JP2023523794A - 人工操作免疫グロブリン - Google Patents

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Abstract

本発明は、人工操作免疫グロブリン又はその断片並びにそれらの調製方法及び使用を提供する。人工操作免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１に由来し、Ｆｃアルファ受容体結合能を付与するように人工操作された。さらに、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片は、Ｆｃガンマ受容体及び／又はＦｃＲｎへの結合を保持し得る。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２１年４月９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＰＡＴ０５８７３６－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズが９７５Ｋバイトである。
本発明は、好中球の動員を促進する改変を含む人工操作免疫グロブリン及びその断片並びにそれらの調製方法に関する。人工操作免疫グロブリン及びその断片は、腫瘍、特に固形腫瘍の処置において有用であり得る。
目下、全ての臨床的に承認された抗体は、免疫グロブリンＩｇＧアイソタイプを含む。抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を認識し、それに結合するＩｇＧ抗体により媒介される腫瘍細胞殺傷のための重要な機序である。しかしながら、高い腫瘍負荷を有する患者においては再発が生じ得、ＩｇＧ抗体治療薬は有効性を損失し得る。これは主に腫瘍及び宿主関連因子に起因するが、標的との相互作用の変更、細胞生存経路間のクロストーク、及び抗アポトーシスタンパク質の関与を伴い得る（Ｒｅｓｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９）ＭＡＢＳ．，１（３）：２２２－９）。ＩｇＡは、骨髄エフェクター細胞、例えば、好中球及び腫瘍常在性骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）により発現されるＦｃアルファ受容体（ＦｃαＲ）をエンゲージすることにより抗体療法のための代替的アイソタイプを表す。ＩｇＡは、ヒト血清中でＩｇＧに次いで２番目に最も豊富な免疫グロブリンであり；単量体ＩｇＡアロタイプ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の両方がヒト血清免疫グロブリンの最大２５％を占める。かつて、好中球は一般に潜在的なエフェクター細胞とみなされなかった。しかしながら、好中球は循環白血球の最も豊富な集団であり、固形腫瘍に浸潤することも示されている（Ｇｒｅｇｏｒｙ ＆ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７１：２４１１－１６；Ｖｏｇｔ Ｓｉｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎ．，８（３）：１２５－５８；Ｕｒｉｂｅ－Ｑｕｅｒｏｌ ＆ Ｒｏｓａｌｅｓ（２０１５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ：９８３６９８；Ｒｏｓａｌｅｓ（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９：１１３）。ＭＤＳＣも骨髄系統に由来し、最も多い免疫抑制細胞タイプの１つである。ＩｇＡ抗体は、好中球及びＭＤＳＣの動員とそれによるＡＤＣＣの向上により腫瘍細胞を有効に殺傷することが示されている。残念ながら、治療薬としてのＩｇＡ抗体の使用は、いくつかの不利益及び制限、例えば、低い発現収量及び高価な精製スキームにより妨げられる。さらに、産生は不均質グリコシル化を被る。ＩｇＡは、グリカン不均質性に感受性であり得る複数のグリコシル化部位を有する。単量体ＩｇＡについての一過的発現レベルは、ヒトＩｇＡ１について３０～７０μｇ／Ｌで報告されている（Ｌｏｍｂａｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）ＭＡＢＳ，１１：１１２２－３８；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）ＭＡＢＳ，８：８７－９８）。
したがって、好中球を動員してＡＤＣＣを向上させることによる腫瘍細胞殺傷の有効な方法が必要とされ続けている。本発明者らは、免疫グロブリンＩｇＧ Ｆｃ領域を人工操作してＦｃγＲ及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）に結合して好中球、ＭＤＳＣの動員及びＡＤＣＣの向上により腫瘍細胞殺傷を生じさせ得るＩｇＧを開発した。
本発明は、Ｆｃ領域がＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）に結合し得るような改変Ｆｃ領域を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンに関する。この特性を有するＩｇＧ１免疫グロブリンを生成するため、ＦｃαＲＩへの結合に重要なＩｇＡ免疫グロブリン中の特異的アミノ酸残基及びアミノ酸残基のストレッチを同定するためのタンパク質人工操作方針を設計した。本発明者らが実施した大規模タンパク質人工操作作業は、実施例に説明される。最初に、ＩｇＡ抗体へのＩｇＧ１定常ドメインの段階的な移行を実施し、次いでＩｇＧ１／ＩｇＡヒンジ置き換えを行った。この後、ＩｇＧ１及びＩｇＡ１ Ｆｃ領域の結晶構造分析を行い、それはＩｇＡ Ｆｃ／ＦｃαＲＩ相互作用に関与するＩｇＡ残基と構造的に同等のＩｇＧ１残基の同定をもたらした。ＩｇＧ１ ＣＨ２／ＣＨ３エルボーの長さも、ＩｇＡのものに対応するように短縮した。合理的設計の後続の使用は、ＩｇＧ１残基をＩｇＡからの対応する残基で置換するためのＩｇＧ１のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン中の種々のアミノ酸残基の改変をもたらした。半合理的設計及びドメイン切断を使用してＩｇＧ１ ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの人工操作をさらにリファインした。
したがって、第１の態様において、本発明は、ＦｃαＲＩ機能を動員し得る人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。本開示において、「人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン」という用語は、野生型ＩｇＧ１免疫グロブリンと比較して少なくとも１つのアミノ酸残基が改変されているＩｇＧ１アイソタイプの天然に生じない免疫グロブリンを指す。一実施形態において、本開示は、第１及び第２のＦｃドメインを含むＦｃ領域を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片であって、第１のＦｃドメインは、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、第１のＦｃドメインは、野生型ＩｇＧ１からのＦｃドメイン（アミノ酸ＣＨ２－１．６～ＣＨ３－１２５（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）、配列番号１のアミノ酸２３１～４４５（ＥＵナンバリング）と同等）と少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性を有し、ヒトＦｃαＲＩに結合し、それを活性化させる人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片を提供する。例えば、第１のＦｃドメインは、野生型ＩｇＧ１からのＦｃドメインと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。一実施形態において、第１のＦｃドメインは、野生型ＩｇＧ１からのＦｃドメインと少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有する。好ましい実施形態において、第１のＦｃドメインは、野生型ＩｇＧ１からのＦｃドメインと少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有する。
ＦｃαＲＩへの人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの結合は、ＫＤにより測定される結合親和性、若しくは他のＦｃ受容体と比べたＦｃαＲＩに対する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの選択性により、又は野生型ＩｇＧ１免疫グロブリンと比較したＦｃαＲＩへの競合結合により定義することができる。
本開示の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンによるＦｃ受容体、例えば、ＦｃαＲＩ又はＦｃγＲの活性化は、例えば、エフェクター細胞、例えば、多形核細胞（ＰＭＮ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する細胞殺傷アッセイにおいてＡＤＣＣのレベルを測定することにより評価することができる。ＰＭＮを使用して人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンのアルファエフェクター機能を特徴付けすることができる一方、ＰＢＭＣを使用してガンマエフェクター機能を特徴付けすることができる。細胞殺傷アッセイは、様々な細胞系、例として、ＳＫ－ＢＲ－３、Ｃａｌｕ－３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３又はＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞を使用して実行することができる。
本明細書において定義されるとおり、Ｆｃドメインは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。改変された第１の及び／又は改変された第２のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン中若しくはＣＨ３ドメイン中又はＣＨ２及びＣＨ３ドメイン中の両方の改変を含み得る。改変は、付加又は挿入、欠失又は置換を含み得る。好ましくは、改変は置換であり、第１のＦｃドメイン中のアミノ酸改変は、ＩｇＡのＦｃドメイン、例えば、野生型ＩｇＡ１のＦｃドメイン（配列番号２５４）、野生型ＩｇＡ２のＦｃドメイン（配列番号２のアミノ酸ＣＨ２－１．２～ＣＨ３－１２５（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング））、ＩｇＡ２のｍ２アロタイプのＦｃドメイン（配列番号３のアミノ酸ＣＨ２－１．２～ＣＨ３－１２５（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）；Ｌｏｍｂａｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）ＭＡＢＳ，１１：１１２２－３８；本明細書において「親ＩｇＡ２」と称される）又はＩｇＡ１若しくはＩｇＡ２中の親和性成熟バリアントＦｃドメイン中のアミノ酸に対応する置換である。２つ以上の配列間の対応するアミノ酸は、当技術分野において公知の及び以下に詳述される方法に従って配列をアラインすることにより決定することができる。
アミノ酸改変は、任意選択で、未改変又は野生型Ｆｃドメインに対して１つ以上の最適化された特性を提供するが、一部の例においてバリアントは未改変又は野生型Ｆｃドメインと実質的に同一の生物学的特性を示す。最適化することができる特性としては、限定されるものではないが、Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃαＲＩへの結合が挙げられる。ＦｃαＲＩへの結合は、ＦｃαＲＩに対する親和性の向上又は低減により実証されるとおり向上させ、又は低減させることができる。一実施形態において、本発明の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、向上したヒトＦｃαＲＩに対する親和性を有するように最適化される。ＦｃαＲＩの活性化は、食作用又は細胞毒性細胞を刺激してＡＤＣＣの機序により微生物、又は感染細胞を破壊し、したがって人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、野生型ＩｇＧ１免疫グロブリンと比較して改善されたＡＤＣＣを有し得る。このような最適化特性は、ヒトにおいて向上した治療特性、例えば、向上したエフェクター機能及びより大きい抗癌効力を有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片を提供することが予測される。
「ＩｇＡ１又はＩｇＡ２の親和性成熟バリアントＦｃドメイン」は、本明細書においてＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメイン中のアミノ酸改変を含むＦｃドメインと定義される。アミノ酸改変は、任意選択で、非親和性成熟バリアントＦｃドメインに対して１つ以上の最適化された特性を提供するが、一部の例においてバリアントは非親和性成熟バリアントＦｃドメインと実質的に同一の生物学的特性を示す。最適化することができる特性としては、限定されるものではないが、ＦｃαＲＩへの結合が挙げられる。ＦｃαＲＩへの結合は、ＦｃαＲＩに対する親和性の向上又は低減により実証されるとおり向上させ、又は低減させることができる。一実施形態において、本発明の親和性成熟バリアントＦｃドメインは、向上したヒトＦｃαＲＩに対する親和性を有するように最適化される。一実施形態において、ＦｃバリアントのＦｃドメインは親和性成熟されており、それによりアミノ酸改変は、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン中で作製されてＦｃ領域のその標的ＦｃαＲＩへの結合を向上させる。このようなタイプの改変は、標的抗原への結合についての会合及び／又は解離キネティクスを改善し得る。この最適化特性は、ヒトにおいて向上した治療特性、例えば、向上したエフェクター機能及びより大きい抗癌効力を有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片を提供することが予測される。
一実施形態において、改変された第１及び第２のＦｃドメインを含むＦｃ領域を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片はホモ二量体として発現され、第１及び第２のＦｃドメインは同じである。ＦｃαＲＩへのＦｃ領域ホモ二量体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴を使用して測定し、ＦｃαＲＩに対する野生型ＩｇＡの結合親和性（ＫＤ）と類似することが見出された。本明細書において試験されるとおり、ＦｃαＲＩについての親ＩｇＡ２の結合親和性（ＫＤ）は約２Ｅ－０７Ｍ～約６Ｅ－０７Ｍであることが見出され、本開示の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの結合親和性は約２Ｅ－１０Ｍ～約３．５Ｅ－０６Ｍであることが見出された（表２３、２４及び４７参照）。一実施形態において、本開示の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、親ＩｇＡ２と同等の親和性で、又は親ＩｇＡ２と比べて少なくとも約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、約１００倍若しくは約１０００倍だけ改善された親和性でＦｃαＲＩに結合する。
本開示の一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片は、以下の配列：配列番号９９～１２３、１４６～１４９、１６５～１８１から選択され、それに含まれるＦｃドメインを含み得る。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片は、配列番号１２２内に含まれるＦｃドメインを含む。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片は、配列番号１４８内に含まれるＦｃドメインを含む。
しかしながら、ＦｃαＲＩ結合特性を付与するための本開示のＩｇＧ１免疫グロブリンの人工操作は、ＦｃＲｎへの結合の損失をもたらした。したがって、ＦｃＲｎ結合に重要な野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン中のアミノ酸残基を決定するための試験を実施した。ＩｇＡ２抗体へのこれらの残基の移行は、ＦｃＲｎ結合を回復させることが見出された。一実施形態において、本開示は、ヒトＦｃαＲＩに結合し、それを活性化させ、ヒトＦｃＲｎにも結合する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。好ましい実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、野生型ＩｇＧ１と同等の親和性でヒトＦｃＲｎに結合する。
ＦｃαＲＩ結合特性を付与するための本開示のＩｇＧ１免疫グロブリンの人工操作は、ＦｃγＲに結合し、ガンマエフェクター機能を動員する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの能力に対する効果も有した。したがって、ＩｇＡ残基をＩｇＧ１からの対応する残基で置換し、ＣＨ２ドメインへの追加のアミノ酸改変Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ／Ｓ＿ＣＨ２．３＿Ｄ及びＩ＿ＣＨ２．１１７＿Ｅ（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング；「ＳＤＩＥ」突然変異）を作製する試験を実施した。一実施形態において、本開示は、ＦｃαＲＩ、ＦｃγＲＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａに結合する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片は、配列番号１４８内に含まれるＦｃドメインを含む。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片は、配列番号１５２内に含まれるＦｃドメインを含む。
上記実施形態の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、ホモ二量体として構築した。したがって、Ｆｃα及びＦｃγエフェクター機能の両方を親ＩｇＡ又は野生型ＩｇＧ１と同等のレベルに維持することが困難であった。これに対処するため、異なる結合特性を有するＦｃドメインを利用して人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンをヘテロ二量体として構築した。したがって、第２の態様において、本発明は、親ＩｇＡ及び野生型ＩｇＧ１と同等の又はそれと比べて改善された親和性でＦｃαＲＩ、ＦｃＲｎ及びＦｃγ受容体に結合する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、本開示は、ＦｃαＲＩに結合するように人工操作された第１のＦｃドメインと、Ｆｃγ受容体及びＦｃＲｎに結合するための野生型ＩｇＧ１のアミノ酸配列を含む第２のＦｃドメインとを含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。或いは、第２のＦｃドメインは、ＩｇＡに由来するＣＨ２のトップ上に空間的に位置する残基、例えば、パックされたトップループ及びジスルフィド結合を含み；しかしながら、この実施形態ではＦｃγＲはもはや動員されず、ＦｃＲｎ結合を回復させるための追加の突然変異、例えば、「ＬＳ」又は「ＹＴＥ」突然変異（以下により詳細に記載）が望まれる。
人工操作免疫グロブリンの発現時の正確なヘテロ二量体対合を確保するため、突起及び対応する空洞を作出するための突然変異を第１及び第２のＦｃドメインに導入した。このような「ノブイントゥホール」突然変異は、当技術分野において記載されている（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６７７－６８１）。一実施形態において、本開示は、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、第１のＦｃドメインは、「ノブ」を導入するためのアミノ酸突然変異Ｔ３３６Ｗ及びＳ３５４Ｃ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｗ及びＳ＿ＣＨ３．１０＿Ｃを含み、第２のＦｃドメインは、「ホール」を導入するためのアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ／Ｙ＿ＣＨ３．５＿Ｃ、Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｓ、Ｌ＿ＣＨ３．２４＿Ａ及びＹ＿ＣＨ３．８６＿Ｖ（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、第１のＦｃドメインは、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１５４、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３又は１６４内に含まれるＦｃドメインを含み得る。一実施形態において、第２のＦｃドメインは、配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１５５、１５６、１５７又は１５８内に含まれるＦｃドメインを含み得る。ＦｃＲｎへの人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの結合をさらに改善するため、追加の突然変異、例えば、「ＬＳ」突然変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ／Ｍ＿ＣＨ３．１０７＿Ｌ及びＮ＿ＣＨ３．１１４＿Ｓ（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）並びに／又は「ＹＴＥ」突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ／Ｍ＿ＣＨ２．１５．１＿Ｙ、Ｓ＿ＣＨ３．１６＿Ｔ及びＴ＿ＣＨ２．１８＿Ｅ（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）をＦｃドメインに作製することができる。一実施形態において、第１のＦｃドメインは「ＬＳ」突然変異を含み、配列番号１５４又は１６２内に含まれるＦｃドメインを含み得る。別の実施形態において、第２のＦｃドメインは「ＹＴＥ」突然変異を含み、配列番号１６３内に含まれるＦｃドメインを含み得る。
本開示の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを最適に機能させるため、例えば、親ＩｇＡ及び野生型ＩｇＧ１と同等の又はそれらと比べて改善された親和性でＦｃαＲＩ、ＦｃＲｎ及びＦｃγ受容体に結合させるため、「ホール」を導入するためのアミノ酸改変は、ＦｃαＲＩへの結合及びその活性化のためのアミノ酸改変を含むＦｃドメイン中で作製される。一実施形態において、本開示は、ヒトＦｃγ受容体及びＦｃＲｎに結合し、「ノブ」を作出するためのアミノ酸突然変異を含む第１のＦｃドメインと、ヒトＦｃαＲＩに結合し、「ホール」を作出するためのアミノ酸突然変異を含む第２のＦｃドメインとを含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。別の実施形態において、第１のＦｃドメインは、完全なＦｃγＲエフェクター機能を回復させるための「ＬＳ」突然変異若しくは「ＳＤＩＥ」突然変異又はその両方をさらに含み得、例えば、第１のＦｃドメインは、配列番号１６１、１６２又は１６４内に含まれるＦｃドメインを含み得る。
本開示の一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、配列番号１５４、１５９、１６０、１６１又は１６２内に含まれるＦｃドメインから選択される第１のＦｃドメインと、配列番号１３７又は１５７内に含まれるＦｃドメインから選択される第２のＦｃドメインとを含む。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、配列番号１３７内に含まれる第１のＦｃドメインと、配列番号１５４内に含まれる第２のＦｃドメインとを含む。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、配列番号１５７内に含まれる第１のＦｃドメインと、配列番号１５９内に含まれる第２のＦｃドメインとを含む。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、配列番号１５７内に含まれる第１のＦｃドメインと、配列番号１６０内に含まれる第２のＦｃドメインとを含む。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、配列番号１５７内に含まれる第１のＦｃドメインと、配列番号１６１内に含まれる第２のＦｃドメインとを含む。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、配列番号１５７内に含まれる第１のＦｃドメインと、配列番号１６２内に含まれる第２のＦｃドメインとを含む。
本発明の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定した。以下の結合特性を有するように、得られる人工操作免疫グロブリンを生成した（表３７参照）：
ａ．親ＩｇＡ２様結合から親ＩｇＡ２よりも１０倍低い範囲のＦｃαＲＩ結合；
ｂ．親ＩｇＡ２様結合から１０倍低い範囲のＦｃαＲＩ結合、及びＦｃγ受容体への野生型ＩｇＧ１様結合；
ｃ．親ＩｇＡ２様結合から１０倍低い範囲のＦｃαＲＩ結合、及びＦｃＲｎへの野生型ＩｇＧ１様結合；
ｄ．親ＩｇＡ２様結合から１０倍低い範囲のＦｃαＲＩ結合、並びにＦｃγ受容体及びＦｃＲｎへの野生型ＩｇＧ１様結合。
ＦｃαＲＩへの本発明の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの結合親和性は、結合の改善に寄与することが親和性成熟により決定されたアミノ酸を含めることによりさらに向上させることができた。ＩｇＡ２ Ｆｃライブラリーを生成し、スクリーニングして親ＩｇＡ２と比較して向上したＦｃαＲＩ結合親和性をＩｇＡ２バリアントに付与するアミノ酸突然変異を同定した。これらの突然変異は、ＩｇＡ２中に取り込まれた場合にＦｃαＲＩへの結合を約２２５倍超、改善した。次いで、これらの突然変異を合理的設計により生成された人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン中に取り込んだ。これらの突然変異は、ＦｃαＲＩへのそれらの人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの結合を約１２００倍超だけ改善した。これは、ＩｇＡ２バリアントについてのＦｃαＲＩへの結合の顕著な改善であり、突然変異を人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン中に取り込んだ場合、ＦｃαＲＩへの結合がＩｇＡ２バリアントと比べて約５倍だけここでも改善したことが観察されたことは極めて驚くべきことであった。
本開示の一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、配列番号２５２内に含まれる第１のＦｃドメインと、配列番号１５９又は１６１内に含まれるＦｃドメインから選択される第２のＦｃドメインを含む。アミノ酸配列の配列番号２５２及び１５９からの第１及び第２のＦｃドメインを有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、それぞれ、ガンマエフェクター機能（すなわち、ＦｃγＲへの結合）が所望されない場合に好ましかった。アミノ酸配列の配列番号２５２及び１６１からの第１及び第２のＦｃドメインを有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、それぞれ、ガンマエフェクター機能（すなわち、ＦｃγＲへの結合）が所望される場合に好ましかった。
一実施形態において、本開示の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、ＣＨ２．１０、ＣＨ２．８９、ＣＨ２．９１、ＣＨ２．９４、ＣＨ２．９７、ＣＨ２．９９、ＣＨ３．４５、ＣＨ３．１０５、ＣＨ３．１０９、ＣＨ３．１１８及びＣＨ３．１２４からなる群から選択される位置におけるアミノ酸改変を含み、ナンバリングは、Ｃ－ドメインについてのＩＭＧＴナンバリングに従う。一実施形態において、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、位置ＣＨ２．９４、ＣＨ２．９７及びＣＨ３．４５におけるアミノ酸改変を含む。好ましい実施形態において、本開示の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、アミノ酸改変Ｑ＿ＣＨ２．９４＿Ｅ、Ｌ＿ＣＨ２．９７＿Ｙ及びＳ＿ＣＨ３．４５＿Ｄを含む。これらの人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、インビトロ細胞殺傷アッセイにおいて特徴付けされた場合、親人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン及び親ＩｇＡ２と比較してＰＭＮアッセイにおいて改善された殺傷特性を有することが示された。
