する均質なタンパク質が得られた。
結晶化。精製されたタンパク質は、およそ１２００の異なる条件を有する標準的なスクリーニングと、文献データを用いて同定された結晶化条件との両方を採用した結晶化試験で使用された。最初に得られた条件は、標準的な戦略、温度などの結晶化に重大な影響を及ぼす全身的に変化するパラメータ、タンパク質濃度、及び滴下比などを用いて最適化された。これらの条件はまた、ｐＨ又は沈殿剤濃度を体系的に変化させることによって精密化した。
最終結晶化条件：
３０ｗ／ｖ％ ＰＥＧ ４Ｋ
０．２４Ｍ ＬｉＳＯ４
０．１ＭトリスｐＨ＝８．５０
０．３５Ｍ ＮａＢｒ
データ収集及びプロセス。結晶を急速凍結し、１００Ｋの温度で測定した。極低温条件を用いて、ＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ（ＳＬＳ、Ｖｉｌｌｉｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にてリガンドＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質（配列番号３）に結合したｈＣＤ４０の複合結晶からＸ線回折データを収集した。結晶は空間群Ｃ２に属する。データは、ａｕｔｏＰＲＯＣ、ＸＤＳ及びａｕｔｏＰＲＯＣ、ＡＩＭＬＥＳＳというプログラムを用いて処理した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質のデータ収集及び処理統計を以下の表１３に列挙する。
Figure 2023528204000013
構造モデリング及び精密化。構造の決定及び分析に必要な相情報は分子置換によって得た。ｈＣＤ４０の以前に解明された構造を検索モデルとして使用した。その後のモデル構築及び精密化を、それぞれ、ＣＯＯＴ及びソフトウェアパッケージＣＣＰ４を用いた標準プロトコルに従って実施した。最終モデルの正確さを交差検証するための尺度である自由Ｒ因子の計算のために、測定された反射の約４．９％が、精密化手順から除外された（以下の表１４を参照されたい）。ＴＬＳ精密化（ＲＥＦＭＡＣ５、ＣＣｐ４を使用）を行ったところ、より低いＲ因子及びより高い品質の電子密度マップが得られた。自動的に産生された局所のＮＣＳ制約を適用した（新規のＲＥＦＭＡＣ５バージョンのキーワード「ｎｃｓｒ局所」）。リガンドのパラメータ化及び対応ライブラリーファイルの産生は、ＧＲＡＤＥ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて行った。ＲＥＦＭＡＣ５を用いて３．０で合わせたＦo－Ｆcマップのピークに水分子を入れ、ＣＯＯＴの検証ツールを用いて全ての水を確認することによって、ＣＯＯＴの「Ｆｉｎｄ ｗａｔｅｒｓ」アルゴリズムを用いて水モデルを構築した。疑われる水のリストについての基準は以下のとおりであった：８０Å2より大きいＢ因子、１．２σ未満である２Ｆo－Ｆcマップ、２．３Å未満である最も近い接触までの距離、又は３．５Ａを超える最も近い接触までの距離。疑われる水分子及びリガンド結合部位内の水分子（リガンドまでの距離が１０Å未満）を手動で確認した。最終モデルのラマチャンドランプロットは、最も好ましい領域では全残基の９２．２％、追加で許容される領域では７．８％、許容される領域では０．０％を示す。許容されない領域に残基は見られない（表１４）。最終構造及び精密化プロセスの統計を以下の表１４に列挙する。
Figure 2023528204000014
結果
構造を解明し、最終分解能２．２９Åまで精密化した。Ｘ線結晶学を用いた構造分析の結果、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質（配列番号３）は、ＣＤ４０受容体（配列番号５１）のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）１（アミノ酸２３～５９）に結合し、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の結合部位と反対側の一側でＣＤ４０受容体に結合することが明らかになり、これは、ＤＡＲＰｉｎタンパク質とＣＤ４０Ｌとの間に直接の結合部位競合がないことを示した（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。ＣＤ４０受容体のＣＲＤ１ドメインは、細胞膜から離れて位置する。
強力なＣＤ４０アゴニスト抗体がＣＤ４０受容体の膜遠位エピトープに結合することが報告されている（Ｙｕら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ」第３３巻第６６４～６７５頁、ｅ６６４（２０１８年））。同様に、この実施例で説明したＸ線結晶学的研究では、ＣＤ４０特異的結合タンパク質（配列番号３）が、細胞膜から離れたＣＤ４０受容体のＣＲＤ１と相互作用することが示された。ＣＤ４０アゴニスト抗体については既に示唆されているように、細胞膜からより離れたエピトープの方が立体障害が少ないため、局在化分子（例えば、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質）を構成するＣＤ４０特異的結合タンパク質へのアクセスがよくなり、ＣＤ４０受容体のクラスター形成がより効率的になり、結果として、ＣＤ４０受容体の活性化がより効率的になる可能性がある。更に、ＣＤ４０特異的結合タンパク質（配列番号３）とＣＲＤ１との相互作用領域は、ＣＤ４０Ｌの結合部位と反対であることが示され、これは、本発明の結合タンパク質とＣＤ４０Ｌとの間に直接の結合競合が存在しないことを示唆した。ＣＤ４０Ｌについて競合しない化合物は、リガンドと相加的又は相乗的な効果を有してもよく、受容体のより良好な活性化をもたらし得る（例えば、Ｙｕら、同所；Ｃｈａｌｌａら、「Ａｌｌｅｒｇｙ」第５４巻第５７６～５８３頁（１９９９年）；Ｐｏｕｎｄら、「Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ」第１１巻第１１～２０頁（１９９９年））。
