JP2023513314A - メタゲノムライブラリーおよび天然物発見プラットフォーム - Google Patents

Abstract

本開示は、天然物コード多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）を同定するための方法およびシステムを提供する。一部の実施形態では、本開示はまた、ＭＧＣ検索生物情報学ツールおよび技法に適している、配列決定され、かつアセンブルされたメタゲノムライブラリーを産生するための方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、メタゲノムライブラリー調製、配列決定およびアセンブリーのための新規方法を教示する。特に、一部の実施形態では、本開示は、初めて、メタゲノム試料の有効なｉｎ ｓｉｌｉｃｏ多重遺伝子クラスター解析を可能にする、より高い品質のアセンブルされた配列を提供する長いアセンブリーメタゲノムライブラリーをもたらす方法を教示する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月１３日に出願された米国仮出願第６２／９７６，１９４号、２０２０年２月１３日に出願された米国仮出願第６２／９７６，１９８号および２０２０年２月１３日に出願された米国仮出願第６２／９７６，２０１号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

開示の分野
本開示は、全般的には、天然物発見の改善のためのシステムおよび方法に関する。開示されるシステムおよび方法は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ天然物発見パイプラインに適している、配列決定されたメタゲノムデータベースをもたらす。新たな天然物コード多重遺伝子クラスターを同定および検証するための方法も提供される。

背景
植物および微小生物由来の天然物は、臨床薬物開発および研究のための歴史的に重要な供給源であった。最初の抗生物質であるペニシリンは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｆｌｅｍｉｎｇによって１９２８年に真菌から発見された。現在、臨床使用されている抗生物質のほぼ３分の２は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓに由来し、現在使用されている薬の総計で約半分は、天然物またはその派生物である。

伝統的に、微小生物における天然物の発見は、二次代謝物の産生を駆り立てるために種々の成長条件下で株を培養し、次いで、様々な医療活動のためにそれらの二次代謝物をアッセイすることを伴っていた。しかし、発見される新たな天然物が少なくなるにつれて、このような伝統的アプローチは、収穫逓減を生じた。

天然物発見における困難から、合成ライブラリーのハイスループットスクリーニングの方が好まれて、多くの製薬会社によって天然物研究の優先順位が落とされた。そうであるにもかかわらず、天然物は、タンパク質と相互作用し、生物学的効果を誘導するように進化したという点において、合成分子ライブラリーを上回る利点を有する。

新たな天然物を同定するための方法、システムおよびツールに対して、継続中かつ満たされていない必要がある。

開示の概要
一部の実施形態では、本開示は、メタゲノムライブラリー調製、配列決定およびアセンブリーのための新規方法を教示する。特に、一部の実施形態では、本開示は、初めて、メタゲノム試料の有効なｉｎ ｓｉｌｉｃｏ多重遺伝子クラスター解析を可能にする、より高い品質のアセンブルされた配列を提供する長いアセンブリーメタゲノムライブラリーをもたらす方法を教示する。

よって、一部の実施形態では、本開示は、徹底的に配列決定された長いＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーをアセンブルするための方法であって、ａ）特有の全ゲノムを含む配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料を提供するステップと、ｂ）ｉ）メタゲノムライブラリー由来のＤＮＡ断片を複数のベクターにクローニングして、配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料由来のＤＮＡを含むメタゲノムベクター断片ライブラリーを創出すること；ｉｉ）メタゲノムベクター断片ライブラリー由来のベクターを、それぞれ約１，０００～約２０，０００個のプールされたベクターを含む複数の別々のミニメタゲノムサブユニットへとプールして、複数のミニメタゲノムサブユニット内に、配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料由来のＤＮＡを含むミニメタゲノムライブラリーを創出することにより、メタゲノムＤＮＡ試料のゲノム複雑性を低下させるステップと、ｃ）ミニメタゲノムライブラリーの複数の別々のミニメタゲノムサブユニットに存在するプールされたベクターに含有されるメタゲノムＤＮＡのプール内配列決定およびアセンブリーを行って、配列決定され、かつアセンブルされたＤＮＡコンティグを創出するステップであって、平均の配列決定され、かつアセンブルされたＤＮＡコンティグ長が、少なくとも約１０ｋｂであり、これにより、配列決定され、かつアセンブルされた中間のＤＮＡコンティグ長ミニメタゲノムライブラリーを創出する、ステップと、ｄ）中間のＤＮＡコンティグ長ミニメタゲノムライブラリー由来の複数の配列決定され、かつアセンブルされたＤＮＡコンティグをさらにアセンブルして、長いＤＮＡコンティグ長メタゲノムライブラリーを創出することにより、プール間ＤＮＡコンティグアセンブリーを必要に応じて行うステップとを含む方法を教示する。

本開示はまた、天然物コード多重遺伝子クラスターのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ同定のためのプラットフォームを提供する。よって、一部の実施形態では、本開示は、多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索し、目的の天然物を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、ａ）デジタルメタゲノミクスライブラリーを、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルについて問い合わせるステップと、ｂ）前記問い合わせの出力を、複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットとして供給するステップと、ｃ）シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定し、１個もしくは複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルすること、および／またはシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定することにより、生物学的関連性を決定し、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットに割り当てて、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定するステップと、ｄ）デジタル処理でアセンブルされた生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットの閾値パラメーター内に位置している、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子に基づき、目的の天然物を同定するステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、本開示のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ多重遺伝子発見方法は、長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーにおいて遂行される。よって、一部の実施形態では、本開示は、多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂもしくは４０ｋｂ、またはそれらの間のいずれかの範囲もしくは部分的範囲の平均長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法を教示する。

一部の実施形態では、本開示のシステムおよび方法は、大型のアセンブルされたライブラリーにおける多重遺伝子クラスターを同定することに特に強く、伝統的な発見技法は、ライブラリーの多様性を完全に解析することができない。よって、一部の実施形態では、本開示は、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５０ＭＢ、７５ＭＢ、１００ＭＢ、２００ＭＢ、３００ＭＢ、４００ＭＢまたは５００メガベースのサイズである、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法を教示する。

一部の実施形態では、本開示は、ステップａ）における問い合わせるステップが、ＨＭＭモデルを利用して、公知の抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログについてデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法を教示する。よって、一部の実施形態では、本開示は、ステップａ）における問い合わせるステップが、ＨＭＭモデルを利用して、コンピューターにより予測または仮定される抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログについてデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法を教示する。

一部の実施形態では、本開示は、ステップａ）における問い合わせるステップが、１個または複数の生合成オペロンを含む多重遺伝子クラスターを含有することがコンピューターにより予測される全ての配列を同定するステップを含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法を教示する。

一部の実施形態では、本開示はまた、天然物を生合成により改変するためのシステムおよび方法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、酵素パネルを使用して、標的天然物をアナログ化（ａｎａｌｏｇ）することを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示は、標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、ａ）標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される複数の酵素を提供し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、ｂ）アナログ化酵素パネル由来の個々の酵素を、標的天然物または標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物のうち少なくとも１種を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、ｄ）アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｃ）の解析によって決定される通り、選択された酵素が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップとを含む方法を教示する。

他の実施形態では、本開示は、天然物をアナログ化するために組換え細胞を使用することを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、ａ）標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれ発現する、複数の微生物株を提供し、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、ｂ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を、標的天然物または標的天然物の前駆体と接触させ、これにより、混合物を生成するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）の混合物を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、ｄ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｃ）の解析によって決定される通り、選択された微生物株が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化し、選択された微生物株によって発現される酵素が、選択された酵素である、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、組換え細胞を使用する方法は、標的天然物を既に産生し得る細胞に適用される。よって、一部の実施形態では、本開示は、標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、ａ）標的天然物の第１のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれコードする、複数の遺伝的配列を提供するステップと、ｂ）ステップ（ａ）の複数の遺伝的配列のうち１種または複数によってコードされる酵素をそれぞれ発現するように、第１の基礎微生物株の１個または複数の細胞のゲノムを撹乱するステップであって、第１の基礎微生物株が、標的天然物を合成することができ、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、ｃ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、ｄ）ステップ（ｃ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、ｅ）微生物株のアナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｄ）の解析によって決定される通り、選択された微生物株が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、本開示は、天然物をアナログ化するための酵素を同定するためのシステムおよび方法を提供する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、ｉ）遺伝的配列入力変数が、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、ｉｉ）表現型性能出力変数が、１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、ｂ）訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有するメタゲノムライブラリーに適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、第１の予測的機械学習モデルによって、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒すると予測される、ステップと、ｄ）第１の信頼度スコアの第２の信頼度スコアに対する比が、予め選択された閾値から外れる場合、候補配列のプールから、第２の信頼度スコアによる第２の予測的機械学習モデルによって、異なる機能を果たすことが予測されるあらゆる配列を除去し、これにより、候補配列のフィルタリングされたプールを産生するステップと、ｅ）ステップ（ｄ）由来の候補配列のフィルタリングされたプールから配列をそれぞれ発現するように１個または複数の微生物細胞を製造するステップと、ｆ）ステップ（ｅ）の製造された宿主細胞を培養し、培養された細胞を溶解し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、ｇ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の酵素を、標的天然物または標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、ｈ）ステップ（ｇ）の反応混合物のうち少なくとも１種を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、ｉ）アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｈ）の解析によって決定される通り、選択された酵素が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、本開示はまた、標的天然物のアナログを産生するための方法であって、ａ）標的天然物を産生することが公知である第１の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、ｂ）前記第１の多重遺伝子クラスターに基づき予測モデルを開発するステップと、ｃ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、デジタルメタゲノミクスライブラリーを新たな多重遺伝子クラスターについて問い合わせるステップであって、前記新たな多重遺伝子クラスターが、予測モデルによって、標的天然物または標的天然物のバリアントを産生することが予測され、これにより、候補多重遺伝子クラスターのプールを産生する、ステップと、ｄ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、アノテーションエンジンにより、ステップ（ｃ）の候補多重遺伝子クラスターのプールの新たな多重遺伝子クラスターの１個または複数内の生合成酵素をコードする個々の遺伝子を同定し、これにより、新たな多重遺伝子クラスターから生合成遺伝子を含むアナログ化酵素パネルライブラリーを産生するステップと、ｅ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の遺伝子を発現するように基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱するステップであって、基礎微生物宿主細胞が、第１の多重遺伝子クラスターを含む、ステップと、ｆ）ステップ（ｅ）において製造された微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、ｈ）ステップ（ｆ）において培養された微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の解析によって決定される通り、選択された微生物宿主細胞が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物のアナログを産生する、ステップとを含む方法を教示する。

図１は、本開示の天然物発見プラットフォームのワークフローを示す。一部の実施形態では、ワークフローは、（１）例えば本開示のサイロプールする方法を使用して、複雑性が低下した物理的メタゲノムライブラリーを生成するステップと、（２）長いアセンブリー配列によってデジタルメタゲノミクスライブラリーを創出するステップと、（３）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＭＧＣプラットフォーム発見ツールを、本明細書に開示される長いアセンブリーメタゲノムライブラリーに適用するステップと、（４）例えば物理的ライブラリーまたは長いＤＮＡ合成からＭＧＣを再構築することによって、同定されたＭＧＣによって産生される天然物の表現型を決定するステップと、必要に応じて（５）前記天然物をアナログ化するステップとを含む。ステップ１～３は、本開示のｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ ＭＧＣ発見ワークフローを表す。

図２は、本開示の天然物発見プラットフォームのステップ１～３を示す。

図３は、本開示の天然物発見プラットフォームのステップ４～５を示す。

図４は、バーコードを使用するＤＮＡ配列決定多重化戦略の図を示す。識別可能な配列を、配列決定の前にＤＮＡに付加することができる（例えば、アダプター配列の付加を通して）。次に、異なるバーコードを有するＤＮＡ断片を単一の配列ランにプールする（すなわち、多重化する）ことができる。バーコードは配列決定後の処理において同定され、これを使用して異なるＤＮＡ試料に属するリードを分離する（すなわち、デマルチプレクス）。

図５は、多重遺伝子クラスター関連抵抗性遺伝子の作用機序の非限定的なリストを示す。抵抗性遺伝子は、産生細胞に対して毒性である天然物を外部へと輸送することによって機能することができる。抵抗性遺伝子は、産生細胞内に蓄積する天然物を、細胞内の毒性を低減または除去するように改変することができる。抵抗性遺伝子は、内因性の遺伝子に作用し、それらが天然物によってもはや影響を受けないように改変することができる。抵抗性遺伝子は、産生細胞が機能し続けることをバリアントが可能にする、天然物の標的のバリアントであり得る。

図６は、本開示のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ天然物多重遺伝子クラスター発見方法の一実施形態のステップを示す。候補抵抗性遺伝子は、選択される標的遺伝子（例えば、他の生物におけるまたは関連天然物の抵抗性遺伝子）に基づいて選択されるＨＭＭを介して、デジタルメタゲノムライブラリー（ＤＭＬ）において同定され得る。メタゲノムライブラリーはまた、多重遺伝子クラスターの存在についてもスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、本開示は、ＭＧＣ内または前記ＭＧＣの１～２個のＯＲＦ内に候補抵抗性遺伝子を含むＭＧＣを選択することを教示する。

図７は、本開示の多重遺伝子発見プラットフォームにおいて使用することができる標的抵抗性遺伝子の同定のための方法を例証する。目的の各標的抵抗性遺伝子に関して、対応するオルソログ群クラスター（ＣＯＧ）タンパク質のタンパク質配列および（利用可能であれば）ＩＤを、配列データベース（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース）から取得する。一部の実施形態では、ＣＯＧは、ＥｇｇＮＯＧクラスタリングアルゴリズム（例えば、データベースバージョン４．５．１）によって形成される。一部の実施形態では、ＣＯＧ内の配列を、ｄｉａｍｏｎｄ ｂｌａｓｔｐを使用して同じオルソログ群の全ての微生物タンパク質と比較する。一部の実施形態では、関連するヒット、すなわち、１０^－３またはそれより低いｅ値が下流の解析のために選択される。

図８は、本開示のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ天然物多重遺伝子クラスター発見方法の優先順位をつける実施形態のステップを示す。

図９は、本開示の天然物アナログ化プラットフォームの様々な戦略を示す。一部の実施形態では、本開示は、ＭＧＣを操作することによって（例えば、前記天然物の生合成に関係する１個または複数の遺伝子を改変またはノックアウトすることによって）天然物をアナログ化することを教示する。一部の実施形態では、本開示は、酵素パネル（例えば、所望の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される雑多な酵素）を通して天然物をアナログ化する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、天然物をアナログ化するために相同なクラスターを活用する方法を教示する。これらの技術の組合せもまた、本開示の想定される実施形態内である。

図１０は、実施例５に記載されるブレフェルジンＡおよびゲルダナマイシンの改変を生成するためにスクリーニングしたメタゲノムを起源とするアルド－ケトレダクターゼのパネルを示す。本開示の方法を使用して、ブレフェルジンを改変することができる３つの酵素およびゲルダナマイシンを改変することができる１つの酵素を同定した。

図１１は、本開示の生合成アナログ化方法を化学に基づく相対方法と比較する表である。

図１２は、本開示の生合成アナログ化方法の１つのワークフローを示す。

図１３は、本開示のライブラリー調製方法の最初のステップを示す。環境試料から抽出したＤＮＡを、コスミド骨格にクローニングし、ファージを介してパッケージングし、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主に形質導入してメタゲノミクスＤＮＡライブラリーを創出する。

図１４は、本開示のライブラリー調製方法のステップを示す。メタゲノムＤＮＡライブラリーからのコスミド（主に１個／細胞）を含有するＥ．ｃｏｌｉを、配列決定の前にミニメタゲノムへとサイロプールする。プールサイズは、本開示で考察されたシミュレーションの結果に基づく。

図１５は、本開示のデジタルメタゲノムライブラリーのアセンブリーステップを示す。一部の実施形態では、２相アセンブリー方法を使用してより長いアセンブリーを得る。

図１６は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＤＮＡストックのいずれかとしてのミニメタゲノムプールを配置して、物理的メタゲノムライブラリーを創出することを示す。これらの配置したライブラリーは後に、さらなる解析のために目的の配列を回収するために使用される。

図１７は、本開示の方法に従う抵抗性遺伝子に基づく多重遺伝子クラスター検索の結果を示す。

図１８は、本開示の方法に従う抵抗性遺伝子に基づく多重遺伝子クラスター検索のさらなる結果を示す。本開示のワークフローを使用して、ＷＲＮ－ヘリカーゼ、ＭＦＮ２、ＨＳＰ４０、ＳＥＣ６１Ａ１、およびＦＰＧＳを標的化する天然物の天然物コードクラスターを同定した。

図１９は、コスミドに基づくデジタルメタゲノムライブラリー構築の概略図である。

図２０は、システムが、単一の新規検索可能なメタゲノムライブラリーを生成するために長期間にわたって特定の試料の再配列決定から洗練された費用効果の高いやり方で新規情報を集計することができるかを例証する。

図２１Ａ～Ｃは、アセンブリー全体の品質に及ぼすサイロプールサイズを増加させる効果を試験するために創出された様々なアセンブリーの結果を示す。図２１Ａは、様々なプールサイズのアセンブリーのＮ５０を示す。３０，０００個のコスミドのプールの１０×配列決定カバレッジ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｏｖｅｒａｇｅ）はなおも、ＭＧＣ発見を可能にするために十分な長さのＮ５０を有するメタゲノムアセンブリーを産生することができる。図２１Ｂは、パートＡの結果を対数尺度で示す。図２１Ｃは、生の配列をプールする方法を変化させた場合の、生の配列の５００ＭＢ当たりに生成される１５ｋｂ＋コンティグの数を示す。６，０００～１５，０００個のプールサイズは、ＭＧＣ発見に関して最高の効率を提供する。 同上。 同上。

図２２は、Ｎ５０の範囲を産生するために配列決定されている非常に類似の試料由来の配列決定アセンブリーを活用し、ＭＧＣ発見率に及ぼすライブラリーアセンブリーの質（Ｎ５０によって測定した場合）の効果を試験する解析の結果を示す。配列１Ｋｂ当たりのＭＧＣの数は、約１５ＫｂのＮ５０までは急速に増加し、その後横ばいとなり始める。

図２３は、Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）土壌メタゲノムライブラリー（プロジェクト１０７７７０６）と、本開示の方法に従って土壌試料から産生されたデジタルメタゲノミクスライブラリー（ＭＣＥ）との間のサイズの差を示す（実施例４を参照されたい）。ＪＧＩは、本開示の方法に従って産生されたＭＣＥより４倍より多くの総アセンブルされた配列を有する。しかし、ＭＣＥは、９８５ｂｐのＪＧＩのＮ５０と比較して約１５ＫｂｐのＮ５０を有する。

図２４は、本開示のデジタル検索方法論を使用してＪＧＩおよびＭＣＥライブラリーにおいて同定されたクラスターの数を示す。１２０個のＭＧＣのみがＪＧＩデータベースでは同定されたが、これに対しＭＣＥでは１２８７個が同定された。このように、ＭＣＥデータベースでは１０倍多くのＭＧＣを同定することが可能であったが、ＭＣＥデータベースはＪＧＩ土壌メタゲノムデータベースの４分の１のサイズである（すなわち、ＭＣＥはＭＧＣの同定に関して５０倍より高く有効であることを示す）。

図２５は、本開示のデジタル検索方法論を使用してＪＧＩおよびＭＣＥライブラリーにおいて同定されたクラスターの数を示す。結果を、配列のギガベース当たりに同定されたＭＧＣの数として示す。約１５ｋｂｐのＮ５０を有するＭＣＥは、ＭＧＣの同定において５０倍より高く効率的である。

図２６は、本開示のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ天然物多重遺伝子クラスター発見方法の一実施形態のステップを示す。デジタルメタゲノムライブラリーを、多重遺伝子クラスターの存在について問い合わせる。候補抵抗性遺伝子は、公知のまたは予測される標的抵抗性遺伝子（例えば、他の生物におけるまたは関連天然物の抵抗性遺伝子）に基づいて選択されるＨＭＭを介してデジタルメタゲノムライブラリーにおいて同定され得る。一部の実施形態では、本開示は、ＭＧＣ内に、または前記ＭＧＣの１～２個のＯＲＦ内に候補抵抗性遺伝子を含むＭＧＣを選択することを教示する。

図２７は、本開示の標的化されない（「ｄｅ ｎｏｖｏ」）抵抗性シグナル多重遺伝子クラスター特色セット開発ワークフローを示す。

図２８は、土壌試料から本開示の方法に従って産生されたデジタルメタゲノミクスライブラリー（ＭＣＥ）の分類学上の特徴付けを例証するＫｒｏｎａプロットである（実施例４を参照されたい）。ＭＣＥは、元の環境土壌試料を表す代表する分類学上の多様性を示した。

図２９は、実施例１７の標的化されないＭＧＣ発見ワークフローの一部としての予測されるＭＧＣ内の遺伝子の組合せスコアを示す。

図３０は、標的遺伝子としてＨＤＡＣ１を使用して抵抗性遺伝子ワークフローを介して同定されたＭＧＣによってコードされる新たに同定された天然物の活性曲線を示す。本開示の方法は、選択された治療標的を特異的に標的化する天然物を同定することができる。

図３１は、標的遺伝子としてＳＯＤ２を使用して抵抗性遺伝子ワークフローを介して同定されたＭＧＣによってコードされる新たに同定された天然物の正規化されたＳＯＤ活性を示す。本開示の方法は、選択された治療標的を特異的に標的化する天然物を同定することができる。

詳細な説明
本開示は、目的のタンパク質標的を結合することができる天然物をコードする、多様なメタゲノム試料からの多重遺伝子クラスターの同定のための新規方法を提供する。
定義

宿主細胞が、少なくとも１種の新たな遺伝子／タンパク質（例えば、天然物を合成することができる酵素）を産生するように、宿主細胞のゲノムが改変されている（例えば、多重遺伝子クラスターをコードするプラスミドの挿入を含む、遺伝子の挿入、欠失、置換えにより）場合、本開示は、タンパク質等の部分が、宿主細胞へと「操作されている」と言う。

本明細書で使用される場合、「信頼度スコア」は、分類または分類子に割り当てられる信頼度の尺度である。例えば、信頼度スコアは、抵抗性遺伝子をコードするとして、アミノ酸配列の同定に割り当てることができる。信頼度スコアは、とりわけ、ビットスコアおよびｅ値を含む。「ビットスコア」は、予測の精度における信頼度を提供する。「ビット」は、情報内容を指し、ビットスコアは一般に、ヒットにおける情報の量を示す。より高いビットスコアは、より優れた予測を示し、一方、低いスコアは、より低い情報内容、例えば、より低い複雑性マッチまたはより悪い予測を示す。「ｅ値」は、本明細書で使用される場合、結果、例えば、検索タンパク質（例えば、天然物に対する抵抗性タンパク質）と同じ機能を有するタンパク質をコードすることが予測されるデータベースにおける配列の同定に割り当てられた有意性の尺度を指す。ｅ値は一般に、同じデータベース内で同様の結果を観察する尤度を推定する。ｅ値が低いほど、結果の有意性が高くなる。

「隠れマルコフモデル」または「ＨＭＭ」は、本明細書で使用される場合、モデル化されているシステムが、観測できない（すなわち、隠れた）状態を有するマルコフ過程であると仮定される、統計モデルを指す。アミノ酸配列に適用される場合、ＨＭＭは、配列のファミリーを数学的に表す仕方を提供する。これは、配列が順序付けられており、かつ、アミノ酸が、ある位置で他の位置よりも保存されている、特性を捕捉する。ＨＭＭが、配列のファミリーのために構築されると、新たな配列をこれに対してスコア化して、これらが申し分なくマッチする程度およびこれらがファミリーのメンバーとなる可能性の程度を評価することができる。

本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」は、２種の最適に整列されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、残基、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の整列のウィンドウ全体にわたり不変である程度を指す。検査配列および参照配列の整列されたセグメントの「同一性分率」は、参照配列セグメント、すなわち、参照配列全体、または参照配列のより小さい定義された部分における残基の総数で割った、２種の整列された配列によって共有される同一残基の数である。「パーセント同一性」は、同一性分率掛ける１００である。パーセント同一性を決定するための配列の比較は、例えば、例えば、配列解析プログラムのＢＬＡＳＴ一式におけるアルゴリズム等の数学的アルゴリズムを使用することによるものを含む、いくつかの周知の方法によって達成することができる。特に断りのない限り、特許請求の範囲における用語「配列同一性」は、デフォルトパラメーターを使用したＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（登録商標）によって計算される配列同一性を指す。

本明細書で使用される場合、配列ＸおよびＹが、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａまたはＢＬＡＳＴ（登録商標）等、当技術分野で公知のアミノ酸配列整列ツールを使用して整列されたときに、配列「Ｘ」における残基が、配列「Ｙ」における「ａ」のカウンターパート位置にある場合、配列「Ｘ」における残基（核酸残基またはアミノ酸残基等）は、異なる配列「Ｙ」における位置または残基（核酸残基またはアミノ酸残基等）「ａ」に対応すると称される。

配列同一性のパーセンテージが、タンパク質を参照して使用される場合、同一ではない残基位置は、アミノ酸残基が同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に代えて置換される、保存的アミノ酸置換によって異なることが多く、したがって、分子の機能的特性を変化させないことが認識される。斯かる保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を為すための手段は、当業者にとって周知である。典型的には、これは、完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとしての保存的置換のスコア化を伴い、これにより、パーセンテージ配列同一性を増加させる。よって、例えば、同一アミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換には、ゼロ～１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ．， ４：１１－１７ （１９８８）のアルゴリズムに従って計算される。類似性は、同一性よりも高感度な、配列間の関連性の尺度である；これは、同一の（すなわち、１００％保存された）残基のみならず、非同一だが（サイズ、電荷等が）同様の残基をも考慮に入れる。その正確な数値が、その推定に使用される置換マトリックス（例えば、許容的ＢＬＯＳＵＭ４５対厳密なＢＬＯＳＵＭ９０）等のパラメーターに依存するため、％類似性は、少々トリッキーである。

本開示の方法およびシステムを使用して、１種もしくは複数の標的遺伝子／タンパク質に対して、または抵抗性タンパク質等の１種もしくは複数の選択されたタンパク質ドメイン、または抵抗性タンパク質のクラス内の共有されるドメインに対して相同／オルソロガスである配列を同定することができる。一部の実施形態では、相同配列は、標的遺伝子／タンパク質と配列同一性を共有する配列である（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％パーセント同一性であり、その間のあらゆる値を含む）。一部の実施形態では、相同配列は、本開示のＨＭＭモデルによって同定された配列である。一部の実施形態では、相同配列はまた、標的遺伝子／タンパク質と同じまたは同様の生物学的機能を実行する。

一部の実施形態では、本開示は、標的タンパク質または遺伝子のホモログまたはオルソログを同定するための方法およびシステムを教示する。本明細書で使用される場合、用語「標的タンパク質」または「標的遺伝子」は、ホモログまたはオルソログが探索されている出発遺伝子またはタンパク質（例えば、核酸またはアミノ酸配列）を指す。一部の実施形態では、検索は、１つより多くの標的遺伝子／タンパク質により遂行される。

本明細書で使用される場合、用語「オルソログ」は、標的配列に対して相同であり、かつ異なる種に由来する、核酸またはタンパク質を指す。一部の実施形態では、オルソログは、種分化事象によって分かれた、同じ祖先配列から枝分かれすると仮定される。

本開示は、標的遺伝子／タンパク質のホモログおよびオルソログを同定するための方法およびシステムであって、前記ホモログおよびオルソログが、標的遺伝子／タンパク質と同じ機能を果たす、方法およびシステムを教示する。本明細書で使用される場合、用語「同じ機能」は、新たに同定されたホモログまたはオルソログが、少なくともあるレベルの機能性を維持しつつ、本来の標的遺伝子／タンパク質に取って代わることができるような、互換的な遺伝子またはタンパク質を指す。一部の実施形態では、標的酵素と同じ反応を触媒することができる酵素は、同じ機能を果たすと考慮される。一部の実施形態では、標的転写因子と同じ遺伝子を調節することができる転写因子は、同じ機能を果たすと考慮される。一部の実施形態では、標的低分子ＲＮＡと同じ（または等価の）核酸と複合体形成することができる低分子ＲＮＡは、同じ機能を果たすと考慮される。

しかし、「同じ機能」を果たすということは、新たに同定されたホモログまたはオルソログが、標的遺伝子／タンパク質の機能の全てを果たすことを必ずしも要求することもなければ、新たに同定されたホモログが、標的遺伝子／タンパク質の機能を越えた追加的な機能を果たし得ることを除外することもない。よって、一部の実施形態では、新たに同定されたホモログまたはオルソログは、例えば、標的酵素と比較した場合、使用可能な反応物のより小さいプールを有することができる、または追加的な産物を産生することができる。

当業者であれば、用語「同じ機能」が、一部の実施形態では、合同な、ただし同一ではない機能を包含することもできることも理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、本開示の方法およびシステムにより同定されたホモログまたはオルソログは、ある生物において同じ機能を果たすことができるが、別の生物において同じ機能を果たすことができない。このシナリオの説明に役立つ一例は、多サブユニット酵素のオルソログサブユニットであり、これは、ある生物の他の適合性サブユニットと共に発現されたときに同じ機能を果たすことができるが、異なる生物由来のサブユニットと直接的に組み合わせることができない。斯かるサブユニットは依然として、「同じ機能」を果たすと考慮されるであろう。同定された遺伝子／タンパク質が、標的遺伝子／産物と同じ機能を果たすか否か決定するための技法は、本開示において詳細に記述されている。

用語「ポリペプチド」または「タンパク質」または「ペプチド」は、天然に存在するタンパク質、ならびに組換えによりまたは合成により産生されたタンパク質を網羅することが特に意図される。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」が、グリコシル化された形態等、天然に存在する修飾された形態のタンパク質を含むことができることに留意されたい。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」または「ペプチド」は、本明細書で使用される場合、任意のアミノ酸配列を包含することが意図され、糖タンパク質等の修飾された配列を含む。

用語「予測」は、タンパク質が、所与の機能を果たすこと、または一連の遺伝子が、天然物コード多重遺伝子クラスターを形成することの尤度、確率またはスコアを指すように本明細書で使用される。

本明細書において、用語「オープンリーディングフレーム」またはＯＲＦは、タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡ配列を指し、前記オープンリーディングフレームは、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ、ＧＴＧおよびＴＴＧ）から停止コドン（例えば、ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）に及ぶ。本出願の目的のため、タンパク質を産生しないことがコンピューターにより予測される（または経験的に決定される）ＤＮＡ配列は、ＯＲＦと考慮されない。例えば、関連する転写開始部位がないＯＲＦ（すなわち、ｍＲＮＡへと転写されないであろうＤＮＡ配列）は、ＯＲＦと考慮されないであろう。その上、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットのエレメント間の近接計算の目的のため、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個未満のアミノ酸をコードするＯＲＦは、ＯＲＦと考慮されない。

用語「訓練データ」、「訓練セット」または「訓練データセット」は、分類が公知となり得るデータセットを指す。一部の実施形態では、訓練セットは、入力および出力変数を含み、モデルの訓練に使用することができる。セットのための特色の値は、訓練セットのための入力ベクトル、例えば、訓練ベクトルを形成することができる。訓練ベクトル（または他の入力ベクトル）の各エレメントは、１個または複数の変数を含む特色に対応することができる。例えば、訓練ベクトルのエレメントは、マトリックスに対応することができる。セットの標識の値は、任意のサイズ、次元または組合せで、上述のデータ型のストリング、数、バイトコードまたは任意かの集合を含有するベクトルを形成することができる。一部の実施形態では、「訓練データ」は、標的遺伝子／タンパク質と同じ機能を示す可能性がある他の配列を同定することができる機械学習予測モデルの開発に使用される。一部の実施形態では、訓練データセットは、標的タンパク質と同じ機能を果たすことができるタンパク質をコードする１種または複数の遺伝的配列（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）を有する遺伝的配列入力変数を含む。一部の実施形態では、訓練データセットは、同じ機能を果たさないと標識された配列を含有することもできる。

一部の実施形態では、訓練データセットは、「表現型性能出力変数」も含む。一部の実施形態では、「表現型出力変数」は、バイナリ（例えば、関連する配列が、同じ機能を示すか否かについて示す）であり得る。一部の実施形態では、表現型出力変数は、同じ機能が、肯定的もしくは否定的として実験により検証されたか否か、または１種もしくは複数の他の因子に基づき予測されるか否かについて示す等、記述される機能に関する確実性のレベルを示すことができる。一部の実施形態では、表現型出力変数は、データとして記憶されないが、単に、所与の機能を果たすという事実である。例えば、訓練データセットは、標的機能を果たすことが公知のまたは予測される配列を含むことができる。斯かる実施形態では、遺伝的入力変数は、配列であり、表現型性能出力変数は、機能を果たすまたは機能を果たすことが予測されるという事実である。よって、一部の実施形態では、リストにおける包接は、配列が同じ機能を果たすことを示す表現型性能変数を暗示する。

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」、「細胞生物」、「微小生物」または「微生物」は、広範に解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使用されており、２つの原核生物ドメインである細菌および古細菌、ならびにある特定の真核生物の真菌および原生生物を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本開示は、本開示に存在するリスト／表および図の「微小生物」または「細胞生物」または「微生物」を指す。この特徴付けは、表および図の同定された分類学的な属のみならず、前記表または図におけるいずれかの生物の同定された分類学的な種ならびに様々な新規のおよび新たに同定または設計された株を指すこともできる。同じ特徴付けが、実施例等の本明細書の他の部分における、これらの用語の列挙に当てはまる。

一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１個の無培養微生物または微小生物の遺伝的配列を含むメタゲノムデータベースを開示する。本明細書で使用される場合、用語「無培養微生物」、「無培養細胞」または「無培養生物」は、実験室培地において育成されていない細胞を指す。一部の実施形態では、無培養微生物／細胞／生物は、実験室における育成に適応されていない。一部の実施形態では、無培養微生物／細胞／生物は、環境試料から直接的に得られる。一部の実施形態では、無培養微生物／細胞／生物は、以前に配列決定されたことがない、またはゲノム配列が公開されていない。

用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核も他の細胞オルガネラも含有しない細胞を指す。原核生物は一般に、２つのドメインである細菌および古細菌の一方に分類される。古細菌および細菌ドメインの生物の間の決定的な差は、１６ＳリボソームＲＮＡにおけるヌクレオチド塩基配列の根本的な差に基づく。

用語「古細菌」は、普通でない環境において典型的に見出され、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含むいくつかの判定基準によって原核生物の残りから区別される、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物のカテゴリー化を指す。ｓｓｒＲＮＡ解析に基づいて、古細菌は、２つの系統発生的に明確に異なる群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。その生理学に基づいて、古細菌は、３つの型：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生きる原核生物；および高度（超）好熱菌（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（非常に高温で生きる原核生物）へと組織化することができる。それらを細菌から区別する統合的古細菌特色（すなわち、細胞壁にムレインなし、エステル結合された膜脂質等）の他に、これらの原核生物は、その特定の生息地に自身を適応させる特有の構造的または生化学的特質を示す。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、主に超好熱性硫黄依存性原核生物からなり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。

「細菌」または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、次の通りの少なくとも１１種の明確に異なる群を含む：（１）グラム陽性（グラム＋）細菌、これには、２つの主要な細区分：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）がある；（２）プロテオバクテリア、例えば、紅色光合成および非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）ラン藻、例えば、酸素発生型光栄養生物；（４）スピロヘータおよび近縁の種；（５）プランクトミセス；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光栄養生物でもある）；（１０）放射線抵抗性小球菌および近縁種；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。

「真核生物」は、その細胞が、膜内に封入された核および他のオルガネラを含有する、任意の生物である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。真核細胞を原核細胞（上述の細菌および古細菌）から隔てる明確な特色は、膜に結合されたオルガネラ、特に、遺伝材料を含有し、核膜によって封入された核を有することである。

用語「遺伝子改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用されており、本開示のクローニングおよび形質転換方法によって遺伝子改変された宿主細胞を指す。よって、これらの用語は、それが由来する天然に存在する生物と比較して変更された、改変されたまたは異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が、微小生物のコード核酸配列に影響を与える場合）を示すように、遺伝的に変更された、改変されたまたは操作された宿主細胞（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞、ＣＨＯ、ヒト細胞等）を含む。一部の実施形態では、これらの用語は、問題になっている特定の組換え宿主細胞のみならず、斯かる宿主細胞の後代または潜在的な後代も指すことが理解される。

用語「野生型微小生物」または「野生型宿主細胞」は、自然界に発生する細胞、すなわち、遺伝子改変されていない細胞を表す。

用語「遺伝子操作された」は、宿主細胞のゲノムの任意のマニピュレーション（例えば、核酸の挿入、欠失、変異または置換えによる）を指すことができる。遺伝子操作されたとは、プラスミド等、人為的に加えられた染色体外ＤＮＡを有する生物を含む。

用語「対照」または「対照宿主細胞」は、遺伝子改変または実験処置の効果を決定するための適切なコンパレーター宿主細胞を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を識別する遺伝子改変は別として、遺伝子改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。

用語「多重遺伝子クラスター」または「ＭＧＣ」は、微生物にコードされる天然物等、特殊化された代謝物の産生に関与する遺伝子の組織化された群を指す。ＭＧＣ内の遺伝子は典型的に、一緒になって密接に群れをなして、共遺伝を容易にする。ＭＧＣは多くの場合、一緒に調節され、時に、生合成オペロンを形成する。ＭＧＣを同定するための方法は、本出願の後述するセクションに記述される。

「バーコード」または「分子バーコード」は、標識するための材料である。バーコードは、核酸またはポリペプチド等の分子を標識することができる。一部の実施形態では、核酸内のバーコードを使用して、加工／配列決定ステップにより核酸を追跡することができる。一部の実施形態では、バーコードを使用して、配列決定後に配列を選別することができる。一部の実施形態では、バーコードを使用して、配列混合物を逆多重化する。標識するための材料は、情報に関連する。一部の実施形態では、バーコードは、配列識別子（すなわち、配列に基づくバーコードまたは配列インデックス）である。一部の実施形態では、バーコードは、特定のヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、バーコードは、同じ分子の異なるサイズ分子または異なる終止点である。バーコードは、分子内の特異的配列、および異なる終止配列を含むことができる。例えば、同じプライマーから増幅され、２５個のヌクレオチド位置を有する分子は、増幅され、２７個のヌクレオチド位置を有する分子とは異なる。２７ｍｅｒ配列における付加位置は、バーコードと考慮される。一部の実施形態では、バーコードは、ポリヌクレオチドに取り込まれる。バーコードを取り込むための一部の非限定的な方法は、分子生物学方法を含むことができる。バーコードを取り込むための分子生物学方法の一部の非限定的な例は、プライマー（例えば、テイルドプライマー伸長）、プローブ（すなわち、プローブへのライゲーションによる伸長）またはライゲーション（すなわち、分子への公知の配列のライゲーション）による。

本明細書で使用される場合、アセンブルされたライブラリーのＮ５０の参照は、その長さまたはそれよりも長い全てのコンティグの収集物が、アセンブリーの少なくとも半分を被覆する長さを指す。一部の実施形態では、Ｎ５０は、アセンブリーにおける全コンティグを、最長から最短へと長さによって先ず順序付けすることにより計算される。最長コンティグから開始して、和が、アセンブリーにおける全てのコンティグの全長（総アセンブリー長）の半分に等しくなるまで、各コンティグの長さを合計する。このリストにおける最短コンティグの長さは、Ｎ５０値である。
天然物発見における伝統的アプローチ
産物に基づくスクリーニング

ＤＮＡ配列決定および解析の出現に先立ち、実験室において培養依存性技法を主として使用して、微小生物由来の天然物の同定が遂行された（Ｋａｔｚ Ｌ．， Ｂａｌｔｚ Ｒ．Ｈ． Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ： Ｐａｓｔ， ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ． Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１６；４３：１５５－１７６）。天然物の発見は伝統的に、環境から試料採取するステップと、実験室においてこれらの試料を培養するステップと、最後に、抽出された産物を生物活性についてスクリーニングするステップとを伴った。よって、天然物発見のためのこの伝統的アプローチは、培養可能な生物に制限されており、ＭＧＣ発見の速度および発見されたＭＧＣの多様性の両方を著しく制限する。

天然物同定のための伝統的アプローチは、天然物が、その後の生物学的アッセイに十分な分量で発現され、蓄積することを要求したため、現存する多様性を活用するその能力においても限定された。しかし、大部分の天然物産生クラスターは、あるとしても、全ての条件下で発現するとは限らない（Ｒｅｎ Ｈ．， Ｗａｎｇ Ｂ．， Ｚｈａｏ Ｈ． Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｌｅｎｃｅ： Ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７；４８：２１－２７）。発現されるもののうち、一部のみが、生物学的検査を可能にするのに十分に高いレベルで分泌され、蓄積する（Ｌｕｏ Ｙ．， Ｃｏｂｂ Ｒ．Ｅ．， Ｚｈａｏ Ｈ． Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１４；３０：２３０－２３７）。

天然物クラスタリングの発現の欠如を克服する試みは、ある程度の成功を収めた。例えば、あるグループは、クラスター内に包埋された遺伝的エレメントをマニピュレートすることにより、天然物コード遺伝子クラスターの発現を増加させることを試みた（Ｐａｌａｚｚｏｔｔｏ Ｅ．， Ｗｅｂｅｒ Ｔ． Ｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉ－ｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１８；４５：１０９－１１６）。他のグループは、標的クラスターの上流に位置する強いプロモーターを人為的にノックインすることにより、ネイティブ宿主におけるクラスター発現を誘発することを試みた。Ｒｅｎ Ｈ．， Ｗａｎｇ Ｂ．， Ｚｈａｏ Ｈ． Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｌｅｎｃｅ： Ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７；４８：２１－２７。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムに基づくプロモーターノックイン戦略を使用して、５種の異なるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種における複数のサイレントＭＧＣを活性化し、これにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからの新規五角形ポリケタイドの発見がもたらされた。

他のアプローチは、異種宿主において（多くの場合サイレントな）遺伝子クラスターを発現させることにより、これらの推定上の天然物コード遺伝子クラスターを連続的におよび／またはランダムにスクリーニングする試みに着目した（Ｋｏｕｐｒｉｎａ Ｎ．， Ｌａｒｉｏｎｏｖ Ｖ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｏｃｉ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ２００８；３：３７１）。異種宿主は、ネイティブ宿主を上回る有意な成長利点を提供することができ、後者における調節システムをバイパスすることができる。これらのアプローチは、標的多重遺伝子クラスターを発現させることを支援するが、これらのアプローチは、ロースループットとなる傾向があり、あらゆる公知の（かつ無培養の）微小生物における新たな天然物のラージスケールスクリーニングおよび同定のための実際的な解法ではない。
メタゲノムライブラリー由来の天然物

新たな天然物に関する未開発の潜在性の最大の供給源の１つは、無培養微小生物である。実験室で育成することができる細菌種の数は、自然界に存在する全多様性のごく一部しか含まない（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｅ．Ｊ． Ｇｒｏｗｉｎｇ Ｕｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２０１２；１９４：４１５１－４１６０）。複数の証拠が、標準実験室技法を使用して、土壌中の微小生物の０．１％未満が容易に培養されることを示す（Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｃｅｓｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｅｓ： ａ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｆｏｒ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ． １９９８，５：Ｒ２４５－２４９）。実際に、新たな推定は、地球上の微生物多様性の９９．９９９％が、未だに探索されていないことを示唆する（Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｊ． Ｌｏｃｅｙａ， ａｎｄ Ｊａｙ Ｔ． Ｌｅｎｎｏｎａ． Ｓｃａｌｉｎｇ ｌａｗｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｇｌｏｂａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． ＰＮＡＳ， ２０１６）。

上に記載されている通り、無培養生物は、伝統的な発酵に基づく天然物発見アプローチのための有用な供給源ではなかった。しかし、ごく最近になって、ハイスループット配列決定、ＤＮＡクローニングおよび編集を含むゲノミクス時代に開発されたツール、ならびにバイオインフォマティクスツールは現在、そのゲノムのＤＮＡ配列を直接的に調べることにより（生物を培養するのではなく）、これらの無培養生物のゲノムを探索することを理論的に可能にする。これは、環境試料から直接的に回収された遺伝材料の研究である、メタゲノミクスの分野の発展をもたらした。理論的には、無培養生物のゲノムを有するのであれば、そのゲノムにおいてコードされるＭＧＣを生物情報学的に同定することができる。しかし、メタゲノミクスの分野が希求するスケールに近いスケールでのこのアプローチを実行することを困難にする、いくつかの技術的課題が存在する。例えば、地球上の表層土１グラムは、１０^９個の細菌細胞を含有し、少なくとも３００，０００，０００種の明確に異なるゲノムを含むことが推定される（Ｄｅｌｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｒａｒｅ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｓｉｔｕ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１５；６； ３５８）。この驚異的な複雑性は、任意の有意な長さへとＤＮＡ配列を生物情報学的にアセンブルすることを極めて困難にする。メタゲノムライブラリーの研究は、土壌中の明確に異なる微生物の大部分が、生態系内の少数を表すことを示唆し、感度を低下させることにより、発見の問題をさらに悪化させる。メタゲノム多様性をマイニングするための以前のアプローチについては、さらに詳細に後述する。
縮重プライマーを使用したＭＧＣのメタゲノムスクリーニング