この模式図は、ＩｇＡからＩｇＧへのアミノ酸残基の移行のために本出願において使用される合理的設計の全体的方針を示す。得られるＩｇＧ構造は、Ｆｃ領域の両方又は１つのＦｃドメイン中のＩｇＡからの残基を含有する。 図２：これらの模式図は、テールピースを有する（図２ａ）及びテールピースを有さない（図２ｂ）全長ＩｇＡ、ＩｇＧ１からＩｇＡへの定常ドメインＣＨ１（図２ｃ）及びヒンジ（図２ｄ）の移行、「ＣＨ２／ＣＨ３エルボー」領域（図２ｅ）、ＩｇＧ／ＩｇＡ ＣＨ２／ＣＨ２改変（図２ｆ）及びＩｇＧ／ＩｇＡ ＣＨ３／ＣＨ３改変（図２ｇ）の位置を示す。 図３：これらの模式図は、ＩｇＡ２／ＦｃαＲＩ相互作用に関与するアミノ酸残基のＩｇＧ１ Ｆｃ中への後続の移行のための、ＩｇＡ２／ＦｃαＲＩ相互作用に関与するアミノ酸残基位置を同定するために使用される半合理的設計をまとめる。改変は、ベータ鎖スキャニング（図３ａ、図３ｂ）及びドメイン切断（上面／下面、正面／側面）（図３ｃ～３ｇ）後に作製した。図３ｈ及び図３ｉは、それぞれ、間接的ＦｃαＲＩ結合に関与する残基を決定するためにＣＨ２及びＣＨ３ドメインに作製された改変を示す。 図４：これらの模式図は、ＩｇＡ残基を取り込むためにＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ２／ＣＨ３エルボー領域に改変が作製された人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン上の位置を説明する。図４ａはＩｇＡからのヒンジ領域も含む一方、図４ｂはＩｇＧ１からのヒンジ領域を含む。これらの人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、ＩｇＡ免疫グロブリンのＦｃαＲＩ結合能を保持した。 図５：これらの模式図は、ＦｃＲｎ結合（図５ａ）及びＦｃγＲ結合（図５ｂ）を回復させるために作製された改変のおよその位置を説明する。図５ａにおいて、ＦｃＲｎ結合を回復させるためにＩｇＧ１免疫グロブリンからの対応する残基で置き換えられたＩｇＡ免疫グロブリンＣＨ３ドメイン中のアミノ酸の位置を星印で示す。図５ｂにおいて、ＦｃγＲ結合を回復させるためにＩｇＧ１免疫グロブリンＣＨ２ドメインに作製されたＳＤＩＥ突然変異の位置を星印で示す。 図６：これらの模式図は、ｈＦｃαＲＩ、ＦｃＲｎ及びＦｃγＲ結合を有するように生成された人工操作ＩｇＧ１ヘテロ二量体免疫グロブリンをまとめる。全ての構築物は、ＬＳ突然変異（図６ａ、６ｃ及び６ｅ）の付加及び／又はＳＤＩＥ突然変異（図６ｄ及び６ｅ）の付加を有する「ノブイントゥホール」改変を有する。 図７：これらの模式図は、ＩｇＡの親和性成熟により生成された突然変異セットのおよその位置及び人工操作ＩｇＧ１ヘテロ二量体免疫グロブリンへのそれらの適用を示す。図７ａは、全長ＩｇＡ２免疫グロブリン中の突然変異の位置を示し、図７ｂ及び７ｃは、ＦｃαＲＩに結合し得るＩｇＧ１免疫グロブリン中への同じ突然変異セットの取り込みを示す。図７ｄは、ＩｇＡ２からの親和性成熟突然変異セットが適用された人工操作ＩｇＧ１ヘテロ二量体免疫グロブリンを模式的に示す。 この模式図は、ＩｇＡ及びＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメインの界面におけるＣＨ２／ＣＨ３エルボー領域の位置を示す。暗灰色＝ＩｇＧ（ＰＤＢ １ＦＣ１）／ＩｇＡ ＦＣ（ＰＤＢ １ＯＷＯ）の重複、淡灰色＝ＩｇＧ１（ＰＤＢ １ＦＣ１）／ＩｇＡ ＦＣ（ＰＤＢ １ＯＷＯ）ＣＨ２－ＣＨ３ヒンジの重複。矢印はエルボー領域を示す。 ＩｇＡ２ Ｆｃのこの模式図は、ＩｇＡ２ Ｆｃのトップ上に空間的に位置するジスルフィド結合及びパックされたループの位置を示す。 この図面は、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するホモ二量体リード候補物の細胞殺傷アッセイにおけるＰＭＮ細胞毒性に対する効果を示す。試験候補物は、以下の配列を有した：配列番号１１９（■）、配列番号１２０（▲）、配列番号１２２（▼）及び配列番号１２３（◆）。 この図面は、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＣａｌｕ－３細胞に対する配列番号１２２の配列を有するホモ二量体リード候補物（■）の細胞殺傷アッセイにおけるＰＭＮ細胞毒性に対する効果を示す。 この図面は、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））及び野生型ＩｇＧ１（配列番号１（■））と比較したＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する配列番号１２２の配列を有するホモ二量体リード候補物（▲）の食作用活性を示す。 図１３：この図面は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する配列番号１４８又は１５２の配列を有するホモ二量体リード候補物のＰＭＮ細胞毒性に対する効果を示す。図１３ａにおいて、配列番号１４８の配列を有する候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１３ｂは、増加濃度の配列番号１４８の配列を有する候補物（■）及び親ＩｇＡ２を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１３ｃにおいて、配列番号１５２の配列を有する候補物（◆）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１３ｄは、増加濃度の配列番号１５２の配列を有する候補物（■）及び親ＩｇＡ２を用いた特異的殺傷の割合を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図１４：この図面は、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＣａｌｕ－３細胞に対する配列番号１４８の配列を有するホモ二量体リード候補物（▲）のＰＭＮ細胞毒性を示す。図１４ａにおいてＰＭＮ殺傷アッセイにおける効果が示され、図１４ｂは増加濃度の候補物又は親ＩｇＡ２を用いた特異的殺傷の割合を示す。 （上記の通り。） 図１５：この図面は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する配列番号１４８又は１５２の配列を有するホモ二量体リード候補物のＰＢＭＣ細胞毒性を示す。図１５ａにおいて、配列番号１４８の配列を有する候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１５ｂは、増加濃度の配列番号１４８の配列を有する候補物（■）及び親ＩｇＡ２を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１５ｃにおいて、配列番号１５２の配列を有する候補物（◆）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１５ｄは、増加濃度の配列番号１５２の配列を有する候補物（■）及び親ＩｇＡ２を用いた特異的殺傷の割合を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） この図面は、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））及び野生型ＩｇＧ１（配列番号１（■））と比較したＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する配列番号１２２（▲）、配列番号１４８（▼）及び配列番号１５２（◆）の配列を有するホモ二量体リード候補物の食作用活性を示す。 図１７：この図面は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する配列番号１３７－１５４、１５７－１５９、１５７－１６０、１５７－１６１、１５７－１６２の配列を有する５つのヘテロ二量体リード候補物のＰＭＮ細胞毒性を示す。図１７ａにおいて、配列番号１３７－１５４の配列を有するヘテロ二量体候補物（◆）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１７ｂは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１７ｃにおいて、配列番号１５７－１５９の配列を有するヘテロ二量体候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１７ｄは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１７ｅにおいて、配列番号１５７－１６０の配列を有するヘテロ二量体候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１７ｆは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１７ｇにおいて、配列番号１５７－１６１の配列を有するヘテロ二量体候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１７ｈは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１７ｉにおいて、配列番号１５７－１６２の配列を有するヘテロ二量体候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１７ｊは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図１８：この図面は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する配列番号１３７－１５４、１５７－１５９、１５７－１６０、１５７－１６１、１５７－１６２の配列を有する５つのヘテロ二量体リード候補物のＰＢＭＣ細胞毒性を示す。図１８ａにおいて、配列番号１３７－１５４の配列を有するヘテロ二量体候補物（◆）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１８ｂは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１８ｃにおいて、配列番号１５７－１５９の配列を有するヘテロ二量体候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１８ｄは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１８ｅにおいて、配列番号１５７－１６０の配列を有するヘテロ二量体候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１８ｆは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１８ｇにおいて、配列番号１５７－１６１の配列を有するヘテロ二量体候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１８ｈは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。図１８ｉにおいて、配列番号１５７－１６２の配列を有するヘテロ二量体候補物（▼）の効果を、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））と比較したＰＭＮ殺傷アッセイにおいて示す。図１８ｊは、増加濃度の同じヘテロ二量体候補物（■）及び親ＩｇＡ２（●）を用いた特異的殺傷の割合を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） この図面は、親ＩｇＡ２（配列番号３（●））及び野生型ＩｇＧ１（配列番号１（■））と比較したＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する配列番号１３７－１５４（●）、１５７－１５９（■）、１５７－１６０（▲）、１５７－１６１（▼）及び１５７－１６２（◆）の配列を有する５つのヘテロ二量体リード候補物の食作用活性を示す。 この図面は、実施例６に記載のＡＤＣＣアッセイにおけるＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する配列番号１２２（■）、１４８（▲）、２０４（▼）、２０９（◆）及び２１４（
Figure 2023523794000002
）の配列を有する増加濃度のホモ二量体候補物並びに親ＩｇＡ２（配列番号３（●））のＰＭＮ細胞毒性を示す。それぞれのホモ二量体候補物の有効性（Ｅｍａｘ％）は以下のとおりであった：配列番号３：２５％、配列番号１２２：３２％、配列番号１４８：２７％、配列番号２０４：２８％、配列番号２０９：３５％及び配列番号２１４：３４％。
この図面は、実施例６に記載のＡＤＣＣアッセイにおけるＣａｌｕ－３細胞に対する配列番号１２２（■）、１４８（▲）、２０４（▼）、２０９（◆）及び２１４（
Figure 2023523794000003
）の配列を有する増加濃度のホモ二量体候補物、並びに親ＩｇＡ２（配列番号３（●））のＰＭＮ細胞毒性を示す。それぞれのホモ二量体候補物の有効性（Ｅｍａｘ％）は以下のとおりであった：配列番号３：４２％、配列番号１２２：４４％、配列番号１４８：４１％、配列番号２０４：７１％、配列番号２０９：７６％及び配列番号２１４：８１％。
この図面は、実施例６に記載のＡＤＣＣアッセイにおけるＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞に対する配列番号２１４の配列を有する増加濃度のホモ二量体候補物（
Figure 2023523794000004
）及び親ＩｇＡ２（配列番号３（●））のＰＭＮ細胞毒性を示す。配列番号３の配列を有するホモ二量体候補物についてのＥＣ５０値は２．４５ｎＭであり、配列番号２１４の配列を有するホモ二量体候補物についてのＥＣ５０値は０．３６ｎＭであった。
この図面は、実施例６に記載のＡＤＣＣアッセイにおけるＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞に対する配列番号２１４の配列を有する増加濃度のホモ二量体候補物（
Figure 2023523794000005
）及び親ＩｇＡ２（配列番号３（●））のＰＭＮ細胞毒性を示す。
図２４：この図面は、実施例６に記載のＡＤＣＣアッセイにおけるＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する増加濃度のヘテロ二量体候補物のＰＭＮ及びＰＢＭＣ細胞毒性を示す。図２４ａ及び２４ｂは、それぞれ親ＩｇＡ２（配列番号３（●）；図２４ａ）及び野生型ＩｇＧ１（配列番号１（●）；図２４ｂ）と比較した配列番号１５７－１５９（■）及び２５２－１５９（▲）の配列を有するヘテロ二量体候補物を示す。図２４ｃ及び２４ｄは、それぞれ親ＩｇＡ２（配列番号３（●）；図２４ｃ）及び野生型ＩｇＧ１（配列番号１（●）；図２４ｄ）と比較した配列番号１５７－１６１（▼）及び２５２－１６１（◆）の配列を有するヘテロ二量体候補物を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） この図面は、ＩｇＡ２及びＩｇＧ１の両方と比較した人工操作免疫グロブリンの熱安定性の全体的な改善を示す。配列番号１１９、１２０、１２２、１２３の配列の人工操作免疫グロブリン並びにそれらの親ＩｇＧ１及びＩｇＡ２（それぞれ配列番号１及び２）の個々のサーモグラムをＤＳＣ測定により得、重ねた。矢印は、モル熱容量（ｋＪ／ｍｏｌ Ｋ）として測定されたＩｇＧ１又はＩｇＡ２のＣＨ２の融解温度（ＴＭ）と比較したＣＨ２のＴＭの増加を表す。 この図面は、ＩｇＡ２と比較した人工操作免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインの両方の熱安定性の改善を示す。配列番号１２６、１２７、１２８、１２９の配列の人工操作免疫グロブリン並びにそれらの親ＩｇＡ２ Ｆｃ（配列番号１２５）の個々のサーモグラムをＤＳＣ測定により得、重ね、モル熱容量（ｋＪ／ｍｏｌ Ｋ）として測定した。個々のＣＨ２及びＣＨ３ドメインの融解温度（ＴＭ）を抜き出し、表４８に提示した。 この図面は、マウスにおけるＩｇＧ、ＩｇＡ及び人工操作免疫グロブリンの血清時間濃度プロファイルを示す。（◆）ＨＥＫ２９３Ｔからの配列番号１の配列を有する免疫グロブリン、（▲）ＨＥＫ２９３Ｔからの配列番号３の配列を有する免疫グロブリン、（●）ＨＥＫ２９３Ｔからの配列番号１５７－１５９の配列を有する人工操作免疫グロブリン、（ｘ）ＨＥＫ２９３Ｔからの配列番号２５２－１５９の配列を有する人工操作免疫グロブリンの血清中の濃度。 マウスにおけるＩｇＧ、ＩｇＡ及び糖人工操作免疫グロブリンの血清時間濃度プロファイル。（◆）ＣＨＯ－Ｓからの配列番号１の配列を有する免疫グロブリン、（▲）ＣＨＯ－Ｓからの配列番号３を有する免疫グロブリン、（ｘ）ＣＨＯ－Ｓからの配列番号２５２－１５９の配列を有する人工操作免疫グロブリン、（■）ＣＨＯ－Ｓからの配列番号２１２の配列を有する人工操作免疫グロブリン、（〇）ＣＨＯ－Ｓからの配列番号２５６の配列を有する人工操作免疫グロブリン、（□）ＣＨＯ－Ｓからの配列番号２５７の配列を有する人工操作免疫グロブリン、（●）ＣＨＯ－Ｓからの配列番号２５８の配列を有する人工操作免疫グロブリンの血清中の濃度。
改変ＩｇＧ１がＦｃα受容体に結合し、それによりアルファエフェクター機能を動員するような突然変異Ｆｃ領域を含む人工操作免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１又はその断片が本明細書において開示される。人工操作免疫グロブリンは、Ｆｃγ受容体への結合を介してＩｇＧエフェクター機能も動員し得る。さらに、人工操作免疫グロブリンはＦｃＲｎにも結合し得、したがって延長された半減期を有する。
定義
本開示をより容易に理解することができるように、ある用語は詳細な説明全体にわたり具体的に定義される。特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語などが配列（例えば、アミノ酸配列）に関して使用される全ての場合において、前記配列は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」、又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語などによっても限定され得ることを理解されたい。本明細書において使用されるとき、「本質的に～からなる」という語句は、方法又は組成物に含まれる活性医薬剤の属又は種、及び方法又は組成物の意図される目的に不活性である任意の賦形剤を指す。一部の態様において、「本質的に～からなる」という語句は、本開示の多重特異的結合分子以外の１つ以上の追加の活性剤の包含を明示的に排除する。一部の態様において、「本質的に～からなる」という語句は、本開示の多重特異的結合分子及び第２の同時投与薬剤以外の１つ以上の追加の活性剤の包含を明示的に排除する。
本明細書において使用されるとき、「抗体」という用語は、対応する抗原に非共有結合的に、可逆的に、及び特異的に結合し得る免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。それぞれの抗体の基礎的な機能単位は、本明細書において「Ｉｇ単量体」と定義される１つのＩｇ単位のみを含有する免疫グロブリン単量体である。分泌抗体は、２つのＩｇ単位を有する二量体（例えば、ＩｇＡ）、４つのＩｇ単位を有する四量体又は５つのＩｇ単位を有する五量体（例えば、哺乳類ＩｇＭ）でもあり得る。「抗体」という用語には、例えば、モノクローナル抗体（例として、免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体）が含まれる。Ｉｇ単量体は、４つのポリペプチド鎖；ジスルフィド結合により連結される２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖からなるＹ型分子である（Ｗｏｏｆ ＆ Ｂｕｒｔｏｎ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（２）：８９－９９）。それぞれの鎖は、それらのサイズ及び機能に従って２つのカテゴリー：可変又は定常に分類される約７０～１１０個のアミノ酸を含有する多数の構造ドメインを含む。重鎖は、１つの可変ドメイン（可変重鎖ドメイン；ＶＨと略記）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と略記）を含む。それぞれの軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬと略記）及び１つの定常ドメイン（ＣＬと略記）を含む。免疫グロブリンドメインは、２つのベータシートが保存システイン残基と他の荷電アミノ酸との間の相互作用により一緒に保持される「サンドイッチ」形を作出する特徴的な免疫グロブリンフォールドを有する。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存される領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変の領域にさらに下位分類することができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ酸末端からカルボキシ末端に配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、以下の順序である：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する抗原結合ドメイン又は抗原結合部位を含有する。
「抗体」という用語には、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例として、例えば、本開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体）が含まれる。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のものであり得る。
本明細書において使用される「単一特異的分子」という用語は、標的抗原上の１つのエピトープに結合する分子を指す。一部の実施形態において、本開示の単一特異的分子は、単一特異的抗体様分子である。一部の実施形態において、本開示の単一特異的分子は、単一特異的抗体である。「二重特異的分子」という用語は、２つの異なる抗原に結合する多重特異的結合分子を指す。一部の実施形態において、本開示の二重特異的分子は、二重特異的抗体様分子である。本明細書において使用される「多重特異的結合分子」という用語は、２つ以上の異なる抗原に結合する分子を指す。それぞれの抗原の認識は、一般に、「抗原結合ドメイン」を介して達成される。一部の実施形態において、本開示の多重特異的結合分子は、多重特異的抗体様分子、例えば、二重特異的抗体様分子である。
「抗原結合部位」という用語は、抗原、又はそのエピトープに結合する界面を形成する決定基を含む抗体の部分を指す。「抗原結合部位」という用語は、「抗原結合ドメイン」という用語と互換的に使用することができる。タンパク質（又はタンパク質模倣体）に関して、抗原結合部位は、典型的には、抗原ポリペプチドに結合する界面を形成する（少なくとも４つのアミノ酸又はアミノ酸ミミックの）１つ以上のループを含む。典型的には、抗体分子の抗原結合部位は、少なくとも１若しくは２つのＣＤＲ及び／若しくは超可変ループ、又はより典型的には、少なくとも３、４、５若しくは６つのＣＤＲ及び／若しくは超可変ループを含む。
本明細書において使用される「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は、ＶＬ及びＶＨの超可変領域を指す。ＣＤＲは、標的タンパク質に対する特異性を保有する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。それぞれのヒトＶＬ又はＶＨ中には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～３、Ｎ末端から連続してナンバリングされる）が存在し、可変ドメインの合計約１５～２０％を構成する。ＣＤＲは、それらの領域及び順序により称することができる。例えば、「ＶＨＣＤＲ１」又は「ＨＣＤＲ１」は、両方とも、重鎖可変領域の第１のＣＤＲを指す。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープに構造的に相補的であり、したがって結合特異性を直接担う。ＶＬ又はＶＨの残りのストレッチ、いわゆるフレームワーク領域はアミノ酸配列の少ないバリエーションを示す（Ｋｕｂｙ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置は、当技術分野において種々の公知の定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、及び組み合わせ定義（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０５－２０６；Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８８３；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９２）２２７：７９９－８１７；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０７－２０９；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－７４８及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ ＤＨＨＳ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎ°９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９参照）を使用して決定することができる。抗原結合部位の定義は、以下：Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１９－２２１；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２－７４５；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，８６：９２６８－９２７２；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０３：１２１－１５３；及びＲｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１－１７２にも記載されている。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームの組み合わせにおいて、一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、又はその両方の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えば、一部の実施形態において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば、哺乳類ＶＨ、例えば、ヒトＶＨ中のアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）；及びＶＬ、例えば、哺乳類ＶＬ、例えば、ヒトＶＬ中のアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）に対応する。ＩＭＧＴのもと、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基は、およそ２６～３５（ＣＤＲ１）、５１～５７（ＣＤＲ２）及び９３～１０２（ＣＤＲ３）とナンバリングされ、ＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基は、およそ２７～３２（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＣＤＲ３）とナンバリングされる（「Ｋａｂａｔ」に従うナンバリング）。ＩＭＧＴのもと、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎを使用して決定することができる。ＩＭＧＴツールは、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおいて利用可能である。
一実施形態において、抗体は、抗体の「抗原結合断片」を含む。このような断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるダイアボディ（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）ラクダ又はラクダ化可変ドメイン；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３参照）；（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体；（ｉｘ）ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価及び二重特異的）、及び（ｘ）全抗体又は組換えＤＮＡ技術を使用してデノボ合成されたものの改変により産生することができるキメラ（例えば、ヒト化）抗体が挙げられる。これらの機能的抗体断片は、それらのそれぞれの抗原又は受容体と選択的に結合する能力を保持する。これらの抗体断片は、当業者に公知の慣用の技術を使用して得られ、断片はインタクト抗体と同様に有用性についてスクリーニングされる。
哺乳類において、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）と呼ばれる２つのタイプの免疫グロブリン軽鎖が存在する。それぞれの抗体は常に同一の２つの軽鎖を含有し；哺乳類において軽鎖、κ又はλの１つのタイプのみが抗体ごとに存在する。軽鎖のおよその長さは２１１～２１７アミノ酸であり、それぞれの軽鎖は２つのドメイン、１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインを有する。
α、δ、ε、γ、及びμと示される５つのタイプの哺乳類Ｉｇ重鎖が存在し、抗体中に存在する重鎖のタイプが抗体のクラス又はアイソタイプ：ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥをそれぞれ定義する。重鎖は物理化学的、構造的、及び免疫学的特性が変動するが、それぞれの重鎖は２つのドメイン、可変ドメイン及び定常ドメインを有する。可変ドメインは単一のＩｇドメイン（およそ１１０アミノ酸長さ）を含み、抗体結合特異性を決定する。定常ドメインは同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体において異なる。重鎖γ、α及びδは、３つのタンデムＩｇドメインから構成される定常領域、及びフレキシビリティの付加のためのヒンジ領域を有し；重鎖μ及びεは、４つの免疫グロブリンドメインから構成される定常領域を有する（Ｗｏｏｆ ＆ Ｂｕｒｔｏｎ、前掲）。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」という用語と互換的に使用される。一実施形態において、免疫グロブリンの「その断片」は、Ｆｃ領域又は１つ以上のＦｃドメインであり得る。
ＩｇＧは、ヒト免疫グロブリンの７０～７５％を占める血液（血漿）中の最も豊富な抗体アイソタイプである。ＩｇＧは有害物質を解毒し、白血球及びマクロファージによる抗原－抗体複合体の認識において重要である。ＩｇＧは、ヒトにおいて４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４にさらに分類される。ＩｇＭは、通常、血液中を循環し、ヒト免疫グロブリンの約１０％を占める。ＩｇＭは、５つの基礎Ｙ型分子が一緒に結合している五量体構造を有する。Ｂ細胞は、微生物感染／抗原侵襲に応答して最初にＩｇＭを産生する。ＩｇＭはＩｇＧよりも低い抗原に対する親和性を有するが、それは、その五量体／六量体構造のために高い抗原に対するアビディティを有する。ＩｇＭは、細胞表面受容体への結合により、細胞シグナリング経路も活性化させる。ＩｇＡは、血清、鼻腔粘膜、唾液、母乳、及び腸液中で豊富であり、ヒト免疫グロブリンの２５％を占める。ＩｇＡは、二量体（すなわち、一緒に結合している２つのＩｇＡ単量体）を形成する。母乳中のＩｇＡは、新生児の胃腸管を病原体から保護する。ＩｇＡは、２つのサブクラス：ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。ＩｇＤは、ヒト免疫グロブリンの１％未満を占め、Ｂ細胞中の抗体産生の誘導に関与し得るが、その正確な機能は不明のままである。ＩｇＥは微量で存在し、ヒト免疫グロブリンの０．００１％以下を占める。この元の役割は、寄生虫から保護することである。寄生虫感染が希少な領域において、ＩｇＥは主にアレルギーに関与する。
免疫細胞活性は、結晶化可能断片領域又は「Ｆｃ領域」として公知の抗体の領域によりモジュレートされる。Ｆｃ領域は２つのポリペプチド鎖又はＦｃドメインから構成され、ＩｇＧは重鎖のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメイン又は「ＣＨ２ドメイン」及び「ＣＨ３ドメイン」をそれぞれ含む。ＩｇＭ及びＩｇＥ Ｆｃ領域は、それぞれのポリペプチド鎖中の３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２～４）を含有する。ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン中のアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング体系（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９６９）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，６３，７８－８５）、「Ｋａｂａｔ」ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前掲）に従って、又は代替的にＣドメインについてのＩＭＧＴナンバリングを使用してナンバリングすることができる。ＩＭＧＴツールは、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおいて利用可能である。
Ｆｃ領域は、抗体の生理学的効果を媒介する細胞表面受容体、「Ｆｃ受容体」及び補体タンパク質に結合する。Ｆｃ受容体は、免疫系の多くの細胞、例として、Ｂリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ヒト血小板及びマスト細胞上で見出される。Ｆｃ受容体への抗体Ｆｃ領域の結合は、食作用又は細胞毒性細胞を刺激して抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）の機序により微生物、又は感染細胞を破壊する。いくつかの異なるタイプのＦｃ受容体（ＦｃＲ）が存在し、それらはそれらが認識する抗体のタイプに基づき分類される。例えば、ＩｇＧに結合するものはＦｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、Ｔ及びＢ細胞）及びそれぞれの受容体のシグナリング特性によっても区別される（Ｏｗｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（７ｔｈ ｅｄ．）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐ４２３）。以下の表（表１）は、異なるＦｃ受容体、それらのリガンド、細胞分布及び結合効果をまとめる。
Figure 2023523794000006
一実施形態において、抗体は、全長抗体、又は全長免疫グロブリン鎖を含む。一実施形態において、抗体は、全長抗体、又は全長免疫グロブリン鎖の抗原結合又は機能的断片を含む。抗体の調製物は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。抗体は、ヒト、ヒト化、ＣＤＲグラフト化、又はインビトロ生成抗体でもあり得る。
一実施形態において、抗体又は免疫グロブリンは組換え産生することができ、例えば、ファージディスプレイにより、又はコンビナトリアル法により産生することができる。抗体を生成するためのファージディスプレイ及びコンビナトリアル法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９１／１７２７１号パンフレット；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９２／２０７９１号パンフレット；Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９２／１５６７９号パンフレット；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９３／０１２８８号パンフレット；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９２／０９６９０号パンフレット；Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３７０－１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，３：８１－８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１；Ｇｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：７２５－７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＰＮＡＳ，８９：３５７６－３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３７３－１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：４１３３－４１３７；及びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＰＮＡＳ，８８：７９７８－７９８２に記載；それらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