本明細書は、明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しない限り、本明細書は、任意のそのような資料に優先する。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の実施形態によって包含されることが意図される。

Claims (15)

  1. 組換えタンパク質であって、
    血清アルブミンに特異的に結合する第１のアンキリン反復ドメイン、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する第２のアンキリン反復ドメイン、ＣＤ４０に特異的に結合する第３のアンキリン反復ドメイン、及びＣＤ４０に特異的に結合する第４のアンキリン反復ドメインを含み、
    ここで、前記アンキリン反復ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の式：
    （血清アルブミン結合ドメイン）－（ＦＡＰ結合ドメイン）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（ＣＤ４０結合ドメイン）
    の式に従って配置される、組換えタンパク質。
  2. 前記ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくはここで、前記ＦＡＰ結合ドメインが、配列番号２又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えタンパク質。
  3. 前記ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくはここで、前記ＣＤ４０結合ドメインの各々が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の組換えタンパク質。
  4. 前記ＣＤ４０結合ドメインの各々が、独立して、８位にＱ、１５位にＬ、１４３位にＲ、及び１４７位にＱを含み、ここで、前記位置番号が、配列番号３の位置と対応する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  5. 前記血清アルブミン結合ドメインが、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくはここで、前記血清アルブミン結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  6. Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：
    （血清アルブミン結合ドメイン）－（リンカー）－（ＦＡＰ結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）－（リンカー）－（ＣＤ４０結合ドメイン）を含み、ここで、前記リンカーが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  7. 前記ＦＡＰ結合ドメインが、１００ｎＭ以下のＫD値でヒトＦＡＰに結合し、及び／又は前記ＣＤ４０結合ドメインの各々が、１００ｎＭ以下のＫD値でヒトＣＤ４０に結合し、及び／又は前記血清アルブミン結合ドメインが、１００ｎＭ以下のＫD値でヒト血清アルブミンに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  8. 配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む組換えタンパク質であって、ここで、前記組換えタンパク質が、１００ｎＭ以下のＫD値でヒトＦＡＰ、ヒトＣＤ４０、及びヒト血清アルブミンに結合し、好ましくは前記組換えタンパク質が、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
  9. 前記タンパク質が、インビトロヒトＢ細胞活性化アッセイによって評価されるように、約０．０１ｎＭ～約１０ｎＭの半数効果濃度（ＥＣ50）を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  10. ＦＡＰへの前記タンパク質の結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％より大きく阻害しない、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質又は請求項１～１０のいずれか一項に記載のアンキリン反復ドメインをコードする核酸。
  12. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質又は請求項１１に記載の核酸と、任意選択的には薬学的に許容される担体若しくは賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  13. 請求項１１に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  14. 前記組換えタンパク質が発現される条件下において、請求項１３に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を生成する方法。
  15. 医学的状態を処置する方法であって、医学的状態を処置することを必要とする対象、好ましくはヒトに、治療有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項１１に記載の核酸、又は請求項１２に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、ここで、前記医学的状態が癌であり、好ましくは前記癌が固形腫瘍である、方法。
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