メタゲノムライブラリーにおける多重遺伝子クラスターを調査するための有名なアプローチは、縮重プライマーの使用である。縮重プライマーは、１つより多くの可能なヌクレオチド塩基を含有するいくつかの位置を有するオリゴヌクレオチド配列である。縮重プライマーの柔軟なハイブリダイゼーション特性を使用して、非常に類似しているが僅かな変形形態を有するゲノム中の区域を標的化および増幅することができる（Ｌｉｎｈａｒｔ Ｃ．， Ｓｈａｍｉｒ Ｒ． Ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎ ｐｒｏｂｌｅｍ： Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． Ａ Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００５；１２：４３１－４５６）。縮重プライマーを使用して、配列決定された培養されたゲノムの間で十分に保存されていることが見出された、アデニル化およびチオール化ドメインに関連する非リボソーム性ペプチドシンターゼＮＲＰＳ遺伝子を選択的に増幅した（Ｋｈｏｓｌａ Ｃ．， Ｇｏｋｈａｌｅ Ｒ．Ｓ．， Ｊａｃｏｂｓｅｎ Ｊ．Ｒ．， Ｃａｎｅ Ｄ．Ｅ． Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９９；６８：２１９－２５３）。次いで、縮重プライマーにより同定されたゲノム配列を配列決定し、伝統的な「プライマーウォーキング」技法により周囲のＤＮＡ配列を同定するために使用することができる。

縮重プライマーは、多数の天然物同定の取り組みにわたり使用されてきた。カスタマイズされたプライマーセットが、アクチノバクテリアにおけるＮＲＰＳおよびＩ型ＰＫＳ（ＰＫＳ－Ｉ）システムのスクリーニングに使用された（Ａｙｕｓｏ－Ｓａｃｉｄｏ Ａ．， Ｇｅｎｉｌｌｏｕｄ Ｏ． Ｎｅｗ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＮＲＰＳ ａｎｄ ＰＫＳ－Ｉ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ： Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍａｊｏｒ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｇｒｏｕｐｓ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ． ２００５；４９：１０－２４）。本研究において、プライマーセットは、アクチノバクテリアにおける主要な科および３３種の異なる属を網羅する２１０種の参照株において検査された。ＮＲＰＳを標的とするプライマーのＰＣＲ増幅は、７９．５％の株において観察され、一方、ＰＫＳ－Ｉを標的とするプライマーのＰＣＲ増幅は、５６．７％の株に見られた。

別の研究において、保存された生合成モチーフに由来する縮重プライマーを使用して、１８５種の土壌マイクロバイオーム試料由来のケトシンターゼドメインを調べた（Ｏｗｅｎ Ｊ．Ｇ．， Ｃｈａｒｌｏｐ－Ｐｏｗｅｒｓ Ｚ．， Ｓｍｉｔｈ Ａ．Ｇ．， Ｔｅｒｎｅｉ Ｍ．Ａ．， Ｃａｌｌｅ Ｐ．Ｙ．， Ｒｅｄｄｙ Ｂ．Ｖ．Ｂ．， Ｍｏｎｔｉｅｌ Ｄ．， Ｂｒａｄｙ Ｓ．Ｆ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｈｏｒｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｅｐｏｘｙｋｅｔｏｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ２０１５；１１２：４２２１－４２２６．）。エポキシケトンプロテアソーム阻害剤をコードする生合成多重遺伝子クラスターが検出され、さらなる解析は、特有の弾頭構造を有する化合物を含む、７種のエポキシケトン天然物の単離および特徴付けをもたらした。

しかし、第１のパスの（ｆｉｒｓｔ－ｐａｓｓ）発見ツールとしての縮重プライマーの使用は、いくつかの欠点がある。第一に、これは、培養および無培養生物にわたって保存されていると仮定される選択された数の遺伝子のみの同定に頼る。しかし、プライマー内の縮重のレベルは限定されており、標的配列における僅かな予想外の変形形態であっても、ハイブリダイゼーションの喪失をもたらし得る。これは、この技法によって標的化され得る遺伝子の型を限定し、斯かる特異的な共有されるモチーフを有する遺伝子に集中することが、ユーザーが、新たなかつ配列決定されていない微小生物の完全な多様性を探索することを防止しているか否かに関する疑問をさらに生じる。

指数関数的ＰＣＲ増幅における縮重プライマーへの依存もまた、ゲノムコピー数における大きい変形形態を考慮して若干問題になる。斯かるライブラリーのＰＣＲ増幅は、１つの型のクラスターが高度に富化された増幅産物を産生するが、潜在的に、その他を検出し損なうことによる、ライブラリー表現の問題点を悪化し得る。

縮重プライマーの第２の限界は、完全な天然物クラスターが再調査に利用できるようになる前に要求される、下流加工の量である。縮重プライマーによるＰＣＲ増幅からの配列は多くの場合、ゲルで泳動されて、サイズによって産物を分離し、その後、各バンドを抽出し、配列決定する。完全に配列決定された多重遺伝子クラスターに達するための時間および支出のみならず、偽陽性を回避するためにかかる圧力も原因で、この限界は重要である。広すぎるハイブリダイゼーション範囲を有する縮重プライマーは、追加的な多重遺伝子クラスターを明らかにすることができる可能性があるものの、結局のところ、作業セットから除外され得る前にいくつかの追加のステップで加工される必要がある、非特異的遺伝子を増幅する場合もある。よって、縮重プライマーは依然として、メタゲノムライブラリーにおけるＭＧＣを同定するタスクにとって相対的に使いにくいツールである。
メタゲノムライブラリーを生成するための他の以前の試み

高品質メタゲノムを生成するための多くの他のアプローチが試みられたが、殆ど成功しなかった。例えば、いくつかのグループは、細胞選別機を使用してメタゲノム試料を分解することにより、メタゲノムライブラリーアセンブリーの複雑性を低下させることを試みた。これらの試みは、極めてスモールスケール（例えば、プール当たり１００個の細胞）においてある程度の成功を示し、ごく少数の低カバレッジゲノムの回収を報告した。これらの論文は一般に、「アセンブリーは多くの場合、高度に断片化されており不完全であり、全体的なプロセスは、偏向およびコンタミネーションの傾向がある」と結論した（例えば、Ａｌｔｅｉｏ ＬＶ， Ｓｃｈｕｌｚ Ｆ， Ｓｅｓｈａｄｒｉ Ｒ， ｅｔ ａｌ． ｍＳｙｓｔｅｍｓ． ２０２０；５（２）：ｅ００７６８－１９． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０２０ Ｍａｒ １０． ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＳｙｓｔｅｍｓ．００７６８－１９）。

探索されている別の手段は、「合成長リード配列データ」の創出である。このアプローチは一般に、標準短リードＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定を利用するが、近接性データ情報を取り込むようにＤＮＡ試料を加工する。例えば、当技術分野は、ライブラリーアセンブリーの様々なステージで加えられるトランスポソーム複合体を使用して、近接性データを提供することを試みた（例えば、ＥＰ３６３６７５７、ＵＳ２０２０／０２０２１４４、ＵＳ１０，５７７，６０３およびＥＰ３３７７６２５Ｂ１）。同様の試みは、特有の分子識別子バーコードを利用して、配列近接性情報を同様に提供する（例えば、ＵＳ２０２０／０１２３５３９、ＥＰ２９７７４５５、ＵＳ１０，５５７，１６６、ＵＳ１０，５５７，１３３およびＵＳ１０，７２６，９４２を参照）。これらのアプローチは、スモールスケールで働くが、合成長リード技法をメタゲノムデータベースに適用する試みは全て、失敗に終わった（ＷＯ２０２０／１６５４３３の「１０２４種のバーコードは、生体試料由来のゲノムまたはメタゲノムＤＮＡ由来の分子ミックスの特有のタギングに十分な多様性を表さなかった」を参照）。

研究者らは、メタゲノム試料の複雑性を低下させるためにｉｎ ｓｉｌｉｃｏアプローチを使用することも試みた。これらは、メチル化パターン（ＵＳ２０２０／０１６０９３６）、予測される種（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｑｕｉｎｃｅ， Ａｌａｎ Ｗ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｊａｒｅｄ Ｔ． Ｓｉｍｐｓｏｎ， Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｊ． Ｌｏｍａｎ， Ｎｉｃｏｌａ Ｓｅｇａｔａ ”Ｓｈｏｔｇｕｎ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ， ｆｒｏｍ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｔｏ ａｎａｌｙｓｉｓ．”）に基づくビニング（すなわち、配列をアセンブリー群に割り当てること）を含む。これらのアプローチは、有望ではあるものの、高度に誤りがちであり、現時点では、その大部分が未だ探索されていない、メタゲノム試料に存在する完全な分類学的スペクトルにわたり、配列を完全にビニングすることができない（「分類性能における進化距離および不十分に記載された分類群の影響をさらに強調する」、分類学に基づき配列をビニングする試みがどのように失敗したかについて説明する、Ｓｉｍｏｎ Ｈ Ｙｅ， Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｊ Ｓｉｄｄｌｅ， Ｄａｎｉｅｌ Ｊ Ｐａｒｋ， Ｐａｒｄｉｓ Ｃ Ｓａｂｅｔｉ Ｃｅｌｌ． ２０１９ Ａｕｇｕｓｔ ０８； １７８（４）： ７７９－７９４． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１９．０７．０１０．を参照）。

これらのアプローチは、目標を進めるそれらの試みにおいて称賛に値するものの、天然物発見のための実行可能なデジタルメタゲノムデータベースを提供することに全て失敗した。このスペースにおける大部分の著者は、当技術分野の限界について公にしている（Ａｎａ Ｅｌｅｎａ Ｐｅｒｅｚ－Ｃｏｂａｓ， Ｌａｕｒａ Ｇｏｍｅｚ－Ｖａｌｅｒｏ， Ｃａｒｍｅｎ Ｂｕｃｈｒｉｅｓｅｒ， Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｃｏｌｏｇｙ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｅｓ「これに基づき、ＷＧＳを行う際に、ゲノムアセンブリーは、慎重に為され、解析されるべきであり、これらの試料から得たリードの大部分は、アセンブルされないままとなるであろう」を参照；ＷＯ２０１９／１４７７５３「土壌マイクロバイオームの複雑性は、土壌メタゲノムにおける生合成遺伝子クラスターを同定するためのツールとしてのショットガン配列決定の有用性を限定した。」も参照）。本開示は、当技術分野におけるこれらの限界に取り組み、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＭＧＣ発見に適しているデジタルメタゲノミクスライブラリーを創出するための方法を提供する。
生物情報学パイプラインによる検出および解析

多重遺伝子クラスター解析における近年の取り組みは、配列決定されたゲノムおよび生物情報学ツールに頼る。多くのバイオインフォマティクスツールが、現在、整然としたゲノム配列およびゲノムに分解されたメタゲノムにおける公知のＭＧＣを検出するために開発されている（Ｗｅｂｅｒ Ｔ．， Ｋｉｍ Ｈ．Ｕ． Ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｐｏｒｔａｌ： Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｔｏｏｌｓ ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｓｙｎｔｈ． Ｓｙｓｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１６；１：６９－７９．）。配列決定された公開データベースにおける使用のために本来開発された、これらのツールは、環境ゲノムに分解されたメタゲノムにも適用されている（Ｃｉｍｅｒｍａｎｃｉｃ Ｐ．， Ｍｅｄｅｍａ Ｍ．Ｈ．， Ｃｌａｅｓｅｎ Ｊ．， Ｋｕｒｉｔａ Ｋ．， Ｂｒｏｗｎ Ｌ．Ｃ．， Ｍａｖｒｏｍｍａｔｉｓ Ｋ．， Ｐａｔｉ Ａ．， Ｇｏｄｆｒｅｙ Ｐ．Ａ．， Ｋｏｅｈｒｓｅｎ Ｍ．， Ｃｌａｒｄｙ Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｆｒｏｍ ａ Ｇｌｏｂａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ． Ｃｅｌｌ． ２０１４；１５８：４１２－４２１）。

ＡｎｔｉＳＭＡＳＨ、ＮＡＰＤＯＳおよびＣｌｕｓｔＳｃａｎは、その解析における低い新規性だが高い信頼度を提供し、よって、公知の生合成クラスの遺伝子クラスターを探すユーザーに、またはアノテーション目的のために単一もしくは複数のゲノムにおけるあらゆる検出可能なＭＧＣを調べるのに適した、バイオインフォマティクスソフトウェアの例である（Ｂｌｉｎ Ｋ．， Ｗｏｌｆ Ｔ．， Ｃｈｅｖｒｅｔｔｅ Ｍ．Ｇ．， Ｌｕ Ｘ．， Ｓｃｈｗａｌｅｎ Ｃ．Ｊ．， Ｋａｕｔｓａｒ Ｓ．Ａ．， Ｓｕａｒｅｚ Ｄｕｒａｎ Ｈ．Ｇ．， ｄｅ ｌｏｓ Ｓａｎｔｏｓ Ｅ．Ｌ．Ｃ．， Ｋｉｍ Ｈ．Ｕ．， Ｎａｖｅ Ｍ．， ｅｔ ａｌ． ａｎｔｉＳＭＡＳＨ ４．０－ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１７；４５：Ｗ３６－Ｗ４１；およびＳｔａｒｃｅｖｉｃ Ａ．， Ｚｕｃｋｏ Ｊ．， Ｓｉｍｕｎｋｏｖｉｃ Ｊ．， Ｌｏｎｇ Ｐ．Ｆ．， Ｃｕｌｌｕｍ Ｊ．， Ｈｒａｎｕｅｌｉ Ｄ． ＣｌｕｓｔＳｃａｎ： Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｉｃ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｕｌａｒ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００８；３６：６８８２－６８９２）。より新しいバージョンのａｎｔｉＳＭＡＳＨは現在、新規の型を含む追加的な型のＭＧＣのためのアルゴリズムも取り込む（Ｋａｉ Ｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ａｎｔｉＳＭＡＳＨ ５．０： ｕｐｄａｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ｐｉｐｅｌｉｎｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４７， Ｉｓｓｕｅ Ｗ１， ０２ Ｊｕｌｙ ２０１９， Ｐａｇｅｓ Ｗ８１－Ｗ８７。

他の利用できるツールは、より欲張りなアルゴリズムにより設計されている。ＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒは、例えば、低い信頼度だが高い新規性の解析を提供する、近年開発されたソフトウェアである（Ｃｉｍｅｒｍａｎｃｉｃ Ｐ．， Ｍｅｄｅｍａ Ｍ．Ｈ．， Ｃｌａｅｓｅｎ Ｊ．， Ｋｕｒｉｔａ Ｋ．， Ｂｒｏｗｎ Ｌ．Ｃ．， Ｍａｖｒｏｍｍａｔｉｓ Ｋ．， Ｐａｔｉ Ａ．， Ｇｏｄｆｒｅｙ Ｐ．Ａ．， Ｋｏｅｈｒｓｅｎ Ｍ．， Ｃｌａｒｄｙ Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｆｒｏｍ ａ Ｇｌｏｂａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ． Ｃｅｌｌ． ２０１４；１５８：４１２－４２１）。ＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒアルゴリズムは近年、ａｎｔｉＳＭＡＳＨツールへと統合された。新たな化学的足場を有する分子をコードする可能性があるため、新規クラスから遺伝子クラスターを予測することは役に立つ。ＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒは、ＭＧＣおよび非ＭＧＣ解析の間でスイッチする隠れマルコフモデルを使用して、特異的な個々のシグネチャー遺伝子の存在を検索するのではなく、ゲノム領域においてコードされる広範な遺伝子機能のパターンを探す。この方法は、ＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒが、様々な門由来の広い範囲の細菌におけるアリールポリエンの生合成をコードする遺伝子クラスターの大型な、以前に認識されなかったファミリーを同定することを可能にした（同上）。

ＭＧＣ発見のために現在利用できるバイオインフォマティクスツールの非限定的なリストを下の表１に提示する。これらのツールについて説明する参考文献のそれぞれが、参照により本出願に組み込まれる。
表１－ ＭＧＣ発見および解析のための生物情報学ソフトウェア（ＭＧＣ予測アルゴリズムを適用することができるツール）

しかし、上に記載されているツール等、生物情報学ツールは、有効かつ信頼度できる出力のために、高品質のゲノムに分解されたメタゲノムに大いに頼る（Ｂｌｉｎ Ｋ．， Ｋｉｍ Ｈ．Ｕ．， Ｍｅｄｅｍａ Ｍ．Ｈ．， Ｗｅｂｅｒ Ｔ． Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉＳＭＡＳＨ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｍｉｎｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ． Ｂｒｉｅｆ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ． ２０１７）。実際に、メタゲノム由来の配列決定データまたは分解されたゲノムの品質は、結果の信頼度性に影響することができる。ＭＧＣについてのメタゲノム配列決定データの解析に関するさらに別の厄介な問題は、より詳細に以前に概説されている（Ｍｅｄｅｍａ Ｍ．Ｈ．， Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ Ｍ．Ａ． Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０１５；１１：６３９－６４８；およびＷｉｌｓｏｎ Ｍ．Ｃ．， Ｐｉｅｌ Ｊ． Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ Ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｓ ａ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０１３；２０：６３６－６４７）。これらの限界については、下でより詳細に記述する。
メタゲノム配列におけるＭＧＣ発見の課題

整然とした（例えば、公開された完全）ゲノム配列と比較して、ＭＧＣについてのメタゲノム配列データの解析は、いくつかの肝要な課題を提示する。メタゲノムにおける生合成遺伝子クラスターを同定するための２種の主なアプローチ：ＰＣＲに基づく配列タグアプローチおよびショットガンアセンブリーアプローチが存在する。ＰＣＲに基づくアプローチは、上に詳細に記述しており、したがって、本セクションでは再度取り組まない。

ショットガンアセンブリーアプローチにおいて、無培養生物由来のメタゲノムＤＮＡは、まとめて配列決定され、次いで一斉にアセンブルされる。しかし、このアプローチは、その適用を、相対的に低い複雑性の生態系、またはより複雑な生態系から分類学的に富化された試料に限定する、いくつかの技術的課題に直面する。有意義な配列解析およびその後のＭＧＣ回収を可能にするために、ゲノムの十分に長い部分を生成する能力が問題となっている。

配列決定後のゲノムアセンブリーにおいて、試料が、単一の種を含有することが予想される（アセンブリーに先立ちスクリーニングされ得る何らかのコンタミネーションは別として）。この予想は、アセンブリーツールが、アセンブリーを容易にするある特定の仮定を為すことを可能にする。標的ゲノムの予想されるカバレッジは、ゲノムの推定サイズで割ったデータセットの総サイズから予測することができる。シーケンサーへのＤＮＡ入力は、ゲノムにわたる配列について相対的に安定していると仮定される。したがって、予想されるカバレッジと比較して非常に低いカバレッジで発生するグラフにおけるノードまたはエッジは、配列決定エラーまたは低レベルコンタミネーションの結果である可能性が高いことが仮定され得、グラフは、斯かるノードまたはパスを除去することにより相当に単純化される。同様に、平均カバレッジよりもはるかに高いカバレッジを有するノードは、ゲノム内の反復構造の一部であると仮定され得る。単一ゲノムアセンブラのための典型的な最適配列カバレッジは、２０～２００×範囲内であり、一般的な「スイート・スポット」は、約５０×である（Ｄｅｓａｉ Ａ， Ｍａｒｗａｈ ＶＳ， Ｙａｄａｖ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｍｕｍ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｐｔｈ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｆｏｒ ｄｅ ｎｏｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ． ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３；８（４）：ｅ６０２０４）。

しかし、メタゲノムデータセットにおいて、この仮定および単純化を為すことはできない。より低いカバレッジのノードは、エラーではなく、より低い存在量を有するゲノムに起源を持つ可能性があるため、軽率に廃棄するべきではない。この問題をこじらせることに、試料内の種の数、および種の存在量の分布は、未知である。不均一な試料における存在量は、多くの場合、べき法則に従い、このことは、多くの種が、同様に低い存在量で発生するであろうことを意味し、あるものを別のものから区別する問題が、問題になる（Ｌｉ Ｄ， Ｌｉｕ ＣＭ， Ｌｕｏ Ｒ， ｅｔ ａｌ． ＭＥＧＡＨＩＴ： ａｎ ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｏｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｖｉａ ｓｕｃｃｉｎｃｔ ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ ｇｒａｐｈ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１５；３１（１０）：１６７４－６）。大部分の種の低カバレッジは、問題になっているゲノムが相対的に小型でない限り、ｄｅ ｎｏｖｏアセンブリーの可能性が低いことを意味する。

実際に、大部分の複雑なメタゲノムライブラリーからのアセンブリーは、長さが高度に限定されており、よって、有意義なＭＧＣ解析を防止する。短いアセンブリーは、多くの場合、完全ＭＧＣを含まず、このことは、生物情報学アルゴリズムが、クラスターを同定および解析することを困難にする。遺伝子が同定される場合、多くの場合、結果として生じる天然物を発現および検査するために、本来のＭＧＣを再構築することは、不可能ではないにしても困難である。これらの限界が原因で、高度に複雑なメタゲノムライブラリーのいかなるｉｎ ｓｉｌｉｃｏバイオインフォマティクスＭＧＣ解析も存在してこなかった。代わりに、現在までに報告された大部分のバイオインフォマティクス研究は、公開された予めアセンブルされたライブラリー、または１０ｋ未満のゲノムの限定された小型のメタゲノムアセンブリーのいずれかに頼った。

本明細書にて開示される発明は、これらの技術的問題点を解決し、本開示のＭＧＣバイオインフォマティクスツールによって検索され得る、長リード断片アセンブルされたメタゲノムライブラリー生成するための方法、システムおよびツールを提供する。本開示はまた、メタゲノムライブラリーが創出されたら、新たな天然物コードＭＧＣを同定するためのいくつかの新規ｉｎ ｓｉｌｉｃｏワークフローを提供する。
本天然物発見プラットフォームの方法、システムおよびツール

本開示は、ＭＧＣ含有微小生物を培養する必要のない、微小生物から多量のＭＧＣをマイニングすることを可能にする、いくつかの先進的メタゲノムライブラリー調製およびバイオインフォマティクス解析パイプラインを提供する。よって、本開示において提供されるツールは、無培養の微生物多様性の大部分である微生物ダークマターの二次代謝特性を解明する驚くべき機会を提供する。

一部の実施形態では、本開示は、１）物理的メタゲノムライブラリー創出、２）配列決定、およびデジタルメタゲノミクスライブラリー（「ＤＭＬ」）の創出、３）新規バイオインフォマティクス発見アプローチに基づく、ＤＭＬの問い合わせおよび目的のクラスターの同定、４）天然物分子表現型決定、５）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏおよび／またはウェットラボ天然物構造解明、ならびに必要に応じて６）化学的または生合成的アプローチによるアナログ化を含む、天然物発見ワークフローを教示する（例えば、図１～３を参照）。天然物発見プラットフォームのエレメントのそれぞれについて、下でより詳細に記述する。
デジタルメタゲノミクスライブラリー－序文

一部の実施形態では、本開示は、メタゲノムライブラリーからＭＧＣを同定するための方法およびシステムを教示する。本開示はまた、ＭＧＣ生物情報学検索に適しているメタゲノムライブラリーを生成するための方法およびシステムを教示する。

一部の実施形態では、本開示のＭＧＣ発見システムおよび方法は、メタゲノムライブラリーに、またはより具体的には、デジタルメタゲノミクスライブラリー（ＤＭＬ）に適用される。本開示の目的のため、メタゲノムライブラリーは、次の仕方で定義される：

１）無培養種のゲノムを含む物理的またはデジタル配列ライブラリー（例えば、介在する培養ステップなしの環境試料に由来するライブラリー）。一部の実施形態では、無培養種は、酵母、真菌、細菌、古細菌（ａｒｃｈａｅ）、原生生物、ウイルス、寄生生物または藻類種に由来する。無培養種は、任意の供給源、例えば、土壌、腸、水界生息地から得ることができる。一部の実施形態では、アセンブルされたライブラリー内の配列の大部分が、無培養生物に由来する場合、およびライブラリーが、他のサイズ限界を満たす場合、ライブラリーは、メタゲノミクスライブラリーと考慮される。一部の実施形態では、本開示の物理的および／またはデジタル配列ライブラリーは、それが抽出された環境試料を代表し、現存する小型（例えば、１００種未満の生物）のアセンブリーの凝集ではない。環境試料から供給される配列を越えた、いかなる外因的に添加／スパイクされた配列も、本開示のライブラリーの外部と考慮することができる。

２）上のポイント１の定義を満たし、さらに、ライブラリー内の配列の大部分が無培養生物に由来する、物理的またはデジタル配列ライブラリー。一部の実施形態では、ライブラリーにおける生物の大部分が無培養である物理的ライブラリーを配列決定することにより産生される場合、デジタルメタゲノミクスライブラリーは、無培養生物由来の配列の大部分を含有すると考慮される。一部の実施形態では、配列決定に先立ちいずれの生物も培養されていない物理的ライブラリーを配列決定することにより産生される場合、デジタルメタゲノミクスライブラリーは、無培養生物由来の配列の大部分を含有すると考慮される。一部の実施形態では、アセンブルされたライブラリー内の配列の実質的に全てが、無培養生物に由来する場合、およびライブラリーが、他のサイズ限界を満たす場合、ライブラリーは、メタゲノミクスライブラリーと考慮される。この文脈で使用される場合、用語「実質的に全て」は、アセンブルされた配列の少なくとも９０％が無培養生物に由来するライブラリーを指す。一部の実施形態では、ライブラリーにおける生物の実質的に全てが無培養である物理的ライブラリーを配列決定することにより産生される場合、デジタルメタゲノミクスライブラリーは、無培養生物由来のその配列の実質的に全てを含有すると考慮される。一部の実施形態では、配列決定に先立ちいずれの生物も培養されていない物理的ライブラリーを配列決定することにより産生される場合、デジタルメタゲノミクスライブラリーは、無培養生物由来の配列の実質的に全てを含有すると考慮される。

３）上のポイント１および／または２の定義を満たし、１つより多くの無培養種のゲノムをさらに含む、物理的またはデジタル配列ライブラリー。一部の実施形態では、メタゲノムライブラリーは、少なくとも１００、５００、１０００、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７種またはそれよりも多い無培養種のゲノムを含む。一部の実施形態では、デジタルメタゲノミクスライブラリーにおけるアセンブルされたゲノムの数は、ＤＭＬにおける総アセンブルされた配列を、ゲノムに存在すると予想される生物の種類のゲノムの平均サイズで割ることにより計算される。一部の実施形態では、デジタルメタゲノミクスライブラリーにおけるアセンブルされたゲノムの数は、ＤＭＬにおける特有の１６ｓ ｒＲＮＡ配列の数を計数することにより評価される。一部の実施形態では、デジタルメタゲノミクスライブラリーにおけるアセンブルされたゲノムの数は、ＤＭＬにおける特有の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）の数を計数することにより評価される。

４）上のポイント１～３のうち１種または複数の定義を満たし、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５０Ｍｂ、６０Ｍｂ、７０Ｍｂ、８０Ｍｂ、９０Ｍｂ、１００Ｍｂ、１１０Ｍｂ、１２０Ｍｂ、１３０Ｍｂ、１４０Ｍｂ、１５０Ｍｂ、１６０Ｍｂ、１７０Ｍｂ、１８０Ｍｂ、１９０Ｍｂ、２００Ｍｂ、２１０Ｍｂ、２２０Ｍｂ、２３０Ｍｂ、２４０Ｍｂ、２５０Ｍｂ、２６０Ｍｂ、２７０Ｍｂ、２８０Ｍｂ、２９０Ｍｂ、３００Ｍｂ、３１０Ｍｂ、３２０Ｍｂ、３３０Ｍｂ、３４０Ｍｂ、３５０Ｍｂ、３６０Ｍｂ、３７０Ｍｂ、３８０Ｍｂ、３９０Ｍｂ、４００Ｍｂ、４１０Ｍｂ、４２０Ｍｂ、４３０Ｍｂ、４４０Ｍｂ、４５０Ｍｂ、４６０Ｍｂ、４７０Ｍｂ、４８０Ｍｂ、４９０Ｍｂ、５００Ｍｂ、５５０Ｍｂ、６００Ｍｂ、６５０Ｍｂ、７００Ｍｂ、７５０Ｍｂ、８００Ｍｂ、８５０Ｍｂ、９００Ｍｂ、９５０Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１０５０Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１１５０Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１２５０Ｍｂ、１３００Ｍｂ、１３５０Ｍｂまたは１４００Ｍｂのサイズである、デジタル配列ライブラリー。アセンブルされた配列は、ＤＭＬにおける全てのコンティグの相加的な長さである。

５）上のポイント１～４のうち１種または複数の定義を満たし、少なくとも約１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂ、２１ｋｂ、２２ｋｂ、２３ｋｂ、２４ｋｂ、２５ｋｂ、２６ｋｂ、２７ｋｂ、２８ｋｂ、２９ｋｂ、３０ｋｂ、３１ｋｂ、３２ｋｂ、３３ｋｂ、３４ｋｂ、３５ｋｂのＮ５０をさらに含む、デジタル配列ライブラリー（すなわち、長いアセンブリーデジタルメタゲノムライブラリー）。

一部の実施形態では、メタゲノミクスは、環境試料からのＤＮＡの直接的抽出を伴う。メタゲノムデータベースの別の利点は、所望の天然物をコードする可能性がある遺伝子を含む可能性がより高い生物を富化することができることである。例えば、抗真菌特性を有する天然物のためのＭＧＣは、真菌感染によって定期的に曝露された微生物試料から産生されたメタゲノムデータベースにおいて富化され得る。ヒトの消化器健康に関連する天然物のためのＭＧＣは、ヒトまたは動物の腸管から集められた微生物試料から産生されたメタゲノムデータベースにおいて富化され得る。よって、本開示の方法およびシステムは、メタゲノムデータベースにより利用できる配列の広い多様性から、および所望の最終使用のために斯かるデータベースを富化するための潜在性から利益を得る。

微小生物は、生態系の機能において必須の役割を果たし、定量的に十分に表される。土壌試料、食物試料または生物学的組織試料等の環境試料は、極めて多数の生物を含有し、結果的に、ゲノムデータの大型セットを生成することができる。例えば、消化、内分泌および免疫機能のモジュレーションのために細菌に頼る人体は、最大１００兆個の生物を含有することができると推定される。加えて、１グラムの土壌が、培養可能および培養不能な細菌を含む、１０^７～１０^９個の間の細胞で、１，０００～１０，０００種の間の異なる種の細菌を含有することができると推定される。メタゲノムＤＮＡライブラリーにおいてこの多様性全体を再現することは、多数のクローンを生成および管理する能力を要求する。一部の実施形態では、メタゲノムデータベースは、取り込んだＤＮＡによって互いに異なる、少なくとも１、数十、数十万またはさらには数百万種の組換えクローンを含むことができる。一部の実施形態では、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４７８，５４４号、同第１０，２２７，５８５号および同第９，３７２，９５９号に記載されている通り、メタゲノムライブラリーは、メタゲノム断片から構築する、および／またはコンティグへとアセンブルすることができる。一部の実施形態では、メタゲノム配列は、全ゲノムへとアセンブルすることができる。一部の実施形態では、メタゲノムライブラリーは、微生物生合成経路の検索を容易にするために、平均サイズ（またはＮ５０）のクローニングされたメタゲノム挿入物を含むように最適化することができるが、それは、これらの経路は、多くの場合、微小生物のゲノムにおけるクラスターにおいて組織化されるからである。クローニングされるＤＮＡ断片が大型になるほど（３０Ｋｂよりも大型）、解析されるべきクローンの数は限定されるようになり、完全代謝経路を再現する可能性は大きくなる。研究されるべき多数の組換えクローンを考慮すると、細菌群集の特徴付けのため等、高密度ハイブリダイゼーションシステム（高密度膜またはＤＮＡチップ）を用いることができる（概説については、参照により本明細書に組み込まれるＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． ２００３；６：２８８－２９４を参照）。

当業者であれば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質配列の間の関係性に気づき、よって、ＤＮＡ配列データを容易に変換して、ＲＮＡまたはタンパク質情報によるメタゲノムライブラリーを創出することができるであろう。一部の実施形態では、本開示のメタゲノムライブラリーは、細胞集団から得られるＤＮＡ配列を含む。よって、一部の実施形態では、メタゲノムライブラリーは、直接的なＤＮＡ配列決定から得られる情報を含む。一部の実施形態では、メタゲノムライブラリーは、直接的に測定されたか、またはＤＮＡ配列に基づき予測される、転写されたＲＮＡを含む。よって、一部の実施形態では、メタゲノムライブラリーは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびアプタマーについて検索することができる。一部の実施形態では、メタゲノムライブラリーは、測定されたか、または測定されたＤＮＡ配列に基づき予測される、アミノ酸タンパク質配列データを含む。例えば、メタゲノムライブラリーは、本開示に記載されている機械学習モデルにアクセス可能な、予測されるまたは検証されたタンパク質配列のリストを含むことができる。

一部の実施形態では、本開示のＭＧＣ発見システムおよび方法は、環境試料由来のアセンブルされた配列ライブラリー（「環境ライブラリー」または「ＥＬ」）に適用される。一部の実施形態では、Ｅｌは、直接的に配列決定された（よって、メタゲノム試料となり得る）か、または少なくとも１回の培養ステップを経た（例えば、１種または複数種の生物を富化するために）環境ＤＮＡ試料の徹底的に（すなわち、少なくとも１０×カバレッジ）配列決定されたアセンブリーである。一部の実施形態では、本開示のＥＬは、本開示のＭＧＣ発見方法およびシステムによりその機能を改善する次の特性を含むであろう：

１）ＥＬは、少なくとも約５０Ｍｂ、６０Ｍｂ、７０Ｍｂ、８０Ｍｂ、９０Ｍｂ、１００Ｍｂ、１１０Ｍｂ、１２０Ｍｂ、１３０Ｍｂ、１４０Ｍｂ、１５０Ｍｂ、１６０Ｍｂ、１７０Ｍｂ、１８０Ｍｂ、１９０Ｍｂ、２００Ｍｂ、２１０Ｍｂ、２２０Ｍｂ、２３０Ｍｂ、２４０Ｍｂ、２５０Ｍｂ、２６０Ｍｂ、２７０Ｍｂ、２８０Ｍｂ、２９０Ｍｂ、３００Ｍｂ、３１０Ｍｂ、３２０Ｍｂ、３３０Ｍｂ、３４０Ｍｂ、３５０Ｍｂ、３６０Ｍｂ、３７０Ｍｂ、３８０Ｍｂ、３９０Ｍｂ、４００Ｍｂ、４１０Ｍｂ、４２０Ｍｂ、４３０Ｍｂ、４４０Ｍｂ、４５０Ｍｂ、４６０Ｍｂ、４７０Ｍｂ、４８０Ｍｂ、４９０Ｍｂ、５００Ｍｂのサイズである、デジタル処理でアセンブルされた配列ライブラリーを含む。アセンブルされた配列は、Ｅｌにおける全てのコンティグの相加的な長さである。

２）ＥＬは、上のポイントＥＬのポイント１の定義を満たし、少なくとも約１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂ、２１ｋｂ、２２ｋｂ、２３ｋｂ、２４ｋｂ、２５ｋｂ、２６ｋｂ、２７ｋｂ、２８ｋｂ、２９ｋｂ、３０ｋｂ、３１ｋｂ、３２ｋｂ、３３ｋｂ、３４ｋｂ、３５ｋｂのＮ５０をさらに含む（すなわち、長いアセンブリーデジタル環境ライブラリー）。

本文書のその後のセクションは、本開示の方法において使用される環境ライブラリーおよびメタゲノムライブラリーを調製する方法を教示する。メタゲノムライブラリーを調製するための下に記述される方法も、環境ライブラリーに適用する。例えば、一部の実施形態では、本開示の環境ライブラリーは、やはり環境試料から抽出され、配列決定に先立ちプールへとサイロ貯蔵（ｓｉｌｏ）され、必要に応じて、下に記述される２つのステージにおいてアセンブルされ得る。さらに、本文書で記述されるデジタル検索ワークフローの全ては、Ｅｌに適用することもできる。すなわち、本明細書において下に記述される方法におけるＤＭＬの使用についてのあらゆる参照を、ＥＬという用語に置き換えることができる。本段落は、単に、培養された生物を含有し得るライブラリーへの、本明細書にて開示される方法の適用性を記しているにすぎないが、上に定義されている通り、真のメタゲノムライブラリーの利益と矛盾するものではない。
メタゲノムライブラリー創出－ＤＮＡ抽出

メタゲノムライブラリーを産生することにおける最初のステップは、目的のメタゲノム試料（例えば、土壌、川の水、腸内糞便）からＤＮＡを抽出することである。当業者であれば、ＤＮＡ抽出方法を熟知しているであろう。メタゲノム試料からの配列決定適用に最適化された、多くの商業的ＤＮＡ抽出キットが存在する。例えば、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）は、土壌試料からのＤＮＡ抽出のためのＦａｓｔＤＮＡ（商標）スピンキットを販売する。他の公知の技法が、当技術分野で開示される（Ｓｈａｍｉｍ Ｋ， Ｓｈａｒｍａ Ｊ， Ｄｕｂｅｙ ＳＫ． Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｅｓｔｕａｒｉｎｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ． ３ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２０１７；７（３）：１８２；また、Ｂａｇ， Ｓ．， Ｓａｈａ， Ｂ．， Ｍｅｈｔａ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６， ２６７７５ （２０１６）；およびＡｈｍａｄｉ， Ｅ．， Ｋｏｗｓａｒｉ， Ｍ．， Ａｚａｄｆａｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１８） ７５： ４３も参照）。

一部の実施形態では、本開示は、ａ）金網を用いて土壌試料から非土壌デブリを除去するステップと、ｂ）３００ｍＬのＣＴＡＢに基づく溶解緩衝剤（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ８．０）を添加し、続いて、混合するために一貫して反転しつつ、７０℃で２時間インキュベーションすることにより、結果として生じる土壌からＤＮＡを抽出するステップと、ｃ）４，０００ｇで２０分間４℃にて試料を遠心分離し、上清を清潔なボトルに移し、その後、４，０００ｇで２０分間４℃にて２回目の遠心分離をするステップと、ｄ）ライセートを新たなボトルに移し、０．７体積のイソプロパノールを添加し、３０分間穏やかに混合するステップと、ｅ）４，０００ｇで３０分間、４℃での２ラウンドの遠心分離により、沈殿したＤＮＡをペレットにし、１回目と２回目の遠心分離の間に７０％エタノールで洗浄するステップと、ｆ）上清を除去し、ペレットを乾かすステップと、ｇ）ペレットを１０ｍＬのＴＥ緩衝剤に再懸濁するステップとを含む、土壌メタゲノムＤＮＡ抽出のためのプロトコールを教示する。抽出されたＤＮＡは、必要に応じて、分光光度計によって定量化し、さらなる加工のために保存することができる。当業者であれば、環境試料からＤＮＡを抽出するための多くの他の方法を熟知しているであろう（例えば、Ｂａｇ， Ｓ．， Ｓａｈａ， Ｂ．， Ｍｅｈｔａ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６， ２６７７５ （２０１６）；Ｐｏｒｔｅｏｕｓ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９， ３０１－３０７ （１９９４）；Ｃ． Ｍａｒｏｔｚ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ． ６２ ＮＯ． ６；Ｒ． Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １４３， ２０１７， Ｐａｇｅｓ ７８－８６；Ｋ． Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ－Ｑｕａｌｉｔｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｏｉｌ Ｓａｍｐｌｅｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｕｎ ２０１０， ７６（１３）４５７１－４５７３を参照）。
メタゲノムライブラリー創出－サイズ選択およびコスミドパッケージング

メタゲノムライブラリーを産生することにおける次のステップは、抽出されたＤＮＡの大型断片を組換えＤＮＡベクターにクローニングし、結果として生じる組換えプラスミドを貯蔵および繁殖のために微生物宿主に形質導入することである。加えて、クローニングされたＤＮＡを使用して、抽出されたＤＮＡを配列決定のために調製することができる。当業者であれば、様々な次世代配列決定プラットフォームのためにＤＮＡを加工するための多くの方法を熟知しているであろう。しかし、一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ試料をプールして、下流ゲノムアセンブリーの複雑性を低下させる特異的な方法を教示する。

一部の実施形態では、ＤＮＡ試料は、コスミドベクター骨格にクローニングされ、ファージによってパッケージングされ、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞へと形質導入されて、抽出されたＤＮＡの物理的コピーを増幅および創出する。一部の実施形態では、メタゲノム試料から抽出されたＤＮＡは、初期サイズ分画ステップのために、アガロースゲルにロードされ、泳動される。一部の実施形態では、３５～４５ｋｂ前後であるＤＮＡが切り出され、さらなる加工のためにアガロースゲルから溶出される。一部の実施形態では、特に、ファージパッケージング技法が、所望のサイズの挿入物を選択的にパッケージングする場合（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）によるＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ ＸＬ（商標）を使用することにより）、サイズ分画は必要ない。

一部の実施形態では、次いで、ＤＮＡは、増幅のためにファージにおけるコスミドへとパッケージングされる。一部の実施形態では、コスミドへのＤＮＡのパッケージングは、次の一般ステップを含む：（１）２個のｃｏｓ部位の間への外来性ＤＮＡのライゲーション；（２）コンカテマーＤＮＡの作製；（３）ファージ頭部にＤＮＡを導入して、成熟ファージ粒子を形成するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング；および（４）形質導入によるクローニングされたＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉへの導入。当業者であれば、様々なコスミド産生および増幅技法を熟知しているであろう。ファージパッケージングのための商業的キットの非限定的なリストは、ＭａｘＰｌａｘ（商標）Ｌａｍｂｄａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓ Ｋｉｔ、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ（商標）、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｐｌｕｓ（商標）、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ ＸＬ（商標）、Ｐａｃｋａｇｅｎｅ（登録商標）を含む。

一部の実施形態では、本開示は、ラムダファージパッケージングのためのプロトコールであって、ａ）抽出されたＤＮＡをＥｎｄ－Ｉｔ ＤＮＡ Ｅｎｄ－Ｒｅｐａｉｒキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＥＲ０７２０）により加工して、平滑断端ＤＮＡを産生するステップと、ｂ）Ｔ４リガーゼを使用して、２５０ｎｇの結果として生じる平滑断端ＤＮＡを５００ｎｇの平滑断端コスミドベクター中にライゲーションするステップと、ｃ）製造業者の使用説明書に従ってＭａｘＰｌａｘ（商標）パッケージングキットを使用して、結果として生じるコスミドをファージ中にパッケージングするステップとを含むプロトコールを教示する。
メタゲノムライブラリー創出－サイロプーリング

上に記述されている通り、配列決定されたメタゲノムライブラリーへ生物情報学ＭＧＣ発見ツールを適用することにおける主要課題は、複雑な環境ＤＮＡ試料由来の長い配列をアセンブルすることができないことである。本開示は、先行技術の問題点を解決し、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ多重遺伝子クラスター発見に適しているデジタルメタゲノミクスライブラリーを産生する、ライブラリー調製およびアセンブリーステップにおける複雑性低下方法を教示する。

次世代配列決定プロトコールが、試料をプールするステップを含むことは珍しいことではない。配列決定前の試料のプーリングは、典型的に、コストを低下させ、シーケンサーを効率的に活用するために行われ、これは多くの場合、単一の試料よりもをはるかに多く配列決定することができる。細菌ゲノムの平均サイズは、例えば、約３．６５Ｍｂである（ｄｉＣｅｎｚｏ ＧＣ， Ｆｉｎａｎ ＴＭ． ２０１７． Ｔｈｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ８１：ｅ０００１９－１７を参照）。他方では、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｏｖａＳｅｑ ６０００（商標）配列決定機械は、１ラン当たり３２０億～４００億個の間の塩基を配列決定することができる（すなわち、平均細菌ゲノムの約１０，０００×とほぼ等価）。この型の意図的な試料のプーリングは、典型的に、ゲノムアセンブリーを始める前に、コンピューターが、結果として生じる配列を、各個々の（予め混合された）試料に対応するファイルへと選別することを可能にする、バーコード化技術の使用に頼る。

