KR20230022176A - 다중특이적 단백질 - Google Patents

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KR20230022176A
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recombinant protein
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니콜로 리가몬티
클라라 돔케
발레리 페린 칼라브로
파멜라 안나 트래일 스미스
빅토르 레빗스키
니나 엘리사벳 바이톤마에키
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몰리큘라 파트너스 아게
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Abstract

본 발명은, 예를 들어 CD40 및 FAR와 같은 상이한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 다중특이적 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 다중특이적 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 다중특이적 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 인간을 포함하는 포유류에서 암과 같은 질병을 치료하거나 진단하기 위한 방법에서 이러한 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

다중특이적 단백질
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 5월 14일에 유럽 특허청에 제출된 유럽 특허 출원 EP20174847호 및 2020년 6월 22일에 유럽 특허청에 제출된 유럽 특허 출원 EP20181498호의 이익 및 우선권을 주장한다. 유럽 특허 출원 EP20174847호 및 EP20181498호의 내용은 모든 표, 도면 및 청구항을 포함하여 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
기술분야
본 발명은, 예를 들어 CD40 및 FAP와 같은 상이한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 다중특이적 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 다중특이적 단백질을 코딩하는 핵산, 이러한 다중특이적 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 인간을 포함하는 포유류에서 암과 같은 질병을 치료하거나 진단하기 위한 방법에서 이러한 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 CD40은 주요 공동-자극 수용체이며 리간드(CD40L) 또는 작용 항체에 의해 결합될 때 세포 및 체액 적응 면역의 개시 및 진행을 포함하여 광범위한 분자 및 세포 과정의 조절에 관여한다. 예를 들어, 수지상 세포 표면의 CD40 결합이 사이토카인 생산을 촉진하고, 표면에서 공동자극 분자의 발현을 유도하고, 항원의 제시를 촉진한다는 것이 입증되었다. 전반적으로 CD40 신호 전달의 영향은 수지상 세포를 성숙시키고 T 세포 활성화 및 분화를 효과적으로 촉발하는 데 필요한 모든 특성을 달성한다. B 세포에서 CD40 신호전달은 배 중심 형성, 면역글로불린(Ig) 이소형 전환, 항원에 대한 친화력을 향상시키기 위한 Ig의 체세포 과돌연변이, 그리고 마지막으로 수명이 긴 형질 세포 및 기억 B 세포의 형성을 촉진한다. 더욱이, CD40 경로는 정상 및 염증 조건 하에서 배중심 B 세포, 수지상 세포 및 내피 세포를 포함하는 많은 세포 유형의 생존에 중요하다는 것이 밝혀졌다. 다양한 자가면역 질병에서 CD40 신호전달의 탈조절이 관찰되었다. 함께, 이러한 기능의 폭은 후천성 면역 반응 생성을 위한 CD40 수용체의 중요성을 강조한다.
CD40은 처음에 B 세포에서 특성화되었으며 수지상 세포, 단핵구, 혈소판 및 대식세포뿐만 아니라 근섬유모세포, 섬유모세포, 상피 및 내피 세포와 같은 비조혈 세포에서도 발현된다. CD154 또는 CD40L로 알려진 CD40의 리간드는 활성화된 B 세포 및 혈소판뿐만 아니라 활성화된 T 세포에 의해 주로 발현되며 염증 상태에서 단핵구 세포, 자연 살해 세포, 비만 세포 및 호염기구에서도 유도된다.
CD40은 선천성 면역과 후천성 면역 시스템을 모두 활성화시킬 수 있기 때문에 종양 면역치료에 적합한 표적으로 인식되고 있다. 여러 보고서에서 CD40 자극이 수지상 세포 성숙을 통해 항종양 면역 반응을 향상시킬 수 있음을 확인했다. CD40 작용제로 수지상 세포를 활성화하면 생존율이 증가하고 IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α 및 대식세포 염증성 단백질-1α가 분비된다. 또한 CD40 활성화는 MHC 클래스 II, LFA-3, CD80 및 CD86과 같은 공동자극 분자의 상향 조절을 유도하고 각각 항원 제시, T 헬퍼 세포(Th) 및 세포독성 T 림프구(CTL)의 프라이밍 및 교차 프라이밍을 촉진한다. CD40에 대한 작용 항체는 전임상 뮤린 종양 모델에서 효과적인 것으로 입증되었다. 그러나, 임상에서의 사용이 일부 항종양 효능을 나타내긴 했지만, 작용제 항-CD40 항체의 임상 개발은 용량 제한 독성 및 결과로서의 낮은 효능으로 인해 방해를 받았을 가능성이 있다.
따라서, 새로운 CD40 특이적 결합 단백질, 그리고 CD40 특이적 결합 및 활성화로부터 혜택을 받는 암을 포함한 질병의 치료 및 특성화를 위한 치료 및 진단 접근법에 대한 필요성이 남아 있다. 특히, 바람직하지 않은 부작용을 피하면서 CD40와 효과적으로 결합할 수 있는 신세대 작용제가 필요하다.
본원에 제공된 개시내용에 기초하여, 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 실시형태(E)에 포함되는 것으로 의도된다.
E1. 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인 및 CD40에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 단백질.
E2. E1에 있어서, CD40에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는, 재조합 단백질.
E3. E2에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 하기 식: (FAP-결합 도메인) - (CD40 결합 도메인) - (CD40 결합 도메인)에 따라 배열되는, 재조합 단백질.
E4. E1 내지 E3 중 어느 하나에 있어서, 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하는, 재조합 단백질.
E5. E4에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인을 포함하는, 재조합 단백질.
E6. E5에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 하기 식: (혈청 알부민 결합 도메인) - (FAP-결합 도메인) - (CD40 결합 도메인) - (CD40 결합 도메인)에 따라 배열되는, 재조합 단백질.
E7. E1 내지 E6 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인, 상기 CD40 결합 도메인(들), 및 상기 반감기 연장 모이어티 중 임의의 것 사이에 링커를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E8. E1 내지 E7 중 어느 하나에 있어서, N-말단에서 C-말단으로 하기 식: (FAP-결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인)을 포함하는, 재조합 단백질.
E9. E1 내지 E8 중 어느 하나에 있어서, N-말단에서 C-말단으로 하기 식: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인)을 포함하는, 재조합 단백질.
E10. E4에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 재조합 단백질.
E11. E10에 있어서, 상기 면역글로불린 도메인이 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 면역글로불린의 Fc 도메인인, 재조합 단백질.
E12. E11에 있어서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인인, 재조합 단백질.
E13. E12에 있어서, 상기 Fc 도메인이 이펙터 기능을 감소시키도록 변형된, 재조합 단백질.
E14. E1 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP가 인간 FAP인, 재조합 단백질.
E15. E1 내지 E14 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40가 인간 CD40인, 재조합 단백질.
E16. E5 내지 E19 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민이 인간 혈청 알부민(HSA)인, 재조합 단백질.
E17. E10 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인인, 재조합 단백질.
E18. E1 내지 E17 중 어느 하나에 있어서, FAP에 대한 상기 재조합 단백질의 결합이 FAP의 프로테아제 활성을 25% 초과, 20% 초과, 15% 초과, 10% 초과, 또는 5% 초과만큼 감소시키지 않는, 재조합 단백질.
E19. E1 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 SEQ ID NO: 2의 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 SEQ ID NO: 2의 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는, 재조합 단백질.
E20. E19에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E21. E1 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 8과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 SEQ ID NO: 8의 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 SEQ ID NO: 8의 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는, 재조합 단백질.
E22. E21에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E23. E1 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9 및 28-38 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E24. E23에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 SEQ ID NO: 9 및 28-38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E25. E23에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 SEQ ID NO: 9, 28-31 및 38 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는, 재조합 단백질.
E26. E25에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 28과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는, 재조합 단백질.
E27. E23에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 32-37 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환되는, 재조합 단백질.
E28. E27에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 34와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환되는, 재조합 단백질.
E29. E1 내지 E28 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 (i)SEQ ID NO: 2, 8, 9, 및 28-37 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는, 재조합 단백질.
E30. E1 내지 E29 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9 및 28-37 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E31. E1 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40-결합 도메인 또는 상기 CD40-결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 SEQ ID NO: 3의 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 SEQ ID NO: 3의 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는, 재조합 단백질.
E32. E1 내지 E31 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E33. E1 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40-결합 도메인 또는 상기 CD40-결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 10 및 43-50 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E34. E1 내지 E30 및 E33 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40-결합 도메인 또는 상기 CD40-결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 10 및 43-50 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E35. E1 내지 E30 및 E33에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 10, 43, 44, 및 48-50 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는, 재조합 단백질.
E36. E35에 있어서, 상기 CD40-결합 도메인 또는 상기 CD40-결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 43과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는, 재조합 단백질.
E37. E1 내지 E30 및 E33 중 어느 하나에 있어서, 상기CD40 결합 도메인 또는 상기CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 45-47 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환되는, 재조합 단백질.
E38. E37에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 47과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환되는, 재조합 단백질.
E39. E1 내지 E38 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 (i) SEQ ID NO: 3, 10, 및 43-49 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는, 재조합 단백질.
E40. E1 내지 E39 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10 및 43-49 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는, 재조합 단백질.
E41. E1 내지 E40 중 어느 한 하나에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응하는, 재조합 단백질.
E42. E1 내지 E41 중 어느 한 하나에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응하는, 재조합 단백질.
E43. E1 내지 E42 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은, 재조합 단백질:
(a) 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9 및 28-37 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 선택적으로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음; 및
(b) 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10 및 43-49 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 선택적으로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음.
E44. E43에 있어서, 하기와 같은, 재조합 단백질:
(a) 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9 및 28-37 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 선택적으로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음; 및
(b) 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10 및 43-49 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 선택적으로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음.
E45. E43에 있어서, 하기와 같은, 재조합 단백질:
(a) 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9 및 28-37 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 선택적으로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음; 및
(b) 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10 및 43-49 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 선택적으로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음.
E46. E43에 있어서, 하기와 같은, 재조합 단백질:
(a) 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9 및 28-37 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 선택적으로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음; 및
(b) 상기 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10 및 43-49의 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 선택적으로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음.
E47. E5 내지 E9, E14 내지 E16 및 E18 내지 E46 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는, 재조합 단백질.
E48. E5 내지 E9, E14 내지 E16, 및 E18 내지 E47 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E49. E5 내지 E9, E14 내지 E16 및 E18 내지 E46 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 39-42 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 SEQ ID NO: 39-40 및 42 중 임의의 하나의 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 SEQ ID NO: 39, 40 및 42 중 임의의 하나의 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 선택적으로 SEQ ID NO: 41의 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/되거나 SEQ ID NO: 41의 마지막 위치의 N은 A로 치환되는, 재조합 단백질.
E50. E5 내지 E9, E14 내지 E16, E18 내지 E45, 및 E49 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 SEQ ID NO: 39-42 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E51. E5 내지 E9, E14 내지 E16 및 E18 내지 E50 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 (i) SEQ ID NO: 1 및 39-41 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, (ii) SEQ ID NO: 42와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S 또는 GS를 추가로 포함하는, 재조합 단백질.
E52. E5 내지 E9, E14 내지 E16 및 E18 내지 E51 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 (i) SEQ ID NO: 1 및 39-41 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, (ii) SEQ ID NO: 42와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는, 재조합 단백질.
E53. E5 내지 E9, E14 내지 E16 및 E18 내지 E52 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 (i) SEQ ID NO: 1 및 39-41 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, (ii) SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는, 재조합 단백질.
E54. E8 내지 E53 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E55. E1 내지 E54 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질이 정확히 4개의 안키린 반복 도메인을 포함하는, 재조합 단백질.
E56. SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질로서, FAP 및 CD40에 특이적으로 결합하는, 재조합 단백질.
E57. E56에 있어서, 상기 단백질이 SEQ ID NO: 5와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E58. E56 또는 E57에 있어서, 상기 단백질이 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E59. E56 내지 E58 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질이 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E60. E56에 있어서, 상기 단백질이 SEQ ID NO: 6와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E61. E56 또는 E60에 있어서, 상기 단백질이 SEQ ID NO: 6과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E62. E56, E60 및 E61 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질이 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E63. E56 내지 E62 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP가 인간 FAP인, 재조합 단백질.
E64. E56 내지 E63 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40가 인간 CD40인, 재조합 단백질.
E65. E1 내지 E64 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 140 pM, 130 pM, 또는 120 pM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E66. E1 내지 E65 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E67. E1 내지 E66 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 1 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E68. E1 내지 E67 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 120 pM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E69. E1 내지 E68 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40-결합 도메인 또는 상기 CD40-결합 도메인 각각이 100 nM, 90 nM, 80 nM 또는 75 nM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 독립적으로 결합하는, 재조합 단백질.
E70. E1 내지 E69 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40-결합 도메인 또는 상기 CD40-결합 도메인 각각이 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 독립적으로 결합하는, 재조합 단백질.
E71. E1 내지 E70 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40-결합 도메인 또는 상기 CD40-결합 도메인 각각이 75 nM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 독립적으로 결합하는, 재조합 단백질.
E72. E1 내지 E71 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 또는 35 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E73. E1 내지 E72 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E74. E1 내지 E73 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 50 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E75. E1 내지 E74 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인이 35 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E76. E1 내지 E75 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 또는 300 pM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E77. E1 내지 E76 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E78. E1 내지 E77 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 1 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E79. E1 내지 E78 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 500 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E80. E1 내지 E79 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 300 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E81. E1 내지 E80 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 140 pM, 130 pM, 120 pM, 115 pM, 110 pM, 105 pM 또는 100 pM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 결합하는, 재조합 단백질.
E82. E1 내지 E81 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 결합하는, 재조합 단백질.
E83. E1 내지 E82 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 1 nM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 결합하는, 재조합 단백질.
E84. E1 내지 E83 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 500 nM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 결합하는, 재조합 단백질.
E85. E1 내지 E84 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 100 pM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 결합하는, 재조합 단백질.
E86. E1 내지 E85 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 또는 50 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E87. E1 내지 E86 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E88. E1 내지 E87 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 75 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E89. E1 내지 E88 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 50 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E90. E65 내지 E89 중 어느 하나에 있어서, 상기 KD가 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 PBS에서 측정되는, 재조합 단백질.
E91. E90에 있어서, 상기 KD가 Biacore T200 기기를 사용하여 측정되는, 재조합 단백질.
E92. E65 내지 E89 중 어느 하나에 있어서, 상기 KD가 생물층 간섭계(BLI)에 의해 측정되는, 재조합 단백질.
E93. E92에 있어서, 상기 KD가 ForteBio Octet 기기를 사용하여 측정되는, 재조합 단백질.
E94. E1 내지 E93 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질은 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의한 평가 시 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 65 nM 이하, 약 55 nM 이하, 약 45 nM 이하, 약 35 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 4 nM 이하, 약 3 nM 이하, 약 2 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하, 약 0.01 nM 내지 약 50 nM, 약 0.01 nM 내지 약 25 nM, 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 약 0.01 nM 내지 약 5 nM, 약 0.01 nM 내지 약 1 nM, 약 0.01 nM 내지 약 0.1 nM, 약 0.01 nM 내지 약 0.07 nM, 약 0.04 nM 내지 약 50 nM, 약 0.04 nM 내지 약 25 nM, 약 0.04 nM 내지 약 10 nM, 약 0.04 nM 내지 약 5 nM, 약 0.04 nM 내지 약 1 nM, 약 0.04 nM 내지 약 0.1 nM, 약 0.04 nM 내지 약 0.07 nM, 약 0.1 nM 내지 약 50 nM, 약 0.1 nM 내지 약 25 nM, 약 0.1 nM 내지 약 10 nM, 약 0.1 nM 내지 약 5 nM, 약 0.1 nM 내지 약 1 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.9 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.85 nM, 약 0.18 nM 내지 약 0.85 nM의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 갖는. 재조합 단백질.
E95. E1 내지 E94 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 10 nM 이하의 EC50을 갖는, 재조합 단백질.
E96. E1 내지 E95 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 1 nM 이하의 EC50을 갖는, 재조합 단백질.
E97. E1 내지 E96 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 0.1 nM 내지 약 1 nM, 바람직하게는 약 0.18 nM 내지 약 0.85 nM의 EC50을 갖는, 재조합 단백질.
E98. E1 내지 E97 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 0.01 nM 내지 약 0.1 nM, 바람직하게는 약 0.04 nM 내지 약 0.07 nM의 EC50을 갖는, 재조합 단백질.
E99. E94 내지 E98 중 어느 하나에 있어서, 상기 B 세포 활성화 검정이 인간 B 세포 활성화 검정인, 재조합 단백질.
E100. E94 내지 E99 중 어느 하나에 있어서, 상기 EC50이 GraphPad Prism(버전 8.1.2)을 사용하여 측정되는, 재조합 단백질.
E101. 재조합 단백질로서,
혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, CD40에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 및 CD40에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인을 포함하고,
상기 안키린 반복 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 하기 식: (혈청 알부민 결합 도메인) - (FAP-결합 도메인) - (CD40 결합 도메인) - (CD40 결합 도메인)에 따라 배열되는, 재조합 단백질.
E102. E101에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO:2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 100 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 120 pM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
E103. E101 또는 E102에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E104. E101 내지 E103 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 100 이하 nM, 바람직하게는 75 nM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 결합하는, 재조합 단백질.
E105. E101 내지 E104 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응하고, 바람직하게는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응하는, 재조합 단백질.
E106. E101 내지 E105 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E107. E101 내지 E106 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO:1와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 100 nM 이하, 바람직하게는 50 nM 이하, 보다 바람직하게는 35 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E108. E101 내지 E107 중 어느 하나에 있어서, 혈청 알부민 도메인이 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E109. E101 내지 E108 중 어느 하나에 있어서, N-말단에서 C-말단으로 하기 식: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인)을 포함하고, 링커는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
E110. E101 내지 E110 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질이 정확히 4개의 안키린 반복 도메인을 포함하는, 재조합 단백질.
E111. SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E112. SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E113. SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E114. SEQ ID NO: 5과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 CD40 및 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
E115. E5 내지 E114 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질이 CD40, FAP 및 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있는, 재조합 단백질.
E116. E1 내지 E115 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질은 시험관 내 인간 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 0.1 nM 내지 약 5 nM의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 갖는, 재조합 단백질.
E117. E1 내지 E116 중 어느 하나에 있어서, FAP에 대한 상기 단백질의 결합이 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 넘게 억제하지 않는, 재조합 단백질.
E117a. E1 내지 E117 중 어느 하나에 있어서, CD40 수용체의 N-말단 시스테인-풍부 도메인 1(CRD1)(SEQ ID NO: 51의 아미노산 23-59)에 특이적으로 결합하는, 재조합 단백질.
E118. E1 내지 E117 중 어느 하나의 재조합 단백질 또는 E1 내지 E117 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 안키린 반복 도메인을 코딩하는 핵산.
E119. SEQ ID NO: 58의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 E118의 핵산.
E120. SEQ ID NO:58의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E121. SEQ ID NO: 58의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E122. 고도로 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO: 58의 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E123. E118 또는 E119의 핵산을 포함하는 벡터.
E124. E118 또는 E119의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
E125. E123의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
E126. E124 또는 E125에 있어서, 상기 숙주 세포가 박테리아 세포인, 숙주 세포.
E127. E124 내지 E126 중 어느 하나에 있어서, 상기 숙주 세포가 대장균인, 숙주 세포.
E128. E124 또는 E125에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵 세포인, 숙주 세포.
E129. E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나의 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 재조합 단백질이 발현되는 조건 하에 E124 내지 E128 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
E130. E129에 있어서, 상기 재조합 단백질을 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
E131. E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 한 하나의 재조합 단백질 또는 E118 또는 E119의 핵산, 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
E132. 인간을 포함하는 포유류의 CD40-발현 세포에서 CD40의 국소 활성화 방법으로서, 상기 포유류에게 E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나의 재조합 단백질, E118 또는 E119의 핵산, 또는 E131의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
E133. E132에 있어서, 상기 CD40-발현 세포가 종양, 바람직하게는 고형 종양에 위치하는, 방법.
E134. E133에 있어서, 상기 종양이 FAP를 발현하는 세포를 포함하는, 방법.
E135. E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나의 재조합 단백질, E118 또는 E119의 핵산, 또는 E131의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 의학적 병태의 치료 방법.
E136. E134에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
E137. E134 또는 E135에 있어서, 상기 의학적 병태가 암인, 방법.
E138. E136에 있어서, 상기 암이 고형 종양인, 방법.
E139. E136 또는 E137에 있어서, 상기 암이 FAP를 발현하는 세포를 포함하는, 방법.
E140. E137 내지 E139 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 뇌암, 방광암, 유방암, 투명세포신암, 자궁경부암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 위암, 두경부암, 두경부 편평세포암, 입술암, 구강암, 간암, 자궁경부암, 폐 편평세포암, 흑색종, 중피종, 비소세포폐암(NSCLC), 비흑색종 피부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 요로상피암, 육종, 소세포폐암(SCLC), 편평세포암 두경부(SCCHN), 삼중 음성 유방암 또는 갑상선암인, 방법.
E141. E137 내지 E140 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 부신피질 종양, 폐포 연부 육종, 암종, 연골육종, 결장직장 암종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 소원형세포 종양, 내분비 종양, 내배엽 부비동 종양, 상피양 혈관내피종, 유잉 육종, 생식 세포 종양, 간모세포종, 간세포 암종, 흑색종, 신종, 신경모세포종, 비횡문근육종 연조직 육종(NRSTS), 골육종, 척수 주위 육종, 신세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 활액 육종 또는 윌름스 종양인, 방법.
E142. E137에 있어서, 암이 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 만성 골수성 백혈병(CML)인, 방법.
E143. E137에 있어서, 암이 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 호지킨 림프종(HL), 외투 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 소림프구성 림프종(SLL)인, 방법.
E144. E132 내지 E143 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물이 정맥 내 투여되는, 방법.
E145. E132 내지 E144 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물이 피하 투여되는, 방법.
E146. E132 내지 E145 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물이 약 1주에 2회, 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 5주에 1회, 6주에 1회, 7주에 1회, 8주에 1회, 9주에 1회, 10주에 1회, 1달에 2회, 1달에 1회, 2달에 1회, 3달에 1회, 또는 4달에 1회 투여되는, 방법.
E147. 약제로서 사용하기 위한 E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나의 재조합 단백질, E118 또는 E119의 핵산, 또는 E131의 약제학적 조성물.
E148. 대상체의 의학적 병태의 치료에 사용하기 위한 E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나의 재조합 단백질, 또는 E118 또는 E119의 핵산, 또는 E131의 약제학적 조성물.
E149. E148에 있어서, 상기 의학적 병태는 암인, 재조합 단백질.
E150. 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나의 재조합 단백질, E118 또는 E119의 핵산, 또는 E131의 약제학적 조성물의 용도.
E151. 대상체에서 의학적 병태를 치료하기 위한 E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나의 재조합 단백질, E118 또는 E119의 핵산, 또는 E131의 약제학적 조성물의 용도.
E152. E151에 있어서, 상기 의학적 병태가 암인, 용도.
E153. 용기, E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나의 재조합 단백질, 또는 E118 또는 E119의 핵산, 또는 E131의 약제학적 조성물, 및 치료적 유효량의 재조합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자의 치료를 위해 투여하기 위한 지침을 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
E154. 인간을 포함하는 포유류에서 항종양 면역 기억을 유도하는 방법으로서, 상기 포유류에게 E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나의 재조합 단백질, E118 또는 E119의 핵산, 또는 E131의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
E155. E154에 있어서, 면역학적 기억이 FAP-관련 항원에 제한되지 않는, 방법.
E156. E1 내지 E117 및 E120 내지 E122 중 어느 하나에 있어서, 인간을 포함하는 포유류의 종양에 우선적으로 국소화 및/또는 축적될 수 있는, 재조합 단백질.
E157. E156에 있어서, 상기 종양이 FAP를 발현하는 세포를 포함하는, 재조합 단백질.
E158. E1 내지 E117, E120 내지 E122, E156 및 E157 중 어느 하나에 있어서, 인간을 포함하는 포유류에서 항종양 면역 기억을 유도할 수 있는, 재조합 단백질.
E159. E158에 있어서, 상기 면역학적 기억은 FAP-관련 항원에 제한되지 않는, 재조합 단백질.
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도 1. 시험관 내 B 세포 활성화 분석을 묘사한 그림. 검정은 정제된 1차 인간 B 세포 및 FAP 발현(+FAP) 또는 비-FAP 발현(-FAP) CHO 세포를 사용하여 수행되었다.
도 2. CD86에 대해 양성인 세포의 백분율 및 MFI를 결정하는 데 사용되는 게이팅 전략의 개요. 하기 설정이 사용되었다: FSC: 200; SSC: 400; 획득: 200 ul/분, 100.000 이벤트 약어: FMO = 형광 마이너스 원, SSC = 측면 산란, FSC = 전방 산란, FSC - A = 전방 산란 영역, FSC - H = 전방 산란 높이.
도 3. HSA 결합 도메인(들)은 이중특이적 FAPxCD40 안키린 반복 결합 단백질의 효과 및 효능을 손상시킨다. 인간 B 세포는 FAP-발현 CHO 세포(채워진 기호)의 존재 하에 공동 배양되었고 증가하는 농도의 SMA014(위를 가리키는 삼각형), SMA087(아래를 가리키는 삼각형), SMA095(다이아몬드) 및 작용제 항-CD40 mAb(정사각형)로 처리되었다. 대조군으로서, B 세포를 FAP-음성 CHO 세포의 존재 하에 동시배양하고, 빈(empty) 기호로 나타낸 각각의 작제물의 가장 높은 농도로만 처리하였다. 인간 B 세포의 활성화는 600 μM HSA의 부재 A) 및 존재 B)에서 CD86의 상향조절(평균 형광 강도(MFI) 및 세포 백분율(%)로 측정) 측면에서 평가되었다. 각 값은 중복 측정의 평균을 나타낸다. 표시된 데이터는 2개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다. FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 모든 작제물에 대한 EC50 및 효능 값(단위 nM)은 그래프의 묘사된 표에 제시되어 있다.