一実施形態において、抗体又は免疫グロブリンは、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を産生するように遺伝子人工操作されたマウス中で作製される抗体又はヒトから単離される抗体）、又は非ヒト抗体、例えば、齧歯類（マウス又はラット）、ヤギ、霊長類（例えば、サル）、ラクダ抗体である。ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを使用して生成することができる。目的の抗原で免疫されたこれらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を使用してヒトタンパク質からのエピトープに対する特異的親和性を有するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生する（例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９１／００９０６号パンフレット、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９１／１０７４１号パンフレット；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９２／０３９１７号パンフレット；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３－２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３－４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：３７２０－３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３－１３２６参照）。
抗体又は免疫グロブリンは、可変領域、又はその一部、例えば、ＣＤＲが非ヒト生物、例えば、ラット又はマウス中で生成されるものであり得る。キメラ、ＣＤＲグラフト化、及びヒト化抗体は、本発明の範囲内である。非ヒト生物、例えば、ラット又はマウス中で生成され、次いで、ヒトにおける抗原性を減少させるように例えば可変フレームワーク又は定常領域中で改変された抗体は、本発明の範囲内である。キメラ抗体は、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術により産生することができる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、国際公開第８７／００２６７１号パンフレット；Ａｋｉｒａ ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願公開第１８４１８７Ａ１号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願公開第１７１４９６Ａ１号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願公開第１７３４９４Ａ１号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願公開第１２５０２３Ａ１号明細書；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９－３４４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１－３５２６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４－２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７），Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９－１００５；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６－４４９；及びＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８８），Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９参照）。
ヒト化又はＣＤＲグラフト化抗体は、ドナーＣＤＲで置き換えられた少なくとも１又は２つの（重鎖及び又は軽鎖免疫グロブリン鎖の）レシピエントＣＤＲを有するが、一般に３つ全てのレシピエントＣＤＲを有する。抗体を非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えることができ、又はＣＤＲの一部のみを非ヒトＣＤＲで置き換えることができる。標的抗原へのヒト化抗体の結合に要求されるＣＤＲの数を置き換えることのみ必要である。好ましくは、ドナーは齧歯類抗体、例えば、ラット又はマウス抗体であり、レシピエントはヒトフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークである。典型的には、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態において、ドナー免疫グロブリンは、非ヒト（例えば、齧歯類）である。アクセプターフレームワークは、天然に生じる（例えば、ヒト）フレームワーク若しくはコンセンサスフレームワーク、又はそれと約８５％以上、好ましくは、９０％、９５％、９９％以上同一の配列である。
本明細書において使用されるとき、「コンセンサス配列」という用語は、関連配列のファミリーにおける最も高頻度に生じるアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，（１９８７）Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）参照）。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列中のそれぞれの位置は、そのファミリーにおけるその位置において最も高頻度に生じるアミノ酸により占有される。２つのアミノ酸が等しい頻度で生じる場合、いずれもコンセンサス配列中に含まれ得る。「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。
抗体は、当技術分野において公知の方法によりヒト化させることができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８６），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、並びにＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書及び米国特許第５，６９３，７６２号明細書参照、それらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ヒト化又はＣＤＲグラフト化抗体は、免疫グロブリン鎖の１、２、又は全てのＣＤＲを置き換えることができるＣＤＲグラフト化又はＣＤＲ置換により産生することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２－５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３－４０６０及びＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号明細書参照、それらの全ての内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。規定のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたヒト化抗体も本発明の範囲内である。ドナーからのアミノ酸を選択するための基準は、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書の第１２～１６列に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。抗体をヒト化するための他の技術は、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願公開第５１９５９６Ａ１号明細書に記載されている。
抗体定常領域を変更する方法は、当技術分野において公知である。変更された機能、例えば、エフェクターリガンド、例えば、細胞上のＦｃＲ、又は補体のＣ１成分に対する変更された親和性を有する抗体は、抗体の定常部分中の少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で置き換えることにより産生することができる（例えば、欧州特許出願公開第３８８１５１Ａ１号明細書、米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び米国特許第５，６４８，２６０号明細書参照）。
本明細書において使用されるアミノ酸残基／位置の「改変」又は「突然変異」は、出発アミノ酸配列と比較した一次アミノ酸配列の変化を指し、その変化は、前記１つ以上のアミノ酸残基／位置が関与する配列変更から生じる。例えば、典型的な改変としては、１つ以上の残基の（又は前記位置における）別のアミノ酸での置換（例えば、保存的又は非保存的置換）、前記１つ以上の残基／位置に隣接する１つ以上のアミノ酸の挿入、及び前記１つ以上の残基／位置の欠失、前記１つ以上の残基／位置の逆位、及び前記１つ以上の残基／位置の重複が挙げられる。
「アミノ酸置換」又は「置換」は、所定の（出発又は親）アミノ酸配列中の１つ以上の既存のアミノ酸残基の、１つ以上の異なるアミノ酸残基での置き換えを指す。例えば、置換Ｉ３３２Ｅは、３３２位のイソロイシンがグルタミン酸で置き換えられているバリアントポリペプチド、この場合、定常重鎖バリアントを指す（ＥＵナンバリング）。或いは、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインの置換の位置を挙げることができ、例えば、ＣＨ２．９７は、ＣＨ２ドメイン中の９７位における置換を示し、ナンバリングはＣ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリングに従う。正確な置換は、例えば、ＣＨ２ドメイン中の９７位におけるロイシンがチロシンにより置き換えられていることを示すＬ＿ＣＨ２．９７＿Ｙによっても示すことができる。
本明細書において使用される「アミノ酸挿入」又は「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の付加を意味する。本明細書に記載の挿入は、記号「∧」とそれに続く位置とそれに続く挿入されるアミノ酸により指定される。例えば、「∧２３６Ｒ」は、２３６位の後のアルギニンの挿入を指定し；「∧２３６ＲＲ」は、２３６位の後の２つのアルギニンの挿入を示すなどである。参照の容易性のため、挿入後の元のナンバリングは変えず；したがって、挿入を含有する分子において、挿入部位後に通常見出されるアミノ酸は、特に記述のない限り依然として挿入が生じなかったようにナンバリングされる。
本明細書において使用される「アミノ酸欠失」又は「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の除去を意味する。本明細書に記載の欠失は、欠失すべきアミノ酸及び位置により先行される記号「＃」により指定される。例えば、Ｇ２３７＃は、２３７位におけるグリシンの欠失を指定する。参照の容易性のため、欠失後の元のナンバリングは変えず；したがって、欠失を含有する分子において、欠失部位後に通常見出されるアミノ酸は、特に記述のない限り依然として欠失が生じなかったようにナンバリングされる。
一般に且つ好ましくは、改変は、出発（又は「野生型」）アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較したバリアントポリペプチドの少なくとも１つの物理生化学的活性の変更をもたらす。例えば、抗体又は多重特異的結合分子の場合、変更される物理生化学的活性は、標的分子に対する結合親和性、結合能及び／又は結合効果であり得る。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ））、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ））、非極性側鎖（例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ））、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ））及び芳香族側鎖（例えば、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ））を有するアミノ酸が挙げられる。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関する「同一パーセント」又は「同一性パーセント」という用語は、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。２つの配列は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は手作業のアラインメント及び目視検査により測定して比較ウィンドウ、又は指定領域上で比較し、最大対応についてアラインした場合、２つの配列が規定の割合の同じ（すなわち、規定の領域と比べて、又は規定されない場合、配列全体と比べて６０％の同一性、任意選択で６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性）であるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する場合、「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（又は１０アミノ酸）長である領域上、又はより好ましくは、１００～５００又は１０００ヌクレオチド以上（又は２０、５０、２００アミノ酸以上）の長さである領域上に存在する。本開示の「同一性の割合」又は「配列同一性の割合」は、（ｉ）２つの最適にアラインされた配列（ヌクレオチド又はタンパク質）を比較のウィンドウ上で比較することにより、（ｉｉ）同一の核酸塩基（ヌクレオチド配列についての）又はアミノ酸残基（タンパク質についての）が両方の配列中で生じる位置の数を決定してマッチ位置の数を得ることにより、（ｉｉｉ）マッチ位置の数を、比較のウィンドウ中の位置の総数により割ることにより、及び次いで（ｉｖ）この商に１００％を掛けて同一性パーセントを得ることにより計算することができる。「同一性パーセント」が規定される特定の比較ウィンドウなしで参照配列に関して計算されている場合、同一性パーセントは、アラインメントの領域上のマッチ位置の数を参照配列の全長で割ることにより決定される。したがって、本開示の目的のため、２つの配列（クエリ及び対象）が（それらのアラインメントにおけるギャップを許容して）最適にアラインされる場合、クエリ配列についての「同一性パーセント」は、２つの配列間の同一位置の数をその長さ（又は比較ウィンドウ）にわたるクエリ配列中の位置の総数で割り、次いでそれに１００％を掛けたものに等しい。
配列比較のため、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列はコンピュータに入力され、必要であれば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、又は代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
本明細書において使用される「比較ウィンドウ」という用語には、配列を２つの配列が最適にアラインされた後に連続位置の同じ数の参照配列と比較することができる２０～６００、通常、約５０～約２００、より通常、約１００～約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントへの言及が含まれる。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃのローカル相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，８５：２４４４の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は手作業のアラインメント及び目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ参照）により実施することができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、それらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，．２５：３３８９－３４０２；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインした場合、マッチし、又はある正の値の閾値スコアＴを満たすクエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）前掲）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシーズとして機能する。ワードヒットは、累積的アラインメントスコアが増加され得る限り、それぞれの配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対のマッチ残基に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するため、スコアリング行列が使用される。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ降下した場合；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して累積スコアが０以下になった場合；又はいずれかの配列の末端に達した場合、それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長３及び期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，８９：１０９１５参照）は、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似するとみなされる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１－１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、ギャップ長さペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用して決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈの前掲のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれか、並びにギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６、又は４及び長さウエイト１、２、３、４、５、又は６を使用して決定することができる。
上記の配列同一性の割合以外で、２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一である別の指標は、下記のとおり第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生じる抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみ異なる第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子又はそれらの相補体が下記のとおりストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーを使用してその配列を増幅させることができることである。
「核酸」という用語は、本明細書において「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを指す。この用語は、合成、天然発生、及び非天然発生であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される公知のヌクレオチド類似体又は改変骨格残基若しくは結合を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
特に示されない限り、特定の核酸配列は、明示的に示される配列だけでなく、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、及び相補的配列も黙示的に包含する。具体的には、以下に詳述されるとおり、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することにより達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５－２６０８；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１－９８）。本明細書において使用されるとき、「最適化ヌクレオチド配列」という用語は、産生細胞、この場合、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするようにヌクレオチド配列が変更されていることを意味する。最適化ヌクレオチド配列は、「親」配列としても公知の出発ヌクレオチド配列により最初にコードされる完全にアミノ酸配列を保持するように人工操作される。特定の実施形態において、本明細書における最適化配列は、ＣＨＯ哺乳類細胞において好ましいコドンを有するように人工操作されている。
本明細書において使用されるとき、「Ｃ末端」は、フリーカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有するポリペプチド鎖のカルボキシル末端アミノ酸を指す。本明細書において使用されるとき、「Ｎ末端」は、フリーアミン基（－ＮＨ２）を有するポリペプチド鎖のアミノ末端アミノ酸を指す。
本明細書において使用される「作動可能に結合している」又は「機能的に結合している」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、これは、転写調節配列と転写される配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系中でコード配列の転写を刺激又はモジュレートする場合、コード配列に作動可能に結合している。一般に、転写される配列に作動可能に結合しているプロモーター転写調節配列は、転写される配列に物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、一部の転写調節配列、例えば、エンハンサーは、それらが転写を向上させるコード配列に物理的に連続する必要も、近接して位置する必要もない。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。この語句は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に生じるアミノ酸ポリマー及び天然に生じないアミノ酸ポリマーにも当てはまる。特に示されない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に改変されたバリアントも黙示的に包含する。
本明細書において使用される「インビボ半減期」という用語は、所与の哺乳類の血液中で循環する目的の分子又はそのバリアントの半減期を指す。
「対象」という用語には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物としては、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類が挙げられる。注記される場合を除き、「患者」又は「対象」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
本明細書において使用されるとき、「処置が必要とされる患者」又は「処置が必要とされる対象」などの語句には、例えば、検出、診断手順及び／又は処置に使用される本開示の分子又は医薬組成物の投与から利益を得る対象、例えば、哺乳類対象が含まれる。
本明細書において使用されるとき、「処置」又は「処置する」という用語は、本明細書において、対象への、又は対象からの単離組織若しくは細胞系への本開示による多重特異的結合分子、又は前記多重特異的結合分子を含む医薬組成物の適用又は投与と定義され、対象は、特定の疾患（例えば、関節炎）、その疾患に伴う症状、又はその疾患発生の素因（該当する場合）を有し、その目的は、その疾患の１つ以上の症状を治癒し（該当する場合）、予防し（該当する場合）、その発症を遅延させ、その重症度を低減させ、緩和し、改善し、疾患を改善し、疾患の任意の付随症状又は疾患発生の素因を低減又は改善することである。「処置」又は「処置する」という用語には、疾患を有すると疑われる患者及び疾病患者又は疾患若しくは医学的病態を罹患していると診断された患者を処置することが含まれ、臨床的再発の抑制が含まれる。「見込みを低減させること」という語句は、疾患、感染又は障害の発症又は発生又は進行を遅延させることを指す。
「治療許容量」又は「治療有効量」又は「治療有効用量」という用語は、所望の結果（すなわち、疾患活動性の低減、疾患進行の低減、疾患徴候及び／又は症状の低減など）を生じさせるために十分な量を互換的に指す。一部の態様において、治療許容量は、不所望な副作用を誘導せず惹起もしない。治療許容量は、最初に低用量を投与し、次いで所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加させることにより決定することができる。本開示の分子の「予防有効投与量」及び「治療有効投与量」は、疾患症状の発症を予防し（該当する場合）、又はその重症度の減少をそれぞれもたらし得る。
本明細書において使用されるとき、患者に関して「選択すること」及び「選択される」は、特定の患者が所定の基準を有する特定の患者に起因してより大きい患者群から具体的に選択されることを意味するために使用される。同様に、「患者を選択的に処置すること」は、所定の基準を有する特定の患者に起因してより大きい患者群から具体的に選択される患者に処置を提供することを指す。同様に、「選択的に投与すること」は、所定の基準を有する特定の患者に起因してより大きい患者群から具体的に選択される患者に薬物を投与することを指す。
特に具体的に記述のない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書において使用されるとき、数値に関する「約」という用語は、当技術分野において通常の許容範囲内、例えば、平均の２つの標準偏差内であることが理解される。したがって、「約」は、記述値の＋／－１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％、好ましくは、記述値の＋／－１０％の範囲内であり得る。「約」という用語は、数値又は数のリストの前で使用される場合、その系列のそれぞれの数に適用され、例えば、「約１～５」という語句は、「約１～約５」であると解釈すべきであり、又は例えば、「約１、２、３、４」という語句は、「約１、約２、約３、約４」解釈すべきなどである。
「実質的に」という語は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に有さない」組成物は、Ｙを完全に有さなくてよい。必要な場合、「実質的に」という語は、本開示の定義から除外することができる。
「同時投与する」という用語は、個体の血液中の２つの活性剤の同時存在を指す。本開示の抗体及び抗原結合断片と同時投与される活性剤（例えば、追加の治療剤）は、同時に又は連続的に送達することができる。
本開示の種々の態様は、以下のセクション及び下位セクションにさらに詳細に記載される。
人工操作免疫グロブリン
抗原に結合する抗体の能力に加え、抗体の重要な特徴は、免疫エフェクター機能を動員するその能力である。体液性免疫応答のエンゲージメントは、Ｃ１ｑとの相互作用及び補体カスケードの開始により主に支配される（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ＭＡＢＳ，６（５）：１１３３－４４）。細胞性免疫応答は、大部分が抗体とＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）との間の相互作用に起因して生じる。５つの活性化ＦｃγＲが存在する：一価抗体に結合し得る高親和性ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、並びにアビディティベース相互作用を要求するより低い親和性のＦｃγＲＩＩａ及びＩＩｃ（ＣＤ３２）、並びにＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）及びＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）。１つの阻害受容体：ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２）が存在する。活性化受容体を介する細胞内シグナリングは、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及びサイトカイン分泌の誘導を介する炎症をもたらす免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化を介してモジュレートされる。対照的に、阻害ＦｃγＲＩＩｂを介する細胞内シグナリングは、活性化シグナリング経路をカウンターバランスさせるホスファターゼを動員する免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）のリン酸化を介してモジュレートされる（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ＆ Ｒａｖｅｔｃｈ，（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３４－４７）。ＦｃγＲ及びＣ１ｑとの抗体相互作用は、ヒンジ及び近接ＣＨ２アミノ酸配列並びにＣＨ２領域中のグリコシル化に依存的である（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９６９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，６３：７８－８５）。
多くの抗体ベース療法は臨床的及び商業的成功を示しているが、それらの治療法は患者の小集団においてのみ有効であることが多い。これまで、全ての市販抗体は、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を介して免疫エフェクター機能を動員するＩｇＧクラス、主にＩｇＧ１のものである。典型的な反応は、ＡＤＣＣをトリガーするＩｇＧ抗体のＦｃ部分により細胞表面上でＦｃγＲＩＩＩをディスプレイするナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を伴う。しかしながら、ＮＫ細胞は自然免疫系の唯一の構成成分であり、他の形態の白血球の活性化を使用してＩｇＧによりトリガーされるＡＤＣＣ応答を向上させることができた。抗体のＩｇＡクラスは、好中球上で広く発現されるＦｃαＲＩをエンゲージする。好中球は循環中で見出される自然エフェクター細胞の最大の割合をなし、それらの活性化はＡＤＣＣ及びＡＤＣＰの両方をトリガーする。さらに、これらは固形腫瘍に浸潤することが示されている（Ｇｒｅｇｏｒｙ ＆ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（２０１１）前掲）。しかしながら、ＩｇＧ抗体はＦｃαＲＩに結合しないため、ほとんどの市販の抗体ベース療法は、好中球を活性化させ得ない。ＩｇＡベース治療抗体は、種々の欠点に起因して商業的に開発されておらず、それらのクラスの抗体はＩｇＧ抗体の好ましい治療特性も欠く。例えば、ＩｇＡのヒンジ領域は高度にグリコシル化され、複数の複雑なグリカンを有するタンパク質の産生は、薬物開発の間の生物処理及び品質制御のために課題であり得（Ｗｏｏｆ ＆ Ｋｅｒｒ（２００６）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０８：２７０－８２）、ＩｇＡはＣ１ｑに結合せず、したがってそれは古典的補体経路を介してＣＤＣを媒介し得ず（ｖａｎ Ｅｇｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：２０５－１１）、ＩｇＡはＦｃγ受容体にも結合せず、したがってＩｇＧ１療法に関連する免疫細胞活性化の多様な機序を利用し得ず、ＩｇＡは、細胞内再循環に重要なＦｃＲｎ受容体への結合の欠落のためにＩｇＧよりも短い循環半減期を示す。ＩｇＧとＩｇＡ抗体の組み合わせ療法は、規制及びコストの懸念及び潜在的な不所望な治療効果に起因して開発されていない。
ヒトＩｇＧ及びＩｇＡクラスの免疫グロブリン様ドメインは高程度の構造相同性を共有するため、多数のグループが一方のクラスから他方のクラスへの特性の移行の可能性を試験してきた。例えば、ＦｃγＲ及びＦｃαＲＩをエンゲージするための試行においてＩｇＡ２の単一ドメインがガンマ１定常領域の末端に付属され、４ドメイン定常領域（ＣＨ１ｇ－ＣＨ２ｇ－ＣＨ３ｇ－ＣＨ３ａ）が作出された（Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０１：２１－３１）。アルファ定常領域により類似する定常領域を作製するため、ガンマ１のＣＨ１ドメインがアルファ１定常領域ドメインに代用された（ＣＨ１ａ－ＣＨ２ｇ－ＣＨ３ｇ－ＣＨ３ａ）。これらの４ドメイン交差アイソタイプＩｇＧ／Ａキメラ抗体は、天然ＩｇＡ２に類似する様式でＪ鎖を有するポリマーを形成するが、ポリマーＩｇ受容体による輸送を低減させた。４ドメイン交差アイソタイプ抗体は、ヒツジ赤血球の補体依存性溶解を媒介し得、ＩｇＧ１よりもｐＨ耐性であることが明らかになり；しかしながら、それらはＦｃγＲＩ親和性の３倍～５倍の減少を有し、ＩｇＡ２の短い血清半減期を有した（Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ ｅｔ ａｌ．、前掲）。