メタゲノムＤＮＡ試料は、本来の材料試料（例えば、土壌）中に存在する数百～数百万種の微生物のゲノムを含む、大規模な、非自発的な（ｉｎｖｏｌｕｎｔａｒｙ）かつマークされていないＤＮＡプールを表す。ゲノムは予め混合されていたため、メタゲノムＮＧＳ由来の結果として生じる配列は、リードを、それが属する生物に従って予め選別する能力を用いずにアセンブルしなければならない。

一部の実施形態では、本開示は、複雑性を減少させ、アセンブリーを改善するための、メタゲノム試料のサイロプーリングの方法を教示する。一部の実施形態では、メタゲノムＤＮＡ試料由来のＤＮＡコスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉライブラリー内で加工および貯蔵される。Ｅ．ｃｏｌｉライブラリー内の各コロニーは、約３５～４０ｋｂの長さの１個のコスミドを含む。一部の実施形態では、メタゲノムライブラリーのゲノムを個々のコスミドへと分解することにより、斯かる断片のアセンブリー困難が低下される。これは、ライブラリーを個々のコスミドへと先ず分離することなく、直ちに全ゲノムを配列決定する一部の伝統的アプローチと対比される。

多くの伝統的な配列決定プロトコールは、ショットガン配列決定のための、単一の試料への全ゲノムで構成されるメタゲノム環境ＤＮＡの抽出を教示する（例えば、単一のプールへとメタゲノムライブラリー内の全てのクローンを組み合わせる）。本明細書にて開示されるアプローチは、ＭＧＣ発見に十分な品質のアセンブリーを依然として産生しながら、シーケンサーの使用を最大化するサイズの複数の小型のプールを産生するという点において、これらの伝統的アプローチとは異なる。

具体的には、一部の実施形態では、本明細書にて開示される方法は、１）コスミドへのゲノムの断片のクローニングと、２）複数の配列決定サイロへの、コスミドを含有する限られた数のＥ．ｃｏｌｉコロニーの選択的なプーリングを教示する（図２のステップ１および図１４を参照）。結果として生じる配列決定サイロは、限られた数の全長コスミドを含み、よって、その後のアセンブリーの複雑性を低下させる。下でより詳細に記述する通り、サイロプーリング方法は、全ゲノムまたは数百／数千種のゲノムに対応する２０００万種のコスミドを並行してアセンブルするものから、アセンブリーが数千種のコスミドのみに集中するものへと問題を低下させる。

いくつかの刊行物が、バーコード化または全ゲノム配列決定の代替として、少数のクローンのプーリングを以前に開示した（Ｄｚｕｎｋｏｖａ Ｍ， Ｄ’Ａｕｒｉａ Ｇ， Ｐｅｒｅｚ－Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ Ｄ， Ｍｏｙａ Ａ （２０１２） Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｆｅｃａｌ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｏｎｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ Ｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７： ｅ４７６５４．；Ｗａｎｇ Ｌ， Ｈａｔｅｍ Ａ， Ｃａｔａｌｙｕｒｅｋ ＵＶ， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｍ， Ｙｕ Ｚ （２０１３） Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｃａｒｒｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ａｄｈｅｒｉｎｇ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ Ｄｉｇｅｓｔａ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｕｍｅｎ ｏｆ Ｃｏｗｓ． ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ８： ｅ７８５０７）．）。例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ． ２０１３は、環境試料に由来する９２個の明確に異なるクローンのプーリングを開示した（Ｌａｍ ＫＮ， Ｈａｌｌ ＭＷ， Ｅｎｇｅｌ Ｋ， Ｖｅｙ Ｇ， Ｃｈｅｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｏｏｌｅｄ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ． ＰｌｏＳ ＯＮＥ ９（６）： ｅ９８９６８． Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９８９６８）。しかし、Ｌａｍらにおける実験は、およそ９００倍リード深度および＞１００倍被覆度まで配列決定された少数の予めスクリーニングされたクローンに限定された。この極端に高レベルの配列決定にもかかわらず、Ｌａｍは、９２個の本来のクローンのうち７７個についての参照コンティグの回収のみを報告した。よって、Ｌａｍらの結果は、本明細書にて開示される通り、３，０００～１４，０００個のコスミドのサイロプーリングからデジタルメタゲノムライブラリーを産生することのいかなる成功予想も提供しなかった。

本発明は、一部には、５～２０ｋコスミド、１０～１５ｋコスミドまたは１２～１２ｋコスミドの間のサイロのプールを創出することにより、環境ライブラリーまたはメタゲノムライブラリー由来のライブラリー等の大型の物理的ライブラリーを、ＭＧＣ発見のために創出し、配列決定し、アセンブルに成功することができるという出願人の予想外の発見に基づく。本出願に記載されている研究は、本開示の方法に従って、ＭＧＣ発見に適しているデジタル環境またはメタゲノムライブラリーを依然として産生しながら、プールすることができるコスミドの数を実証する。例えば、図２１Ａは、１０×被覆度の配列決定において、少なくとも１５ｋｂのＮ５０（ＭＧＣの最適な発見を可能にするように決定）を有するライブラリーを依然として生成しながら、約３０，０００個のコスミドをプールすることが可能であることを実証する。図２１Ｃは、サイロの最適なプーリングへのさらなる洞察を提供する。多くすぎるコスミドのプーリングは、アセンブリーステージにおいて困難を生じ、ライブラリーにおける１５ｋｂのアセンブルされたコンティグの数およびアセンブリーの全体的な効率を低下させる。少なすぎるコスミドのプーリングは、シーケンサーの非効率的な使用をもたらし、より少ない総配列、よって、より少ないアセンブルされた１５＋ｋｂのアセンブルされたコンティグをもたらす。

一部の実施形態では、結果として生じる配列決定サイロのそれぞれは、３，０００～３５，０００個の間のコスミドを含む。一部の実施形態では、各配列決定サイロは、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、６，１００、６，２００、６，３００、６，４００、６，５００、６，６００、６，７００、６，８００、６，９００、７，０００、７，１００、７，２００、７，３００、７，４００、７，５００、７，６００、７，７００、７，８００、７，９００、８，０００、８，１００、８，２００、８，３００、８，４００、８，５００、８，６００、８，７００、８，８００、８，９００、９，０００、９，１００、９，２００、９，３００、９，４００、９，５００、９，６００、９，７００、９，８００、９，９００、１０，０００、１０，１００、１０，２００、１０，３００、１０，４００、１０，５００、１０，６００、１０，７００、１０，８００、１０，９００、１１，０００、１１，１００、１１，２００、１１，３００、１１，４００、１１，５００、１１，６００、１１，７００、１１，８００、１１，９００、１２，０００、１２，１００、１２，２００、１２，３００、１２，４００、１２，５００、１２，６００、１２，７００、１２，８００、１２，９００、１３，０００、１３，１００、１３，２００、１３，３００、１３，４００、１３，５００、１３，６００、１３，７００、１３，８００、１３，９００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、３１，０００、３２，０００、３３，０００、３４，０００または３５，０００個のコスミド（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）を含む。一部の実施形態では、結果として生じる配列決定サイロのそれぞれは、６，０００～１０，０００個の間のコスミドを含む。一部の実施形態では、サイロプールは、配列決定被覆度に伴い変動する。一部の実施形態では、サイロプールのサイズは、図２１Ａ～Ｃにおいて定義される曲線に従って定義される。

一部の実施形態では、各配列決定サイロは、総計１億５００万～１４億塩基（Ｍｂ）の間の長さに及ぶＤＮＡを含む。一部の実施形態では、各配列決定サイロは、総計１００Ｍｂ、１０１Ｍｂ、１０２Ｍｂ、１０３Ｍｂ、１０４Ｍｂ、１０５Ｍｂ、１０６Ｍｂ、１０７Ｍｂ、１０８Ｍｂ、１０９Ｍｂ、１１０Ｍｂ、１１１Ｍｂ、１１２Ｍｂ、１１３Ｍｂ、１１４Ｍｂ、１１５Ｍｂ、１１６Ｍｂ、１１７Ｍｂ、１１８Ｍｂ、１１９Ｍｂ、１２０Ｍｂ、１２１Ｍｂ、１２２Ｍｂ、１２３Ｍｂ、１２４Ｍｂ、１２５Ｍｂ、１２６Ｍｂ、１２７Ｍｂ、１２８Ｍｂ、１２９Ｍｂ、１３０Ｍｂ、１３１Ｍｂ、１３２Ｍｂ、１３３Ｍｂ、１３４Ｍｂ、１３５Ｍｂ、１３６Ｍｂ、１３７Ｍｂ、１３８Ｍｂ、１３９Ｍｂ、１４０Ｍｂ、１４１Ｍｂ、１４２Ｍｂ、１４３Ｍｂ、１４４Ｍｂ、１４５Ｍｂ、１４６Ｍｂ、１４７Ｍｂ、１４８Ｍｂ、１４９Ｍｂ、１５０Ｍｂ、１５１Ｍｂ、１５２Ｍｂ、１５３Ｍｂ、１５４Ｍｂ、１５５Ｍｂ、１５６Ｍｂ、１５７Ｍｂ、１５８Ｍｂ、１５９Ｍｂ、１６０Ｍｂ、１６１Ｍｂ、１６２Ｍｂ、１６３Ｍｂ、１６４Ｍｂ、１６５Ｍｂ、１６６Ｍｂ、１６７Ｍｂ、１６８Ｍｂ、１６９Ｍｂ、１７０Ｍｂ、１７１Ｍｂ、１７２Ｍｂ、１７３Ｍｂ、１７４Ｍｂ、１７５Ｍｂ、１７６Ｍｂ、１７７Ｍｂ、１７８Ｍｂ、１７９Ｍｂ、１８０Ｍｂ、１８１Ｍｂ、１８２Ｍｂ、１８３Ｍｂ、１８４Ｍｂ、１８５Ｍｂ、１８６Ｍｂ、１８７Ｍｂ、１８８Ｍｂ、１８９Ｍｂ、１９０Ｍｂ、１９１Ｍｂ、１９２Ｍｂ、１９３Ｍｂ、１９４Ｍｂ、１９５Ｍｂ、１９６Ｍｂ、１９７Ｍｂ、１９８Ｍｂ、１９９Ｍｂ、２００Ｍｂ、２０１Ｍｂ、２０２Ｍｂ、２０３Ｍｂ、２０４Ｍｂ、２０５Ｍｂ、２０６Ｍｂ、２０７Ｍｂ、２０８Ｍｂ、２０９Ｍｂ、２１０Ｍｂ、２１１Ｍｂ、２１２Ｍｂ、２１３Ｍｂ、２１４Ｍｂ、２１５Ｍｂ、２１６Ｍｂ、２１７Ｍｂ、２１８Ｍｂ、２１９Ｍｂ、２２０Ｍｂ、２２１Ｍｂ、２２２Ｍｂ、２２３Ｍｂ、２２４Ｍｂ、２２５Ｍｂ、２２６Ｍｂ、２２７Ｍｂ、２２８Ｍｂ、２２９Ｍｂ、２３０Ｍｂ、２３１Ｍｂ、２３２Ｍｂ、２３３Ｍｂ、２３４Ｍｂ、２３５Ｍｂ、２３６Ｍｂ、２３７Ｍｂ、２３８Ｍｂ、２３９Ｍｂ、２４０Ｍｂ、２４１Ｍｂ、２４２Ｍｂ、２４３Ｍｂ、２４４Ｍｂ、２４５Ｍｂ、２４６Ｍｂ、２４７Ｍｂ、２４８Ｍｂ、２４９Ｍｂ、２５０Ｍｂ、２５１Ｍｂ、２５２Ｍｂ、２５３Ｍｂ、２５４Ｍｂ、２５５Ｍｂ、２５６Ｍｂ、２５７Ｍｂ、２５８Ｍｂ、２５９Ｍｂ、２６０Ｍｂ、２６１Ｍｂ、２６２Ｍｂ、２６３Ｍｂ、２６４Ｍｂ、２６５Ｍｂ、２６６Ｍｂ、２６７Ｍｂ、２６８Ｍｂ、２６９Ｍｂ、２７０Ｍｂ、２７１Ｍｂ、２７２Ｍｂ、２７３Ｍｂ、２７４Ｍｂ、２７５Ｍｂ、２７６Ｍｂ、２７７Ｍｂ、２７８Ｍｂ、２７９Ｍｂ、２８０Ｍｂ、２８１Ｍｂ、２８２Ｍｂ、２８３Ｍｂ、２８４Ｍｂ、２８５Ｍｂ、２８６Ｍｂ、２８７Ｍｂ、２８８Ｍｂ、２８９Ｍｂ、２９０Ｍｂ、２９１Ｍｂ、２９２Ｍｂ、２９３Ｍｂ、２９４Ｍｂ、２９５Ｍｂ、２９６Ｍｂ、２９７Ｍｂ、２９８Ｍｂ、２９９Ｍｂ、３００Ｍｂ、３０１Ｍｂ、３０２Ｍｂ、３０３Ｍｂ、３０４Ｍｂ、３０５Ｍｂ、３０６Ｍｂ、３０７Ｍｂ、３０８Ｍｂ、３０９Ｍｂ、３１０Ｍｂ、３１１Ｍｂ、３１２Ｍｂ、３１３Ｍｂ、３１４Ｍｂ、３１５Ｍｂ、３１６Ｍｂ、３１７Ｍｂ、３１８Ｍｂ、３１９Ｍｂ、３２０Ｍｂ、３２１Ｍｂ、３２２Ｍｂ、３２３Ｍｂ、３２４Ｍｂ、３２５Ｍｂ、３２６Ｍｂ、３２７Ｍｂ、３２８Ｍｂ、３２９Ｍｂ、３３０Ｍｂ、３３１Ｍｂ、３３２Ｍｂ、３３３Ｍｂ、３３４Ｍｂ、３３５Ｍｂ、３３６Ｍｂ、３３７Ｍｂ、３３８Ｍｂ、３３９Ｍｂ、３４０Ｍｂ、３４１Ｍｂ、３４２Ｍｂ、３４３Ｍｂ、３４４Ｍｂ、３４５Ｍｂ、３４６Ｍｂ、３４７Ｍｂ、３４８Ｍｂ、３４９Ｍｂ、３５０Ｍｂ、３５１Ｍｂ、３５２Ｍｂ、３５３Ｍｂ、３５４Ｍｂ、３５５Ｍｂ、３５６Ｍｂ、３５７Ｍｂ、３５８Ｍｂ、３５９Ｍｂ、３６０Ｍｂ、３６１Ｍｂ、３６２Ｍｂ、３６３Ｍｂ、３６４Ｍｂ、３６５Ｍｂ、３６６Ｍｂ、３６７Ｍｂ、３６８Ｍｂ、３６９Ｍｂ、３７０Ｍｂ、３７１Ｍｂ、３７２Ｍｂ、３７３Ｍｂ、３７４Ｍｂ、３７５Ｍｂ、３７６Ｍｂ、３７７Ｍｂ、３７８Ｍｂ、３７９Ｍｂ、３８０Ｍｂ、３８１Ｍｂ、３８２Ｍｂ、３８３Ｍｂ、３８４Ｍｂ、３８５Ｍｂ、３８６Ｍｂ、３８７Ｍｂ、３８８Ｍｂ、３８９Ｍｂ、３９０Ｍｂ、３９１Ｍｂ、３９２Ｍｂ、３９３Ｍｂ、３９４Ｍｂ、３９５Ｍｂ、３９６Ｍｂ、３９７Ｍｂ、３９８Ｍｂ、３９９Ｍｂ、４００Ｍｂ、４０１Ｍｂ、４０２Ｍｂ、４０３Ｍｂ、４０４Ｍｂ、４０５Ｍｂ、４０６Ｍｂ、４０７Ｍｂ、４０８Ｍｂ、４０９Ｍｂ、４１０Ｍｂ、４１１Ｍｂ、４１２Ｍｂ、４１３Ｍｂ、４１４Ｍｂ、４１５Ｍｂ、４１６Ｍｂ、４１７Ｍｂ、４１８Ｍｂ、４１９Ｍｂ、４２０Ｍｂ、４２１Ｍｂ、４２２Ｍｂ、４２３Ｍｂ、４２４Ｍｂ、４２５Ｍｂ、４２６Ｍｂ、４２７Ｍｂ、４２８Ｍｂ、４２９Ｍｂ、４３０Ｍｂ、４３１Ｍｂ、４３２Ｍｂ、４３３Ｍｂ、４３４Ｍｂ、４３５Ｍｂ、４３６Ｍｂ、４３７Ｍｂ、４３８Ｍｂ、４３９Ｍｂ、４４０Ｍｂ、４４１Ｍｂ、４４２Ｍｂ、４４３Ｍｂ、４４４Ｍｂ、４４５Ｍｂ、４４６Ｍｂ、４４７Ｍｂ、４４８Ｍｂ、４４９Ｍｂ、４５０Ｍｂ、４５１Ｍｂ、４５２Ｍｂ、４５３Ｍｂ、４５４Ｍｂ、４５５Ｍｂ、４５６Ｍｂ、４５７Ｍｂ、４５８Ｍｂ、４５９Ｍｂ、４６０Ｍｂ、４６１Ｍｂ、４６２Ｍｂ、４６３Ｍｂ、４６４Ｍｂ、４６５Ｍｂ、４６６Ｍｂ、４６７Ｍｂ、４６８Ｍｂ、４６９Ｍｂ、４７０Ｍｂ、４７１Ｍｂ、４７２Ｍｂ、４７３Ｍｂ、４７４Ｍｂ、４７５Ｍｂ、４７６Ｍｂ、４７７Ｍｂ、４７８Ｍｂ、４７９Ｍｂ、４８０Ｍｂ、４８１Ｍｂ、４８２Ｍｂ、４８３Ｍｂ、４８４Ｍｂ、４８５Ｍｂ、４８６Ｍｂ、４８７Ｍｂ、４８８Ｍｂ、４８９Ｍｂ、４９０Ｍｂ、４９１Ｍｂ、４９２Ｍｂ、４９３Ｍｂ、４９４Ｍｂ、４９５Ｍｂ、４９６Ｍｂ、４９７Ｍｂ、４９８Ｍｂ、４９９Ｍｂ、５００Ｍｂ、５０５Ｍｂ、５１０Ｍｂ、５１５Ｍｂ、５２０Ｍｂ、５２５Ｍｂ、５３０Ｍｂ、５３５Ｍｂ、５４０Ｍｂ、５４５Ｍｂ、５５０Ｍｂ、５５５Ｍｂ、５６０Ｍｂ、５６５Ｍｂ、５７０Ｍｂ、５７５Ｍｂ、５８０Ｍｂ、５８５Ｍｂ、５９０Ｍｂ、５９５Ｍｂ、６００Ｍｂ、６０５Ｍｂ、６１０Ｍｂ、６１５Ｍｂ、６２０Ｍｂ、６２５Ｍｂ、６３０Ｍｂ、６３５Ｍｂ、６４０Ｍｂ、６４５Ｍｂ、６５０Ｍｂ、６５５Ｍｂ、６６０Ｍｂ、６６５Ｍｂ、６７０Ｍｂ、６７５Ｍｂ、６８０Ｍｂ、６８５Ｍｂ、６９０Ｍｂ、６９５Ｍｂ、７００Ｍｂ、７０５Ｍｂ、７１０Ｍｂ、７１５Ｍｂ、７２０Ｍｂ、７２５Ｍｂ、７３０Ｍｂ、７３５Ｍｂ、７４０Ｍｂ、７４５Ｍｂ、７５０Ｍｂ、７５５Ｍｂ、７６０Ｍｂ、７６５Ｍｂ、７７０Ｍｂ、７７５Ｍｂ、７８０Ｍｂ、７８５Ｍｂ、７９０Ｍｂ、７９５Ｍｂ、８００Ｍｂ、８０５Ｍｂ、８１０Ｍｂ、８１５Ｍｂ、８２０Ｍｂ、８２５Ｍｂ、８３０Ｍｂ、８３５Ｍｂ、８４０Ｍｂ、８４５Ｍｂ、８５０Ｍｂ、８５５Ｍｂ、８６０Ｍｂ、８６５Ｍｂ、８７０Ｍｂ、８７５Ｍｂ、８８０Ｍｂ、８８５Ｍｂ、８９０Ｍｂ、８９５Ｍｂ、９００Ｍｂ、９０５Ｍｂ、９１０Ｍｂ、９１５Ｍｂ、９２０Ｍｂ、９２５Ｍｂ、９３０Ｍｂ、９３５Ｍｂ、９４０Ｍｂ、９４５Ｍｂ、９５０Ｍｂ、９５５Ｍｂ、９６０Ｍｂ、９６５Ｍｂ、９７０Ｍｂ、９７５Ｍｂ、９８０Ｍｂ、９８５Ｍｂ、９９０Ｍｂ、９９５Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１００５Ｍｂ、１０１０Ｍｂ、１０１５Ｍｂ、１０２０Ｍｂ、１０２５Ｍｂ、１０３０Ｍｂ、１０３５Ｍｂ、１０４０Ｍｂ、１０４５Ｍｂ、１０５０Ｍｂ、１０５５Ｍｂ、１０６０Ｍｂ、１０６５Ｍｂ、１０７０Ｍｂ、１０７５Ｍｂ、１０８０Ｍｂ、１０８５Ｍｂ、１０９０Ｍｂ、１０９５Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１１０５Ｍｂ、１１１０Ｍｂ、１１１５Ｍｂ、１１２０Ｍｂ、１１２５Ｍｂ、１１３０Ｍｂ、１１３５Ｍｂ、１１４０Ｍｂ、１１４５Ｍｂ、１１５０Ｍｂ、１１５５Ｍｂ、１１６０Ｍｂ、１１６５Ｍｂ、１１７０Ｍｂ、１１７５Ｍｂ、１１８０Ｍｂ、１１８５Ｍｂ、１１９０Ｍｂ、１１９５Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１２０５Ｍｂ、１２１０Ｍｂ、１２１５Ｍｂ、１２２０Ｍｂ、１２２５Ｍｂ、１２３０Ｍｂ、１２３５Ｍｂ、１２４０Ｍｂ、１２４５Ｍｂ、１２５０Ｍｂ、１２５５Ｍｂ、１２６０Ｍｂ、１２６５Ｍｂ、１２７０Ｍｂ、１２７５Ｍｂ、１２８０Ｍｂ、１２８５Ｍｂ、１２９０Ｍｂ、１２９５Ｍｂ、１３００Ｍｂ、１３０５Ｍｂ、１３１０Ｍｂ、１３１５Ｍｂ、１３２０Ｍｂ、１３２５Ｍｂ、１３３０Ｍｂ、１３３５Ｍｂ、１３４０Ｍｂ、１３４５Ｍｂ、１３５０Ｍｂ、１３５５Ｍｂ、１３６０Ｍｂ、１３６５Ｍｂ、１３７０Ｍｂ、１３７５Ｍｂ、１３８０Ｍｂ、１３８５Ｍｂ、１３９０Ｍｂ、１３９５Ｍｂまたは１４００Ｍｂの長さに及ぶＤＮＡ（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）を含む。
メタゲノムライブラリー創出－バーコード化によるサイロプーリング

当業者であれば、上に記載されている物理的サイロプーリングを、バーコード化技術の使用により、様々な程度で再現、補充および／または拡張することができることを認識するであろう。一般的に、タグ、インデックス化配列または識別子コードとも称されるＤＮＡバーコードは、同定目的で核酸分子に取り込まれる特異的配列を含む。バーコードを使用して、個々の核酸分子または核酸分子の群を同定することができる。

一部の実施形態では、本開示は、メタゲノムライブラリー由来のＤＮＡをサイロプールするためにバーコードを使用することを教示する。例えば、本開示は、配列決定に先立ち、個々でのまたは群でのＥ．ｃｏｌｉコロニー由来のコスミドのバーコード化を企図する。よって、一部の実施形態では、本開示の方法は、ＮＧＳのために個々のコスミドを加工およびバーコード化するステップを含む。

一部の実施形態では、本開示は、現存する配列決定サイロの複雑性をさらに低下させるためのバーコードの伝統的な使用を教示する。よって、一部の実施形態では、本開示は、個々のコスミドのバーコード化を教示する。

バーコードが、全コスミドに適用されないが、その代わりに、配列決定サイロ（上に記載されている通り）における加工された配列に、またはミニサイロプールにおける加工された配列に付加され、次いでこれを配列決定サイロへとさらにプールすることができるという点において、本開示のある特定のバーコード化実施形態は、伝統的なバーコード使用とは異なる。

一部の実施形態では、本開示は、ＮＧＳのために複数のコスミドがプールおよび加工された、ミニサイロプールを創出することを教示する。一部の実施形態では、各ミニサイロは、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２０，５００、２１，０００、２１，５００、２２，０００、２２，５００、２３，０００、２３，５００、２４，０００、２４，５００、２５，０００、２５，５００、２６，０００、２６，５００、２７，０００、２７，５００、２８，０００、２８，５００、２９，０００、２９，５００、３０，０００、３０，５００、３１，０００、３１，５００、３２，０００、３２，５００、３３，０００、３３，５００、３４，０００、３４，５００、３５，０００個のコスミド（それらの間の任意の範囲および部分的範囲を含む）を含む。

一部の実施形態では、プーリングが起こった後に、かつ、各サイロ内の配列が次世代配列決定のために断片サイズへと断片化された後に、バーコードは、ミニサイロプールに付加される。次いで、バーコード化されたミニサイロプールは、シーケンサーにかける前に、より広範な配列決定プールへとさらに組み合わせることができる。

一部の実施形態では、個々にバーコード化された配列は、他のバーコード化された試料と一緒に配列決定される。次いで、バーコード化されたリードは、公知の技法により選別（例えば、逆多重化）し、その対応する群に割り当てることができる（例えば、図４を参照）。

バーコードは、特定の核酸配列を選択することに基づき生成することができる。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）配列決定は、４８種の異なるバーコードを有効に生成するために６塩基を利用することができる。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンサー（例えば、Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シーケンサーまたはＩｏｎ ＰＧＭ（商標）シーケンサー）は、１６種のバーコードを生成するために６塩基を利用することができる。一部の実施形態では、配列決定の際に２個のエラーが発生したとしても別々のバーコードが正確に同定されることを可能にする、バーコードの生成に法則を適用することができる。バーコード化は、例えば、米国特許第７，９０２，１２２号および米国特許出願公開第２００９／００９８５５５号に記載されている。例えばＰＣＲによる、プライマー伸長によるバーコード取込みは、米国特許第５，９３５，７９３号またはＵＳ２０１０／０２２７３２９に記載されている方法を使用して行うことができる。一部の実施形態では、バーコードは、続いて増幅を行うことができるライゲーションを使用することにより、核酸に取り込むことができる；例えば、米国特許第５，８５８，６５６号、同第６，２６１，７８２号、米国特許出願公開第２０１１／０３１９２９０号または米国特許出願公開第２０１２／００２８８１４号に記載されている方法は、本発明と共に使用することができる。一部の実施形態では、例えば、米国特許出願公開第２００７／００２０６４０号、米国特許出願公開第２００９／００６８６４５号、米国特許出願公開第２０１０／０２７３２１９号、米国特許出願公開第２０１１／００１５０９６号または米国特許出願公開第２０１１／０２５７０３１号に記載されている通り、１種または複数のバーコードを使用することができる。

当業者であれば、上に記載されている通り、サイロプールの核酸配列決定を、合成長リード技術の使用により再現および／または潜在的に改善することができることを認識するであろう。一部の実施形態では、本開示の方法は、あらゆる目的のためにこれにより参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１８／０１１９２０３、ＵＳ２０１９／０２４１９３３、ＵＳ９，７１５，５７３、ＵＳ１０，４５７，９３４およびＵＳ１０，５２６，６４１に開示される技術等の「クロマチン捕捉」技術と組み合わせることができる。一部の実施形態では、試料のバーコード化および／またはクロマチン（ｃｈｒｏｍａｔｉｃ）捕捉は、当業者にとって公知の商業的に利用できるロボット工学（例えば、Ｔｅｃａｎ等の液体ハンドラー）により、または本文書に記載されている他の仕方で自動化することができる。

バーコードの正確なインプリメンテーションにもかかわらず、結果として生じるデジタルアセンブルされたライブラリーは、依然として、上に記述されているデジタルライブラリーの限界を満たすべきである。一部の実施形態では、バーコードにより創出されたデジタル環境またはメタゲノムライブラリーは、少なくとも１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂまたは１５ｋｂのＮ５０を示すべきである。
メタゲノムライブラリー創出－ライブラリーの配置

一部の実施形態では、本開示は、多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーの物理的（ＤＮＡストック）コピーを創出する方法を教示する。一部の実施形態では、物理的ライブラリーコピーは、デジタル処理で記憶されたアセンブルされた配列の生物学的バックアップコピーを提供する。一部の実施形態では、物理的ライブラリーを使用して、１個または複数のサイロプールまたはバーコード群のさらなる配列決定を遂行して、配列決定されたライブラリーを増強することができる（例えば、データベースの１個または複数の部分のための配列被覆度を増加させることにより）。

一部の実施形態では、物理的ライブラリーは、本開示のシステムおよび方法により同定されたＭＧＣをクローニングおよび研究するための機構を提供する。すなわち、一部の実施形態では、多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリー内の各配列は、関連しているＤＮＡにアクセスすることができる、物理的ライブラリー内の位置に関連する。

よって、一部の実施形態では、上述の方法によって生成されたコスミドサイロプールは、コスミドを含むＥ．ｃｏｌｉのグリセロールストックにおいて貯蔵される。一部の実施形態では、上述の方法によって生成されたコスミドサイロプールは、単離されたＤＮＡストックとして貯蔵される。一部の実施形態では、上述の方法によって生成されたコスミドサイロプールは、プールされたコスミドを含む微小生物のグリセロールストックとして貯蔵される。一部の実施形態では、物理的ライブラリーは、より容易な貯蔵およびアクセスのために９６ウェルフォーマットにおいて貯蔵される（図２のステップ１および図１６を参照）。これらの物理的ライブラリーは、その配列の供給源に応じて、「メタゲノム物理的ライブラリー」または「環境物理的ライブラリー」と本明細書において称される。
デジタルメタゲノミクスライブラリーを産生する方法－ライブラリープレップおよび配列決定

一部の実施形態では、上で生成された結果として生じるサイロプール（またはコスミドまたはミニサイロプール）は、配列決定のために個々に調製される。ＤＮＡから配列決定ライブラリーを作製するための多数のキットが、種々のベンダーから市販されている。キットは、マイクログラムからピコグラムに至る分量の出発材料からライブラリーを作製するために利用できる。しかし、より多い分量の出発材料は、より少ない増幅を要求し、よって、ライブラリー複雑性をより良くすることができる。

ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａプレップを除いて、ライブラリー調製は一般に、（ｉ）断片化、（ｉｉ）末端修復、（ｉｉｉ）５’プライム末端のリン酸化、（ｉｖ）配列決定アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）へのライゲーションを容易にするするための３’末端のＡテイル付加（ｔａｉｌｉｎｇ）、（ｖ）アダプターのライゲーション、および（ｖｉ）必要に応じて、両末端にライゲーションされたアダプターを有する産物を富化するための数回のＰＣＲサイクルを必要とする。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔワークフローにおける主要な差は、異なるアダプター配列への平滑断端ライゲーションの使用である。

マルチプレックス化を容易にするために、各試料により異なるバーコード化されたアダプターを使用することができる。あるいは、異なるバーコード化されたＰＣＲプライマーを使用することにより、ＰＣＲ増幅ステップにおいてバーコードを導入して、異なる試料を増幅することができる。バーコード化されたアダプターおよびＰＣＲプライマーを有する高品質試薬は、多くのベンダーからのキットにおいて容易に利用できる。しかし、ＤＮＡライブラリー構築の構成成分の全ては現在、アダプターから酵素まで、十分に考証されており、「自家製」ライブラリー調製キットへと容易にアセンブルすることができる。

代替方法は、トランスポザーゼ酵素を使用して、「タグメンテーション」と命名とされる単一管内での反応においてＤＮＡを同時に断片化およびタグ付けすることによりゲノムＤＮＡライブラリーを調製する、Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ試料プレップキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）である。操作された酵素は、デュアル活性を有する；酵素は、ＤＮＡを断片化し、同時に、断片の両末端に特異的アダプターを付加する。これらのアダプター配列は、ＰＣＲにより挿入物ＤＮＡを増幅するために使用される。ＰＣＲ反応は、インデックス（バーコード）配列も付加する。調製手順は、単一のステップへとＤＮＡ断片化、末端修復およびアダプター（ａｄａｐｔｏｒ）ライゲーションを組み合わせることにより、伝統的なプロトコールを改善する。このプロトコールは、機械的断片化方法と比較して、ＤＮＡ入力の量に対して非常に高感度である。適切な距離によって分離された転位事象を得るために、トランスポザーゼ複合体の試料ＤＮＡに対する比が重要となり得る。断片サイズもまた、反応効率に依存するため、温度および反応時間等の全ての反応パラメーターが、最適な結果のために厳密に制御されるべきである。

蛍光に基づく配列決定方法論を含む、いくつかのＤＮＡ配列決定技法が当技術分野で公知である（例えば、Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ， １， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． を参照）。一部の実施形態では、当技術分野で理解される自動配列決定技法が利用される。一部の実施形態では、区分化されたアンプリコンの並列配列決定を利用することができる（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６０８４１３２）。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列決定は、並列オリゴヌクレオチド伸長によって達成される（例えば、米国特許第５，７５０，３４１号；同第６，３０６，５９７号を参照）。配列決定技法の追加的な例は、チャーチポロニー（Ｃｈｕｒｃｈ ｐｏｌｏｎｙ）技術（Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２０， ５５－６５；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９， １７２８－１７３２；米国特許第６，４３２，３６０号、同第６，４８５，９４４号、同第６，５１１，８０３号）、４５４ピコタイター（ｐｉｃｏｔｉｔｅｒ）パイロシークエンシング技術（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｎａｔｕｒｅ ４３７， ３７６－３８０；ＵＳ２００５０１３０１７３）、Ｓｏｌｅｘａ単一塩基付加技術（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ， ６， ３７３－３８２；米国特許第６，７８７，３０８号；同第６，８３３，２４６号）、Ｌｙｎｘ超並列シグネチャー配列決定技術（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８：６３０－６３４；米国特許第５，６９５，９３４号；同第５，７１４，３３０号）およびＡｄｅｓｓｉ ＰＣＲコロニー技術（Ａｄｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２８， Ｅ８７；ＷＯ０００１８９５７）を含む。

次世代配列決定（ＮＧＳ）方法は、旧式の配列決定方法と比較してより低いコストの目標により、超並列ハイスループット戦略の一般的な特色を共有する（例えば、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．， ５５： ６４１－６５８， ２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ７－２８７－２９６を参照；これらの全体が、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。ＮＧＳ方法は、鋳型増幅を典型的に使用する方法と、そうでない方法へと広範に分けることができる。増幅を要求する方法は、Ｒｏｃｈｅによって４５４技術プラットフォームとして商業化されたパイロシークエンシング（例えば、ＧＳ ２０およびＧＳ ＦＬＸ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって商業化されたＳｏｌｅｘａプラットフォーム、ならびにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって商業化された支援されたオリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出（Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（ＳＯＬｉＤ）プラットフォームを含む。単一分子配列決定としても公知の非増幅アプローチは、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって商業化されたＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットフォーム、ならびにそれぞれＶｉｓｉＧｅｎ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ ＴｏｒｒｅｎｔおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって商業化された新興プラットフォームによって例証される。

パイロシークエンシング（米国特許第６，２１０，８９１号；同第６，２５８，５６８号）において、鋳型ＤＮＡは、断片化され、末端修復され、アダプターにライゲーションされ、アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを有するビーズにより単一の鋳型分子を捕捉することにより、ｉｎ－ｓｉｔｕでクローン的に増幅される。単一の鋳型の型を有する各ビーズは、油中水型マイクロベシクルへと区分けされ、鋳型は、エマルションＰＣＲと称される技法を使用してクローン的に増幅される。エマルションは、増幅後に破壊され、ビーズは、配列決定反応中にフローセルとして機能するピコタイタープレートの個々のウェル内に沈着される。４種のｄＮＴＰ試薬のそれぞれの順序付けされた反復導入は、配列決定酵素、およびルシフェラーゼ等のルミネセントレポーターの存在下でフローセルにおいて発生する。適切なｄＮＴＰが、配列決定プライマーの３’末端に付加される場合、結果として生じるＡＴＰ産生は、ウェル内でルミネセンスのバーストを引き起こし、バーストは、ＣＣＤカメラを使用して記録される。４００塩基を超えるまたはそれに等しいリードの長さを達成することが可能であり、１０６個の配列リードを達成することができ、最大５億塩基対（Ｍｂ）の配列をもたらす。

Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．， ５５－６４１－６５８， ２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ７・’ ２８７－２９６；米国特許第６，８３３，２４６号；同第７，１１５，４００号；同第６，９６９，４８８号）において、配列決定データは、より短い長さのリードの形態で産生される。この方法において、一本鎖の断片化されたＤＮＡが末端修復されて、５’リン酸化平滑断端を生成し、続いて、断片の３’末端への単一のＡ塩基のクレノウ媒介性付加を行う。Ａ付加は、Ｔオーバーハングアダプターオリゴヌクレオチドの付加を容易にし、これはその後、オリゴヌクレオチドアンカーを付けたフローセルの表面における鋳型－アダプター分子を捕捉するために使用される。アンカーは、ＰＣＲプライマーとして使用されるが、鋳型の長さ、および他の近くのアンカーオリゴヌクレオチドに対するその近接が原因で、ＰＣＲによる伸長は、分子の「アーチ形成（ａｒｃｈｉｎｇ ｏｖｅｒ）」をもたらして、隣接アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、フローセルの表面にブリッジ構造を形成する。これらのＤＮＡループは、変性および切断される。次いで、可逆的ダイターミネーターによりフォワード鎖を配列決定する。取り込まれたヌクレオチドの配列は、取込み後の蛍光の検出によって決定され、各フルオロフォアおよびブロックは、ｄＮＴＰ付加の次のサイクルに先立ち除去される。配列リードの長さは、３６ヌクレオチド～５０ヌクレオチド超に及び、全体的な出力は、分析的ラン当たり十億ヌクレオチド対を超える。

ＳＯＬｉＤ技術（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．， ５５－６４１－６５８， ２００９；米国特許第５，９１２，１４８号；同第６，１３０，０７３号）を使用した核酸分子の配列決定もまた、鋳型の断片化、オリゴヌクレオチドアダプターへのライゲーション、ビーズへの付着、およびエマルションＰＣＲによるクローナル増幅を伴う。これに続いて、鋳型を有するビーズが、ガラスフローセルの誘導体化表面に固定化され、アダプターオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーがアニールされる。しかし、このプライマーを３’伸長のために利用するのではなく、その代わりに、これは、２個のプローブ特異的塩基とそれに続く６個の縮重塩基および４種の蛍光標識のうち１種を含有する照合プローブへのライゲーションのための５’リン酸基を提供するために使用される。ＳＯＬｉＤシステムにおいて、照合プローブは、各プローブの３’末端における２個の塩基の１６通りの可能な組合せ、および５’末端における４種の蛍光のうち１種を有する。蛍光の色、よって、各プローブの同一性は、指定された色－空間コーディングスキームに対応する。複数ラウンド（通常７回）のプローブアニーリング、ライゲーションおよび蛍光検出に続いて、変性、次いで、初期プライマーに対して１塩基によって相殺されるプライマーを使用した第２のラウンドの配列決定が行われる。この様式で、鋳型配列をコンピューターにより再構築することができ、鋳型塩基は、２回照合され、精度増加をもたらす。配列リードの長さは、平均３５ヌクレオチドであり、全体的な出力は、配列決定ラン当たり４０億塩基を超える。

ある特定の実施形態では、ナノポア配列決定が用いられる（例えば、Ａｓｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００６ Ｆｅｂ． ８； １２８（５）：１７０５－１０を参照）。ナノポア配列決定の背後にある理論は、ナノポアが導電性流体に浸漬され、それを越えて電位（電圧）が印加されたときに発生するものに関係している。これらの条件下で、ナノポアを通したイオンの伝導による僅かな電流を観察することができ、電流の量は、ナノポアのサイズに対して極めて高感度である。核酸の各塩基が、ナノポアを通過する際に、これは、４種の塩基のそれぞれで明確に異なる、ナノポアを通る電流の振幅の変化を生じ、これにより、ＤＮＡ分子の配列が決定されることを可能にする。

Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術は、ＤＮＡの重合の際に放出された水素イオンの検出に基づくＤＮＡ配列決定の方法である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７（５９７０）： １１９０ （２０１０）；米国特許出願公開第２００９００２６０８２号、同第２００９０１２７５８９号、同第２０１００３０１３９８号、同第２０１００１９７５０７号、同第２０１００１８８０７３号および同第２０１００１３７１４３号を参照）。マイクロウェルは、配列決定されるべき鋳型ＤＮＡ鎖を含有する。マイクロウェルの層の下には、超高感度ＩＳＦＥＴイオンセンサーがある。全ての層が、エレクトロニクス産業において使用されるものと同様の、ＣＭＯＳ半導体チップ内に含有される。伸びつつある相補鎖にｄＮＴＰが取り込まれると、水素イオンが放出され、これが、超高感度イオンセンサーを誘発する。鋳型配列にホモポリマー反復が存在する場合、複数のｄＮＴＰ分子が、単一のサイクルにおいて取り込まれるであろう。これは、対応する数の放出水素および比例してより高い電子シグナルをもたらす。この技術は、改変ヌクレオチドも光学も使用されないという点において、他の配列決定技術とは異なる。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンサーの塩基当たりの精度は、５０塩基のリードについてほぼ９９．６％であり、１ラン当たりほぼ１００Ｍｂが生成される。リードの長さは、１００塩基対である。５回反復の長さのホモポリマー反復の精度は、ほぼ９８％である。イオン半導体配列決定の利益は、速い配列決定スピードならびに低い先行投資および運営費である。

一部の実施形態では、本開示は、長いアセンブリー配列決定技術の使用を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ＰａｃＢｉｏ配列決定および／またはナノポア配列決定を教示する。

ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ技術は、透明底を備える個々のピコリットルサイズのウェルを有する特殊フローセルに基づく。ゼロモード導波路（ＺＭＷ）と称されるウェルのそれぞれは、底に単一の固定されたポリメラーゼを含有する（Ａｒｄｕｉ， Ｓ．， Ｒａｃｅ， Ｖ．， ｄｅ Ｒａｖｅｌ， Ｔ．， Ｖａｎ Ｅｓｃｈ， Ｈ．， Ｄｅｖｒｉｅｎｄｔ， Ｋ．， Ｍａｔｔｈｉｊｓ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８ｂ）． Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＡＧＧ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｅｍａｌｅｓ ｗｉｔｈ ａ ＦＭＲ１ ｐｒｅｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｎｇ－ｒｅａｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： ａ １ ｙｅａｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ． Ｆｒｏｎｔ． Ｇｅｎｅｔ． ９：１５０）。これは、ポリメラーゼが、鋳型ＤＮＡに標識された塩基を取り込む際に、ライブラリー調製において環状化された単一のＤＮＡ分子（すなわち、ＳＭＲＴｂｅｌｌ）が、ウェル中を進行することを可能にする。塩基の取込みは、ＺＭＷの透明底を通してリアルタイムで記録され得る蛍光を誘導する（Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｍ． Ｏ．， Ｇｕｒｄａｓａｎｉ， Ｄ．， Ｍｅｎｔｚｅｒ， Ａ． Ｊ．， Ｐｏｒｔｅｒ， Ｔ．， ａｎｄ Ｓａｎｄｈｕ， Ｍ． Ｓ． （２０１８）． Ｌｏｎｇ ｒｅａｄｓ： ｔｈｅｉｒ ｐｕｒｐｏｓｅ ａｎｄ ｐｌａｃｅ． Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ２７， Ｒ２３４－Ｒ２４１。ＳＭＲＴの平均リード長さは、初期に、ほぼ１．５Ｋｂしかなく、偽挿入によって特徴付けされるほぼ１３％の高い誤り率が報告された（ａｒｎｅｉｒｏ， Ｍ． Ｏ．， Ｒｕｓｓ， Ｃ．， Ｒｏｓｓ， Ｍ． Ｇ．， Ｇａｂｒｉｅｌ， Ｓ． Ｂ．， Ｎｕｓｂａｕｍ， Ｃ．， ａｎｄ ＤｅＰｒｉｓｔｏ， Ｍ． Ａ． （２０１２）． Ｐａｃｉｆｉｃ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄａｔａ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：３７５．； Ｑｕａｉｌ， Ｍ． Ａ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｍ．， Ｃｏｕｐｌａｎｄ， Ｐ．， Ｏｔｔｏ， Ｔ． Ｄ．， Ｈａｒｒｉｓ， Ｓ． Ｒ．， Ｃｏｎｎｏｒ， Ｔ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （２０１２）． Ａ ｔａｌｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ， Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：３４１．）。その導入以降、ＳＭＲＴ技術のリード長さおよびスループットは、実質的に増加した。スループットは、Ｓｅｑｕｅｌ機械についてＳＭＲＴセル当たり＞１０Ｇｂに達し得るが、一方、ＲＳＩＩおよびＳｅｑｕｅｌの両方について平均リード長さは、＞１０ｋｂであり、一部のリードは、＞１００ｋｂに及ぶ（ｖａｎ Ｄｉｊｋ， Ｅ． Ｌ．， Ｊａｓｚｃｚｙｓｚｙｎ， Ｙ．， Ｎａｑｕｉｎ， Ｄ．， ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｅｓ， Ｃ． （２０１８）． Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ３４， ６６６－６８１．）。