도 4. CD40 2가는 이중특이적 FAPxCD40 안키린 반복 결합 단백질의 효과와 효능을 강력하게 증가시킨다. 인간 B 세포는 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 배양되었고 증가하는 농도의 SMA014(위를 가리키는 삼각형), SMA104(아래를 가리키는 삼각형), SMA105(다이아몬드) 및 작용제 항-CD40 mAb(정사각형)로 처리되었다. 대조군으로서, B 세포를 FAP-음성 CHO 세포의 존재 하에 동시배양하고, 빈 기호로 나타낸 각각의 작제물의 가장 높은 농도로만 처리하였다. 인간 B 세포의 활성화는 HSA의 부재 하에 CD86의 상향조절(평균 형광 강도(MFI) 및 세포 백분율(%)로 측정) 측면에서 평가되었다. 각 값은 중복 측정의 평균을 나타낸다. 표시된 데이터는 2개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다. FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 모든 작제물에 대한 EC50 및 효능 값(단위 nM)은 그래프의 묘사된 표에 제시되어 있다.
도 5. CD40 2가는 HSA 결합 도메인에 의해 유도된 억제 효과를 구제한다. 인간 B 세포는 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 배양되었고 증가하는 농도의 SMA014(위를 가리키는 삼각형), SMA104(아래를 가리키는 삼각형), SMA091(원형), SMA099(다이아몬드), AS579(육각형) 및 작용제 항-CD40 mAb(정사각형)로 처리되었다. 대조군으로서, B 세포를 FAP-음성 CHO 세포의 존재 하에 동시배양하고, 빈 기호로 나타낸 각각의 작제물의 가장 높은 농도로만 처리하였다. 인간 B 세포의 활성화는 HSA의 부재 A) 및 존재 B)에서 CD86의 상향조절(평균 형광 강도(MFI) 및 세포 백분율(%)로 측정) 측면에서 평가되었다. 각 값은 중복 측정의 평균을 나타낸다. 표시된 데이터는 2개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다. FAP 발현 CHO 세포의 존재 하에 모든 작제물에 대한 EC50 및 효능 값(단위 nM)은 그래프의 묘사된 표에 제시되어 있다.
도 6. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 다각도 광산란(MALS)을 통한 단백질 #5(SMA136이라고도 함)의 분석. 그래프는 시간 경과에 따른 몰 질량으로 SEC 프로파일을 보여준다. 결정된 단백질 #5의 분자량이 표시된다.
도 7. 인간 CD40(A), 인간 FAP(B) 및 인간 혈청 알부민(C)에 대한 단백질 #5(SMA136이라고도 함)의 결합을 보여주는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 트레이스. 결정된 KD 값이 표시된다.
도 8. hCD40, hFAP 및 HSA에 대한 단백질 #5의 동시 결합을 보여주는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 트레이스. 수직선(1, 2 및 3)은 3회 주입을 나타낸다: (1) 고정화된 bio-hCD40에 대한 단백질 #5의 결합; (2) bio-hCD40/단백질 #5 복합체에 대한 hFAP(다이아몬드 ◆, 삼각형 ▲ 및 원 ● 기호) 또는 단백질 #5(대조군; x 기호)의 결합; (3) bio-hCD40/단백질 #5/hFAP 복합체에 대한 HSA(다이아몬드 ◆, 삼각형 ▲ 기호) 또는 hFAP(대조군; 원 ● 기호)의 결합, 이어서 600초 해리 단계. 주입 계획은 동일한 기호를 사용하여 표 8에 설명되어 있다. hCD40/단백질 #5/hFAP/HSA의 동시 결합은 2개의 다른 레인(다이아몬드 및 삼각형 기호)에서 이중으로 측정된다.
도 9. 단백질 #5는 시험관 내에서 CD40을 통해 인간 B 세포를 활성화한다. 인간 B 세포를 FAP 발현 CHO 세포의 존재 하에 배양하고 증가하는 농도의 단백질 #5(원 기호) 및 항-CD40 mAb(사각형 기호)로 처리하였다. 인간 B 세포의 활성화를 CD86 및 CD69의 상향조절 측면에서 평가하였다(평균 형광 강도(MFI) 및 세포 백분율(%)로 측정됨). 각 값은 중복 측정의 평균을 나타낸다. 표시된 데이터는 13개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다. 도시된 표는 단백질 #5(왼쪽 열) 및 항-CD40 mAb(오른쪽 열)에 대한 EC50 및 효능 값을 보여준다.
도 10. 시험관 내 단백질 #5에 의한 인간 B 세포의 활성화는 FAP 의존적이다. 데이터는 시험관 내 FAP 발현 CHO 세포의 부재 하에 단백질 #5가 인간 B 세포에서 CD86 및 CD69의 상향조절을 유도하지 않음을 보여준다. 실험 및 데이터 플로팅은 도 9에 기술된 바와 같이, 즉 단백질 #5(원 기호) 및 항-CD40 mAb(사각형 기호)를 사용하여 수행되었지만, FAP-음성 CHO 세포의 존재 하에 수행되었다. 표시된 데이터는 13개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다. 도시된 표는 항-CD40 mAb에 대한 EC50 및 효능 값만을 보여준다.
도 11. 시험관 내 분화된 MDDC 및 조사된 FAP 발현(+FAP) 또는 비-FAP 발현(-FAP) CHO 세포를 사용한 인간 단핵구 유래 수지상 세포(MDDC) 활성화 검정의 도식적 표현.
도 12. 생체 내 항종양 효능 연구의 실험 설계의 도식적 표현. 0일차에 마우스에 MC38-FAP 결장 암종 세포를 피하로 접종하였다. 각각의 연구에 대해 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이 종양 크기 및 일자에 기초하여 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 서로 다른 일정으로 4개의 서로 다른 실험을 수행했다: (A) 초기 시점 종료: 첫 번째 처리 4일 후에 마우스를 희생시키고 종양을 FACS 분석(연구 PD1033 및 PD1038)으로 분석했다. (B) 늦은 시점 종료: 첫 번째 처리 후 10 내지 11일차에 마우스를 안락사시키고, 항종양 효능 평가를 위해 시간 경과에 따라 종양 크기를 측정하고 종료일에 종양을 FACS 분석(연구 PD1032 및 PD1035)으로 조사했다. 마우스는 표시된 시점에서 AS598, AS608 또는 항-CD40 항체로 i.p. 처리되었다.
도 13. 항종양 효능 연구 동안의 마우스 체중. 마우스는 도 12에 설명된 대로 처리되었다. 연구 PD1032(A) 및 연구 PD1035(B)에 대해 처리군당 평균 체중(± SEM, n=10)을 나타냈다. 점선은 무작위화 시점과 치료 시작 시점을 나타낸다. 비히클에 대한 다중 비교와 함께 Kruskal-Wallis를 사용하여 통계 분석을 수행했다. 결과는 * p<0.05, ** p<0.01*** p<0.001일 때 유의한 것으로 간주되었다.
도 14. 항종양 효능 연구 동안의 평균 종양 성장 부피. 도 12에 기재된 바와 같이 마우스를 처리하고 종양 부피를 3 내지 4일마다 측정하였다. 연구 PD1032(A) 및 연구 PD1035(B)에 대해 처리 그룹당 평균 종양 부피(± SEM, n=10)를 나타내었다. 점선은 무작위화 시점과 치료 시작 시점을 나타낸다. 화살표는 치료 시점을 나타낸다. 종료 시 비히클 또는 음성 대조군 AS608(괄호 안)에 대한 다중 비교와 함께 Kruskall-Wallis를 사용하여 통계 분석을 수행했다. 결과는 ** p<0.01*** p<0.001 **** p<0.0001일 때 유의한 것으로 간주되었다.
도 15. 다양한 FAP 특이적 재조합 결합 단백질이 존재하는 경우 평균 FAP 활성. 재조합 인간 FAP에 의한 기질 Z-GLY-PRO-AMC의 형광 생성물로의 전환은 다양한 재조합 단백질의 존재 또는 부재에서 측정되었다. 95분 동안 인큐베이션 후 FAP 활동이 표시된다. 시험 분자(제1 대조군: hFAP 및 기질)의 부재 하에서의 FAP 활성과 비교하여, FAP-결합 도메인을 함유하는 모든 시험된 재조합 단백질(분자 1-4)은 FAP 효소 활성에 대한 억제 효과를 나타내지 않았다. FAP 활성의 부분적 억제가 분자 번호 5(분석 대조군으로 사용됨)에 대해 관찰되었다. 평균 FAP 활동 및 표준 편차는 4중(quadruplet) 측정으로부터 표시된다.
도 16. (A) 인듐-111 표지 단백질 #7을 주사한 후 96시간 후 MC38-FAP 종양 보유 마우스의 대표적인 SPECT/CT 이미지. 정규화된 강도 설정을 사용하여 생성된 최대 강도 투영(MIP)이 표시된다. 표지된 단백질 #7은 종양에 우선적으로 국한되고 축적된다. (B) 주사 24시간 후 MC38-FAP 종양에서 면역조직화학(IHC)에 의한 단백질 #7(위 이미지) 또는 대조군 DARPin® 단백질(아래 이미지)의 검출. 크기 막대는 이미지의 오른쪽 하단 모서리에 도시된다. (C) 인듐-111 표지된 DARPin® 분자의 조직 분포의 시간 경과. 대조군 DARPin® 분자(실선 막대) 및 단백질 #7(줄무늬 막대)의 조직 분포를 표시된 시점에서 종양(왼쪽 그래프) 및 근육(오른쪽 그래프)에서 분석했다. 데이터는 조직 1 그램당 DARPin® 분자의 주입된 용량의 백분율(% ID/g)로 제공되며 평균 ± SD로 표시된다. 시점당 N= 4마리 마우스.
도 17. (A) 생체 내 항종양 효능 연구의 실험 설계의 도식적 표현. (B) 항종양 효능 연구 동안의 평균 종양 성장 부피. 도 17a 및 실시예 9에 기재된 바와 같이 마우스를 처리하고 종양 부피를 측정하였다. 비히클(삼각형 기호), AS598(원형 기호) 및 항-CD40 항체(사각형 기호)에 대해 처리군당 평균 종양 부피(± SEM, n=10)를 나타낸다. 화살표는 치료 시작을 나타낸다.
도 18. 항종양 효능 연구에서의 장기 효과. MC38-FAP 종양을 갖는 마우스를 실시예 10에 기술된 바와 같이 비히클(삼각형 기호), AS598(사각형 기호) 및 AS608(음성 대조군)(원형 기호)로 처리하고 종양 부피를 3 내지 4일마다 측정하였다. 치료 그룹당 평균 종양 부피(± SEM)는 (A)에 도시되고 Kaplan-Meier 생존 곡선은 (B)에 도시된다. 화살표는 치료 시점을 나타낸다.
도 19. 항종양 면역 기억의 유도. (A) 도 18a에 도시된 실험은 더 긴 기간 동안 이어졌으며, 비히클(위쪽을 가리키는 흰색 삼각형), AS598(흰색 원) 및 AS608(음성 대조군)(아래쪽을 가리키는 흰색 삼각형)으로 처리된 MC38-FAP 종양 보유 마우스에 대해 평균 종양 성장 곡선이 도시되어 있다. 짧은 화살표는 치료 시점을 나타낸다. 약 120일에, 이전에 AS598로 치료한 종양이 없는 마우스를 MC38-WT(아래를 가리키는 검정색 삼각형) 또는 MC38-FAP(위를 가리키는 검정색 삼각형) 종양 세포로 재도전하고(re-challenge) 200일까지 모니터링했다. 평균 종양 성장 곡선은 그룹당 8마리의 마우스로 표시된다. (B) 나이브 대조군 마우스는 약 120일에 MC38-WT(아래를 가리키는 삼각형) 또는 MC38-FAP(위를 가리키는 삼각형) 종양 세포로 도전되었다. 평균 종양 성장 곡선은 그룹당 5마리의 마우스로 표시된다.
도 20. 독성 평가. (A) MC38-FAP 종양이 있는 마우스를 비히클(n=10)(위를 향하는 삼각형), AS608(음성 대조군)(n=5)(아래를 향하는 삼각형), AS598(단백질 #7)(n= 10)(원) 또는 항-mCD40 항체(n=10)(사각형)로 1회 처리하고 24시간 후 혈청 사이토카인을 측정하였다. 두 개의 독립적인 실험에서 샘플을 수집하고 함께 분석했다. (B) MC38-FAP 종양이 있는 마우스를 비히클(위를 향하는 삼각형), AS608(음성 대조군)(아래를 향하는 삼각형), AS598(단백질 #7)(원) 또는 항-mCD40 항체(사각형)(그룹당 마우스 5마리)로 1회 처리하고 24시간 후 혈청 아스파르테이트 아미노전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)를 측정하였다. 두 개의 독립적인 실험에서 샘플을 수집하고 함께 분석했다. (C) MC38-FAP 종양이 있는 마우스를 비히클, AS608(음성 대조군)(나타내지 않음), AS598(단백질 #7) 또는 항-mCD40 항체(n=5-10)로 1회 처리하고 24시간 후 간을 채취하여 면역조직화학(IHC)으로 조직 손상을 분석했다. 다양한 치료의 대표 사진이 표시된다. NEC, 괴사; ICI, 면역 세포 침윤. 크기 막대는 사진의 오른쪽 하단 모서리에 표시된다.
도 21. SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 DARPin® 단백질과 복합체를 이루는 인간 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 5(hCD40)의 X-선 결정학에 의한 구조 결정.
1. 개요
FAP 및 CD40에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 단백질이 본원에 개시된다. 또한, 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물을 사용하는 방법이 개시된다. 일 양태에서, 본 개시내용의 물질 및 방법은 종양-관련 기질에서의 FAP의 발현을 이용하여, 예를 들어 종양에서의 CD40-발현 세포의 특이적 표적화 및 이러한 CD40-발현 세포에서의 CD40의 선택적 활성화를 허용한다.
CD40 작용제 항체는 전임상 뮤린 종양 모델에서 효능이 입증되었으며 임상에서의 사용에서도 일부 항종양 효능이 나타났다. 그러나, 작용제 항-CD40 항체의 임상 개발은 용량 제한 독성 및 결과로서의 낮은 효능으로 인해 방해를 받았을 가능성이 있다.
본원에 기재된 다중특이적 재조합 단백질은 CD40의 암 표적-매개 및 종양-국소화 클러스터링 및 활성화를 촉진함으로써 이전의 치료적 접근법과 관련된 문제를 해결한다. 자연 환경에서, CD40의 클러스터링은 삼량체성 CD40 리간드(CD40L, CD154)에 대한 결합에 의해 달성되며, 이는 특정 세포, 예를 들어 활성화된 CD4+ T 세포의 표면에 막 분자로 발현된다. 예를 들어, CD40L에 의해 표적화된 세포의 세포 막에서 CD40 클러스터링은 이의 신호전달 경로의 활성화를 위한 전제조건이다. 본원에 개시된 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 이러한 클러스터링 효과를 이용하며; CD40의 활성화는 종양 항원 FAP의 발현과 관련이 있다.
섬유아세포 활성화 단백질 (α)(FAP, Seprase라고도 함)은 암 관련 섬유아세포에 의해 많은 고형 종양의 기질에서 풍부하게 발현되는 II형 막 결합 당단백질이다. FAP는 폐, 결장, 방광, 난소 및 유방 암종을 포함하는 상피 악성 종양(원발성 및 전이성)의 90% 초과의 반응성 기질 섬유아세포 및 뼈 및 연조직 육종의 악성 중간엽 세포에서 선택적으로 발현되는 반면, 이는 일반적으로 정상 성인 조직에서는 부재한다(문헌[Brennen et al., Mol Cancer Ther. 11: 257-266 (2012)]; 문헌[Garin-Chesa et al., Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235-7239 (1990)]; 문헌[Rettig et al., Cancer Res. 53:3327-3335 (1993)]; 문헌[Rettig et al., Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110-3 114 (1988)]). FAP는 특정 악성 종양 세포에서도 발현된다.
특정한 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 종양 항원 FAP(정상, 비-악성, 비-암 관련 세포)가 없으면 CD40의 최소 클러스터링이 발생하고 면역 활성화가 제한된다. 대조적으로, 암 관련 섬유아세포에서 FAP는 고도로 발현되며, 따라서 FAP-결합을 통해, 본 발명의 다중특이적 단백질은 예를 들어 B 세포 및 항원 제시 세포와 같은 CD40 발현 면역 세포에서 CD40 클러스터링 및 활성화를 촉진한다. 이 전략의 장점은 두 가지이다: 활성화가 FAP를 발현하는 조직에 주로 국한될 것이기 때문에 전신 독성이 제한되어야 하고, 종양 매개 CD40 클러스터링이 강력한 작용을 유도해야 한다.
2. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 공지되고 일반적으로 사용되는 명명법이다.
"포함하는", "갖는", "비롯한" 및 "함유하는"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어로 해석되어야 한다. 본 발명의 양태가 특징을 "포함하는" 것으로 기술되는 경우, 실시형태는 또한 특징으로 "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는" 것으로 고려된다. 본원에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 개시를 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 개시내용의 실행에 필수적인 것으로 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 작업예에서 또는 달리 표시된 경우를 제외하고, 본원에서 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 나타내는 모든 숫자는 해당 용어가 관련 기술 분야의 숙련자에 의해 해석될 것이기 때문에 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 값의 범위를 언급하는 것은 본원에 달리 표시되지 않는 한 범위 및 각 끝점에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 속기 방법으로서 역할을 하기 위한 것이며, 각각의 개별 값과 종점은 마치 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다.
용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 다수의, 즉 2개 이상의 아미노산의 하나 이상의 사슬로 이루어진 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 연결된 8개 초과의 아미노산으로 이루어진다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 시스테인의 S-S 가교에 의해 함께 연결된 다수의 아미노산 사슬들을 포함한다. 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려져 있다.
용어 "단백질"은 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭하는 것으로, 여기서는 폴리펩티드의 적어도 일부가 단일 폴리펩티드 사슬 내에 그리고/또는 다수의 폴리펩티드 사슬들 사이에 2차, 3차, 및/또는 4차 구조를 형성함으로써 명확한 3차원 배열을 갖거나 획득할 수 있다. 단백질이 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 경우에, 개별 폴리펩티드 사슬들은, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 사슬 사이의 이황화물 결합에 의해 비공유적으로 또는 공유적으로 연결될 수 있다. 2차 및/또는 3차 구조를 형성함으로써 명확한 3차원 배열을 개별적으로 갖거나 획득할 수 있는 단백질의 일부를 "단백질 도메인"이라 칭한다. 그러한 단백질 도메인은 당업자에게 잘 알려져 있다.
국제공개 WO 2002/020565호 및 문헌[Forrer et al., 2003 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K., Pl
Figure pct00001
ckthun, A., 2003. FEBS Letters 539, 2-6)]은 반복 단백질, 반복 도메인 및 반복 모듈 특징, 기술 및 적용에 대한 일반적인 설명을 포함한다.
용어 "반복 도메인"은 구조 단위로서 2개 이상의 연속 반복 모듈을 포함하는 단백질 도메인을 지칭하며, 여기서 상기 반복 모듈들은 구조적 상동성 및 서열 상동성을 갖는다. 바람직하게는, 반복 도메인은 또한 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 명확성을 위하여, 캡핑 모듈은 반복 모듈일 수 있다. 이러한 반복 도메인, 반복 모듈 및 캡핑 모듈, 서열 모티프, 뿐만 아니라 구조적 상동성 및 서열 상동성은 안키린 반복 도메인(문헌[Binz et al., J. Mol. Biol. 332, 489-503, 2003; Binz et al., 2004, loc. cit.]; 국제공개 WO 2002/020565호; 국제공개 WO 2012/069655호), 류신-풍부 반복 도메인(국제공개 WO 2002/020565호), 테트라트리코펩티드 반복 도메인(문헌[Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003]), 및 아르마딜로 반복 도메인(국제공개 WO 2009/040338호)의 예로부터 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 반복 도메인은 반복 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 상이하고, 모든 반복 아미노산 서열이 개별 도메인(예를 들어, 피브로넥틴의 FN3 도메인)을 형성할 수 있다는 것이 당업자에게 추가로 잘 알려져 있다.
용어 "안키린 반복 도메인"은 구조 단위로서 2개 이상의 연속 안키린 반복 모듈을 포함하는 반복 도메인을 지칭하며, 여기서 상기 안키린 반복 모듈들은 구조적 상동성 및 서열 상동성을 갖는다.
용어 "반복 모듈"은 천연 발생 반복 단백질의 반복 단위로부터 원래 유래되는, 설계된 반복 도메인의 반복된 아미노산 서열 및 구조 단위를 지칭한다. 반복 도메인 내에 포함된 각각의 반복 모듈은 천연 발생 반복 단백질들의 패밀리 또는 하위패밀리, 바람직하게는 안키린 반복 단백질들의 패밀리의 하나 이상의 반복 단위로부터 유래된다. 따라서, 용어 "안키린 반복 모듈"은 천연 발생 안키린 반복 단백질의 반복 단위로부터 원래 유래되는 반복 모듈을 지칭한다. 안키린 반복 단백질은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2002/020565호, 국제공개 WO 2010/060748호, 국제공개 WO 2011/135067호, 국제공개 WO 2012/069654호, 국제공개 WO 2012/069655호, 국제공개 WO 2014/001442호, 국제공개 WO 2014/191574호, 국제공개 WO 2014/083208호, 국제공개 WO 2016/156596호, 및 국제공개 WO 2018/054971호 참조.
안키린 반복 도메인은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 선택적으로 반감기 연장 도메인과 함께 본 개시내용에 따라 더 큰 안키린 반복 단백질로 모듈식으로 조립될 수 있다(예를 들어, 문헌[Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2--6, 2003], 국제공개 WO2012/069655호, 국제공개 WO 2002/020565호 참조).
설계된 반복 단백질, 설계된 반복 도메인, 설계된 안키린 반복 도메인 등에 사용되는 바와 같이, 용어 "설계된"은 그러한 반복 단백질 및 반복 도메인이 각각 인공이고 천연에서 발생하지 않는다는 특성을 지칭한다.
재조합 단백질, 재조합 결합 단백질, 재조합 폴리펩티드 등에 사용되는 바와 같이, "재조합"이라는 용어는 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 생성된다는 것을 의미한다. 예를 들어, (예를 들어, 유전자 합성에 의해 생성된) 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 DNA 분자가 세균 발현 플라스미드(예를 들어, pQE30, QIAgen), 효모 발현 플라스미드, 포유류 발현 플라스미드 또는 식물 발현 플라스미드 또는 시험관 내 발현을 가능하게 하는 DNA 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 그러한 재조합 세균 발현 플라스미드가 적절한 세균(예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)) 내로 삽입되는 경우에, 이들 세균은 이 재조합 DNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)를 생성할 수 있다. 상응하여 생성된 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질로 불린다.
본 발명과 관련하여, 용어 "결합 단백질"은 결합 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 결합 단백질은 또한 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 재조합 결합 단백질이다.
용어 "결합 도메인"은 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 도메인을 의미한다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 재조합 결합 도메인이다.
용어 "표적"은 개별 분자, 예컨대 핵산 분자, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 또는 임의의 다른 천연 발생 분자 - 그러한 개별 분자의 임의의 부분을 포함함 -, 또는 2개 이상의 그러한 분자의 복합체, 또는 전세포(whole cell) 또는 조직 샘플, 또는 임의의 비천연 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 표적은 천연 발생 또는 비천연 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 화학적 변형, 예를 들어 천연 발생 또는 비천연 인산화, 아세틸화, 또는 메틸화를 함유하는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 예를 들어, SEQ ID NO: 39 내지 42로 이루어진 각각의 설계된 안키린 반복 도메인의 표적은 혈청 알부민이다.
"표적에 대하여 결합 특이성을 갖는다", "표적에 특이적으로 결합하는", "높은 특이성으로 표적에 결합하는", "표적에 특이적인" 또는 "표적 특이성" 등의 용어는 결합 단백질 또는 결합 도메인이 대체 표적(예를 들어, 세포 또는 물질)보다 특정 표적(예를 들어, 세포 또는 물질)과 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 지속 시간 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 회합함을 의미한다. 예를 들어, FAP에 특이적으로 결합하는 결합 도메인은 대장균 말토스 결합 단백질(MBP)과 같은 관련 없는 단백질에 결합하는 것보다 더 낮은 해리 상수로(즉, 더 높은 친화도로 결합) PBS에서 FAP에 결합하는 결합 도메인으로 정의될 수 있다. 바람직하게는, 표적에 대한 PBS에서의 해리 상수("KD")는 MBP에 대한 상응하는 해리 상수보다 적어도 102; 보다 바람직하게는, 적어도 103; 보다 더 바람직하게는, 적어도 104; 또는 가장 바람직하게는, 적어도 105배 낮다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 기법(예를 들어, SPR 평형 분석) 또는 등온 적정 열량계(isothermal titration calorimetry, ITC)와 같은 단백질-단백질 상호작용의 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특정 단백질-단백질 상호작용의 측정된 KD 값은 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, KD 값의 측정은 표준화된 단백질 용액 및 표준화된 완충액, 예컨대 PBS에 의해 바람직하게 이루어진다. 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인은 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다는 것이 이 정의를 읽음으로써 또한 이해된다. 따라서 "특이적 결합"은 배타적 결합을 포함할 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니다. 일반적으로, 지정된 분석 조건에서, 안키린 반복 도메인은 특정 표적 분자에 우선적으로 결합하고 시험 샘플에 존재하는 다른 성분에는 유의한 양으로 결합하지 않는다.