タンデムＩｇＧ１／ＩｇＡ２抗体フォーマットがＢｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌにより生成され、それによりトラスツズマブ結合ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域がＩｇＡ２のＦｃ領域で置き換えられ、又はＩｇＡ２ Ｆｃ領域が全長ＩｇＧ１抗体のＣ末端に付属された（Ｂｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）ＭＡＢＳ，７（４）：７４３－５１）。これらの構築物は、向上したＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ能力を示し、ＩｇＧ１／ＩｇＡ２タンデムＦｃフォーマットはＩｇＧ１ ＦｃγＲ結合とＦｃＲｎ媒介血清持続性を保持し、ＦｃαＲＩ／ＩｇＡ Ｆｃ相互作用を介する骨髄細胞媒介エフェクター細胞を有した。タンデムＩｇＧ１／ＩｇＡ２ Ｆｃを有する抗ヒト上皮成長因子受容体－２抗体は、細胞毒性ＰＭＮ細胞を親ＩｇＧ１又はＩｇＡ２よりも良好に動員し、エンゲージすることが示された。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩｇＧ１／ＩｇＡ２の薬物動態は親ＩｇＧに類似し、ＩｇＡ２の不十分な血清持続性をはるかに凌ぐ。
ＩｇＧ１のＦｃドメインのどの部分がＦｃγ受容体と相互作用するかを決定するため（Ｗｏｏｆ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２３（３）：３１９－３３０）、及びＩｇＡのＦｃドメインのどの部分がＦｃα受容体と相互作用するかを決定するため（Ｗｏｏｆ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（６）：５９０－７）に早期の構造生物学研究が使用された。この知見を用いて、Ｆｃα受容体及びＦｃγ受容体に結合する免疫グロブリンが生成された。例えば、ある改変重鎖のＦｃ領域のＣＨ３ドメインがＩｇＧ１アイソタイプであり、別の改変重鎖のＦｃ領域のＣＨ３ドメインがＩｇＡアイソタイプである改変重鎖を有する抗原結合タンパク質が構築された（国際公開第１２／１１６９２６Ａ１号パンフレット、Ｂｏｓｓｅｎｍａｉｅｒ ＆ Ｋｅｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒ）。「交差アイソタイプ」抗体と称されるキメラＩｇＧ－ＩｇＡ抗体がＫｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌにより記載され、それによりＩｇＡからのα１及び／又はα２ループを有するキメラＩｇＧ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＡからのＣＨ３ドメインとを含むように抗体のＦｃ領域が人工操作された。ＦｃＲｎ結合ペプチドをキメラ抗体のＣ末端に付加することによりキメラ分子にＦｃＲｎ結合活性を付与することもできた（Ｋｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２１（１２）：１６０３－９；国際公開第１４／０６５９４５Ａ１号パンフレット）。
上記のキメラＩｇＧ／ＩｇＡ免疫グロブリンがＦｃα及びＦｃγ受容体の両方への結合の特性を有する一方；Ｆｃ領域は、それが完全ＩｇＡ Ｆｃドメイン（例えば、ＣＨ２及び又はＣＨ３ドメイン）を含有するために高い比率のＩｇＡアミノ酸残基を依然として含み、したがってＦｃドメインは５０％超のＩｇＡ残基を有する（国際公開第１４／０６５９４５Ａ１号パンフレット）。したがって、これらのキメラタンパク質は、上記のとおり治療ＩｇＡ抗体の産生を妨げた同じ欠点、すなわち、不十分な開発特性に付される。キメラタンパク質には、ＦｃγＲ及びＦｃαＲＩについてのＳＰＲにより測定される、それぞれ野生型、全長ＩｇＧ１及びＩｇＡ２と比較して低い親和性も伴う（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，１０７（２）：６０４－９；国際公開第１４／０６５９４５Ａ１号パンフレット（２７～２８頁））。
対照的に、本発明において、本発明者らは、ＩｇＡエフェクター機能を付与するが、最小数のアミノ酸改変を有するＩｇＧ１アイソタイプの免疫グロブリンＦｃ領域を人工操作した。これは、図１に模式的に示される。驚くべきことに、ＩｇＧ１の所望の発現及び製造特性が好中球活性化の追加の利益を伴って維持された。合理的設計を使用して、ヒトＩｇＡ２及びヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを重ね合わせ、長さを調整して改変のためのアミノ酸残基を決定した。この方法を使用して、ｈＩｇＡ２ Ｆｃ／ＦｃαＲＩ界面をｈＩｇＧ１ Ｆｃ中に移行し、Ｆｃαエフェクター機能を動員するＩｇＧ１様分子を作出した。さらに、アルファエフェクター機能の移行を、Ｆｃ領域のさらなる改変と合わせてＦｃＲｎに結合する能力を回復させ、それにより半減期を延長させた。さらに、ＩｇＧエフェクター機能を回復させるため、Ｆｃ領域をさらに改変してＦｃγＲ結合をもたらす改変を導入した。改変Ｆｃ配列を含む抗ＨＥＲ２結合抗体を使用し、生成されたホモ二量体及びヘテロ二量体ＩｇＧ１様分子を用いるタンパク質人工操作を例示した。
１．ＦｃαＲ機能を動員する人工操作ホモ二量体免疫グロブリン
第１の態様において、ＦｃαＲ機能を動員するヒトＩｇＧ１アイソタイプの人工操作免疫グロブリンの生成は、合理的及び半合理的設計の両方を使用する、ヒトＦｃαＲＩと結合するヒトＩｇＡ２ Ｆｃ残基の、ＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域への移行により達成した。ＩｇＡが多数の異なる形態（単量体、二量体、分泌）で天然に存在する場合、ＩｇＡ２構造の初期改変を作製してタンパク質人工操作に好ましい形態である単量体ＩｇＡ２を生成した。テールピースをＣＨ３ドメインから除去し、ＣＨ１ドメイン中の１２４位（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）におけるプロリン残基をアルギニンで置換してＩｇＡ２不均質性を低減させた。これらの改変に続き、ＩｇＡ２構築物のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を、ＩｇＧ１からの対応するＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域で置き換えた。これらの置き換えは、ＦｃαＲＩ結合に対する限定された影響を有した（実施例１参照）。
次いで、インシリコ分析を使用してＩｇＧ１及びＩｇＡ１のＦｃ領域を重ね合わせてＩｇＡ１とＦｃαＲＩとの相互作用に関与するＩｇＡ１残基と構造的に同等であるＩｇＧ１残基を同定した。ＩｇＡ２ Ｆｃの結晶構造は依然として不明であり；しかしながら、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のＦｃ領域は、それらが９６．２％の同一性／９８．６％の類似性（配列番号２（アミノ酸ＣＨ２－１．２～ＣＨ３－１２５（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）及び配列番号２５４に含まれるＣＨ２－ＣＨ３配列のアラインメントを共有するため、構造的に極めて類似する。次いで、これらの同定残基をＩｇ１構築物中で同等のＩｇＡ２残基で置き換えた。ＩｇＧ１及びＩｇＡ２が構造的相同性を共有する一方、配列長さ及びＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の角度は異なる。ＩｇＡ２のＣＨ２ドメインのほぼ最後の３残基及びＣＨ３ドメインの最初の６残基を含み、本明細書において「ＣＨ２－ＣＨ３エルボー」と称されるこのＣＨ２－ＣＨ３界面を、ＩｇＧ１中で改変してこの領域中のＣＨ２及びＣＨ３ドメインの長さを短縮してＩｇＡ２に見出されるものと同様の、ＩｇＧ１ ３Ｄ構造中のそれらのドメイン間の角度を達成した。次いで、ＩｇＡ２構築物のベータシート構造をＦｃαＲＩへの結合に関して試験した。シートの一方の面が残基側鎖をＦｃαＲＩに向けてターンさせ、他方の面が残基側鎖をＣＨ３－ＣＨ３コア界面に向けてターンさせることが公知である。ＣＨ３－ＣＨ３コア残基は残基側鎖の位置決めに、それらの特性及び立体障害に応じてＦｃαＲＩとのそれらの相互作用において影響を与え得る。ＩｇＡ２及びＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのベータシートが高程度の構造的相同性を共有するため、ＩｇＧ１構築物中のＣＨ３－ＣＨ３界面におけるＣＨ３残基を、ＩｇＡ２ ＣＨ３からの対応する残基と交換してＦｃαＲＩと相互作用する残基を正確に方向付けすることが可能であった。
上記の合理的設計の使用は、重要なＩｇＡ２残基の同定及びＩｇＧ１構築物へのそれらの後続の移行を可能とした。しかしながら、人工操作活動を完全に完了させるため、次いで、半合理的アプローチを実施してＣＨ２及びＣＨ３人工操作を微調整してＦｃαＲＩへの結合を改善した。上記のとおり、ＩｇＧ１及びＩｇＡ２のベータシートは高程度の構造的相同性を共有する。ＩｇＡ２ ＣＨ２及びＣＨ３の逆平行β鎖Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ（ＩＭＧＴ命名法）を、同等のＩｇＧ１β鎖での連続的置換により個々にスキャンした。これに続き、ＩｇＧ１のβ鎖を２つずつ及び３つずつなど、ＩｇＡ２－ＦｃαＲＩ相互作用におけるそれらの役割に応じて同等のＩｇＡ２β鎖で置き換えた。
ＩｇＧ１及びＩｇＡ２ ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは「ビルディングブロック」として事実上記載することができ、したがってそれらのドメインをピースに切断することが可能である。２つの異なるタイプの断面を横断面（上面－下面断面）に従って切断し、次いで正面（正面－側面断面）に従って切断した。これは、５０％のＩｇＡ２及び５０％のＩｇＧ１を含むＩｇＧ１／ＩｇＡ２ハイブリッドＣＨ２又はＣＨ３ドメインを含有する構築物を与えた。
半合理的設計を使用して、見かけの無関連役割又はＦｃαＲＩ界面からの長い距離における位置にかかわらず、ＩｇＡ２ Ｆｃ領域のどの部分がＦｃαＲＩとのその相互作用に必要であるかも決定した。ベータシートを連結し、ＩｇＡ２ ＣＨ２のトップ上に空間的に位置するジスルフィド結合及びループ（図３参照）は、ＦｃαＲＩ結合部位におけるＣＨ２残基の正確な位置決めにおける重要な役割を担うことが見出された。さらに、溶媒曝露されるＣＨ３中に位置するα－ヘリックスも、ＩｇＡ２－ＦｃａＲＩ相互作用に対する影響を有することが示された。ＩｇＡ２－ＦｃαＲＩ結合部位からの距離を考慮してＦｃαＲＩ相互作用におけるこれらの領域の重要性を発見したことは驚くべきことであった。
上記の作業は、ＦｃαＲＩ結合特性を付与するために多数の残基がＩｇＡ残基で置換されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む人工操作ホモ二量体免疫グロブリンの生成を可能とした。一実施形態において、本開示は、多数の置換を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、ＦｃαＲＩを認識し、それに結合し得る人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、本開示は、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、Ｆｃドメイン中のＩｇＧ１残基の３５％未満がＩｇＡからの対応する残基で置き換えられている人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、本開示は、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、Ｆｃドメイン中の残基の約３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％未満がＩｇＡからの対応する残基で置き換えられている人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、本開示は、改変Ｆｃドメインを含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、Ｆｃドメイン中の残基がＩｇＡからの対応する残基で置き換えられており、改変Ｆｃドメインは、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、９０％又は９５％の野生型ＩｇＧ１からのＦｃドメイン（配列番号１）とのアミノ酸配列同一性を有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、Ｆｃドメインは、少なくとも７０％の野生型ＩｇＧ１からのＦｃドメインとのアミノ酸配列同一性を有する。好ましい実施形態において、Ｆｃドメインは、少なくとも７５％の野生型ＩｇＧ１からのＦｃドメインとのアミノ酸配列同一性を有する。
一実施形態において、本開示は、Ｆｃドメイン中のある位置における多数の置換を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。全ての置換位置のナンバリングは、Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリングに従う。一実施形態において、本開示は、Ｆｃドメインであって、例えば、表６、表１０、表１４及び表１８に列記されるＣＨ２ドメイン中の位置におけるアミノ酸がＩｇＡ２からの対応するアミノ酸で置換されたＦｃドメインを提供する。一実施形態において、本開示は、Ｆｃドメインであって、例えば、表８、表１２、表１６及び表２０に列記されるＣＨ３ドメイン中の位置におけるアミノ酸がＩｇＡ２からの対応するアミノ酸で置換されたＦｃドメインを提供する。一実施形態において、本開示は、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、例えば、表２２に列記されるＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン中の位置におけるアミノ酸がＩｇＡ２からの対応するアミノ酸で置換された人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。
改変Ｆｃドメインを全長抗ＨＥＲ２抗体（アミノ酸配列の配列番号１のＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ及び配列番号１２４の軽鎖）中に取り込み、哺乳類ＨＥＫ細胞系中で発現させた。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴を使用して、発現された免疫グロブリンバリアントの結合親和性を決定した。一実施形態において、本開示は、ＣＨ２ドメイン中のアミノ酸置換を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、アミノ酸がＩｇＡ２からの対応するアミノ酸で置換されており、表７、表１１、表１５及び表１９に列記される結合親和性でヒトＦｃαＲＩに結合する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、本開示は、ＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、アミノ酸がＩｇＡ２からの対応するアミノ酸で置換されており、表９、表１３、表１７及び表２１に列記される結合親和性でヒトＦｃαＲＩに結合する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、本開示は、ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、アミノ酸がＩｇＡ２からの対応するアミノ酸で置換されており、表２３及び表２４に列記される結合親和性でヒトＦｃαＲＩに結合する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。
ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインの改変を有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの選択物を、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ細胞殺傷アッセイにおいてそれぞれ実施例６及び７に記載の手順に従って試験した。結果を図１０、図１１及び図１２に示し、それらは人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンが野生型免疫グロブリンと同様に良好に機能したことを示す。
上記のとおり、本発明者らは、ＩｇＡ２免疫グロブリンのＦｃαＲＩ結合特性がＩｇＧ１免疫グロブリンに移行された人工操作免疫グロブリンを生成した。しかしながら、ＩｇＧ１のＦｃ領域中のアミノ酸の置換は構成的ＦｃＲｎ結合特性の損失をもたらし、ＩｇＧ１免疫グロブリンの半減期の減少が生じた。ＦｃＲｎ結合に重要な残基を同定し、ＣＨ３置換Ａ＿ＣＨ３．１５＿Ｈ、Ｆ＿ＣＨ３．１１６＿Ｙ又はＰ＿ＣＨ３．１１３＿Ｈ、Ｌ＿ＣＨ３．１１４＿Ｎ、Ａ＿ＣＨ３．１１５＿Ｈ、Ｆ＿ＣＨ３．１１６＿Ｙ（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）をＩｇＡ２免疫グロブリン中に作製した。これらの突然変異を用いると、ＦｃＲｎ結合は回復し；しかしながら、ＦｃＲｎと相互作用するＩｇＧ１ ＣＨ３の重要な残基はＦｃαＲＩ相互作用を担うＩｇＡ２ ＣＨ３の対応する領域中に位置するため、表２５に示されるとおり、ＦｃαＲＩ結合のいくらかを損失させずに、これらの残基をＩｇＧ１からのものに戻すように人工操作することは可能でなかった。
さらに、ＦｃαＲＩ結合を付与するためのＩｇＧ１のＦｃ領域中のアミノ酸の置換は、人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの構成的ＦｃγＲ結合特性の損失をもたらした。アミノ酸改変を人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン中に導入してＦｃγＲエフェクター機能を回復させた。ＣＨ２ドメインの突然変異、例えば、「ＳＤＩＥ」突然変異のＳ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ／Ｓ＿ＣＨ２．３＿Ｄ及びＩ＿ＣＨ２．１１７＿Ｅ又は三重突然変異Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ及びＡ３３０Ｌ／Ｓ＿ＣＨ２．３＿Ｄ、Ｉ＿ＣＨ２．１１７＿Ｅ及びＡ＿ＣＨ２．１１５＿Ｌ（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング；Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ（２００６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０３（１１）：４００５－１０）は、ＦｃγＲエフェクター機能の改善のために記載されている。本開示の一実施形態において、ＳＤＩＥ突然変異を、表２６に記載されるとおりＦｃαＲＩへの結合を付与するための突然変異を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン中で作製した。組み合わせにおいて、これらの突然変異はＦｃγＲエフェクター機能を部分的に回復させるために十分であった。
ヒトＦｃαＲＩへの結合並びにヒトＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａへの結合を回復させるためのアミノ酸改変を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの結合親和性をＳＰＲにより決定した。一実施形態において、本開示は、Ｆｃドメイン中のアミノ酸置換を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンであって、それぞれ表２７、表２８及び表２９に列記される結合親和性でヒトＦｃαＲＩ、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａに結合する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。多数の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンのエフェクター機能をインビトロＰＭＮ／ＰＢＭＣ殺傷アッセイ及びＡＤＣＰアッセイにおいて試験し、結果を図１３～１６に示す。
２．ＦｃαＲ機能、ＦｃγＲ機能及びＦｃＲｎ結合を動員する人工操作ヘテロ二量体免疫グロブリン
上記のタンパク質人工操作作業は、ＦｃαＲ、ＦｃγＲ及びＦｃＲｎへの結合の特性を有する人工操作ホモ二量体免疫グロブリンの生成をもたらした。しかしながら、Ｆｃ受容体のあるクラスへの結合は別のクラスへの結合を犠牲にすることが多く、さらなる最適化作業が要求された。したがって、最適化人工操作免疫グロブリンを生成するため、ＦｃαＲＩを動員するようにＩｇＧ１ Ｆｃ領域の第１のＦｃドメインが人工操作され、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域の第２のＦｃドメインは未変化のままであるヘテロ二量体Ｆｃ領域を生成した。本発明の第２の態様は、ＦｃαＲＩ及びＦｃγＲ機能の両方を動員し、ＦｃＲｎに結合し得るヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。人工操作免疫グロブリンのＣＨ２のトップ上に空間的に位置する残基がＩｇＧ１に由来した場合、ＦｃＲｎ結合を回復させるためのヘテロ二量体Ｆｃ領域中のさらなるアミノ酸置換は要求されなかった。したがって、一実施形態において、ＣＨ２のトップ上に空間的に位置するＩｇＧ１からの残基を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンが提供される。別の実施形態において、ＦｃγＲエフェクター機能を完全に回復させるため、二重突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＥＵナンバリング）／Ｓ＿ＣＨ２．３＿Ｄ／Ｉ＿ＣＨ２．１１７＿Ｅ（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）をＩｇＧ１に由来する第２のＦｃドメインのＣＨ２ドメイン中で作製した。別の実施形態において、ＣＨ２のトップ上に空間的に位置する残基、例えば、パックされたループ及びジスルフィド結合がＩｇＡ２に由来した場合、ＦｃＲｎ結合を回復させるための「ＬＳ」又は「ＹＴＥ」突然変異の付加が要求され；しかしながら、ＦｃγＲへの結合は損失した。
本開示の人工操作免疫グロブリンのＦｃ領域の２つのＦｃドメインの適切なヘテロ二量体化を確保するため、例えば、欧州特許第１８７０４５９号明細書；米国特許第５，５８２，９９６号明細書；米国特許第５，７３１，１６８号明細書；米国特許第５，９１０，５７３号明細書；米国特許第５，９３２，４４８号明細書；米国特許第６，８３３，４４１号明細書；米国特許第７，１８３，０７６号明細書；米国特許出願公開第２００６２０４４９３Ａ１号明細書；国際公開第０９／０８９００４Ａ１号パンフレットに記載のとおり種々のアプローチを使用して二量体化を向上させることができる。一態様において、重鎖定常ドメインを含む人工操作免疫グロブリンの第１のＦｃドメインの１つ以上の突然変異は「ノブ」を作出し、重鎖定常ドメインを含む人工操作免疫グロブリンの第２のＦｃドメインの１つ以上の突然変異は「ホール」を作出し、その結果、第１及び第２のＦｃドメインのヘテロ二量体化は「ノブ」を「ホール」と結合させる（例えば、相互作用する、例えば、第１のＦｃドメインのＣＨ２ドメインが第２のＦｃドメインのＣＨ２ドメインと相互作用し、又は第１のＦｃドメインのＣＨ３ドメインが第２のＦｃドメインのＣＨ３ドメインと相互作用する）。「ノブ」は、この用語が本明細書において使用されるとき、重鎖定常ドメインを含む人工操作免疫グロブリンの第１のＦｃドメインの界面から突出し、したがって重鎖定常ドメインを含む人工操作免疫グロブリンの第２のＦｃドメインとの界面中の補整「ホール」中に位置可能であり、例えば、ヘテロ二量体、及びそれによりホモ二量体形成と比べて好ましいヘテロ二量体形成を安定化させる少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。ノブの形成に好ましいインポート残基は、一般に、天然に生じるアミノ酸残基であり、好ましくは、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。トリプトファン及びチロシンが最も好ましい。好ましい実施形態において、突起の形成のための元の残基は小さい側鎖容積を有し、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン又はバリンである。
「ホール」は、重鎖定常ドメインを含む人工操作免疫グロブリンの第２のＦｃドメインの界面から陥没しており、したがって重鎖定常ドメインを含む人工操作免疫グロブリンの第１のＦｃドメインの隣接結合表面上の対応するノブを収容する少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。ホールの形成に好ましいインポート残基は通常、天然に生じるアミノ酸残基であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）から選択される。セリン、アラニン及びトレオニンが最も好ましい。好ましい実施形態において、ホールの形成のための元の残基は大きい側鎖容積を有し、例えば、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン又はトリプトファンである。
一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインを残基３６６、４０５又は４０７（ＥＵナンバリング）／、ＣＨ３．２２、ＣＨ３．８５．１、ＣＨ３．８６（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）において突然変異させて「ノブ」又は「ホール」（上記）のいずれかを作出し、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインを：残基３６６／ＣＨ３．２２を第１のＣＨ３ドメイン中で突然変異させる場合は残基４０７／ＣＨ３．８６、残基４０５／ＣＨ３．８５．１を第１のＣＨ３ドメイン中で突然変異させる場合は残基３９４／ＣＨ３．８１、又は残基４０７／ＣＨ３．８６を第１のＣＨ３ドメイン中で突然変異させる場合は残基３６６／ＣＨ３．２２（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）において突然変異させて第１のＣＨ３ドメインの「ノブ」又は「ホール」と相補的な「ホール」又は「ノブ」を作出する。
別の実施形態において、第１のＣＨ３ドメインを残基３６６／ＣＨ３．２２において突然変異させて「ノブ」又は「ホール」（上記）のいずれかを作出し、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインを残基３６６／ＣＨ３．２２、３６８／ＣＨ３．２４及び／又は４０７／ＣＨ３．８６（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）において突然変異させて第１のＣＨ３ドメインの「ノブ」又は「ホール」と相補的な「ホール」又は「ノブ」を作出する。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインの突然変異は、３６６／ＣＨ３．２２位におけるチロシン（Ｙ）残基を導入する。一実施形態において、第１のＣＨ３の突然変異は、Ｔ３６６Ｙ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｙである。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインの突然変異は、３６６／ＣＨ３．２２位におけるトリプトファン（Ｗ）残基を導入する。一実施形態において、第１のＣＨ３の突然変異は、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｗである。実施形態において、３６６／ＣＨ３．２２位において突然変異された第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインの突然変異（例えば、３６６／ＣＨ３．２２位に導入されたチロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）を有し、例えば、突然変異Ｔ３６６Ｙ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｙ又はＴ３６６Ｗ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｗを含む）は、３６６／ＣＨ３．２２位における突然変異、３６８／ＣＨ３．２４位における突然変異及び４０７／ＣＨ３．８６位における突然変異（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）を含む。実施形態において、３６６／ＣＨ３．２２位における突然変異はセリン（Ｓ）残基を導入し、３６８／ＣＨ３．２２位における突然変異はアラニン（Ａ）を導入し、４０７／ＣＨ３．８６位における突然変異はバリン（Ｖ）を導入する。実施形態において、突然変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｓ、Ｌ＿ＣＨ３．２４＿Ａ及びＹ＿ＣＨ３．８６＿Ｖ（ＥＵ／ＩＭＧＴナンバリング））を含む。一実施形態において、多重特異的結合分子の第１のＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３６６Ｙ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｙを含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｓ、Ｌ＿ＣＨ３．２４＿Ａ及びＹ＿ＣＨ３．８６＿Ｖ）を含み、又はその逆もある。一実施形態において、多重特異的結合分子の第１のＣＨ３ドメインは突然変異Ｔ３６６Ｗ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｗを含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｓ、Ｌ＿ＣＨ３．２４＿Ａ及びＹ＿ＣＨ３．８６＿Ｖを含み、又はその逆もある。
好ましい実施形態において、「ホール」を作出するために突然変異されるＣＨ３ドメインは、ＦｃαＲＩエフェクター機能を動員するためのアミノ酸改変を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域の第１のＦｃドメイン中に存在し、「ノブ」を作出するために突然変異されるＣＨ３ドメインは、ＦｃαＲＩエフェクター機能を動員するためのアミノ酸改変を含まない人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域の第２のＦｃドメイン中に存在する。一実施形態において、本開示は、配列番号１３７又は１５７内に含まれるアミノ酸配列を有するＦｃ「ホール」ドメインを含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。別の実施形態において、本開示は、配列番号１５４、１５９、１６０、１６１又は１６２内に含まれるアミノ酸配列を有するＦｃ「ノブ」ドメインを含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。好ましい実施形態において、本開示は、配列番号１５４、１５９、１６０、１６１又は１６２を有する配列番号１３７又は１５７から選択されるアミノ酸配列からの第１及び第２のＦｃドメインを有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。ガンマエフェクター機能（すなわち、ＦｃγＲへの結合）が要求されなかった場合、それぞれ配列番号１５７及び１５９のアミノ酸配列からの第１及び第２のＦｃドメインを有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンが好ましかった。ガンマエフェクター機能（すなわち、ＦｃγＲへの結合）が要求された場合、それぞれ配列番号１５７及び１６１のアミノ酸配列からの第１及び第２のＦｃドメインを有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンが好ましかった。この人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの第２のＦｃドメイン（配列番号１６１）は、ＳＤＩＥ突然変異も含んだ。さらに、配列番号１５７内に含まれる人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの第１のＦｃドメインは、ＦｃαＲＩへの結合を改善するための親和性成熟活動に由来する突然変異を含んだ。
本開示の人工操作免疫グロブリンのいずれかにおける使用に好適な追加のノブインホール突然変異ペアは、例えば、国際公開第１９９６／０２７０１１号パンフレット、及びＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）前掲にさらに記載されており、その内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
人工操作免疫グロブリンのさらなる改変