ＯＮＴによるナノポア配列決定は、ポータブルＭｉｎＩＯＮシーケンサーにより２０１５年に導入され、この後に、よりハイスループットなデスクトップシーケンサーＧｒｉｄＩＯＮおよびＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮが続いた。ナノポア配列決定の基本原則は、ＤＮＡ分子の一本鎖を、バイオセンサーとして働く付着した酵素を有する、膜に挿入されたナノポアに通すことである（Ｄｅａｍｅｒ， Ｄ．， Ａｋｅｓｏｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｂｒａｎｔｏｎ， Ｄ． （２０１６）． Ｔｈｒｅｅ ｄｅｃａｄｅｓ ｏｆ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３４， ５１８－５２４）。ポアを通過する塩基をリアルタイムで決定するために、膜を越えた電気的シグナルの変化が測定および増幅される。ポリメラーゼまたはヘリカーゼのいずれかとなり得るナノポア連結された酵素は、ポアを通るその挙動を制御するポリヌクレオチドに密接に結合される（Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｍ． Ｏ．， Ｇｕｒｄａｓａｎｉ， Ｄ．， Ｍｅｎｔｚｅｒ， Ａ． Ｊ．， Ｐｏｒｔｅｒ， Ｔ．， ａｎｄ Ｓａｎｄｈｕ， Ｍ． Ｓ． （２０１８）． Ｌｏｎｇ ｒｅａｄｓ： ｔｈｅｉｒ ｐｕｒｐｏｓｅ ａｎｄ ｐｌａｃｅ． Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ２７， Ｒ２３４－Ｒ２４１）。ナノポア配列決定について、解析されるＤＮＡ断片のサイズを除いて、リードの長さに明快な限界は存在しない。平均して、ＯＮＴ単一分子リードは、＞１０ｋｂの長さであるが、ＳＭＲＴを上回る＞１Ｍｂの、一部の個々のリードの長さについて、非常に長い長さに達することがある（Ｊａｉｎ， Ｍ．， Ｋｏｒｅｎ， Ｓ．， Ｍｉｇａ， Ｋ． Ｈ．， Ｑｕｉｃｋ， Ｊ．， Ｒａｎｄ， Ａ． Ｃ．， Ｓａｓａｎｉ， Ｔ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａ－ｌｏｎｇ ｒｅａｄｓ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３６， ３３８－３４５）。また、ＯＮＴ ＧｒｉｄＩＯＮおよびＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮシーケンサーの１ラン当たりのスループットは、ＰａｃＢｉｏよりも高い（それぞれ１ラン当たり最大１００Ｇｂおよび６Ｔｂ）（ｖａｎ Ｄｉｊｋ， Ｅ． Ｌ．， Ｊａｓｚｃｚｙｓｚｙｎ， Ｙ．， Ｎａｑｕｉｎ， Ｄ．， ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｅｓ， Ｃ． （２０１８）． Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ３４， ６６６－６８１）。

本開示はまた、Ｈｉ－Ｃ、３Ｃ、４Ｃ、５Ｃ、ＴＬＡ、ＴＣＣおよびｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｉ－Ｃからなる群より選択される技法の使用を教示する。例えば、ＤＮＡ配列リードは、ＤＮＡを、固化剤と共に、ｉｎ ｓｉｔｕでゲノムＤＮＡが架橋されるような期間インキュベートして、これにより、架橋されたゲノムＤＮＡを形成し；架橋されたゲノムＤＮＡを断片化し；架橋され断片化されたゲノムＤＮＡをライゲーションして、近位にライゲーションされた複合体を形成し；近位にライゲーションされた複合体を剪断して、近位にライゲーションされたＤＮＡ断片を形成し；複数の近位にライゲーションされたＤＮＡ断片を得て、ライブラリーを形成し、これにより、複数のゲノムＤＮＡ断片を得ることである。合成長リードに関するさらなる情報については、Ａｍａｒａｓｉｎｇｈｅ， Ｓ．Ｌ．， Ｓｕ， Ｓ．， Ｄｏｎｇ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｌｏｎｇ－ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２１， ３０ （２０２０）を参照されたい。

一部の実施形態では、本開示は、メタゲノムライブラリーの配列決定へのハイブリッドアプローチを教示する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、２種またはそれよりも多い配列決定技術（例えば、１種は短リード、１種は長リード）による配列決定を教示する。一部の実施形態では、長リード配列決定へのアクセスは、他の仕方ではアセンブリーが短リードだけでは進まないＤＮＡ領域のための参照配列を提供することにより、ライブラリーのその後のアセンブリーを改善することができる。
デジタルメタゲノミクスライブラリーを産生する方法－配列決定後の加工および逐次的アセンブリー

一部の実施形態では、本開示は、長いアセンブリーの配列決定されたメタゲノムライブラリーを産生するための、逐次配列アセンブリー方法を教示する。配列アセンブリーは、配列決定機械から得られる様々な配列リードを、本来のＤＮＡ分子を表す、より長いリードへと一緒につなぎ合わせるプロセスを説明する。アセンブリーは、特に、配列が５０～５００塩基範囲内に及ぶ、短リードＮＧＳプラットフォームに関連している。

一部の実施形態では、配列決定ステップから得られる配列を直接的にアセンブルすることができる。一部の実施形態では、配列決定ステップ由来の配列は、配列決定製造業者の使用説明書に従って、または当技術分野で公知の方法に従って、いくつかの加工を経る。例えば、一部の実施形態では、プールされた試料由来のリードをトリミングして、任意のアダプター／バーコード配列を除去し、品質フィルタリングする。一部の実施形態では、一部のシーケンサー（例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））由来の配列を加工して、ペアードエンドリードをマージする。一部の実施形態では、コンタミネーション配列（例えば、クローニングベクター、宿主ゲノム）も除去する。一部の実施形態では、本開示の方法は、任意の適用可能なＮＧＳ後の配列加工ツールと適合性である。一部の実施形態では、本開示の配列は、ＢＢＴｏｏｌｓ（ＢＢＭａｐ－Ｂｕｓｈｎｅｌｌ Ｂ． － ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｂｍａｐ／）により加工される。

配列アセンブリー技法は、２種のカテゴリー：比較アセンブリーおよびｄｅ ｎｏｖｏアセンブリーへと広く分けることができる。当業者であれば、オーバーラップ－レイアウト－コンセンサス、整列－レイアウト－コンセンサス、欲張りアプローチ、グラフに基づくスキームおよびオイラーパスを含む、ゲノムアセンブラの基本を熟知しているであろう（Ｂｉｌａｌ Ｗａｊｉｄ， Ｅｒｃｈｉｎ Ｓｅｒｐｅｄｉｎ， Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒｓ ｆｏｒ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １０， Ｉｓｓｕｅ ２， ２０１２， Ｐａｇｅｓ ５８－７３）。

一部の実施形態によれば、メタゲノムライブラリー配列のアセンブリーは、ＡＢｙＳＳ、ＡＬＬＰＡＴＨＳ－ＬＧ、ＡＭＯＳ、Ａｒａｐａｎ－Ｍ、Ａｒａｐａｎ－Ｓ、Ｃｅｌｅｒａ ＷＧＡアセンブラ／ＣＡＢＯＧ、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ＆ＣＬＣ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｅｌｌ、Ｃｏｒｔｅｘ、ＤＮＡ Ｂａｓｅｒ、ＤＮＡ Ｄｒａｇｏｎ、ＤＮＡｎｅｘｕｓ、Ｅｄｅｎａ、Ｅｕｌｅｒ、Ｅｕｌｅｒ－ｓｒ、Ｆｏｒｇｅ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｇｒａｐｈ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｏｒ、ＩＤＢＡ、ＩＤＢＡ－ＵＤ、ＬＩＧＲアセンブラ、ＭａＳｕＲＣＡ、ＭＩＲＡ、ＮｅｘｔＧＥＮｅ、Ｎｅｗｂｌｅｒ、ＰＡＤＥＮＡ、ＰＡＳＨＡ、Ｐｈｒａｐ、ＴＩＧＲアセンブラ、Ｒａｙ、Ｓｅｑｕｅｃｈｅｒ、ＳｅｑＭａｎ ＮＧｅｎ、ＳＧＡ、ＳＧＡＲＣＧＳ、ＳＯＰＲＡ、ＳｐａｒｓｅＡｓｓｅｍｂｌｅｒ、ＳＳＡＫＥ、ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ、ＳＰＡｄｅｓ、Ｓｔａｄｅｎ ｇａｐ４パッケージ、Ｔａｉｐａｎ、ＶＣＡＫＥ、Ｐｈｕｓｉｏｎアセンブラ、ＱＳＲＡおよびＶｅｌｖｅｔを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適した配列アセンブラを使用してアセンブルされるｄｅ ｎｏｖｏアセンブリーであり得る。

現在までに利用できる配列アセンブラの非限定的なリストを表２に提示する。
表２－ｄｅ ｎｏｖｏ配列アセンブラの非限定的なリスト

一部の実施形態では、本開示は、少なくとも第１のアセンブリーおよび第２のアセンブリーを含む逐次的アセンブリー技法を教示する。一部の実施形態では、第１のアセンブリーは、各サイロプール由来（またはバーコード化されている場合、配列の任意の明確に異なってバーコード化された群由来）の配列のアセンブリーである。よって、この第１のアセンブリーは、同じサイロプール（またはバーコード化された群）内から得られるリードを組み合わせることによる配列のみを建設する。この第１のアセンブリーは、リードの相対的により低い複雑性のプールから利益を得て、したがって、より高い信頼度で配列を整列する（よって、より複雑なプールと比較してより長いアセンブリーを生成する）ことができる。第１のアセンブリー由来の結果として生じる配列は、初期Ｅ．ｃｏｌｉコスミドライブラリーにおける１個または複数のコスミドの部分にそれぞれ対応する、複数のミニメタゲノムからなる（図１５を参照）。

一部の実施形態では、第１のアセンブリー由来のミニメタゲノムは、約５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂ、２１ｋｂ、２２ｋｂ、２３ｋｂ、２４ｋｂ、２５ｋｂ、２６ｋｂ、２７ｋｂ、２８ｋｂ、２９ｋｂ、３０ｋｂ、３１ｋｂ、３２ｋｂ、３３ｋｂ、３４ｋｂ、３５ｋｂ、３６ｋｂ、３７ｋｂ、３８ｋｂ、３９ｋｂまたは４０ｋｂ（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）のＮ５０長を有するデジタルライブラリーを産生する。よって、一部の実施形態では、第１のアセンブリー由来のミニメタゲノムは、少なくとも５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂ、２１ｋｂ、２２ｋｂ、２３ｋｂ、２４ｋｂ、２５ｋｂ、２６ｋｂ、２７ｋｂ、２８ｋｂ、２９ｋｂ、３０ｋｂ、３１ｋｂ、３２ｋｂ、３３ｋｂ、３４ｋｂ、３５ｋｂ、３６ｋｂ、３７ｋｂ、３８ｋｂ、３９ｋｂまたは４０ｋｂのＮ５０長を有するデジタルライブラリーを産生する。

一部の実施形態では、次いで、第１のアセンブリー由来の結果として生じるアセンブリーを使用して、第２のアセンブリーにおける異なるサイロプール（またはバーコードが使用された場合は、バーコード化された群）にわたりより長いアセンブリーを調製する。上に記載されている通り、第１のアセンブリーに使用されるサイロプール（またはバーコード化された群）のそれぞれは、出発メタゲノムＤＮＡ試料のより小型の部分である。よって、ある１つのサイロプール／バーコード群に含有される配列が、１個または複数の他のサイロプール／バーコード群由来の配列に対応する（すなわち、アセンブルする、整列する）ことができることが可能であり、さらには、その可能性が高い。よって、一部の実施形態では、第１のアセンブリー由来のアセンブルされたミニメタゲノムのそれぞれは、第２のアセンブリーのための入力として提供される。一部の実施形態では、第１のアセンブリー由来のミニメタゲノムを組み合わせ、より長い配列アセンブリーをもたらすことができる（図１５を参照）。一部の実施形態では、第２のアセンブリーは、サイロプール／バーコード群のそれぞれから残された任意のアセンブルされていないリードをアセンブルすることも含む。

一部の実施形態では、結果として生じるサイロ／バーコード群間のアセンブリーは、さらに大型の配列ストリングを産生する。第１および第２のアセンブリーステップ由来の結果として生じるアセンブルされた配列は、データベースへと投入され、配列の供給源に応じて「デジタルメタゲノミクスライブラリー」または「デジタル環境ライブラリー」と称された。

一部の実施形態では、結果として生じるデジタルメタゲノミクスまたは環境ライブラリーは、約１５Ｋｂ、１６Ｋｂ、１７Ｋｂ、１８Ｋｂ、１９Ｋｂ、２０Ｋｂ、２１Ｋｂ、２２Ｋｂ、２３Ｋｂ、２４Ｋｂ、２５Ｋｂ、２６Ｋｂ、２７Ｋｂ、２８Ｋｂ、２９Ｋｂ、３０Ｋｂ、３１Ｋｂ、３２Ｋｂ、３３Ｋｂ、３４Ｋｂ、３５Ｋｂ、３６Ｋｂ、３７Ｋｂ、３８Ｋｂ、３９Ｋｂ、４０Ｋｂ、４１Ｋｂ、４２Ｋｂ、４３Ｋｂ、４４Ｋｂ、４５Ｋｂ、４６Ｋｂ、４７Ｋｂ、４８Ｋｂ、４９Ｋｂ、５０Ｋｂ、５１Ｋｂ、５２Ｋｂ、５３Ｋｂ、５４Ｋｂ、５５Ｋｂ、５６Ｋｂ、５７Ｋｂ、５８Ｋｂ、５９Ｋｂ、６０Ｋｂ、６１Ｋｂ、６２Ｋｂ、６３Ｋｂ、６４Ｋｂ、６５Ｋｂ、６６Ｋｂ、６７Ｋｂ、６８Ｋｂ、６９Ｋｂ、７０Ｋｂ、７１Ｋｂ、７２Ｋｂ、７３Ｋｂ、７４Ｋｂ、７５Ｋｂ、７６Ｋｂ、７７Ｋｂ、７８Ｋｂ、７９Ｋｂ、８０Ｋｂ、８１Ｋｂ、８２Ｋｂ、８３Ｋｂ、８４Ｋｂ、８５Ｋｂ、８６Ｋｂ、８７Ｋｂ、８８Ｋｂ、８９Ｋｂ、９０Ｋｂ、９１Ｋｂ、９２Ｋｂ、９３Ｋｂ、９４Ｋｂ、９５Ｋｂ、９６Ｋｂ、９７Ｋｂ、９８Ｋｂ、９９Ｋｂ、１００Ｋｂ、１０１Ｋｂ、１０２Ｋｂ、１０３Ｋｂ、１０４Ｋｂ、１０５Ｋｂ、１０６Ｋｂ、１０７Ｋｂ、１０８Ｋｂ、１０９Ｋｂ、１１０Ｋｂ、１１１Ｋｂ、１１２Ｋｂ、１１３Ｋｂ、１１４Ｋｂ、１１５Ｋｂ、１１６Ｋｂ、１１７Ｋｂ、１１８Ｋｂ、１１９Ｋｂ、１２０Ｋｂ、１２１Ｋｂ、１２２Ｋｂ、１２３Ｋｂ、１２４Ｋｂ、１２５Ｋｂ、１２６Ｋｂ、１２７Ｋｂ、１２８Ｋｂ、１２９Ｋｂまたは１３０Ｋｂ（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）の平均配列長を含む。一部の実施形態では、デジタルメタゲノミクスライブラリーの平均配列長は、３２ｋｂである。

一部の実施形態では、結果として生じるデジタルメタゲノミクスまたは環境ライブラリーは、約１０Ｋｂ、１１Ｋｂ、１２Ｋｂ、１３Ｋｂ、１４、Ｋｂ、１５Ｋｂ、１６Ｋｂ、１７Ｋｂ、１８Ｋｂ、１９Ｋｂ、２０Ｋｂ、２１Ｋｂ、２２Ｋｂ、２３Ｋｂ、２４Ｋｂ、２５Ｋｂ、２６Ｋｂ、２７Ｋｂ、２８Ｋｂ、２９Ｋｂ、３０Ｋｂ、３１Ｋｂ、３２Ｋｂ、３３Ｋｂ、３４Ｋｂ、３５Ｋｂ、３６Ｋｂ、３７Ｋｂ、３８Ｋｂ、３９Ｋｂ、４０Ｋｂ、４１Ｋｂ、４２Ｋｂ、４３Ｋｂ、４４Ｋｂ、４５Ｋｂ、４６Ｋｂ、４７Ｋｂ、４８Ｋｂ、４９Ｋｂ、５０Ｋｂ、５１Ｋｂ、５２Ｋｂ、５３Ｋｂ、５４Ｋｂ、５５Ｋｂ、５６Ｋｂ、５７Ｋｂ、５８Ｋｂ、５９Ｋｂ、６０Ｋｂ、６１Ｋｂ、６２Ｋｂ、６３Ｋｂ、６４Ｋｂ、６５Ｋｂ、６６Ｋｂ、６７Ｋｂ、６８Ｋｂ、６９Ｋｂ、７０Ｋｂ、７１Ｋｂ、７２Ｋｂ、７３Ｋｂ、７４Ｋｂ、７５Ｋｂ、７６Ｋｂ、７７Ｋｂ、７８Ｋｂ、７９Ｋｂ、８０Ｋｂ、８１Ｋｂ、８２Ｋｂ、８３Ｋｂ、８４Ｋｂ、８５Ｋｂ、８６Ｋｂ、８７Ｋｂ、８８Ｋｂ、８９Ｋｂ、９０Ｋｂ、９１Ｋｂ、９２Ｋｂ、９３Ｋｂ、９４Ｋｂ、９５Ｋｂ、９６Ｋｂ、９７Ｋｂ、９８Ｋｂ、９９Ｋｂ、１００Ｋｂ、１０１Ｋｂ、１０２Ｋｂ、１０３Ｋｂ、１０４Ｋｂ、１０５Ｋｂ、１０６Ｋｂ、１０７Ｋｂ、１０８Ｋｂ、１０９Ｋｂ、１１０Ｋｂ、１１１Ｋｂ、１１２Ｋｂ、１１３Ｋｂ、１１４Ｋｂ、１１５Ｋｂ、１１６Ｋｂ、１１７Ｋｂ、１１８Ｋｂ、１１９Ｋｂ、１２０Ｋｂ、１２１Ｋｂ、１２２Ｋｂ、１２３Ｋｂ、１２４Ｋｂ、１２５Ｋｂ、１２６Ｋｂ、１２７Ｋｂ、１２８Ｋｂ、１２９Ｋｂまたは１３０Ｋｂ（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）のＮ５０を含む。一部の実施形態では、結果として生じるデジタルメタゲノミクスまたは環境ライブラリーは、少なくとも１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０を含む。

一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている物理的および／またはデジタル配列ライブラリーが、それが抽出された環境試料を代表することを教示する。一部の実施形態では、デジタル配列ライブラリーは、ライブラリー内のアセンブルされた配列の予測される分類学的分類を概説することにより評価することができる。当業者であれば、配列およびアセンブルされたライブラリー内の分類学的多様性を評価する仕方を熟知しているであろう。一部の実施形態では、デジタルメタゲノミクスライブラリーの分類学的特徴付けは、クローナプロットにより行うことができる。分類が行われ得る仕方についての説明に役立つ記載が提供される。アセンブルされたコンティグのヌクレオチド配列は、ソフトウェアツールＫａｉｊｕ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ－ｃｅｎｔｒｅ／ｋａｉｊｕ； Ｍｅｎｚｅｌ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． （２０１６） ”Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ｗｉｔｈ Ｋａｉｊｕ．” Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ７：１１２５７）への入力として使用される。Ｋａｉｊｕツールは、コンティグにおける全６個の読み枠におけるＯＲＦを予測し、予測されたＯＲＦを使用して、参照データベースに対する相同性検索を行う。分類学は、Ｌｅａｓｔ Ｃｏｍｍｏｎ Ａｎｃｅｓｔｏｒ（ＬＣＡ）に基づき、それに含有されるＯＲＦのそれぞれについての分類学の割当てに基づく供給源コンティグ配列に割り当てられる。使用される参照データベースは、ＮＣＢＩ ＮＲデータベースにおける全てのタンパク質配列である。これは、あらゆる培養されたおよび環境中の細菌、古細菌、ならびに真核生物由来の配列データを含む。この方法を使用して決定される多様性は、配置されたメタゲノムライブラリーにおいて捕捉される環境ＤＮＡの組成の概観を提供する。
天然物のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ同定－コードクラスター

微生物における多くの天然物は、生合成遺伝子のコードに加えて、典型的に、発現制御、自己抵抗性および搬出もコードする、多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）によってコードされる仕組みによって産生される（Ｗａｌｓｈ ＣＴ， ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ ＭＡ ２０１０． Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０： Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３２：２４６９－２４９３．； Ｋｏｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｂｏｕｔ ａ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１：６２５－６３１； Ｔｅｎｃｏｎｉ Ｅ． ａｎｄ Ｒｉｇａｌｉ Ｓ ． ２０１８． Ｓｅｌｆ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ ＤＮＡ－ｄａｍａｇｉｎｇ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５：１００－１０８）。産物／種にわたる多重遺伝子クラスターの比較もまた、他のＤＮＡ調節および生合成遺伝子のバックグラウンドの中のＭＧＣの様々なカテゴリーを同定することができる、一連の保存された構造的特色を明らかにした。本開示の発明は、天然物コードＭＧＣの保存された構造的、配列および組織的な特性を活用して、新たなｉｎ ｓｉｌｉｃｏ天然物発見ワークフローを産生する（図１を参照）。本開示のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法は、１）抵抗性遺伝子に基づくＭＧＣ検索、２）標的化されない抵抗性シグナルＭＧＣ検索および３）推移的なＭＧＣ検索へと広範にカテゴリー化することができる。これらはそれぞれ、下でより詳細に記述する。

一部の実施形態では、本開示のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法（すなわち、上に記述されている方法１～３）は、デジタルメタゲノムライブラリーまたはデジタル環境ライブラリーを活用する（およびその多様性を探索する）ことができる。本文書は、天然物発見のためにメタゲノムライブラリーを使用することの多くの利点の概要を述べた。しかし、一部の実施形態では、本開示のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法は、本開示の前のセクションに記載されている通り、株の収集物もしくは他の非公式のおよび公開されたデータベースを表すライブラリー、またはデジタル環境ライブラリー等、他の配列ライブラリーに適用することもできる。よって、当業者であれば、メタゲノミクスライブラリーの文脈における下の方法の記載を、他の配列ライブラリーに適用することもできることを認識するであろう。したがって、これらのライブラリーへの方法の適用もまた、本質的に開示される。
天然物コードＭＧＣのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ発見－抵抗性遺伝子検索
理論的基盤

一部の実施形態では、本開示は、ＭＧＣのための抵抗性に基づく検索戦略を教示する。これらの戦略は、大部分は、天然物進化の抵抗性仮説に基づく。

抵抗性仮説は、ＭＧＣ内に、生物が産生する潜在的に有害な天然物（「ＮＰ」）に対する抵抗性を付与する少なくとも１個の遺伝子が存在することが多いことを言う。いずれか１つの理論に制約されることは望まないが、本発明者らは、ＭＧＣ内における抵抗性遺伝子の存在が、天然物を産生する微生物が、新たなＮＰをその環境に送達する、またはその蓄積から生じる任意のマイナスの効果を他の仕方で緩和する方策を有することを確実にするための進化上の自己防衛機構であることを仮定する。この仮説は、大部分の（ただし全てではない）抵抗性遺伝子が、ＭＧＣ内にまたはＭＧＣに高度に近接して位置することも仮定する。この遺伝的近接は、抵抗性遺伝子が、天然物コードＭＧＣと共遺伝（および潜在的に同時調節）される機会を増加させる。

抵抗性仮説は、４種の注目すべき機構へとカテゴリー化され得る種々の抵抗性戦略を包含する（図５を参照）。例えば、一部の実施形態では、抵抗性は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからのテトラサイクリンの搬出によって例証される通り、ＮＰ搬出（排出）に基づく抵抗性である。一部の実施形態では、抵抗性は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおけるクロラムフェニコールのアセチルトランスフェラーゼ改変によって例証される通り、ＮＰ改変に基づく抵抗性である。一部の実施形態では、抵抗性は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおけるアミノグリコシドのリボソームメチル化によって例証される通り、標的改変に基づく抵抗性である。一部の実施形態では、抵抗性は、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｒｉｆａｍｙｃｉｎｉｃａにおけるリファマイシンに対する抵抗性を分け与えるＲＮＡポリメラーゼバリアントのコードによって例証される通り、標的バリアントに基づく抵抗性である。当業者であれば、これらの機構が、説明に役立つものであり、本発明の範囲を限定することを意味しないことを認識するであろう。よって、一部の実施形態では、本出願における抵抗性遺伝子の参照は、上に記述されている機構、または抵抗性遺伝子のそのＮＰコードＭＧＣへの近位の位置付けをもたらす他の機構のいずれかの支配下にある遺伝子を網羅することが広範に理解されるであろう。

抵抗性仮説における標的バリアントに基づく戦略の拡大として、重複仮説は、ＭＧＣ内の抵抗性遺伝子が、生物において主要機能を果たす必須遺伝子と配列類似性を共有することを言う。

重複仮説は、ＤＮＡジャイレース等、多くの抗生物質の一般的な標的部位が、産生微生物においても見出されることの観察から生じる。よって、自身を保護するために、産生微生物は、変更されたタンパク質を毒性天然物の効果に対して抵抗性にする、僅かな改変を有する標的配列のコピーを有する。一部の実施形態では、改変は、タンパク質に結合する天然物の能力に影響を与えるが、細胞においてその正常な役割を実行するタンパク質の能力には影響を与えない（例えば、図１７および下に記述される実施例において説明されるエポキソミシン（Ｅｘｐｏｘｏｍｉｃｉｎ）抵抗性を参照）。

例えば、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａは、プロテアソームを阻害するためにサリノスポラミドＡを産生する。しかし、プロテアソームは、Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａの中にも存在する。サリノスポラミドＡをコードする遺伝子クラスターは、Ｓｔｒｏｐ＿２２４４におけるプロテアソームβ－サブユニット遺伝子に対して５８％の配列同一性を共有するＳａｌＩ遺伝子を封入する。しかし、タンパク質レベルでは、ＳａｌＩサブユニットおよび典型的なβ－サブユニットは、４５および４９位の２個のアミノ酸のみが異なる。そうであるにもかかわらず、α－サブユニットと組み合わされた場合、ＳａｌＩタンパク質は、サリノスポラミドＡによって結合され得ないプロテアソーム複合体を形成し、これにより、サリノスポラミドＡに対する有効な標的バリアントに基づく抵抗性として作用する（Ｋａｌｅ ＡＪ， ＭｃＧｌｉｎｃｈｅｙ ＲＰ， Ｌｅｃｈｎｅｒ Ａ， Ｍｏｏｒｅ ＢＳ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｅｌｆ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ Ａ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１１；６（１１）：１２５７－１２６４）。

その核心において、標的バリアントに基づく戦略および重複仮説は、非常に類似したアイデアを言い表す。しかし、「標的バリアントに基づく戦略」は、自己防御機構を指し、一方で、重複仮説は、ＭＧＣ予測を増強するために使用され得るＭＧＣの可能な特性の１つを言い表す。実際に、本開示のある特定の実施形態は、ＭＧＣ内にコードされる標的バリアントが、産生微生物だけではなく他の生物にも存在する必須遺伝子に対して相同性を示すであろうという仮説に基づく。

よって、一部の実施形態では、本開示は、異なる生物にわたる「抵抗性遺伝子」の保存が、保存された遺伝子が、ＭＧＣによってコードされる天然物の標的となり得ることを示すことを教示する。一部の実施形態では、本開示のシステムおよび方法は、微生物ＭＧＣ抵抗性遺伝子と、他の生物における必須遺伝子との間の関係性を活用して、特異的適用標的に焦点を合わせた天然物発見プログラムを設計する。

例えば、本出願内の実施例は、同じ必須遺伝子を標的化する尤度に基づき、ヒトのがんにおいて同定された抵抗性遺伝子の類似性を使用して、潜在的な抗がん特性を有する新規天然物を同定する（実施例２および図１７を参照）。

抵抗性遺伝子仮説に基づく具体的な発見ワークフローについて、下でより詳細に記述する。
抵抗性遺伝子検索ワークフロー

一部の実施形態では、本開示は、デジタルメタゲノミクスライブラリーを検索し、目的の天然物を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法を教示する。一部の実施形態では、本開示の方法は、ａ）デジタルメタゲノミクスライブラリーを、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルについて問い合わせるステップと、ｂ）前記問い合わせの出力を、複数のシグナル関連の（多重遺伝子クラスター）デジタル特色セットとして供給するステップと、ｃ）ｉ）シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定し、生合成オペロンを含むコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルすること、および／またはｉｉ）シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定して、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定することにより、生物学的関連性を決定し、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットに割り当てるステップと、ｄ）デジタル処理でアセンブルされた生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットの閾値パラメーター内に位置するコンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子に基づき、目的の天然物を同定するステップとを含む。

一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索は、３つのステップを伴う：候補抵抗性遺伝子を同定するステップ；候補遺伝子クラスターを同定するステップ；最後に、候補抵抗性遺伝子および候補遺伝子クラスターが、ＤＮＡ断片内で近接していることの決定。当業者であれば、候補抵抗性遺伝子および候補遺伝子クラスターの同定を任意の順序で遂行することができることを認識するであろう。両方の可能な順序が本特許請求の範囲によって包含され、下でより詳細に記述される。

本開示の抵抗性遺伝子ＭＧＣ検索のワークフローの実施形態の視覚的表現を図６に提示する。手短に説明すると、デジタルメタゲノムライブラリーは、公知のまたは予測される抵抗性遺伝子に対するホモログの存在について問い合わされる（すなわち、ステップａ）に対応する抵抗性遺伝子相同性）。すなわち、一部の実施形態では、初期「ａ）デジタルメタゲノミクスライブラリーを、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルについて問い合わせるステップ」は、デジタルメタゲノミクスライブラリーを、候補抵抗性遺伝子の存在について問い合わせるステップを含む。

同定された候補抵抗性遺伝子を含むデジタルＤＮＡ配列ヒットは、必要に応じてフィルタリングされ、次いで、天然物コード多重遺伝子クラスターの存在について解析される（すなわち、ステップｃ）ｉ）に対応するクラスター予測）。すなわち、一部の実施形態では、「生物学的関連性を決定し、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットに割り当てるステップ」は、候補遺伝子クラスターを同定するステップを含む。

最後に、同定された候補抵抗性遺伝子の位置は、同定された候補クラスターの位置と比較して解析され、これにより、候補抵抗性遺伝子が、クラスターの予測される境界内にまたは前記境界からの所定の距離内に位置する、候補クラスターを同定する（すなわち、ステップｄ）に対応する近接解析）。

上に記す通り、当業者であれば、候補クラスターおよび候補抵抗性遺伝子の同定を任意の順序で遂行することができることを認識するであろう。例えば、一部の実施形態では、デジタルメタゲノムライブラリーは、全ての予測される天然物コード多重遺伝子クラスター（ステップａ）に対応する候補クラスター）の存在について問い合わされる。すなわち、一部の実施形態では、初期ａ）「デジタルメタゲノミクスライブラリーを、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルについて問い合わせるステップ」は、デジタルメタゲノミクスライブラリーを、候補抵抗性遺伝子の存在について問い合わせるステップを含む。

予測される天然物コード多重遺伝子クラスターを含むデジタルＤＮＡ配列ヒットは、公知のまたは予測される抵抗性遺伝子に対するホモログ（ステップｃ）ｉｉ）に対応する候補抵抗性遺伝子）の存在についてさらに問い合わされる。すなわち、一部の実施形態では、「生物学的関連性を決定し、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットに割り当てるステップ」は、候補抵抗性遺伝子を同定するステップを含む。

最後に、同定された候補抵抗性遺伝子の位置は、同定された候補クラスターの位置と比較して解析され、これにより、候補抵抗性遺伝子が、クラスターの予測される境界内にまたは前記境界からの所定の距離内に位置する、候補クラスターを同定する（すなわち、ステップｄ）に対応する近接解析）。これらのステップのそれぞれについて、下でより詳細に記述する。
抵抗性遺伝子検索のために標的遺伝子を選択する

一部の実施形態では、発見プラットフォームの初期ステップは、目標を設定し、所望の天然物を同定するように設計された抵抗性遺伝子を同定することである（図７）。一部の実施形態では、本開示の方法は、特定のクラスの天然物をコードするＭＧＣについて検索するようにカスタマイズすることができる。例えば、一部の実施形態では、目標は、ヒトタンパク質（すなわち、標的遺伝子／タンパク質）と相互作用することができる天然物を同定することとなり得る。この説明に役立つ例では、デジタルメタゲノムライブラリーは、原核生物において十分に保存されているヒトタンパク質のホモログの存在について問い合わされる（すなわち、抵抗性遺伝子についてデータベースを問い合わせるステップ）。例によって、一部の実施形態では、ヒトプロテアソームは、一部の原核生物において十分に保存されているため、本明細書にて開示される方法を使用して、抵抗性遺伝子検索を使用して、ヒトプロテアソーム阻害剤をコードする細菌天然物について検索することができる。

よって、本明細書にて開示される方法は、初めて、特異的な治療標的のための新たな天然物の探索および同定を可能にする。例えば、目標が、がんに関連するヒト細胞周期遺伝子の活性をモジュレートすることができる天然物を同定することである場合には、標的遺伝子／タンパク質は、ヒト細胞周期遺伝子および関連遺伝子となるであろう。すなわち、一部の実施形態では、細胞周期遺伝子の活性をモジュレートすることができる天然物の検索は、予測モデル（例えば、ヒト細胞周期遺伝子および（おそらく）他の関連遺伝子（例えば、同じｐＦＡＭにおける、または科学的報告によって同じクラス内にあると認識される遺伝子）において訓練されたＨＭＭ）を利用するであろう。一部の実施形態では、本明細書にて開示される長いアセンブリーライブラリーへのＭＧＣ発見ワークフローの適用は、初めて、メタゲノム試料の広範な遺伝的多様性の探索を可能にする予想外の相乗作用を示す。実際に、実験は、発見ワークフローの適用が、他の大型配列データベースよりも、ＭＧＣを同定することにおいて１０×、２０×、３０×、４０×または５０×を超えて有効であることを実証する。

別の説明に役立つ例では、目標は、公知の抗生物質のバリアントを同定することであり得る。これらの実施形態では、デジタルメタゲノミクスライブラリーは、公知の抗生物質（例えば、アンピシリン抵抗性のためのＴＥＭ－１ Ｂ－ラクタマーゼ）の抵抗性の原因となる遺伝子に対するホモログの存在について問い合わせることができる。結果として生じるヒットは、公知の抗生物質の抵抗性の原因となる遺伝子と相同性を共有する候補抵抗性遺伝子の存在に基づき、抗生物質バリアントをコードするＭＧＣにおいて富化されると予想されるであろう。よって、一部の実施形態では、本開示の抵抗性遺伝子検索は、抵抗性遺伝子を標的化する天然物（またはそのホモログ）、またはその効果が抵抗性遺伝子の存在によって低下／修正される天然物をコードするＭＧＣを同定する。

しかし、当業者であれば、本開示の方法を、植物、真菌および細菌に由来する種を含む、任意の種の遺伝子／タンパク質に適用することができることを認識するであろう。

一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索に使用される標的遺伝子配列は、完全遺伝子配列（例えば、転写開始部位から終結部位まで）である。一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索に使用される標的遺伝子配列は、遺伝子のコード配列（例えば、発現遺伝子マイナスＵＴＲ）である。一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索に使用される標的遺伝子配列は、１個または複数の関連しているドメインを含むもの等の部分的遺伝子である。一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索に使用される標的遺伝子配列は、完全発現タンパク質の配列等のタンパク質配列である。一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索に使用される標的遺伝子配列は、完全発現タンパク質の配列等のタンパク質配列である。一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索に使用される標的遺伝子配列は、目的の特定のタンパク質ドメインに属するもの等の部分的タンパク質配列である。よって、標的抵抗性遺伝子が、十分に保存されたＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質である場合、本開示の抵抗性遺伝子検索は、タンパク質配列全体とは対照的に、保存されたＤＮＡ結合ドメインに集中することができる。

一部の実施形態では、本開示は、次のｉｎ ｓｉｌｉｃｏワークフローを使用した抵抗性遺伝子検索標的を選択するステップを教示する：１）所望の天然物標的遺伝子（例えば、公知のまたは予測される天然物により影響を受けることが仮定される遺伝子）を同定する；２）所望の天然物標的遺伝子（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔにおいて見出される）の共通オルソログ群（ＣＯＧ）を同定する；３）同定されたＣＯＧが、微生物配列を含有するか否か決定する；および４）含有する場合、標的遺伝子を、同じＣＯＧ由来の微生物配列と比較するＢＬＡＳＴを遂行する。一部の実施形態では、結果として生じるｂｌａｓｔヒットは、５）保存についてさらに評価される（例えば、＜０．００１のＥ値は、標的遺伝子／タンパク質および微生物遺伝子／タンパク質の間に有意な保存が存在することを示す）。一部の実施形態では、本開示は、上に記載されている通り、ｂｌａｓｔにより遺伝子を選択するステップを教示する。一部の実施形態では、本開示は、＜０．００１のＥ値を有するｂｌａｓｔヒットのみを選択するステップを教示する。一部の実施形態では、選択された標的遺伝子は、本文書に記載されているＭＧＣ検索ワークフローにおいて使用される。
抵抗性遺伝子相同性検索

一部の実施形態では、本開示は、デジタルメタゲノミクスライブラリーを、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルについて問い合わせるステップを教示する。一部の実施形態では、問い合わせるステップは、デジタルメタゲノミクスライブラリーを、公知のまたは予測される抵抗性遺伝子（両者共に、標的抵抗性遺伝子と称される）に対するホモログについて検索し、これにより、候補抵抗性遺伝子を同定するステップを含む。上に記す通り、一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索は、生物学的関連性をシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットに割り当てるためのステップにおいて、方法において後に遂行することができる。

一部の実施形態では、抵抗性遺伝子の検索は、伝統的検索方法論を使用して行われる。例えば、一部の実施形態では、候補抵抗性遺伝子は、配列同一性に基づき同定される。一部の実施形態では、関連ポリペプチドまたは核酸配列の同一性は、当業者にとって公知の方法のいずれかによって容易に計算することができる。２種の配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）の「パーセント同一性」は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３－７７， １９９３のように改変された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４－６８， １９９０のアルゴリズムを使用して決定することができる。斯かるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０のＮＢＬＡＳＴ（登録商標）およびＸＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（バージョン２．０以降）へと取り込まれる。ＢＬＡＳＴ（登録商標）タンパク質検索は、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて行って、本明細書に記載されているタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。ギャップが、２種の配列の間に存在する場合、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９－３４０２， １９９７に記載されている通りに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（登録商標）を利用することができる。ＢＬＡＳＴ（登録商標）およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ（登録商標）およびＮＢＬＡＳＴ（登録商標））のデフォルトパラメーターを使用することができる、またはパラメーターを、当業者によって理解される通りに適切に調整することができる。

一部の実施形態では、候補抵抗性遺伝子は、標的抵抗性遺伝子と少なくとも２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）。

一部の実施形態では、候補抵抗性遺伝子は、配列類似性に基づき同定される。核酸配列およびタンパク質配列の類似性は、本開示に従って、当技術分野で公知の方法を含むいくつかの方法によって評価することができる。

当業者にとって公知の広く使用されている類似性検索プログラムは、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ， Ｍａｄｄｅｎ ＴＬ， Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＡＡ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ， Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ． Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７；２５：３３８９－３４０２； ｕｎｉｔｓ ３．３ ａｎｄ ３．４）、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（同上）、ＳＳＥＡＲＣＨ（Ｓｍｉｔｈ ＴＦ， Ｗａｔｅｒｍａｎ ＭＳ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８１；１４７：１９５－１９７； Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ． Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ： Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｍｉｔｈ－ｗａｔｅｒｍａｎ ａｎｄ ｆａｓｔａ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９１；１１：６３５－６５０， ｕｎｉｔ ３．１０）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ， Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９８８；８５：２４４４－２４４８ ｕｎｉｔ ３．９）およびＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ ＲＣ． ＭＵＳＣＬＥ： ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４；３２（５）：１７９２－１７９７）を含む。

一部の実施形態では、候補抵抗性遺伝子は、標的抵抗性遺伝子と少なくとも２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を示す（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）。

一部の実施形態では、候補抵抗性遺伝子は、予測エンジンにより同定される。一部の実施形態では、予測エンジンは、機械学習モデルである。一部の実施形態では、予測エンジンは、ＨＭＭモデルである。

当業者であれば、本開示のワークフローに対する複数の機械学習予測モデルの適合性を認識するであろう。よって、説明に役立つモデルとしてＨＭＭが使用されることが多いが、一部の実施形態では、ＨＭＭへの言及が、「予測モデル」または「予測的機械学習モデル」として一般に理解され得ることが理解されるであろう。一部の実施形態では、予測エンジン／モデルは、長・短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくもの等の回帰型ニューラルネットワークを含む、ＨＭＭ、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、双方向性ＬＳＴＭ（長・短期記憶）、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）、ＲＮＮ（回帰型ニューラルネットワーク）、動的ベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク、およびそれらの組合せからなる群より選択される。

当業者であれば、ＨＭＭ配列モデルのための様々な公開供給源を、および／または抵抗性遺伝子検索を遂行するための新たな機械学習モデルを生成する方法を熟知しているであろう。例えば、一部の実施形態では、本開示は、候補抵抗性遺伝子を同定するための、ＴＩＧＲＦａｍまたはＰＦａｍ ＨＭＭモデルの使用を教示する。これらのＨＭＭは、広い範囲の型のタンパク質およびタンパク質ドメインに利用でき、本開示のデジタルメタゲノムライブラリーに直接的に適用することができる。

ＴＩＧＲＦＡＭは、キュレートされた多重配列整列、タンパク質配列分類のための隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、および相同タンパク質について検索することができる関連情報からなるリソースである。リリース１０．０から開始して、ＴＩＧＲＦＡＭモデルは、優れた検索スピードおよび検索感度を提供するＨＭＭＥＲ３を使用する（Ｈａｆｔ ＤＨ， ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧＲＦＡＭｓ： ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２００１－０１－０１； ２９．１： ４１－３．）。

Ｐｆａｍは同様に、完全タンパク質ドメインの多重整列および隠れマルコフモデルに基づくプロファイル（ＨＭＭ－プロファイル）を含有する。ドメイン境界、ファミリーメンバーおよび整列の定義は、専門知識、配列類似性、他のタンパク質ファミリーデータベース、ならびにメンバーを正確に同定および整列するＨＭＭ－プロファイルの能力に基づき半自動的に為される（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＥＬ， Ｅｄｄｙ ＳＲ， Ｂｉｒｎｅｙ Ｅ， Ｂａｔｅｍａｎ Ａ， Ｄｕｒｂｉｎ Ｒ． Ｐｆａｍ： ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ＨＭＭ－ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８；２６（１）：３２０－３２２）。候補抵抗性タンパク質のためのＨＭＭ検索の説明に役立つ例は、本文書の後のセクションに提示する。
抵抗性遺伝子検索出力および必要に応じたフィルタリング