다양한 분석 형식을 사용하여 관심 분자에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 선택하거나 특성화할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석, 면역침전, BIAcore™(GE Healthcare, Piscataway, NJ), 형광 활성화 세포 분류(FACS), Octet™(ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) 및 웨스턴 블롯 분석이 표적과 특이적으로 반응하는 안키린 반복 도메인을 식별하기 위해 사용될 수 있는 많은 분석 중 하나이다. 일반적으로, 특정 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈의 적어도 2배, 더 일반적으로 배경의 10배 초과이다. 훨씬 더 구체적으로, 안키린 반복 도메인은 평형 해리 상수(KD) 값이 < 1 μΜ, 예컨대 < 100 nM, < 10 nM, < 100 pM, < 10 pM, 또는 < 1 pM일 때 표적에 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다.
KD 값은 종종 결합 친화도로도 지칭된다. 결합 친화도는 하나의 결합 파트너(예를 들어, 본원에 개시된 FAP 또는 CD40 결합 도메인)의 접촉 잔기와 그의 결합 파트너(예를 들어, FAP 또는 CD40)의 접촉 잔기 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 측정한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된, 결합 친화도는 결합 쌍의 구성원 또는 결합 파트너 간의 1:1 상호작용을 반영하는 결합 친화도를 지칭한다. 하나의 결합 파트너에 대해 2개의 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질의 경우, 결합 친화도는 결합 단백질과 결합 파트너 간의 1:2 상호작용을 반영하는 결합 친화도를 의미할 수 있다.
결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 예시된 바와 같이, 결합 친화도는 특정 안키린 반복 도메인 및 그의 결합 표적의 해리 속도를 나타내는 KD 값으로 표현될 수 있다. KD는 결합 속도 또는 "온 속도(Kon)"에 대한 "오프 속도(Koff)"라고도 하는 해리 속도의 비이다. 따라서, KD는 Koff/Kon과 같으며 몰 농도(M)로 표시되며, KD가 작을수록 결합 친화도는 강하다.
KD 값은 임의의 적절한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. KD를 측정하는 한 가지 예시적인 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다(예를 들어, 문헌[Nguyen et al. Sensors (Basel). 2015 May 5; 15(5):10481-510] 참조). KD 값은 BIACORE® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하여 SPR에 의해 측정될 수 있다. BIAcore 동역학 분석은 표면에 고정된 분자(예를 들어, 에피토프 결합 도메인을 포함하는 분자)가 있는 칩으로부터 항원의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다. 단백질의 KD를 결정하는 또 다른 방법은 Bio-Layer Interferometry를 사용하는 것이다(예를 들어, 문헌[Shah et al. J Vis Exp. 2014; (84): 51383] 참조). KD 값은 OCTET® 기술(Octet QKe 시스템, ForteBio)을 사용하여 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, Sapidyne Instruments(Boise, Id.)로부터 입수가능한 KinExA®(Kinetic Exclusion Assay) 분석이 또한 사용될 수 있다. 2개의 결합 파트너 사이의 결합 친화도를 평가하기에 적합한 임의의 방법이 본원에 포함된다. 바람직하게는, KD 값은 SPR에 의해, 예를 들어 실시예 2에 설명된 바와 같이 PBS에서 결정된다.
용어 "폴리펩티드 태그"는 폴리펩티드/단백질에 부착된 아미노산 서열을 지칭하며, 상기 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드/단백질의 정제, 검출, 또는 표적화에 유용하거나, 또는 상기 아미노산 서열은 폴리펩티드/단백질의 물리화학적 거동을 개선하거나, 또는 상기 아미노산 서열은 이펙터 기능을 보유한다. 결합 단백질의 개별 폴리펩티드 태그, 모이어티 및/또는 도메인은 서로 직접 연결되거나 또는 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 이들 폴리펩티드 태그는 모두 당업계에 잘 알려져 있고, 당업자가 충분히 이용가능하다. 폴리펩티드 태그의 예는 작은 폴리펩티드 서열, 예를 들어 His(예를 들어, 서열 번호 57로 이루어진 His-태그), myc, FLAG, 또는 Strep-태그 또는 모이어티, 예컨대 효소(예를 들어, 알칼리성 포스파타제와 같은 효소)이며, 이는 상기 폴리펩티드/단백질, 또는 표적화(예컨대, 면역글로불린 또는 이의 단편)에 그리고/또는 이펙터 분자로서 사용될 수 있는 모이어티의 검출을 가능하게 한다.
용어 "폴리펩티드 링커"는, 예를 들어 2개의 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그와 단백질 도메인, 단백질 도메인과 비-폴리펩티드 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 2개의 폴리펩티드 태그를 연결시킬 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 그러한 추가의 도메인, 태그, 비-폴리펩티드 모이어티 및 링커는 관련 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다. 그러한 폴리펩티드 링커의 예는 SEQ ID NO: 4 및 56으로 이루어진 링커이다.
용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는, 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 어느 하나인 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 분자일 수 있고, DNA 또는 RNA의 변형된 형태 및 인공 형태를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단리된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 재조합 핵산 분자 또는 벡터 내에 포함될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 "의학적 병태", "질병" 및 "장애"는 상호교환 가능하게 사용되며, 자가면역 장애, 염증성 장애, 망막병증(특히, 증식성 망막병증), 신경퇴행성 장애, 감염성 질병, 대사성 질병, 및 신생물성 질병을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. "의학적 병태"는 부적절한 세포 증식을 특징으로 하는 것일 수 있다. 의학적 병태는 과증식성 병태일 수 있다. 의학적 병태는 신생물성 질병일 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "신생물성 질병"은 급속하게 증식하는 세포 성장 또는 신생물을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 비정상적인 상태 또는 병태를 지칭한다. 의학적 병태는 악성 신생물성 질병일 수 있다. 의학적 병태는 암일 수 있다. 본원에서, 용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는, 포유동물에서의 생리학적 병태를 지칭하거나 기재하는 데 사용된다. 암은 고형 종양 및 액체 종양뿐만 아니라 원발성 종양 및 전이를 포함한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 고형 종양은 전형적으로 또한 종양 간질을 포함한다. 암의 예에는 원발성 및 전이성 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 골수종, 흑색종 및 백혈병, 및 임의의 다른 상피 및 혈액 세포 악성종양이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 그러한 암의 더 특정한 예에는 뇌암, 방광암, 유방암, 난소암, 신장암, 결직장암, 위암, 두경부암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 악성 흑색종, 골육종, 연조직 육종, 암종, 편평 세포 암종, 투명 세포 신장암, 두경부 편평 세포 암종, 폐 선암종, 폐 편평 세포 암종, 비소세포 폐암(NSCLC), 신세포 암종, 소세포 폐암(SCLC), 삼중 음성 유방암, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 호지킨 림프종(HL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL), 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN), 만성 골수원성 백혈병(CML), 소림프구성 림프종(SLL), 악성 중피종, 지질육종, 신경아세포종, 또는 활막 육종이 포함된다.
용어 "치료하다" 및 이와 관련된 단어가 반드시 100% 또는 완전한 치료를 의미하는 것은 아니다. 오히려, 당업자가 잠재적인 이점 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식하는 다양한 정도의 치료가 존재한다. 이와 관련하여, 본 개시내용의 암을 치료하는 방법은 임의의 양 또는 임의의 수준의 치료를 제공할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 치료는 하나 이상의 병태 또는 증상의 치료(즉, 완화)를 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 치료는 암의 진행을 늦추는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 T 세포 활성 또는 암에 대한 면역 반응의 향상, 종양 또는 암의 성장 또는 새로운 병변의 출현 감소, 종양 세포의 전이 감소, 종양 또는 암세포의 세포 사멸 증가, 종양 또는 암 세포 생존의 억제 등에 의해 암을 치료할 수 있다. 예시적인 양태에서, 방법은 암의 발병 또는 재발을 1일, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 15일, 30일, 2개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 4년 또는 그 이상 지연시키는 방식으로 치료한다. 예시적인 양태에서, 방법은 대상체의 생존을 증가시키는 방식으로 치료한다. "치료"라는 용어에는 예방적 치료도 포함된다.
임의의 소정의 질병 또는 상태에서의 치료 반응은 그 질병 또는 상태에 특정한 표준화된 반응 기준에 의해 결정될 수 있다. 종양 반응은 자기공명영상(MRI) 스캔, x-방사선 영상, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 양전자 방출 단층촬영(PET) 스캔, 뼈 스캔, 초음파, 종양 생검 샘플링, 순환계 내 종양 세포 계수, 및/또는 종양 항원(예를 들어, 전립선 특이적 항원(PSA) 및/또는 알파펠토단백질(AFP))의 측정과 같은 스크리닝 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 치료적 반응에 더하여, 치료를 받는 대상체는 질병과 관련된 증상의 개선이라는 유익한 효과를 경험할 수 있다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 치료적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 자들은 이미 장애를 갖는 자들뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 자들도 포함한다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 원하는 생물학적, 약리학적, 또는 치료적 결과를 유도하기에 충분한 양을 지칭한다. 본 발명과 관련하여 치료적 유효량은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 효과/위험 비로 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하기에 충분한 양의 결합 단백질을 의미한다.
치료 목적상, 용어 "포유동물"은 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭하며, 이러한 포유동물에는 인간, 가축 및 농장 동물, 비인간 영장류, 및 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등이 포함된다.
용어 "인큐베이션"은 pH 7.4에서의 인큐베이션을 지칭한다. 일 실시형태에서, pH 7.4에서의 상기 인큐베이션은 PBS 중에서의 인큐베이션을 지칭한다.
용어 "PBS"는 137 mM NaCl, 10 mM 인산염 및 2.7 mM KCl을 함유하고, pH가 7.4인 인산염 완충 수용액을 의미한다.
용어 개선된 약동학적 특성은 증가된 곡선 아래 면적, 감소된 제거율, 또는 증가된 최종 반감기를 지칭한다. 이들을 결정하기 위한 약동학적 특성 및 방법의 이들 파라미터는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Mahmood, I., Methods to determine pharmacokinetic profiles of therapeutic proteins, Drug Discov Today: Technol (2009), doi:10.1016/j.ddtec.2008.12.001] 참조).
본 발명과 관련하여, 용어 "임의의 아미노산"은 바람직하게는 20개의 가장 흔한 천연 발생 아미노산, 즉 알라닌(ala; A), 아르기닌(arg; R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y), 발린(val, V) 중 어느 하나를 의미한다.
3. FAP 및 CD40을 표적으로 하는 다중특이적 분자
FAP 및 CD40을 표적으로 하는 다중특이적 분자가 본원에 개시되어 있다. 분자는 예를 들어 암 치료에 유용하다. 본 발명에 있어서, FAP 및 CD40을 표적으로 하는 본원에 제공된 다중특이적 분자는 바람직하게는 설계된 반복 단백질, 보다 바람직하게는 설계된 안키린 반복 단백질이다.
3.1. 안키린 반복 도메인 및 안키린 반복 단백질
설계된 안키린 반복 단백질은 단일클론 항체의 제한을 극복하는 잠재성을 갖는 결합 분자들의 부류이며, 이에 따라 신규한 치료적 접근법을 가능하게 한다. 그러한 안키린 반복 단백질은 단일의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함할 수 있거나, 동일하거나 상이한 표적 특이성을 갖는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 설계된 안키린 반복 도메인의 조합을 포함할 수 있다(문헌[Stumpp et al., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008]; 미국 특허 제9,458,211호). 단지 단일의 설계된 안키린 반복 도메인만을 포함하는 안키린 반복 단백질은 높은 친화도 및 특이성으로 소정의 표적 단백질에 결합하도록 선택될 수 있는 작은 단백질(14 kDa)이다. 이들 특성, 및 하나의 단백질 내에 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 설계된 안키린 반복 도메인을 조합하는 것에 대한 가능성은 설계된 안키린 반복 단백질을 이상적인 작용적, 길항적 및/또는 억제성 약물 후보가 되게 한다. 더욱이, 상기 안키린 반복 단백질은 다양한 이펙터 기능을 갖도록 조작될 수 있어서(예를 들어, 세포독성제 또는 반감기 연장제), 완전히 새로운 약물 포맷을 가능하게 할 수 있다. 종합하면, 설계된 안키린 반복 단백질은 기존의 항체 약물을 능가할 잠재성을 갖는 차세대 단백질 치료제의 한 예이다.
본원에 기재된 디자인된 안키린 반복 도메인은 일반적으로 하나 이상의 설계된 반복 모듈, 바람직하게는 안키린 반복 모듈을 구조 단위(이하 구조적 반복부 또는 반복 단위라고도 함)로 포함하고, 상기 반복 모듈, 바람직하게는 상기 안키린 반복 모듈은 구조 및 서열 상동성을 갖는다. 안키린 반복 모듈은 일반적으로, 2개의 역평행 α-헬릭스와, 이에 이어 베타-팽대부 및 베타-헤어핀으로 구성된 루프(당해 반복부를 다음 반복부에 연결함)를 함유하며, 그 각각이 약 28-33개의 잔기를 갖는다.
설계된 안키린 반복 모듈를 포함하는 재조합 단백질, 또는 이의 설계된 결합 도메인은 또한 본원에서 DARPin® 단백질로 지칭된다. 문헌[Stumpp et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 10(2): 153-9 (2007)]; 및 문헌[Binz et al., Nature Biotech. 22(5): 575-582 (2004)] 참조. DARPin® 단백질은 표적 단백질에 대한 높은 특이성과 높은 결합 친화도를 갖는 항체 모방체로 간주될 수 있다. 일반적으로, DARPin® 단백질은 적어도 하나의 안키린 반복 모듈, 예를 들어, 적어도 2개, 3개 이상의 안키린 반복 모듈을 포함한다. DARPin®은 스위스 소재의 Molecular Partners AG가 소유한 상표이다.
본원에 기재된 안키린 반복 도메인은 일반적으로 구조를 제공하는 코어 스캐폴드, 및 표적에 결합하는 표적 결합 잔기를 포함한다. 구조적 코어는 보존된 아미노산 잔기를 포함하고, 표적 결합 표면은 표적에 따라 상이한 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 안키린 반복 모듈은 다음 서열을 포함할 수 있다: xDxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNA (SEQ ID NO: 23), 여기서 "x"는 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 "x"는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아니다. 다른 예로서, 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 24 내지 27 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리를 포함하는 설계된 반복 단백질 라이브러리(국제공개 WO 2002/020565호; 문헌[Binz et al., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp et al., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008])은 높은 친화도로 표적에 결합하는 표적 특이적 설계 반복 도메인의 선택/스크리닝에 사용될 수 있다. 결과적으로, 그러한 표적-특이적 설계된 반복 도메인은 질병의 치료를 위한 재조합 결합 단백질의 유용한 성분으로서 사용될 수 있다. 이러한 라이브러리의 제조 방법은 당업자에게 알려져 있다(국제공개 WO 2002/020565호).
다중 안키린 반복 도메인은 (공유 결합 또는 비공유 결합을 통해) 연결되어 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 형성할 수 있다. 하나의 FAP-결합 도메인 및 2개의 CD40-결합 도메인이 연결된 분자를 포함하는 이러한 다중특이적 분자가 본원에 개시되어 있다. 이러한 분자는 또한 N-말단에 반감기 연장 모이어티를 포함할 수 있다.
3.2. N-말단 및 C-말단 캡핑 모듈
본원에 개시된 재조합 단백질의 반복 도메인, 바람직하게는 안키린 반복 도메인은 바람직하게는 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈(이후 캡핑 반복부 또는 캡핑 단위로도 지칭됨)을 포함한다. 캡핑 모듈은 안키린 반복 도메인의 N- 및/또는 C-말단 끝에 위치하며, 일반적으로 중간에 있는 안키린 반복 모듈(들)과 긴밀한 3차 상호작용(즉, 3차 구조 상호작용)을 형성하며, 이로써 안키린 반복 도메인의 소수성 코어를 용매에 대한 노출로부터 측면에서 보호하는 캡을 제공한다.
N- 및/또는 C-말단 캡핑 모듈은 반복 단위에 인접한 자연 발생 반복 단백질에서 발견되는 캡핑 단위 또는 다른 구조 단위로부터 유래될 수 있다. 캡핑 서열의 예는 국제공개 WO 2002/020565호 및 국제공개 WO 2012/069655호, 미국 특허출원공개 US20130296221호, 및 문헌[Interlandi et al., J Mol Biol. 2008 Jan 18;375(3):837-54]에 기재되어 있다. N-말단 캡핑 모듈(즉, N-말단 캡핑 반복부)의 예는 SEQ ID NO: 11-16이고 C-말단 캡핑 모듈(즉, C-말단 캡핑 반복부)의 예는 SEQ ID NO: 18-21이다.
예시적인 실시형태에서, N-말단 캡핑 모듈은 아미노산 서열 DLGKKLLEAARAGQDDEVRILLAAGADVNA(SEQ ID NO: 14) 또는 DLGKKLLEAARAGQDDEVRELLKAGADVNA (SEQ ID NO: 15)를 포함하고, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개 아미노산은 임의의 아미노산에 의해 선택적으로 교환되고; SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15는 선택적으로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, C-말단 캡핑 모듈은 아미노산 서열 QDIFGKTPADIAADAGHEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO: 19) 또는 QDKSGKTPADLAADAGHEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO: 20)를 포함하고, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 아미노산은 임의의 아미노산에 의해 선택적으로 교환된다.
유리하게는, 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 설계된 안키린 반복 도메인의 N-말단 캡핑 모듈 및/또는 C-말단 캡핑 모듈의 특정 아미노산 잔기를 변경하여 설계된 안키린 반복 도메인 및 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 연장된 소실 반감기를 포함하는 약동학적 특성이 개선된다. 변경된 아미노산 잔기는 대부분 표면 노출된 잔기이다. 바람직하게는, 변경된 아미노산 잔기는 N-말단 캡핑 모듈의 위치 8 및 15에 있는 아미노산 잔기이며, 위치 번호는 SEQ ID NO: 11의 위치 및 C-말단 캡핑 모듈의 위치 14 및 18에 있는 아미노산 잔기에 상응하며, 위치 번호는 SEQ ID NO: 18의 위치에 상응한다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 설계된 안키린 반복 도메인은 위치 8에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 이러한 N-말단 캡핑 모듈의 예는 SEQ ID NO: 11, 12 및 13이다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 위치 4에서의 아미노산이 S이고/이거나, 위치 8에서의 아미노산이 Q이고/이거나, 위치 15에서의 아미노산이 L이고/이거나, 위치 17에서의 아미노산이 T이고/이거나, 위치 20에서의 아미노산이 T이고/이거나, 위치 23에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 이러한 N-말단 캡핑 모듈의 예는 SEQ ID NO: 16이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 N-말단 캡핑 모듈은 30개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 N-말단 캡핑 모듈은 30개의 아미노산의 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, N-말단 캡핑 모듈의 위치들의 상기 위치 번호는 SEQ ID NO: 11의 위치 번호를 사용하여 SEQ ID NO: 11에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다. 서열 정렬 생성은 당업계에 잘 알려진 절차이다. 임의의 상기 N-말단 캡핑 모듈은 선택적으로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 변경된 아미노산 잔기를 갖는 N-말단 캡핑 모듈은 다음 서열을 포함할 수 있다: DLGxxLLQAAxxGQLDxVRxLxxxGADVNA (SEQ ID NO: 17), 여기서 "x"는 임의의 아미노산을 나타낸다.
예시적인 실시형태에서, N-말단 캡핑 서열은 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA(SEQ ID NO: 11), DLGKKLLQAARAGQLDEVRILLKAGADVNA(SEQ ID NO: 12) 또는 DLGKKLLQAARAGQLDEVRILLAAGADVNA(SEQ ID NO: 13)을 포함하며, 위치 8과 15 이외의 위치에서 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 또는 SEQ ID NO: 13의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 아미노산은 임의의 아미노산에 의해 선택적으로 교환되고; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 또는 SEQ ID NO: 13은 선택적으로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 설계된 반복 도메인, 바람직하게는 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA(SEQ ID NO: 11)를 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 위치 8과 15 이외의 위치에서 SEQ ID NO: 11의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 아미노산은 임의의 아미노산에 의해 선택적으로 교환되고; SEQ ID NO: 11은 선택적으로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, N-말단 캡핑 서열은 DLGSKLLQAARAGQLDTVRTLLQAGADVNA(SEQ ID NO: 16)를 포함하고, 위치 4, 8, 15, 17, 20 및 23 이외의 위치에서 SEQ ID NO: 16의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 아미노산은 임의의 아미노산에 의해 선택적으로 교환되고; SEQ ID NO: 16은 선택적으로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 본원에서 제공되는 설계된 반복 도메인, 바람직하게는 안키린 반복 도메인은 위치 14의 아미노산이 R이고/이거나 위치 18의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 이러한 C-말단 캡핑 모듈의 예는 SEQ ID NO: 18 및 19이다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 위치 3에서의 아미노산이 T이고/이거나, 위치 4에서의 아미노산이 Q이고/이거나, 위치 6에서의 아미노산이 T이고/이거나, 위치 14에서의 아미노산이 R이고/이거나, 위치 18에서의 아미노산이 Q이고/이거나, 위치 19에서의 아미노산이 Q이고/이거나, 위치 22에서의 아미노산이 S이고/이거나, 위치 26에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 이러한 C-말단 캡핑 모듈의 예는 SEQ ID NO: 21이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 C-말단 캡핑 모듈은 28개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 C-말단 캡핑 모듈은 28개의 아미노산의 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, C-말단 캡핑 모듈의 위치들의 상기 위치 번호는 서열 번호 18의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 18에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다.
예를 들어, 변경된 아미노산 잔기를 갖는 C-말단 캡핑 모듈은 다음 서열을 포함할 수 있다: xDxxGxTPADxAARxGHQxIAxVLQxAA (SEQ ID NO: 22), 여기서 "x"는 임의의 아미노산을 나타낸다.
예시적인 실시형태에서, C-말단 캡핑 서열은 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA(SEQ ID NO: 18)을 포함하고, 위치 14 및 18 이외의 위치에서 SEQ ID NO: 18의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 아미노산은 임의의 아미노산에 의해 선택적으로 교환된다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, C-말단 캡핑 서열은 QDTQGTTPADLAARAGHQQIASVLQQAA(SEQ ID NO: 21)를 포함하고, 위치 3, 4, 6, 14, 18, 19, 22 및 26 이외의 위치에서 SEQ ID NO: 21의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 아미노산은 임의의 아미노산에 의해 선택적으로 교환된다.
3.3. FAP-결합 도메인
하나의 매력적인 기질 세포 표적은 사실상 모든 상피암의 암 관련 기질 세포에서 고도로 발현되는 막횡단 세린 프로테아제인 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. FAP는 또한 배아 발달 동안, 상처 치유 조직, 간경변 및 특발성 폐 섬유증과 같은 만성 염증 및 섬유증 상태에서 발현된다. 그러나, FAP는 양성 종양이나 대부분의 정상 정지 성인 기질 세포에서 면역조직화학에 의해 검출되지 않았다.
본원에 기재된 재조합 단백질은 본원에서 "FAP 결합 도메인"으로도 지칭되는 FAP에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 8와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 8와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 28-38 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 28-38 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 28-38 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 단백질의 KD 값과 비교하여 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과로 KD 값을 변경하지 않는다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 8의 서열에 대해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 8의 서열에 대해 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 8의 서열에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 8의 서열에 대해 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 8의 서열에 대해 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 8의 서열에 대해 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 단백질의 KD 값과 비교하여 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과로 KD 값을 변경하지 않는다. 특정 실시형태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다. 특정 실시형태에서, 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 밖에서, 예를 들어 알파-나선을 연결하는 베타 루프에서 치환이 이루어진다. 특정 실시형태에서, 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 내에 치환이 이루어진다. 예를 들어, 안키린 도메인은 공통 서열: xDxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNA (SEQ ID NO: 23)(여기서, "x"는 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아님); 또는 xDxxGxTPLHLAxxxGHLEIVEVLLKzGADVNA (SEQ ID NO: 24)(여기서, "x"는 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아니고, "z"는 아스파라긴, 히스티딘 또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택됨)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기에서 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기 외부에서 이루어진다.
또한, 마지막에서 두 번째 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 2, 8, 9, 28-31 및 38 참조) 또는 "L"(예를 들어, SEQ ID NO: 32-37 참조)일 수 있고/있거나 마지막 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 2, 8, 9, 28-31 및 38 참조) 또는 "N"(예를 들어, SEQ ID NO: 32-37 참조)일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, FAP-결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9, 28-31 및 38 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, FAP-결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9, 28-31 및 38 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 일부 실시형태에서, FAP-결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적 실시형태에서, FAP-결합 도메인은 SEQ ID NO: 2과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 일부 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9, 28-31 및 38 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9, 28-31 및 38 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9, 28-31 및 38의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 일부 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 32-37 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 32-37 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환된다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 32-37 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 N는 A로 치환된다. 서열은 선택적으로 그 N-말단에 G, S 또는 GS를 포함할 수 있다(하기 참조).
또한, FAP 결합 도메인은 선택적으로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO: 2와 비교하여 SEQ ID NO: 38 참조). 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 FAP 결합 도메인은 (i)SEQ ID NO: 2, 8, 9, 및 28-37 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9, 및 28-37 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9, 및 28-37 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 8, 9, 및 28-37 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 또한 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 38과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 38의 위치 1의 G 및/또는 위치 2의 S는 선택적으로 누락된다.