ＦｃαＲＩに対する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの結合親和性をさらに向上させるため、酵母ディスプレイを使用して親和性成熟活動を実施してＦｃαＲＩに対するＩｇＡ２親和性を向上させるアミノ酸突然変異を同定した。一実施形態において、本開示は、以下の位置の１つ以上：ＣＨ２．１０、ＣＨ２．８９、ＣＨ２．９１、ＣＨ２．９４、ＣＨ２．９７、ＣＨ２．９９、ＣＨ３．４５、ＣＨ３．１０５、ＣＨ３．１０９、ＣＨ３．１１８及び／又はＣＨ３．１２４におけるＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメイン中のアミノ酸突然変異を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供し、ナンバリングはＣ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリングに従う。一実施形態において、本開示は、Ａ＿ＣＨ２．１０＿Ｓ、Ｌ＿ＣＨ２．８９＿Ｉ、Ｇ＿ＣＨ２．９１＿Ｑ、Ｇ＿ＣＨ２．９１＿Ｖ、Ｑ＿ＣＨ２．９４＿Ｅ、Ｎ＿ＣＨ２．９７＿Ｈ、Ｎ＿ＣＨ２．９７＿Ｙ、Ｇ＿ＣＨ２．９９＿Ｗ、Ｓ＿ＣＨ３．４５＿Ｄ、Ｍ＿ＣＨ３．１０５＿Ｙ、Ｅ＿ＣＨ３．１０９＿Ｄ、Ｑ＿ＣＨ３．１１８＿Ｙ及びＬ＿ＣＨ３．１２４＿Ｆからなる群から選択されるＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供し、ナンバリングはＣ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリングに従う。別の実施形態において、本開示は、表３９に列記される突然変異セットの１つから選択されるＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。一実施形態において、本開示は、以下のアミノ酸置換：Ｑ＿ＣＨ２．９４＿Ｅ、Ｎ＿ＣＨ２．９７＿Ｙ、Ｓ＿ＣＨ３．４５＿Ｄ、Ｍ＿ＣＨ３．１０５＿Ｙ、Ｑ＿ＣＨ３．１１８＿Ｙ（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。好ましい実施形態において、本開示は、以下のアミノ酸置換：Ｑ＿ＣＨ２．９４＿Ｅ、Ｌ＿ＣＨ２．９７＿Ｙ及びＳ＿ＣＨ３．４５＿Ｄ（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを提供する。この突然変異セットを配列番号１５７内に含まれるヘテロ二量体Ｆｃの「ホール」アームに適用し、配列番号２５２をもたらした。配列番号２５２及び１５９又は配列番号２５２及び１６１から選択され、それに含まれるアミノ酸配列からの第１及び第２のＦｃドメインを有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、ＰＭＮ殺傷アッセイにおいてそれらの親免疫グロブリン及びＩｇＡ２と比較して良好な、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する殺傷特性を有することが示された（図２４）。ガンマエフェクター機能（すなわち、ＦｃγＲへの結合）が要求されなかった場合、それぞれ配列番号２５２及び１５９のアミノ酸配列からの第１及び第２のＦｃドメインを有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンが好ましかった。ガンマエフェクター機能（すなわち、ＦｃγＲへの結合）が要求された場合、それぞれ配列番号２５２及び１６１のアミノ酸配列からの第１及び第２のＦｃドメインを有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンが好ましかった。配列番号１６１内に含まれる人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの第２のＦｃドメインは、ＳＤＩＥ突然変異も含んだ。
本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、ＣＨ３ドメインをさらに突然変異させてシステイン残基のペアを導入することができる。理論により拘束されるものではないが、ジスルフィド結合を形成し得るシステイン残基のペアの導入がヘテロ二量体人工操作免疫グロブリンに安定性を提供することが考えられる。実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、３５４／ＣＨ３．１０（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）位におけるシステインを含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、３４９／ＣＨ３．５（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）位におけるシステインを含む。
別の態様において、人工操作免疫グロブリンのＦｃドメインのヘテロ二量体化は、ヘテロ二量体構成で類似の（又は相補的）物理的特性の残基と相互作用するために２つのＦｃドメインの結合界面における残基を引き起こす合理的な「極性架橋」に基づく突然変異を導入することにより増加させる。特に、これらの突然変異は、ヘテロ二量体形成において、極性残基が極性残基と相互作用する一方、疎水性残基が疎水性残基と相互作用するように設計する。対照的に、ホモ二量体形成において、残基を、極性残基が疎水性残基と相互作用するように突然変異させる。ヘテロ二量体構成における好ましい相互作用及びホモ二量体構成における好ましくない相互作用が一緒に作用してＣＨ３ドメインがホモ二量体を形成するよりもヘテロ二量体を形成する可能性がより高くなる。
例示的な実施形態において、上記突然変異は、ＣＨ３ドメイン中の残基３６４、３６６、３６８、３９９、４０５、４０７、４０９、及び４１１（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）／ＣＨ３．２０、ＣＨ３．２２、ＣＨ３．２４、ＣＨ３．８４．２、ＣＨ３．８５．１、ＣＨ３．８６、ＣＨ３．８８、ＣＨ３．９０（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）の１つ以上の位置において生成させる。一態様において、一方のＣＨ３ドメインは、Ｓ３６４Ｌ、Ｔ３６６Ｖ、Ｌ３６８Ｑ、Ｄ３９９Ｌ、Ｆ４０５Ｓ、Ｋ４０９Ｆ及びＴ４１１Ｋ／Ｓ＿ＣＨ３．２０＿Ｌ、Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｖ、Ｌ＿ＣＨ３．２４＿Ｑ、Ｄ＿ＣＨ３．８４．２＿Ｌ、Ｆ＿ＣＨ３．８５．１＿Ｓ、Ｋ＿ＣＨ３．８８＿Ｆ、Ｔ＿ＣＨ３．９０＿Ｋ（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）からなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する一方、他方のＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ｆ、Ｋ４０９Ｑ及びＴ４１１Ｄ／Ｙ＿ＣＨ３．８６＿Ｆ、Ｋ＿ＣＨ３．８８＿Ｑ及びＴ＿ＣＨ３．９０＿Ｄ（ＥＵ／ＩＭＧＴナンバリング）からなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。極性架橋方針は、例えば、国際公開第２００６／１０６９０５号パンフレット、国際公開第２００９／０８９００４号パンフレット及びＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８５：１９６３７－１９６４６に記載されており、その内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のアミノ酸の置き換えは、当技術分野において公知の技術を使用してＣＨ３ドメイン中に導入される。通常、重鎖をコードするＤＮＡは、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈに記載の技術を使用して遺伝子人工操作される。オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、２つのハイブリッド重鎖をコードするＤＮＡの置換バリアントの調製に好ましい方法である。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）ＤＮＡ，２：１８３により記載されているとおり当技術分野において公知である。
コンジュゲート
本開示は、融合タンパク質を生成するための異種タンパク質又はポリペプチドに（又はその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドに）組換え融合している又は化学コンジュゲート（共有及び非共有結合コンジュゲーションの両方を含む）している人工操作免疫グロブリン（例えば、抗体）又はその断片を含む。タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを抗体又は抗体断片に融合又はコンジュゲートする方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、米国特許第５，６２２，９２９号明細書、米国特許第５，３５９，０４６号明細書、米国特許第５，３４９，０５３号明細書、米国特許第５，４４７，８５１号明細書、及び米国特許第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７４３４号明細書及び欧州特許第３６７１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレット及び国際公開第９１／０６５７０号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ ８８：１０５３５－１０５３９；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０－５６００；及びＶｉｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ ８９：１１３３７－１１３４１参照。
追加の融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、及び／又はコドンシャッフリング（まとめて、「ＤＮＡシャッフリング」と称される）の技術を介して生成することができる。ＤＮＡシャッフリングを用いて本開示の分子又はその断片の活性を変更することができる（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する分子又はその断片）。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８１１，２３８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書、米国特許第５，８３４，２５２号明細書、及び米国特許第５，８３７，４５８号明細書；Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４－３３；Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６－８２；Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５－７６；及びＬｏｒｅｎｚｏ ＆ Ｂｌａｓｃｏ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４（２）：３０８－３１３（これらの特許及び刊行物のそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）参照。本明細書に記載の分子又はその断片は、組換え前にエラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入又は他の方法によるランダム突然変異誘発に供することにより変更することができる。本分子の断片をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の異種分子の１つ以上の構成成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換えることができる。
さらに、本開示の人工操作免疫グロブリンは、マーカー配列、例えば、ペプチドに融合させて精製を容易にすることができる。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ－ヒスチジンペプチド（配列番号２５５）、例えば、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）中に提供されるタグであり、それらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ ８６：８２１－８２４に記載のとおり、ヘキサ－ヒスチジン（配列番号２５５）は、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：７６７）、及び「ｆｌａｇ」タグが挙げられる。
他の実施形態において、本開示の人工操作免疫グロブリンは、診断又は検出剤にコンジュゲートされる。このような分子は、臨床試験手順の一部としての疾患又は障害の発症、発生、進行及び／又は重症度のモニタリング又は予後診断、例えば、特定の治療法の有効性の決定に有用であり得る。このような診断及び検出は、分子を検出可能な物質、例として、限定されるものではないが、種々の酵素、例えば、限定されるものではないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリン；発光材料、例えば、限定されるものではないが、ルミノール；生物発光材料、例えば、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン；放射性材料、例えば、限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、及び１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、及び１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｉｎ；並びに種々の陽電子放出断層撮影を使用する陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンにカップリングすることにより達成することができる。
本出願は、治療部分にコンジュゲートしている本開示の人工操作免疫グロブリンの使用をさらに包含する。例えば、治療部分は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制又は殺細胞剤、治療剤又は放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体であり得る。細胞毒素又は細胞毒性剤としては、細胞に有害な任意の薬剤が挙げられる。
さらに、人工操作免疫グロブリンは、所与の生物学的応答を改変する治療部分又は薬物部分にコンジュゲートすることができる。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチド、又はポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素；タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス剤、抗血管新生剤；又は生物学的応答調節物質、例えば、リンホカインなどを挙げることができる。
細胞毒素、リンカーのタイプ及び治療剤を人工操作免疫グロブリンにコンジュゲートする方法のさらなる考察については、Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９－２１５；Ｔｒａｉｌ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８－３３７；Ｐａｙｎｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７－２１２；Ａｌｌｅｎ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２：７５０－７６３；Ｐａｓｔａｎ ＆ Ｋｒｅｉｔｍａｎ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，３：１０８９－１０９１；Ｓｅｎｔｅｒ ＆ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７－２６４も参照。
本開示の人工操作免疫グロブリンを放射性同位体にコンジュゲートして放射性免疫コンジュゲートとも称される細胞毒性放射性医薬品を生成することもできる。診断又は治療的な使用のために人工操作免疫グロブリンにコンジュゲートすることができる放射性同位体の例としては、限定されるものではないが、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、及びルテチウム１７７が挙げられる。放射性免疫コンジュゲートを調製する方法は、当技術分野において確立されている。例えば、Ｄｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３－９０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３－７；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３－５０参照、それぞれ参照により全体として組み込まれる。
治療部分を人工操作免疫グロブリン、例えば、抗体又は抗体様分子にコンジュゲートするための技術は公知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３－５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３－５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５－５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３－１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９－５８参照。
人工操作免疫グロブリンは、免疫アッセイ又は標的抗原の精製に特に有用である固体担体に付着させることもできる。このような固体担体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンが挙げられる。
人工操作免疫グロブリンを作製する方法
ポリペプチド鎖の調製
抗体又は免疫グロブリン及びその断片は、種々の技術、例として、慣用のモノクローナル抗体技術、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術により産生することができる。モノクローナル抗体を産生するための多くの技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換を用いることができる。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、ネズミ系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、確立された手順である。免疫化プロトコル及び融合のための免疫化脾細胞の単離のための技術は、当技術分野において公知である。融合相手（例えば、ネズミ骨髄腫細胞）及び融合手順も公知である。
キメラ又はヒト化抗体は、上記のとおり調製されるネズミモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを目的のネズミハイブリドーマから得、標準的分子生物学技術を使用して非ネズミ（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように人工操作することができる。例えば、キメラ抗体を作出するため、当技術分野において公知の方法を使用してネズミ可変領域をヒト定常領域に結合させることができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．参照）。ヒト化抗体を作出するため、当技術分野において公知の方法を使用してネズミＣＤＲ領域をヒトフレームワーク中に挿入することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、Ｗｉｎｔｅｒ、及び米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書及び米国特許第６，１８０，３７０号明細書、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．参照。
ある実施形態において、本開示の抗体又は免疫グロブリンは、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニック又はトランスクロモソミックマウスを使用して生成することができる。これらのトランスジェニック及びトランスクロモソミックマウスとしては、本明細書においてそれぞれＨＵＭＡＢマウス及びＫＭマウスと称されるマウスが挙げられ、本明細書においてまとめて「ヒトＩｇマウス」と称される。
ＨＵＭＡＢマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、再編成されていないヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を、内因性μ及びκ鎖遺伝子座を不活性化させる標的化突然変異（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６－８５９参照）と一緒に含有する。したがって、マウスはマウスＩｇＭ又はκの低減された発現を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子はクラススイッチ及び体細胞突然変異を受けて高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）前掲；Ｌｏｎｂｅｒｇ，（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９－１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ＆ Ｈｕｓｚａｒ，（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３、及びＨａｒｄｉｎｇ ＆ Ｌｏｎｂｅｒｇ，（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６に概説されている）。ＨＵＭＡＢマウスの調製及び使用、並びにそのようなマウスにより担持されるゲノム改変は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７－６２９５；Ｃｈｅｎ Ｙ．，（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７－６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ Ｙ．，（１９９３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：３７２０－３７２４；Ｃｈｏｉ Ｙ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７－１２３；Ｃｈｅｎ Ｙ．，（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８２１－８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２－２９２０；Ｔａｙｌｏｒ Ｙ．，（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７９－５９１；及びＦｉｓｈｗｉｌｄ Ｙ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－８５１にさらに記載されており、それらの全ての内容は参照により全体として本明細書に具体的に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；及び米国特許第５，７７０，４２９号明細書；全て、Ｌｏｎｂｅｒｇ ＆ Ｋａｙ；米国特許第５，５４５，８０７号明細書、Ｓｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．；国際公開第９２／１０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９７／１１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット及び国際公開第９９／４５９６２号パンフレット、全てＬｏｎｂｅｒｇ ＆ Ｋａｙ；並びに国際公開第０１／１４４２４号パンフレット、Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．参照。
別の実施形態において、本開示において使用されるヒト抗体又は免疫グロブリンは、導入遺伝子及び導入染色体上のヒト免疫グロブリン配列を担持するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスを使用して生じさせることができる。このようなマウスは、本明細書において「ＫＭマウス」と称され、国際公開第０２／４３４７８号パンフレット（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ）に詳述されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的トランスジェニック動物系が当技術分野において利用可能であり、それを使用してヒト抗体を生じさせることができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称される代替的トランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号明細書；米国特許第６，０７５，１８１号明細書；米国特許第６，１１４，５９８号明細書；米国特許第６，１５０，５８４号明細書及び米国特許第６，１６２，９６３号明細書（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ）に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的トランスクロモソミック動物系が当技術分野において利用可能であり、それを使用して本開示のヒト抗体又は免疫グロブリンを生じさせることができる。例えば、「ＴＣマウス」と称されるヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体の両方を担持するマウスを使用することができ；このようなマウスはＴｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：７２２－７２７に記載されている。さらに、ヒト重鎖及び軽鎖導入染色体を担持するウシが当技術分野において記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８８９－８９４）、それを使用して本出願において使用されるヒト抗体を生じさせることができる。
ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。ヒト抗体を単離するこのようなファージディスプレイ法は当技術分野において確立されており、又は以下の実施例に記載される。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；及び米国特許第５，５７１，６９８号明細書（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ）；米国特許第５，４２７，９０８号明細書及び米国特許第５，５８０，７１７号明細書（Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ）；米国特許第５，９６９，１０８号明細書及び米国特許第６，１７２，１９７号明細書（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ）；及び米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第６，５２１，４０４号明細書；米国特許第６，５４４，７３１号明細書；米国特許第６，５５５，３１３号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書及び米国特許第６，５９３，０８１号明細書（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ）参照。
本開示において使用されるヒトモノクローナル抗体は、免疫化時にヒト抗体応答を生じさせることができるようにヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。このようなマウスは、例えば、米国特許第５，４７６，９９６号明細書及び米国特許第５，６９８，７６７号明細書（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ）に記載されている。
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載の少なくとも１つの改変Ｆｃドメインを含む、上記の方法のいずれかにより生成された抗体を提供する。
核酸及び発現系
本発明はまた、本明細書に記載の人工操作免疫グロブリンのポリペプチド鎖、Ｆｃドメイン又はＦｃ領域をコードする核酸を包含する。本開示の核酸分子としては、一本鎖及び二本鎖形態の両方のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに対応する相補的配列が挙げられる。本開示の核酸分子としては、全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子並びにそれらの断片の組み合わせが挙げられる。本開示の核酸はヒト資源に由来するが、非ヒト種に由来するものも含まれ得る。
「単離核酸」は、天然に生じる資源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノム中に存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸である。例えば、鋳型から酵素的に、又は化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、そのようなプロセスから生じる核酸が単離核酸であることが理解される。単離核酸分子は、個別の断片の形態の、又はより大きい核酸構築物の構成成分としての核酸分子を指す。１つの好ましい実施形態において、核酸は、汚染内因性材料を実質的に有さない。核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋な形態で、且つ標準的生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されるもの）によるその構成成分ヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収を可能とする量又は濃度で少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡに由来している。このような配列は、好ましくは、典型的には真核生物遺伝子中に存在する内部非翻訳配列、又はイントロンにより中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列はオープンリーディングフレームから５’又は３’に存在し得、その場合、それはコード領域の操作も発現も妨害しない。
バリアント配列は、本明細書に概説されるとおり、そのバリアントをコードするＤＮＡを産生するための、カセット若しくはＰＣＲ突然変異誘発又は当技術分野において公知の他の技術を使用する、ポリペプチドをコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発、及びその後に細胞培養物中でその組換えＤＮＡを発現させることにより調製することができる。
「最適化ヌクレオチド配列」は、産生細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするようにヌクレオチド配列が変更されたことを意味する。最適化ヌクレオチド配列は、「親」配列としても公知の出発ヌクレオチド配列により最初にコードされるアミノ酸配列を完全に保持するように人工操作される。
本開示はまた、少なくとも１つの上記のポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写又は発現カセットの形態の発現系及び構築物を提供する。さらに、本開示は、そのような発現系又は構築物を含む宿主細胞を提供する。人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片の重鎖及び軽鎖は、単一核酸によりコードさせる（例えば、単一ベクター中に挿入する）ことができ、又は複数の核酸分子、例えば、２つの核酸分子（「セット」とも称される）によりコードさせることができ、それらは複数のベクター（例えば、２つのベクター、すなわち、ベクターのセット）中に挿入することができる。
一実施形態において、本発明は、改変された第１及び第２のＦｃドメインを含むＦｃ領域を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片を調製する方法であって、（ａ）人工操作Ｆｃドメインポリペプチドを含む重鎖をコードする核酸及び軽鎖ポリペプチドを含む核酸を含む宿主細胞を培養し、培養された宿主細胞は、人工操作ポリペプチドを発現するステップ；及び（ｂ）宿主細胞培養物から人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンを回収するステップを含む方法を提供する。
本開示における使用の発現ベクターは、出発ベクター、例えば、市販のベクターから構築することができる。ベクターを構築し、人工操作免疫グロブリンのポリペプチド鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位中に挿入した後、完成ベクターを増幅及び／又はポリペプチド発現のために好適な宿主細胞中に挿入することができる。選択宿主細胞中への発現ベクターの形質転換は、公知の方法、例として、形質移入、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介形質移入、又は他の公知の技術により達成することができる。選択される方法は、部分的には、使用すべき宿主細胞のタイプに依存する。これらの方法及び他の好適な方法は当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１、前掲に記載されている。