一部の実施形態では、抵抗性遺伝子相同性検索からの出力は、デジタルメタゲノミクスライブラリー由来のアセンブルされた配列内に含有される複数の候補抵抗性遺伝子配列である（すなわち、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セット）。一部の実施形態では、各候補抵抗性遺伝子配列は、検索モデルの予測が的確である尤度に関係する信頼度スコアに関連する。よって、候補抵抗性遺伝子配列は、モデル（例えば、機械学習モデル、例えば、ＨＭＭ）によって候補配列に割り当てられた信頼度スコアに基づき同定することができる。

一部の実施形態では、本開示は、次のワークフローステップのために、全ての予測される遺伝子候補配列を保つステップを教示する。一部の実施形態では、本開示は、最良の信頼度を有するヒットのみが解析のその後のステップに進めるような、予め選択された信頼度カットオフの使用を教示する。信頼度スコアカットオフは、データベースのサイズおよび方法の特定のインプリメンテーションの他の特色に基づき変動し得る。あるいは、方法またはシステムは、候補配列および非候補配列の間を判別するための他の手段を用いることができる。一部の実施形態では、候補抵抗性遺伝子配列は、その信頼度スコアによって最高信頼度から最低信頼度の順序でランク付けされ、次いで、カットオフが用いられて、特定の信頼度閾値を下回る任意の配列を除去する。例えば、信頼度スコアがｅ値である場合、候補配列は、昇順ｅ値の順序でランク付けすることができる：最低ｅ値（最高信頼度）から最高ｅ値（最低信頼度）。次いで、選択された閾値を上回るｅ値を割り当てられた任意の配列を、候補配列のプールから除去することができる。類似的に、信頼度スコアがビットスコアである場合、候補配列は、降順ビットスコアの順序でランク付けすることができる：最高ビットスコア（最高信頼度）から最低ビットスコア（最低信頼度）。次いで、選択された閾値を下回るビットスコアを割り当てられた任意の配列を、候補配列のプールから除去することができる。

一部の実施形態では、配列データベースからの候補抵抗性配列の同定に続いて、候補配列がフィルタリングされて、標的抵抗性遺伝子の機能を果たす可能性が低い候補配列を除去する。一部の実施形態では、候補配列は、１個または複数の第２の「対照」予測モデルを使用したその評価に基づきフィルタリングされる。用いられる対照予測モデルの数は、状況、標的抵抗性遺伝子の型、関連しているデータの利用能、および他の斯かる特色に依存し得る。一部の実施形態では、対照予測モデルの数は、１～１００，０００個の間である。一部の実施形態では、対照予測モデルの数は、少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００または少なくとも１００，０００個である。

一部の実施形態では、候補抵抗性配列は、例えば、信頼度スコアを割り当てることにより、配列が標的抵抗性遺伝子の機能を果たす尤度を決定する第１の予測モデルによって評価され；次いで、候補配列は、例えば、信頼度スコアを割り当てることにより、配列が異なる機能を果たす尤度を決定する第２の予測モデル（単数または複数）によって評価される。次いで、標的タンパク質もしくは標的遺伝子機能または別の機能を果たす候補配列の相対的な尤度が比較される。一部の実施形態では、各候補配列は、第１の予測モデルによって生成される「標的抵抗性遺伝子信頼度スコア」と、候補配列が標的タンパク質または標的遺伝子機能とは異なる機能を果たす尤度を評価する第２の予測モデルによって生成される最良の信頼度スコアである、「最良のマッチの信頼度スコア」とを割り当てられる。例えば、５００個の対照予測モデルが用いられて、配列が、標的タンパク質または標的遺伝子機能以外の機能を果たすタンパク質または遺伝子をコードする可能性があるか否か決定する場合、「最良のマッチの信頼度スコア」は、５００個の対照予測モデルのうちいずれか１個によって生成される最良の信頼度スコア（例えば、最高ビットスコア、最低ｅ値）となるであろう。

よって、一部の実施形態では、標的タンパク質または標的遺伝子信頼度スコアおよび最良のマッチの信頼度スコアが比較される。一部の実施形態では、標的タンパク質または標的遺伝子ｅ値の対数および最良のマッチの（例えば、第２の予測的機械学習モデルから）ｅ値の対数が比較される。一部の実施形態では、標的タンパク質または標的遺伝子ビットスコアおよび最良のマッチのビットスコアが比較される。一部の実施形態では、標的タンパク質または標的遺伝子機能を果たす相対的な尤度の閾値が確立される。

用いられる対照予測的機械学習モデルの数は、数的に限定されないが、標的タンパク質または標的遺伝子が属する群以外のオルソロジー群の同定に基づき生成され得るモデル等の対照モデルを生成する能力および／またはその利用能に基づく。一部の実施形態では、少なくとも１個の二次モデルが用いられる。一部の実施形態では、少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００または１０，０００個の対照モデルが用いられる。

一部の実施形態では、標的タンパク質または標的遺伝子機能を果たす尤度が、異なるタンパク質機能を果たす尤度を超える場合（すなわち、標的マッチ信頼度スコアが、最良のマッチの信頼度スコアである場合）にのみ、候補抵抗性配列は保持される。一部の実施形態では、標的抵抗性遺伝子機能を果たす尤度が、異なるタンパク質機能を果たす尤度を超えるまたはそれにほぼ等しい場合にのみ、候補抵抗性配列は保持される。一部の実施形態では、標的抵抗性遺伝子機能を果たす相対的な尤度が、ある特定の信頼度区間内に収まる場合、候補抵抗性配列は保持される。一部の実施形態では、標的抵抗性遺伝子機能を果たす相対的な尤度が、ある特定の閾値を超える場合、候補抵抗性配列は保持される。一部の実施形態では、次の判定基準（または標的抵抗性遺伝子の等価物）を満たす場合、候補抵抗性配列は保持される：

一部の実施形態では、最良のマッチのＥ値または最良のマッチのビットスコアは、対照予測モデルのうちの最良の信頼度スコアである。他の実施形態では、最良のマッチは、候補抵抗性遺伝子信頼度スコアを含む、全ての検査された予測モデルのうちの最良の信頼度スコアである。この第２の実施形態では、候補抵抗性遺伝子信頼度スコア（例えば、ビットスコアまたはＥ値）が、最良のマッチである場合には、比は１である。最良のマッチの信頼度スコアが対照予測モデルの中から選択される、他の実施形態では、比は、１を超えることができる。

候補抵抗性遺伝子配列を保持するための閾値は、所望の信頼度範囲に基づき改変することができる。一部の実施形態では、閾値は、０．１～０．９９の間である。一部の実施形態では、閾値は、０．５～０．９９の間である。一部の実施形態では、閾値は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９である。一部の実施形態では、閾値は、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９または０．９５である。

上述の閾値計算は、説明に役立つが、決して徹底的なものではない。当業者であれば、その信頼度スコアが計算される仕方に応じて様々な閾値カットオフを適用する仕方を認識するであろう。例えば、信頼度スコアが、より低いスコアがより大きい信頼度を示すようなものである場合には、標的タンパク質または標的遺伝子信頼度スコアの最良のマッチの信頼度スコアに対する比が、ある特定の閾値よりも低いのであれば、配列を保持することができる。

一部の実施形態では、出力候補抵抗性遺伝子のそれぞれは、より長いＤＮＡ配列に関連する（すなわち、各候補抵抗性遺伝子は、デジタルメタゲノムライブラリー内のより長いアセンブルされたＤＮＡ配列内に含有される）。一部の実施形態では、本開示は、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂまたは３０ｋｂ未満の長さのアセンブルされたＤＮＡ配列内に含有される候補抵抗性遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを教示する。一部の実施形態では、配列長カットオフは、多重遺伝子クラスターの予想されるサイズに基づき作製される。予想される天然物が、少なくとも３０ｋｂの多重遺伝子クラスターによって産生されると予想される場合、１０ｋｂ未満の長さの候補抵抗性遺伝子をさらに加工することに関連していない場合がある。

一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索の出力は、アセンブルされたＤＮＡ配列の予測される分類学に基づきフィルタリングすることもできる。よって、目標が、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ由来の天然物を同定することである場合、他の属／種に属すると同定された配列を、その後のワークフローステップに先立ちフィルタリングして取り除くことができる。

一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索の出力は、重複または高度に関連する配列を除去するようにフィルタリングすることもできる。一部の実施形態では、抵抗性遺伝子結果は、部分的配列を除去するようにフィルタリングすることもできる。

一部の実施形態では、抵抗性遺伝子検索の出力は、別の生物由来の対応する標的遺伝子に対する各候補抵抗性配列の相同性に基づき優先順位をつけることができる。よって、一部の実施形態では、候補抵抗性遺伝子は、ＢＬＡＳＴを使用して公知のデータベースと比較されて、最強マッチが、所望の標的配列に対するホモログとしてｂｌａｓｔによって同定されるか否か決定する。例えば、一部の実施形態では、ヒトプロテアソームのベータ－サブユニットを標的化する天然物の検索は、ｂｌａｓｔを使用してヒトプロテオームに対して比較されて、候補配列が、プロテオームデータベースからベータ－サブユニットを同定することができたことを確実にするであろう。これらのヒットは、一部の実施形態では、さらなる再調査のために優先順位をつけられるであろう。

一部の実施形態では、候補抵抗性遺伝子を含むと同定され、（必要に応じて）上に記載されているフィルタリングステップをさらに生き延びた、デジタルメタゲノミクスライブラリー由来のＤＮＡデジタル配列は、「シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セット」と本明細書において称される。

一部の実施形態では、フィルタリングされていない配列は、本明細書にて開示されるワークフローに沿って進むことが可能になる。
多重遺伝子クラスター予測

一部の実施形態では、本開示は、生物学的関連性をシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットに割り当てるステップを教示する。一部の実施形態では、関連性を割り当てるステップは、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定し、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップを含む（例えば、生合成遺伝子クラスターの同定）。一部の実施形態では、このステップは、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットが、任意の天然物コード多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）を含むか否かコンピューターにより決定するステップを含む。

上に記す通り、一部の実施形態では、多重遺伝子クラスター予測は、デジタルメタゲノミクスライブラリーを、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルについて問い合わせるためのステップにおいて、方法において先に遂行することができる。よって、一部の実施形態では、多重遺伝子クラスター予測は、複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットを産生する。

ＭＧＣのためのゲノムマイニングの概念は、様々なアプローチを利用して潜在的天然物（ＮＰ）コードクラスターのプールを活用する、多くのバイオインフォマティクスツールの開発によって容易になる。これらのツールは、現在までに発見されたＭＧＣに関連する様々な遺伝子および構造の存在を検索するように設計されたアルゴリズムに頼ることが多い。

天然物の様々な生合成クラスをコードするＭＧＣは、ポリケタイド（ＰＫＳ）（Ｈｅｒｔｗｅｃｋ Ｃ （２００９） Ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｏｇｉｃ ｏｆ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４８：４６８８－４７１６）、非リボソーム性ペプチド（ＮＲＰ）（Ｃｏｎｄｕｒｓｏ ＨＬ， Ｂｒｕｎｅｒ ＳＤ （２０１２） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ． Ｎａｔ ｒｏｄ Ｒｅｐ ２９：１０９９－１１１０）、リボソームにより合成され、翻訳後修飾されたペプチド（ＲｉＰＰ）（Ｄｕｎｂａｒ ＫＬ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＤＡ （２０１３） Ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｎａｔｕｒｅ’ｓ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ８：４７３－４８７）、サッカライド（Ｍｃｃｒａｎｉｅ ＥＫ， Ｂａｃｈｍａｎｎ ＢＯ （２０１４） Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ ３１：１０２６－１０４２）、テルペノイド（Ｃａｎｅ ＤＥ， Ｉｋｅｄａ Ｈ （２０１２） Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｅｒｐｅｎｏｍｅ． Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ４５：４６３－４７２）およびハイブリッド構造を含む。

上述の天然物クラスのそれぞれを、サブクラスへとさらに分けることができる。例えば、ポリケタイドは、その生合成酵素、ポリケタイドシンターゼ（ＰＫＳ）のアーキテクチャに基づき３つの群へと分けられる。最小では、ＰＫＳは、３種の活性を含む：（１）アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）－基本単位を選択する決定ゲート；（２）基本単位が共有結合により繋留される、チオール化（Ｔ）またはアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）；および（３）活性化カルボン酸単量体の縮合を触媒するケトシンターゼ（ＫＳ）（「ヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）」、脱炭酸的、クライゼン型反応）。触媒ドメインは、Ｉ型ＰＫＳにおいて融合され、一方、ＩＩ型ＰＫＳは、別々の酵素の解離可能な複合体である。植物において主に見出されるＩＩＩ型ＰＫＳは、マロニル－ＣｏＡをＴドメインに先ず転移するのではなく、直接的にそれを使用する、多機能酵素である。さらに、Ｉ型ＰＫＳは、真菌ポリケタイド生合成の典型である通り、反復（すなわち、各ドメインが、１ラウンドより多くの伸長を触媒する）、または細菌Ｉ型ＰＫＳの原型であるマルチモジュラーのいずれかへとさらにカテゴリー化することができる。加えて、ｔｒａｎｓ－ＡＴ ＰＫＳ（Ｐｉｅｌ Ｊ （２０１０） Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ＡＴ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ ２７：９９６－１０４７）は、ＡＴドメインが自立型であるマルチモジュラーＰＫＳの進化的に明確に異なるサブタイプである。非リボソーム性ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）は、マルチモジュラーＰＫＳと同様の様式で組織化される。アデニル化（Ａ）ドメインは、これをＴドメインに転移させるアミノ酸基本単位を選択し（ＮＲＰＳにおけるペプチジル担体タンパク質、ＰＣＰとも呼ばれる）、縮合（Ｃ）ドメインは、ペプチド結合形成を触媒する。

公知のＭＧＣのこれらの上述の特色は、それらの関連するシグネチャードメイン／遺伝子と一緒に、本開示のデジタルメタゲノムライブラリー内の新たなＭＧＣの検索モデルを開発するために使用することができる（例えば、シグネチャードメインのさらに多くのための隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）のプロファイルにより）。

一部の実施形態では、生合成遺伝子クラスターの予測は、いくつかの開発されたアルゴリズムを使用して自動化することができる。本開示の方法と適合性であるクラスター予測アルゴリズムの非限定的なリストは、ＳＢＳＰＫＳ（Ａｎａｎｄ Ｓ， Ｐｒａｓａｄ ＭＶ， Ｙａｄａｖ Ｇ ｅｔ ａｌ （２０１０） ＳＢＳＰＫＳ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８： Ｗ４８７－Ｗ４９６）、ＮＰ．ｓｅａｒｃｈｅｒ（Ｌｉ ＭＨ， Ｕｎｇ ＰＭ， Ｚａｊｋｏｗｓｋｉ Ｊ ｅｔ ａｌ （２００９） Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １０：１８５）およびＢＡＧＥＬ３（Ｖａｎ Ｈｅｅｌ ＡＪ， Ｄｅ Ｊｏｎｇ Ａ， Ｍｏｎｔａｌｂａｎ－Ｌｏｐｅｚ Ｍ ｅｔ ａｌ （２０１３） ＢＡＧＥＬ３： ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ ａｎｄ （ｎｏｎ－）ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：Ｗ４４８－Ｗ４５３）を含み、それぞれポリケタイド、ポリケタイドおよびＮＲＰおよびＲｉＰＰに集中する。利用できるｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールの近年の概説については、（Ｗｅｂｅｒ Ｔ （２０１４） Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３０４：２３０－２３５）を参照されたい。本開示の表１は、さらなるＭＧＣ同定アルゴリズムを提示する。

多重遺伝子クラスターの自動的な同定および解析のための最も包括的なコンピューターによるツールは、ａｎｔｉＳＭＡＳＨ（抗生物質および二次代謝物解析シェル－現行バージョン５．０）Ｋａｉ Ｂｌｉｎ， Ｓｉｍｏｎ Ｓｈａｗ， Ｋａｔｈａｒｉｎａ Ｓｔｅｉｎｋｅ， Ｒａｓｍｕｓ Ｖｉｌｌｅｂｒｏ， Ｎａｄｉｎｅ Ｚｉｅｍｅｒｔ， Ｓａｎｇ Ｙｕｐ Ｌｅｅ， Ｍａｒｎｉｘ Ｈ Ｍｅｄｅｍａ， ＆ Ｔｉｌｍａｎｎ Ｗｅｂｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１９））である。加えて、Ｃｉｍｅｒｍａｎｃｉｃら（Ｃｉｍｅｒｍａｎｃｉｃ Ｐ， Ｍｅｄｅｍａ ＭＨ， Ｃｌａｅｓｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ （２０１４） Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｆｒｏｍ ａ ｇｌｏｂａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ． Ｃｅｌｌ １５８：４１２－４２１）は近年、Ｐｆａｍドメイン頻度を中心とした天然物の公知および未知のクラスの両方を同定することができるＨＭＭに基づく確率的アルゴリズムであるＣｌｕｓｔｅｒＦｉｎｄｅｒを開発した。一部の実施形態では、本開示は、ＭＧＣの予測のためにＤｅｅｐＢＧＣを利用する（Ｇｅｏｆｆｒｅｙ Ｄ Ｈａｎｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｄｅｅｐ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ－ｍｉｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４７， Ｉｓｓｕｅ １８， １０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１９， Ｐａｇｅ ｅ１１０を参照）。一部の実施形態では、本開示は、ＭＧＣ予測ステップのために、表１に記載されているツールのいずれかを使用する。

一部の実施形態では、多重遺伝子クラスター予測ステップからの出力は、デジタルメタゲノミクスライブラリー内の複数のコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスターである。一部の実施形態では、結果は、候補抵抗性遺伝子を含むと同様に同定されたＤＮＡ配列である。
近接解析

一部の実施形態では、目的の天然物を同定するための本明細書にて開示される方法は、デジタル処理でアセンブルされた生合成オペロン（単数または複数）を含むコンピューターにより決定された（候補）天然物多重遺伝子クラスター特色セットの閾値パラメーター内に位置している、コンピューターにより決定された（候補）生物学的抵抗性遺伝子に基づき目的の天然物を同定するステップを含む。よって、一部の実施形態では、本開示は、そのクラスター境界内のまたは前記境界の予め選択された閾値内の同定された候補抵抗性遺伝子（すなわち、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子）のうち少なくとも１個を含有する、上に記載されている通りコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター（例えば、ａｎｔｉＳＭＡＳＨまたは等価の解析により同定される通り）を選択する（図６および図８を参照）。

一部の実施形態では、そのクラスター境界内に候補抵抗性遺伝子を含む場合、コンピューターにより決定された多重遺伝子クラスターが選択される。一部の実施形態では、クラスター境界のいずれか一方の１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の内に候補抵抗性遺伝子を含む場合（すなわち、予測されるクラスターの外部）、コンピューターにより決定された多重遺伝子クラスターが選択される。すなわち、クラスターの境界と、候補抵抗性遺伝子の転写開始部位との間に１個またはそれ未満のコンピューターにより予測されるオープンリーディングフレームが存在する場合、クラスターが選択される。一部の実施形態では、クラスター境界のいずれか一方の２個のＯＲＦの内に候補抵抗性遺伝子を含む場合、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスターが選択される。一部の実施形態では、クラスター境界のいずれか一方の３、４、５、６個またはそれよりも多いＯＲＦの内に候補抵抗性遺伝子を含む場合、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスターが選択される。

一部の実施形態では、クラスター境界のいずれか一方の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂ以内の候補抵抗性遺伝子を含む場合（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスターが選択される。すなわち、候補抵抗性遺伝子の開始コドン（ＭＧＣの下流の場合）または停止コドン（ＭＧＣの上流の場合）のいずれかが、クラスター境界のいずれか一方の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂ以内にある場合（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスターが選択される。

一部の実施形態では、結果として生じる選択された天然物多重遺伝子クラスターは、予測信頼度スコアおよび／または配列類似性に従ってさらにフィルタリングまたは優先順位をつけることができる（図６を参照）。例えば、一部の実施形態では、本開示は、配列類似性に基づき配列を複製排除（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｅ）するステップを教示する。一部の実施形態では、本開示は、密接に関係している配列をフィルタリングして取り除くことにより複製排除するステップを教示する（例えば、配列相同性によって）。一部の実施形態では、複製排除または優先順位付けは、生合成遺伝子類似性クラスタリングおよび探査エンジンＢｉＧ－ＳＣＡＰＥ（Ｎａｖａｒｒｏ－Ｍｕｎｏｚ， Ｊ．Ｃ．， Ｓｅｌｅｍ－Ｍｏｊｉｃａ， Ｎ．， Ｍｕｌｌｏｗｎｅｙ， Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １６， ６０－６８ （２０２０））を使用して遂行される。
製造および検証

一部の実施形態では、本開示は、本開示の方法により同定された新たな多重遺伝子クラスターを実験的に検証するステップを想定する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、天然物をコードする（候補／選択された）ＭＧＣまたはそのリファクタリングされたバージョンを含む細胞の製造を教示する。一部の実施形態では、本開示は、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットまたはそのリファクタリングされたバージョンを含む細胞の製造を教示する。一部の実施形態では、製造ステップは、本開示の他のＭＧＣ発見および抵抗性遺伝子発見ワークフローにも適用される。

一部の実施形態では、配列ライブラリーから回収されたＭＧＣ含有配列は、発現のために宿主細胞へと直接的にクローニングすることができる。一部の実施形態では、ＭＧＣは、異なる細胞での発現のためにリファクタリング（ｒｅｆａｃｔｏｒｉｎｇ）（例えば、最適化）される必要がある。当業者であれば、ＭＧＣをリファクタリングする方法を熟知しているであろう。例えば、一部の実施形態では、ＭＧＣをリファクタリングするステップは、コードされた遺伝子をコドン最適化するステップを含む。一部の実施形態では、ＭＧＣをリファクタリングするステップは、宿主細胞におけるより優れた発現のために、１個または複数の調節配列を他の配列に置き換えるステップを含む。一般的なリファクタリング戦略に関するガイダンスは、Ｇａｏ－Ｙｉ Ｔａｎ， Ｔｉａｎｇａｎｇ Ｌｉｕ， Ｒａｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｆａｃｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅ ３９， ２０１７， Ｐａｇｅｓ ２２８－２３６において見出すことができる。
抵抗性遺伝子ワークフロー代替実施形態

上に開示される抵抗性遺伝子ワークフローは、最初に抵抗性遺伝子相同性検索を遂行し、後に多重遺伝子クラスター予測を遂行するという、一般順序に従った。本開示はまた、多重遺伝子クラスター予測が最初に遂行され、抵抗性遺伝子相同性検索が次に遂行されるような、検索順序が反転された実施形態を想定する。実際に、順序を反転することが解析効率を生じ得る、いくつかの実例が存在し得る。例えば、多重遺伝子クラスター予測ツールが、抵抗性遺伝子相同性検索よりもコンピューター的に負荷が少ない場合、最初に多重遺伝子クラスター予測を導くことにより、最初に検索空間を絞り込むことがコンピューター的に効率的であり得る。同様に、ユーザーが、同じデジタルメタゲノミクスライブラリー内の複数の標的抵抗性遺伝子の検索を遂行することを予想する場合、最初にライブラリー全体にわたり網羅的多重遺伝子クラスター解析を遂行し、次いで、それらの同定されたクラスターを使用して、その後の抵抗性遺伝子相同性検索をスピードアップすることがコンピューター的に効率的であり得る。これらのステップの順序を反転することが望ましい、他の状況が生じ得る。あらゆる可能なシナリオを同定するのではなく、本開示は、一部の実施形態では、順序が反転され得ることを単に記述する。
標的化されない抵抗性シグナル多重遺伝子クラスター特色セット発見ワークフロー

天然物コード配列ライブラリーからのＡｇ、薬物および消費製品発見の潜在性は、大部分は未開発のままである。メタゲノムライブラリーは特に、探索されていない遺伝的多様性の豊富な供給源を表す。しかし、これらのメタゲノムライブラリー内に含有される発見されていない天然物の多くは、現存する天然物およびその関連する合成オペロンと有意関係性を欠く、完全に新たな分子であると予想される。本開示のツールは、本セクションにおいて説明される通り、生合成オペロンの保存された構造的特性を活用して、新たな天然物、および可能であれば、その対応する新規抵抗性遺伝子（標的化されない抵抗性シグナル多重遺伝子クラスター特色セット発見プラットフォーム）を同定する。

一部の実施形態では、本開示の標的化されない抵抗性シグナル多重遺伝子クラスター特色セット発見プラットフォームは、次の一般ワークフローに従う：ａ）長いアセンブリーデジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測するステップと、ｂ）予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セット内（または前記クラスターの境界の１～２個のＯＲＦ内）の遺伝子をアノテートするステップと、ｃ）ｉ）予測される生合成機能を有さず、ｉｉ）（必要に応じて）公知の抵抗性遺伝子に対するホモログとして認識されない遺伝子に集中するように、予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セットから、アノテートされた遺伝子をフィルタリングし、これにより、複数のフィルタリングされた目的の遺伝子を産生するステップと、ｄ）複数のフィルタリングされた目的の遺伝子のうち少なくとも１個を含む、１個または複数の天然物多重遺伝子クラスター特色セットを選択し、これにより、候補ＭＧＣ配列のライブラリーを創出するステップ。一部の実施形態では、ワークフローは、ｅ）１個または複数の宿主細胞を製造するステップであって、各製造された宿主細胞が、候補ＭＧＣ配列の中からの天然物多重遺伝子クラスター特色セットを含む、ステップと、ｆ）ステップ（ｅ）の製造された宿主細胞を培養するステップと、ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、製造された宿主細胞中に存在する天然物多重遺伝子クラスター特色セットを欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップとをさらに含む。本ワークフローの各ステップについて、下でより詳細に記述する。

一部の実施形態では、遺伝子は、ａｎｔｉＳＭＡＳＨによって評価される場合、ＭｉＢｉｇにおいて１０、９、８、７、６、５、４、３または２を超えるＢＬＡＳＴヒットを有する場合、生合成機能を有することが予測される。

一部の実施形態では、方法は、生合成オペロン内になく、それに直接隣接してもいない遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。一部の実施形態では、方法は、コア生合成遺伝子の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂまたは１０ｋｂ以内にない遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。一部の実施形態では、方法は、必須遺伝子（例えば、ｗｗｗ．ｅｓｓｅｎｔｉａｌｇｅｎｅ．ｏｒｇに収載される通り）ではない、または必須遺伝子と２５０、２００、１５０、１００もしくは５０よりも低いＢＬＡＳＴ結果ビットスコアを有する遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。一部の実施形態では、方法は、輸送関連または調節遺伝子としてアノテートされる遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。一部の実施形態では、アノテーションは、例えば、ａｎｔｉＳＭＡＳＨを含む、任意のアノテーションエンジンによって取り扱われる。
抵抗性機構によるフィルタリング

抵抗性遺伝子は、種々の抵抗性機構により、天然物に対する抵抗性を分け与えることができる。例えば、図５を参照されたい。あらゆる抵抗性機構の抵抗性遺伝子を有するＭＧＣを同定することが役立ち得るが、一部の適用では、１種または複数の抵抗性機構により機能することが予測されるＭＧＣ／抵抗性遺伝子を検索することが有益であり得る。

したがって、一部の実施形態では、方法は、所望の抵抗性機構とは異なる抵抗性機構を有することが予測される遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。よって、一部の実施形態では、方法は、所望の抵抗性機構とは異なる抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する類似性を示す遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。一部の実施形態では、方法は、所望の抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する類似性を示す遺伝子を除いて全ての遺伝子をフィルタリングするステップを含む。

一部の実施形態では、抵抗性遺伝子機構の決定は、機構毎にｒｅｓｆａｍモデルによる遺伝子の解析により評価される。

一部の実施形態では、所望の抵抗性機構は、標的バリアントに基づく抵抗性である。その理由として、バリアントに基づく抵抗性機構が、コードされる天然物の生物学的標的に関する情報を提供することが挙げられる。すなわち、バリアントに基づく抵抗性遺伝子の存在は、抵抗性遺伝子の非バリアント等価物（すなわち、バリアントが取って代わる遺伝子）が、ＭＧＣによってコードされる天然物の標的である可能性があることを示す。よって、機構によるフィルタリングは、一部の実施形態では、新たに発見された天然物の機能性に関する情報を提供することもできる。
追加的な標的化されないワークフロー

一部の実施形態では、本開示は、予測される抵抗性遺伝子を有する候補多重遺伝子クラスター特色セットを同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、ａ）デジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測するステップと、ｂ）生合成潜在性スコアを多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成潜在性スコアが、遺伝子が生合成酵素であることの計算された尤度に基づく、ステップと、ｃ）必要に応じて、公知の抵抗性遺伝子スコアを多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記公知の抵抗性スコアが、公知の抵抗性遺伝子との遺伝子の共有される配列同一性に基づく、ステップと、ｄ）予測される抵抗性遺伝子を含む候補多重遺伝子クラスター特色セットを選択するステップであって、前記予測される抵抗性遺伝子が、予め設定された組合せスコア閾値を示し、前記組合せスコアが、生合成潜在性スコアおよび公知の抵抗性遺伝子スコア（割り当てられた場合）の組合せに基づく、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、方法は、生合成オペロンスコアを多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成オペロンスコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロンに対する遺伝子の近接に基づき、組合せスコアがまた、生合成オペロンスコアに基づく、ステップを含む。

一部の実施形態では、方法は、コア生合成遺伝子距離スコアを多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記コア生合成遺伝子距離スコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内のコア生合成遺伝子に対する遺伝子の近接に基づき、組合せスコアがまた、コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む。

一部の実施形態では、方法は、必須遺伝子スコアを多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記必須遺伝子スコアが、公知の必須遺伝子配列のリストに対する遺伝子の最高の配列同一性に基づき、組合せスコアがまた、必須遺伝子スコアに基づく、ステップを含む。一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、必須遺伝子と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％の配列同一性を共有する。

一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、公知の抵抗性遺伝子と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％未満の配列同一性を共有する。

一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、公知の抵抗性遺伝子と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％超の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、この戦略は、抵抗性遺伝子ワークフローのさらなる絞り込み／改善を表す。

一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、生合成酵素と９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％未満の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、生合成酵素は、予測される抵抗性遺伝子を含有する多重遺伝子クラスター特色セットによってコードされる天然物のための生合成酵素である。一部の実施形態では、生合成酵素は、多重遺伝子クラスター特色セット（例えば、ＭｉＢｉｇ）によってコードされる天然物に関連する生合成酵素である。一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、ａｎｔｉｓｍａｓｈによって評価される場合、ｍｉＢＩＧにおける８、６、４または２未満のＢＬＡＳＴヒットを返す。

一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、組合せスコアを有し、それぞれ公知の生合成酵素または公知の抵抗性遺伝子と比較した場合、遺伝子が生合成酵素であることの計算された尤度は低く、公知の抵抗性遺伝子との共有される配列同一性は低い。一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、組合せスコアを有し、それぞれ公知の生合成酵素または公知の抵抗性遺伝子と比較した場合、遺伝子が生合成酵素であることの計算された尤度は低く、公知の抵抗性遺伝子との共有される配列同一性は高い。

一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロン内にまたはそれに直接隣接して位置する（すなわち、その間に他のＯＲＦがない）。一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セットに含有される生合成オペロンの内部にまたは生合成オペロンの５００ｂｐ以内に位置する。

一部の実施形態では、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子は、コア生合成酵素の１ｋＢ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂまたは５ｋｂ以内に位置する。

一部の実施形態では、方法は、輸送遺伝子潜在性スコアを多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記輸送遺伝子潜在性スコアが、輸送関連遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、組合せスコアがまた、コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む。一部の実施形態では、輸送遺伝子潜在性は、ａｎｔｉＳＭＡＳＨ等のアノテーションエンジンにより評価される。

一部の実施形態では、方法は、調節遺伝子潜在性スコアを多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記調節遺伝子潜在性スコアが、調節遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、組合せスコアがまた、コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む。一部の実施形態では、調節遺伝子潜在性は、ａｎｔｉＳＭＡＳＨ等のアノテーションエンジンにより評価される。

一部の実施形態では、方法は、抵抗性機構スコアを多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、所望の抵抗性機構とは異なる抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、組合せスコアがまた、抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む。

一部の実施形態では、方法は、抵抗性機構スコアを多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、所望の抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、組合せスコアがまた、抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む。

一部の実施形態では、所望の抵抗性機構は、標的バリアントに基づく抵抗性である。
ＭＧＣをコンピューターにより予測する

一部の実施形態では、標的化されない抵抗性シグナル多重遺伝子クラスター特色セット発見プラットフォームは、ａ）長いアセンブリーデジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測するステップを含む。一部の実施形態では、本ステップは、ヘッダー「多重遺伝子クラスター予測」の下に、上に記載されている通りに遂行される。手短に説明すると、デジタルメタゲノミクスライブラリー内の配列は、ＭＧＣ予測アルゴリズムにより解析されて、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを同定する。一部の実施形態では、天然物多重遺伝子クラスター特色セットの同定は、ａｎｔｉＳＭＡＳＨにより為される。
ＭＧＣ特色セット内の遺伝子をアノテートする

一部の実施形態では、標的化されない抵抗性シグナル多重遺伝子クラスター特色セット発見プラットフォームは、ｂ）予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セット内（または前記クラスターの境界の１～２個のＯＲＦ内）の遺伝子をアノテートするステップを含む。様々なアノテーション（例えば、調節または輸送遺伝子）に基づく、他のフィルタリングステップも列挙される。一部の実施形態では、予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セットのアノテーションは、１種または複数のアノテーションエンジンを使用して、公知の遺伝子に対するＭＧＣにおける配列の相同性に基づき為される。

一部の実施形態では、アノテーションは、ａｎｔｉＳＭＡＳＨにより遂行され、そのＭＧＣ同定もまた、各ＭＧＣ内の遺伝子のアノテーションを含む。一部の実施形態では、アノテーションステップは、公開データベースに含有される公知の生合成酵素と、ＭＧＣ内の配列との比較により為される。

例えば、一部の実施形態では、アノテーションは、ＭＩＢｉＧ（／／ｍｉｂｉｇ．ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄ）等、天然物遺伝子クラスターの公開データベースに含有される生合成酵素に対する相同性に基づく。よって、一部の実施形態では、ＭＩＢｉＧデータベース由来の生合成酵素のアミノ酸配列は、アノテーション「生合成」および「生合成－追加的」により問い合わされ、配列ｇｅｎｂａｎｋファイルから抽出される。アミノ酸配列の結果として生じるセットは、ＣＤ－ＨＩＴを使用してクラスター化されて、冗長性を低下させる。一部の実施形態では、アミノ酸配列の結果として生じる非冗長性セットは、生合成酵素ホモログを同定するために、ＭＧＣ内の配列のより大型のセットに対する問い合わせに使用することができる生合成酵素データベースを表す。

当業者であれば、本開示のワークフローと適合性の様々な他の遺伝子アノテーションツールを熟知しているであろう。アノテーションツールの非限定的なリストを、下に表３として提示する。
表３－配列アノテーションツールの非限定的なリスト

生合成遺伝子をフィルタリングして取り除く

一部の実施形態では、標的化されない抵抗性シグナル多重遺伝子クラスター特色セット発見プラットフォームは、ｃ）ｉ）予測される生合成機能を有さず、ｉｉ）（必要に応じて）公知の標的抵抗性遺伝子に対するホモログでもない、遺伝子に集中するように、予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セットから、アノテートされた遺伝子をフィルタリングし、これにより、複数のフィルタリングされた目的の遺伝子を産生するステップを含む。
生合成的役割を有さない遺伝子

よって、一部の実施形態では、本開示は、予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セットから遺伝子をフィルタリングして取り除くステップであって、前記フィルタリングして取り除かれた（すなわち、考慮から除去された）遺伝子が、アノテーションステップによって、生合成的役割を有するとアノテートされた、ステップを教示する。
一部の実施形態では、方法は、生合成オペロン内になく、それに直接隣接してもいない遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。一部の実施形態では、方法は、コア生合成遺伝子の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂまたは１０ｋｂ以内にない遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。一部の実施形態では、方法は、必須遺伝子（例えば、ｗｗｗ．ｅｓｓｅｎｔｉａｌｇｅｎｅ．ｏｒｇに収載される通り）ではない、または必須遺伝子と２５０、２００、１５０、１００もしく５０よりも低いＢＬＡＳＴ結果ビットスコアを有する、遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。一部の実施形態では、方法は、輸送関連または調節遺伝子としてアノテートされる遺伝子をフィルタリングして取り除くステップを含む。
他のＭＧＣにおける公知の標的抵抗性遺伝子のホモログではない遺伝子。

一部の実施形態では、本開示は、予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セットから遺伝子をフィルタリングして取り除くステップであって、前記フィルタリングして取り除かれた（すなわち、考慮から除去された）遺伝子が、他のＭＧＣにおける公知の標的抵抗性遺伝子のホモログである、ステップを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示は、ＭＧＣ内の遺伝子を、公知の標的抵抗性遺伝子のリストと比較するステップと、そのホモログを同定するステップとを教示する。

一部の実施形態では、公知の標的抵抗性遺伝子のリストは、標的タンパク質のバリアントをコードすることによって抵抗性をもたらさない抵抗性遺伝子を含むＲｅｓＦａｍデータベース由来のＲｅｓＦａｍに由来する。一部の実施形態では、抵抗性遺伝子のデータベースは、Ｄａｎｔａｓ Ｌａｂ Ｒｅｓｆａｍ（Ｇｉｂｓｏｎ ＭＫ， Ｆｏｒｓｂｅｒｇ ＫＪ， Ｄａｎｔａｓ Ｇ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔｏｍｅｓ ｃｌｕｓｔｅｒ ｂｙ ｅｃｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ＩＳＭＥ Ｊｏｕｒｎａｌ． ２０１４， ｄｏｉ：ＩＳＭＥＪ．２０１４．１０６）を含む。一部の実施形態では、相同性の評価は、標的抵抗性に基づき候補抵抗性遺伝子の同定と同じ様式で遂行される（すなわち、ヘッダー「抵抗性遺伝子相同性検索」の下に、本文書に記載されている通り）。手短に説明すると、相同性は、配列同一性、配列類似性に基づき、および／またはＨＭＭ予測モデルにより、決定することができる。
一部の実施形態では、配列は、公知の抵抗性遺伝子と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超の配列同一性を共有する場合（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）、公知の抵抗性遺伝子のホモログと考慮される。一部の実施形態では、その候補抵抗性ビットスコアの最良のマッチのビットスコアに対する比が、０．６、０．７、０．８または０．９（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）を超える場合、配列は、公知の抵抗性遺伝子のホモログと考慮される。
クラスターにおける少なくとも１種の生合成遺伝子／酵素と同時調節される遺伝子

一部の実施形態では、本開示は、追加的なステップである、ｃ）ｉｉｉ）予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セットから、アノテートされた遺伝子をフィルタリングして、予測される生合成機能がない遺伝子であって、また、予測される生合成機能を有する多重遺伝子クラスター特色セット内の別の遺伝子と同時調節される遺伝子を含む遺伝子のみを残すステップをさらに教示する。一部の実施形態では、本開示は、天然物多重遺伝子クラスター特色セットの生合成遺伝子のうち少なくとも１種と同時調節される遺伝子に集中するように、遺伝子をフィルタリング除去するステップをさらに教示する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、複数のフィルタリングされた目的の遺伝子が、天然物多重遺伝子クラスター特色セットにおける少なくとも１種の生合成遺伝子／酵素と同時調節されることを教示する。

一部の実施形態では、本開示は、天然物多重遺伝子クラスター特色セットの生合成遺伝子のうち少なくとも１種と同時調節される遺伝子に集中するように、生合成オペロン内になく、それに直接隣接してもいない遺伝子をフィルタリング除去するステップをさらに教示する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、複数のフィルタリングされた目的の遺伝子が、天然物多重遺伝子クラスター特色セットにおける少なくとも１種の生合成遺伝子／酵素と同時調節される（例えば、生合成オペロンにより）ことを教示する。

当業者であれば、２種の遺伝子が同時調節されるか否か経験的に決定するまたはコンピューターにより予測する様々な仕方に気づくであろう。例えば、一部の実施形態では、多重遺伝子クラスターの構造が、２種の遺伝子が同時調節されることを示す（例えば、遺伝子が、オペロン内に含まれる、または予測されるポリシストロニックｍＲＮＡの一部である場合、２種の遺伝子は、同時調節されると考慮されるであろう。一部の実施形態では、第１の遺伝子の発現が、第２の遺伝子の産生と相関すると経験的に決定される場合（例えば、両方の遺伝子が、同様の条件下で活性化／抑圧される場合）、２種の遺伝子は、同時調節されると考慮されるであろう。一部の実施形態では、それらのプロモーターが、同じ転写因子に結合することが予測されるまたは示される結合部位を含有する場合、２種の遺伝子は、同時調節されると考慮されるであろう。

一部の実施形態では、結果として生じる複数のフィルタリングされた目的の遺伝子は、複数のフィルタリングされた目的の遺伝子のうち少なくとも１個を含む、１個または複数の天然物多重遺伝子クラスター特色セットを選択するために使用され、これにより、候補ＭＧＣ配列のライブラリーを創出する。
推移的な多重遺伝子クラスター特色セット発見ワークフロー

一部の実施形態では、本開示は、新規天然物コード多重遺伝子クラスターを同定する推移的な方法を教示する。一部の実施形態では、本開示の推移的な方法は、公知の／予測される目的のＭＧＣの特色に基づく、ＭＧＣの水平探索を表す。推移的な検索は、一部には、公知のＭＧＣのホモログ／オルソログが、宿主細胞のゲノムの他の部分に、または異なる微生物種に存在し得るという発明者の発見に基づいており、前記ホモログ／オルソログは、本来の公知のＭＧＣの象徴的な抵抗性遺伝子を欠く、または本来の遺伝子と殆ど類似点がない抵抗性遺伝子を含有する。

よって、一部の実施形態では、本開示は、候補多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、ａ）公知のまたは予測されるＭＧＣの配列を提供するステップと、ｂ）長いアセンブリーデジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測し、前記予測の出力を、複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットとして供給するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）の複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットの中から候補ＭＧＣを選択するステップであって、前記候補ＭＧＣが、ｉ）公知のまたは予測されるＭＧＣおよび候補ＭＧＣ内の生合成酵素の間の配列相同性；ｉｉ）公知のまたは予測されるＭＧＣおよび候補ＭＧＣ内の同数の各型の生合成モジュール；ならびにｉｉｉ）公知の／予測されるＭＧＣおよび候補ＭＧＣによって産生される天然物の予測される化学構造の類似性によって決定される、公知のまたは予測されるＭＧＣとの類似性からなる群より選択される少なくとも１種の類似性因子を含み、これにより、抵抗性遺伝子をコードしない、または本来の遺伝子に似ていない抵抗性遺伝子を含有する候補ＭＧＣを同定する、ステップとを含む方法を教示する。一部の実施形態では、類似性因子（ｉ）のみが使用される。一部の実施形態では、ＭＧＣは、少なくとも２種の類似性因子（例えば、（ｉ）と（ｉｉ）、または（ｉ）と（ｉｉｉ）、または（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を含む）を含むものに基づき選択される。

一部の実施形態では、新規候補ＭＧＣの推移的な（水平）検索は、公知のまたは予測されるＭＧＣに対するＭＧＣ候補の類似性に基づく。すなわち、一部の実施形態では、本開示の方法は、「公知のまたは予測されるＭＧＣの配列を提供する」ステップを含む。一部の実施形態では、公知のＭＧＣは、天然物を産生することが実験的に検証および実証されたＭＧＣである（例えば、方法を実行する人物によって保持されるもしくは公知である経験的データにより、または学術誌に報告される通り）。一部の実施形態では、予測されるＭＧＣは、本開示のＭＧＣ発見方法のうちいずれか１種によって天然物をコードすることが予測されるＭＧＣである。一部の実施形態では、予測されるＭＧＣは、ｉ）抵抗性遺伝子を含み、ｉｉ）本文書の「多重遺伝子クラスター予測」セクションにおいて記述される通り、少なくとも一部には、ＰＫＳ、ＮＲＰ、ＲｉＰＰ等、ＭＧＣ特色の存在に基づき多重遺伝子クラスターをコードすると同定される、ＭＧＣである。