따라서, 하나의 특정 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단은 선택적으로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다.
특정 실시형태에서, FAP 결합 도메인 또는 FAP 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질과 이의 표적(즉, FAP) 사이의 친화성은 KD로 기술된다. 예시적인 실시형태에서, KD는 약 10-1 M 이하, 약 10-2 M 이하, 약 10-3 M 이하, 약 10-4 M 이하, 약 10-5 M 이하, 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하, 약 10-12 M 이하, 약 10-13 M 이하, 약 10-14 M 이하, 약 10-5 M 내지 약 10-15 M, 약 10-6 M 내지 약 10-15 M, 약 10-7 M 내지 약 10-15 M, 약 10-8 M 내지 약 10-15 M, 약 10-9 M 내지 약 10-15 M, 약 10-10 M 내지 약 10-15 M, 약 10-5 M 내지 약 10-14 M, 약 10-6 M 내지 약 10-14 M, 약 10-7 M 내지 약 10-14 M, 약 10-8 M 내지 약 10-14 M, 약 10-9 M 내지 약 10-14 M, 약 10-10 M 내지 약 10-14 M, 약 10-5 M 내지 약 10-13 M, 약 10-6 M 내지 약 10-13 M, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-13 M이다.
예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 약 100 nM, 약 90 nM, 약 80 nM, 약 75 nM, 약 60 nM, 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값, 바람직하게는 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 140 pM, 130 pM, 또는 120 pM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 약 100 nM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 약 10 nM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 약 1 nM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 약 120 pM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 바람직하게는, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는다.
예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 약 100 nM, 약 90 nM, 약 80 nM, 약 75 nM, 약 60 nM, 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값, 바람직하게는 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 또는 300 pM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 100 nM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 약 10 nM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 1 nM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 500 pM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 300 pM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 바람직하게는, 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, FAP는 인간 FAP(SEQ ID NO: 52)이다.
[표 1]
Figure pct00002
3.4. CD40 결합 도메인
본원에 개시된 재조합 단백질은 또한 CD40에 의해 유도된 면역 세포 공동-자극 활성을 이용한다.
본원에 기재된 재조합 단백질은 본원에서 "CD40 결합 도메인"으로도 지칭되는 CD40에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함한다. CD40 작용제 항체와 마찬가지로 CD40 결합 도메인은 CD40/CD40L 신호 전달 경로를 활성화한다. 본원에 기재된 재조합 단백질은 또한 1개 초과의 CD40 결합 도메인, 예를 들어 2개 또는 3개 이상의 CD40 결합 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 제1 및 제2 CD40 결합 도메인, 또는 제1, 제2 및 제3 CD40 결합 도메인을 포함할 수 있다. 하기에 제공된 실시형태는 이러한 제1 CD40 결합 도메인, 제2 CD40 결합 도메인, 및/또는 제3 CD40 결합 도메인을 기술한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 재조합 단백질은 2개의 CD40 결합 도메인, 즉 제1 CD40 결합 도메인 및 제2 CD40 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 10과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 10과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 43-50 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 43-50 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 에시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 43-50 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 단백질의 KD 값과 비교하여 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과로 KD 값을 변경하지 않는다. 특정 실시형태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다. 특정 실시형태에서, 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 밖에서, 예를 들어 알파-나선을 연결하는 베타 루프에서 치환이 이루어진다. 특정 실시형태에서, 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 내에 치환이 이루어진다. 예를 들어, 안키린 도메인 또는 안키린 도메인 각각은 공통 서열: xDxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNA (SEQ ID NO: 23)(여기서, "x"는 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아님); 또는 xDxxGxTPLHLAxxxGHLEIVEVLLKzGADVNA (SEQ ID NO: 24)(여기서, "x"는 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아니고, "z"는 아스파라긴, 히스티딘 또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택됨)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기에서 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기 외부에서 이루어진다.
또한, 마지막에서 두 번째 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 3, 10, 43, 44, 및 48-50 참조) 또는 "L"(예를 들어, SEQ ID NO: 45-47 참조)일 수 있고/있거나 마지막 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 3, 10, 43, 44, 및 48-50 참조) 또는 "N"(예를 들어, SEQ ID NO: 45-47 참조)일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10, 43, 44, 및 48-50 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10, 43, 44, 및 48-50 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 일부 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 일부 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 10, 43, 44, 및 48-50 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 10, 43, 44, 및 48-50 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 10, 43, 44, 및 48-50 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 서열은 선택적으로 그 N-말단에 G, S 또는 GS를 포함할 수 있다(하기 참조).
또한, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 선택적으로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO: 3와 비교하여 SEQ ID NO: 50 참조). 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 (i) SEQ ID NO: 3, 10, 및 43-49 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10, 및 43-49 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10, 및 43-49 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 10, 및 43-49 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 또한 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 CD40-결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 50과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 50의 위치 1의 G 및/또는 위치 2의 S는 선택적으로 누락된다.
따라서, 하나의 특정 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단은 선택적으로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다.
일부 바람직한 실시형태에서, 본원에 기술된 CD40 결합 도메인 중 임의의 하나는 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 (1) 위치 8에 Q 및 (2) 위치 143에 R 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 (1) 위치 15에 L 및 (2) 위치 143에 R 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 (1) 위치 8에 Q 및 위치 15에 L 및 (2) 위치 143에 R 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 또한 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 (1) 위치 8에 Q 및/또는 위치 15에 L 및 (2) 위치 143에 R을 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 (1) 위치 8에 Q 및/또는 위치 15에 L 및 (2) 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. . 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 (1) 위치 8에 Q 및/또는 위치 15에 L 및 (2) 위치 143에 R 및 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 일부 더 바람직한 실시형태에서, 본원에 기술된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다.
또한, 보다 더 바람직한 실시형태에서, 본원에 기술된 CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응하고, 각각 Q, L, R 및 Q와 상이한 위치 8, 15, 143 및 147의 아미노산을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 갖는 CD40 결합 도메인과 비교하여 상기 CD40 결합 도메인의 개선된 약동학적 특성을 야기하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다.
특정 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각, 또는 CD40 결합 도메인(들)을 포함하는 재조합 단백질과 이의 표적(즉, CD40) 사이의 친화성은 KD로 기술된다. 예시적인 실시형태에서, KD는 약 10-1 M 이하, 약 10-2 M 이하, 약 10-3 M 이하, 약 10-4 M 이하, 약 10-5 M 이하, 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하, 약 10-12 M 이하, 약 10-13 M 이하, 약 10-14 M 이하, 약 10-5 M 내지 약 10-15 M, 약 10-6 M 내지 약 10-15 M, 약 10-7 M 내지 약 10-15 M, 약 10-8 M 내지 약 10-15 M, 약 10-9 M 내지 약 10-15 M, 약 10-10 M 내지 약 10-15 M, 약 10-5 M 내지 약 10-14 M, 약 10-6 M 내지 약 10-14 M, 약 10-7 M 내지 약 10-14 M, 약 10-8 M 내지 약 10-14 M, 약 10-9 M 내지 약 10-14 M, 약 10-10 M 내지 약 10-14 M, 약 10-5 M 내지 약 10-13 M, 약 10-6 M 내지 약 10-13 M, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-13 M이다.
예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 약 100 nM, 약 90 nM, 약 80 nM, 약 75 nM, 약 60 nM, 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값, 바람직하게는 100 nM, 90 nM, 80 nM, 또는 75 nM 이하의 KD 값으로 CD40에 결합한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 약 100 nM 이하의 KD 값으로 CD40에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 약 75 nM 이하의 KD 값으로 CD40에 결합한다. 바람직하게는, CD40 결합 도메인 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는다.
예시적 실시형태에서, 2개의 CD40 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 약 100 nM, 약 90 nM, 약 80 nM, 약 75 nM, 약 60 nM, 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값, 바람직하게는 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 140 pM, 130 pM, 120 pM, 115 pM, 110 pM, 105 pM 또는 100 pM 이하의 KD 값으로 CD40에 결합한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 100 nM 이하의 KD 값으로 CD40에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 1 nM 이하의 KD 값으로 CD40에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 500 pM 이하의 KD 값으로 CD40에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 100 pM 이하의 KD 값으로 CD40에 결합한다. 바람직하게는, 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CD40 클러스터링 및 면역 세포 공동-자극을 추가로 촉진하기 위해 2개 이상의 CD40 결합 도메인이 바람직하다. CD40 리간드는 삼량체로서 면역 세포 상의 CD40에 결합하는 것으로 보고되었다. 그러나, 삼량체화만으로는 CD40 신호전달 경로를 활성화하기에 충분하지 않다. CD40의 활성화를 위해서는 더 높은 수준의 CD40 클러스터링이 필요하다. 본원에 기재된 바와 같이, FAP-결합을 통해, 다중특이적 분자는 이미 종양 환경에서 CD40 클러스터링을 촉진한다. CD40 클러스터링을 추가로 촉진하기 위해, 2개 이상의 CD40 결합 도메인을 사용하여 세포 표면에 "가교" 효과를 생성할 수 있다. 예를 들어, 도 4에 도시된 바와 같이, 1가 CD40 바인더(FC)는 CD40 경로를 활성화하기에 충분했다. 더 높은 효능은 2개의 CD40 결합 도메인(FCC) 또는 3개의 CD40 결합 도메인(FCCC)을 사용하여 달성될 수 있었다. 도 4는 또한 2개의 CD40 결합 도메인이 높은 효능으로 CD40 경로를 활성화하기에 충분하고 효율적인 CD40 클러스터링을 위해 3개의 CD40 결합 도메인을 가질 필요가 없다는 것을 보여준다.
특정 실시형태에서, CD40는 인간 CD40(SEQ ID NO: 51)이다.
3.5. 반감기 연장 모이어티
"반감기 연장 모이어티"는 반감기 연장 모이어티가 없는 동일한 단백질과 비교하여 본원에 기재된 재조합 단백질의 생체내 혈청 반감기를 연장시킨다. 반감기 연장 모이어티의 예에는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 도메인, 말토스 결합 단백질(MBP), 인간 혈청 알부민(HSA) 결합 도메인, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 다중특이적 단백질은 본원에서 "혈청 알부민 결합 도메인"으로도 지칭되는 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 재조합 단백질은 또한 1개 초과의 혈청 알부민 결합 도메인, 예를 들어 2개 또는 3개 이상의 혈청 알부민 결합 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 제1 및 제2 혈청 알부민 결합 도메인, 또는 제1, 제2 및 제3 혈청 알부민 결합 도메인을 포함할 수 있다. 하기에 제공된 실시형태는 이러한 제1 혈청 알부민 결합 도메인, 제2 혈청 알부민 결합 도메인, 및/또는 제3 혈청 알부민 결합 도메인을 기술한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 재조합 단백질은 단 하나의 혈청 알부민 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 39-42 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 39-42 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 본원에 기재된 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 39-42 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 단백질의 KD 값과 비교하여 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과로 KD 값을 변경하지 않는다. 특정 실시형태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다. 특정 실시형태에서, 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 밖에서, 예를 들어 알파-나선을 연결하는 베타 루프에서 치환이 이루어진다. 특정 실시형태에서, 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 내에 치환이 이루어진다. 예를 들어, 안키린 도메인은 공통 서열: xDxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNA (SEQ ID NO: 23)(여기서, "x"는 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아님); 또는 xDxxGxTPLHLAxxxGHLEIVEVLLKzGADVNA (SEQ ID NO: 24)(여기서, "x"는 임의의 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아니고, "z"는 아스파라긴, 히스티딘 또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택됨)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기에서 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기 외부에서 이루어진다.
또한, 마지막에서 두 번째 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 1, 39, 40 및 42 참조) 또는 "L"(예를 들어, SEQ ID NO: 41 참조)일 수 있고/있거나 마지막 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 1, 39, 40 및 42 참조) 또는 "N"(예를 들어, SEQ ID NO: 1 참조)일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 39, 40 및 42 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 39, 40 및 42 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 39, 40 및 42 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 39, 40 및 42 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 39, 40 및 42의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/치환되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 서열은 선택적으로 그 N-말단에 G, S 또는 GS를 포함할 수 있다(하기 참조).
또한, 혈청 알부민 결합 도메인은 선택적으로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO: 42와 비교하여 SEQ ID NO: 1 참조). 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 혈청 알부민 결합 도메인은 (i) SEQ ID NO: 42와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 또한 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 혈청 알부민 도메인은 SEQ ID NO: 1, 및 39-41 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1, 및 39-41 중 어느 하나의 위치 1의 G 및/또는 위치 2의 S는 선택적으로 누락된다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 및 39-41 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1, 및 39-41 중 어느 하나의 위치 1의 G 및/또는 위치 2의 S는 선택적으로 누락된다.
따라서, 하나의 특정 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 위치 1의 G 및/또는 위치 2의 S는 선택적으로 누락되고, 선택적으로 마지막 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다.
특정 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인 또는 혈청 알부민 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질과 이의 표적(즉, 혈청 알부민) 사이의 친화성은 KD로 기술된다. 예시적인 실시형태에서, KD는 약 10-1 M 이하, 약 10-2 M 이하, 약 10-3 M 이하, 약 10-4 M 이하, 약 10-5 M 이하, 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하, 약 10-12 M 이하, 약 10-13 M 이하, 약 10-14 M 이하, 약 10-5 M 내지 약 10-15 M, 약 10-6 M 내지 약 10-15 M, 약 10-7 M 내지 약 10-15 M, 약 10-8 M 내지 약 10-15 M, 약 10-9 M 내지 약 10-15 M, 약 10-10 M 내지 약 10-15 M, 약 10-5 M 내지 약 10-14 M, 약 10-6 M 내지 약 10-14 M, 약 10-7 M 내지 약 10-14 M, 약 10-8 M 내지 약 10-14 M, 약 10-9 M 내지 약 10-14 M, 약 10-10 M 내지 약 10-14 M, 약 10-5 M 내지 약 10-13 M, 약 10-6 M 내지 약 10-13 M, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-13 M이다.
예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 약 100 nM, 약 90 nM, 약 80 nM, 약 75 nM, 약 60 nM, 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값으로, 바람직하게는 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 또는 35 nM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 약 100 nM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 약 50 nM 이하의 KD 값으로 혈청에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 약 35 pM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다. 바람직하게는, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는다.
예시적 실시형태에서, 혈청 알부민 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 약 100 nM, 약 90 nM, 약 80 nM, 약 75 nM, 약 60 nM, 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값으로, 바람직하게는 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 60 nM, 또는 50 nM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 100 nM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 75 nM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 50 nM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다. 바람직하게는, 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(SEQ ID NO: 53)이다.
일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 도메인은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 알려진 중쇄 이소타입 중 임의의 하나로부터 유래된다: IgG(γ), IgM(μ), IgD(δ), IgE(ε), 또는 IgA(α). 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 알려진 중쇄 이소타입 또는 서브타입 중 임의의 하나로부터 유래된다: IgG1(γ1), IgG2(γ2), IgG3(γ3), IgG4(γ4), IgA1(α1), IgA2(α2). 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 Fc 도메인이다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 중단되지 않은 천연 서열(즉, 야생형 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 도메인은 변경된 생물학적 활성을 야기하는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 점 돌연변이 또는 결실이 Fc 도메인에 도입되어, 이펙터 활성을 감소 또는 제거(예를 들어, 국제공개 WO 2005/063815호)하고/하거나 재조합 단백질의 생산 동안 균질성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 Fc 도메인이고 하기 무(無)-이펙터 치환 중 하나 이상을 포함한다: L234A, L235A, 및 G237A (Eu 넘버링). 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 C-말단 위치(즉, Eu 넘버링에 의한 K447)에 위치한 라이신을 포함하지 않는다. 라이신의 부재는 재조합 단백질의 생산 동안 균질성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 C-말단 위치(K447, Eu 넘버링)에 위치한 라이신을 포함한다.
3.6. 링커
본원에 기재된 재조합 단백질은 링커를 포함할 수 있다. "링커"는 2개의 개별 엔티티(예를 들어, FAP-결합 도메인 및 CD40 결합 도메인)를 서로 결합시키고 두 엔티티 사이에 간격과 유연성을 제공하여 이들이 예를 들어 각각의 표적(예를 들어, FAP 및 CD40)에 특이적으로 결합하는 형태를 달성할 수 있게 하는 분자 또는 분자 그룹이다. 단백질 링커가 특히 바람직하고, 이들은 당업계에 잘 알려진 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 재조합 단백질의 성분으로서 발현될 수 있다.
안키린 반복 도메인은 예를 들어 이황화 결합, 폴리펩티드 결합 또는 가교제에 의해 공유적으로 연결될 수 있거나; 또는 비공유적으로, 이종이량체 단백질을 생성한다. 재조합 단백질은 FAP를 포함하는 임의의 결합 도메인과 CD40 결합 도메인 사이 및 임의의 결합 도메인과 선택적인 반감기 연장 모이어티(그 자체가 또한 결합 도메인일 수 있음) 사이에 링커를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 링커는 펩티딜 링커이다. 일부 실시형태에서, 펩티딜 링커는 약 1 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함한다. 예시적인 링커는 예를 들어 글리신 풍부 펩티드; 글리신과 세린을 포함하는 펩티드; 서열 [Gly-Gly-Ser]n(n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6임)을 갖는 펩티드; 또는 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO: 56)(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)을 갖는 펩티드를 포함한다. 글리신 풍부 펩티드 링커는 펩티드 링커를 포함하며, 적어도 25%의 잔기가 글리신이다. 글리신 풍부 펩티드 링커는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Chichili et al. Protein Sci. 2013 February; 22(2): 153-167]).
일부 실시형태에서, 펩티딜 링커는 프롤린-트레오닌이 풍부한 펩티드 링커이다. 예시적인 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4의 프롤린-트레오닌이 풍부한 펩티드 링커이다.
일부 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
3.7. fap/cd40 이중 표적 이중특이적 또는 다중특이적 분자
본 발명의 다중특이적 분자는 본원에 기재된 결합 도메인 및 선택적으로 링커의 임의의 종류의 조합을 포함한다. 즉, 상기 섹션 3.3 내지 3.6에 기재된 도메인 및 링커 중 임의의 하나가 본 발명의 다중특이적 분자에서 조합될 수 있다. 또한, 본 발명의 다중특이적 분자의 결합 도메인은 상기 섹션 3.2에 기재된 임의의 N-말단 캡핑 모듈 및/또는 C-말단 캡핑 모듈을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 하기를 포함한다: (i) 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, (ii) FAP에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, (iii) CD40에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 및 (iv) CD40에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인. 상기 제1 안키린 반복 도메인은 상기 섹션 3.5에 기재된 바와 같은 혈청 알부민 결합 도메인 중 임의의 하나일 수 있고, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 상기 섹션 3.3에 기재된 바와 같은 FAP 결합 도메인 중 어느 하나일 수 있고, 상기 제3 및 제4 안키린 반복 도메인은 상기 섹션 3.4에 기재된 바와 같은 CD40 결합 도메인 중 어느 하나일 수 있다. 제3 및 제4 안키린 반복 도메인은 동일한 서열을 가질 수 있거나 상이한 서열을 가질 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인)을 포함하고, 링커는 바람직하게는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 더 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, SEQ ID NO: 5의 4개의 결합 도메인 중 임의의 하나에 대해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 5의 4개의 결합 도메인 중 임의의 하나에 대해 10개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 5의 4개의 결합 도메인 중 임의의 하나에 대해 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 5의 4개의 결합 도메인 중 임의의 하나에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 5의 4개의 결합 도메인 중 임의의 하나에 대해 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 5의 4개의 결합 도메인 중 임의의 하나에 대해 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 5의 1개의 결합 도메인 중 임의의 하나에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함하는 단백질의 KD 값과 비교하여 FAP-결합 또는 CD40 결합 또는 혈청 알부민 결합에 대한 KD 값을 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과 변화시키지 않는다. 특정 실시형태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 3 x 10-10 M 미만, 또는 2 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만 또는 3 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 7 x 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 혈청 알부민에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 혈청 알부민에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 3 x 10-10 M 미만, 또는 2 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합하고/결합하거나 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 또는 3 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합하고, 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 3 x 10-10 M 미만, 또는 2 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합하고/결합하거나 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 또는 3 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합하고/결합하거나 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 7 x 10-8 M 미만 또는 5 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 혈청 알부민과 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합하고 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합한다. 하나의 더 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합하고 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합하고 재조합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 혈청 알부민에 결합한다.
특정 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 FAP, CD40 및 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있고, 바람직하게는 상기 동시 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 FAP 및 CD40에 결합 시 B 세포의 활성화를 유도한다. 특정 실시형태에서, B 세포는 인간 B 세포이다. 특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질의 생물학적 활성은 CD86 및 CD69와 같은 공동-자극 분자의 발현을 측정하는 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의해 평가된다. B 세포에서 이러한 공동-자극 분자(CD86 및 CD69)의 증가된 발현이 CD40 활성화를 나타내는 것으로 보고되었다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 CD40-발현 B 세포에서 인간 CD40을 활성화시킨다.
특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의한 평가 시 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 65 nM 이하, 약 55 nM 이하, 약 45 nM 이하, 약 35 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 4 nM 이하, 약 3 nM 이하, 약 2 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하, 약 0.01 nM 내지 약 50 nM, 약 0.01 nM 내지 약 25 nM, 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 약 0.01 nM 내지 약 5 nM, 약 0.01 nM 내지 약 1 nM, 약 0.01 nM 내지 약 0.1 nM, 약 0.01 nM 내지 약 0.07 nM, 약 0.04 nM 내지 약 50 nM, 약 0.04 nM 내지 약 25 nM, 약 0.04 nM 내지 약 10 nM, 약 0.04 nM 내지 약 5 nM, 약 0.04 nM 내지 약 1 nM, 약 0.04 nM 내지 약 0.1 nM, 약 0.04 nM 내지 약 0.07 nM, 약 0.1 nM 내지 약 50 nM, 약 0.1 nM 내지 약 25 nM, 약 0.1 nM 내지 약 10 nM, 약 0.1 nM 내지 약 5 nM, 약 0.1 nM 내지 약 1 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.9 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.85 nM, 약 0.18 nM 내지 약 0.85 nM의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 갖는다.
예시적 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 10 nM 이하의 EC50을 갖는다. 또 다른 예시적 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 1 nM 이하의 EC50을 갖는다. 또 다른 예시적 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 바람직하게는 약 0.1 nM 내지 약 1.0 nM 또는 약 0.18 nM 내지 약 0.85 nM의 EC50을 갖는다. 또 다른 예시적 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 시험관 내 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 0.01 nM 내지 약 0.1 nM, 바람직하게는 약 0.04 nM 내지 약 0.07 nM의 EC50을 갖는다.
특정 실시형태에서, B 세포 활성화 검정은 인간 B 세포 활성화 검정이다. 예시적인 실시형태에서, 제조사의 지침에 따라 GraphPad Prism(버전 8.1.2)을 사용하여 EC50을 측정한다. 예시적인 실시형태에서, EC50 값은 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 피팅 모델로 데이터를 피팅함으로써 결정된다. 예시적인 실시형태에서, EC50 값은 실시예에 기술된 방법을 사용하여 결정된다.
특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 마우스 모델에서 적어도 10시간, 적어도 20시간, 적어도 30시간, 적어도 40시간, 또는 약 44시간의 소실 반감기를 갖는다. 특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 사이노몰구스 원숭이 모델에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 소실 반감기를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 FAP-발현 MC38 결장 암종 마우스 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 실시예 6에 기재된 바와 같은 치료 조건으로 FAP-발현 MC38 결장 암종 마우스 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있다.