典型的には、宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための並びに外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有する。このような配列は、まとめて「フランキング配列」と称され、ある実施形態において、典型的には、以下のヌクレオチド配列の１つ以上：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるべきポリペプチドをコードする核酸の挿入のためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメントが挙げられる。
宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合、それを使用して二重特異的抗体を発現させることができ、続いてそれを培養培地から（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）又はそれを産生する宿主細胞から直接（それが分泌されない場合）回収することができる。適切な宿主細胞の選択は、種々の因子、例えば、所望の発現レベル、活性に望ましい又は必要なポリペプチド改変（例えば、グリコシル化又はリン酸化）及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さに依存する。宿主細胞は、真核生物でも原核生物でもよい。
発現用宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当技術分野において周知であり、それとしては、限定されるものではないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から利用可能な不死化細胞系及び当技術分野において公知の発現系中で使用される任意の細胞系が挙げられ、それらを使用して本開示の人工操作免疫グロブリンを含むポリペプチドを作製することができる。一般に、宿主細胞は、所望の人工操作免疫グロブリンをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。用いることができる宿主細胞のうち、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞が存在する。原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は細菌が挙げられる。高等真核生物細胞としては、昆虫細胞及び哺乳類起源の樹立細胞系が挙げられる。好適な哺乳類宿主細胞系の例としては、ＣＯＳ－７細胞、Ｌ細胞、Ｃｌ２７細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は無血清培地中で成長するそれらの誘導体及び関連細胞系、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞系、ＣＶＩＩＥＢＮＡ細胞系、ヒト胚腎細胞、例えば、２９３、２９３ＥＢＮＡ又はＭＳＲ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞系、正常二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物に由来する細胞株、初代外植体、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。任意選択で、種々のシグナル伝達又はレポーターアッセイにおいてポリペプチドを使用することが望ましい場合、哺乳類細胞系、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ３Ｔ３又はＳ４９などをポリペプチドの発現に使用することができる。或いは、下等真核生物、例えば、酵母中で又は原核生物、例えば、細菌中でポリペプチドを産生することが可能である。好適な酵母としては、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、***酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、又は異種ポリペプチドを発現し得る任意の酵母株が挙げられる。好適な細菌株としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、又は異種ポリペプチドを発現し得る任意の細菌株が挙げられる。人工操作免疫グロブリンを酵母又は細菌中で作製する場合、その中で産生された産物を、例えば、適切な部位のリン酸化又はグリコシル化により改変して機能的産物を得ることが望ましいことがある。このような共有結合は、公知の化学又は酵素法を使用して達成することができる。
医薬組成物及び投薬
本明細書において、本開示の人工操作免疫グロブリンを含む医薬組成物が提供される。人工操作免疫グロブリンは、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体との組み合わせであり得る。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む医薬又は無菌組成物を調製するため、免疫グロブリンを薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と混合する。「薬学的に許容可能な」という語句は、連邦若しくは州政府の規制機関により承認されていること、又は動物、より特定すると、ヒトにおける使用について米国薬局方若しくは他の一般に認識される薬局方に列記されていることを意味する。「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの活性成分（例えば、本開示の人工操作免疫グロブリン）及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体の混合物を指す。「医薬品」は、医学的処置に使用される物質を指す。
治療及び診断剤の医薬組成物は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、又は懸濁液の形態で生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより調製することができる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｏｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．参照）。
治療薬のための投与レジメンの選択は、いくつかの因子、例として、実体の血清又は組織ターンオーバー速度、症状のレベル、実体の免疫原性、及び生物学的マトリックスにおける標的細胞の接近可能性に依存する。ある実施形態において、投与レジメンは、許容レベルの副作用と整合させて患者に送達される治療薬の量を最大化する。したがって、送達される生物薬の量は、部分的には、特定の実体及び処置されている病態の重症度に依存する。抗体、サイトカイン、及び小分子の適切な用量の選択指針が利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１－６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６－１９７３；Ｓｌａｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３－７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３－６１９；Ｇｈｏｓｈ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４－３２；Ｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４－１６０２参照）。
適切な用量の決定は、例えば、当技術分野において処置に影響を与えることが公知の若しくは疑われ、又は処置に影響を与えることが予測されるパラメータ又は因子を使用して臨床医により行われる。一般に、用量は、最適用量よりもいくらか少ない量で開始し、その後に任意の負の副作用に対して所望又は最適効果が達成されるまでそれを少しずつ増加させる。重要な診断尺度としては、例えば、炎症の症状のもの又は産生される炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性なしで特定の患者、組成物、及び投与方式について所望の治療応答を達成するために有効な活性成分の量を得るように変えることができる。選択投与量レベルは、種々の薬物動態因子、例として、用いられる本開示の特定の組成物、又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の***速度、処置の持続期間、用いられる特定の化合物との組み合わせで使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、病態、全身健康状態及び既往歴、並びに医学分野において公知の同様の因子に依存する。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む医薬組成物は、連続注入により、又は例えば、１日、１週間、若しくは週１～７回の間隔の用量により提供することができる。用量は、静脈内に、皮下的に、局所的に、経口的に、経鼻的に、直腸的に、筋肉内で、脳内で、又は吸入により提供することができる。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療薬の望ましい用量は、モル／ｋｇ体重基準で抗体又はポリペプチドとほぼ同じである。対象に投与される用量は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２以上になり得る。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療薬のため、患者に投与される投与量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ患者体重であり得る。
一連の用量を投与する場合、例えば、それらをほぼ毎日、ほぼ毎週、ほぼ毎月投与することができる。用量は、例えば、疾患進行、有害事象、又は医師により決定される他の時間まで投与し続けることができる。
特定の患者についての有効量は、因子、例えば、処置されている病態、患者の全身健康状態、投与の方法、経路及び用量並びに副作用の重症度に応じて変動し得る（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ参照）。
必要な場合、本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療薬は、可溶化剤及び注射部位における疼痛を軽減するための局所麻酔薬、例えば、リドカインを含む組成物中に取り込むことができる。さらに、例えば、吸入器又はネブライザー、及びエアロゾル化剤を有する配合物の使用により経肺投与を用いることもできる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号明細書、米国特許第５，９８５，３２０号明細書、米国特許第５，９８５，３０９号明細書、米国特許第５，９３４，２７２号明細書、米国特許第５，８７４，０６４号明細書、米国特許第５，８５５，９１３号明細書、米国特許第５，２９０，５４０号明細書、及び米国特許第４，８８０，０７８号明細書；並びに国際公開第９２／１９２４４号パンフレット、国際公開第９７／３２５７２号パンフレット、国際公開第９７／４４０１３号パンフレット、国際公開第９８／３１３４６号パンフレット、及び国際公開第９９／６６９０３号パンフレット参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療薬は、当技術分野において公知の種々の方法の１つ以上を使用して１つ以上の投与経路を介して投与することもできる。当業者により認識されるとおり、投与経路及び方式は、所望の結果に応じて変動する。抗体の選択投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路、例えば、注射又は注入によるものが挙げられる。非経口投与は、通常、注射による腸及び局所投与以外の投与方式を表し得、それとしては、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。或いは、本開示の組成物は、非経口経路、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路を介して、例えば、鼻腔内で、経口的に、経膣的に、直腸的に、舌下的に又は局所的に投与することができる。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療薬は、例えば、注射デバイス、注射ペン、バイアル及びシリンジ、プレフィルドシリンジ、自動注射器、注入ポンプ、パッチポンプ、注入バッグ及び針などを使用して上記経路のいずれかを介して投与することができる。本開示の分子又はその断片を制御放出又は徐放系中で投与する場合、ポンプを使用して制御放出又は徐放を達成することができる（Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４参照）。ポリマー材料を使用して本開示の治療薬の制御放出又は徐放を達成することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ（１９８３）Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１参照；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，７（１）：１０５；米国特許第５，６７９，３７７号明細書；米国特許第５，９１６，５９７号明細書；米国特許第５，９１２，０１５号明細書；米国特許第５，９８９，４６３号明細書；米国特許第５，１２８，３２６号明細書；国際公開第９９／１５１５４号パンフレット；並びに国際公開第９９／２０２５３号パンフレットも参照。徐放配合物中で使用されるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態において、徐放配合物中で使用されるポリマーは、不活性で、浸出不純物を有さず、貯蔵安定的で、無菌で、生分解性である。制御放出又は徐放系は、予防又は治療標的に近接して配置することができ、したがって、全身用量のほんの一部が要求されるにすぎない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、前掲、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）参照）。
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：１５２７－１５３３）による概説において考察されている。当業者に公知の任意の技術を使用して本出願の１つ以上の分子又はその断片を含む徐放配合物を産生することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号明細書、国際公開第９１／０５５４８号パンフレット、国際公開第９６／２０６９８号パンフレット、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３９：１７９－１８９；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ＆ Ｔｅｃｈ．，５０：３７２－３９７；Ｃｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３－８５４；Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：７５９－７６０参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む医薬組成物を局所投与する場合、それは軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチ剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー剤、噴霧剤、エアロゾル剤、液剤、乳濁液剤の形態、又は当業者に公知の他の形態で配合することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）参照。非噴霧局所剤形のため、局所適用と適合性の担体又は１つ以上の賦形剤を含み、一部の例において、水よりも大きい動的粘度を有する粘性から半固体又は固体形態が典型的には用いられる。好適な配合物としては、限定されるものではないが、液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、膏薬などが挙げられ、それらは、所望により、滅菌され、又は種々の特性、例えば、浸透圧などに影響を与えるために補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、又は塩）と混合される。他の好適な局所剤形としては、活性成分が一部の例において固体又は液体不活性担体との組み合わせで加圧揮発物質（例えば、気体噴射剤、例えば、Ｆｒｅｏｎ）との混合物中で、又はスクイーズボトル中でパッケージされている噴霧エアロゾル製剤が挙げられる。所望により、保湿剤又は加湿剤を医薬組成物及び剤形に添加することもできる。このような追加の成分の例は、当技術分野において公知である。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む医薬組成物を鼻腔内投与する場合、それをエアロゾル形態、スプレー、ミストで、又は液滴の形態で配合することができる。特に、本開示による使用のための予防又は治療剤は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適な気体）を使用する加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提供物の形態で簡便に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することにより決定することができる。化合物及び好適な粉末基剤、例えば、ラクトース又はデンプンの粉末混合物を含有する、吸入器又は散布器における使用のためのカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される）を配合することができる。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む医薬組成物は、患者に定期的に投与することもできる。
ある実施形態において、本開示の人工操作免疫グロブリンを含む医薬組成物は、適切なインビボ分布を確保するように配合することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。本開示の治療化合物がＢＢＢを通過することを確保するため（所望により）、それらを、例えばリポソーム中で配合することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書；米国特許第５，３７４，５４８号明細書；及び米国特許第５，３９９，３３１号明細書参照。リポソームは規定の細胞又は器官中に選択的に輸送され、したがって標的化薬物送達を向上させる１つ以上の部分を含み得る（例えば、Ｒａｎａｄｅ ＶＶ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５参照）。例示的な標的化部分としては、葉酸塩又はビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号明細書、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３９：１８０）；サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が挙げられ；Ｋｅｉｎａｅｎｅｎ ＆ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３４６：１２３－６；Ｋｉｌｌｉｏｎ ＆ Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２７３も参照。
本出願はまた、本開示の人工操作免疫グロブリンを他の治療法又は治療剤との組み合わせで含む医薬組成物を使用する患者の同時投与又は処置のためのプロトコルを提供する。追加の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、又は放射線を用いる同時投与又は処置の方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｐｏｏｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，Ｐａ．；Ｃｈａｂｎｅｒ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，Ｐａ．参照）。有効量の治療薬は、症状を少なくとも１０％だけ、少なくとも２０％だけ、少なくとも約３０％だけ、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％だけ減少させ得る。
一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は、１つ以上の追加の治療剤をさらに含む。
上記の治療レジメンに加え、患者を手術及び他の理学療法の形態に供することができる。
治療用途
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物は、限定されるものではないが、本明細書において「細胞増殖障害又は病態」と称される細胞の異常増殖が存在する細胞増殖障害又は病態の処置、予防、又は改善に有用である。一態様において、本開示は、細胞増殖障害又は病態を処置する方法を提供する。一態様において、処置の対象はヒトである。
本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物を使用して処置し、予防し、又は改善することができる細胞増殖障害又は病態の例としては、限定されるものではないが、線維症及び癌が挙げられる。本明細書において使用されるとき、「癌」という用語は、組織病理学的タイプも侵襲のステージも関係なく、全てのタイプの癌性成長若しくは発癌プロセス、転移性組織又は悪性形質転換細胞、組織、若しくは器官が含まれることを意味する。
一実施形態において、人工操作免疫グロブリンは、フィブロネクチンＥＤＡ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２及び固形腫瘍抗原からなるリストから選択される標的抗原に結合する。
具体的な実施形態において、本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物の、本明細書に記載の方法による対象への投与は、１、２、又は３つ以上の結果を達成する：（１）腫瘍又は新生物の成長の低減；（２）腫瘍の形成の低減；（３）原発性、局所性及び／又は転移性癌の根絶、除去、又は制御；（４）転移の拡がりの低減；（５）死亡率の低減；（６）生存率の増加；（７）生存期間の増加；（８）寛解期の患者数の増加；（９）入院率の減少；（１０）入院期間の減少；並びに（１１）腫瘍のサイズが約１０％超だけ、又は約８％超だけ、又は約６％超だけ、又は約４％超だけ増加しないような維持；好ましくは、腫瘍のサイズは約２％超だけ増加しない。
具体的な実施形態において、本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物の、本明細書に記載の方法による癌を有する対象（一部の実施形態において、癌の動物モデル）への投与は、当技術分野において周知のアッセイを使用して測定して陰性対照を投与された癌を有する対象（一部の実施形態において、同じ癌の動物モデル）における腫瘍の成長に対して腫瘍の成長を少なくとも約２倍、好ましくは、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７倍、又は少なくとも約１０倍だけ阻害し、又は低減させる。別の実施形態において、本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物の、本明細書に記載の方法による癌を有する対象（一部の実施形態において、癌の動物モデル）への投与は、当技術分野において周知のアッセイを使用して測定して陰性対照を投与された癌を有する対象（一部の実施形態において、同じ癌の動物モデル）における腫瘍の成長に対して腫瘍の成長を少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％だけ阻害し、又は低減させる。
癌性障害の例としては、限定されるものではないが、固形腫瘍、血液癌、軟部組織腫瘍、及び転移性病変が挙げられる。
具体的な実施形態において、癌は、乳癌、神経芽細胞腫、リンパ腫、結腸癌、膵管腺癌、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫又は多発性骨髄腫である。
組み合わせ療法
追加の治療剤に関して「組み合わせで」投与される、は、２つ（以上）の異なる処置物が対象に障害による対象の苦痛の過程の間に送達されることを意味する。一部の実施形態において、１つの処置物の送達は第２の処置物の送達が開始する時に依然として生じており、その結果、投与に関して重複が存在する。これは、「同時」又は「同時送達」と称される。他の実施形態において、１つの処置物の送達が終了してから他の処置物の送達が開始する。これは、「連続送達」と称される。いずれかの場合の一部の実施形態において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。本開示の組み合わせ療法の追加の治療剤は、定期的に投与することもできる。組み合わせサイクリング療法は、一定期間の第１の治療物の投与とそれに続く一定期間の第２の治療物の投与並びにこの連続投与の反復を伴う。
本明細書に記載の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物は、１つ以上の他の治療法、例えば、抗癌剤、サイトカイン又は抗ホルモン剤と一緒に投与して癌を処置及び／又は管理することができる。本明細書に記載の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物との組み合わせで使用することができる他の治療法としては、限定されるものではないが、小分子、合成薬物、ペプチド（環状ペプチドを含む）、ポリペプチド、タンパク質、核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチド、例として、限定されるものではないが、アンチセンスヌクレオチド配列、三重ヘリックス、ＲＮＡｉ、及び生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列）、抗体、合成又は天然無機分子、模倣剤、及び合成又は天然有機分子が挙げられる。
本明細書に記載の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物に加えて使用することができる１つ以上の他の治療法の非限定的な例としては、限定されるものではないが、化学療法、放射線療法、細胞毒性剤、化学療法剤、サイトカイン、キナーゼ阻害剤、低用量ゲムシタビン、５－フルオロウラシル及びサイトカインモジュレーターが挙げられる。特に、本開示の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物に加えて使用することができる１つ以上の他の治療法としては、特に、腫瘍微小環境を摂動させる免疫腫瘍学的アプローチ、例えば、組換えＩＬ－２、組換えＩＬ－１５、組換えＩＬ－１２、組換えＩＬ－２１、抗ＩＬ１β、抗ＴＧＦβ、抗ＣＤ３９、抗ＣＤ７３、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ（Ｌ）１、抗ＴＩＭ３、ＨＤＡＣ阻害剤、ＨＩＦ１ａ阻害剤及び抗血管新生薬、例えば、抗ＶＥＧＦが挙げられる。
キット
本開示はまた、細胞増殖障害を有する患者を処置するためのキットを包含する。このようなキットは、本明細書に記載の人工操作免疫グロブリンを含む治療有効量の治療又は医薬組成物を含む。さらに、このようなキットは、本明細書に記載の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物を投与するための手段（例えば、自動注射器、シリンジ及びバイアル、プレフィルドシリンジ、プレフィルドペン）及び使用指示書を含み得る。これらのキットは、細胞増殖障害を治療するための追加の治療剤（下記）を含有し得る。このようなキットは、患者を処置するための、本明細書に記載の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物の投与指示書も含み得る。このような指示書は、本明細書に記載の人工操作免疫グロブリンを含む治療又は医薬組成物についての使用のための用量、投与経路、レジメン、及び総処置継続期間を提供し得る。
「投与するための手段」という語句は、薬物を患者に全身投与するための任意の利用可能な手法、例として、限定されるものではないが、プレフィルドシリンジ、バイアル及びシリンジ、注射ペン、自動注射器、ＩＶ点滴及びバッグ、注入ポンプ、パッチ、注入バッグ及び針などを示すために使用される。このような道具を用いて、患者は薬物を自己投与する（すなわち、医師の補助なしで薬物を投与する）ことができ、又は医療従事者が薬物を投与することができる。
以下の実施例は本開示をさらに説明するために提供するが、その範囲を限定するものではない。本開示の他のバリアントは当業者に容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲により包含される。
実施例１、２及び３に従って生成されたアミノ酸配列に由来する全ての構築物を哺乳類系中で発現させ、精製し（実施例４）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＦｃαＲＩ、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａへの結合について査定した（実施例５）。人工操作免疫グロブリンの機能性は、ヒト新鮮単離ＰＭＮ、ＰＢＭＣ及び単球由来マクロファージを使用する細胞ベースアッセイにより査定した（実施例６及び７）。熱安定性は、示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）の測定法で調査した（実施例８）。全ての実施例は、抗原ＨＥＲ２を認識するＶＨ及びＶＬドメインと、ＩｇＡ２又はＩｇＧ１のいずれかをベースとする人工操作ヒンジ及びＦｃ領域とを含む抗体フォーマットの人工操作免疫グロブリンを使用して実施した。配列番号１は、ＨＥＲ２に結合するＶＨドメインと、ＩｇＧ１からのヒンジ及び定常ドメインとを有する抗ＨＥＲ２結合抗体の全長重鎖配列である。配列番号３は、ＨＥＲ２に結合するＶＨドメインと、ＩｇＡ２のｍ２アロタイプからのヒンジ及び定常ドメインとを有する抗ＨＥＲ２結合抗体の全長重鎖配列である（Ｌｏｍｂａｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）ＭＡＢＳ，１１（６）：１１２２－３８）。配列番号１２４は、ＨＥＲ２に結合するＶＬドメインとＩｇＧ１からの定常ドメイン（ＣＬ；カッパ）とを有する抗ＨＥＲ２結合抗体の軽鎖配列である。
実施例１：ＩｇＡ／ＩｇＧタンパク質人工操作
１．１ ヒトＩｇＡからヒトＩｇＧ免疫グロブリンへのＩｇＡ Ｆｃ／ｈＦｃαＲＩ界面の移行
初期実験作業は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体から、ＨＥＲ２に結合するＶＨ及びＶＬドメインを含むＩｇＡ２アイソタイプ抗体への定常ドメインの段階的移行にフォーカスした。
１．１．１．単量体ＩｇＡ２生成のためのアルファテールピース除去及びＰ＿ＣＨ１．１２４＿Ｒ（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）
ＩｇＡは３つの異なる形態、血液中の循環中の単量体形態、粘膜コンパートメント中で見出される二量体形態及びトランスサイトーシスを受ける分泌コンパートメントとの会合で見出される分泌形態で存在する。目下の作業のため、ＩｇＡ２の単量体形態を使用する場合、タンパク質分解酵素による分解にあまり感受性でないＩｇＡ２の単量体形態を生成することが必要であった。したがって、ＩｇＡ２ ＣＨ３ドメインのＣ末端において見出され、配列番号１３０（図２ａ）に表されるテールピースを、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ＤＥ）により合成された改変配列を使用する標準的クローニング及びＰＣＲ法により除去した。ＩｇＡ２の得られた単量体形態はテールピースを欠き、それを配列番号２（図２ｂ）に示す。さらに、ＣＨ１ドメイン中の１２４位（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）における、ヒンジ領域に直接先行するアミノ酸残基プロリンの存在は、ＩｇＡ２軽鎖がその重鎖とどのように対合するかに影響を与える（Ｌｏｍｂａｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）ＭＡＢＳ，１１（１）：７５－９３）。１２４位におけるプロリンのアルギニンでの置換（Ｐ１２４Ｒ）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（結果示さず）により決定されたとおり、ｈＦｃαＲＩと相互作用するＩｇＡ２の能力に影響を与えずにＩｇＡ２の不均質性（すなわち、軽鎖－重鎖の誤対合）をかなり低減させた（表２）。この改変は、配列番号１３１に示されるとおりテールピースを有するＩｇＡ２配列中で、及び配列番号３に示されるとおりテールピースを有さないＩｇＡ２配列中で作製した。