一部の実施形態では、本推移的な検索ワークフローは、公知のまたは予測されるＭＧＣとの類似性因子を含む候補ＭＧＣを同定するステップを含む。一部の実施形態では、公知のまたは予測されるＭＧＣとの類似性は、クラスターにおける生合成酵素の間の配列相同性によって決定される（例えば、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭによって、またはａｎｔｉＳＭＡＳＨアノテーションエンジン等の他のツールによって決定される通り）。一部の実施形態では、公知のまたは予測されるＭＧＣとの類似性は、クラスターにおけるコア生合成酵素の間の配列相同性によって決定される（例えば、候補ＭＧＣにおけるＡＣＡＤは、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＨＭＭによって決定され、下でより詳細に記述される通り、公知のまたは予測されるＭＧＣにおけるＡＣＡＤに対して有意な類似性を有する）。一部の実施形態では、本開示は、候補ＭＧＣが、公知のまたは予測されるＭＧＣの生合成酵素の全てに対するホモログを含有するであろうことを教示する。一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、公知のまたは予測されるＭＧＣの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９種の生合成酵素に対するホモログを含有する。一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、公知のまたは予測されるＭＧＣの生合成酵素の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）に対するホモログを含有する。

一部の実施形態では、生合成遺伝子／酵素は、生化学的合成反応を触媒することができる、または反応を触媒する複合体の一部である、発現されたタンパク質（または文脈に応じて、これをコードする核酸配列）を含む。すなわち、単独では触媒活性を有さないが、生化学的反応を触媒することができる１種または複数の他の酵素と複合体形成する配列は、生合成酵素と考慮される。例えば、タンパク質ＴｆｕＡは、それ自体では触媒活性を有さないが、天然物の産生においてＹｃａＯと複合体形成する。一部の実施形態では、生合成酵素は、１種または複数のアノテーションエンジンによって同定される。一部の実施形態では、遺伝子は、ａｎｔｉＳＭＡＳＨによってそのようなものとしてアノテートされる場合、生合成遺伝子／酵素と考慮される。一部の実施形態では、遺伝子は、ＭｉＢＩＧデータベースにおいてそのようなものとして収載される場合、生合成遺伝子／酵素と考慮される。

一部の実施形態では、本開示は、候補ＭＧＣが、公知のまたは予測されるＭＧＣのコア生合成酵素の全てに対するホモログを含有するであろうことを教示する。当業者であれば、関連ＭＧＣを定義する遺伝子を容易に同定することができるであろう（すなわち、「コア生合成酵素」を同定すること）。一部の実施形態では、「コア生合成酵素」は、ＭＧＣによって変動する。例えば、一事例では、これは、分子足場を生成する２種の生合成酵素であり得る。別の事例では、これは、コア生合成酵素と特有の前駆体を利用することに関与する酵素の存在であり得る。別の事例では、特徴的改変を触媒するテーラリング酵素は、クラスターに特徴的なものであり得る。一部の実施形態では、遺伝子は、アノテーションエンジンによってそのようなものとしてアノテートされる場合、「コア生合成酵素」と考慮される。一部の実施形態では、遺伝子は、ａｎｔｉＳＭＡＳＨによってそのようなものとしてアノテートされる場合、「コア生合成酵素」と考慮される。本開示は、「コア生合成」酵素または遺伝子を同定する方法を教示する。一部の実施形態では、コア生合成遺伝子は、天然物の産生において生合成的役割を有し、分子のクラスの全てのメンバーによっては共有されない分子の構造または機能に決定的な部分を形成する、ＭＧＣ内の酵素をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、これらの酵素は、足場または弾頭のいずれかを産生する。例えば、エポキソミシンクラスターにおいて、ＡＣＡＤ遺伝子は、これらのうちの１つとなるであろう（分子機能に不可欠なエポキシケトンを形成する）が、ＮＲＰＳ遺伝子は、そうならないであろう（ＮＲＰＳ遺伝子は、全ＮＲＰＳクラスターの間で共有される）。一部の実施形態では、これらの酵素は、標的結合および薬物動態特性に影響し得るが、明らかな構造的足場または弾頭を形成しない、官能基および部分を導入するテーラリング酵素である。例としては、チオアミド形成を触媒するＴｆｕＡ遺伝子、およびチオビリダミド生合成におけるセリン／スレオニン脱水を触媒するＨｏｐＡ１様遺伝子がある。これらは両者共に、いくつかの非チオビリダミドクラスターが有するテーラリング反応である（準特有）が、２種の交差は、チオビリダミド様クラスターを大いに富化するであろう。

一部の実施形態では、「コア生合成」酵素のさらなる選択は、ＮＰの産生に重要であり、目的のＮＰ内で富化されるまたは特有であると考えられる酵素の存在についてフィルタリングすることにより、ユーザーが、候補ＭＧＣのプールを、目的のＮＰをコードする可能性が最も高いものへとさらに富化することを可能にする。一部の実施形態では、「コア生合成」酵素として認定しないであろう酵素は、一般的な生合成またはテーラリングの酵素である。一般的な生合成酵素は、代謝物のクラスのためのクラス定義足場を建設する酵素である。例としては、ＩＩＩ型ＰＫＳにおけるカルコン／スチルベンシンターゼ遺伝子がある。一般的なテーラリング酵素は、クラス定義官能基を建設する酵素である。例としては、Ｏ－メチルトランスフェラーゼまたはヒドロキシラーゼがある。これらは、多くの異なるクラスターにわたり共通するのみならず、クラスターアナログにおけるそれらの存在は、多くの場合、信頼度できない。よって、一部の実施形態では、一般的な生合成およびテーラリングの酵素は、個別に、候補ＭＧＣのプールを、目的のＮＰをコードするものについて富化するとは予想されないであろう（例えば、初期の公知のまたは予測されるＭＧＣによってコードされるものと同様のＮＰをコードする推移的な検索の場合）。用語「コア生合成酵素」は、用語「コア生合成遺伝子」と互換的に使用される。

一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、公知のまたは予測されるＭＧＣの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９種のコア生合成酵素に対するホモログを含有する。一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、公知のまたは予測されるＭＧＣのコア生合成酵素の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）に対するホモログを含有する。

一部の実施形態では、相同性の評価は、標的抵抗性に基づき、候補抵抗性遺伝子の同定と同じ様式で遂行される（すなわち、ヘッダー「抵抗性遺伝子相同性検索」の下に、本文書に記載されている通り）。手短に説明すると、相同性は、配列同一性、配列類似性に基づき、および／またはＨＭＭ予測モデルにより、決定することができる。

一部の実施形態では、配列は、初期の公知のまたは予測されるＭＧＣの生合成遺伝子／酵素と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超の配列同一性を共有する場合（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）、生合成またはコア生合成遺伝子／酵素のホモログと考慮される。一部の実施形態では、その候補抵抗性ビットスコアの最良のマッチのビットスコアに対する比が、０．６、０．７、０．８または０．９（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）を超える場合、配列は、公知の抵抗性遺伝子のホモログと考慮される。

一部の実施形態では、本開示は、新たなＭＧＣを同定するために使用することができる、公知のまたは予測されるＭＧＣとの追加的な類似性因子を教示する。一部の実施形態では、類似性は、両方のクラスターにおける遺伝子の同様の相補体を同定することにより決定される（例えば、両方のクラスターにおけるコードされるテーラリング酵素の同じセット）。

一部の実施形態では、遺伝子の同様の相補体は、候補ＭＧＣが、公知のまたは予測されるＭＧＣにおいて同数（またはプラスマイナス１～２個）の各型の生合成モジュールを含有することを意味する。例えば、候補ＭＧＣは、３個のＰＫＳ様モジュールおよび４個のＮＲＳ様モジュールを有した場合、遺伝子の同様の相補体を有し、予測されるＭＧＣは、３個のＰＫＳ様モジュールおよび３個のＮＲＳ様モジュールを有した。

一部の実施形態では、公知のまたは予測されるＭＧＣとの類似性は、公知の／予測されるＭＧＣおよび候補ＭＧＣによって産生される天然物の予測される化学構造の類似性によって決定される。当業者であれば、ＭＧＣから化学構造を予測する仕方に気づくであろう。ＭＧＣからＮＰ化学構造を予測することができるツールの非限定的なリストは、下の表４に提示する。遺伝子配列からの化学構造解明についての追加的な記述は、本文書の「構造解明－ 遺伝子から化学へ」セクションに提示する。
表４－化学構造予測ツールの非限定的なリスト

一部の実施形態では、予測される化学構造の類似性は、ヒトの点検によって為される。よって、一部の実施形態では、２種の予測される化学構造は、同じコア構造エレメントを共有する場合、同様であると考慮されるであろう。他の実施形態では、化学構造類似性は、Ｎｉｋｏｌｏｖａ， Ｎ． ａｎｄ Ｊａｗｏｒｓｋａ， Ｊ． （２００３）， Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｍｅａｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ－ ａ Ｒｅｖｉｅｗ． ＱＳＡＲ Ｃｏｍｂ． Ｓｃｉ．， ２２： １００６－１０２６に開示される方法を含む、当業者にとって公知の任意のアルゴリズム／コンピューターによる方法によって決定される。

一部の実施形態では、ＮＰの構造的類似性は、Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数に基づき、ｐｙｔｈｏｎライブラリーＲＤＫｉｔ（ｗｗｗ．ｒｄｋｉｔ．ｏｒｇ）を使用して、ＮＰ対応フィンガープリントからペアワイズＮＰ構造類似性を計算することにより評価される。手短に説明すると、ｍｏｒｇａｎフィンガープリントは、複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セット（例えば、ａｎｔｉＳＭＡＳＨによって同定されたＭＧＣ）によって、合成された（または合成されることが予測される）ＮＰのため、および合成された（または合成されることが予測される）ＮＰ（複数）のために調製される。次いで、これらのフィンガープリントが比較されて、最も類似したＮＰ構造およびその対応する候補ＭＧＣを同定する。

一部の実施形態では、Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数は、二分変数のための式により計算される。

一部の実施形態では、Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数は、連続型変数のための次式を使用して計算される。

式中、分子ＡおよびＢの間のＳ_ＡＢ類似性スコアは、２種の分子の間で共通した「Ｃ」特色を、「Ａ」第１の分子の特色、プラス「Ｂ」第２の分子の特色、マイナスＣで割ることにより計算される。すなわち、Ａは、分子Ａにおけるオン（ｏｎ）ビットの数であり、Ｂは、分子Ｂにおけるオンビットの数であり、一方、Ｃは、両方の分子におけるオンであるビットの数である。ｘ_ｊＡは、分子Ａのｊ番目の特色を意味する。ｘ_ｊＢは、分子Ｂのｊ番目の特色を意味する。Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数を計算する仕方に関するさらなる情報については、Ｂａｊｕｓｚ， Ｄ．， Ｒａｃｚ， Ａ． ＆ Ｈｅｂｅｒｇｅｒ， Ｋ． Ｗｈｙ ｉｓ Ｔａｎｉｍｏｔｏ ｉｎｄｅｘ ａｎ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｈｏｉｃｅ ｆｏｒ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ－ｂａｓｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ？． Ｊ Ｃｈｅｍｉｎｆｏｒｍ ７， ２０ （２０１５）を参照されたい。

一部の実施形態では、Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数は、０～１の範囲に及び、０は類似性なしであり、１は同一分子である。一部の実施形態では。一部の実施形態では、２種の天然物構造は、少なくとも０．６、０．７、０．８、０．９または０．９５（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）のＴａｎｉｍｏｔｏ類似性係数を有する場合、同様であると考慮される。

一部の実施形態では、類似性は、上に記載されている２種またはそれよりも多い方法の組合せによって評価される（例えば、全てのもしくはコア生合成酵素の間の配列相同性によって、両方のＭＧＣにおいて遺伝子の同様の相補体を含有することによって、または予測される化学構造の類似性によって）。一部の実施形態では、本開示の推移的な検索は、候補ＭＧＣがその境界内に抵抗性遺伝子を欠くにもかかわらず、推定上の機能をこのＭＧＣに割り当てることができる。

一部の実施形態では、本開示は、改変された推移的なＭＧＣ発見ワークフローを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、候補多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、ａ）公知のまたは予測されるＭＧＣの生合成遺伝子／酵素を同定するステップと、ｂ）デジタルメタゲノミクスライブラリーを、（ａ）において同定された生合成遺伝子／酵素のそれぞれのホモログについて問い合わせるステップであって、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、デジタル処理でアセンブルされたコンティグを含む、ステップと、ｃ）デジタルメタゲノミクスライブラリーの単一のコンティグ内の生合成酵素のホモログの存在に基づき、新たな候補ＭＧＣを同定するステップとを含む方法を教示する。一部の実施形態では、本ワークフローの生合成遺伝子／酵素は、本文書の上に記載されている通り、コア生合成遺伝子／酵素である。

一部の実施形態では、本開示は、候補多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、ａ）コア生合成遺伝子／酵素のセットを有する公知のまたは予測されるＭＧＣを提供するステップと、ｂ）デジタルメタゲノミクスライブラリーを、（ａ）のコア生合成遺伝子／酵素のそれぞれのホモログについて問い合わせるステップであって、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、デジタル処理でアセンブルされたコンティグを含む、ステップと、ｃ）デジタルメタゲノミクスライブラリーの単一のデジタル処理でアセンブルされたコンティグ内のコア生合成遺伝子／酵素のそれぞれのホモログの存在に基づき、新たな候補ＭＧＣを同定するステップとを含む方法を教示する。一部の実施形態では、本ワークフローの生合成遺伝子は、本文書の上に記載されている通り、コア生合成遺伝子／酵素である。

本開示の本セクションは、デジタルメタゲノミクスライブラリーの単一のコンティグ内の生合成酵素のホモログの存在に基づく新たな候補ＭＧＣの同定について記載する。一部の実施形態では、本開示は、公知のまたは予測されるＭＧＣの生合成酵素の全てに対するホモログを含有する候補ＭＧＣの同定を教示する。一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、公知のまたは予測されるＭＧＣの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９種の生合成酵素（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）に対するホモログを含有する。一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、公知のまたは予測されるＭＧＣの生合成酵素の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）に対するホモログを含有する。

一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、公知のまたは予測されるＭＧＣの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９種のコア生合成酵素（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）に対するホモログを含有する。一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、公知のまたは予測されるＭＧＣのコア生合成酵素の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）に対するホモログを含有する。

よって、一部の実施形態では、本開示は、デジタル処理でアセンブルされたコンティグを、公知のまたは予測されるＭＧＣの生合成またはコア生合成遺伝子／酵素に対するホモログの存在についてスクリーニングするステップを教示する。一部の実施形態では、生合成遺伝子またはコア生合成遺伝子／酵素のホモログは、１つずつ同定され、次いで、第２のステップは、同定されたホモログが、単一のコンティグにあること（すなわち、ホモログの少なくとも１個の完全「セット」が、デジタル処理でアセンブルされたコンティグ内にあること）を確認する。他の実施形態では、生合成遺伝子またはコア生合成遺伝子／酵素のホモログが検索され、単一のステップで、単一のデジタル処理でアセンブルされたコンティグにあることが確認される。

一部の実施形態では、生合成遺伝子またはコア生合成遺伝子／酵素の相同性は、本開示および特に本セクションの他の相同性ステップと同じ仕方で遂行される（すなわち、配列同一性によってまたはＨＭＭによって、上に記載されているカットオフによって）。一部の実施形態では、Ｍｕｌｔｉ－ＧｅｎｅＢｌａｓｔ等のツールが使用される（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３６７０７３７／）。

一部の実施形態では、本開示の推移的な検索方法は、本文書に開示される他のＭＧＣ発見プラットフォームのいずれかに従って遂行される。よって、一部の実施形態では、推移的な検索を使用して、上に記述されている抵抗性遺伝子に基づく検索方法により同定されたＭＧＣに基づき追加的な候補ＭＧＣを同定することができる。一部の実施形態では、推移的な検索方法を使用して、文献において報告された公知のクラスターに基づき追加的な関連ＭＧＣを同定することができる、または本明細書で開示されていない他の方法により他の仕方で同定される。
ＨＭＭの構築

本文書に記載されている相同性検索のうちいくつかは、ＨＭＭ検索により遂行することができる。一部の実施形態では、ＨＭＭ検索は、ＰｆａｍおよびＴＩＧＲｆａｍにおいて利用できるＨＭＭモデル等、現存するＨＭＭモデルに基づく。他の実施形態では、本開示は、候補ホモログ遺伝子を検索するように設計された新たなＨＭＭを構築する方法を教示する。候補ホモログ遺伝子を検索するためのカスタムＨＭＭを構築する方法について、下でより詳細に記述する。

本開示は、一部の実施形態では、候補ホモログ遺伝子の予測のために隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を活用する方法およびシステムを提供する（例えば、候補抵抗性遺伝子、または公知の機能を有する遺伝子に対する相同性によるアノテーションの目的で）。しかし、簡素にするために、以下のセクションは、標的遺伝子／タンパク質に対するホモログを同定するためのＨＭＭの使用について総括的に言及する。

次に、本方法およびシステムにおける使用のためのＨＭＭを生成するための例示的なワークフローを提供する。一部の実施形態では、ＨＭＭ生成ワークフローは、次のステップを含む：

１）標的抵抗性遺伝子に対応する訓練データセットにおいて使用されるべき配列を同定する；

２）配列を整列する；

３）整列を評価する；

４）多重配列整列からＨＭＭ予測的機械学習モデルを生成する；

５）ＨＭＭを評価する。

これらの例示的なステップのそれぞれについて、本明細書で詳しく述べる。
１．訓練データセットにおいて使用されるべき配列を同定する

所与の配列が、標的遺伝子／タンパク質に対するホモログであるか否かに関して予測するためのＨＭＭを構築するために、所望の特性を示す（すなわち、標的抵抗性遺伝子の属に属する等、目的のアノテーションカテゴリーに属することが決定された）標的配列（少なくとも１個）のセットを得る必要がある。これは、本方法およびシステムにおいて機械学習モデル（例えば、ＨＭＭ）を訓練するために使用される初期訓練データセットである：データセットは、入力遺伝的データ（核酸および／またはアミノ酸配列）および出力表現型データ（配列が所望の機能を果たす）を含む。リストは、所望の機能を有すると同定された現存するオルソロジー群（例えば、ＫＥＧＧオルソロジー群）から、またはＵｎｉｐｒｏｔにおける所望の機能を果たす配列を同定し、当該配列のホモログを見出すことにより（例えば、前記ホモログの発表された検証の再調査により、または伝統的ＢＬＡＳＴ方法により）生成することができる。一部の実施形態では、リストは、公開配列データベースからコンパイルすることができる。一部の実施形態では、リストは、独自データベースからコンパイルすることができる。一部の実施形態では、リストは、商業的データベースからコンパイルすることができる。一部の実施形態では、リストは、検証実験等、経験的データからコンパイルすることができる。

一部の実施形態では、本開示は、モデルに、所望の機能、すなわち、標的タンパク質機能を果たすタンパク質をコードする多様な配列、または所望の機能、すなわち、標的遺伝子機能を果たす遺伝子をコードする多様な配列を提供することにより、ＨＭＭの予測能力を改善することができることを教示する。非常に同様の配列セットは、ＢＬＡＳＴと同様に、同様の配列を同定するようにＨＭＭを訓練することができる。多様な配列は、ＨＭＭが、いずれの位置（例えば、アミノ酸）を変動し得るか、およびいずれが保存に重要であるかについて捕捉することを可能にする。一部の実施形態では、所望の標的機能を果たすことが合理的に予想される、可能な限り多くの配列を含むことが望ましい。

一部の実施形態では、本開示は、訓練データセットにおける配列が、１種または複数の配列特色を共有するべきであることを教示する。訓練データセットにおける配列は、いかなる共通配列特色も共有しない場合、オルソログでない可能性が高く、訓練データセットから除外されるべきである。一部の実施形態では、本開示は、高い信頼度の訓練データセットにおいてもっぱら訓練される一次ＨＭＭ、および所望の機能を有するが、訓練データセットの残りの内に存在する配列特色の多くを共有しないと考えられる外れ値配列等、より寛大なガイドラインにより選択される配列において訓練される別々のＨＭＭの創出を教示する。これは、ユーザーが、高いｖｓ．低い信頼度の訓練データにより結果を解析することを可能にし、任意の下流解析に柔軟性を提供する。

説明目的のため、配列の初期訓練データセットの同定のためのガイダンスは、標的タンパク質Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼに適用される。これらのステップは、個人によって追跡され得る、または方法またはシステムの一部としてソフトウェアへとプログラムされ得る。標的タンパク質Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼのために初期配列訓練データセットを見出すために、例えば、次の通り、所望の機能をアノテートされた現存するオルソロジー群を探すことにより開始することができる：
ａ．ＫＥＧＧオルソロジーデータベースを所望の用語について検索する（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ－ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｆｉｎｄ＿ｓｕｂ？ｍｏｄｅ＝ｂｆｉｎｄ＆ｍａｘ＿ｈｉｔ＝１０００＆ｄｂｋｅｙ＝ｋｅｇｇ＆ｋｅｙｗｏｒｄｓ＝Ｏ－ａｃｅｔｙｌｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ＋ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ）。
ｂ．ＫＥＧＧオルソロジーリンクを選択する。
ｃ．Ｇｅｎｅｓまでスクロールダウンし、Ｕｎｉｐｒｏｔリンクを選択して、この機能のためのＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのリストを得る。
ｄ．ＥｘｃｅｌにＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのリストをカットアンドペーストして、記載とは別にＩＤの欄を得る。
ｅ．ＵｎｉｐｒｏｔにおけるＲｅｔｒｉｅｖｅ／ＩＤに進む。
ｆ．ステップ（ｅ）において読み出されたＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのセットをペーストする。これは、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリーのリストを返す。ダウンロードリンクを選択して、ＦＡＳＴＡフォーマットでこれらのエントリーのリスト配列を読み出す。

例えば、次の通り、Ｕｎｉｐｒｏｔを所望の配列について検索することにより初期訓練データセットをコンパイルすることも可能である：
ａ．任意の生物、例えば、目的の生物における標的タンパク質の機能を果たすタンパク質についてＵｎｉｐｒｏｔＫＢを検索する。この例のため、検索は、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ａ４ＷＱＬ８に見出される例示的なＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼにより始める。
ｂ．左上隅に、完全ＵｎｉｐｒｏｔＫＢに対してこの配列のＢＬＡＳＴ検索を行うためのボタンがある。これをクリックし、さらなるオプションを選択する。
ｃ．Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを０．１に、Ｈｉｔｓを１０００に設定する；これは、非常に異なる配列を除去しつつ、多数のヒットをもたらす。次いで、検索をランする。検索の完了には数分間を要する。
ｄ．ダウンロードリンクをクリックして、全ての配列をＦＡＳＴＡファイルとしてダウンロードする。
２．配列を整列する

ステップ１において蓄積された配列は、任意の利用できる多重配列整列ツールを使用して整列させることができる。多重配列整列ツールは、とりわけＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＥＭＢＯＳＳ Ｃｏｎｓ、Ｋａｌｉｇｎ、ＭＡＦＦＴ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＶｉｅｗ、Ｔ－ＣｏｆｆｅｅおよびＷｅｂＰＲＡＮＫを含む。この説明に役立つ例の目的のため、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを用いる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａは、コンピューターにインストールし、例えば、次のプロンプトにより、コマンドラインからランすることができる：

３．整列を評価する（必要に応じ）

ステップ２において行われた多重配列整列を評価し、不十分なマッチについてフィルタリングすることができる。前述の通り、配列特色を共有しない配列は、同じオルソロジー群には存在しない可能性が高く、ＨＭＭの品質にとって有害となり得る。

整列の評価を支援するための、例示的なブラウザ内整列ツールは、ｈｔｔｐ：／／ｍｓａ．ｂｉｏｊｓ．ｎｅｔ／および／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｖｅｉｄｅｎｂｅｒｇ／ｗａｓａｂｉである。両者共に、ダウンロードし、ローカルにランすることができる。

訓練データセットの残りにマッチしない配列は、次のステップに進む前に、訓練データセットから除去することができる。斯かる配列は、オルソロジー群の大部分の他のメンバーに共通する１種または複数の配列特色を保有しないこと等、整列の品質の客観的判定基準に基づき自動様式で除去することができる。一部の実施形態では、オルソロジー群にマッチしない配列は、他の手段、例えば、目視検査によって除去することができる。
４．訓練データセットに基づきＨＭＭ予測的機械学習モデルを生成する

ＨＭＭは、任意のＨＭＭ建設ソフトウェアによって生成することができる。例示的なソフトウェアは、ｍａｌｌｅｔ．ｃｓ．ｕｍａｓｓ．ｅｄｕ； ｗｗｗ．ｃｓ．ｕｂｃ．ｃａ／～ｍｕｒｐｈｙｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＨＭＭ／ｈｍｍ．ｈｔｍｌ； ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ＨＭＭ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｑｕｂ．ｂｕｆｆａｌｏ．ｅｄｕ； ／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｌｉｍｍｅｒｈｍｍ／に見出すことができる、またはこれから適応させることができる。一部の実施形態では、ＨＭＭＥＲツールが用いられる。

この説明に役立つ例の目的のため、ＨＭＭｂｕｉｌｄが使用され、ダウンロードし、次のコマンドによりローカルにランすることができる：

５．ＨＭＭを評価する（必要に応じ）

ステップ４において生成されたＨＭＭを評価するために、アノテートされたデータベースをランして、配列を正確に認識するその能力を評価することができる。この説明に役立つ例において、ＨＭＭは、全てのアノテーションが真であると推定されるＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを問い合わせるために使用される。この検査ランの結果をチェックして、検索結果のアノテーションが、ＨＭＭが表すべき機能にマッチするかどうか知ることができる。

タンパク質配列の検索データベースのｆａｓｔａファイル（単数または複数）により（例えば、ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｄｂ．ｆａｓｔａ）、次のコマンドをランして、対応するＥ値によるＨＭＭマッチの出力ファイルを得ることができる。

このコマンドは、ゲノムの翻訳されたプロテオームにおいて使用して、機能モチーフにマッチする全てのヒットを見出すこともできる。

このコマンドにおける様々なオプションは、次のものに対応する：

一部の実施形態では、本方法および他の公知の方法に従って築かれた特注のＨＭＭを使用して、本開示のワークフローステップのいずれかのために相同性を確立することができる（例えば、候補抵抗性遺伝子を同定するステップ、または遺伝子をアノテートするステップ）。一部の実施形態では、ＨＭＭは、「完全」標的配列（例えば、本開示に記載されている、抵抗性検索のための標的遺伝子、生合成遺伝子または「コア生合成遺伝子／酵素」またはその他）を中心にして築かれる。一部の実施形態では、ＨＭＭＳは、前記標的配列の特異的ドメイン（例えば、特定の目的の標的遺伝子／タンパク質を代表することが見出されるドメイン）を中心にして築かれる。
構造解明－ 遺伝子から化学へ

一部の実施形態では、本明細書にて開示される天然物発見ワークフロー（例えば、図１）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ構造解明のステップを含む。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される方法により同定された天然物多重遺伝子クラスターの配列（例えば、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セット）に基づき、天然物化学構造を予測する方法を教示する（図３を参照）。

一部の実施形態では、コンピューターにより予測される天然物（ＮＰ）構造は、ＮＰ発見の取り組みに優先順位をつけることの助けになることができる。例えば、公知の構造を有するＮＰを産生することが予測されるＭＧＣは、プログラムの目標に対するより高い関心のＮＰを産生することが予測されるＭＧＣと比較して、発見パイプラインにおける優先順位を落とすことができる。一部の実施形態では、ＮＰ構造に関するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測は、その後のＮＰ検出を容易にすることができる（例えば、質量分析による）。

ゲノム配列データから直接、広い範囲の生合成経路の小分子産物を予測することは、コンピューターによるかつデータ集約型のプロセスである。天然物足場の合成およびテーラリングに関与する膨大な種類の酵素、ならびに公知の化学的テーマにおける無数の変形形態が存在する。コンピューターによる展望から、問題は、大部分は、この多様性および複雑性を網羅するための十分に包括的な訓練データセットをどのように取得するかについての疑問へと低下させることができる。

ある範囲のアルゴリズムが、ＮＲＰＳアデニル化ドメインおよびＰＫＳアシルトランスフェラーゼドメインの基質特異性を予測するように開発された（例えば、Ｋｈａｙａｔｔ ＢＩ， Ｏｖｅｒｍａｒｓ Ｌ， Ｓｉｅｚｅｎ ＲＪ， Ｆｒａｎｃｋｅ Ｃ． Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｙｌ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＮＲＰＳ ａｎｄ ＰＫＳ ｓｙｓｔｅｍｓ ｕｓｉｎｇ ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３；８：ｅ６２１３６およびＢａｒａｎａｓｉｃ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｂｙ ｌａｔｅｎｔ ｓｅｍａｎｔｉｃ ｉｎｄｅｘｉｎｇ． Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１４；４１：４６１－７を参照）。Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｂｏｕｔ ａ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ（ＭＩＢｉＧ）もまた、公知のＭＧＣについて全ての酵素機能および特異性、ならびに各観察に利用できる証拠のレベルに関するアノテートされた情報を含む（Ｍｅｄｅｍａ ＭＨ． Ｔｈｅ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｂｏｕｔ ａ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ （ＭＩＢｉＧ） ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１５）。

これらおよび他の個々の単量体予測を、ＮＰ．ｓｅａｒｃｈｅｒおよびａｎｔｉＳＭＡＳＨ等のツールによって組み合わせて、ポリケタイドまたは非リボソーム性ペプチドのコア足場の大まかなアイデアを得る（Ｌｉ ＭＨ， Ｕｎｇ ＰＭ， Ｚａｊｋｏｗｓｋｉ Ｊ， Ｇａｒｎｅａｕ－Ｔｓｏｄｉｋｏｖａ Ｓ， Ｓｈｅｒｍａｎ ＤＨ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ ［ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｆｉｌｅ］ ２００９；１０：１８５、Ｍｅｄｅｍａ ＭＨ， ｅｔ ａｌ． ａｎｔｉＳＭＡＳＨ： ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．およびＢｌｉｎ Ｋ， ｅｔ ａｌ． ａｎｔｉＳＭＡＳＨ ２．０－ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１３）。ＲｉＰＰのいくつかのクラスのため、分子内架橋を予測することもできる（Ｂｌｉｎ Ｋ， Ｋａｚｅｍｐｏｕｒ Ｄ， Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ Ｗ， Ｗｅｂｅｒ Ｔ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｌａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎｔｉＳＭＡＳＨ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１４；９：ｅ８９４２０）。

本開示によって企図される別の構造予測ツールは、ＰＲｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅｓ（ＰＲＩＳＭ）ソフトウェアである。ＰＲＩＳＭは、化学的なグラフを使用して、様々なクラスター型の天然物足場をモデル化する（Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ． Ｓｋｉｎｎｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＲＩＳＭ ３： ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４５， Ｉｓｓｕｅ Ｗ１， ３ Ｊｕｌｙ ２０１７， Ｐａｇｅｓ Ｗ４９－Ｗ５４および米国特許出願公開第２０１８／０３７３８３３号、これらはそれぞれ、これにより参照により本明細書に組み込まれる）。構造予測ソフトウェアツールの追加的な例を上の表４に提示する。
分析化学技法を使用して遺伝子を分子にマッチさせること

一部の実施形態では、天然物発見プラットフォームの構造解明ステップは、同定されたＭＧＣから天然物を合成および解析するステップを含む。一部の実施形態では、本開示は、天然物の構造に関するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測を活用することにより、新たな天然物の経験的解析からデータを解析する方法を教示する（図３を参照）。

例えば、ペプチドゲノミクスおよびグリコゲノミクス方法論は、分子の断片組成をプロファイルするタンデム質量分析の能力を、これらの断片に対応し得る化学的部分構造のＭＧＣ予測と組み合わせる（Ｋｅｒｓｔｅｎ ＲＤ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｅｐｔｉｄｏｇｅｎｏｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１１；７：７９４－８０２およびＫｅｒｓｔｅｎ ＲＤ， ｅｔ ａｌ． Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｓ ａ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ－ｍｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１３；１１０：Ｅ４４０７－１６を参照）。一部の実施形態では、ペプチドゲノミクスのための質量分析およびゲノムデータのコンピューターによるカップリングは、いくつかのアルゴリズムによって完全に自動化された。これは、遺伝子クラスターを分子に接続するための前例になく速い方法をもたらす。

ＲｉＰＰＱｕｅｓｔおよびＮＲＰＱｕｅｓｔアルゴリズムは両者共に、それぞれランチペプチド（ＲｉＰＰのクラス）および非リボソーム性ペプチド（ＮＲＰ）の観察されるタンデム質量スペクトルのための潜在的な遺伝子クラスターを同定するために分子ネットワーク形成アプローチを使用する（Ｍｏｈｉｍａｎｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１４； Ｍｏｈｉｍａｎｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ． ＮＲＰｑｕｅｓｔ： Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｉｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ． ２０１４；およびＧｕｔｈａｌｓ Ａ， Ｗａｔｒｏｕｓ ＪＤ， Ｄｏｒｒｅｓｔｅｉｎ ＰＣ， Ｂａｎｄｅｉｒａ Ｎ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｐａｒａｄｉｇｍ ｉｎ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ． ２０１２；８：２５３５－２５４４）。

ＲｉＰＰｑｕｅｓｔのための検索データベースは、ゲノムにおける各検出されたランチオニンシンテターゼコード遺伝子に近い全ての短いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を見出すことによりコンパイルされ、一方、ＮＲＰｑｕｅｓｔは、各検出されたＮＲＰ ＭＧＣ内のあらゆる可能な順序のＮＲＰＳアセンブリーラインを生成し、次いで、ＮＲＰＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ２を使用して各ＮＲＰＳモジュールによってコードされるアミノ酸を予測することにより、可能なＮＲＰのデータベースを創出する（Ｒｏｔｔｉｇ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ＮＲＰＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ２－ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ＮＲＰＳ ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１１；３９：Ｗ３６２－７）。スペクトルネットワーク形成アプローチは、分子の複数バリアントが評価されることを可能にし、これは、予期せぬテーラリング改変からの偽陰性結果の尤度を低下させる。また、これは、公知のペプチドの以前に未知のバリアントの即時同定を可能にする。

代替方法、Ｐｅｐ２Ｐａｔｈは、確率的フレームワークを使用して、各ＮＲＰＳモジュールが、基質として全ての可能なアミノ酸を選択することの尤度を予測し、次いで、あらゆる可能なＮＲＰＳアセンブリーラインのために組み合わせた確率を計算して、質量分析由来の質量シフト配列タグをマッチさせる：研究中のペプチドのアミノ酸配列を代表する断片分子量差の配列（Ｍｅｄｅｍａ ＭＨ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｐ２Ｐａｔｈ： Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｉｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｉｃ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ． ２０１４；１０：ｅ１００３８２２）。Ｐｅｐ２Ｐａｔｈは、ＮＲＰｑｕｅｓｔと同じ、基質特異性予測のためのアルゴリズムに基づくものの（すなわち、ＮＲＰＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ２）、このアプローチの利点は、いくつかのモジュールが僅かに予測を誤る場合、アルゴリズムが、ペプチド－ＭＧＣリンクの予測に失敗しないことであり、例えば、モジュールが、チロシンに特異的であり、フェニルアラニンが観察される場合、観察されるアミノ酸の原因となるモジュールの確率は、依然として高い。Ｐｅｐ２Ｐａｔｈはまた、ゲノムにおけるあらゆる可能なＯＲＦを、観察される質量シフト配列タグに対するヒットについて検索する、ＲｉＰＰ ＭＧＣ同定のためのツールを有する。
抵抗性遺伝子およびクラスターに優先順位をつけるためのワークフロー

本開示は、抵抗性遺伝子およびクラスターの優先順位つけの実施形態を表すワークフローを提供する（図８を参照）。

一部の実施形態では、本明細書にて開示されるワークフローは、推定上の抵抗性遺伝子がクラスターにおいて異なる役割を果たす有意な機会を有するクラスターをフィルタリングして取り除くように設計される（例えば、生合成ｖｓ．抵抗性）と共に、不完全であることまたはある特定の生合成遺伝子の欠如に基づき真のクラスターとして低い信頼度を有すること等の追加的な技術的問題点を有するクラスターをフィルタリングして取り除くように設計される。

一部の実施形態では、本ワークフローは、抵抗性遺伝子に信憑性があるか否かについて決定するためのチェックポイントを含む。生合成遺伝子を有するオペロンに存在する（例えば、メチルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびオキシダーゼ／レダクターゼ等の公知のテーラリング）、または生合成遺伝子の２種の遺伝子内でオーファン化される場合、抵抗性遺伝子は、信憑性がある。抵抗性遺伝子が、生合成的役割を有し得る場合、これは、関連する遺伝子と協調して評価される（例えば、脂肪酸含有遺伝子クラスターに関連する場合、脂肪酸代謝に関与する標的抵抗性遺伝子は、信憑性が低い）。信憑性がない抵抗性遺伝子は、他の一次代謝／ハウスキーピング遺伝子を有するまたはこれに近いオペロンに存在する（例えば：アミノ酸代謝に関与する複数酵素）。マルチパート複合体の他の部分の近くにある場合、これもまた、信憑性が低い（例えば、標的抵抗性遺伝子が、リボソームサブユニットであり、他のリボソームサブユニットに関連した場合）。

一部の実施形態では、本ワークフローは、遺伝子クラスターが、信憑性をもって実在するかについて決定するためのチェックポイントを含む。信憑性がある遺伝子クラスターは、足場を産生することができる複数の生合成遺伝子を含有する。例えば、これは、モジュラーアセンブリーライン（ＰＫＳ／ＮＲＰＳ）、構造ペプチド（ＲｉＰＰ）またはテルペンシンターゼをコードする遺伝子を含むことができる。周囲の生合成テーラリング遺伝子がない単離された遺伝子は多くの場合、信憑性がなく、例えば、他の関連する遺伝子がない、プロテアーゼの存在のため呼ばれるバクテリオシンクラスターは廃棄される。一部の実施形態では、この品質管理ステップは、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子が、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットの閾値パラメーター内に位置することを確実にすることにより取り組まれる。

一部の実施形態では、本ワークフローは、クラスターが、興味深い何かを産生することができるかについて決定するためのチェックポイントを含む。遺伝子クラスターの「興味深さ」は、いくつかのメトリクス（ｍｅｔｒｉｃｓ）により評価される。遺伝子クラスターが、以前に同定された遺伝子クラスターと同一に見える場合、クラスターは廃棄される。これが、以前に同定された遺伝子クラスターと同様に見える場合には、以前に同定された遺伝子クラスターのアナログの値が評価される（例えば、生理活性がない分子のアナログは、興味深くない）。産生することができる予測される分子の特徴が評価され、例えば、バクテリオシンは、不十分な薬物動態を有する可能性があり、したがって、興味深さが低い。一部の実施形態では、おそらく興味深い分子特色も評価され、例えば、ハロゲナーゼが存在する場合、これは、同定がより容易であり、より役立つ薬物動態を有し得る分子を産生することができる。

一部の実施形態では、本ワークフローは、遺伝子クラスターが、単一のコスミドに含有されるかについて決定するためのチェックポイントを含む。コスミドのオンまたはオフを作動する生合成遺伝子のオペロンが存在しない場合、クラスターは、単一のコスミドに存在することが推察される。

一部の実施形態では、本ワークフローは、クラスターが完了され得るかについて決定するためのチェックポイントを含む。単一のコスミドに含有されないクラスターは、本発明者らのライブラリーにおける他のコンティグに対して比較される。遺伝子クラスターを完了するオーバーラップコンティグ（または複数のコンティグ）を見出すことができる場合には（コスミドのオンまたはオフを作動する生合成遺伝子のオペロンが存在しないような）、クラスターは、完了可能と思われる。コスミドのアセンブルされた配列が、不完全であることを示す、短い（＜３０ｋｂ）場合には、物理的コスミドライブラリーからコスミドが回収され、再度配列決定されるのであれば、完了可能であり得る。したがって、特に興味深く、完了されないリスクの価値がある場合、これをさらに継続することができる。
本発明の天然物アナログ化プラットフォームの方法、システム、およびツール

本開示の一部は、メタゲノムライブラリーからの新規天然物の発見のための様々な方法を提供する。これらの新規天然物は、低分子薬物処置、農業製品、例えば殺虫剤または昆虫フェロモン、ならびに中でも他の消費者食品、化粧品、および洗浄剤に及ぶ多様な応用のために利用可能なＮＰ多様性を劇的に増加させる潜在性を有する。

しかし、一部の例では、所望の応用に関して高い潜在性を有する天然物は、なおも他の理由から利用できないと考えられている。例えば天然物は、必要な貯蔵寿命を欠如することがあり、患者の一部の集団において有害な反応を引き起こすことがあり、または単に広範囲に採用することができない望ましくない風味もしくは臭いを有することがある。天然物はまた、不良な生物学的利用率、または不良な吸収、分布、代謝および***（ＡＤＭＥ）プロファイルも有し得る。その他の有益な天然物が商業的成功を得られない場合がある他の理由は、生産コストであり得るか、または天然に存在する化合物の特許保護の欠如であり得る。これらの例では、認識された欠点を軽減するおよび／または所望の特性を植え付ける分子を産生するように天然物を改変することが有益であり得る。

改変によって利益が得られる天然物の例は、サリチル酸（ＳＡ）である。この天然物は、元はヤナギにおける一般的な植物ストレスホルモンとして発見された。この天然物は、古代から価値があり、シュメールの粘土板およびエジプトのパピルスに疼痛の処置として参照されている（Ｄｉａｒｍｕｉｄ Ｊｅｆｆｒｅｙｓ． Ａｓｐｉｒｉｎ： Ｔｈｅ Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ Ｓｔｏｒｙ ｏｆ ａ Ｗｏｎｄｅｒ Ｄｒｕｇ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ２００８）。しかし、サリチル酸は合成が難しく、一部の患者では嫌われ、天然物が胃に及ぼす刺激作用に関して苦情を訴えた。１８９７年に、Ｂａｙｅｒ（登録商標）の科学者がＳＡのアセチルサリチル酸バリアントを開発し、これは元の薬物の刺激作用を和らげ、合成がより容易であった（同書）。この薬物は、現在、アスピリンとして一般的に公知である。

一部の実施形態では、本開示は、新たに発見された天然物を改善するための方法を教示する。このように、一部の実施形態では、本開示は、天然物のアナログ化方法を教示する。本明細書で記載される場合、アナログ化は、改善されたまたはそれ以外の方法で望ましい特性を有するバリアント分子を創出するための天然物の改変を記載する。一部の実施形態では、アナログ化は、天然物の中心コア構造に対して様々な化学基を付加または除去することを含む。

一部の実施形態では、本開示は、天然物をアナログ化する生合成方法を教示する。このように、一部の実施形態では、本開示は既存の生合成経路を改変することによって、または１つもしくは複数の酵素触媒による天然物の合成後処理のいずれかによって天然物のバリアントを生成する。一部の実施形態では、本開示は、「生体変換」としての生合成に基づくアナログ化を指す。本開示の生体変換戦略と、アナログ化の伝統的な化学アプローチとの比較を図１１に提供する。

一部の実施形態では、本開示のアナログ化方法は、天然物の合成の間または合成後に起こる改変を含む。すなわち、一部の実施形態では、本開示のアナログ化方法は、天然物が合成された後にそれを改変し始める（例えば、抽出後、異なる反応で、または追加の生合成ステップの組み込みを通して）。一部の実施形態では、本開示のアナログ化方法は、天然物そのものの生合成ステップを改変してバリアントを産生する（例えば、天然物の生合成経路内の遺伝子を置き換えまたは改変してバリアントを創出する）。一部の実施形態では、本開示はまた、生合成経路に中間ステップを追加することによる天然物のアナログ化方法も教示する。

一部の実施形態では、本開示のアナログ化方法は、以下を表す少なくとも３つの広い範疇に分類される：１）クラスターの操作（例えば、既存の生合成遺伝子／生合成経路を破壊するまたはそれ以外の方法で改変すること）、２）酵素パネル（例えば、雑多な酵素の使用）、および３）相同なクラスターの利用（例えば、一部または全体のＭＧＣのスワッピングを通しての生合成操作）（図９を参照されたい）。一部の実施形態では、本開示はまた、上記の３つの広い戦略の１個または複数の組合せを通してアナログ化することも教示する。これらの戦略の各々を以下により詳細に考察する。
天然物のアナログ化－クラスター操作

一部の実施形態では、本開示は、天然物をアナログ化するクラスター操作方法を教示する。このように、一部の実施形態では、本開示は、標的天然物のアナログを産生するための方法であって、ａ）標的天然物を産生することが公知の多重遺伝子クラスターを含む基礎微生物宿主細胞を提供するステップと、ｂ）多重遺伝子クラスター内で１個または複数の遺伝子の発現を変異させるまたはノックアウトするように、基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱し、これにより、変異した微生物宿主細胞のライブラリーを創出するステップと、ｃ）変異した微生物宿主細胞のライブラリーから微生物宿主細胞を培養するステップと、ｄ）ステップ（ｃ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析する（または同定する）ステップと、ｅ）ステップ（ｃ）で培養した微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｄ）の解析によって決定される通り、選択された微生物宿主細胞が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物のアナログを産生する、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、ゲノムを撹乱するステップは、ＤＮＡ配列を改変する任意の公知の方法を介して行うことができる。一部の実施形態では、本開示は、多重遺伝子クラスターの全て（または一部）を、所望の変異を含む対応するＤＮＡと置き換えることによってゲノムを撹乱することを教示する。一部の実施形態では、本開示は、例えばループイン／アウト技術の使用を教示する。一部の実施形態では、本開示は、所望の改変を為すための遺伝子編集ツールの使用を教示する。