특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 FAP 프로테아제 활성을 억제하지 않는다. 특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질의 존재 하에, FAP 프로테아제 활성은 대조군과 비교하여 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 또는 2% 이하만큼 감소된다(대조군은 다중특이적 재조합 단백질의 부재 하에 FAP 프로테아제 활성일 수 있음). 예시적인 실시형태에서, FAP 활성은 실시예 7에 예시된 바와 같은 방법을 사용하여 측정된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 2개의 CD40 결합 도메인을 포함하고, 상기 CD40 결합 도메인 중 하나 또는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 2개의 CD40 결합 도메인을 포함하고, 상기 2개의 CD40 결합 도메인 각각은 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, SEQ ID NO: 5와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 추가로 하기 특성 중 하나 또는 임의의 조합을 갖는다: (i) 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 3 x 10-10 M 미만 또는 2 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합한다; (ii) 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만 또는 3 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합한다; (iii) 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 7 x 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 혈청 알부민에 결합한다; (iv) 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 CD40-발현 B 세포에서 인간 CD40을 활성화시킨다; (v) 재조합 결합 단백질은 FAP, CD40 및 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있다; (vi) 재조합 단백질은 FAP 프로테아제 활성을 억제하지 않거나, 재조합 단백질의 존재 하에 FAP 프로테아제 활성의 감소가 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 또는 10%이다; (vii) 재조합 단백질은 마우스 모델에서 적어도 10시간, 적어도 20시간, 적어도 30시간, 적어도 40시간, 또는 약 44시간의 소실 반감기를 갖는다; (viii) 재조합 단백질은 사이노몰구스 원숭이 모델에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 소실 반감기를 갖는다; (ix) 재조합 단백질은 FAP-발현 MC38 결장 암종 마우스 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있고; (x) 2개의 CD40 결합 도메인 중 하나 또는 상기 2개의 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응하고, 또는 보다 바람직하게는 상기 2개의 CD40 결합 도메인 각각은 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합하고/결합하거나 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합하고, 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합하고, 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 혈청 알부민에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 약 10-8 M 이하 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 CD40-발현 B 세포에서 인간 CD40을 활성화시킨다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 인간 CD40, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있고; 바람직하게는 상기 동시 결합은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 단백질은 FAP 프로테아제 활성을 억제하지 않거나, 재조합 단백질의 존재 하에 FAP 프로테아제 활성의 감소가 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하 또는 10% 이하이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 마우스 모델에서 적어도 10시간, 적어도 20시간, 적어도 30시간, 적어도 40시간 또는 약 44시간의 소실 반감기를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 사이노몰구스 원숭이 모델에서 소실 반감기를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 단백질은 FAP-발현 MC38 결장 암종 마우스 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있고; 바람직하게는 상기 종양 억제는 실시예 6에 기술된 바와 같이 측정된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 2개의 CD40 결합 도메인 중 하나 또는 상기 2개의 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 특정 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 2개의 CD40 결합 도메인 각각은 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 단백질은 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 CD40 및 인간 혈청 알부민에 결합하고, 상기 재조합 단백질은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 사이노몰구스 원숭이 모델에서 소실 반감기를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 단백질은 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 CD40 및 인간 혈청 알부민에 결합하고, 상기 재조합 단백질의 존재 하에, FAP 프로테아제 활성은 대조군과 비교하여 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 또는 2% 이하 만큼 감소되며, 여기서 전형적으로 그리고 바람직하게는 상기 대조군은 상기 재조합 단백질의 부재 하에 FAP 프로테아제 활성이고, 추가로 전형적으로 그리고 바람직하게는 상기 FAP 프로테아제 활성은 실시예 7에 기재된 바와 같이 측정된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 단백질은 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 CD40 및 인간 혈청 알부민에 결합하고, 상기 재조합 단백질은 사이노몰구스 원숭이 모델에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 소실 반감기를 갖고, 상기 재조합 단백질의 존재 하에, FAP 프로테아제 활성은 대조군과 비교하여 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 또는 2% 이하만큼 감소되며, 여기서 전형적으로 그리고 바람직하게는 상기 대조군은 상기 재조합 단백질의 부재 하에 FAP 프로테아제 활성이고, 추가로 전형적으로 그리고 바람직하게는 상기 FAP 프로테아제 활성은 실시예 7에 기재된 바와 같이 측정된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 상기 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 결합하고; 상기 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 결합하고; 상기 단백질은 약 10-8 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 CD40-발현 B 세포에서 인간 CD40을 활성화하고; 상기 단백질은 FAP 및 CD40에 동시에 결합할 수 있고; 상기 단백질은 FAP 프로테아제 활성을 억제하지 않거나, 재조합 단백질의 존재 하에 FAP 프로테아제 활성의 감소가 25% 이하이고; 상기 단백질은 마우스 모델에서 적어도 10시간의 소실 반감기를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, CD40에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인 및 CD40에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인을 포함하고, 상기 안키린 반복 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 하기 식: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인)에 따라 배열되고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 CD40에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS에서 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 섹션 3.3에 기재된 FAP 결합 도메인 중 임의의 하나이고, 상기 2개의 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 섹션 3.4에 기재된 CD40 결합 도메인 중 임의의 하나이고, 상기 혈청 알부민 결합 도메인은 섹션 3.5에 기재된 혈청 알부민 결합 도메인 중 임의의 하나이고, 링커는 섹션 3.6에 기재된 링커 중 임의의 하나이다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질은 인간 CD40, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있고; 바람직하게는 상기 동시 결합은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다. 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 CD40-발현 B 세포에서 인간 CD40을 활성화한다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질은 FAP 프로테아제 활성을 억제하지 않거나, 재조합 단백질의 존재 하에 FAP 프로테아제 활성의 감소가 25% 이하이다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질은 마우스 모델에서 적어도 20시간의 소실 반감기를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질 상기 단백질은 사이노몰구스 원숭이 모델에서 적어도 3일의 소실 반감기를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질은 FAP-발현 MC38 결장 암종 마우스 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있고; 상기 종양 성장 억제는 바람직하게는 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정된다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질의 상기 2개의 CD40 결합 도메인 중 하나 또는 상기 2개의 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및/또는 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질의 상기 2개의 CD40 결합 도메인 각각은 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및 위치 147에 Q를 포함하고, 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응한다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질은 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 다중특이적 재조합 단백질은 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
3.8. 핵산 및 다중특이적 단백질 생산 방법
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 상기 방법에 의해 수득된 재조합 단백질을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 절차에 의해 생성 및 발현될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 재조합 다중특이적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 단백질은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 및 CD40에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 및 선택적으로 반감기 연장 모이어티를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 및/또는 4를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 5 또는 6을 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 58의 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 변이체를 제공하며, 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 58의 핵산 서열을 포함하는 핵산과 같은 본원에 개시된 임의의 핵산에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이의 변이체를 제공하며, 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는 매우 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO: 58의 서열에 혼성화할 수 있다. "매우 엄격한 조건"에는 다음이 포함된다: (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 고온, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 황산도데실나트륨을 사용한다; (2) 혼성화 동안 포름아미드, 예를 들어, pH 6.5에서 0.1% 소혈청 알부민/0.1% Ficoll/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액과 42℃에서 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 포함하는 50%(v/v) 포름아미드와 같은 변성제를 사용한다; 또는 (3) 50% 포름아미드, 5×SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5×덴하르트 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50 pg/mL), 42℃에서 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2×SSC(염화나트륨/구연산나트륨) 및 50% 포름아미드 중 55℃에서 세척한 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1×SSC로 구성된 고강도 세척.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 본 개시내용에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA(재조합, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 포함하고 DNA 분자에 일대일로 대응하는 hnRNA 분자와 인트론을 포함하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있지만 그럴 필요는 없다.
유전자 코드의 축중(degeneracy)의 결과로서, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질(또는 그의 개별 도메인)을 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열과 최소한의 상동성을 갖는다. 코돈 사용의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 개시내용에 의해 구체적으로 고려된다.
본 개시내용은 또한 핵산 서열이 특정 세포에서 발현을 최대화하도록 최적화된 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일반적으로, 코돈 최적화는 원래의 아미노산 서열을 유지하면서 원래 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 해당 숙주의 유전자에서 더 빈번하거나 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 의미한다. 다양한 종이 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 보인다. 코돈 편향(유기체 간 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율성과 상관관계가 있으며, 이는 무엇보다도 번역되는 코돈의 특성과 특정 전사 RNA(tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 간주된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 자주 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 소정의 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 표는 쉽게 사용할 수 있으며 이러한 표는 다양한 방식으로 맞춤화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]). Gene Forge(Aptagen; Jacobus, Pa.)와 같은 특정 숙주 세포에서 발현을 위한 특정 서열을 최적화하는 코돈을 위한 컴퓨터 알고리즘도 사용 가능하다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 서열 내의 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개, 또는 그 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구성될 수 있거나 당업계에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가 복제 능력이 있고, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고, 그리고/또는 벡터를 포함하는 클론을 선택하는 데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, Bluescript(예를 들어, pBS SK+) 및 그 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 BioRad, Strategene 및 Invitrogen과 같은 상용 공급업체에서 입수 가능하다.
발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구조물이다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 필수 부분으로서 숙주 세포에서 복제가능하다는 것이 함축되어 있다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 국제공개 WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터(들)을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 벡터 구성요소는 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열; 복제 원점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소(예컨대 프로모터, 인핸서 및 터미네이터). 발현(즉, 번역)을 위해서는 일반적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈과 같은 하나 이상의 번역 제어 요소가 또한 필요하다.
관심 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 자체를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세 발사체 포격; 리포펙션; 및 감염(예를 들어, 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 다를 것이다.
예시적인 숙주 세포는 대장균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포를 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 당업계에 잘 알려진 많은 세포 중에서 대장균 세포, CHO 세포, 인간 배아 신장(HEK) 293 세포, 또는 Sp2.0 세포를 포함한다.
4. 치료 방법
본원에 기재된 재조합 단백질은 예를 들어 암과 같은 의학적 병태를 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기재된 재조합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 의학적 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 바람직한 실시형태에서, 의학적 병태는 암이다. 특정 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 특정 실시형태에서, 암세포는 FAP를 발현한다. 특정 실시형태에서, 종양 기질 세포는 FAP를 발현한다.
일부 실시형태에서, 암은 뇌암, 방광암, 유방암, 투명세포신암, 자궁경부암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 위암, 두경부암, 두경부 편평세포암, 입술암, 구강암, 간암, 자궁경부암, 폐 편평세포암, 흑색종, 중피종, 비소세포폐암(NSCLC), 비흑색종 피부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 요로상피암, 육종, 소세포폐암(SCLC), 편평세포암 두경부(SCCHN), 삼중 음성 유방암 또는 갑상선암이다.
일부 실시형태에서, 암은 부신피질 종양, 폐포 연부 육종, 암종, 연골육종, 결장직장 암종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 소원형세포 종양, 내분비 종양, 내배엽 부비동 종양, 상피양 혈관내피종, 유잉 육종, 생식 세포 종양, 간모세포종, 간세포 암종, 흑색종, 신종, 신경모세포종, 비횡문근육종 연조직 육종(NRSTS), 골육종, 척수 주위 육종, 신세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 활액 육종 또는 윌름스 종양이다.
일부 실시형태에서, 암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 만성 골수성 백혈병(CML)이다.
일부 실시형태에서, 암은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 호지킨 림프종(HL), 외투 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 소림프구성 림프종(SLL)이다.
실제로, 치료될 수 있는 암에는 폐포 횡문근육종, 뼈암, 항문암, 항문관 또는 항문직장암, 눈암, 간내담관암, 관절암, 암이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 목, 담낭 또는 흉막, 코, 비강 또는 중이의 암, 구강암, 외음부암, 식도암, 위장관 유암종, 하인두암, 후두암, 비인두암, 복막, 대망 및 장간막암, 인두암, 소장암, 연조직암, 위암, 고환암, 요관암 및 방광암이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 양태에서, 암은 두경부암, 난소암, 자궁경부암, 방광암 및 식도암, 췌장암, 위장관암, 위암, 유방암, 자궁내막암 및 결장직장암, 간세포암종, 교모세포종, 방광암, 폐암 및 세기관지 폐포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), 두경부암, 신장암, 삼중 음성 유방암, 또는 위암이다. 특정 실시형태에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 두경부암, 신장암, 유방암, 흑색종, 난소암, 간암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 위암, 림프종 또는 백혈병이다. 특정 실시형태에서, 암은 뇌암이다.
본원에 기재된 재조합 단백질은 종양을 제거하기 위한 수술 전 또는 후에 사용될 수 있고 방사선 요법 전, 동안 또는 후에 사용될 수 있다. 재조합 단백질은 촉진 또는 MRI, 초음파 또는 CAT 스캔과 같은 당업계에 잘 알려진 영상 기술에 의해 발견될 만큼 충분히 큰 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 적어도 약 200 ㎣, 300 ㎣, 400 ㎣, 500 ㎣, 750 ㎣, 또는 최대 1000 ㎣의 치수를 갖는 진행성 단계 종양을 치료하는 데 사용된다.
5. 약제학적 조성물 및 투여
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 표준 약제학적 담체에는 인산염 완충 식염수 용액, 물, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼과 같은 에멀젼 및 다양한 유형의 습윤제가 포함된다.
약제학적 조성물은 예를 들어 산성화제, 첨가제, 흡착제, 에어로졸 추진제, 공기 치환제, 알칼리화제, 케이킹 방지제, 항응고제, 항미생물 보존제, 항산화제, 방부제, 염기, 결합제, 완충제, 킬레이트제, 코팅제, 착색제, 건조제, 세제, 희석제, 소독제, 붕해제, 분산제, 용해 증진제, 염료, 연화제, 유화제, 에멀젼 안정화제, 충전제, 필름 형성제, 향미 증진제, 향미제, 유동 향상제, 겔화제, 과립화제, 습윤제, 윤활제, 점막접착제, 연고 베이스, 연고, 유성 비히클, 유기 베이스, 알약 베이스, 안료, 가소제, 광택제, 방부제, 격리제, 피부 침투제, 가용화제, 용제, 안정화제, 좌약 기제, 표면 활성제, 계면활성제, 현탁제, 감미제, 치료제, 증점제, 등장화제, 독성제, 점도 증가제, 수분 흡수제, 수혼화성 공용매, 연수제 또는 습윤제를 비롯한 임의의 약제학적으로 허용되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000)] 참조. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)] 참조.
약제학적 조성물은 생리학적으로 적합한 pH를 달성하도록 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 예를 들어 약 4 또는 약 5 내지 약 8.0, 또는 약 4.5 내지 약 7.5, 또는 약 5.0 내지 약 7.5일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 5.5 내지 7.5이다.
본원에 기재된 재조합 다중특이적 단백질은 비경구, 비강, 경구, 폐, 국소, 질 또는 직장 투여와 같은 임의의 적합한 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형에는 항산화제, 완충제, 정균제 및 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다. 자세한 내용은 문헌[Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., 페이지 238-250 (1982)], 및 문헌[ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., 페이지 622-630 (1986)] 참조.
치료 요법의 과정에 걸쳐 투여되는 본 개시내용의 활성제의 용량은 투여 시점으로부터 임상적으로 허용되는 시간 프레임(예를 들어, 1 내지 4주 이상(예를 들어, 5 내지 20주 이상))에서 암을 치료하기에 충분해야 한다. 특정 실시형태에서, 기간은 훨씬 더 길 수 있다. 투여량은 특정 활성제의 효능 및 동물(예를 들어, 인간)의 상태뿐만 아니라 때때로 치료할 동물(예를 들어, 인간)의 체중에 의해 결정될 것이다. 특정 용량의 투여 시 암이 치료되는 정도는 예를 들어 활성제의 세포독성 또는 활성제로 달성된 종양 퇴행의 정도로 나타낼 수 있다. 재조합 다중특이적 단백질의 세포독성을 측정하는 방법 및 종양 퇴행을 분석하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예로서 그리고 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아니라, 본 개시내용의 활성제의 용량은 약 0.0001 내지 약 1 g/치료되는 대상체의 체중 ㎏/일, 약 0.0001 내지 약 0.001 g/체중 ㎏/일, 또는 약 0.01 mg 내지 약 1 g/체중 ㎏/일일 수 있다. 투여량 단위는 체표면적 평방 미터 당 밀리그램 단위의 양을 나타내는 rag/m2로 표시할 수도 있다.
본원에 기재된 재조합 다중특이적 단백질은 다른 항암제와 같은 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 각각의 치료제는 동시에(예를 들어, 동일한 약제로 또는 동시에), 동시에(즉, 임의의 순서로 차례로 투여되는 별도의 약제로) 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 순차 투여는 병용 요법의 치료제가 상이한 투여 형태(예를 들어, 한 제제는 정제 또는 캡슐이고 다른 제제는 멸균 액체임)로 존재하고/하거나 상이한 투여 일정, 예를 들어 적어도 매일 투여되는 화학요법제 및 덜 빈번하게 투여되는 생물요법제, 예를 들어 매주 1회, 2주마다 1회, 또는 3주에 1회 투여되는 경우에 유용할 수 있다.
실시예
실시예 1 - 다중특이적 결합 단백질의 설계
다양한 형식의 다중특이적 결합 단백질을 생성하고 이들의 FAP-특이성, 효능 및 CD40 활성화 효능을 결정하였다. 이들 다중특이적 단백질은 모두 FAP-특이적 결합 도메인 및 CD40-특이적 결합 도메인을 포함하였다. (i) 인간 혈청 알부민(HSA) 결합 도메인(들) 추가, (ii) 추가의 CD40 결합 도메인(들) 추가에 의한 원자가 증가, 및 (iii) 단백질 내 결합 도메인 순서 변경의 영향을 평가하였다.
다양한 형식을 비교하기 위해, CD40 촉발 시 인간 B 세포에서 발현되는 공동-자극 수용체 CD86의 상향조절을 측정하는 시험관 내 검정을 설정하였다. 이 세포 검정은 FAP-발현 세포의 존재 또는 부재 하에 1차 인간 B 세포를 사용하였다. CD86 공동-자극 분자의 상향조절을 B 세포 활성화의 마커로 평가하였다. 작용 메커니즘이 FAP 매개 가교에 독립적인 항-CD40 단일클론 항체를 참조 물질로 사용하였다.
상이한 형식의 다중특이적 단백질. 하나의 FAP-특이적 결합 도메인 및 하나의 CD40-특이적 결합 도메인을 포함하는 모 분자(SEQ ID NO: 59; SMA014)로 시작하여 표 2에 요약된 바와 같이 여러 다중특이적 단백질 형식이 생성되었다.
[표 2]
Figure pct00003
표 2의 "C", "F" 및 "H"는 각각 CD40, FAP 및 HSA에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 나타낸다. 표 2에 표시된 다른 도메인의 순서는 단백질의 분자 구조에서 N-말단에서 C-말단으로 도메인의 실제 순서를 반영한다. 모든 단백질은 추가로 용이한 정제를 위해 N-말단에 His-태그(SEQ ID NO: 57)를 가졌다.
물질 및 방법
참고로, CD40 단일클론 항체를 사용하였다. 이 CD40 mAb(IgG2 mAb)를 CD40에 결합하면 FAP와 독립적으로 항원 제시 세포가 활성화된다. 항-CD40 mAb는 미국 특허 제7,338,660 B2호의 서열 21.4.1에 상응한다.
CHO 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2에서 배양하고 세포를 분리하기 위해 아큐타아제를 사용하여 2 내지 3일마다 분할하였다.
FAP-발현 CHO 세포주는 세포 표면에서 인간 FAP를 발현하는 안정적으로 형질감염된 클론 세포주이다. 인간 FAP의 ORF의 GFP-융합물을 함유하는 플라스미드는 OriGene Technologies(#RG204692)로부터 입수하였다. 인간 FAP(GFP 없음)를 코딩하는 cDNA는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 서브클로닝되었다. 그런 다음 이 플라스미드를 CHO 세포로 형질감염시켜 리포펙타민을 사용하여 인간 FAP를 과발현하는 안정한 형질감염체를 생성했다. 다양한 농도의 Geneticin G-418(Promega, V8091)을 사용하여 선택 압력을 가했다. FAP의 발현은 ESC11(국제공개 WO2011/040972호)에 상응하는 항-FAP 항체를 사용하여 유동 세포측정법으로 분석하였다. 조건 1.9 mg/mL G-418(FAP-CHO-1.9)의 FAP-CHO 형질전환체 집단은 FAP의 발현 수준이 더 낮았고 조건 1.7 mg/mL(FAP-CHO-1.7)의 집단은 FAP의 발현 수준이 더 높았다. 이 실시예의 데이터는 FAP-CHO-1.7을 사용하여 생성되었다.
시험관 내 B 세포 활성화 검정. 시험관 내 B 세포 활성화 검정의 디자인은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 버피 코트는 취리히 헌혈 센터에서 수득하였고 PBS로 희석했다. 그런 다음 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 류코셉 튜브를 사용하여 밀도 원심분리에 의해 단리했다. 여러 세척 단계 후, 제조사의 권장 사항에 따라 양성 선택(인간 CD19 MicroBeads Kit)을 사용하여 PBMC에서 인간 CD19+ B 세포를 풍부하게 했다. 1x105/웰의 CD19+ B 세포 및 5x104 세포/웰의 FAP-발현 CHO 세포 또는 CHO 야생형(WT-CHO) 세포는 표시된 분자의 용량 적정(400, 200, 40, 8, 5, 1.6, 0.3, 0 nM)과 함께 96-웰 플레이트에 600 μM HSA가 있거나 없는 RPMI 1640 배지 + 10% FBS에 함께 시딩되었다. 배양물을 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하고 CD20+ B 세포에 대한 CD86 및 CD69의 상향조절을 AttuneNxT를 사용하여 유동 세포측정법으로 평가했다.
FACS 염색, 유세포 분석기 설정 및 항체 희석. 세포를 먼저 150 μl PBS로 세척한 다음 실온(RT)에서 20분 동안 PBS에 희석(1:100)한 BD 인간 Fc-블록 100 μl와 함께 인큐베이션했다. Fc-차단 인큐베이션 후, 세포를 FACS 완충액에 희석된(희석 인자에 대해서는 하기 표 3 참조) 100 μl의 직접 표지된 항체와 함께 인큐베이션하고 암실에서 4℃에서 20분 더 인큐베이션했다. 세포를 PBS로 세척하고, PBS에 희석된(1:1000) 100 μl Live/Dead 염색에 재현탁하고 암실에서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션했다. FBS 반응을 포함하는 FACS 완충액 100 μl를 첨가하여 Live/Dead 염색 반응을 중지시켰다. 세포를 PBS로 다시 세척하고 제조사의 권장 사항에 따라 물에 희석(1:10)한 BD Cell Fix 용액을 사용하여 고정했다. 항체 희석 및 FACS 설정은 아래 표 3에 요약되어 있다. 제조사의 권장 사항(ThermoFisher; AbC™ Total Antibody Compensation Bead Kit)에 따라 보정 비드를 사용하여 FACS 기계의 보정을 수행했다. Raw_fcs 파일은 FlowJo 소프트웨어(버전 10.0.3)를 사용하여 분석되었다. 세포는, CD86에 대해 도 2에 보여지는 바와 같이, Live-Dead 식별 염료를 사용하여 생세포에 대해 게이팅되고, 이어서 CD20 양성 세포에 대해 게이팅되었다. MFI 및 CD86에 대한 양성 세포의 백분율을 내보내고 GraphPad 프리즘 소프트웨어 버전 8.1.2를 사용하여 플로팅했다.
[표 3]
Figure pct00004
EC50 결정. EC50 값은 GraphPad Prism 버전 7.02를 사용하여 로그 모드에서 x 값(농도)을 변환하고 EC50 값 결정을 위한 가변 기울기(3개 매개변수) 방정식을 사용한 응답 대 비선형 모드 로그(작용제)에 피팅하여 결정하였다.
효능 결정. 최고 농도(400 nM)에서 MFI 값에 대한 중복 평균을 계산하여 GraphPad Prism 버전 7.02를 사용하여 효능 값을 결정하였다.
결과
HSA 결합 도메인(들)은 이중특이적 FAPxCD40 안키린 반복 결합 단백질(F-C 형식)의 효과 및 효능을 손상시킨다. F-C 형식의 이중특이적 FAPxCD40 DARPin® 분자, SMA014는 1개(H-F-C, SMA087) 또는 2개(H-F-C-H, SMA095) HSA 결합 안키린 반복 도메인을 추가하는 다양한 형식으로 클로닝되었고 시험관 내 B 세포 활성화 검정에서 시험되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, HSA 결합 도메인(들)은 F-C 형식에서 본래의 이중특이적 결합 단백질의 효과 및 효능 모두를 손상시켰고 손상 수준은 결합 단백질에 추가된 HSA 결합 도메인의 수와 상관관계가 있었다. 중요한 것은 억제가 인간 혈청 내 알부민의 생리학적 농도를 모방하는 600 μM의 알부민이 있을 때 더욱 두드러졌다는 것이다. 복합 HSA 결합제/알부민이 CD40 및/또는 FAP 도메인(들)의 결합 및 결과적으로 활성에 대한 입체적 손상일 수 있다는 가설을 세울 수 있다. 예상대로 DARPin® 단백질과 항-CD40 mAb는 CD86을 용량 의존적으로 상향 조절했으며 DARPin® 단백질은 FAP 발현 CHO 세포가 있는 경우에만 활성이었다(도 3). HSA의 부재 및 존재 시, HSA 결합 도메인은 FAP 특정 작용 방식에 영향을 미치지 않았다. 예상대로 작용제 항-CD40 mAb는 FAP 발현과 독립적으로 인간 B 세포의 활성화를 유도하여 FAP-CHO 또는 WT-CHO 세포의 존재 하에 B 세포를 활성화했다. 2개의 독립적인 실험의 EC50(효과) 및 최대 MFI(효능) 평균값은 각각 FAP-CHO의 경우 표 4 및 표 5에 그리고 WT-CHO의 경우 표 6에 요약되어 있다.
요약하면, 반감기 연장 HSA-결합 도메인(들)의 추가는 이중특이적 FAPxCD40 결합 단백질(F-C 형식)의 기능을 손상시켰고, 억제는 추가된 HSA 결합 도메인의 수에 따라 증가하였고, 억제는 알부민의 생리학적 농도의 존재 하에 더욱 두드러졌다.