Figure 2023523794000007
１．１．２．ＩｇＧ１／ＩｇＡ２ ＣＨ１置き換え（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）
ＩｇＡ２定常ドメインを含む抗ＨＥＲ２抗体のＣＨ１ドメインを、ＩｇＧ１の対応するＣＨ１ドメインにより置き換えた（図２ｃ）。人工操作抗体をｈＦｃαＲＩ結合について試験した場合、配列番号４に示されるＣＨ１ドメインの置換は、表面プラズモン共鳴を使用して決定されたとおり、ｈＦｃαＲＩ結合に対して限定された影響を有することが見出された（表３）。
Figure 2023523794000008
１．１．３．ＩｇＧ１／ＩｇＡ２ヒンジ置き換え（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）
ＩｇＡ２抗ＨＥＲ２抗体の重鎖のＣＨ１及びヒンジドメインを、ＩｇＧ１からの対応するＣＨ１及びヒンジドメインで置き換えた（図２ｄ）。人工操作抗体をｈＦｃαＲＩ結合について試験した場合、配列番号７、８及び９に示されるＣＨ１及びヒンジドメインの置換は、表面プラズモン共鳴を使用して決定されたとおり、ｈＦｃαＲＩ結合に対してほどんど影響を有さないことが見出された（表４）。
Figure 2023523794000009
１．１．４．ＩｇＡ２ Ｆｃ／ｈＦｃαＲＩ複合体インシリコ分析（Ｙａｓａｒａ及びＰｙＭｏｌ）
ＩｇＡ１ ＦｃとｈＦｃαＲＩとの複合体に対して結晶構造ＰＤＢ １Ｄ １ＯＷ０を使用してインシリコ分析を実施した。分子可視化用コンピュータプログラムＹＡＳＡＲＡ（ｗｗｗ．ｙａｓａｒａ．ｏｒｇ）及びオープンソース分子可視化システムＰｙＭＯＬ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を使用して３Ｄ複合体構造をディスプレイし、その上で作業した。全ての溶媒曝露残基及びｈＦｃαＲＩに近接して位置する残基（距離ｄ＜７オングストローム）をＩｇＡ１ ＦｃとｈＦｃαＲＩの相互作用に潜在的に関与するとみなした。
１．１．５．ＩｇＧ１／ＩｇＡ１ Ｆｃの重ね合わせ（ＰｙＭＯＬ）
ＩｇＡ１ Ｆｃ／ｈＦｃαＲＩ結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ １ＯＷ０）及びＩｇＧ１ Ｆｃ結晶構造ＰＤＢ １ＦＣ１を使用してＩｇＧ１及びＩｇＡ１ Ｆｃのインシリコ重ね合わせを実施した。この重ね合わせ及び「ネックレス」表示（ＩＭＧＴリソース）に基づき、ＩｇＡ１ Ｆｃ／ｈＦｃαＲＩ相互作用に関与するＩｇＡ１残基と構造的に同等であるＩｇＧ１残基を同定した。
１．１．６．ＩｇＡ／ｈＦｃαＲＩ相互作用部位及び二次構造エレメント抽出（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）
事前に同定されたＩｇＧ１残基（セクション１．１．４参照）を、ＩｇＡ２からの対応する残基により置き換えた。さらに、二次構造（上記１．１．４に記載の残基を保持し、又はそれに関連するアルファヘリックス、ベータ鎖及びターン）を担う残基をＩｇＡ２からＩｇＧ１中に移行させた。それというのも、それらはｈＦｃαＲＩと直接相互作用する残基を保持し、方向付けすることが結晶構造から観察されたためである。
１．１．７．ＩｇＧ／ＩｇＡ ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ２／ＣＨ３エルボー長さ調整（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）
ＩｇＧ１及びＩｇＡ２は同じ構造的相同性を共有するが、アミノ酸配列長さ並びにｈＦｃαＲＩと相互作用するＣＨ２及びＣＨ３保持残基間の角度は異なる。この理由のため、ＩｇＧ１ ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの長さを、本明細書において「ＣＨ２／ＣＨ３エルボー」と称されるＣＨ２／ＣＨ３界面における領域中で調整した（図２ｅ）。この領域は、ＩｇＡ２のＣＨ２ドメインのほぼ最後の３残基及びＣＨ３ドメインの最初の６残基を含み（図８に模式的に示す）、配列番号４、５、６、７、８及び９に示される構造ＩｇＧ１／ＩｇＡ１比較及び「ネックレス」ディスプレイ（ＩＭＧＴリソース）に基づき短縮した。ｈＦｃαＲＩへの結合に対するこのエルボーの長さの影響を表５に示す。
Figure 2023523794000010
１．１．８．合理的設計に基づくＩｇＧ／ＩｇＡ ＣＨ２／ＣＨ２改変
ＩｇＧ１からのＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を既に含む人工操作抗ＨＥＲ２抗体において、次いでＣＨ２ドメインをＩｇＧ１からのＣＨ２ドメインで置き換えた（図２ｆ）。合理的設計を使用して、種々のアミノ酸改変を上記セクション１．１．５に記載の重ね合わせ作業に基づきＣＨ２ドメイン中の位置において作製してＩｇＧ１残基をＩｇＡ２からの対応する残基で置換した（配列番号１０～１２、１４～２３に示される）。これらのＣＨ２突然変異を野生型ＩｇＧ１（配列番号１）と比較して以下の表６にまとめ、ｈＦｃαＲＩ上の結合に対するそれらの影響を表７に提示する。
Figure 2023523794000011
Figure 2023523794000012
１．１．９ 合理的設計を使用するＩｇＧ／ＩｇＡ ＣＨ３／ＣＨ３コア界面置き換え
上記ＣＨ２改変は、人工操作抗体へのｈＦｃαＲＩ結合を回復させるために十分でなかった。したがって、ＣＨ３ドメインの改変がｈＦｃαＲＩ結合に寄与し得たか否かを調査するため、ＩｇＧ１からのＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むが、ＩｇＡ２からのヒンジ及びＣＨ２ドメインを保持し、ＩｇＧ１からのＣＨ２／ＣＨ３エルボー領域を有する人工操作抗ＨＥＲ２抗体を生成した。さらに、さらなる改変をＣＨ３ドメインに導入してＩｇＧ１残基を、ベータシートにより保持されるｈＦｃαＲＩと相互作用するＩｇＡ２残基で置き換えた。構造的分析から、ベータシートの一方の面がＩｇＡ２ ＣＨ３ドメインアミノ酸残基の側鎖をｈＦｃαＲＩに向けてターンさせる一方、ベータシートの他方の面がＩｇＡ２ ＣＨ３残基の側鎖をＣＨ３／ＣＨ３コア界面に向けてターンさせることが公知である。ＣＨ３／ＣＨ３コア残基は残基側鎖の位置決めに、それらの特性及び立体障害に応じてｈＦｃαＲＩとのそれらの相互作用において影響を与え得る。この理由のため、ＣＨ３／ＣＨ３界面におけるＩｇＧ１ ＣＨ３コア残基をＩｇＡ２残基と交換してベータシートの他方の面上に位置するｈＦｃαＲＩと相互作用する残基を正確に方向付けた（図２ｇ；配列番号１３、２４～２７、４６～４８及び８７～９４に示される）。これらのＣＨ２突然変異を以下の表８にまとめ、ｈＦｃαＲＩ結合に対するそれらの効果を表９に提示する。
Figure 2023523794000013
Figure 2023523794000014
１．２ 半合理的設計－ＩｇＡ２からＩｇＧ１へ
上記セクション１．１に記載の純粋な合理的設計は、ＩｇＡ２／ｈＦｃαＲＩ相互作用に関与する残基のＩｇＧ１ Ｆｃ中への後続の移行のための、ＩｇＡ２／ｈＦｃαＲＩ相互作用に関与する残基を同定する可能性を提供した。相互作用残基及び構造エレメントの移行、長さ調整及びＣＨ３／ＣＨ３コア残基の人工操作は、ヒンジ、ＣＨ２／ＣＨ３エルボー及びＣＨ３人工操作については成功した。しかしながら、ＣＨ２及びＣＨ３人工操作の微細なチューニングのため、半合理的アプローチを使用して活動を完了させることが必要であった。
１．２．１．ＡＢＣＤＥＦＧベータ鎖スキャン
既に考察されたとおり、ＩｇＧ１及びＩｇＡ２は高程度の構造的相同性を共有し、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは両方とも逆平行β鎖Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ（ＩＭＧＴ命名法）から作製されるベータシートを含む。ＩｇＡ２ ＣＨ２及びＣＨ３β鎖のそれぞれを、同等のＩｇＧ１β鎖での連続置換により個々にスキャンした。さらに、β鎖をＩｇＡ２／ｈＦｃαＲＩ相互作用におけるそれらの役割に応じて置き換えた。それというのも、一部の鎖はｈＦｃαＲＩと直接相互作用する重要な残基を保持することが公知であるためである。置き換えはＡ＋Ｂ、Ｅ＋Ｆ、Ｃ＋Ｄ、Ｃ＋Ｄ＋Ｇ、Ａ＋Ｂ＋Ｅ＋Ｆ、Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ＋Ｇ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｇであり、最大５つのＩｇＡ２ベータ鎖をＩｇＧ１ベータ鎖により置き換えた。配列番号２８～４１に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインからの残基で置換することによりＩｇＡ２ ＣＨ２ドメインに作製された改変を例示する（図３ａ）。配列番号５８～６８に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインからの残基で置換することによりＩｇＡ２ ＣＨ３ドメインに作製された改変を例示する（図３ｂ）。これらのＣＨ２及びＣＨ３突然変異を以下の表１０及び１２にまとめ、ｈＦｃαＲＩ結合に対するそれらの効果を表１１及び１３に提示する。
Figure 2023523794000015
Figure 2023523794000016
Figure 2023523794000017
Figure 2023523794000018
Figure 2023523794000019
１．２．２．ドメイン切断（上面／下面、正面／側面）
ＩｇＧ１及びＩｇＡ２ ＣＨ２及びＣＨ３は、それらの構造的類似性を考慮して、「ビルディングブロック」と定義することができ、それらのドメインをピースに切断するという可能性がある。２つの異なるタイプの断面を切断した：（ｉ）横断面に従う断面（上面／下面断面）、及び（ｉｉ）正面に従う断面（正面／側面断面）。ＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインを有する抗ＨＥＲ２抗体をベースとする最終構築物は、５０％のＩｇＡ２及び５０％のＩｇＧ１から構成されるＩｇＧ１／ＩｇＡ２ハイブリッドＣＨ２又はＣＨ３ドメインを含有した。配列番号４２～４５に示されるアミノ酸配列はＣＨ２ドメインに作製された改変を例示し、配列番号６９及び７０に示されるアミノ酸配列は横断面又は正面断面置換によりＣＨ３ドメインに作製された改変を例示する。これらのＣＨ２及びＣＨ３突然変異を図３ｃ～図３ｇに模式的に示し、以下の表１４及び１６にまとめ、ｈＦｃαＲＩ結合に対するそれらの効果を表１５及び１７に提示する。
Figure 2023523794000020
Figure 2023523794000021
Figure 2023523794000022
Figure 2023523794000023
１．２．３．トップ－ＣＨ２ジスルフィドノード、ＣＨ３曝露アルファヘリックス
半合理的設計を使用して、ＩｇＡ２のＦｃ領域のどのアミノ酸残基がｈＦｃαＲＩと相互作用するために必要であるかを、そのような相互作用におけるそれらの見かけの無関連役割、又はそれらの残基をｈＦｃαＲＩ界面から隔離する長い距離にかかわらず決定した。ＩｇＡ２のＣＨ２ドメインのトップ上に空間的に位置するジスルフィド結合及びパックされたループ（図９に示す）が、ｈＦｃαＲＩ結合部位におけるＣＨ２ドメイン残基の正確な位置決めにおいて重要な役割を担うことが見出された。このような効果の発見は極めて驚くべきことであった。それというのも、ＣＨ２ドメインのこの部分は、ＩｇＡ２がｈＦｃαＲＩに結合する場合、結合部位から離れて見出されるためである。溶媒により曝露され、ｈＦｃαＲＩから離れて位置するＩｇＡ２のＣＨ３ドメイン上に位置するアルファヘリックスが、ＩｇＡ２ Ｆｃ／ｈＦｃαＲＩ相互作用に対して影響を有することも見出された。配列番号４９～５７及び７３～７９に示されるアミノ酸配列は、間接的なｈＦｃαＲＩ結合に関与する残基を決定するためにＣＨ２ドメインに作製された改変を例示する。配列番号８０～９９に示されるアミノ酸配列は、間接的なｈＦｃαＲＩ結合に関与する残基を決定するためにＣＨ３ドメインに作製された改変を例示する。これらのＣＨ２及びＣＨ３突然変異を図３ｈ及び図３ｉに模式的に示し、以下の表１８及び２０にまとめ、ｈＦｃαＲＩ結合に対するそれらの効果を表１９及び２１に提示する。
Figure 2023523794000024
Figure 2023523794000025
Figure 2023523794000026
Figure 2023523794000027
Figure 2023523794000028
１．３ ホモ二量体を生成するための合理的及び半合理的設計のまとめ
上記のとおり同定されたＩｇＧ１ ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ２／ＣＨ３エルボーからの好ましい人工操作配列を一緒にアセンブルしてＩｇＡ免疫グロブリンのｈＦｃαＲＩ結合能を保持し得る人工操作ＩｇＧ１を生成した。ＣＨ２及びＣＨ３突然変異の位置を示す好ましい構造を、図４ａ及び図４ｂに模式的に示す。人工操作配列のＣＨ２及びＣＨ３突然変異を表２２に列記する。ｈＦｃαＲＩへの結合を表２３及び表２４に示されるとおり表面プラズモン共鳴により特徴付けした。得られた人工操作免疫グロブリンは、親ＩｇＡ２様結合から親ＩｇＡ２よりも約１０倍低い結合の範囲のｈＦｃαＲＩ結合を有した。
この人工操作ラウンドから選択されたリード候補物は配列番号１１９、１２０、１２２及び１２３を含み、ｈＦｃαＲＩに対する対応する結合データを表２４に提示する。次いで、これらの候補物を、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰアッセイにおいてそれぞれ実施例６及び７に記載の手順に従って試験した。結果を図１０、１１及び１２に示す。配列番号１１９、１２０、１２２及び１２３を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、ＳＫ－ＢＲ－３細胞ＰＭＮ殺傷アッセイにおいて親ＩｇＡ２と比較して改善された有効性を有することが示された（図１０）。図１１に示されるとおり、配列番号１２２を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、Ｃａｌｕ－３細胞ＰＭＮ殺傷アッセイにおいて親ＩｇＡ２と同等の有効性を有することが示された。配列番号１２２を含む人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの食作用活性をＡＤＣＰアッセイにおいて決定し、図１２に示す。この免疫グロブリンの食作用活性は、野生型ＩｇＧ１（配列番号１）及び親ＩｇＡ２（配列番号３）の両方と同等であることが示された。
Figure 2023523794000029
Figure 2023523794000030
Figure 2023523794000031
Figure 2023523794000032
Figure 2023523794000033
Figure 2023523794000034
Figure 2023523794000035
Figure 2023523794000036
実施例２：ｈＦｃＲｎ結合、ｈＦｃγＲ結合の回復及びアルファ／ガンマエフェクター機能とｈＦｃＲｎ結合とを合わせたヘテロ二量体の生成
２．１ 半減期延長のためのｈＦｃＲｎ結合回復
ｈＦｃＲｎと相互作用するＩｇＧ１ Ｆｃの重要な残基は、ｈＦｃαＲＩ相互作用を担うＩｇＡ２ Ｆｃ（ＣＨ３）の対応する領域中に位置する。この理由のため、ｈＦｃＲｎ結合能を損失させずにＩｇＡ２ ＣＨ３からＩｇＧ１ ＣＨ３に完全なｈＦｃαＲＩ相互作用部位を移行させることが可能ではなかった。ｈＦｃＲｎ結合が、ＩｇＡ２からのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む人工操作免疫グロブリンに付与され得るか否かを決定するため、ＣＨ３ドメインの置換を、ＩｇＧ１からの対応するアミノ酸残基を用いて作製した（図５ａに模式的に示す；表２５参照）。人工操作免疫グロブリン中のこれらの突然変異を用いると、ｈＦｃＲｎ結合を回復させることができ；しかしながら、これはｈＦｃαＲ結合を損ね、したがって表２５に示されるとおり、ｈＦｃαＲＩに対する人工操作免疫グロブリンの応答がいくらか損失した。
Figure 2023523794000037
２．２ ガンマ応答回復
ＩｇＧ１ Ｆｃ領域ベースとし、ＩｇＡ結合を回復させるための突然変異を有する人工操作免疫グロブリンは、ｈＦｃγＲへの結合によりガンマエフェクター機能を動員する能力を欠いた。したがって、トップ－ＣＨ２ジスルフィドノード領域中に位置するＩｇＡ残基をＩｇＧ１残基により置き換えることが必要であった。ｈＦｃγＲへの結合の向上は、さらなる突然変異をホモ二量体に導入することにより可能であった。これらの突然変異Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ（「ＳＤＩＥ」；ＥＵナンバリング；Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ（２００６）前掲）を、ホモ二量体の両方のＦｃドメインのＣＨ２ドメイン中に導入し（図５ｂに模式的に示す）、人工操作ホモ二量体免疫グロブリンに対するＩｇＧエフェクター機能の回復において有効であった。配列番号１５０～１５３に示されるアミノ酸配列は、ＳＤＩＥ突然変異及び以下の表２６に示される追加の突然変異を含む。
しかしながら、人工操作ホモ二量体免疫グロブリンに対するｈＦｃγＲＩａ及びｈＦｃγＲＩＩＩａ相互作用の回復は、表２７、２８及び２９に示されるとおりｈＦｃαＲＩへの結合を低減させた。表２７に見ることができるとおり、高含有量のＩｇＡに由来する残基を含む人工操作免疫グロブリンは、低含有量のＩｇＡ残基を有する人工操作免疫グロブリンと比べてｈＦｃαＲＩに対する改善された結合親和性を有した。表２８に見ることができるとおり、低含有量のＩｇＡに由来する残基を含む人工操作免疫グロブリンは、高含有量のＩｇＡ残基を有する人工操作免疫グロブリンと比較してｈＦｃγＲＩａに対する改善された結合親和性を有した。ｈＦｃγＲＩａへの結合は、ＣＨ２のトップ上に空間的に位置する残基が完全にＩｇＧ１に由来する場合にのみ観察された。表２９に見ることができるとおり、低含有量のＩｇＡに由来する残基を含む人工操作免疫グロブリンは、高含有量のＩｇＡ残基を有する人工操作免疫グロブリンと比較してｈＦｃγＲＩＩＩａに対する改善された結合親和性を有した。
したがって、ホモ二量体Ｆｃフォーマットを使用してＩｇＡ２又はＩｇＧ１レベルにおけるアルファ及びガンマエフェクター機能の両方を維持することは困難であった。インビトロＰＭＮ／ＰＢＭＣ殺傷アッセイ及びＡＤＣＰアッセイは、配列番号１２２、１４８及び１５２を含む人工操作免疫グロブリンについて、図１３～１６に示されるとおりそれらの観察を裏付ける。
ｈＦｃαＲＩ、ｈＦｃγＲＩａ及びｈＦｃγＲＩＩＩａ結合特性を有する好ましいホモ二量体人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン候補物は、配列番号１４８及び１５２内に含まれるＦｃドメインを含んだ。
Figure 2023523794000038
Figure 2023523794000039
Figure 2023523794000040
Figure 2023523794000041
２．３ ヘテロ二量体Ｆｃ（ノブイントゥホール）
したがって、ＩｇＡ２又はＩｇＧ１レベルにおけるアルファ及びガンマエフェクター機能の両方を維持するための試行の困難は、「ノブイントゥホール」技術（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）前掲）をベースとする人工操作ヘテロ二量体免疫グロブリンＦｃ領域を使用することにより対処した。このような分子において、ｈＦｃＲｎへの結合は、ＩｇＧ１ Ｆｃの一方の片側を、ｈＦｃαＲＩに結合し、それを動員するように人工操作し、ＩｇＧ１ Ｆｃの第２の片側を不変のままにした場合に回復した。ＩｇＧ１ Ｆｃの第２の片側がＩｇＡ２に由来するＣＨ２のトップ上に空間的に位置する残基、例えば、パックされたループ及びジスルフィド結合を含んだ場合、ｈＦｃＲｎへの結合を回復させるためにＩｇＧ１ Ｆｃの第２の片側においてアミノ酸突然変異「ＬＳ」（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ（ＥＵナンバリング）／Ｍ＿ＣＨ３．１０７＿Ｌ／Ｎ＿ＣＨ３．１１４＿Ｓ（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）；Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）前掲）及び「ＹＴＥ」突然変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ（ＥＵナンバリング）／Ｍ＿ＣＨ２．１５．１＿Ｙ／Ｓ＿ＣＨ３．１６＿Ｔ／Ｔ＿ＣＨ２．１８＿Ｅ（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）；Ｄａｌｌ’ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，（２００２）前掲）が要求されたことも見出された。配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１５４、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３及び１６４内に含まれるＦｃドメインは、「ノブ」を導入するための突然変異Ｓ３５４Ｃ／Ｓ＿ＣＨ３．１０＿Ｃ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｗ（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）を含む。配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１５５、１５６、１５７及び１５８内に含まれるＦｃドメインは、「ホール」を導入するための突然変異Ｙ３４９Ｃ／Ｙ＿ＣＨ３．５＿Ｃ、Ｔ３６６Ｓ／Ｔ＿ＣＨ３．２２＿Ｓ、Ｌ３６８Ａ／Ｌ＿ＣＨ３．２４＿Ｓ及びＹ４０７Ｖ／Ｙ＿ＣＨ３．８６＿Ｖ（ＥＵ／Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング）を含む。配列番号１５４、１６０及び１６２内に含まれるＦｃドメインはＬＳ突然変異も含み、配列番号１６３内に含まれるＦｃドメインはＹＴＥ突然変異も含む。「ノブ」突然変異及び追加の突然変異を含むＦｃドメインについての完全な突然変異セットの詳細は、以下の表３０に示す。「ホール」突然変異及び追加の突然変異を含むＦｃドメインについての完全な突然変異セットの詳細は、以下の表３１に示す。
ｈＦｃαＲＩを動員する残基を含むＦｃの片側に「ホール」突然変異を作製する一方、「ノブ」突然変異をそのＦｃの他の片側上に配置することが、この「ノブイントゥホール」構造の機能化に重要であった。ｈＦｃαＲＩを動員するＦｃの片側における「ノブ」突然変異の作製が、ｈＦｃαＲＩに対する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの親和性の高い損失をもたらすことが見出された。
ＩｇＡエフェクター機能を回復させるための突然変異を有する第１のＦｃドメインと、ＩｇＧ１からの第２のＦｃドメインとを含み、実施例１．３に記載のとおり両方のＦｃドメインが「ホール」及び「ノブ」突然変異をそれぞれ有するヘテロ二量体人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンのため、完全なＦｃγＲエフェクター機能をＳＤＩＥ突然変異の付加で回復させた。しかしながら、「ノブ」突然変異のみを含有するＦｃドメイン中にＳＤＩＥ突然変異を導入してＦｃαＲＩ結合を妨害しないようにすることが必要であった。配列番号１６１、１６２及び１６４内に含まれるＦｃドメインは、ＳＤＩＥ突然変異及びヘテロ二量体安定化のための「ノブ」を生成するための突然変異を含む。配列番号１６２内に含まれるＦｃドメインは、ｈＦｃＲｎ結合を回復させるためのＬＳ突然変異も含む。生成されたヘテロ二量体フォーマットを図６ａ～ｅに模式的に示す。
ｈＦｃαＲＩ、ｈＦｃγＲＩａ、ｈＦｃγＲＩＩＩａ及びｈＦｃＲｎへの人工操作ヘテロ二量体免疫グロブリンの結合を、表面プラズモン共鳴により特徴付けした。結果を表３２～３６に示す。ヘテロ二量体リード候補物（図６ａ及び図６ｂに模式的に示す）を表３７に列記し、それぞれ６及び７に記載のとおりインビトロＡＤＣＣ及びＡＤＣＰアッセイにおいて試験した。結果を図１７、図１８及び図１９に示す。以下の結合特性を達成するように、得られる人工操作免疫グロブリンを構築した（表３７参照）：
ａ．親ＩｇＡ２様結合から親ＩｇＡ２よりも約１０倍低い範囲のｈＦｃαＲＩ結合；
ｂ．親ＩｇＡ２様結合から約１０倍低い範囲のｈＦｃαＲＩ結合、及びｈＦｃγ受容体に対する野生型ＩｇＧ１様結合；
ｃ．親ＩｇＡ２様結合から約１０倍低い範囲のｈＦｃαＲＩ結合、及びｈＦｃＲｎに対する野生型ＩｇＧ１様結合；並びに
ｄ．親ＩｇＡ２様結合から約１０倍低い範囲のｈＦｃαＲＩ結合、及びｈＦｃγＲＩａ、ｈＦｃγＲＩＩＩａ及びｈＦｃＲｎに対する野生型ＩｇＧ１様結合。
食作用を査定するためのＡＤＣＰアッセイにおいて、配列番号１３７－１５４ペアを除く全てのヘテロ二量体候補物は、図１９に示されるとおり、親ＩｇＡ２（配列番号３）及び野生型ＩｇＧ１（配列番号１）と比較して増加濃度で改善された食作用を示した。
Figure 2023523794000042
Figure 2023523794000043
Figure 2023523794000044
Figure 2023523794000045
Figure 2023523794000046
Figure 2023523794000047
Figure 2023523794000048
Figure 2023523794000049
まとめ
実施例１及び２に記載のタンパク質人工操作活動は、アルファ及びガンマエフェクター機能の両方を有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンの生成をもたらした。半減期延長のためのｈＦｃＲｎ結合を有する又は有さないこれらの人工操作免疫グロブリンを構築することができ、リード候補物の結合特性及び細胞エフェクター機能を表３７に示す。
Figure 2023523794000050
実施例３：ｈＦｃαＲＩのためのＩｇＡ２ Ｆｃ親和性成熟
３．１ ＩｇＡ２ Ｆｃライブラリー設計
ＩｇＡ１ Ｆｃ／ｈＦｃαＲＩ複合体に対して結晶構造ＰＤＢ １ＯＷ０を使用してインシリコ分析を実施した。それというのも、ＩｇＡ１はヒンジ領域のみ異なるＩｇＡ２と類似の構造を有するためである。ｈＦｃαＲＩに近接して位置する全ての残基はＩｇＡ１ Ｆｃ／ｈＦｃαＲＩ相互作用に潜在的に関与するとみなし、２つのカテゴリーに分類した：（ｉ）「コア」界面領域からの残基（ＬＣＨ２．１５、ＬＣＨ２．１５．１、ＭＣＨ３．１０５、ＥＣＨ３．１０９、ＰＣＨ３．１１３、ＬＣＨ３．１１４、ＡＣＨ３．１１５、ＦＣＨ３．１１６、ＱＣＨ３．１１８、Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリングを使用）及び（ｉｉ）コアを包囲する「シェル」領域からの残基（ＱＣＨ２．９４、ＮＣＨ２．９７、ＨＣＨ２．９８、ＲＣＨ３．１、ＥＣＨ３．３、ＲＣＨ３．４０、ＬＣＨ３．４２、ＳＣＨ３．４５、ＥＣＨ３．４５．２、Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリングを使用）。トリヌクレオチド特異的突然変異誘発（ＴＲＩＭ）ベースアプローチ（Ｖｉｒｎｅｋａｅｓ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：５６００－５６０７；Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２９６：５７－８６）を使用して残基の両方のグループを多様化させて「シェル」領域及び「コア」領域にそれぞれ対応する２つのライブラリーＬ１及びＬ２を生成した。
ＩｇＡ２ ＦｃドメインのエラープローンＰＣＲを使用して第３のライブラリー（ＥＰライブラリー）を生成した（Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８９：３５７６－３５８０）。
３．２ 酵母ディスプレイによるライブラリースクリーニング
酵母ディスプレイ技術（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ．，１５：５５３－５５７）を使用して３つ全てのＩｇＡ２ Ｆｃライブラリーをスクリーニングした。簡潔に述べると、ＩｇＡ Ｆｃを酵母細胞膜上でα－アグルチニン（Ａｇａ１／Ａｇａ２）タンパク質ヘテロ二量体を介して、ＩｇＡ２ ＦｃをＡｇａ２タンパク質のＮ末端に融合させてディスプレイした。４回のソーティングラウンドを実施した：
（ｉ）第１のソーティングラウンドの間、３つ全てのライブラリーを、１％のラフィノース及び２％のガラクトースを含有する選択培地中で振盪させながら２０℃において２日間成長させて酵母細胞表面上でＩｇＡ２ Ｆｃ発現を誘導した。それぞれの培養物をペレット化し、上清を除去し、ペレットを、１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及び２ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳＭ（ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で１回洗浄した。２０ｍｌのＰＢＳＭ中でのペレットの再懸濁後、１００μｌのそれぞれのストレプトアビジン及び抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。細胞を回転させながら室温において１時間インキュベートした。次いで、ＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してビーズを除去した。次いで、ライブラリーをペレット化し、２０ｍｌのＰＢＳＭ＋５０ｎＭのビオチン化ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）（配列番号２５３）中で再懸濁させ、回転させながら室温において１時間インキュベートした。次いで、細胞をペレット化し、上清を除去し、ＰＢＳＭ中で１回洗浄し、次いで２０ｍｌのＰＢＳＭ＋１００μｌのストレプトアビジンマイクロスフェア（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で再懸濁させた。ライブラリーを時折振盪させながら氷上で５分間インキュベートし、次いで細胞をペレット化し、上清を除去し、２０ｍｌのＰＢＳＭ中で再懸濁させ、次いでＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で分離した。カラムを５ｍｌのＰＢＳＭで１回洗浄し、次いで結合細胞を選択培地で溶出させ、選択培地中で最終１０ｍｌにし、振盪させながら３０℃において一晩成長させた。
（ｉｉ）第２のソーティングラウンドのため、３つのライブラリーのそれぞれからの第１のラウンドアウトプットを、１％のラフィノース及び２％のガラクトースを含有する選択培地中で２０℃において２４時間成長させてＩｇＡ発現を誘導した。ライブラリーをペレット化し、ＰＢＳＦ（ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋０．１％のウシ血清アルブミン）中で１回洗浄し、ＰＢＳＦ中で再懸濁させた。それぞれのライブラリーを２つのサンプルに分け；第１のサンプルをＰＢＳＦ中２５ｎＭのビオチン化ＦｃαＲＩにし、第２のサンプルをＰＢＳＦ中１０ｎＭのビオチン化ＦｃαＲＩにした。それぞれに、ウサギ抗ｍｙｃ－タグＤｙｌｉｇｈｔ ４８８（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｌｉｍｅｒｉｃｋ，ＰＡ）を１：１００の最終希釈率において添加し、サンプルを回転させながら室温において１．５時間インキュベートした。サンプルをペレット化し、ＰＢＳＦで１回洗浄し、次いで回転させながらＰＢＳＦ＋１：１００最終ストレプトアビジンＤｙｌｉｇｈｔ ６３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と５分間インキュベートした。次いでサンプルをペレット化し、１回洗浄し、ＰＢＳＦ中で再懸濁させ、４０μｍストレーナーに通して濾過し、次いでＦＡＣＳ Ａｒｉａセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上でのフローサイトメトリーを使用して分析し、ソートした。Ｌ１及びＬ２ライブラリーについては１０ｎＭのＦｃαＲＩサンプルをソートし、ＥＰライブラリーについては２５ｎＭのＦｃαＲＩサンプルをソートした。それぞれの場合において、シグナルの上位１～２％を示す酵母をゲートにかけ、回収し、選択培地中で３０℃において一晩成長させた。
（ｉｉｉ）第３のソーティングラウンドのため、第２のソーティングラウンドからの培養物を選択培地＋１％のラフィノース＋２％のガラクトース中に接種し、２０℃において一晩成長させてＩｇＡ発現を誘導した。第２のラウンドで行ったとおり３つのライブラリーのそれぞれからの細胞を調製し、ソートし、但し検出試薬としてニワトリ抗ｍｙｃタグＦＩＴＣ（Ｇｅｎｅｔｅｘ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）及びＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ Ｄｙｌｉｇｈｔ ６３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ビオチン化ＦｃαＲＩをＥＰライブラリーについて５ｎＭにおいて、Ｌ１ライブラリーについて２ｎＭにおいて、Ｌ２ライブラリーについて１ｎＭにおいて使用した。それぞれの場合において、シグナルの上位１～２％を示す酵母をゲートにかけ、回収し、選択培地中で３０℃において一晩成長させた。