一部の実施形態では、ゲノム編集システムの分子は、例えばａ）酵素およびＲＮＡ、ｂ）ＲＮＡおよび酵素をコードする核酸、ｃ）酵素およびＲＮＡをコードする核酸、またはｄ）酵素およびＲＮＡの両方をコードする核酸を含み得る。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、デザイナーヌクレアーゼ（またはデザイナーヌクレアーゼをコードする核酸、例えばｍＲＮＡまたはＤＮＡプラスミド）、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＲＣ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（商標））、または核酸ガイドエンドヌクレアーゼ（ＮＧＥＮ）、例えばＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ、例えば、Ｃａｓ９）、またはＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＤＧＥＮ）を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、ガイド核酸（ｇＮＡ）（またはガイド核酸をコードする核酸、例えばｍＲＮＡまたはＤＮＡプラスミド）、例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ；ＣＲＩＳＰＲ）システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および／もしくは核酸、または１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および／もしくは核酸をコードする核酸を含む）である。一部の実施形態では、ゲノム編集システムはＺＦＮを含む。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、ＴＡＬＥＮを含む。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、ホーミングエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、インテグラーゼ（またはインテグラーゼをコードする核酸、例えばｍＲＮＡまたはＤＮＡプラスミド）を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集システムは、インテグラーゼによって認識される組換え部位を含むドナー核酸をさらに含む。

本開示の操作する（すなわち、ゲノムの撹乱）方法は、単独で行うことができ、または大きい株操作プログラムの一部であり得る。例えば、一部の実施形態では、本開示のＭＧＣ操作は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第９，９８８，６２４号の方法に従って行うことができる。
天然物のアナログ化－酵素パネルおよび雑多な酵素

一部の実施形態では、本開示は、天然物をアナログ化する酵素パネルの方法を教示する。このように、一部の実施形態では、本開示は、天然物または天然物の前駆体を改変するための１種または複数の酵素の使用を教示する。

一部の実施形態では、本開示は、標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、ａ）標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される複数の酵素を提供し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、ｂ）アナログ化酵素パネル由来の個々の酵素を、標的天然物または標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物のうち少なくとも１種を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、ｄ）アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｃ）の解析によって決定される通り、選択された酵素が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、アナログ化酵素パネル由来の酵素は精製された酵素である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の酵素は、前記酵素を異種的に発現する微生物株由来のライセートの形態で提供される。

一部の実施形態では、酵素パネル由来の酵素は株内に含まれる。このように、一部の実施形態では、本開示は、標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、ａ）標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれ発現する、複数の微生物を提供し、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、ｂ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を、標的天然物または標的天然物の前駆体と接触させ、これにより、混合物を創出するステップ（例えば、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を、標的天然物または標的天然物の前駆体を含む増殖培地中で培養するステップ）と、ｃ）ステップ（ｂ）の株および標的天然物または前駆体の混合物（例えば、ステップ（ｂ）の培養由来の使用済み培地）を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、ｄ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｃ）の解析によって決定される通り、選択された微生物株が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化し、選択された微生物株によって発現される酵素が、選択された酵素である、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、酵素パネル内の株を、標的天然物またはその前駆体に接触させる前に溶解する。このように、一部の実施形態では、本開示は、標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、ａ）微生物株由来の各ライセートが標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素を発現する、複数の微生物株ライセートを提供し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、ｂ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々のライセートを標的天然物または標的天然物の前駆体に接触させ、これにより、酵素混合物を創出するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）の酵素混合物を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、ｄ）ステップ（ｃ）の解析によって決定される通り、標的天然物の所望のアナログを産生する、アナログ化酵素パネルライブラリー由来のライセートを同定し、これにより、標的天然物をアナログ化するステップであって、同定されたライセートに対応する微生物株によって発現される酵素が、選択された酵素である、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、方法は、選択された酵素を発現するように第１の基礎微生物株のゲノムを撹乱するステップであって、第１の基礎微生物株が、標的天然物を合成することができる、ステップをさらに含む。

他の実施形態では、酵素パネルは、天然物をすでに産生することができる微生物に加えられる一連の配列である。このように、一部の実施形態では、本開示は、以下を教示する。

標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、ａ）標的天然物の第１のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれコードする、複数の遺伝子配列を提供するステップと、ｂ）ステップ（ａ）の複数の遺伝子配列のうち１種または複数によってコードされる酵素をそれぞれ発現するように、第１の基礎微生物株の１個または複数の細胞のゲノムを撹乱するステップであって、第１の基礎微生物株が、標的天然物を合成することができ、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、ｃ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、ｄ）ステップ（ｃ）の培養物由来の使用済み培地またはライセートを、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、ｅ）微生物株のアナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｄ）の解析によって決定される通り、選択された微生物株が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップとを含む、方法。一部の実施形態では、本開示の株は、第２の複数の遺伝子配列によって上記の方法のステップを反復することによって、追加の酵素を含むようにさらに改変することができる。

一部の実施形態では、複数の遺伝子配列によってコードされる酵素を株に加えて、追加の反応（すなわち、元のＭＧＣによってすでにコードされている反応に加えて）を触媒する。このように、一部の実施形態では、本開示は、複数の遺伝子配列によってコードされる酵素をコードする核酸を既存のＭＧＣに加えることを教示する。

一部の実施形態では、複数の遺伝子配列によってコードされる酵素を株に加えて、目的の天然物の生合成経路における反応を置き換える。このように、一部の実施形態では、宿主細胞のゲノムを撹乱するステップは、元のＭＧＣの生合成遺伝子のうち１種または複数を、第１または第２の複数の遺伝子配列のうち１種または複数によってコードされる酵素をコードする配列と置き換えることを含む。

一部の実施形態では、複数の遺伝子配列によってコードされる酵素は、メタゲノムライブラリーから同定される。このように、一部の実施形態では、酵素のうち少なくとも１種はメタゲノムライブラリーに由来し、遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットを投入された機械学習モデルによって、ある型の反応を触媒することが予測されており、ｉ）遺伝的配列入力変数は、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒する酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、ｉｉ）表現型性能出力変数は、１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む。

一部の実施形態では、本開示は、標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、ｉ）遺伝的配列入力変数が、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、ｉｉ）表現型性能出力変数が、１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、ｂ）訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列（例えば、本開示のＤＭＬ内のアセンブルされたコンティグによってコードされるアミノ酸のリスト）を含有するデジタルメタゲノムライブラリーに適用して、デジタルメタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒すると予測される、ステップと、ｄ）第１の信頼度スコアの第２の信頼度スコアに対する比が、予め選択された閾値から外れる場合、候補配列のプールから、第２の信頼度スコアによる第２の予測的機械学習モデルによって、異なる機能を果たすことが予測されるいずれかの配列を除去し、これにより、候補配列のフィルタリングされたプールを産生するステップと、ｅ）ステップ（ｄ）の候補配列のフィルタリングされたプール由来の配列をそれぞれ発現するように１個または複数の微生物細胞を製造するステップと、ｆ）ステップ（ｅ）の製造された宿主細胞を培養し、培養された細胞を溶解し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、ｇ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の酵素を、標的天然物または標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、ｈ）ステップ（ｇ）の反応混合物のうち少なくとも１種を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、ｉ）アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｈ）の解析によって決定される通り、選択された酵素が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップとを含む方法を教示する。

本開示のアナログ化方法の多くの実施形態は、使用済み培地、ライセート、インキュベーション、反応、混合物、またはより初期のステップの等価物を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップを列挙する。一部の実施形態では、この解析ステップは、前記標的天然物またはアナログの存在に関する直接測定を含む。当業者は、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＮＭＲ、ＩＲなどを含む、化学実体を検出する多くの方法を承知している。

一部の実施形態では、この解析ステップは、標的天然物のアナログの存在を示す代理測定を含む。例えば、一部の実施形態では、本開示は、所望の分子の存在または分子の消費のいずれかを同定するための様々な比色アッセイの使用を教示する。一部の場合では、比色アッセイは、アナログの存在を直接測定する。他の実施形態では、比色アッセイは異なる化合物を測定し、これを使用して第１の化合物の存在を推定する。例えば、一部の実施形態では、酵素の補因子の存在または消費を測定して標的天然物の酵素変換を推定する。一部の実施形態では、反応物の存在または消費を測定して、標的天然物の酵素変換を推定する。１つの例示的な例は、還元ニコチンアミドであるアデニンジヌクレオチド（リン酸）の消費を経時的にモニターする比色アッセイの使用である。この比色アッセイは、基質の酵素による還元（アナログ化）がＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化を必要とする場合に使用することができ、したがってこの酵素パネルの活性はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費と連動し、これを３４０ｎｍでの吸光度の減少によってモニターすることができる。
天然物のアナログ化－相同なクラスターの利用

一部の実施形態では、本開示は、天然物のアナログ化のための相同なＭＧＣの利用を教示する。

一部の実施形態では、本開示は、同じまたは非常に類似の天然物を産生することが予測される相同なＭＧＣを同定することによるアナログ化方法を教示する。このアプローチは、１個または複数のメタゲノムライブラリー内の既存の多様性を活用して、元の同定された天然物の品質より優れた品質を有する天然物バリアントを同定する。一部の実施形態では、新たに同定されたＭＧＣは、天然物の対応する改変をもたらし、これにより、アナログを産生する１種または複数のわずかに異なる生合成酵素を含むと予測される。

一部の実施形態では、本開示は、標的天然物のアナログを産生する方法であって、ａ）標的天然物を産生することが公知である第１の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、ｂ）前記第１の多重遺伝子クラスターに基づき予測モデルを開発するステップと、ｃ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでデジタルメタゲノミクスライブラリーを新たな多重遺伝子クラスターについて問い合わせるステップであって、前記新たな多重遺伝子クラスターが、予測モデルによって、標的天然物または標的天然物のバリアントを産生することが予測され、これにより、候補多重遺伝子クラスターのプールを産生する、ステップと、ｄ）各々が候補多重遺伝子クラスターのプール由来の少なくとも１つの多重遺伝子クラスターをそれぞれ発現するように、１個または複数の微生物宿主細胞を製造するステップと、ｅ）ステップ（ｄ）において製造された微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、ｆ）ステップ（ｅ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、ｇ）ステップ（ｅ）において培養された微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｆ）の解析によって決定される通り、選択された微生物宿主細胞が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物のアナログを産生する、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、本開示の予測モデルは、本文書の「推移的な多重遺伝子クラスター特色セット発見ワークフロー」の節に記載されるように、新たな多重遺伝子クラスターが、標的天然物または標的天然物のバリアントを産生するか否かを決定する（例えば、表４に記載されるツールまたはその等価物を使用して）。

一部の実施形態では、公知ＭＧＣは、天然物（例えば、経験的データを通してまたは雑誌に報告されているように）を産生することが実験によって確証され、実証されているＭＧＣである。

一部の実施形態では、本開示は、相同なＭＧＣを同定するおよび酵素のアナログ化のためにそれらのＭＧＣを得る方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、相同なＭＧＣからの１個または複数の部分を加えるための元の天然物コードＭＧＣの操作を教示する。一部の実施形態では、本開示は、その元のＭＧＣ内の１個または複数の遺伝子を、相同なＭＧＣからの１個または複数の部分と置き換えるための元の天然物コードＭＧＣの操作を開示する（図１２を参照されたい）。

このように、一部の実施形態では、本開示は、標的天然物のアナログを産生するための方法であって、ａ）標的天然物を産生することが公知である第１の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、ｂ）前記第１の多重遺伝子クラスターに基づき予測モデルを開発するステップと、ｃ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、デジタルメタゲノミクスライブラリーを新たな多重遺伝子クラスターについて問い合わせるステップであって、前記新たな多重遺伝子クラスターが、予測モデルによって、標的天然物または標的天然物のバリアントを産生することが予測され、これにより、候補多重遺伝子クラスターのプールを産生する、ステップと、ｄ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、アノテーションエンジンにより、ステップ（ｃ）の候補多重遺伝子クラスターのプールの新たな多重遺伝子クラスターの１個または複数内の生合成酵素をコードする個々の遺伝子を同定し、これにより、新たな多重遺伝子クラスターから、生合成遺伝子を含むアナログ化酵素パネルライブラリーを産生するステップと、ｅ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の遺伝子を発現するように基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱するステップであって、基礎微生物宿主細胞が、第１の多重遺伝子クラスターを含み、これにより、細胞を製造するステップと、ｆ）ステップ（ｅ）において製造された微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培地またはライセートを、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、ｈ）ステップ（ｆ）において培養された微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の解析によって決定される通り、選択された微生物宿主細胞が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物のアナログを産生する、ステップとを含む方法を教示する。

一部の実施形態では、前記第１の多重遺伝子クラスターに基づき予測モデルを開発するステップは、類似の生合成クラスターを検索するために使用することができる生合成遺伝子のセットを同定するステップである。一部の実施形態では、類似の生合成クラスターを検索するために使用される生合成遺伝子は、コア生合成酵素である。

一部の実施形態では、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでデジタルメタゲノミクスライブラリーを新たな多重遺伝子クラスターについて問い合わせるステップは、本開示の推移的な多重遺伝子クラスター特色セット発見ワークフローの節に記載されるように遂行される。すなわち、一部の実施形態では、「問い合わせるステップ」は、前回のステップのＭＧＣ予測モデルの全ての生合成遺伝子に関するホモログを含有するＭＧＣを同定するステップを含む。一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、ＭＧＣ予測モデルの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個の生合成遺伝子（それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む）のホモログを含有する。一部の実施形態では、候補ＭＧＣは、ＭＧＣ予測モデルの生合成遺伝子の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のホモログを含有する。上記のように、一部の実施形態では、ＭＧＣ予測モデルは、第１のＭＧＣの全ての生合成遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＭＧＣ予測モデルは、それらの間の全ての範囲および部分的範囲を含む、第１のＭＧＣのコア生合成遺伝子／酵素のみを含む。

一部の実施形態では、本開示は、標的天然物のアナログを産生する方法であって、ａ）標的天然物または関連天然物を産生することが公知のまたは予測される複数の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、ｂ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでアノテーションエンジンにより、ステップ（ａ）の複数の多重遺伝子クラスター内の生合成酵素をコードする個々の遺伝子を同定し、これにより、複数の多重遺伝子クラスターから生合成遺伝子を含むアナログ化酵素パネルライブラリーを産生するステップと、ｃ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の遺伝子を発現するように基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱するステップであって、基礎微生物宿主細胞が、標的天然物を産生することができる第１の多重遺伝子クラスターを含み、これにより、微生物細胞を製造する、ステップと、ｄ）ステップ（ｃ）において製造された微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、ｅ）ステップ（ｄ）の培養物由来の使用済み培地またはライセートを、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、ｆ）ステップ（ｄ）において培養された微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｅ）の解析によって決定される通り、選択された微生物宿主細胞が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物のアナログを産生する、ステップとを含む方法を教示する。
天然物アナログ化－組合せ戦略

一部の実施形態では、本開示は、本開示の戦略の組合せを通してのアナログ化を教示する。このように、一部の実施形態では、本開示は、クラスター操作および酵素パネルの戦略を組み合わせることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、クラスターの操作および相同なクラスターの利用の戦略を組み合わせることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、酵素パネルおよび相同なクラスターの利用の戦略を組み合わせることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、クラスター操作、酵素パネル、および相同なクラスターの利用の戦略を組み合わせることを教示する。
本開示の方法を実行するためのシステム

当業者は、本開示の実施形態の一部または全てのエレメントおよびそれに伴う操作が、１個または複数のプロセッサーおよび１個または複数のメモリーシステムを含む１個または複数のコンピュータシステムによって全体としてまたは部分的にインプリメントされ得ることを理解する。一部のエレメントおよび機能性は、局所でインプリメントされてもよく、他方が例えばクライアントサーバー様式の異なるサーバーを通してネットワーク上で分布された様式でインプリメントされてもよい。特に、サーバー側の操作は、サービスとしてのソフトウェア（ＳａａＳ）様式で複数のクライアントに利用可能であってもよい。

当業者は、一部の実施形態では、本明細書に記載の操作の一部がヒトのインプリメンテーションによって、または自動および手動の手段の組合せを通して実施され得ることを認識する。操作が完全には自動化されていない場合、本開示の実施形態の適切な構成要素は、例えばそれ自体の操作能を通して結果を生成するのではなく、ヒトが操作を行った結果を受ける。
＊＊＊＊＊＊

本記載は、様々な例としての実施形態を示す添付の図面および実施例を参照してなされる。しかし、多くの異なる例としての実施形態を使用してもよく、このように記載は、本明細書に記載される例としての実施形態に限定されないと解釈すべきである。むしろ、これらの例としての実施形態は、本開示が十分かつ完全であるように提供される。例としての実施形態に対する様々な変更は容易に当業者に明白であり、本明細書で定義する一般的原理は、本開示の精神および範囲から逸脱することなく他の実施形態および応用に適用され得る。このように、本開示は、示される実施形態に限定されないと意図され、本明細書に開示される原理および特色と一貫する最も広い範囲と一致する。

以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例証する目的のために示され、本開示をいかなるようにも限定しないことを意味する。特許請求の範囲によって定義される本開示の精神内に包含されるそれらの変更および他の使用は、当業者によって認識される。

内容に関する簡単な表を単に読者を助ける目的で以下に提供する。この表の内容に関するいかなるものも、本出願の例または開示の範囲を限定しないことを意味する。
表４．１－実施例のセクションについての内容の表

（実施例１）
最適なメタゲノムライブラリーパラメーターを確立するためのモデリング

本発明は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの天然物発見を可能にするメタゲノムライブラリーパラメーターを本発明者らが発見したことに一部基づいている。著者らは、ＭＧＣ発見にとって有用であるメタゲノムライブラリーを生成する以前の試みが、ｉ）過度に複雑なＤＮＡ混合物により十分に長いアセンブリーを産生することができなかった、またはｉｉ）配列決定のために選択した細胞／コスミドがごくわずかであったために、環境試料内の意味のある多様性を捉えることができなかったライブラリーを創出したために失敗したという仮説を立てた。すなわち、以前の試みは、複雑性を低下させるために十分なステップを行わなかったか、または試料の多様性を捉えることができないほど複雑性を低下させたかのいずれかであった。

最初のステップとして、本発明者らは、異なるＮ５０長のライブラリーによるＭＧＣ発見率を解析した。類似の複雑性の試料からの多様なデジタルメタゲノムライブラリー（ＤＭＬ）を、約１０００ｂｐから約２５，０００ｂｐまでの範囲に及ぶ異なるＮ５０を有するＤＭＬを産生するために、様々なレベルのカバレッジで配列決定した。次に、Ｎ５０のＤＭＬアセンブリーメトリクス、総アセンブリー長、およびコンティグの数を、ｍｅｔａＱＵＡＳＴを使用して各ＤＭＬについて計算した。次に、これらの試験ＤＭＬを、ａｎｔｉＳＭＡＳＨによって解析して、アセンブリー内に存在する多重遺伝子クラスターを同定した。この解析の目的に関して、目的の天然物をコードする最低の平均クラスターサイズであることが決定されている１０ｋｂより大きいクラスターのみを検索した（Ｒ． Ｂａｌｔｚ． Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｒａ； ｒｅａｌｉｔｉｅｓ， ｃｏｎｊｅｃｔｕｒｅｓ， ｍｉｓｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ． Ｊ． ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９ Ｍａｒ；４６（３－４）：２８１－２９９を参照されたく、これは、少なくとも約１０ｋｂのクラスターが有用な生物活性に最も関連していることを実証した）。最後に、各ＤＭＬに関して、アセンブルされた配列のＭｂｐ当たりの＞１０ｋｂのＭＧＣ数を計算した。

これらの実験の結果を表５に示し、図２２にも例証する。図２２におけるアセンブルされた配列のメガ塩基対当たりのＭＧＣ発見率を、試験ＤＭＬのＮ５０の関数として示す。ＭＧＣの総発見率は、Ｎ５０が増加するにつれて急激に増加するが、約１５，０００ｂｐのＮ５０で平坦化し始める。１５，０００ｂｐのＮ５０を有するライブラリー。
表５－試験ＤＭＬにおけるＭＧＣ発見率

各試料の複雑性が類似であるために、より低いＮ５０もまたＤＭＬに関してより低い総アセンブル長をもたらす（総アセンブル長は、ＤＭＬのコンティグ内に含有される非重複配列情報の全量である）ことに注意されたい。

この実験からの結果は、５，０００ｂｐ未満のＮ５０を有するライブラリーが、実際のＭＧＣ発見にとって不十分であることを示唆した。一部の実施形態では、結果は、少なくとも１５ＫｂのＮ５０を有するＤＭＬがＭＧＣ発見にとって最適であることを示唆している。
（実施例２）
最適なプール用パラメーターを確立するためのモデリング

本開示は、環境試料からのクローンを、その後のアセンブリーのためにメタゲノムライブラリーの複雑性を低下させるように個別のサイロにプールする方法を教示する。プールすることはまた、環境試料のより大きい標本抽出を可能にし、シーケンサーの帯域幅のより効率的な使用を可能にし、ラン当たりより大きい全ライブラリーをもたらし得る。天然物発見のためのＤＭＬを産生するためのプールする最適なレベルを決定するために、一連のシミュレーションを遂行した。

異なるサイズのコスミド（１、５、１０、１００、２００、６，０００、１２，０００、および６０，０００個のコスミド）のプールのシミュレートした配列決定および配列決定アセンブリーを生成するために、異なるサイズの複数の経験的に配列決定されたメタゲノムライブラリーから生成された生ペアエンドｆａｓｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）データを生成した。これらのシミュレートされたプールについての生ｆａｓｔｑファイルを、ＢＢｔｏｏｌｓパッケージ（／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｂｍａｐ／）のｂｂｄｕｋを使用して最初にトリミングした。トリミングしたｆａｓｔｑファイルにおける総リードを次に、サブサンプリングしてＢＢｔｏｏｌｓパッケージにおけるｂｂｎｏｒｍを使用して５×および１０×の標的リード深度に正規化した。正規化およびサブサンプリング後、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇＤＮＡおよびｐＷＥＢクローニングベクター骨格にマッチするリードを、ｂｂｄｕｋを使用してファイルされたｆａｓｔｑから除去した後、ｂｂｍｅｒｇｅを使用してペアエンドリードの融合を行った。融合および非融合ペアエンドｆａｓｔｑリード（各々の正規化された深度に関して）を、ＳＰＡｄｅｓアセンブラー（ｖ．３．１０．１）に入力として提供し、リードのエラー補正を行うことなく、アセンブリーをデフォルトパラメータによって実行した。このプロセスは、５×および１０×カバレッジで配列決定されたコスミドのプールからのシミュレートされたアセンブリーをもたらした。Ｎ５０および長さが１５ｋｂより大きいコンティグ数を含む、各アセンブリーからのコンティグのアセンブリー品質メトリクスを、ｍｅｔａＱＵＡＳＴ（ｖ．５．０．０）を使用して生成した。１５ｋｂ Ｎ５０カットオフは、天然物コードＭＧＣにとって最適であるとして１５ｋｂより大きいコンティグの長さを同定した、実施例１の結果に基づいた。最後に、これらのコンティグにおいてコードされるＭＧＣの数を、コンティグをａｎｔｉＳＭＡＳＨ ５．０に入力することによって同定した。

これらのシミュレーションの結果を、表６に示し、図２１Ａおよび図２１Ｂに例証する。シミュレーションは、１０×カバレッジで、配列決定サイロ当たり最大約３４，０００個のクローンをプールすることによってＭＧＣ発見（すなわち、１５，０００ｂｐより大きいＮ５０を有する）にとって適したデジタルメタゲノムライブラリーを産生することが可能であることを示している。この結果は予想外であったが、その理由は、一般的な考えでは、同時に配列決定されている＜１００個のコスミドのプールは、ＭＧＣアノテーションを可能にするために十分な長さの配列アセンブリーを生じることができるが、より高レベルの複雑性のコスミドプール（例えば、＞１０００個のコスミド）は、プールから試料をデマルチプレクスする方法（例えば、個々のバーコードの使用を通して）がなければ、アセンブリーをもたらすことができないか、またはＭＧＣアノテーションのために使用することができない低い品質のアセンブリーをもたらすということであったためである。
表６－コスミドをプールすることから生成されたライブラリーのＮ５０長

シミュレーションは、最大約３４，０００個のコスミドプールがＭＧＣを含有するために十分な長さの配列アセンブリーを生じることができることを指し示しているが、その複雑性は、ＭＧＣ発見にとって最も有効なプールサイズではないことがある。この応用のためのプールの複雑性をさらに最適化するために、シミュレートされたデータを解析して、生配列データの５００ＭＢの増分当たりの長いコンティグ（＞１５ｋｂ）アセンブリー（５×または１０×生配列カバレッジから計算）の効率を決定した。５００ＭＢは、それがＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑランから生成されたデータの量の次数であるために選択した。これらのシミュレーションからの結果を、以下の表７に示し、図２１Ｃにも例証する。
表７－アセンブルされた長いコンティグの効率とサイロプール当たりのコスミドとの比較

結果は、プールの中で１個のコスミドから約１０，０００個のコスミドまで移動すると、生配列データの５００ＭＢ当たりに生成される＞１５ｋｂのコンティグ数が、有意に増加することを示しており、このことはその複雑度でのコスミドをプールすることが、ＭＧＣアノテーションの配列決定能のより効率的な使用であることを示している。しかし、プールの複雑性が６０，０００まで増加すると、生配列データ５００ＭＢ毎に生成される＞１５ｋｂのコンティグ数は急激に低下する。これらの非常に複雑なプールでは、アセンブリーはなおも多くの絶対数の＞１５ｋｂのコンティグを生じ得るが、各々のコンティグは生成されるためにより多くの配列決定を必要とし、その結果、配列決定ラン当たりのその長さのコンティグはより少なく生成される。このため、この応用では、シミュレーションは、約６，０００～１５，０００個のコスミドプールがＭＧＣ発見のための最適なライブラリーを生じることを指し示している。これらのシミュレーションを２０×カバレッジの配列決定ランに関して繰り返し、上記で報告された結果と類似の結果を生じた。

上記の実施例１および２からの結果に基づき、次に本出願人らは、以下の実施例３により詳細に考察するように、サイロ配列決定ラン当たり６，０００～１０，０００個のコスミドをプールすることによって土壌環境ＤＮＡから最適化メタゲノムライブラリーを産生することに着手した。
（実施例３）
メタゲノムライブラリーの調製
収集

私有地からの土壌試料およそ１ｋｇを収集し、土壌を２ｍｍの網ふるいにかけて石、小枝、および他の非土壌物質を除去した。３００ｍＬのＣＴＡＢに基づく溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ８．０）を最初に加え、その後絶えず反転させて混合しながら７０℃で２時間インキュベートすることによって約２５０ｇの土壌からＤＮＡを抽出した。試料を、４℃、４，０００ｇで２０分間遠心分離した。上清をきれいなボトルに移し、４℃、４，０００ｇで２０分間の２回目の遠心分離を行った。得られたライセートを新しいボトルに移し、０．７体積のイソプロパノールを加え、３０分間穏やかに混合した。沈殿したＤＮＡを、４℃、４，０００ｇで３０分間の遠心分離を２回行うことによって沈降させ、第１の遠心分離と第２の遠心分離の間に７０％エタノールによって洗浄した。上清を捨て、ＤＮＡ沈降物を乾燥させ、乾燥したＤＮＡを１０ｍＬのＴＥに再懸濁した。抽出したＤＮＡを、Ｅｐｏｃｈ分光光度計を使用して定量し、さらなる処理のために保存した。
サイズ選択

土壌試料中の微小生物のゲノムを含む抽出したＤＮＡを、非染色０．７５％アガロースゲルにロードし、３Ｖ／ｃｍの一定電圧で１２～１６時間分離した。ＤＮＡサイジングマーカーを含有するゲルの先端を切り出し、染色した。その後、およそ３５～５０ｋｂのＤＮＡを含有するゲルバンドを切り出した。ＤＮＡを含有するゲルスライスを、１×ＴＡＥ緩衝液を含む１２ｋＤ ＭＷＣ透析チューブの中に入れ、ＤＮＡを３Ｖ／ｃｍの一定電圧で３時間電気溶出した。電気溶出後、ＤＮＡを濃縮し、ＣｅｎｔｒｉＣｏｎ限外ろ過デバイスを使用して３０ｋＤ ＭＷＣメンブレンによって緩衝液を０．５×ＴＥ緩衝液に交換した（図１３を参照されたい）。
コスミドのパッケージング

ＤＮＡを、Ｅｎｄ－Ｉｔ ＤＮＡ Ｅｎｄ－Ｒｅｐａｉｒキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＥＲ０７２０）を使用して平滑末端にし、イソプロパノールによって沈殿させた。２５０ｎｇの平滑末端ＤＮＡを含有するおよそ１０個のライゲーション反応物を、５００ｎｇの平滑末端コスミドベクター（Ｔ４リガーゼ、ＮＥＢ、Ｍ０２０２）と組み合わせ、コスミド骨格にクローニングした。クローニングしたＤＮＡを、ファージにパッケージングし、ＭａｘＰｌａｘ（商標）パッケージングキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＭＰ５１２０）を使用して製造元の使用説明書に従ってＥ．ｃｏｌｉに形質導入した（図１３を参照されたい）。簡単に説明すると、ファージを含むパッケージング抽出溶液を、気泡を導入しないように数回ピペッティングすることによって断片化したＤＮＡと混合する。反応物を３０℃で９０分間インキュベートした。さらに２５μｌの融解したパッケージング抽出溶液を加え、反応物を３０℃でさらに９０分間インキュベートした。インキュベートした試料をファージ希釈緩衝液によって希釈し、穏やかにボルテックス撹拌した。取り込まれていないファージタンパク質は、クロロホルムを加え、試料を穏やかに混合することによって沈殿させた。希釈液を宿主Ｅ．ｃｏｌｉ細胞と混合し、室温で２０分間インキュベートして、ファージを接着させた。トランスフェクトした細胞を、３７℃で７５分間回収し、適切な抗生物質選択を含有するＬＢ寒天に播種した。パッケージング効率を、製造元の使用説明書に従ってパッケージング反応の一部に関して測定した。
プーリングおよび配列決定

実施例２は、１０×カバレッジで天然物発見（例えば、少なくとも１５，０００ｂｐのＮ５０を有する）に供されるＤＭＬをなおも産生する最大約３４，０００個のクローンをプールすることが可能であるが、最大効率は、プール当たり約６，０００～約１５，０００個のクローンの範囲で達成されることを実証した。予算の制限内で可能性がある最良のライブラリーを産生する努力において、形質導入されたコスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉを、測定されたファージパッケージング効率に基づいて各々がおよそ６，０００～１０，０００個のコスミドのプール（「Ｅ．ｃｏｌｉコスミドプール」）に組み合わせた。各々のＥ．ｃｏｌｉコスミドプールを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ（登録商標）ＤＮＡ ライブラリー Ｐｒｅｐキットを使用して配列決定のために調製し、ＨｉＳｅｑ ４０００またはＮｏｖａＳｅｑ ６０００ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンサーにおいて配列決定した（図１４を参照されたい）。
逐次的アセンブリー

プールした試料からのリードをトリミングし、品質をフィルタリングし、ペアエンドリードを、ＢＢＴｏｏｌｓを使用して融合した。混入している配列（例えば、クローニングベクター、宿主ゲノム）もまた、ＢＢＴｏｏｌｓを使用して除去した。きれいな融合および非融合ペアエンドリードを、ＳＰＡｄｅｓバージョン３．１０．１を使用してアセンブルした。Ｎ５０長が約１８ｋｂの得られたコンティグアセンブリーを使用して、異なるコンティグおよびプールにわたってより長いアセンブリーを調製した（図１５を参照されたい）。得られたクロスプールアセンブリーは、Ｎ５０が約３２ｋｂの大きい配列コンティグを産生した。アセンブルされた配列を、データベースに追加し、これを「デジタルメタゲノミクスライブラリー」と呼んだ。
物理的プールの配置

Ｅ．ｃｏｌｉコスミドプールを、長期保存のために個々の凍結バイアルにおいてグリセロール中で保存した。二連のＥ．ｃｏｌｉコスミドプールを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のグリセロールストックとして、または前記ストックからの単離されたＤＮＡとして９６ウェルフォーマットで保存した（図１６を参照されたい）。これらを「メタゲノム物理的ライブラリー」と呼んだ。デジタルメタゲノミクスライブラリー中の各配列を、データベースを介して、保存されたメタゲノム物理的ライブラリー内の対応する物理的ＤＮＡ断片の位置と関連させた。
（実施例４）
本開示のデジタルメタゲノムライブラリーおよび公開されているアセンブルされたメタゲノムライブラリーを使用するＭＧＣ発見の比較

デジタルメタゲノムライブラリーを、実施例３に記載のプロトコールと同じプロトコールに従って調製した。ライブラリーを、実施例１および２で遂行されたシミュレーションから収集した推奨に従って産生した。得られたライブラリーは、それが由来する土壌環境試料を広く代表し（例えば、図２８を参照されたい）、改善されたＭＧＣ発見のために＞１５，０００ｂｐのＮ５０を示した。

これらの上記で参照したライブラリー設計選択を検証するために、本発明者らは、本実施例からのＤＭＬと、公開されている最大の土壌メタゲノム（プロジェクトＩＤ Ｇｐ００５１４４１のＪｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ土壌メタゲノムライブラリー、本明細書において「ＪＧＩ土壌メタゲノム」と呼ぶ）の１つのライブラリーとの実世界での比較を遂行した。ＪＧＩ土壌メタゲノムは、カンザス州、ウィスコンシン州、およびアイオワ州の自然の草原の土壌試料から収集した土壌に基づき、Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｇｅｎｏｍｅポータル／／ｉｍｇ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍ／ｍａｉｎ．ｃｇｉ？ｓｅｃｔｉｏｎ＝ＴａｘｏｎＤｅｔａｉｌ＆ｐａｇｅ＝ｔａｘｏｎＤｅｔａｉｌ＆ｔａｘｏｎ＿ｏｉｄ＝３３０００００９５６で公開されている（同様に、Ａｄｉｎａ Ｃｈｕａｎｇ Ｈｏｗｅ， Ｊａｎｅｔ Ｋ． Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ Ａ． Ｍａｌｆａｔｔｉ， Ｓｕｓａｎｎａｈ Ｇ． Ｔｒｉｎｇｅ， Ｊａｍｅｓ Ｍ． Ｔｉｅｄｊｅ， Ｃ． Ｔｉｔｕｓ Ｂｒｏｗｎ． ”Ｔａｃｋｌｉｎｇ ｓｏｉｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍａｒ ２０１４， ２０１４０２５６４； ＤＯＩ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．１４０２５６４１１１も参照されたい）。

ＪＧＩメタゲノムライブラリーは、本開示のＤＭＬのわずか１．８４と比較して８．８８ギガ塩基対の総アセンブル長を有した。実施例３で産生されたＤＭＬは、１５，０００ｂｐより大きい平均Ｎ５０を有したが、ＪＧＩメタゲノムは９８５の平均Ｎ５０を有した。

ＪＧＩメタゲノムライブラリーおよびＤＭＬをいずれも、ａｎｔｉＳＭＡＳＨ ５．０を使用して解析して、長さが１０ｋｂより長いいくつかの推定上の多重遺伝子クラスターを同定した。この解析のこの結果を、図２４に要約する。ａｎｔｉＳＭＡＳＨは、ＤＭＬにおいて１２８７個の推定上のクラスターを同定したが、ＪＧＩメタゲノムライブラリーではわずか１２０個の推定上のクラスターを同定したに過ぎなかった。これらの結果は、配列のギガ塩基当たりに同定されたクラスター数を提供する図２５においてよりよく表される。ＪＧＩメタゲノムライブラリーは、ギガ塩基当たり１３．５個の推定上のクラスターを生じたが、本開示のＤＭＬは、配列のギガ塩基当たり７００個の推定上のクラスターを生じた。

このように、公開されているメタゲノムライブラリーと比較すると、本開示のＤＭＬは、推定上のクラスターヒットの生成において５０倍より多く良好であった。
（実施例５）
メタゲノムライブラリーにおける天然物の同定（抵抗性シグナル検索）

実施例３のデジタルメタゲノムライブラリー（ＤＭＬ）を設計および検証後、次に本発明者らは、製品発見ワークフローをこのＤＭＬに適用することを求めた。本実施例は、本文書の「抵抗性遺伝子検索ワークフロー」のセクションに考察されているように、新規天然物の同定に関する多重遺伝子クラスター特色セットの抵抗性シグナルに基づく検索を例証する。本実施例は、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルとして、推定上の標的バリアントに基づく抵抗性配列を使用した。本実施例は、抵抗性遺伝子検索ワークフローを適用して、候補抵抗性遺伝子を同定するための標的遺伝子として公知の抵抗性遺伝子を使用することによって、既存の天然物に関連する新たな天然物を同定する。
適用の標的

プロテアソームの阻害剤はいずれも、承認された抗がん剤（例えば、カルフィルゾミブ）ならびに臨床開発中の抗がん剤（例えば、マリゾミブ）である。カルフィルゾミブ（Ｃａｒｆｉｌｘｏｍｉｂ）およびマリゾミブはいずれもそれぞれ、細菌天然物であるエポキソミシンおよびサリノスポラミドＡに基づいている。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ細菌のある特定の種におけるサリノスポラミドＡをコードする生合成遺伝子クラスターは、サリノスポラミドＡを産生するために必要な全ての生合成酵素を含有する。これらの酵素に加えて、生合成遺伝子クラスターは、サリノスポラミドＡの効果に対して抵抗性であるプロテアソームのベータサブユニットのバリアントをコードする遺伝子（抵抗性遺伝子）を含有する。このタンパク質バリアントの発現は、サリノスポラミドＡの存在下で産生細菌が生き延びることを可能にする。新規天然物である低分子プロテアソーム阻害剤は、プロテアソームのベータサブユニットのバリアントをコードする抵抗性遺伝子を含有する生合成遺伝子クラスターによってコードされ得る。これらの新規天然物プロテアソーム阻害剤は、新規抗がん剤の足場構造として役立ち得る。
ＨＭＭの選択

ＨＭＭライブラリー（ＰＦＡＭおよびＴＩＧＲＦＡＭ）を、プロテアソームのベータサブユニットに関する適切なＨＭＭを同定するために検索した。ＴＩＧＲ０３６９０を選択し、検索問い合わせとして使用した。
メタゲノムライブラリーにおける抵抗性遺伝子の検索－天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルに関してデジタルメタゲノミクスライブラリーを問い合わせる

上記で同定されたＨＭＭモデルを使用して、実施例３によって産生されたデジタルメタゲノミクスライブラリーにおけるプロテアソームのベータサブユニットをコードする微生物遺伝子（標的遺伝子、抵抗性遺伝子）に関して検索した。検索によって、「候補配列」と名付けられる一連の配列が同定された。各候補配列を、モデルによって割り当てられる信頼度スコアに関連させた。１ｅ－１０の最大Ｅ値を確立して、さらなる解析のための上位ヒットを選択した。一部の例では、配列を９７％同一性で複製排除した。
複数のシグナル関連の（多重遺伝子クラスター）デジタル特色セットとしてのＨＭＭ問い合わせの出力を供給する

上記で同定された１個または複数の候補配列をコードするアセンブルされた配列（すなわち、プロテアソームのベータサブユニットをコードする遺伝子）を、シグナル関連の（多重遺伝子クラスター）デジタル特色セットを表す新規ファイルにダウンロードした。
多重遺伝子クラスターの同定－シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットに対する生物学的関連性を決定することおよび割り当てること

これらのデジタル特色セットを、ａｎｔｉＳＭＡＳＨクラスター解析ツールを使用して多重遺伝子クラスター特色セットの存在について解析した（Ｋａｉ Ｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ． ”ａｎｔｉＳＭＡＳＨ ５．０： ｕｐｄａｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ｐｉｐｅｌｉｎｅ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１９）、／／ａｎｔｉｓｍａｓｈ．ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．ｏｒｇ／＃！／ｓｔａｒｔで入手可能なツールを参照されたい）。遺伝子クラスターに関連する生合成および他の配列に基づくシグナルの存在に基づくＭＧＣの同定（例えば、ａｎｔｉＳＭＡＳＨを使用する）はまた、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定すること、および生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色をデジタル処理でアセンブルすることと呼ばれる。
コンピューターによって決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットの閾値パラメーター内に位置するコンピューターによって決定された生物学的抵抗性遺伝子に基づいて目的の天然物をコードするＭＧＣを同定する

初期のステップで同定された抵抗性遺伝子（候補配列）の位置を、上記のａｎｔｉＳＭＡＳＨを介して同定されたＭＧＣの位置に対して比較した。その予測される境界内またはこれらの境界から５～１０ｋｂ以内に候補配列を含有する２０個の予測される天然物多重遺伝子クラスターを、さらなる解析のために選択した。
多重遺伝子クラスターの必要に応じた優先順位付け

本実施例の目標は、エポキソミシンに対して構造の類似性を有する、潜在的抗がん特性を有する天然物の新規バリアントをコードするＭＧＣを同定することであった。ボナフィド抵抗性遺伝子を含有する天然物多重遺伝子クラスターに関して富化するために、追加の基準を使用して、最も重要な目的のクラスターを選択した。推定上の抵抗性遺伝子（候補遺伝子）を、ＢＬＡＳＴを利用してヒトプロテオームと比較して、推定上の抵抗性遺伝子に対する最も強いタンパク質のマッチが、プロテアソームのベータサブユニットの構成成分であることを確認した。これはまた、「天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルに関してデジタルメタゲノミクスライブラリーを問い合わせる」ステップにおける抵抗性遺伝子相同性検索のストリンジェンシーを単に増加させることによっても達成されていることに注意されたい。

ａｎｔｉＳＭＡＳＨ解析からのヒットもまた、ＢＩＧＳｃａｐｅを介して解析して、したがって同定された多重遺伝子クラスターと群としての多重遺伝子クラスターの間の関係を同定した（Ｎａｖａｒｒｏ－Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ． ”Ａ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄａｔａ” ＢｉｏＲｘｉＶ ２０１８、ｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／ｂｉｇ－ｓｃａｐｅ－ｔｏｏｌで入手可能なツールを参照されたい）。一部のワークフローでは、多重遺伝子クラスターのリストを、１）多重遺伝子クラスターの予測される長さ、および２）Ｋａｉｊｕによって割り当てられる多重遺伝子クラスターの予測される分類学によってさらにフィルタリングした。

プロテアソームのアルファサブユニットをコードする遺伝子に隣接するプロテアソームのベータサブユニットをコードする遺伝子を含有する多重遺伝子クラスターは、抵抗性遺伝子として役立つ可能性が低いと思われ、セットから除去した。

これらのステップは、検証のために選択した３つの優先順位の高い多重遺伝子クラスターに対して候補クラスターのプールの優先順位を付けた。

この方法のｉｎ ｓｉｌｉｃｏステップを概要するフローチャートを図６に提供する。
ＮＰ検証

本実施例のワークフローステップは、エポネマイシン（１，２－エポキシ－２－ヒドロキシメチル－４－（Ｎ－イソオクタノイルセリルアミノ）－６－メチルヘプタ－６－エン－３－オン）を産生することが文献ですでに報告されているＭＧＣを同定した。エポネマイシンクラスターの同定は、このように抵抗性遺伝子検索ワークフローのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ部分を検証した。

本実施例における追加の候補ＭＧＣを、ウェットラボ技術を介して検証する。候補配列の近位に多重遺伝子クラスターを含むと上記で同定された配列を含むＤＮＡを、メタゲノム物理的ライブラリーから回収する。簡単に説明すると、多重遺伝子クラスターを含む所望のＤＮＡ配列の位置を、各々の配列が物理的に位置するプレートおよびウェル（すなわち、メタゲノム物理的ライブラリー内の位置）を指し示すメタゲノムデータベースから得る。次に、同定されたＤＮＡ配列を物理的ライブラリー（例えば、プールから目的の配列を単離するために一連の希釈を介して）から回収し、多重遺伝子クラスターを含むＤＮＡ配列をクローニングし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＴＡＲ）を使用してプラスミドベクターにおいて再アセンブルする。ベクターを使用して、多重遺伝子クラスターをＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．の微生物宿主に導入した。次に、改変された微生物宿主細胞を培養し、ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテアソームに結合するかもしくはそれ以外の方法で相互作用する、および／またはｉｉ）プロテアソームの阻害を介して細胞に対して毒性である天然物の産生について試験し、同定された多重遺伝子クラスターにおいて（またはその近位で）同定された候補抵抗性遺伝子の発現を保持する。
（実施例６）
抵抗性遺伝子の存在／知識がない場合のクラスターによって産生された天然物の同定（推移的な検索ワークフロー）