CD40에 대한 2가는 효과 및 효능을 증가시키고 HSA 결합 도메인에 의해 유도된 억제 효과를 구제한다. 출원인은 CD40 원자가가 이중특이적 FAPxCD40 DARPin® 분자의 성능에 어떻게 영향을 미치는지 조사했다. F-C 형식의 이중특이적 FAPxCD40 DARPin® 분자, SMA014는 1개(F-C-C, SMA104) 또는 2개(F-C-C-C, SMA105)의 CD40 결합 DARPin 도메인을 추가하는 다양한 형식으로 클로닝되었고 시험관 내 B 세포 활성화 검정에서 시험되었다. 도 4에 도시된 바와 같이 2가 및 3가 형식은 CD86의 더 강력한 상향 조절을 유도하여 원자가가 분자의 성능에 유리하게 기여한다는 것을 나타낸다. 구체적으로, CD40 2가(SMA104)는 FAP 발현 CHO 세포의 존재 하에 분자의 효과(20x) 및 효능(2x)을 강하게 증가시켰다. CD40 3가(SMA105)는 CD40 2가에 비해 분자의 효능을 약간만 증가시켰지만 효능에는 더 이상 영향을 미치지 않았다. FAP가 없는 경우, 2가 CD40 형식(SMA104)은 인간 B 세포에서 CD86의 상향조절을 유도하지 않는 반면, 3가 CD40 형식(SMA105)은 최고 농도에서 FAP가 없는 경우에도 약간의 활성화를 나타내어 3가 CD40 결합제에 의해 유도된 FAP 독립적 활성화 가능성을 시사한다. 이러한 결과를 고려하여 추가 특성화를 위해 2가 CD40 형식을 선택했다. 특히, 출원인은 CD40 2가가 HSA 결합 도메인의 억제 효과를 구제할 수 있는지 시험했다. 이 문제를 해결하기 위해 2가 CD40 구조 SMA104를 다른 위치에 추가 HSA 결합 도메인(들)과 함께 클로닝했다(클론 SMA091, SMA099 및 AS579; 해당 도메인 형식에 대한 정보는 상기 표 2 참조). 시험된 모든 형식은 SMA014에 비해 향상된 효과와 효능을 보여주었다(도 5a). 중요한 것은 HSA가 존재하는 보다 생리학적 조건에서 HSA 결합 도메인이 있는 모든 형식의 활성이 감소했지만 SMA091은 여전히 SMA014에 비해 개선된 활성을 나타냈다(도 5b). 안키린 반복 결합 단백질 중 어느 것도 가장 높은 농도에서도 FAP가 없는 B 세포에서 CD86의 발현을 향상시키지 않았다(도 5a 및 도 5b). 예상대로 작용제 항-CD40 mAb는 FAP 발현에 독립적으로 인간 B 세포의 활성화를 유도하여 FAP-CHO 또는 WT-CHO로 B 세포를 활성화했다. 2개의 독립적인 실험의 EC50(효과) 및 최대 MFI(효능) 평균값은 각각 FAP-CHO의 경우 표 4 및 표 5에 그리고 WT-CHO의 경우 표 6에 요약되어 있다.
[표 4]
Figure pct00005
[표 5]
Figure pct00006
[표 6]
Figure pct00007
결론: F-C 형식의 이중특이적 FAPxCD40 안키린 반복 단백질은 기능적 세포 검정에서 우수한 생물학적 활성과 우수한 물리적 특성을 나타냈다. 그러나, 이 결합 단백질은 임상 개발을 위해 반감기 연장 도메인이 필요할 수 있다. 따라서, 반감기 연장 HSA-결합 도메인의 수와 위치가 분자의 활성에 영향을 미치는지 여부와 그 방법을 결정하기 위해 다양한 형식을 분석했다. 반감기 연장 도메인은 분자의 활성에 유해한 영향을 미치고 이 효과는 반감기 도메인의 수와 HSA의 존재에 따라 증가하는 것으로 관찰되었다. 또한, 놀랍게도 CD40 2가(2개의 CD40 결합 도메인을 가짐으로써)는 결합 단백질의 효과(20x)와 효능(2x)을 강력하게 증가시키고 엄격한 FAP 특이적 작용 메커니즘을 유지하지만 CD40 3가는 (3개의 CD40 결합 도메인을 가짐으로써) CD40 2가에 비해 효능을 약간만 증가시켰고 효능에 대한 추가 영향을 나타내지 않았다. 또한, 3가 CD40 결합 단백질은 가장 높은 농도에서 FAP가 없는 경우에도 약간의 활성화를 나타내어 FAP 특이적 작용 방식의 부분적 손실을 시사한다. CD40 2가는 추가로 결합 단백질의 효과 및 효능을 증가시킴으로써 하나의 반감기 연장 도메인의 억제 효과를 구제할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, HSA의 생리학적 농도에서 H-F-C-C 형식의 결합 단백질은 F-C 형식의 결합 단백질에 필적하는 활성 및 FAP 특이성을 유지했다. 결론적으로 제2 CD40 결합 도메인을 추가함으로써 우리는 HSA 결합 반감기 연장 도메인의 해로운 영향을 방지하고 F-C 형식의 부모 결합 단백질과 기능적 특성이 유사하지만 임상 개발을 촉진할 반감기 연장 도메인을 갖춘 분자를 생성할 수 있다. 이러한 모든 이유로 추가 조사를 위해 H-F-C-C 도메인 형식이 선택되었다. 이 형식은 다음 실시예에 설명된 SEQ ID NO: 5(DARPin® 단백질 #5 또는 단지 "단백질 #5"), SEQ ID NO: 6(DARPin® 단백질 #6 또는 단지 "단백질 #6") 또는 SEQ ID NO: 7(DARPin® 단백질 #7 또는 단지 "단백질 #7")의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 결합 단백질에 사용된다.
실시예 2 - 본 발명의 다중특이적 결합 단백질의 생물리학적 특성, 결합 친화도 및 결합 특이성
이 실시예는 본 발명의 다중특이적 결합 단백질의 (1) 응집체 형성과 같은 생물물리학적 특성, 및 (2) 다양한 표적 단백질(즉, FAP, CD40 및 혈청 알부민)에 대한 결합 친화도 및 종 교차 반응성을 결정하기 위해 수행된 실험을 설명한다.
응집체 형성
단백질 #5(본원에서는 때때로 SMA136이라고도 함)를 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 다각 광 산란(MALS)으로 분석했다. 도 6은 이 분석 결과를 도시한다. 이 SEC 프로파일은 단백질 #5가 용액에서 단량체이고 단분산이며 응집체를 형성하지 않음을 보여준다.
표적 단백질에 대한 결합 친화도
요약 . DARPin® 단백질 #5("단백질 #5")의 CD40, FAP 및 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 마우스의 혈청 알부민에 대한 결합을 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 분석했다. 결과는 단백질 #5가 (i) 인간 및 사이노몰구스 기원의 CD40, (ii) 인간, 마우스 및 사이노몰구스 기원의 혈청 알부민, 및 (iii) 인간 및 사이노몰구스 기원의 FAP에 특이적으로 결합함을 보여주었다. 마우스 CD40 및 마우스 FAP에 대한 특이적 결합은 검출되지 않았다. 단백질 #5의 동역학 파라미터는 표 7에 요약되어 있다. 인간 CD40, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 대한 단백질 #5의 결합에 대한 SPR 트레이스는 도 7에 도시되어 있다.
[표 7]
Figure pct00008
물질 및 방법.
모든 SPR 측정은 ProteOn XPR36 기기(BioRad) 및 0.005% Tween 20®(PBST)을 포함하는 PBS pH 7.4의 실행 완충액을 사용하여 수행되었다. 1:1 Langmuir 모델은 SPR 트레이스 피팅에 사용되었다.
다른 종의 CD40에 결합하는 단백질 #5에 대한 ProteOn 설정. 상이한 종(인간, 사이노몰구스, 마우스)의 CD40 단백질(Acro Biosystem)을 당업계에 알려진 표준 방법으로 비오티닐화하여 bio-hCD40, bio-cCD40 및 bio-mCD40 단백질을 생성하였다. bio-hCD40, bio-cCD40 및 bio-mCD40 단백질을 각각 300 RU, 250 RU 및 300 RU 수준으로 NLC 칩(BioRad)에 고정시켰다. 단백질 #5와 CD40의 상호작용은 100 μl/분의 일정한 유량을 사용하여 120초의 회합 및 900초의 해리로 단백질 #5를 3, 1.5, 0.75, 0.38 및 0.19 nM의 연속 희석액으로 주입하여 측정하였다. 측정은 2회 또는 3회 반복되었고 10 mM 글리신 pH 2를 사용하여 100 μl/분의 유량에서 18초 동안 개별 측정 사이에 표적을 재생성했다. 신호는 실행 완충액(PBST) 처리된 대조군 레인에 대해 이중 참조되었다.
다른 종의 혈청 알부민에 대한 단백질 #5 결합을 위한 ProteOn 설정. 먼저, 인간 FAP(hFAP)를 700 RU 수준으로 GLC 칩(BioRad)에 코팅한 후 50 nM 단백질 #5는 120 RU 수준으로 100 μl/분의 일정한 유량에서 120초 동안(0초 해리) 분석물로서 고정되었다. 단백질 #5에 대한 혈청 알부민의 결합은 100 μl/분의 일정한 유량에서 120초의 회합 및 600초의 해리로 100, 33, 11 및 3.7 nM의 연속 희석에서 인간 혈청 알부민(HSA), 사이노몰구스 혈청 알부민(CSA) 및 마우스 혈청 알부민(MSA)을 주입하여 측정되었다. HSA, CSA 및 MSA 결합을 연속적으로 측정하고 hFAP/단백질 #5 복합체를 100 μl/분의 유량에서 18초 동안 10 mM 글리신 pH2로 매회 재생시켰다. 따라서, 단백질 #5는 각 재생 단계 후에 hFAP에 다시 고정되어야 했다. 신호는 제어 레인((a) PBST 실행 완충액; (b) 단백질 #5가 결합하지 않는 관련 없는 표적으로 코팅됨)에 대해 이중 참조되었다. 동역학은 해리의 처음 300초에 대해 계산되었다.
다른 종의 FAP에 결합하는 단백질 #5에 대한 ProteOn 설정. hFAP, 사이노몰구스 FAP(cFAP) 및 마우스 FAP(mFAP)를 각각 10 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.3에서 GLC 칩(BioRad)에 1200 RU, 800 RU 및 2000 RU 수준으로 고정시켰다. FAP와 단백질 #5의 상호작용은 100 μl/분의 일정한 유속을 사용하여 120초의 회합 및 1800초의 해리로 50, 25, 12, 6.5 및 3.13 nM의 연속 희석액으로 단백질 #5를 적용하여 측정되었다. 표적은 10 mM 글리신 pH 2 및 124 mM H3PO4를 사용하여 재생되었다. 신호는 PBST 처리된 대조군 레인에 대해 이중 참조되었다.
결과 및 결론
표면 플라즈몬 공명 측정은 단백질 #5가 각각 103 ± 12 pM 및 101 ± 11 pM의 본질적으로 동일한 결합 친화도(KD)로 인간 및 사이노몰구스 CD40에 단단히 결합함을 보여주었다. 단백질 #5는 마우스 CD40에 대해 교차 반응하지 않는데 이는 잠재적으로 단지 57.5%의 세포외 도메인의 낮은 서열 동일성 때문이다. 단백질 #5는 50 nM의 결합 친화도(KD)로 인간 혈청 알부민에 결합하는 것으로 나타났다. 또한, 단백질 #5는 각각 0.307 nM 및 0.339 nM의 유사한 결합 친화도(KD)로 인간 및 사이노몰구스 FAP에 결합하는 것으로 나타났으며, 마우스 FAP에 대해서는 교차 반응성이 검출되지 않았다.
실시예 3 - 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석된 CD40, FAP 및 인간 혈청 알부민에 대한 단백질 #5의 동시 결합
다음 실험은 인간 CD40, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민 각각에 대한 SEQ ID NO: 5을 포함하는 다중특이적 결합 단백질의 동시 결합을 분석하기 위해 수행된 표면 플라즈몬 공명 실험을 설명한다.
물질 및 방법. SPR 측정은 ProteOn XPR36 기기(BioRad)를 사용하여 수행되었다. 실행 완충액은 0.005% Tween 20®(PBST)을 함유하는 PBS pH 7.4였다. 비오티닐화 인간 CD40(bio-hCD40-Fc)은 NeutrAvidin 코팅된 NLC 센서 칩에 550 RU 수준으로 고정되었다. 제1 분석 단계(분석물 1)에서 단백질 #5의 25 nM을 120 s의 회합 및 0 s의 해리로 bio-hCD40에 고정시켰다. 이 제1 단계는 PBST, 25 nM 단백질 #5 또는 50 nM hFAP가 120 s의 회합 및 0 s의 해리로 주입되는 제2 분석 단계(분석물 2)로 바로 이어졌다. 제3 단계(분석물 3)에서, PBST, 50 nM hFAP 또는 50 nM HSA를 120 s의 회합 및 600 s의 해리로 적용했다(주입 방식: 표 8 참조). 전체 실험은 100 μl/분의 일정한 유량에서 수행되었다. 설정은 단백질 #5(분석물 1)가 이미 CD40(칩에 고정됨)에 결합된 경우에만 hFAP 및 HSA의 결합을 허용했다. 신호는 L6 및 A6의 PBST 처리된 대조군 레인에 대해 이중 참조되었다.
[표 8]
Figure pct00009
결과. hCD40, hFAP 및 HSA에 대한 단백질 #5의 동시 결합의 SPR 트레이스가 도 8에 도시되어 있다. 간략하게, 비오티닐화된 인간 CD40의 550 RU를 뉴트라비딘 칩 상에 고정시켰다. 제1 회합 단계에서, 단백질 #5는 hCD40에 포화 상태로 결합되어 도 8, 주입 1에 도시된 바와 같이 200 RU의 총 신호에 도달했다. 제2 회합 단계(도 8, 주입 2)에서, hFAP는 복합 단백질 #5/CD40에 결합되어 200 RU의 증가를 야기하였다. 단백질 #5는 주입 1과 주입 2 사이의 시간 간격(75 RU 손실) 동안 hCD40에서 이미 해리되기 시작했음을 주목해야 한다. 제3 회합 단계(도 8, 주입 3)는 복합 hCD40/단백질 #5/hFAP(80 RU 증가)에 대한 인간 혈청 알부민의 결합을 야기했으며, 이는 세 가지 표적 모두에 대한 단백질 #5의 동시 결합이 발생했음을 나타낸다.
결론적으로, 표면 플라즈몬 공명 연구의 결과는 단백질 #5가 CD40, FAP 및 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있음을 보여준다.
실시예 4 - CD40을 통한 인간 B 세포의 활성화
연구의 목적은 다중특이적 결합 단백질, SEQ ID NO: 5를 포함하는 단백질 #5 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 단백질 #6의 생물학적 활성 및 FAP-특이적 작용 메커니즘을 평가하는 것이었다. 단백질 #5 및 단백질 #6은 FAP-발현 세포의 존재 또는 부재 하에 1차 인간 B 세포를 사용하는 세포 검정에서 시험되었다. 공동자극 분자, 특히 CD86 및 CD69의 상향조절은 CD40 신호전달에 의해 매개되는 B 세포 활성화의 마커로서 평가되었다. FAP-매개 가교에 독립적인 작용 메커니즘을 갖는 항-CD40 단일클론 항체를 참조 물질로 사용하였다. 참조 물질과 비교하여 단백질 #5 또는 단백질 #6의 역가, 효능 및 FAP-특이성을 평가하였다.
인간 B 세포 활성화 분석에서 수득한 시험관 내 데이터는 단백질 #5와 단백질 #6이 CD86 및 CD69의 상향 조절에 의해 반영된 바와 같이 CD40 활성화를 통해 B 세포를 활성화할 수 있고 단백질 #5와 단백질 #6은 FAP 양성 세포가 있는 경우에만 B 세포를 활성화할 수 있고 FAP 음성 세포가 있는 경우에는 활성화할 수 없다는 사실을 통해 FAP 매개 가교에 엄격하게 의존하는 작용 메커니즘을 확인함을 보여주었다.
물질 및 방법
시험관 내 B 세포 활성화 검정, FACS 염색, 유세포 분석기 설정 및 항체 희석, EC50 결정 및 효능 결정은 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.
FAP 발현 및 FAP 비발현 CHO 세포뿐만 아니라 참조로 사용된 항-CD40 항체는 실시예 1에 기재된 바와 같다.
결과
단백질 #5 및 단백질 #6은 FAP 의존적 작용 메커니즘으로 인간 B 세포에서 공동-자극 분자의 상향조절을 유도한다. FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 CD40을 통해 인간 B 세포를 활성화시키는 능력에 대해 단백질 #5 및 단백질 #6을 평가하였다. 단백질 #5는 0.04 내지 0.07 nM의 EC50으로 FAP-발현 CHO 세포와 공동 배양된 인간 B 세포에서 공동-자극 분자 CD86 및 CD69의 상향 조절을 유도했다(도 9). 역으로, 단백질 #5는 비-FAP 발현 CHO 세포, 야생형(WT)-CHO 세포의 존재 하에 인간 B 세포를 활성화시키지 않았다(도 10). 예상대로 작용제 항-CD40 mAb는 FAP 발현에 독립적으로 인간 B 세포의 활성화를 유도하여 FAP-CHO 또는 WT-CHO로 B 세포를 활성화했다. 단백질 #5에 대해 유사한 결과가 단백질 #6에 대해 수득되었다.
결론
단백질 #5 및 단백질 #6은 FAP-양성 CHO 세포의 존재 하에서만 1차 인간 B 세포에서 2개의 상이한 공동-자극 분자, CD86 및 CD69의 상향조절을 유도했지만, FAP-음성 CHO 세포의 존재 하에서는 그렇지 않았으며 이는 FAP 매개 가교에 엄격하게 의존하는 작용 메커니즘을 확인한다. FAP가 있는 단백질 #5는 비교 항-CD40 단일클론 항체와 유사한 효과 및 효능을 나타냈다. 단백질 #5는 FAP 발현 CHO 세포의 존재 하에 0.04 내지 0.07 nM의 EC50으로 용량 의존적 방식으로 공동-자극 분자의 상향조절을 유도했다. 유사한 결과가 단백질 #6에 대해 수득되었다.
실시예 5 - CD40을 통한 인간 수지상 세포의 활성화
실시예 4에서 B 세포에 대해 기술된 것과 개념적으로 유사한 연구가 인간 단핵구 유래 수지상 세포(MDDC)로 수행되었다(도 11의 개략도 참조).
연구의 목적은 MDDC에서 다중특이적 결합 단백질, SEQ ID NO: 5를 포함하는 단백질 #5 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 단백질 #6의 생물학적 활성 및 FAP-특이적 작용 메커니즘을 평가하는 것이었다. 단백질 #5 및 단백질 #6은 FAP-발현 세포의 존재 또는 부재 하에 MDDC를 사용하는 세포 검정에서 시험되었다. 공동자극 분자, 특히 CD86, CD83 및 CD80의 상향조절 및 IL-12의 분비를 CD40 신호전달에 의해 매개되는 MDDC 활성화의 마커로서 평가하였다. FAP-매개 가교에 독립적인 작용 메커니즘을 갖는 항-CD40 단일클론 항체를 참조 물질로 사용하였다. 참조 물질과 비교하여 단백질 #5 또는 단백질 #6의 역가, 효능 및 FAP-특이성을 평가하였다.
보조자극 분자의 상향조절 및 IL-12의 분비에 의해 반영된 바와 같이, 인간 MDDC 활성화 검정에서 얻은 시험관 내 데이터는 단백질 #5와 단백질 #6이 CD40 활성화를 통해 MDDC를 활성화할 수 있고 단백질 #5와 단백질 #6은 FAP 양성 세포가 있는 경우에만 MDDC를 활성화할 수 있지만 FAP 음성 세포가 있는 경우에는 활성화할 수 없음을 보여주었으며, FAP 매개 가교에 엄격하게 의존하는 작용 메커니즘을 확인한다. 단백질 #5는 CHO를 발현하는 FAP의 존재 하에서 각각 0.03 내지 7.67 nM 및 0.83 내지 7.63 nM의 EC50으로 용량 의존적 방식으로 공동-자극 분자의 상향조절 및 IL-12의 분비를 유도할 수 있었지만 FAP 음성 CHO 세포의 존재 하에서는 그렇지 않았다. 유사한 결과가 단백질 #6에서 수득되었다.
결론적으로, 이 연구는 단백질 #5 및 단백질 #6이 FAP 의존 방식으로 시험관 내에서 CD40을 통해 인간 MDDC를 활성화할 수 있음을 보여주었다.
실시예 6 - 단백질 #7은 생체 내에서 항종양 활성을 나타냈음
하기 실시예는 뮤린 MC38 결장 암종 모델에서 다중특이적 결합 단백질, DARPin® 단백질 #7의 반복 투여의 투여량 의존성 생체 내 효능을 평가하였다. 단백질 #7은 마우스 FAP에 결합하는 FAP 결합 도메인 및 마우스 CD40에 결합하는 CD40 결합 도메인을 포함하는 단백질 #5 또는 단백질 #6에 대한 마우스 대체물이다. MC38 암종 모델은 이전에 CD40 작용제 치료에 민감한 것으로 나타났다. MC38과 같은 동계 마우스 종양은 일반적으로 인간 종양 기질에 비해 매우 낮은 수준의 기질 FAP를 발현하는 것으로 밝혀졌기 때문에 MC38 세포주는 FAP를 발현하도록 형질감염되어 인간 종양에서 관찰되는 FAP 발현을 더 잘 모방했다.
기술된 연구 PD1032, PD1033, PD1035 및 PD1038에서, 단백질 #7(N-말단 His-태그(SEQ ID NO: 57) 포함; AS598이라고도 함)은 2.5 mg/㎏의 용량으로 시험했으며 PD1032 및 PD1033 연구에서도 12.5 mg/㎏의 용량으로 시험했다. 마우스 CD40에 결합하는 상업적으로 입수 가능한 항-CD40 항체(FGK45; BioXell)를 양성 대조군으로 사용하였다. FAP 결합 도메인이 비-결합 안키린 반복 도메인으로 대체된 단백질 #7의 비-FAP 결합 변이체(AS608로 불림; N-말단 His-태그(SEQ ID NO: 57)를 SEQ ID NO: 67)는 mFAP에 대한 결합에 대한 단백질 #7의 약리학적 활성의 의존성을 입증하기 위해 음성 대조군 분자로 사용되었다.
예를 들어, 단백질 #7과 같은 본 발명의 다중특이적 결합 단백질은 전신 독성을 감소시키기 위해 종양 조직에서 국소적으로 CD40을 활성화하도록 의도된다. 따라서, 단백질 #7의 안전성 프로파일을 평가하기 위해, 간 독성을 유발하는 것으로 알려진 항-mCD40 항체와 비교하여, 체중 감소, 혈청 사이토카인 및 트랜스아미나아제 상승 및 간 조직 손상을 포함하는 전신 독성의 여러 파라미터가 종양 성장 및 억제에 더하여 결정되었다.
물질 및 방법:
종양 실험: 종양 실험은 도 12에 개략적으로 나타낸 바와 같이 수행하였다. 동계 마우스(C57BL/6JRj)에 MC38-mFAP 다클론성 종양 세포를 우측 옆구리 부위에 피하 접종하였다(0일차). 마우스를 처리군으로 무작위화하고 같은 날 처리하였다(25일차 PD1032, 39일차 PD1033, 26일차 PD1035, 37일차 PD1038). 이어서 시험 물품(AS598, AS608, FGK45)을 표 9에 도시된 바와 같이 사전 결정된 요법에 따라 종양 보유 마우스에 투여하였다(또한 도 12 참조). 종양 성장은 접종 후 각각 36, 43, 36 및 40일차까지 캘리퍼스 측정으로 3 내지 4일마다 모니터링되었다. 실험 36일차(PD1032 및 PD1035), 마우스를 희생시키고, 종양을 제거하고, 유동 세포측정법에 의해 면역-표현형 분석을 수행하였다. 실험 43일차(PD1033) 및 40일차(PD1038)에 마우스를 희생시키고, 종양을 제거하고, 유동 세포측정법에 의해 면역-표현형 분석을 수행하였다.
PD1032 및 PD1035는 항종양 효능에 대한 2개의 독립적인 주요 연구인 반면, PD1033 및 PD1038은 FACS에 의한 종양 환경 분석을 위한 2개의 인접 연구였다. 주요 연구에서 AS598을 4일마다 3회 2.5 mg/㎏(연구 PD1032, PD1035) 및 12.5 mg/㎏(연구 PD1032)의 용량으로 투여하였다. 비-FAP 표적 대조군 AS608을 4일마다 3회 2.5 mg/㎏으로 투여하였다(연구 PD1035). FACS 분석을 위한 조기 종료 연구에서, AS598을 2.5 mg/㎏(연구 PD1033, PD1038) 및 12.5 mg/㎏(연구 PD1033)의 용량으로 3일 간격으로 2회 투여하였다. 비-FAP 표적 대조군 AS608을 유사하게 2.5 mg/㎏ 용량으로 3일 간격으로 2회 투여하였다(연구 PD1038). 항-CD40 항체 FGK45를 모든 연구에서 양성 대조군으로 사용하였고 DARPin® 단백질과 동일한 일정으로 5 mg/㎏(2.5 mg/㎏에서 AS598과 동일한 몰 용량)으로 투여하였다.
[표 9]
Figure pct00010
Figure pct00011
종양 접종: 종양 발생을 위해 표준 이소플루란 마취 하에 90마리(PD1032 + PD1033) 또는 105마리(PD1035 + PD1038) 암컷 C57BL6 마우스에 0.2 mL의 PBS에서 MC38-mFAP 다클론성 종양 세포(9 x 106)를 오른쪽 뒷옆구리/등 부위에 피하 접종하였다.
종양 측정: 종양 측정은 종양 접종 후 15일(PD1032 및 PD1033) 또는 14일(PD1035 및 PD1038)부터 일주일에 두 번 수행되었다. 종양의 길이와 너비는 캘리퍼스로 측정하였다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산되었다: (길이 x (너비)2 x π) / 6.
무작위화: 종양 부피에 기초한 그룹 무작위화를 종양 접종 후 25일, 39일, 26일 및 37일에 수행하였다. 종양이 이식된 원래의 90마리(PD1032 및 PD1033) 마우스로부터, 종양 접종(PD1032) 25일 후에 40마리를 각각 10마리 동물의 4개의 하위군으로 무작위화하였다. 남은 50마리의 마우스는 종양 접종(PD1033) 39일 후에 5마리 동물의 4개 하위군으로 각각 무작위화하였다. 종양이 이식된 원래의 105마리(PD1035 및 PD1038) 마우스로부터, 종양 접종(PD1035) 26일 후에 40마리를 각각 10마리 동물의 4개의 하위군으로 무작위화하였다. 남은 65마리의 마우스는 종양 접종(PD1038) 37일 후에 각각 6마리 동물의 4개 하위군으로 무작위화하였다.