（ｉｖ）第４のソーティングラウンドをＥＰ及びＬ１ライブラリーのみに対して完了させた。第３のソーティングラウンドからの培養物を選択培地＋１％のラフィノース及び２％のガラクトース中に接種し、２０℃において一晩成長させてＩｇＡ発現を誘導した。第２のラウンドで行ったとおりライブラリーのそれぞれからの細胞を調製し、ソートし、但し検出試薬としてマウス抗ｃ ｍｙｃ Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びストレプトアビジンｃｙ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ビオチン化ＦｃαＲＩをＥＰライブラリーについて２ｎＭにおいて、Ｌ１ライブラリーについて１ｎＭにおいて使用した。それぞれの場合において、シグナルの上位１～２％を示す酵母をゲートにかけ、回収し、選択培地中で３０℃において一晩成長させた。
３．３ 全長免疫グロブリンにおけるホットスポット同定及び翻訳
第３（Ｌ２ライブラリー）及び第４（ＥＰ及びＬ１ライブラリー）ラウンド培養物からプラスミドを精製し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で形質転換し、選択寒天プレート上にプレーティングし、３７℃において一晩成長させ、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，９４（３）：４４１－８；Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７７）ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，７４（１２）：５４６３－７）のためにＧｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）に送付した。上位クローンをそれらの出現頻度に基づき選択し、それらを使用してＩｇＡ２／ＦｃαＲＩ相互作用を向上させる突然変異を同定した。ＩｇＡ２残基位置を表３８に提示する。
Figure 2023523794000051
同定された突然変異は、配列番号３を有する全長ＩｇＡ２免疫グロブリン中に単一点突然変異として又は組み合わせで取り込み（図７ａ）、ＨＥＫ２９３細胞中で一過的に発現させた（実施例４に記載のとおり）。同じ突然変異を、配列番号１２２及び１４８を有し、ｈＦｃαＲＩに結合し得る人工操作ＩｇＧ Ｆｃを含有するＩｇＧ１アイソタイプ免疫グロブリン中にも取り込んだ（それぞれ図７ｂ及び図７ｃ）。試験突然変異セットを表３９（配列番号３をベースとする）、表４１（配列番号１２２をベースとする）及び表４３（配列番号１４８をベースとする）に提示する。
Ｆｃバリアントを精製し、ｈＦｃαＲＩに対して測定される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して査定してｈＦｃαＲＩに対する免疫グロブリン親和性に対する規定の突然変異の効果を評価した。興味深いことに、全ての突然変異は、それぞれの免疫グロブリンの発現収量及び凝集傾向に対して限定された効果を有し、又は実際の効果を有さなかった。ＳＰＲデータ及び捕捉後の凝集物含有率を表４０、表４２及び表４４に示す。
最後に、リード候補物をＳＰＲ及び凝集データに基づき選択し、より広範囲のｈＦｃαＲＩ濃度を使用してＳＰＲ実験を繰り返した。適合濃度範囲の使用は、人工操作免疫グロブリンとｈＦｃαＲＩとの間の相互作用のより正確な測定を可能とした。結果を表４５、表４６及び表４７に示す。
Figure 2023523794000052
Figure 2023523794000053
Figure 2023523794000054
Figure 2023523794000055
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Figure 2023523794000059
Figure 2023523794000060
３．４ インビトロアッセイにおけるアルファエフェクター機能の向上への親和性成熟の変換
配列番号２０４、２０９及び２１４内に含まれるホモ二量体Ｆｃを有するリード候補物を、ｈＦｃαＲＩに対するそれらの改善された結合能について選択した。次にこれらを実施例６に記載の手順に従ってＰＭＮ殺傷アッセイにおいて試験した。効力（ＥＣ５０；免疫グロブリンの最大効果の５０％を産生するために要求される免疫グロブリンの濃度）及び有効性（Ｅｍａｘ；免疫グロブリンに予測される最大効果）の結果を図２０～図２４に示す。
全ての試験候補物は活性であり、ＳＫ－ＢＲ－３ ＰＭＮ殺傷アッセイにおいて親ＩｇＡ２と比較して改善された有効性を有することが示された（図２０）。
さらに、ＨＥＲ２受容体密度がＳＫ－ＢＲ－３細胞よりも低いことが公知であるＣａｌｕ－３細胞を使用するＰＭＮ殺傷アッセイにおいて有効性のかなりの改善が示された（図２１）（実施例６に記載）。さらに、同様により低レベルのＨＥＲ２受容体を発現することが公知であるＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞に対するＰＭＮ殺傷アッセイにおいて配列番号２１４を有するバリアントについて効力のかなりの改善が示された（図２２）。
最後に、配列番号２１４を有する親和性成熟バリアントを、最小ＨＥＲ２発現細胞系として公知であるＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞を使用するＰＭＮ殺傷アッセイにおいて試験し、それは極めて高い濃度においても殺傷を示さなかった（図２３）。この観察は、試験候補物の安全なプロファイルを強調する。
Ｑ＿ＣＨ２．９４＿Ｅ、Ｌ＿ＣＨ２．９７＿Ｙ及びＳ＿ＣＨ３．４５＿Ｄの突然変異セットを配列番号１５７内に含まれるヘテロ二量体Ｆｃの「ホール」アームに適用し、配列番号２５２をもたらした。配列番号２５２－１５９及び配列番号２５２－１６１を含むヘテロ二量体Ｆｃ候補物（図７ｄに模式的に示す）を、配列番号１５７－１５９及び配列番号１５７－１６１を有する実施例２からのリードＦｃヘテロ二量体に対して試験した。配列番号２５２－１５９及び配列番号２５２－１６１内に含まれるＦｃドメインを有する人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリンは、それらの親免疫グロブリン及びＩｇＡ２と比較してＰＭＮ殺傷アッセイにおいてＳＫ－ＢＲ－３細胞に対して良好な殺傷特性を有することが示された（図２４ａ及び２４ｃ）が、ＰＢＭＣ殺傷アッセイにおいてはガンマ応答を媒介する効果を示さなかった（図２４ｂ及び２４ｄ）。ｈＦｃαＲＩを認識するＦｃドメイン中への親和性成熟に由来する突然変異の導入はアルファ受容体結合を改善するが、ガンマ受容体結合に影響を与えない。
実施例４：人工操作タンパク質の発現及び精製
重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列をＧｅｎｅａｒｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において合成し、制限酵素－ライゲーションベースのクローニング技術を使用して哺乳類発現ベクター中にクローニングした。得られたプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。簡潔に述べると、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ及び人工操作免疫グロブリン）の一過的発現のため、当量の軽鎖及びそれぞれの人工操作重鎖ベクターを懸濁液適合ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にポリエチレンイミン（（ＰＥＩ）参照カタログ番号２４７６５ Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して同時形質移入した。典型的には、１ｍｌ当たり１～２百万個の細胞の密度における懸濁液中の１００ｍｌの細胞を、人工操作重鎖をコードする５０μｇの発現ベクター及び軽鎖をコードする５０μｇの発現ベクターを含有するＤＮＡと形質移入した。次いで、組換え発現ベクターを宿主細胞中に導入し、７日間の期間の細胞のさらなる培養により構築物を産生して０．１％のｐｌｕｒｏｎｉｃ酸、４ｍＭのグルタミン、及び０．２５μｇ／ｍｌの抗生物質が補給された培養培地（ＨＥＫ、無血清培地）中への分泌を可能とした。
次いで、産生された構築物を無細胞上清から免疫親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４で平衡化された抗カッパＬＣ樹脂（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、液体クロマトグラフィーシステム（Ａｅｋｔａ ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して濾過条件培地とインキュベートした。樹脂をＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄してから、構築物を溶出緩衝液（５０ｍＭのクエン酸塩、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．７）で溶出させた。
捕捉後、溶出タンパク質を、１ＭのＴＲＩＳ ｐＨ１０．０溶液を使用してｐＨ中和し、サイズ排除クロマトグラフィー技術（ＨｉＰｒｅｐ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してポリッシュした。最後に、精製タンパク質をＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中で配合した。
凝集傾向は、捕捉及びｐＨ中和ステップ後に分析サイズ排除クロマトグラフィー技術（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ３．２／３００ＧＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
実施例５：ヒトＦｃ受容体に対するＳＰＲ測定
直接結合アッセイを実施してｈＦｃαＲ、ｈＦｃγＲ１ａ、ｈＦｃγＲＩＩＩａ又はｈＦｃＲｎに対する（完全抗体フォーマットの）人工操作免疫グロブリンの結合を特徴付けした。
速度論的結合親和性定数（ＫＤ）を室温においてＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で測定し、タンパク質をランニング緩衝液の１０ｍＭのＮａＰ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６中で希釈した。アミンカップリングにより抗カッパ軽鎖ｓｃＦｖが固定化されたＣＭ５センサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（実施例５ａ）又はビオチン化抗カッパ軽鎖ｓｃＦｖが固定化されたストレプトアビジンセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（実施例５ｂ）を使用して人工操作免疫グロブリンを捕捉し、組換えヒトｈＦｃαＲ、組換えヒトｈＦｃγＲ１ａ、組換えヒトｈＦｃγＲＩＩＩａ又は組換えヒトｈＦｃＲｎを分析物として適宜使用した。
参照として機能させるため、１つのフローセルはいかなる免疫グロブリンも捕捉しなかった。結合データは、参照上の分析物希釈系列の後続のインジェクション及びフローセルの測定により収集した。ゼロ濃度サンプル（ランニング緩衝液のみ）を含めてデータ評価の間の二重参照を可能とした。データ評価のため、二重参照センサーグラムを、１：１結合モデル分析を適用することにより分析して平衡解離定数（ＫＤ）を生成した。さらに、実験の間に達した最大応答をモニタリングした。最大応答は、飽和時の応答に関する表面の結合能を説明する。
実施例６：抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイ
スイスヒト研究法（Ｓｗｉｓｓ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｃｔ）（Ｂａｓｅｌ組織ドナープログラム－Ｐｒｅｖｏｍｅｄ）に従って新鮮に抜き取られた末梢血から回収された血液サンプルを健常ドナーから得た。ＡＣＫ溶解緩衝液での赤血球の溶解後、多形核細胞（ＰＭＮ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ勾配により単離した。ＰＭＮを使用して人工操作免疫グロブリンのアルファエフェクター機能を特徴付けした一方、ＰＢＭＣを使用して人工操作免疫グロブリンのガンマエフェクター機能を特徴付けした。
エフェクター細胞（新鮮単離されたＰＭＮ又はＰＢＭＣ細胞）を、ＨＥＲ２発現標的細胞（ＳＫ－ＢＲ－３、Ｃａｌｕ－３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３又はＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤから購入）に２０：１のエフェクターと標的との比において添加した。ＳＫ－ＢＲ－３は、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞系である。Ｃａｌｕ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３は、それぞれ、ＳＫ－ＢＲ－３と比較して低いレベルにおいてＨＥＲ２を過剰発現する肺及び乳癌細胞系である（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＭＤＡ－ＭＤ－１７５は、最少量のＨＥＲ２を発現する乳癌細胞系である（Ｃｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
免疫グロブリン構築物を示される濃度において添加し、組み合わせを穏やかに混合し、次いで破壊なしで２６０×ｇにおいて４分間遠心分離して標的及びエフェクター細胞の同時局在化を促した。次いで、アッセイ物を標準的組織培養インキュベーター中で５％のＣＯ２中で３７℃において１８時間インキュベートした。１８時間後、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示書に従って使用して上清をＬＤＨ放出測定に使用した。４９０ｎｍにおける吸光度をＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダー上で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用してデータをグラフ化し、分析した。
実施例７：抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイ
単球を健常ヒト血液から新鮮単離し、ヒトＭ－ＣＳＦを使用して６日間分化させた。Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ紫外線標識単球由来マクロファージ（エフェクター細胞）を、ＣＦＳＥ標識ＨＥＲ２発現標的細胞（ＳＫ－ＢＲ－３過剰発現細胞）に８：１のエフェクターと標的との比において添加した。免疫グロブリンを示される濃度において添加し、組み合わせを穏やかに混合した。次いで、アッセイ物を標準的組織培養インキュベーター中で５％のＣＯ２中で３７℃において２時間インキュベートした。食作用は、ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して二重陽性集団を分析することにより定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用してデータをグラフ化し、分析した。
実施例８：示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）による熱安定性査定
人工操作免疫グロブリン並びにそれらの親ＩｇＧ１及びＩｇＡ２の熱安定性を、下記のとおりカロリメトリー測定を使用して比較した。
カロリメトリー測定は、示差走査マイクロカロリメーター（Ｎａｎｏ ＤＳＣ，ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）上で実施した。細胞容量は０．３ｍｌであり、加熱速度は１℃／分であった。全てのタンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１ｍｇ／ｍｌの濃度において使用した。それぞれのタンパク質のモル熱容量を、タンパク質を除いた同一の緩衝液を含有する２つ組のサンプルとの比較により推定した。標準的手順を使用して部分モル熱容量及び融解曲線を分析した。サーモグラムをベースライン補正し、濃度正規化した。
図２５は、親ＩｇＡ２及び野生型ＩｇＧ１の両方と比較した人工操作免疫グロブリンの熱安定性の全体的な改善を示し、免疫グロブリン人工操作が親免疫グロブリンと比べて改善された熱安定性を有する安定分子もたらしたことを実証する。
対応する組換えＦｃを生成し、同じ方法を使用してそれらの熱安定性をＦａｂと無関係に比較した（図２６）。個々のＣＨ２及びＣＨ３ドメインの融解温度（ＴＭ）を決定することができ（表４８）、いかに人工操作Ｆｃが親ＩｇＡ２及びＩｇＧ１の両方よりも全て安定的であるかを示した。Ｆｃ及び人工操作免疫グロブリンの、それらの全体的な熱安定性に関する格付けは同じままであるが、Ｆａｂ融合がＦｃ熱安定性に影響を与え得ることを確認することは興味深い。
Figure 2023523794000061
実施例９：ＩｇＡと比較した人工操作免疫グロブリンの薬物動態（ＰＫ）特性の改善
９．１ 人工操作免疫グロブリンの材料産生
抗ＨＥＲ２人工操作免疫グロブリン重鎖バリアント配列番号１、３、１５７、１５９、２１２、２５２、２５６、２５７、２５８をコードする核酸をＧｅｎｅａｒｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において合成し、制限酵素－ライゲーションベースのクローニング技術を使用して哺乳類発現ベクター中にクローニングした。選択Ｎ－グリコシル化部位を、関連Ａｓｐ残基のＡｌａによる置換により除去した。重鎖をコードする得られたプラスミドを、軽鎖（配列番号１２４）をコードするプラスミドと哺乳類発現系中に同時形質移入した。ＨＥＫ２９３Ｔ発現細胞系については、発現を実施例４に記載の手順に従って実施した。ＣＨＯ－Ｓ発現細胞系（Ｔｈｅｒｍｏ）については以下の手順を使用した。簡潔に述べると、一過的タンパク質発現のため、発現ベクターを懸濁液適合ＣＨＯ－Ｓ細胞中にＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅＣＨＯ形質移入剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して形質移入した。典型的には、１ｍｌ当たり６百万個の細胞の密度における懸濁液中の４００ｍｌの細胞を、人工操作タンパク質をコードする４００μｇの発現ベクターを含有するＤＮＡと形質移入した。次いで、組換え発現ベクターを、さらなる分泌のために宿主細胞中に培養培地（ＥｘｐｉＣＨＯフィード及びエンハンサー試薬が補給されたＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ））中で数日間導入した。次いで、産生された構築物を無細胞上清から実施例４に記載の手順に従って精製した。生成された材料を表４９及び５０に記載し、血清中の測定された免疫グロブリン濃度を時間の関数でプロットし、図２７及び２８に提示した。
Figure 2023523794000062
Figure 2023523794000063
構築物設計及び事前のＳＰＲ測定と一致して、配列番号１５７－１５９及び配列番号２５２－１５９の配列を有する人工操作免疫グロブリンは、ＣＤ８９に結合した一方、ＦｃＲｎへの結合を保持し（実施例５に記載）、図２７に示されるとおり、ＩｇＡ免疫グロブリンと比較して改善されたＰＫ特性及び改善された半減期を示す。
さらに、図２７に示されるとおり、配列番号２５２－１５９の配列を有する親和性成熟バリアントは、配列番号１５７－１５９の配列を有する親免疫グロブリンと同一のＰＫプロファイルを示す。これは、ＣＤ８９に対する親和性成熟が人工操作免疫グロブリンのＰＫ特性を損なうことを示す。
図２８に提示されるデータは、いかにＮ－グリコシル化パターンが免疫グロブリンＰＫに影響を与えるかを記載する。示されるとおり、人工操作免疫グロブリンのＰＫ特性はＩｇＡと比較して改善され、個々のＮ－グリコシル化部位ＣＨ２．８４．４を除去した場合（配列番号２５７）に改善された。
９．２ マウス試験
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから雄ＣＤ１マウスを得た。到着後、全てのマウスを無病原体動物施設中で、標準的な１２時間の明／１２時間の暗サイクル下で２１℃の室温において不断給餌及び給水で飼育した。全てのマウスは、上記のとおり産生及び精製されたＩｇＧ又はＩｇＡ又は人工操作免疫グロブリン（３ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内（ＩＶ）注射を受けた。それぞれの化合物を３匹のマウス中に注射した。血液サンプルを血清分離チューブ中に伏在静脈を介して注射後の種々の時点において回収した。血液を周囲温度において少なくとも２０分間凝固させた。凝固サンプルを遠心分離まで室温において維持し、それを回収時間の１時間以内に開始した。それぞれのサンプルを１５００～２０００×ｇの相対遠心力において２～８℃で５分間遠心分離した。遠心分離後２０分以内に血清を血液サンプルから分離し、標識された２．０ｍＬのポリプロピレンのコニカル底微小遠心チューブ中に移した。健常であることが明らかな動物及び明らかな異常を有さない動物のみを試験に使用した。実施された全ての動物作業はＮｏｖａｒｔｉｓ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによりレビュー及び承認された。
９．３ 薬物動態試験のための免疫グロブリンＥＬＩＳＡ
免疫グロブリンレベルを連続サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。ＩｇＡ投薬については、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートのウェルをヤギ抗ヒトＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０５３－０１）で４℃において一晩コーティングした。ＩｇＧ及び人工操作免疫グロブリン投薬については、Ｒｏｃｈｅ ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌマイクロタイタープレートのウェルをビオチン化ＳＢヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４９－０８）で室温において１時間コーティングした。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））との１時間のインキュベーション後、同じブロッキング緩衝液中で希釈されたサンプルをブロッキングされたプレートに添加し、室温において２時間インキュベートした。インキュベーション後、セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＡ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０５３－０５）又はセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，カタログ番号２０４９－０５）を添加し、室温において１時間インキュベートした。次いで、プレートを基質溶液（ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質ＴＭＢ、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１４８４２８１００１）とインキュベートし、０．５Ｍの硫酸で反応を停止させた。プレートリーダーを使用して吸光度を４５０ｎｍにおいて測定し、６５０ｎｍで減算した。ステップ間で、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した。
配列情報
表５１は、完全抗体を生成するために使用される、実施例に記載のバリアントＦｃ領域を含む全長重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号）を列記する。本明細書に記載の人工操作ＩｇＧ１免疫グロブリン、全長重鎖、軽鎖又は完全抗体は、慣用の組換えタンパク質産生及び精製プロセスを使用して産生することができる。
本明細書において言及される全ての配列（配列番号）は、表５１に見出される。本出願の本文全体にわたり、本明細書の本文（例えば、表５１）と配列表との間に矛盾が存在する場合、本明細書の本文が優先される。参照番号は、社内配列参照番号を指す。
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Claims (29)

  1. 第１及び第２のＦｃドメインを含むＦｃ領域を含む人工操作ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片であって、前記第１のＦＣドメインは、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記第１のＦｃドメインは、野生型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（配列番号１のアミノ酸ＣＨ２－１．６～ＣＨ３－１２５（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング））と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有し、ヒトＦｃαＲＩに結合し、それを活性化させる人工操作ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン又はその断片。
  2. 前記第１のＦｃドメイン中の前記少なくとも１つのアミノ酸改変は、ＩｇＡ１のＦｃドメイン（配列番号２５４）、野生型ＩｇＡ２のＦｃドメイン（配列番号２のアミノ酸ＣＨ２－１．２～ＣＨ３－１２５（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング））、親ＩｇＡ２のＦｃドメイン（配列番号３のアミノ酸ＣＨ２－１．２～ＣＨ３－１２５（Ｃ－ドメイン用ＩＭＧＴナンバリング））又はＩｇＡ１若しくはＩｇＡ２の親和性成熟バリアントＦｃドメイン中のアミノ酸に対応する置換である、請求項１に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  3. 前記第１のＦｃドメイン中の前記少なくとも１つのアミノ酸改変の結果として、ヒトＦｃＲｎに結合し得る、請求項１又は２に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  4. 野生型ＩｇＧ１と同等の親和性でヒトＦｃＲｎに結合し得る、請求項３に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  5. 前記第１のＦｃドメインは、前記人工操作免疫グロブリン又はその断片がヒトＦｃγＲに結合し得るような少なくとも１つの追加のアミノ酸改変をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  6. ホモ二量体であり、前記第２のＦｃドメインは、野生型ＩｇＧ１からのＦｃドメイン（配列番号１）と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  7. ヘテロ二量体であり、前記第２のＦｃドメインは、野生型ＩｇＧ１からのＦｃドメイン（配列番号１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有し、ヒトＦｃγＲに結合し、それを活性化させる、請求項１又は２に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  8. 前記第２のＦｃドメインは、ＦｃＲｎに結合する、請求項７に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  9. 前記ＦｃγＲは、ヒトＦｃγＲＩａ及びヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項７又は８に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  10. 前記第１のＦｃドメインは、配列番号１２２、配列番号１４８又は配列番号２１４内に含まれるアミノ酸配列を有し、前記第２のＦｃドメインは、配列番号１２２、配列番号１４８又は配列番号２１４内に含まれるアミノ酸配列をそれぞれ有する、請求項１又は２に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  11. 前記第１のＦｃドメインは、配列番号１８８～１９３、２３４～２４２、２０５～２０９若しくは２２３内に含まれるアミノ酸配列を有し、又は配列番号１９４～１９９、２４４～２５１、２１０～２１４若しくは２２４内に含まれるアミノ酸配列を有する、請求項３又は４に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  12. 前記第１のＦｃドメインは、配列番号１５０、１５１、１５２又は１５３内に含まれるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  13. 前記第１のＦｃドメインは、配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１５５、１５６、１５７、１５８又は２５２内に含まれるアミノ酸配列を有し、前記第２のＦｃドメインは、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１５４、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３又は１６４内に含まれるアミノ酸配列を有する、請求項７～９のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  14. 前記第１のＦｃドメインは、配列番号１５７内に含まれるアミノ酸配列を有し、前記第２のＦｃドメインは、配列番号１５９又は１６１内に含まれるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  15. 前記第１のＦｃドメインは、配列番号２５２内に含まれるアミノ酸配列を有し、前記第２のＦｃドメインは、配列番号１５９又は１６１内に含まれるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  16. 可変重鎖ドメイン及び軽鎖をさらに含み、標的抗原を認識し、それに結合する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  17. 前記標的抗原は、フィブロネクチンＥＤＡ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２及び固形腫瘍抗原からなる群から選択される、請求項１６に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片。
  18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片を、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体との組み合わせで含む医薬組成物。
  19. １つ以上の追加の治療剤をさらに含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 細胞増殖障害の処置における使用のための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン若しくはその断片、又は請求項１８若しくは１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記増殖障害は、線維症、乳癌、神経芽細胞腫、リンパ腫、結腸癌、上皮癌、結腸直腸癌、腎臓癌及び粘膜腫瘍からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用のための、人工操作免疫グロブリン若しくはその断片又は医薬組成物。
  22. 細胞増殖障害を処置する方法であって、治療有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン若しくはその断片、又は請求項１８若しくは１９に記載の医薬組成物を、それが必要とされる対象に投与することを含む方法。
  23. 前記増殖障害は、線維症、乳癌、神経芽細胞腫、リンパ腫、結腸癌、上皮癌、結腸直腸癌、腎臓癌及び粘膜腫瘍からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片をコードする単離核酸分子又は核酸分子のセット。
  25. 相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２４に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
  26. 請求項２４又は２５に記載の１つ以上の核酸分子又は核酸分子のセットを含むクローニング又は発現ベクターであって、前記人工操作免疫グロブリン又はその断片の組換え産生に好適であるクローニング又は発現ベクター。
  27. １つ以上の請求項２６に記載のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞。
  28. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン又はその断片を産生する方法であって、請求項２７に記載の宿主細胞を、前記人工操作免疫グロブリン又はその断片を発現させるために十分な条件下で培養し、その後、前記宿主細胞培養物から前記人工操作免疫グロブリン又はその断片を精製し、回収することを含む方法。
  29. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の人工操作免疫グロブリン若しくはその断片又は請求項１８若しくは１９に記載の医薬組成物を含むキットであって、使用指示書及び前記人工操作免疫グロブリン若しくはその断片又は医薬組成物をそれが必要とされる対象に投与する手段をさらに含むキット。
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