관찰 및 데이터 수집: 그룹 무작위화 후, 체중 및 종양 측정이 수행되는 동안 매주 2회 동물을 검사했다. 동물은 또한 이동성, 음식 및 물 소비의 시각적 추정, 체중 증가/감소, 눈/털 윤기저하 및 임의의 다른 비정상적인 효과와 같은 정상적인 행동에 대한 종양 성장 및 치료의 임의의 영향에 대해 확인되었다. 사망 및 관찰된 임상 징후는 각 하위 집합 내의 동물 수를 기준으로 기록되었다.
샘플링: 종양을 제거하고 칭량하고 FACS에 사용하고 나머지 물질은 포르말린에 고정했다. 비장을 제거하고 절반은 FACS에 사용하고 나머지 절반은 포르말린에 고정했다. 간을 제거하고 포르말린에 고정했다. Multivette 600Z Gel(Sarstedt #15.1674)에서 PD1032의 경우 24일, 26일 및 36일, PD1033의 경우 43일, PD1035의 경우 27일 및 36일, PD1038의 경우 41일에 혈액 샘플을 채취하고 15,000 rpm에서 5분 동안 원심분리했다. 혈청을 수확하여 나중에 분석할 수 있도록 영하 80℃에 보관했다.
통계 분석: 통계 분석은 Prism 8.2.0 소프트웨어(GraphPad Software)로 수행되었다. 다중 비교가 있는 모든 통계는 비히클과 비교한 모든 그룹에 대해 Kruskal-Wallis 비모수 테스트에 이어 Dunn의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었다. 차이에 대한 두 그룹 간의 비교를 위해 비모수 Mann-Whitney 2-tail 분석을 수행하였다.
간 효소. 뮤린 모델과 인간 임상 시험에서 CD40에 대한 작용 항체가 상당히 증가하는 것으로 나타났지만 일시적으로 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT)와 같은 간 효소가 증가했다. 인간에서 AST는 간, 뇌, 췌장, 심장, 신장, 폐 및 골격근을 포함한 다양한 조직에서 발견된다. 이러한 조직 중 하나라도 손상되면 AST가 혈류로 방출될 것이다. 증가된 AST 수준은 조직 손상을 나타내지만 간 자체에만 국한되지는 않는다. 대조적으로 ALT는 주로 간에서 발견된다. ALT의 상승은 간 손상의 직접적인 징후이다.
따라서, 이러한 실험에서 AST와 ALT의 수준을 간 독성의 척도로 결정했다. 처리 후 24시간 시점에 측정을 수행하였다. 처리 후 24시간 시점이 문헌 및 사내 시간 적정 실험을 기반으로 가장 적절했다. 제조사의 지침에 따라 키트 MAK052 및 MAK055(Sigma-Aldrich)를 사용하여 ALT 및 AST 분석을 각각 수행했다.
사이토카인 수준. 도 12에 따라 처리된 MC38-FAP 결장 암종 종양 보유 마우스로부터의 혈액을 첫 번째 주사 후 24시간(주요 연구 = PD1032 및 PD1035), 두 번째 주사 후 24시간(인접한 연구 = PD1033 및 PD1038) 및 연구 종료 시에 채취했다(주요 연구 = PD1032 및 PD1035). 11가지 사이토카인(TNF-알파, IL-6, IFN-감마, IL12p70, MCP-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타, IP-10, IL-10, IL-2 및 IL-1 베타)을 제조사의 권장 사항에 따라 Luminex 검정(R&D Systems)을 사용하여 분석했다.
간 조직의 면역조직화학(IHC) 분석. 은 첫 번째 주사 후 24시간에 수확하고, PBS로 세척하고, 즉시 포르말린에 고정하고 파라핀 블록에 포매했다. 헤마톡실린/에오신 염색은 파라핀 포매된 간 절편에서 수행되었고 맹검 방식으로 병리학자에 의해 분석되었다.
결과:
전반적인 건강과 체중. 연구 기간 동안, AS598 처리로 마우스의 부정적인 건강 영향 또는 체중 감소의 징후가 관찰되지 않았다(도 13a 및 도 13b). 대조적으로, 그리고 이전 보고와 일치하게, FGK45 처리는 첫 번째 주사 후 상당하지만 일시적인 체중 감소를 초래했다(도 13a 및 도 13b).
종양 성장. 연구 기간 동안 3 내지 4일마다 종양 성장을 측정하였다. 연구 PD1032 및 PD1035의 처리는 평균 종양 부피가 300 ㎣를 초과하는 25일차 및 26일차에 각각 시작되었다. 두 연구에서 상이한 처리 그룹의 평균 종양 성장 곡선이 도 14a 및 도 14b에 도시되어 있다.
AS598은 시험된 두 용량 모두에서 비히클 그룹과 비교하여 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 입증했다(도 14a 및 도 14b). 항-종양 효능은 양성 대조군 항-CD40 항체 FGK45로 관찰된 것과 유사하였다. 연구 PD1035에서 사용된 비-FAP-결합 대조군 AS608은 어떠한 항-종양 효능도 갖지 않았으며 이는 이 종양 모델에서 관찰된 항-종양 효능이 FAP-의존적임을 입증한다.
종양 부피 측정에 더하여, 연구가 끝날 때 마우스에서 종양을 해부하고 종양 중량을 결정하였다. 종양 중량 측정의 결과 및 결론은 종양 부피 측정의 결과 및 결론과 일치했다(데이터는 표시되지 않음).
또한, 연구 PD1033 및 PD1038에서 수득한 결과는 연구 PD1032 및 PD1035에서 수득한 결과와 일치했다(데이터는 표시되지 않음).
혈중 사이토카인 수준. FGK45는 측정된 8개의 사이토카인, 즉 TNF-알파, IL-6, IFN-감마, IL12p70, MCP-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타 및 IP-10의 혈중 수준을 유의하게 증가시켰다(도 20a, 데이터는 표시되지 않음). 대조적으로, AS598(2.5 mg/㎏ 또는 12.5 mg/㎏), AS608 또는 비히클은 측정된 어떤 사이토카인의 혈액 수준도 증가시키지 않았다(도 20a, 데이터는 표시되지 않음).
간 효소 및 손상. 예상한 바와 같이, FGK45는 ALT 수준의 상당한 증가를 유도했는데, 이는 첫 번째 주사 후 24시간 후에 검출되었지만 후속 주사 후에는 검출되지 않았다(도 20b). 이것은 문헌 및 사내 이전 연구에 따른 것이다. FGK45와 대조적으로, AS598은 ALT 수준의 어떠한 증가도 유도하지 않았다(도 20b). ALT에 더하여, AST도 FGK45 처리군에서 첫 번째 주사 후 24시간에 증가했지만, AS598 또는 대조군 처리된 동물에서는 그렇지 않았다(도 20b).
간 조직의 IHC. 조직학적 분석은 마우스가 항-mCD40 항체로 처리되었을 때 단핵 백혈구의 응집체, 혈전증 및 괴사와 함께 혈관 중심 다발성 염증을 특징으로 하는 확산된 조직 손상을 드러냈다(도 20c). 대조적으로, 단백질 #7로 처리된 마우스로부터의 간의 IHC 분석은 비히클-처리된 간에서 관찰된 것과 유사한 조직학적 프로파일을 갖는 간세포 독성의 증거를 나타내지 않았다(도 20c).
종합하면, 항-mCD40 항체와 대조적으로, 단백질 #7은 체중 감소, 전염증성 사이토카인(예를 들어 IL-6, TNFα, IFNγ 및 IL-12p70)의 상승, 트랜스아미나제(AST 및 ALT) 수준 증가 또는 간 조직 손상 측면에서 전신 독성의 징후를 보이지 않았다.
결론:
혈청 알부민 외에 마우스 FAP 및 마우스 CD40에 대하여 결합 특이성을 갖는 대리 마우스 특이적 결합 단백질, 단백질 #7이 생성되었다. 뮤린 세포 기반 시험관 내 분석에서 시험된 단백질 #7은 인간 세포 기반 시험관 내 분석(예를 들어 실시예 4 참조)에서 단백질 #5 및 단백질 #6과 비슷한 결과를 보여 CD40의 엄격한 FAP 의존적 활성화를 나타낸다(데이터는 표시되지 않음). 본 실시예에서 나타낸 바와 같이, 단백질 #7(N-말단 His-태그 포함; AS598)은 또한 생체 내에서 활성이었고 FAP-양성 종양의 진행을 실질적으로 억제하였다. 더욱이, 항-마우스 CD40 항체(FGK45)와 대조적으로, 단백질 #7의 항종양 활성은 상승된 혈중 사이토카인 수준이나 간독성의 시험된 지표와 연관되지 않았다. 상승된 혈중 사이토카인 수준 및 간독성은 일부 임상 CD40 활성화 항체의 용량 제한 독성으로 나타난다. 제시된 데이터는 CD40 수용체의 FAP 매개 가교에 의존하여 말초 또는 종양 외 장기 독성 없이 종양에 국한된 CD40 활성화를 초래하는 시험관 내 및 생체 내 모두의 작용 방식을 지원한다.
결론적으로, FAP 양성 종양에서 국소적으로 CD40 수용체를 활성화하고 전신 독성 없이 상당한 항종양 활성을 유발할 수 있는 종양 표적 CD40 작용제 다중특이적 DARPin® 단백질이 생성되었다.
실시예 7: 본 발명의 다중특이적 결합 단백질의 존재 또는 부재 하에서의 FAP의 프로테아제 활성
이 실시예는 고유 FAP 효소 활성이 다중특이적 재조합 단백질의 결합 시 억제되는지 여부를 결정하기 위해 본 발명의 다양한 다중특이적 결합 단백질의 존재 또는 부재 하에 수행된 FAP 활성 검정을 설명한다.
FAP는 유형 II 단일 막횡단 세린 프로테아제로, 이의 발현은 종양(예를 들어, 상피암의 >90%에서 기질 섬유아세포 표면에서 발현됨), 상처 치유, 배아 조직 및 염증 부위(예를 들어, 동맥경화증/관절염)과 같은 조직 리모델링 부위에서 고도로 상향 조절되며, FAP 발현은 질병이 없는 성인 장기에서 검출하기 어렵다. 이 비정형 세린 프로테아제는 디펩티딜 펩티다아제(엑소펩티다아제)와 엔도펩티다아제 활성을 모두 가지고 있어 프롤린 후 결합에서 기질을 절단한다. 구조적으로, FAP는 짧은 세포질 N-말단 서열(4 aa), 단일 막횡단 헬릭스(21 aa) 및 8개의 블레이드 β-프로펠러 및 α/β-가수분해효소 도메인을 형성하는 세포외 도메인(735 aa)으로 이루어진다. FAP는 동종이량체로 활성이다. FAP 프로테아제 활성에 필수적인 촉매 트라이어드는 Ser624, Asp702 및 His734 잔기로 구성된다. 활성 부위는 베타 프로펠러의 중앙 구멍을 통해 또는 베타 프로펠러와 가수분해효소 도메인의 경계면에 있는 공동을 통해 접근할 수 있다.
FAP의 프로테아제 활성은 뉴로펩티드 Y, 유형 I 콜라겐 및 α2-항플라스민뿐만 아니라 기질 Z-GLY-PRO-AMC를 포함한 다양한 기질의 절단을 생성하며, 이는 엑소펩티다아제 또는 엔도펩티다아제 활성 모두에 의해 형광 판독기로 측정될 수 있는 생성물로 절단될 수 있다.
FAP 활성 분석에서 시험된 분자는 표 10에 요약되어 있다.
[표 10]
Figure pct00012
FAP 활성 검정. 인간 FAP(hFAP) 표적을 검정 완충액(50 mM Tris, 1 M NaCl, 1 mg/ml BSA, pH 7.5)에서 0.67 nM로 희석하고 웰당 45 μl를 96웰 플레이트에 첨가했다(결과적으로 활성 검정에서 0.3 nM의 최종 hFAP 농도). 표 10에 나타낸 바와 같이 분자 1-5는 표적 샘플(최종 농도 150 nM)에 3 μM 분자 5 μl를 첨가하여 500배 몰 과량으로 적용하였다. 마지막으로, 100 μM Z-GLY-PRO-AMC 기질(최종 농도 50 μM) 50 μl를 첨가하여 각 웰에 총 부피 100 μl를 수득하였다. FAP 활성의 부분적 억제를 나타내기 위해 분자 번호 5를 대조군으로 사용하였다.
측정 전에 플레이트를 4000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분석을 방해하는 버블을 제거했다. 형광은 수동 증가가 105%로 설정된 형광 판독기를 사용하여 380 nm 여기 및 460 nm 방출에서 95분의 기간에 걸쳐 5분마다 측정되었다. 4중 측정을 수행하고 평균 및 표준 편차로 설명했다.
결과. 첫 번째 단계에서, 용량 반응 곡선은 50 μM의 고정된 기질 농도에서 0.01 nM에서 최대 1.2 nM까지의 FAP 농도를 사용하여 측정되었다. 선형 시간 의존적 신호 증가는 95분의 기간 동안 0.3 nM의 rhFAP 표적 농도에서 관찰되었다(0.999의 R2로 5분마다 측정). FAP의 효소 활성에 대한 단백질 결합의 효과를 결정하기 위해, 검정은 FAP(0.3 nM)에 대해 500배 몰(150 nM) 과량으로 FAP-결합-분자(예를 들어, 분자 번호 1(SEQ ID NO: 5))를 첨가함으로써 FAP 포화 조건 하에서 수행되었다. 분자 번호 1(SEQ ID NO: 5)의 이러한 농도는 인간 FAP(Kd = 0.3 nM)에 대한 분자 번호 1(SEQ ID NO: 5)의 결합 친화도보다 500배 더 높았다.
도 15에 요약된 바와 같이, 분자 번호 1 내지 4는 내인성 디펩티딜 FAP 효소 활성을 억제하지 않았다. 검정 대조군으로 사용된 대체 FAP-결합 분자(분자 번호 5)에 의해 부분적인 FAP 활성 억제가 관찰되었다.
결론. FAP에 대한 분자 번호 1(HFCC) 또는 분자 번호 2(HF*C*C*)와 같은 본 발명의 다중특이적 결합 단백질 또는 이들의 FAP-결합 도메인(F 또는 F*)의 결합은 형광 기질 Z-GLY-PRO-AMC를 절단하는 능력으로 측정한 FAP의 프로테아제 활성에 영향을 미치지 않았다.
실시예 8: 종양 조직에서 본 발명의 다중특이적 결합 단백질의 우선적인 국소화 및 축적
이 실시예는 본 발명의 다중특이적 결합 단백질이 아마도 종양 조직에서 발현된 FAP에 대한 결합을 통해 종양 조직에서 우선적으로 국소화되고 축적될 수 있는지를 조사하기 위해 수행된 실험을 기술한다. 이를 위해 실시예 6에 기재된 동계 MC38-FAP 마우스 모델을 적합한 실험 시스템으로 사용하였다. 또한 실시예 6에 기재된 단백질 #7을 본 발명의 대표적인 다중특이적 결합 단백질로 사용하였다.
종양 조직에서 단백질 #7의 국소화 및 축적을 조사하기 위해 세 가지 다른 방법론, 즉 SPECT/CT 이미징, 면역조직화학(IHC) 및 생체 내 조직 분포 분석이 사용되었다.
물질 및 방법
종양 접종 및 치료: 이전에 기술된 바와 같이, 마우스에 9 x 106개의 MC38-FAP 마우스 결장 암종 세포를 우측 어깨 옆구리에 피하 접종하였다. 종양의 크기가 500 ㎣에 도달하면, 꼬리 정맥에 2.5 mg/㎏ = 50 ㎍/마우스에 해당하는 대략 150 KBq의 방사성 결합 분자(단백질 #7 또는 상응하는 4개의 안키린 반복 도메인 구조를 갖고 HSA에 결합하지만 FAP 또는 CD40에는 결합하지 않는 대조군 DARPin® 단백질)를 마우스에 주사했다.
인듐-111 표지: DARPin® 분자를 인듐-111로 표지하기 위해, 말레이미드-DTPA(Chematech, Cat Number: C107), 설프하이드릴(SH) 기에 대한 특정 반응성을 갖는 이작용성 킬레이트제를 사용하여 DARPin® 분자의 C-말단 끝에 추가된 시스테인의 유리 SH-기에 방사성 표지를 접합하였다. 분자를 금속이 없는 PBS(pH 7.4, PSI 등급) 및 0.05 mM EDTA에서 1시간 동안 실온(RT)에서 교반했다. 단백질 양보다 10배 몰 과량의 DMSO(Sigma-Aldrich) 중 말레이미드-DTPA를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 용액을 한외여과 튜브(Amicon Amicon Ultra 15, 10 kDa MW 컷오프)로 옮기고 4 mL의 금속이 없는 PBS를 첨가하였다. 튜브를 RT에서 4000 x g로 6분 동안 원심분리했다. 회전 후, 통과액은 버리고, 또 다른 4 mL의 금속이 없는 PBS를 추가하고 튜브를 위에 기재된 바와 같이 다시 원심분리했다. 필터 상청액을 저단백질 결합 Eppendorf 반응 튜브로 옮기고 농도를 결정했다. 전자분무 이온화 비행 시간 질량 분석법(ESI-TOF-MS)을 사용하여 부위 특이적 컨쥬게이션을 측정하였다. 최종 컨쥬게이트된 생성물은 4°에서 보관되었다.
SPECT/CT 이미징 연구: 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)/X-선 컴퓨터 단층촬영(CT) 이미지는 NanoSPECT/CTPlus 카메라(버전 1.2, Bioscan)로 수행되었다. SPECT 및 CT 획득은 소프트웨어 Nucline(버전 1.02)을 사용하여 수행되었다. CT는 소프트웨어 Nucline으로 재구성한 반면 SPECT의 경우 소프트웨어 HISPECT(버전 1.4.3049, Scivis GmbH)를 사용했다. SPECT와 CT 데이터의 융합은 VivoQuant™ 후처리 소프트웨어(Version 3.5, Invicro, USA)로 분석되었다. 이미징 획득 전에 감마 카운터 튜브에서 전신 활동을 측정했다. 111In-DARPin® 분자 주입 후 4, 24, 48, 72, 96시간 시점에 마취된 마우스(2% 이소플루오란/산소 혼합물 흡입)에서 생체 내 SPECT/CT 이미지를 촬영했다. 주입 후 96시간 후에 촬영한 이미지가 도 16a에 도시되어 있다. 모든 SPECT 프로젝션은 프레임당 20초 내지 60초가 걸리므로 이미지당 스캔 시간은 15분에서 45분이다. CT 스캔은 55 ㎸p의 튜브 전압과 145 ㎂의 튜브 전류 및 프로젝션당 1000 밀리초(msec)의 노출 시간으로 수행되었다.
IHC 연구: 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE)-종양 조직 슬라이드에서 먼저 항원 검색 단계를 위해 초기에 70℃에서 8분의 3주기에 이어 pH 7.4(EDTA 기반 용액, Ventana 자동 염색기의 CC1 조건)에서 48분 동안 95℃의 주기로 파라핀을 제거했다. 그런 다음 슬라이드를 토끼 항-DARPin® 항체 컨쥬게이트(자체 생산, 작업 농도: 2.0 ㎍/mL)와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 항-DARPin® 항체 복합체는 37℃에서 20분 동안 Omni Rabbit HRP 자동 분배기(Roche Diagnostics)를 사용하는 HRP 시스템에 의해 검출되었다. 마지막으로, 슬라이드를 헤마톡실린으로 염색하고, 에탄올 구배(70%>90%>100%&100%, 각 단계는 1분)에서 탈수하고, 자일렌에서 2분 동안 세척하고 커버슬립을 세포밀봉 마운팅 배지로 슬라이드에 적용했다. 슬라이드를 Vectra Polaris로 스캔하고 DARPin® 단백질 축적에 대해 정성적으로 평가했다.
생체내 조직 분포 연구: MC38-FAP 종양 보유 마우스를 위에 기재된 바와 같이 처리하고(종양 접종 및 처리), 주사 후 4, 24, 48, 72 또는 96시간에 안락사시켰다. 관심 기관을 해부하고 칭량하고 방사능을 γ-카운터(Packard Cobra II Gamma D5010)를 사용하여 분당 계수(CPM)로 결정했다. 그런 다음 분석된 기관당 CPM 값을 참조 값으로 마우스당 DARPin® 단백질의 총량을 사용하여 기관당 ㎍ DARPin® 단백질(㎍ DARPin® 단백질/기관)로 전환했다. ㎍ DARPin® 단백질/장기는 조직 그램당 ㎍ DARPin® 단백질(㎍ DARPin® 단백질/g 조직)로 전환되었고 그래프에 조직 그램당 주입된 용량의 백분율(% ID/g)로 표시하고 시점당 4마리의 마우스를 사용하여 평균 ± SD로 표시되었다.
결과
SPECT/CT 이미징 실험은 종양 조직에서 본 발명의 다중특이적 결합 단백질인 단백질 #7의 우선적인 국소화 및 축적을 드러냈다(도 16a). 일부 오프-종양 흡수는 주로 비장에서 관찰되었는데, 아마도 단백질 #7의 CD40 특이적 도메인에 의해 유도된 온-표적 분포 때문일 것이다.
MC38-FAP 종양 보유 마우스를 희생시키고 IHC에 의해 DARPin® 분자의 존재에 대해 종양을 분석했다. IHC 분석은 종양 조직에서 본 발명의 다중특이적 결합 단백질인 단백질 #7의 강력한 존재를 보여주었다(도 16b, 상단 패널). 대조적으로, HSA에 결합하지만 FAP 또는 CD40에는 결합하지 않는 음성 대조군 DARPin® 분자는 종양 조직에서 상당한 수준으로 검출되지 않았다(도 16b, 하단 패널). 이들 데이터는 단백질 #7의 종양 국소화 및 축적이 FAP- 및/또는 CD40-특이적 결합 도메인에 의해 매개됨을 확인시켜 주었다. 음성 대조군으로 처리된 종양에서 관찰된 모든 미미한 신호는 종양 미세 환경에 있는 알부민의 존재와 이에 대한 음성 대조군 DARPin® 분자의 결합으로 인해 발생했거나 단순히 분자 확산으로 이어지는 조직 투과성으로 인한 것일 수 있다.
방사성 표지된 단백질 #7 또는 대조군 DARPin® 단백질을 MC38-FAP 종양 보유 마우스에 주입한 생체 내 조직 분포 연구는 특히 종양 조직(도 16c, 좌측 패널)에서 본 발명의 다중특이적 결합 단백질인 단백질 #7의 축적을 나타내었지만, 예를 들어 근육(도 16c, 우측 패널), 골수, 간 및 신장(데이터는 표시되지 않음)과 같은 다른 기관에서는 축적되지 않았다. SPECT/CT 연구와 일관되게 일부 오프-종양 축적은 비장에서만 관찰되었으며, 아마도 이 림프 기관에서 CD40의 발현 때문일 가능성이 높다(데이터는 표시되지 않음). 중요한 것은 HSA에 결합하지만 FAP나 CD40에는 결합하지 않는 방사성 표지된 음성 대조군 DARPin® 단백질이 종양이나 다른 조직에 축적되지 않았다는 것이다. 이를 통해 단백질 #7의 종양 국소화 및 축적이 FAP 및/또는 CD40 특이적 결합에 의해 매개되는 메커니즘을 통해 발생했음을 확인했다.
결론
이 실시예에 제시된 데이터는 본 발명의 다중특이적 결합 단백질이 FAP- 및/또는 CD40-의존 방식으로 종양 조직에 우선적으로 위치하고 축적될 수 있다는 실험적 증거를 제공한다. 이러한 결과는 FAP-특이적 안키린 반복 도메인이 종양-발현된 FAP에 대한 결합을 통해 종양 국소화 및 다중특이적 결합 단백질의 축적을 효과적으로 중재할 수 있다는 발견과 일치한다.
실시예 9: 본 발명의 다중특이적 결합 단백질에 의한 종양 억제는 종양에서의 FAP 발현에 의존적임
실시예 6은 단백질 #7(N-말단 His-태그 포함; AS598)이 생체내에서 활성이고 FAP-양성 종양의 진행을 실질적으로 억제함을 보여주었다. 이 실시예에서, 낮은 FAP 발현을 갖는 동계 마우스 모델을 사용하여 단백질 #7의 FAP-의존성 작용 메커니즘의 추가 증거를 제공하였다. 구체적으로, 생체 내에서 FAP 발현 수준이 매우 낮은 종양을 생성하는 형질감염되지 않은 MC38-WT 세포주를 효능 연구 수행에 사용했다.
물질 및 방법:
종양 실험: 종양 실험은 도 17a에 개략적으로 나타낸 바와 같이 수행하였다. 암컷 동계 마우스(C57BL/6J)에 MC38-WT 결장암 종양 세포를 옆구리 부위에 피하 접종하였다(0일차). 마우스는 7일차에 대략 77 ㎣의 종양 크기에 기초하여 치료 그룹으로 무작위 배정되었다. 시험 항목(단백질 #7(N-말단 His-태그 포함; AS598) 및 항-CD40 항체)을 표 11에 나타낸 바와 같은 사전 결정된 요법에 따라 종양 보유 마우스에게 복강내(i.p.) 투여하였다. 시험 항목을 4일마다 서로 등몰 농도로 투여하였다. 윤리적 종양 부피 한계로 인해 개별 마우스가 종료될 때까지 캘리퍼스 측정으로 3 내지 4일마다 종양 성장을 모니터링했다.
[표 11]
Figure pct00013
종양 접종: 표준 이소플루란 마취 하에, 마우스의 옆구리에 0.1 mL의 PBS 중 1x106 MC38-WT 종양 세포를 피하로 접종하였다.
종양 측정: 종양 측정은 종양 접종 후 일주일에 두 번 수행되었다. 종양의 길이와 너비는 캘리퍼스로 측정하였다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산되었다: V = (L x W x W)/2
무작위화: 7일차에 "일치 분포" 무작위화 방법(StudyDirectorTM 소프트웨어)을 기반으로 무작위화를 수행했다.
관찰 및 데이터 수집: 종양 세포 접종 후, 이환율 및 사망률에 대해 동물을 매일 확인했다. 일상적인 모니터링 시점에, 이동성, 음식 및 물 소비, 체중 증가/감소 및 기타 이상과 같은 행동에 대한 종양 성장 및 치료의 영향에 대해 동물을 확인했다. 치사율 및 관찰된 임상 징후를 개별 동물에 대해 기록하였다.
통계 분석. 통계 분석은 비히클과 비교한 모든 그룹에 대해 Kruskal-Wallis 비모수 테스트에 이어 Dunn의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었다. 결과는 * p<0.05 ** p<0.01*** p<0.001일 때 유의한 것으로 간주되었다.
결과 및 결론:
도 17b에 도시된 바와 같이, 단백질 #7은 이 FAPLOW 종양 모델에서 비히클과 비교하여 통계적으로 유의한 항종양 효능을 나타내지 않았으며, 따라서 단백질 #7의 FAP-의존성 작용 메커니즘의 추가적인 증거를 제공한다. 이와는 달리, 생체 내 활성이 종양 미세 환경에서 FAP의 존재와 관련이 없는 항-CD40 항체는 예상대로 종양 진행을 억제하여 CD40 작용제에 대한 MC38-WT 종양 세포주의 감수성을 확인했다.
실시예 10: 본 발명의 다중특이적 결합 단백질의 장기 항종양 효과
본 실시예는 본 발명의 다중특이적 결합 단백질의 전체 치료 가능성을 추가로 조사하기 위해 MC38-FAP 종양 보유 마우스를 치료하고, 그 후 더 긴 기간 추적한 연구를 설명한다.
물질 및 방법
종양 실험: 연구 PD1035에 대한 실시예 6 및 도 14b에 이전에 기술된 바와 같이 종양 실험을 본질적으로 수행하지만, 그러나 이 경우 마우스는 시간이 지남에 따라 모니터링되었으며 정부 승인 동물 프로토콜에 정의된 바와 같이 고통의 징후를 보이거나 종양이 2000 ㎣의 사전 결정된 종양 크기로 정의된 평가변수를 초과하는 경우에만 희생되었다. 시험 항목(음성 대조군 분자로 단백질 #7(N-말단 His-태그 포함; AS598) 및 단백질 #7의 비-FAP 결합 변이체(AS608; N-말단 His-태그 포함 SEQ ID NO: 67(SEQ ID NO: 57))을 표 12에 나타낸 바와 같이 사전 결정된 요법에 따라 종양 보유 마우스에 투여하였다. 윤리적 종양 부피 한계로 인해 개별 마우스가 종료될 때까지 캘리퍼스 측정으로 3 내지 4일마다 종양 성장을 모니터링했다.
[표 12]
Figure pct00014
종양 접종 및 무작위화: 표준 이소플루란 마취 하에, 마우스의 옆구리에 0.2 mL의 PBS 중 9x106 MC38-FAP 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 대략 300 ㎣의 평균 크기에 도달하면 이전에 설명한 대로 마우스를 무작위로 분류했다.
종양 측정: 종양 측정은 종양 접종 후 일주일에 두 번 수행되었다. 종양의 길이와 너비는 캘리퍼스로 측정하였다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산되었다: V = (L x W x W x π)/6
관찰 및 데이터 수집: 일상적인 모니터링 시점에, 이동성, 음식 및 물 소비, 체중 증가/감소 및 기타 이상과 같은 행동에 대한 종양 성장 및 치료의 영향에 대해 동물을 확인했다. 치사율 및 관찰된 임상 징후를 개별 동물에 대해 기록하였다.
결과 및 결론
결과는 단백질 #7이 MC38-FAP 종양을 억제 및 거부할 수 있고 종양 재발에 대한 장기적인 보호를 제공할 수 있다는 증거를 제공한다. MC38-FAP 종양은 단백질 #7로 마지막 처리한 후 대략 20일 후에 더 이상 검출되지 않았다(도 18a). 또한, 단백질 #7로 처리된 마우스는 접종 후 적어도 200일 동안(즉, 전체 측정 기간) 생존하여, 단백질 #7의 항종양 효과가 지속적이고 장기적이라는 것을 입증하였다(도 18b). 대조적으로, CD40 표적에는 결합하지만 FAP 표적에는 결합하지 않는 음성 대조군으로 처리된 MC38-FAP 종양은 비히클 그룹과 유사하게 진행되었고(도 18a) 마우스는 비히클 그룹에서와 유사한 비율로 사망하거나 희생되어야 했다(도 18b). 이러한 데이터는 생체 내에서 단백질 #7의 항종양 작용 메커니즘의 FAP 의존성을 확인했다. 모두 함께, 이들 데이터는 본 발명의 다중특이적 결합 단백질이 MC38-FAP 종양 마우스 모델에서 FAP-의존적 방식으로 강력하고 지속적인 항-종양 활성을 유도할 수 있다는 증거를 제공하였다.
실시예 11: 본 발명의 다중특이적 결합 단백질에 의한 보호 항종양 면역학적 기억의 유도
잘 확립된 MC38-FAP 종양이 있는 마우스는 도 18에 도시된 바와 같이 단백질 #7로 처리한 후 감지할 수 없는 크기로 종양을 거부할 수 있었다. 단백질 #7에 의해 유도된 가능한 항종양 면역학적 기억을 연구하기 위해 동일한 종양이 없는 마우스를 MC38-FAP 종양 세포로 재도전했다.
물질 및 방법
종양 실험: 연구 PD1035 및 도 14b에 대한 실시예 6 및 도 18b에 대한 실시예 10에 이전에 기술된 바와 같이 종양 실험 및 처리를 본질적으로 수행하였고, 단백질 #7로 처리된 마우스는 MC38-WT 또는 MC38-FAP 종양 세포(0,2 mL의 PBS에서 각각 1 또는 9 x106 세포/마우스)로 재도전하기 전에 약 120일 동안 모니터링되었다. 동시에, 나이브 마우스는 정확히 동일한 종양 세포로 도전되었다. 윤리적 종양 부피 한계로 인해 개별 마우스가 종료될 때까지 캘리퍼스 측정으로 3 내지 4일마다 종양 성장을 모니터링했다.
결과 및 결론
초기 및 약한 종양 성장 후, 이전에 단백질 #7로 처리된 모든 마우스는 재도전된 MC38-FAP 종양을 완전히 거부했으며(도 19a), 이는 면역학적 항종양 기억 반응의 존재를 시사한다. 흥미롭게도, 동일한 현상이 MC38-WT 종양 세포로 재도전된 마우스에서 관찰되었으며(도 19a), 이는 단백질 #7이 FAP 관련 항원에 국한되지 않고 보다 광범위하게는 종양 항원에 대한 면역학적 기억의 확립에 기여했음을 시사한다. 또한, MC38-WT 또는 MC38-FAP 종양 세포로 접종된 나이브 대조군 그룹은 사용된 종양 세포의 발암 능력을 명확하게 보여주었으며(도 19b) 따라서 도 19a에 나타낸 재도전된 마우스에서 종양 성장의 부재가 면역-매개된 항-종양 반응으로 인한 것임을 확인하였다. 결론적으로, 본 발명의 다중특이적 결합 단백질이 방어적인 항-종양 면역학적 기억을 유도하는 능력을 가지며 또한 이 면역학적 기억이 MC38-FAP 종양 모델에서 FAP-관련 항원에 제한되지 않는다는 것을 시사하는 실험적 증거가 수득되었다.
실시예 12: CD40-특이적 결합 단백질에 의해 결합된 인간 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 5(hCD40)의 복합체의 X-선 구조 분석
본 연구의 목적은 X-선 결정학을 사용하여 본 발명의 CD40-특이적 결합 단백질에 의해 결합된 재조합 hCD40의 복합체를 생성하고 분석하는 것이었다. 이 구조 분석에 사용된 CD40-특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 DARPin® 단백질이었다.
물질 및 방법
단백질 생산.hCD40은 글리코실화를 차단하기 위해 튜니카마이신의 존재 하에 Hi5 세포에서 발현되었다. 배양 상청액의 단백질을 HIS-트랩, THB-다이제스트, 음성 HIS-트랩 및 SEC를 통해 정제하였다. 정제된 hCD40을 CD40-특이적 DARPin® 단백질(SEQ ID NO: 3)과 1:1.2 비로 혼합하였다. 과량의 DARPin® 단백질을 10 mM HEPES/NaOH pH 7, 150 mM NaCl에서 SEC를 통해 hCD40:DARPin® 단백질 복합체로부터 제거하였다. 샘플은 36.7 mg/ml로 농축되었다. 이 절차는 Coomassie 염색 SDS-PAGE에서 판단할 때 95% 초과의 순도를 가진 균일한 단백질을 생성하였다.
결정화. 정제된 단백질은 대략 1200개의 다른 조건을 가진 표준 스크린과 문헌 데이터를 사용하여 확인된 결정화 조건을 모두 사용하는 결정화 시험에 사용되었다. 처음에 얻은 조건은 표준 전략을 사용하여 최적화되었으며, 온도, 단백질 농도, 낙하 비 등과 같이 결정화에 결정적으로 영향을 미치는 매개 변수를 체계적으로 다양하게 변경했다. 이러한 조건은 체계적으로 변화하는 pH 또는 침전제 농도에 의해서도 개량되었다.
최종 결정화 조건:
30%w/v PEG 4K
0.24 M LiSO4
0.1 M Tris pH=8.50
0.35 M NaBr
데이터 수집 및 처리. 결정을 급속 냉동하고 100 K의 온도에서 측정했다. X-선 회절 데이터는 극저온 조건을 사용하여 SWISS LIGHT SOURCE(SLS, 스위스 빌리겐 소재)에서 리간드 DARPin® 단백질(SEQ ID NO: 3)에 결합된 hCD40의 복합 결정으로부터 수집되었다. 결정은 공간 그룹 C 2에 속한다. 데이터는 프로그램 autoPROC, XDS 및 autoPROC, AIMLESS를 사용하여 처리되었다. DARPin® 단백질에 대한 데이터 수집 및 처리 통계는 아래 표 13에 나열되어 있다.
[표 13]
Figure pct00015
구조 모델링 및 리파인먼트. 구조를 결정하고 분석하는 데 필요한 위상 정보는 분자 교체를 통해 수득하였다. 이전에 해결된 hCD40의 구조를 검색 모델로 사용했다. 후속 모델 구축 및 리파인먼트는 각각 COOT 및 소프트웨어 패키지 CCP4를 사용하는 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 최종 모델의 정확성을 교차 검증하는 척도인 자유 R-인자 계산을 위해 측정된 반사의 약 4.9%가 리파인먼트 과정에서 제외되었다(하기 표 14 참조). TLS 리파인먼트(REFMAC5, CCp4 사용)가 수행되어 전자 밀도 맵의 R-인자가 낮아지고 품질이 높아졌다. 자동으로 생성된 로컬 NCS 구속이 적용되었다(최신 REFMAC5 버전의 키워드 "ncsr local"). 해당 라이브러리 파일의 리간드 매개변수화 및 생성은 GRADE(Global Phasing Limited)를 사용하여 수행되었다. 물 모델은 REFMAC5로 윤곽이 3.0인 Fo-Fc 맵의 피크에 물 분자를 배치하고 COOT의 검증 도구로 모든 물을 확인함으로써 COOT의 "물 찾기(Find waters)" 알고리즘으로 구축되었다. 의심스러운 물 목록의 기준은 다음과 같았다: B-인자 80 Å2 초과, 2Fo-Fc 맵 1.2 σ 미만, 가장 가까운 접촉 거리 2.3 Å 미만 또는 3.5 A 이상. 의심스러운 물 분자와 리간드 결합 부위(리간드까지의 거리 10 Å 미만)에 있는 물 분자를 수동으로 확인했다. 최종 모델의 라마찬드란 플롯은 가장 선호되는 영역에서 모든 잔류물의 92.2%, 추가 허용된 영역에서 7.8%, 관대하게 허용된 영역에서 0.0%를 보여준다. 허용되지 않는 영역에서 잔류물이 발견되지 않는다(표 14). 최종 구조 및 리파인먼트 과정의 통계는 아래 표 14에 나열되어 있다.
[표 141]
Figure pct00016
결과
구조는 2.29 Å의 최종 분해능으로 해결되고 정제되었다. X-선 결정학을 사용한 구조 분석은 DARPin® 단백질(SEQ ID NO: 3)이 CD40 수용체(SEQ ID NO: 51)의 시스테인-풍부 도메인(CRD) 1(아미노산 23-59)에 결합하고 CD40 리간드(CD40L)의 결합 부위 반대편 한쪽에서 CD40 수용체에 결합하여 DARPin 단백질과 CD40L 사이에 직접적인 결합 부위 경쟁이 없음을 나타낸다(도 21a 및 도 21b). CD40 수용체의 CRD1 도메인은 세포막에서 멀리 떨어져 있다.
강력한 CD40 작용제 항체가 CD40 수용체의 막 말단 에피토프에 결합하는 것으로 보고되었다(문헌[Yu et al., Cancer Cell 33, 664-675 e664 (2018)]). 유사하게, 본 실시예에 기술된 X-선 결정학 연구는 CD40-특이적 결합 단백질(SEQ ID NO: 3)이 세포막에서 멀리 떨어져 있는 CD40 수용체의 CRD1과 상호작용한다는 것을 보여주었다. CD40 작용제 항체에 대해 이미 제안된 바와 같이, 더 많은 세포막-원거리 에피토프는 덜 입체적 장애를 야기할 수 있고, 로컬라이저 분자(예컨대 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질)를 포함하는 CD40-특이적 결합 단백질에 더 잘 접근할 수 있게 하고 더 효율적인 클러스터링을 가능하게 하여 결과적으로 CD40 수용체의 더 효율적인 활성화를 가능하게 한다. 또한, CD40 특이적 결합 단백질(SEQ ID NO: 3)과 CRD1 사이의 상호작용 영역은 CD40L의 결합 부위와 반대인 것으로 나타났으며, 이는 본 발명의 결합 단백질과 CD40L 사이에 직접적인 결합 경쟁이 없음을 시사한다. CD40L에 대해 경쟁하지 않는 화합물은 리간드와 부가적 또는 상승적 효과를 가질 수 있어 수용체의 더 나은 활성화를 야기할 수 있다(예를 들어, 문헌[Yu et al., loc. cit.]; 문헌[Challa et al., Allergy 54, 576-583 (1999)]; 문헌[Pound et al., Int Immunol 11, 11-20 (1999)] 참조).
본 명세서는 명세서 내에서 인용된 참고 문헌의 가르침에 비추어 가장 철저하게 이해된다. 명세서 내의 실시형태는 본 발명의 실시형태의 예시를 제공하며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당업자는 많은 다른 실시형태가 본 발명에 포함된다는 것을 쉽게 인식한다. 본 개시내용에 인용된 모든 간행물, 특허 및 GenBank 서열은 그 전체가 참고로 포함된다. 참조로 포함된 자료가 이 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 경우 명세서는 이러한 자료를 대체할 것이다. 본원에서 참조의 인용은 이러한 참조가 본 발명에 대한 종래 기술임을 인정하는 것이 아니다.
당업자는 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 균등물을 일상적인 실험을 통해서만 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음 실시형태에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Molecular Partners AG <120> MULTISPECIFIC PROTEINS <130> AD1389 PCT S3 <150> EP 20 17 4847.2 <151> 2020-05-14 <150> EP 20 18 1498.5 <151> 2020-06-22 <160> 67 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal HSA binding domain <400> 1 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 2 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 2 Asp Leu Gly Lys 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sequence <400> 21 Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly 1 5 10 15 His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 20 25 <210> 22 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal Capping sequence <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 22 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Ala Asp Xaa Ala Ala Arg Xaa Gly 1 5 10 15 His Gln Xaa Ile Ala Xaa Val Leu Gln Xaa Ala Ala 20 25 <210> 23 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <400> 23 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Ile Val Xaa Val Leu Leu Xaa Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 24 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa is selected from the group consisting of asparagine, histidine, or tyrosine <400> 24 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 25 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <400> 25 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Xaa Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 26 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <400> 26 Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 27 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid, preferably not cysteine, glycine, or proline <400> 27 Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Xaa Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 28 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 28 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Gln Gly 100 105 110 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 29 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 29 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Gln Gly 100 105 110 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 30 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 30 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Gln Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 31 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 31 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Gln Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 32 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 32 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Gln Gly 100 105 110 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 33 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 33 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Gln Gly 100 105 110 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 34 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 34 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Gln Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 35 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 35 Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Val Ala Ala Leu Tyr Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Gln Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Lys Ala Ala Leu Gln Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Glu Arg Gly His Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Arg Phe Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Gln Lys Gly Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu Trp Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 115 120 <210> 36 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 36 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Glu Val Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln Ile Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asn Arg Trp Gly Val Thr Pro Leu His Val Ala Ala Trp Val Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp Gln Gln Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Arg Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 37 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 37 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Glu Trp Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Arg Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Thr His Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Val Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp Tyr Leu Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Lys Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Glu Asp Ile Val Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 38 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP binding domain <400> 38 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Gln Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 39 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA binding domain <400> 39 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 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His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 115 120 125 <210> 42 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA binding domain <400> 42 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala 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Leu Glu Ala Ala 145 150 155 160 Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala 165 170 175 Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala 180 185 190 Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 195 200 205 Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu 210 215 220 Ala Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 225 230 235 240 Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp 245 250 255 Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys 260 265 270 Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro 275 280 285 Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu 290 295 300 Leu Val Ala Ala Leu Tyr Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu 305 310 315 320 Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Gln Trp Gly Leu Thr Pro 325 330 335 Leu His Lys Ala Ala Leu Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu 340 345 350 Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly His Thr 355 360 365 Pro Leu His Trp Ala Ala Arg Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val 370 375 380 Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Gln Lys Gly Tyr 385 390 395 400 Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu 405 410 415 Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro 420 425 430 Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu 435 440 445 Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val 450 455 460 Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Trp 465 470 475 480 Gly Phe Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Glu Ser Gly His Leu Glu Ile 485 490 495 Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val 500 505 510 Gln Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ala His Ser Gly His Leu Glu 515 520 525 Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 530 535 540 Phe Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ser Gly His Leu 545 550 555 560 Glu Ile Val Glu Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln 565 570 575 Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His 580 585 590 Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro 595 600 605 Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro 610 615 620 Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly 625 630 635 640 Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 645 650 655 Ala Lys Asp Thr Trp Gly Phe Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Glu Ser 660 665 670 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 675 680 685 Asn Ala Lys Asp Val Gln Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ala His 690 695 700 Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 705 710 715 720 Val Asn Ala Lys Asp Phe Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 725 730 735 Trp Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala 740 745 750 Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala 755 760 765 Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 770 775 780 <210> 66 <211> 669 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding protein <400> 66 Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Val Ala Ala Leu Tyr Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Lys Ala Ala Leu Gln Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Arg Gly His Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Arg Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Gln Lys Gly Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala 145 150 155 160 Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala 165 170 175 Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Trp Gly Phe Thr Pro Leu His Ile Ala 180 185 190 Ala Glu Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 195 200 205 Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Gln Gly Arg Thr Pro Leu His Ile 210 215 220 Ala Ala His Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 225 230 235 240 Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Arg Gly Trp Thr Pro Leu His 245 250 255 Leu Ala Ala Trp Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Ile Leu Leu Lys 260 265 270 Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala 275 280 285 Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln 290 295 300 Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 305 310 315 320 Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys 325 330 335 Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu 340 345 350 Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Trp Gly Phe Thr 355 360 365 Pro Leu His Ile Ala Ala Glu Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val 370 375 380 Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Gln Gly Arg 385 390 395 400 Thr Pro Leu His Ile Ala Ala His Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu 405 410 415 Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Arg Gly 420 425 430 Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ser Gly His Leu Glu Ile Val 435 440 445 Glu Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser 450 455 460 Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile 465 470 475 480 Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr 485 490 495 Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser 500 505 510 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp 515 520 525 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 530 535 540 Thr Trp Gly Phe Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Glu Ser Gly His Leu 545 550 555 560 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 565 570 575 Asp Val Gln Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ala His Ser Gly His 580 585 590 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 595 600 605 Lys Asp Phe Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ser Gly 610 615 620 His Leu Glu Ile Val Glu Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 625 630 635 640 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala 645 650 655 Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 660 665 <210> 67 <211> 636 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding protein <400> 67 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala 145 150 155 160 Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala 165 170 175 Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala 180 185 190 Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 195 200 205 Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu 210 215 220 Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 225 230 235 240 Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp 245 250 255 Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys 260 265 270 Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro 275 280 285 Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu 290 295 300 Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu 305 310 315 320 Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Leu Gly Ser Thr Pro 325 330 335 Leu His Leu Ala Ala Trp Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu 340 345 350 Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ile Glu Gly Arg Thr 355 360 365 Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val 370 375 380 Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Tyr Gly Phe 385 390 395 400 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu 405 410 415 Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly 420 425 430 Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala 435 440 445 Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 450 455 460 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp 465 470 475 480 Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu 485 490 495 Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr 500 505 510 Leu Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Glu Gly His Leu Glu 515 520 525 Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 530 535 540 Ile Glu Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Val Gly His Leu 545 550 555 560 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 565 570 575 Asp Ala Tyr Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Ser Gly His 580 585 590 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 595 600 605 Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly 610 615 620 His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 625 630 635

Claims (15)

  1. 재조합 단백질로서,
    혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, CD40에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 및 CD40에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인을 포함하며,
    상기 안키린 반복 도메인들은 N-말단에서 C-말단으로 하기 식: (혈청 알부민 결합 도메인) - (FAP-결합 도메인) - (CD40 결합 도메인) - (CD40 결합 도메인)에 따라 배열되는, 재조합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 CD40 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD40 결합 도메인 각각은 독립적으로 위치 8에 Q, 위치 15에 L, 위치 143에 R, 및 위치 147에 Q를 포함하고, 상기 위치 번호는 SEQ ID NO: 3의 위치에 상응하는, 재조합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단에서 C-말단으로 하기 식: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인) - (링커) - (CD40 결합 도메인)을 포함하며, 링커는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하고/결합하거나, 상기 CD40 결합 도메인 각각은 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 CD40에 결합하고/결합하거나, 상기 혈청 알부민 결합 도메인은 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
  8. SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질로서, 상기 재조합 단백질은 100 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 CD40 및 인간 혈청 알부민에 결합하고, 바람직하게는 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 시험관 내 인간 B 세포 활성화 검정에 의해 평가될 때 약 0.01 nM 내지 약 10 nM의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 갖는, 재조합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, FAP에 대한 상기 단백질의 결합이 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 넘게 억제하지 않는, 재조합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 단백질 또는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 안키린 반복 도메인을 코딩하는 핵산.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 단백질 또는 제11항의 핵산, 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 제11항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서, 상기 재조합 단백질이 발현되는 조건 하에서 제13항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 의학적 병태를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 단백질, 제11항의 핵산, 또는 제12항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체, 바람직하게는 인간에게 투여하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 의학적 병태는 암이고, 바람직하게는 상기 암은 고형 종양인, 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020399230A1 (en) 2019-12-11 2022-06-23 Molecular Partners Ag Recombinant peptide-MHC complex binding proteins and their generation and use
EP3957649A1 (en) 2020-08-18 2022-02-23 Athebio AG Improved n-terminal capping modules of ankyrin repeat domains
US11981710B2 (en) 2020-08-18 2024-05-14 Athebio Ag N-terminal capping modules of ankyrin repeat domains
MX2023010543A (es) 2021-03-09 2023-10-13 Molecular Partners Ag Ligadores multiespecificos de celulas t novedosos basados en darpin.
WO2023110983A1 (en) * 2021-12-14 2023-06-22 Molecular Partners Ag Designed repeat domains with dual binding specificity and their use

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
JP2010539915A (ja) 2007-09-24 2010-12-24 ユニバーシティ・オブ・チューリッヒ 設計されたアルマジロリピートタンパク質
JP5954990B2 (ja) 2008-11-03 2016-07-20 モレキュラー・パートナーズ・アーゲーＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ａｇ Ｖｅｇｆ−ａレセプター相互作用を阻害する結合タンパク質
EP2483316A1 (en) 2009-10-02 2012-08-08 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Anti-fibroblast activation protein antibodies and methods and uses thereof
AR081361A1 (es) 2010-04-30 2012-08-29 Molecular Partners Ag Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a
CA2818990C (en) 2010-11-26 2021-06-15 Molecular Partners Ag Designed repeat proteins binding to serum albumin
BR112014032316A2 (pt) 2012-06-28 2017-06-27 Molecular Partners Ag proteínas de repetição de anquirina projetadas que se ligam ao fator de crescimento derivado de plaqueta
EP2738180A1 (en) 2012-11-30 2014-06-04 Molecular Partners AG Binding proteins comprising at least two binding domains against HER2.
WO2014191574A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Molecular Partners Ag Designed ankyrin repeat proteins binding to hepatocyte growth factor
ES2953482T3 (es) 2015-04-02 2023-11-13 Molecular Partners Ag Dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica
MX2019003298A (es) 2016-09-22 2019-09-26 Molecular Partners Ag Proteinas de union recombinantes y sus usos.
CA3053358A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
KR20210069675A (ko) * 2018-10-01 2021-06-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-fap 클론 212를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자

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