本実施例は、本文書の「推移的な多重遺伝子クラスター特色セット発見ワークフロー」のセクションで考察されたように、容易に同定可能な抵抗性遺伝子を欠如する多重遺伝子クラスター特色セットの発見のための方法を例証する。このアプローチを使用して、公知のまたは予測される抵抗性遺伝子を有する公知のクラスターを含む、他の公知のクラスターに対するその類似性に基づいて新規多重遺伝子クラスターを同定することができる。

実施例５で同定された多重遺伝子クラスターをさらに解析して、前記クラスターに対して共通の特有の酵素構成成分を同定した。エポネマイシンを産生することが公知のクラスターを追加の解析のために選択した。エポネマイシンコードクラスターの配列解析は、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤ）遺伝子（ＡＨＢ３８５０８．１）を同定し、これはエポネマイシンにおいて見出される特有のエポキシケトンの形成にとって必須である（すなわち、「コア生合成遺伝子／酵素」）非リボソームペプチドシンテターゼおよびポリケチドシンターゼ遺伝子に関連した。エポネマイシンに構造的に関連する分子をコードするクラスターを同定するために、ＡＨＢ３８５０８．１配列を使用して実施例３のデジタルメタゲノムライブラリーのＢＬＡＳＴ検索を行って、高い同一性スコアを有する他のＡＣＡＤ遺伝子を同定した。次に、上位２５０のヒットを、推定上のＡＣＡＤ遺伝子のすぐ周囲のＤＮＡのデータベースを創出することによってさらに解析した。これは、さらなる解析のためにＡＣＡＤ遺伝子を含有するコンティグ全体を得ることによって達成された。ＤＭＬは、メタゲノムデータベースにおいて同定された２５０個の推定上のＡＣＡＤ遺伝子の各々の２０ｋｂ上流および２０ｋｂ下流を含有した。次に、ＡＣＡＤ遺伝子を含有するこれらの選択された配列を、ａｎｔｉＳＭＡＳＨを使用して解析して、推定上の多重遺伝子クラスター内に含有されるＡＣＡＤ遺伝子を同定した。具体的には、ＮＲＰＳおよびＰＫＳ含有遺伝子クラスターに関連するヒットが同定された。全体で２２個のヒットが、エポネマイシン様天然物をコードすることができる推定上の新規多重遺伝子クラスターとして同定された。

これらの２２個の推定上のヒットを、ｉ）元のエポネマイシンクラスターと類似のサイズ（すなわち、約２０ｋｂ～４０ｋｂの範囲）、およびｉｉ）コア生合成遺伝子／酵素の類似の相補体（例えば、１～２個のＰＫＳ様分子、２～５個のＮＲＰＳ様分子、および上述のＡＣＡＤ遺伝子の存在）を示すヒットに関してさらにフィルタリングした。これらのフィルターは、配列を検討から除外するものではなかったが、その代わりに実験の検証のためにヒットの優先順位を付けるために使用した。

本発明者らが２２個のヒットを調べると、本発明者らは、エポキソミシンと呼ばれるエポキシケトン含有分子または近縁のアナログをコードする２つのクラスターをデータベースにおいて同定した。エポキソミシンクラスター内に抵抗性遺伝子がないにもかかわらず、エポキソミシンは、プロテアソームのベータサブユニットの阻害剤として特徴付けられている。
（実施例７）
メタゲノムライブラリー（標的化されない抵抗性シグナル検索）における天然物の同定

本実施例は、ｄｅ ｎｏｖｏ多重遺伝子クラスター特色セット発見のための方法であって、検索を始めるために推定上の抵抗性遺伝子を予め選択する必要がない方法を例証する。本実施例は、一般的に本文書の「標的化されない抵抗性シグナル多重遺伝子クラスターセット発見ワークフロー」のセクションに概要されるワークフローに従う。一部の場合では、本実施例の方法は、公知の抵抗性遺伝子に対する前記新規抵抗性遺伝子の配列同一性に依存することなく、新規抵抗性遺伝子を同定することができる。
天然物の生合成に関係する酵素の生合成データベースの創出

天然物遺伝子クラスターの公開データベース（ＭＩＢｉＧ／／ｍｉｂｉｇ．ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄ）に含有される生合成酵素を同定する。これらの生合成酵素のアミノ酸配列を、アノテーション「生合成」および「生合成－追加」を介して問い合わせ、配列ｇｅｎｂａｎｋファイルから抽出する。得られたアミノ酸配列セットを、ＣＤ－ＨＩＴを使用してクラスターにして、冗長性を低減する。得られたアミノ酸配列の非冗長セットは、生合成酵素データベースを表し、これを使用して生合成酵素ホモログを同定するためにより大きいセットの配列に対して問い合わせることができる。
メタゲノムライブラリーにおける多重遺伝子クラスター同定（仮想例）－長いアセンブリーデジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターによって予測する

実施例３によって産生されるデジタルメタゲノミクスライブラリーを、ａｎｔｉＳＭＡＳＨクラスター解析ツールを使用して多重遺伝子クラスター特色セットの存在について解析する（Ｋａｉ Ｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ． ”ａｎｔｉＳＭＡＳＨ ５．０： ｕｐｄａｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｎｅ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ｐｉｐｅｌｉｎｅ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１９）、／／ａｎｔｉｓｍａｓｈ．ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．ｏｒｇ／＃！／ｓｔａｒｔで入手可能なツールを参照されたい）。得られたａｎｔｉＳＭＡＳＨ出力は、同定された遺伝子クラスターのリストならびにそれらのクラスター内の重要な生合成酵素の機能的アノテーションを含む。
同定されたＭＧＣ内の推定上の抵抗性遺伝子の同定（仮想例）－予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子のアノテートおよび予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セットからのアノテートされた遺伝子のフィルタリング

同定された多重遺伝子クラスター内の推定上の抵抗性遺伝子は、除去のプロセスを介して行われる。多重遺伝子クラスター内の遺伝子のアノテーションを、ａｎｔｉＳＭＡＳＨによって予測されるまたは本発明者らの生合成データベースに含有される天然物の生合成に関係することが高度の信頼度で予測されるあらゆる配列を除去するようにフィルタリングする。予測される生合成機能を有しない多重遺伝子クラスター内の残りの遺伝子は、「候補抵抗性遺伝子」として見なされ、さらに解析される。

標的タンパク質のバリアントをコードすることによって抵抗性を提供しない抵抗性遺伝子を同定するＲｅｓＦａｍデータベースからのＨＭＭを使用して、非タンパク質バリアント抵抗性遺伝子を同定し、解析から除去した。残っている候補抵抗性遺伝子を、公開データベースにおける前記遺伝子の推定上のオルソログを同定することによってｉｎ ｓｉｌｉｃｏで調べる。同定されたオルソログは、コードされる天然物の推定上の標的を提供する。
ＮＰおよび抵抗性の検証（仮想例）

候補遺伝子の近位で多重遺伝子クラスターを含むとして上記で同定された配列を含むＤＮＡを、メタゲノム物理的ライブラリーから回収する。簡単に説明すると、多重遺伝子クラスターを含む所望のＤＮＡ配列の位置を、各々の配列が物理的に位置するプレートおよびウェル（すなわち、メタゲノム物理的ライブラリー内の位置）を指し示すメタゲノムデータベースから得る。次に、同定されたＤＮＡ配列を、物理的ライブラリーから回収し（例えば、プールから目的の配列を単離するために一連の希釈を介して）、多重遺伝子クラスターを含むＤＮＡ配列をクローニングし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＴＡＲ）を使用してプラスミドベクターにおいて再アセンブルする。ベクターを使用して、多重遺伝子クラスターをＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．微生物宿主に導入する。次に、改変された微生物宿主細胞を培養し、空のベクター対照では見出されない天然物の産生に関して試験する。

天然物を半精製し、非改変微生物宿主に対するその毒性をディスク拡散アッセイによって確認する。推定上の抵抗性遺伝子を非改変微生物宿主細胞において発現させると、天然物はもはや毒性ではない。結合アッセイは、天然物が仮説の標的タンパク質と相互作用することを実証する。
（実施例８）
天然物のアナログ化

本実施例は、天然物分子のアナログ化のための本明細書に開示の方法のいくつかを例証する。具体的には、例は、メタゲノムライブラリーから酵素のパネルを同定および編集するための予測的機械学習モデルの使用を記載する。次に、これらのパネルを、天然物分子に適用して（または天然物を産生する株のゲノムに組み込み）、新規アナログを産生する。
メタゲノムライブラリーからの酵素の選択

ＨＭＭは、１）メタゲノムの多様性を広く標本抽出するため、および／または２）目的の酵素－基質活性に関して富化すると考えられる配列特徴を含有するように選択された３８４個のアルド－ケトレダクターゼ遺伝子を同定するために開発された。
酵素パネルの構築

酵素パネルを含む所望のＤＮＡ配列の位置を、各々の配列が物理的に位置するプレートおよびウェル（すなわち、メタゲノム物理的ライブラリー内の位置）を指し示すメタゲノムデータベースから得た。次に、同定された配列を物理的ライブラリー（例えば、ＰＣＲを介して）から回収し、発現プラスミドにクローニングし、微生物宿主細胞に形質転換する。次に、これらの宿主細胞を９６ウェルまたは３８４ウェルフォーマットに配置する。
活性酵素のアッセイおよび同定

目的の酵素を発現させるために、発現プラスミドを含有する微生物株を、抗生物質選択下、自己誘導培地中で培養する。誘導後、微生物培養物を採取し、溶解し、清澄化して特徴付けのために目的の過剰発現された酵素を放出させる。

酵素パネルの活性を特徴付けるために、清澄化ライセートを、基質、緩衝液、および他の関連する添加剤を明瞭なマーカー（例えば、公知の吸光度を有する補因子）と共に含有する反応混合物中でインキュベートする。活性を、反応の経過にわたる吸光度の強度の変化によって測定する。活性酵素バリアントは、反応期間を通して対照より小さい吸光度差を示した。

一例として、アルド－ケトレダクターゼ酵素パネルは、経時的な還元ニコチンアミドであるアデニンジヌクレオチド（リン酸）の消費をモニターするエンドポイント比色アッセイによって特徴付けられる。基質の酵素による還元（アナログ化）は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化を必要とし、したがって、酵素パネルの活性はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費と連動し、これを３４０ｎｍでの吸光度の減少によってモニターすることができる。

過剰発現された酵素バリアントを含有する清澄化ライセートを、設定濃度の基質（ゲルダナマイシン）、リン酸緩衝液およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈと共に混合した。反応混合物の吸光度を、反応の開始および終了時に得て、吸光度差を決定する。対照をまた使用してバックグラウンド吸光度を決定する。バックグラウンドを超える正の吸光度差を有するバリアントを含有する反応混合物を解析して、所望のアナログ、還元されたゲルダナマイシンの産生を確認する。
ｉｎ ｖｉｖｏ活性
ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素パネルスクリーニングを介して同定されたゲルダナマイシンに作用することができる酵素バリアントを、発現プラスミドにクローニングし、ゲルダナマイシンの天然の産生体であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓに形質転換する。発酵および質量解析後、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで同定されたゲルダナマイシンの還元型を、形質転換された微生物細胞において同定する（図１０を参照されたい）。
（実施例９）
訓練データセットを使用してアナログ化のための候補配列のプールを生成するためにメタゲノムデータベースに適用される予測的機械学習モデルを生成する－カスタムＡＫＲ ＨＭＭアプローチ

これらの実施例は、メタゲノムライブラリーから候補酵素のパネルを同定および編集するための予測的機械学習モデルの使用を記載する。この選択の目的は、Ａ）大きい配列ライブラリー（例えば、本開示のメタゲノムライブラリー）全体にわたる試料の多様性を標本抽出すること、および／またはＢ）本明細書に記載の予測モデルが目的の酵素－基質活性に関して富化する能力を実証することであった。

このように、実施例９および１０は、アナログ化プラットフォームのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ部分を表す。後の実施例１１は、候補となるアナログ化酵素の同定されたプールをクローニングして発現させ、それらを、天然物分子に対して試験して新規アナログを産生する。行われた戦略のさらなる詳細を以下に考察する。

典型的なアルド－ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）配列の最初の訓練データセットを、文献およびアノテートされたデータベースの再検討から産生した。これは、本明細書において「遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップ」と呼ばれる。

これらの訓練データセット配列を使用して、多重配列アライメント（ＭＳＡ）を生成し、これをさらに使用して、本文書で記載されるカスタム予測的機械学習ＨＭＭモデルを開発した。これは、本明細書において「訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップ」と呼ばれる。

次に、カスタムＡＫＲ ＨＭＭを、実施例３のデジタルメタゲノムライブラリーに対して実行して（または適用して）候補ＡＫＲ配列のプールを同定し、これを本明細書においてＨＭＭ出力配列と呼ぶ。これは、本明細書において「コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有するメタゲノムライブラリーに適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップ」と呼ばれる。全体で１１０，２３２個の最初の配列が、ＨＭＭによって同定された。

目的の配列に関してさらに富化するために、これらのＨＭＭ出力配列を、サイズによってフィルタリングする（それぞれ、１５０～１，５００個のアミノ酸の許容される最小／最大の長さを確立する）。この制限は、同定されたいかなる配列も完全なＡＫＲ酵素を表すことを確実にするためであった。このフィルタリングステップの結果によって１０７，８３８個のヒット数が得られた。

結果を、その後の検証段階においてヒットの多様性をよりよく標本抽出するためにその配列類似性に基づいて候補配列を群分けするためにＣＤ－ＨＩＴを使用して４０％ＩＤによってさらにクラスター化した。ＣＤ－ＨＩＴによって生成された２，４０４個のクラスターをそのサイズ（クラスターサイズは、クラスター当たりの配列数である）によって選別した。その後、２，４０４個中１７７個のクラスターを、クラスターサイズによって１０７，８２８個の配列を表すように、すなわち最大の１７７個のＣＤＨＩＴクラスターを表すように選択した。１７７個のクラスターの各々の代表的な配列を同定するために、クラスターの重心を以下のように選択した：最初に、クラスターの全ての配列を、ＭＡＦＦＴアルゴリズムを使用して整列させた。次に、得られた多重配列アライメントを、ＨＭＭＢＵＩＬＤソフトウェアを使用してＨＭＭに変換した。このステップの後、このＨＭＭをクラスターの全ての配列に対して実行した。最高スコアの配列を、最終的にＣＤＨＩＴクラスターの代表として選択した。このステップは、モデルによって同定されるが新たな酵素の発見にとって必ずしも必要ではない配列の可能な限り広い像を提供するために遂行された。

１７７個の候補ＡＫＲ配列を、この検索のヒットの中からさらなる検証のために選択した。１７７個の試験したヒットのうち２つが、初回スクリーニングにおいてブレフェルジンＡをアナログ化することが可能であると検証された。これらの酵素はまた、エリスロマイシンおよびサリノマイシンに対しても活性を示した。結果のより詳細な考察を、本開示の実施例１６に提供する。
（実施例１０）
訓練データセットを使用して、アナログ化のための候補配列のプールを生成するためにメタゲノムデータベースに適用される予測的機械学習モデルを生成する－カスタムＨＭＭライブラリー
本実施例は、結果の多様性を標本抽出するために、ＨＭＭ結果セットの中から遺伝子を選択するための代替アプローチを記載する。実施例９では、結果を、配列同一性に基づいて結果をクラスター化することによって標本抽出した。本実施例では、本発明者らは、実施例９からの１０７，８３８個のＨＭＭ出力配列を表す配列セットを生成した。これは、全ての２，４０４個のＣＤＨＩＴクラスターの「クラスター重心」を計算することによって達成された。加えて、本発明者らは、公開されているＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに対して上記で言及したカスタムＨＭＭを実行し、これによって追加の３７８個の配列が、２，４０４個のＣＤＨＩＴ４０クラスター重心に加えられた。本発明者らはこれらのセットを２，７２２個の配列を含む単一の配列セットに組み合わせた。このセットを使用して、配列類似性ネットワークを生成した。これは、全てのこれらの２，７２２個の配列に関してａｌｌ－ｂｙ－ａｌｌ ＢＬＡＳＴを実行することによって達成され、全てのこれらの配列に関してペアワイズ類似性行列を生じた。この行列を次に、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅソフトウェアを使用して、各々のノードが配列を表し、エッジがペアワイズＢＬＡＳＴ類似性を表すネットワークとして表した。クラスターを可視化するために環流力学的モデル（Ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｆｏｒｃｅｄ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｌａｙｏｕｔ）に基づくレイアウトを使用した。

このステップの後、いくつかのエッジ組み入れカットオフ（ペアワイズＢＬＡＳＴビットスコアによって表される）を、このネットワークに関して手動で標本抽出した。このステップは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを起源とする配列から利用可能な情報によって誘導された。すなわち、８０というエッジ組み入れカットオフ（ペアワイズＢＬＡＳＴビットスコア）を選択して、ＡＫＲスーパーファミリー（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔによって定義される）の異なるサブファミリーに属するＡＫＲホモログを含む配列クラスターを生成した。この手順は３９個の配列類似性クラスターをもたらした。

本発明者らは次に、これらの３９個の広い配列類似性クラスターを使用して、以下のように３９個のカスタムＨＭＭのセットを創出した。各クラスターにつき１つの３９個の配列セットを、ＭＡＦＦＴアルゴリズムを使用して整列させ、次にこれを使用してＨＭＭＢＵＩＬＤソフトウェアを使用してＨＭＭを生成した。これは、刊行物またはアノテートされたデータベースにおいて同定されたものを超えて拡大された一連の配列に基づくＨＭＭモデルを提供した。

次に、全てのこれらの３９個のカスタムＨＭＭライブラリーモデルを、実施例３のメタゲノミクスライブラリーを検索するために使用した。特異的ＨＭＭビットコアカットオフを、所定のＨＭＭのヒットが、他のＨＭＭのいずれのヒットも含まないように（ビットスコアの値は１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、１９０、２６０、２６０、２７０、２８０、２９０、２９０、３００、３００、３００、３００、３００、３１０、３１０、３４０、３４０、３４０、３５０、３７０、３７０、３７０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４１０、４３０、４３０、４３０、４４０、４９０、５２０、および６１０であった）手動で決定した。多くのヒットがなおも各ＨＭＭに関して見出されたことから、ＣＤＨＩＴアルゴリズムを使用して、４０％ＩＤを使用してありとあらゆるこれらの３９セットのヒットをクラスター化した。次に、最大クラスターの上記の７つを参照する重心配列を、３９個の配列セットの各々を代表するように選択した。

１６８個の候補ＡＫＲ配列を、この検索のヒットの中からさらなる検証のために選択した。試験した１６８個のヒットのうち１つが、以下の実施例１６に記載されるようにゲルダナマイシンのアナログ化ができると検証された。
（実施例１１）
天然物に対する候補ＡＫＲ配列の実験による検証

本実施例は、上記の予測エンジンを介して同定された候補配列が実験的に検証される、本開示のアナログ化方法の「ウェットラボ」部分を開示する。

実施例９～１０で同定された３４５個の候補ＡＫＲ配列のプールを、先の実施例で利用されたメタゲノムライブラリーの既存の物理的ライブラリーからＰＣＲによって増幅した。プライマー３を使用して、増幅のための固定化末端プライマーを設計した。ハイスループットでクローニングするために、相同な配列を、ｐＥＴ２４ａ発現プラスミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の複数のクローニング部位内で有効なギブソンアセンブリーのために各遺伝子アンプリコンに挿入した。２０μＬのＰＣＲを、Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって、タッチダウンＰＣＲサーモサイクラー条件（７２℃のアニーリング温度、－１℃／サイクルで８サイクルによるタッチダウン後に、６４℃のアニーリングを２８サイクル）によって行った。ＰＣＲ産物を、磁気ビーズクリーンアッププロトコール（ＤＮＡクリーンアップおよび濃縮Ｍａｇｂｅａｄキット、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。

発現プラスミドを、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ／ＮｏｔＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって消化し、精製した（ＱｉＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ）後にアセンブルした。ギブソンアセンブリー（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリー）および化学的形質転換（１０－ベータコンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、ＮＥＢ）プロトコールを、９６ウェルおよび３８４ウェルプレートフォーマットでのハイスループット自動化のために適合させた。３４５個中２２８個の遺伝子が首尾よくクローニングされた。成功したクローンをミニプレップし（Ｑｉａｇｅｎ、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ ９６キット）、発現宿主（ＢＬ２１－ＤＥ３、ＮＥＢ）に形質転換した。

最適な発現のために、１ｍＬのＢＬ２１－ＤＥ３ ｐＥＴ２４ａ－ＡＫＲ株を、９６ディープウェルプレート中、自己誘導培地＋カナマイシンを使用して、２５℃での誘導によって培養した。一晩誘導後、培養物を、５０００ｒｐｍ、１０℃で１０分間の遠心分離によって採取した。沈降物を再懸濁し、２５０μＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒマスターミックス（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して溶解した。次に、溶解した細胞を沈降させ、脱塩プレート（Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｐｌａｔｅｓ－７Ｋ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の中を通過させて緩衝液を交換し、特徴付けのために過剰発現された酵素ライセートを清澄化した。

クローニングしたＡＫＲライブラリー活性を、ゲルダナマイシン、エリスロマイシン、ブレフェルジンＡ、およびサリノマイシン天然物に対して特徴付けるために、還元されたニコチンアミドであるアデニンジヌクレオチド（リン酸）の消費をモニターするエンドポイント比色アッセイを開発した。基質の酵素による還元は、ＮＡＤ［Ｐ］Ｈが酸化される必要があり、したがってこの酵素パネルの活性はＮＡＤ［Ｐ］Ｈの消費と連動し、これを３４０ｎｍでの吸光度の低減によってモニターすることができる。反応混合物の吸光度を、反応の最初と最後に得て、吸光度差を決定する。対照もまた使用して、バックグラウンド吸光度を決定することができる。バックグラウンドを超える正の吸光度差を有するバリアントを含有する反応混合物を解析して、所望のアナログ、例えば還元されたブレフェルジンＡの産生を確認する。１８０μＬマスターミックス、１００μＭ ＮＡＤ［Ｐ］Ｈ、１７５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７中の２００μＭ天然物（例えば、ブレフェルジンＡ）、および２０μＬの清澄化ライセートを含有する２００μＬ反応物の９６ウェルプレートを、２２℃で１．５時間にわたって振とうした。

実施例９～１０からの２２８個の酵素バリアントのスクリーニング後、対照より低い有意な吸光度差を示す３つの活性バリアントを、アナログの確認のために提出した。同定された酵素は、ゲルダナマイシン（Ｇｅｌｄａｍｙｃｉｎ）、エリスロマイシン、ブレフェルジンＡ、およびサリノマイシンに対して活性を示した。

追加の特徴付けを、有意な正の吸光度差を生成した反応について行った。１００μＬアリコートを、アセトニトリルと１：１の比で混合してタンパク質および緩衝塩を破砕し、撹拌後、有機層の液体抽出を行った。抽出した溶媒５μＬを、解析のためにＬＣ－ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ）に注入した。ブレフェルジンＡの場合、推定上の反応産物が２８１．１７４７ｍ／ｚで観察され、保持時間は１．６９分であった。この質量の電荷に対する比および保持時間は、比色測定結果が所望の酵素活性を示唆する反応混合物において一貫して観察された。対照として、空の株（ｐＥＴ２４ａ）もまた解析し、推定産物は検出されなかった。これは、適切な活性が観察されなかった他のＡＫＲバリアントに関して一貫した。このように、ゲルダナマイシン、エリスロマイシン、ブレフェルジンＡ、およびサリノマイシンアナログが、本開示の方法を使用して同定された。
（実施例１２）
アナログ化酵素発見－ＭＧＣ内での検索による富化

本実施例は、アナログ化酵素発見を、コードする遺伝子の位置を定義することによって増強することができることを実証する。

ＭＩＢＩＧデータベース（／／ｍｉｂｉｇ．ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．ｏｒｇ／）において「デヒドロゲナーゼ」とアノテートされるアミノ酸配列を、問い合わせ配列として使用するために取得した。全体で約２００個のアミノ酸配列を取得した。これらの配列を問い合わせとして使用して、実施例３のメタゲノムデータベースにおける予測ＣＤＳ配列に対して検索した。

次に、本発明者らは、候補デヒドロゲナーゼ配列の位置を使用して、目的のアナログ化酵素に関してさらに富化することができるか否かを試験した。上記で同定された候補デヒドロゲナーゼ配列を含有するコンティグを取得した。生合成遺伝子クラスターを、ａｎｔｉＳＭＡＳＨ４を使用してコンティグ上で予測した。生合成遺伝子クラスターが候補デヒドロゲナーゼ配列を含有するコンティグ上で予測できるか否かに応じて、デヒドロゲナーゼデータセットを、さらに「クラスター関連」および「クラスター非関連」に分配した。任意のクラスの生合成遺伝子クラスターがコンティグ上で予測された場合、これは「ＭＧＣ内」であると分類し、クラスターが予測されなかった場合、「ＭＧＣ外」であると分類した。

これらのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法は、４５１個のデヒドロゲナーゼ配列がＭＧＣ内であると同定し、５２３個のデヒドロゲナーゼ配列がＭＧＣ外であると同定した。

同定されたデヒドロゲナーゼ配列の中で、「ＭＧＣ内の」１４３個の配列および「ＭＧＣ外」の２７０個の配列を、実験による検証のために選択した。ウェットラボ実験による検証を、デジタルメタゲノミクスライブラリーの物理的コピーから完全な候補配列を得ることによって遂行し、それらを、実施例１１に記載されるように発現ベクターにクローニングした。デヒドロゲナーゼ活性を、ゲルダナマイシン、サリノマイシン、およびブレフェルジンＡ天然物基質について試験した。

これらのアッセイの結果を以下の表８に示す。
表８－デヒドロゲナーゼアナログ化の検証

検証実験は、基質として３つの試験天然物のうちの１つを使用することができる全体で３つの酵素を同定した。結果は、本開示のアナログ化酵素発見方法が、予測されるＭＧＣ配列内に位置する候補デヒドロゲナーゼ配列に関して検索を集中させることによって、検証された酵素に関して改善／富化することができることを示した。結果から、２つの酵素がＭＧＣ内に位置すると同定され、１つの酵素のみがＭＧＣ外に位置した。ＭＧＣ内で検証されたデヒドロゲナーゼの富化は、さらに発見率において認められ、ここでは試験された１４３個中２つの酵素が「ＭＧＣ群内」であると検証され、「ＭＧＣ外」分類であると検証された酵素は２７０個中わずか１個であった（ＭＧＣ内で約４倍良好な富化）。
（実施例１３）
アナログ化酵素発見－配列全体または個々のドメインに基づく検索

本開示は、本開示のＨＭＭ検索戦略が、目的の全標的配列に基づくことができることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、本開示のＨＭＭ検索戦略が、標的配列の目的の１個または複数のドメインに基づくことができることを教示している。これらの様々な戦略を比較した。

フラボチトクロムＰ４５０ ＢＭ３は、チトクロムＰ４５０およびＮＡＤＰＨ－チトクロムＰ４５０レダクターゼドメインで構築される天然の融合タンパク質である。Ｐ４５０ ＢＭ３は、いくつかの中鎖から長鎖脂肪酸に結合し、これを酸化させ、典型的にこれらの脂質をω－１、ω－２、およびω－３位置でヒドロキシル化する。

ＢＭ３は、２つの主要なドメイン：チトクロムＰ４５０（ヘム結合）触媒ドメイン、ならびにＣＰＲの別個のドメインにＦＡＤおよびＦＭＮ補因子を含有するＮＡＤＰＨ－チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ドメインを含む天然の融合酵素である。ＢＭ３配列全体に基づくＨＭＭモデル（「完全なＨＭＭ」）、およびＰＦＡＭデータベースに基づくＨＭＭモデル、特に以下の識別子：タンパク質の領域に対応するＰＦ０００６７、ＰＦ００２５８、ＰＦ００６６７、およびＰＦ００１７５（「部分的ＨＭＭＳ」）を有する４つのＨＭＭを得た。

次に、上記のＨＭＭを、以下のように実施例３のデジタルメタゲノムライブラリーに対して実行した（または適用した）。完全なＨＭＭを使用して、デジタルメタゲノムライブラリーを検索し、ヒットを「より高いビットスコア」または「より低いビットスコア」の候補ＢＭ３配列のいずれかとして分類した。次に、タンパク質の部分的ＨＭＭを個々に使用してライブラリーを検索した。次に、部分的ＨＭＭＳの４つの各々によって同定された候補ＢＭ３配列を、検証のために選択した（「複数のＨＭＭモデルのより高いビットスコアＨＭＭヒット」）。

同定された候補ＢＭ３配列のうち、「複数のＨＭＭモデルのより高いビットスコアＨＭＭヒット」の１３０個の配列、「１つのＨＭＭモデルのより高いビットスコアＨＭＭヒット」の４つの配列、および「１つのＨＭＭモデルのより低いビットスコアＨＭＭヒット」の６４個の配列を、実験による検証のために選択した。ウェットラボ実験による検証を、デジタルメタゲノミクスライブラリーの物理的コピーからの完全な候補配列を得ること、および実施例１１に記載されるように発現ベクターにそれらをクローニングすることによって遂行した。

デヒドロゲナーゼ活性を、ゲラニオール天然物基質に関して試験した。これらのアッセイの結果を以下の表９に示す。
表９－ＢＭ３アナログ化の検証

検証実験は、ゲラニオール天然物基質に関して全体で５つの活性酵素を同定した。このように、これは本開示のアナログ化方法の別の検証であった。加えて、結果は、本開示のアナログ化酵素発見方法を、特定の酵素の目的のドメインに対する配列などの部分配列に関して訓練したＨＭＭモデルを使用して遂行することができることも示した。同様に、本開示のアナログ化発見プラットフォームは、ＨＭＭの組合せを利用することができることも示している。
（実施例１４）
アナログ化酵素発見－メチルトランスフェラーゼへの応用

本実施例は、アナログ化酵素発見プラットフォームを、メチルトランスフェラーゼを含む目的の任意のアナログ化酵素に応用することができることを実証する。

検証されたまたは予測されたメチルトランスフェラーゼ機能を有する５３個のメチルトランスフェラーゼ酵素配列の最初の訓練データセットを産生した。これは、「遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップ」という特許請求されるステップに対応する。

これらの訓練データセット配列を使用して、多重配列アライメント（ＭＳＡ）を生成し、これをさらに使用して本明細書において以下に記載されるカスタム予測的機械学習ＨＭＭモデルを開発した。これは、本明細書において「訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップ」と呼ばれる。

次に、カスタムＨＭＭを、実施例３のデジタルメタゲノムライブラリーに対して実行して（または適用して）候補メチルトランスフェラーゼ配列のプールを同定し、これは、本明細書においてＨＭＭ出力配列と呼ばれる。これは、「コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有するメタゲノムライブラリーに適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップ」という特許請求される要素に対応する。７４２個の配列が、さらなる解析のために選択された（「ＨＭＭ出力配列」または具体的には「候補［メチルトランスフェラーゼ］配列」）。

同定された候補メチルトランスフェラーゼ配列の中で、２３３個を実験による検証のために選択した。ウェットラボ実験による検証を、デジタルメタゲノミクスライブラリーの物理的コピーからの完全な候補配列を得ること、および実施例１１に記載される発現ベクターにそれらをクローニングすることによって遂行した。

メチルトランスフェラーゼ活性をリファマイシンおよびデメクロサイクリン天然物基質について試験した。これらのアッセイの結果を以下の表１０に示す。
表１０－メチルトランスフェラーゼアナログ化の検証

検証実験は、基質として２つの試験された天然物のうちの少なくとも１つを使用することができる全体で１１個の酵素を同定した。このように、これは、本開示のアナログ化方法の別の検証であった。
（実施例１５）
アナログ化酵素発見－伝統的なＢＬＡＳＴ検索に対するＨＭＭアルゴリズムの比較

本実施例は、本開示の機械学習に基づくアナログ化酵素発見プラットフォームが、伝統的なＢＬＡＳＴ検索よりアナログ化のための酵素を同定するために優れていることを実証する。

２つの型のＨＭＭモデルを、メタゲノムデータベースを検索するために創出した。第１の型のモデルは、ＬＩＭＳ ＨＭＭＳＣＡＮ完全自動化ＬＩＭＳ検索であった。本発明者らは、ＫｅＧＧオーソロジー群によって定義されるＫｅＧＧデータベースにおいて４つのハロペルオキシダーゼ酵素ファミリーＫ００４３３、Ｋ１７９９０、Ｋ２０２０６、およびＫ００４３１を同定した。各々のこれらの群に関連する配列を整列させて、ＭＡＦＦＴソフトウェアを使用して４つの多重配列アライメントを創出した後、各々のアライメントを使用して、ＨＭＭＢＵＩＬＤソフトウェアを使用してＨＭＭを生成した。

全てのこれらのＨＭＭを、ハロペルオキシダーゼアナログ化酵素を発見するために実施例３のメタゲノムデータベースに対して実行した。次に、結果を、「第１の信頼度スコアの第２の信頼度スコアに対する比が、予め選択された閾値から外れる場合、候補配列のプールから、第２の信頼度スコアによる第２の予測的機械学習モデルによって、異なる機能を果たすことが予測されるいずれかの配列を除去すること」によってフィルタリングした。

このように、無関係なヒットの除去を、以下のように遂行した。第１に、ＨＭＭライブラリーを、全ての利用可能なＫｅＧＧオーソロジー群（異なる酵素機能に関するＨＭＭの閾値）に関して構築した。これらのＨＭＭの生成は、上記の４つのＨＭＭの生成と同じであった。このＨＭＭライブラリーを、ＬＩＭＳ ＨＭＭＳＣＡＮの全てのヒットに対して実行し、ＬＩＭＳ ＨＭＭＳＣＡＮ ＨＭＭの各々のビットスコアの１２０％よりも高い数千個のＨＭＭのいずれかに関するビットスコアを有する全てのヒットを除去した。

第２のＨＭＭモデルは、本開示の方法に従って創出されたカスタムＨＭＭライブラリーであった。簡単に説明すると、ハロペルオキシダーゼ活性を示すことが公知のまたは予測されるハロペルオキシダーゼ酵素配列の最初の訓練データセットを産生した。これは、「遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップ」という特許請求されるステップに対応する。

これらの訓練データセット配列を使用して、多重配列アライメント（ＭＳＡ）を生成し、これをさらに使用して、以下に記載されるようにカスタム予測的機械学習ＨＭＭモデルを開発した。これは、本明細書において「訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップ」と呼ばれる。

次に、カスタムＨＭＭ機械学習モデルを、実施例３のデジタルメタゲノムライブラリーに対して実行して（または適用して）、候補ハロペルオキシダーゼ配列のプールを同定し、これは本明細書においてＨＭＭ出力配列と呼ばれる。これは、「コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有するメタゲノムライブラリーに適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップ」という特許請求される要素に対応する。このカスタムＨＭＭライブラリーから同定された全体で１１４１個の配列をさらなる解析のために選択した一方、２７７個を、ＬＩＭＳ ＨＭＭＳＣＡＮ ＨＭＭからのさらなる解析のために選択した。

比較として、伝統的なＢＬＡＳＴタンパク質アルゴリズムを使用する対照検索を、実施例３のデジタルメタゲノミクスライブラリーについて遂行した。ＢＬＡＳＴ検索は、上記のカスタムＨＭＭライブラリーを創出するために使用した酵素と同じ酵素を使用して実行した。同じ選択手順を、２４個のＢＬＡＳＴ問い合わせ標準配列の各々に適用した。第１に最良のＢＬＡＳＴヒット（単一の配列）を、スクリーニングのために選択した。第２に、ＢＬＡＳＴヒットの２４個のセットの各々に関して、特定のビットスコアカットオフを手動で決定した。選別されたＢＬＡＳＴビットスコアは、非常に高い値の後にこれらのビットスコア値の急激な低下によって特徴付けられ、決定されたビットスコアは、その急激な低下の最低ビットスコアに対応するビットスコアであった。これらの問い合わせの各々に関して典型的に多くのＢＬＡＳＴヒットが存在することから、ＢＬＡＳＴヒットを、ＣＤＨＩＴによって４０％ＩＤでクラスター化し、クラスター重心を、上記の実施例に記載されるように選択した。全体で１０１個の上位ＢＬＡＳＴヒットを保存した。

同定された候補ハロペルオキシダーゼ配列の中で、ＬＩＭＳ ＨＭＭ ＳＣＡＮヒットのうちの１８２個、カスタムＨＭＭライブラリーヒットの３６８個、およびＢＬＡＳＴヒットの５７個を、実験による検証のために選択し、首尾よくクローニングした。ウェットラボ実験による検証を、デジタルメタゲノミクスライブラリーの物理的コピーから完全な候補配列を得ること、および実施例１１に記載されるように発現ベクターにそれらをクローニングすることによって遂行した。

ハロペルオキシダーゼ活性を、リファマイシンおよびデメクロサイクリン天然物基質について試験した。これらのアッセイの結果を以下の表１１に示す。
表１１－ハロペルオキシダーゼアナログ化の検証

検証実験から、基質として２つの試験した天然物の少なくとも１つを使用することができる全体で７つの酵素が同定された。このように、これは、ハロペルオキシダーゼに関する本開示のアナログ化方法の別の検証であった。本実施例はまた、結果をフィルタリングするために他のＨＭＭのスコアを利用する本開示のＨＭＭフィルタリング方法の例証でもあった。

結果はまた、本開示の機械学習プラットフォーム（例えば、ＬＩＭＳ ＨＭＭＳＣＡＮおよびカスタムＨＭＭライブラリー）が、単一のアナログ化酵素さえ同定することができなかった伝統的なＢＬＡＳＴアルゴリズムより実質的に優れていることも示した。
（実施例１６）
アナログ化酵素発見

本実施例は、他のアプローチと比較して本開示の機械学習に基づくアナログ化酵素発見プラットフォームの利点を実証する。

５つの検索戦略を本実施例において比較した。

第１のモデルは、以下のように生成された位置プロファイリングモデルであった。第１に、文献によって報告されたＡＫＲの構造を試験して、基質認識に関与する位置を同定した。第２に、結晶分解構造の配列を含むＡＫＲの構造に基づく多重配列アライメントを、ＭＡＦＦＴアルゴリズムおよび手動でのキュレーションを使用して生成した。第３に、第１の段階で同定された位置の残基に対応する１１個の位置をアライメントにおいて同定した。第４に、１０７，８２８個のＡＫＲ配列の各々を、ＭＡＦＦＴ－ａｄｄアルゴリズムを使用して多重配列アライメントに個々に加えた。第５に、１１個の位置に対応する１０７，８２８個の配列の各々における１１個のアミノ酸の予測される位置を保存した。第６に、１１個の位置の各々を、各々がその位置に存在する異なるアミノ酸を表す２０個の配列（１０７，８２８個のセットから選択される）にマッピングした。一部の場合では、必ずしも２０個全てのアミノ酸バリアントが利用可能ではなかった。

第２のモデルは、実施例１０に記載される方法に従って創出されたカスタムＨＭＭライブラリーであった。

第３のモデルは、実施例９に記載される方法に従って創出されたカスタムＡＫＲ ＨＭＭであった。

第４のモデルは、インデルバリアントモデルであった。ＡＫＲ酵素の複数の結晶分解構造の構造、特に活性部位付近の構造を調べた。これらの構造（ＰＳＢコード：１ＰＺ１、４ＰＭＪ、１ＰＹＦ、１ＧＶＥ、１ＬＱＡ、１ＹＮＰ、および１ＯＧ６）の構造アライメントは、全てのこれらのタンパク質が類似の全体構造を共有する（全てがα／βｔＩＭバレルフォールドを共有する）が、基質に結合する領域の付近が異なることを示唆している。共通のフォールドにおける２つの特定の位置は、異なるＡＫＲ構造が共通のフォールドを「修飾する」異なるループを有する基質結合部位の付近で同定された。このことは、特定のＡＫＲの基質特異性が少なくとも部分的に、活性部位付近で見出される２つのループの配列および長さによって決定されることを指し示した。ループの開始および停止位置の２つの対は、それらの構造に基づく配列アライメントによって指し示されるように、全ての調べた構造において一貫した。

このように、ループ長を、ＡＫＲの基質認識部分における標本抽出変型形態の動機として使用することができる。次に、位置プロファイリングアプローチを使用して、メタゲノムレポジトリにおいて見出される１０７，８２８個の配列の各々のループ長を認識した。これは、多重配列アライメントにおける開始－停止位置を同定すること、ならびに問い合わせ配列における２つのループの開始および停止位置を同定することによって達成された。このステップによって、メタゲノムレポジトリにおいて見出される１０７，８２８個の配列の各々の２つのループの長さのマッピングが得られた。最後に、９１個の配列を、それらがループの長さの異なる組合せ、例えば「短いループ１」（１～１０個のアミノ酸）および「中間のループ２」（１１～２０個のアミノ酸）を標本抽出するように、このセットから選択した。

第５のモデルは、位置組合せプロファイリングモデルであった。このモデルは、位置プロファイリングモデルに基づく。この動機は、位置プロファイリングモデルにおいて見出される１１個の位置の異なる組合せが、基質認識において潜在的に有意な役割を果たすことであった。１１個の位置の異なる組合せを標本抽出するために、以下のステップを行った：メタゲノムライブラリーにおいて見出される１０７，８２８個のＡＫＲホモログの各々と、位置プロファイリングモデルに関して同定された１１個の位置の各々に存在すると予測される１１個のアミノ酸の組合せとの間でマッピングを創出した。これらの組合せの各々の頻度を計算し、その後１１アミノ酸の組合せのリストをその頻度によって選別した。最後に、最も頻繁な６４個の組合せをそれぞれ含む６４個の配列を、スクリーニングのために選択した。

次に上記の５つのモデルを、実施例３のデジタルメタゲノムライブラリーに対して実行して（または適用して）、候補ＡＫＲ配列のプールを同定し、これは、本明細書においてＨＭＭ出力配列と呼ばれる。これは、「コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有するメタゲノムライブラリーに適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップ」という特許請求される要素に対応する。全体で１８０個の最初の配列が、位置プロファイリングモデルによって同定され、全体で１６８個の最初の配列が、本開示のカスタムＨＭＭによって同定され、全体で１７７個の最初の配列が、カスタムＡＫＲ ＨＭＭモデルから同定され、９１個の最初の配列が、インデルバリアントモデルから同定され、６４個の配列が、位置組合せプロファイリングモデルから同定された（「ＨＭＭ出力配列」または具体的に「候補［ＡＫＲ］配列」）。

同定された候補ＡＫＲ配列の中で、位置プロファイリングモデルにおける９４個の最初の配列、カスタムＨＭＭモデルにおける全体で９２個の最初の配列、カスタムＡＫＲ ＨＭＭモデルにおける全体で１３６個の最初の配列、インデルバリアントモデルにおける全体で４９個の最初の配列、および位置組合せプロファイリングモデルにおける全体で３５個の配列を、実験による検証のために選択した。ウェットラボ実験による検証を、デジタルメタゲノミクスライブラリーの物理的コピーからの完全な候補配列を得ること、および実施例１１に記載される発現ベクターにそれらをクローニングすることによって遂行した。

ＡＫＲ活性を、ゲルダナマイシン、エリスロマイシン、ブレフェルジンＡ、およびサリノマイシン天然物基質について試験した。これらのアッセイの結果を以下の表１２に示す。
表１２－ＡＫＲアナログ化の検証

結果は、本開示の予測的機械学習モデルが、ＡＫＲを含む新規アナログ化酵素を同定することが可能であることを確認した。
（実施例１７）
標的化されないＭＧＣ発見ワークフロー

本実施例は、本開示の標的化されないＭＧＣ発見ワークフローの作業例である。一部の実施形態では、標的化されないワークフローは、予測ＭＧＣ内の遺伝子に生合成能スコア、抵抗性遺伝子スコア、および（一部の実施形態では）生合成オペロンスコア、コア生合成遺伝子距離スコア、および必須遺伝子スコアのうち１個または複数を割り当てることを記載する。これらのスコアリング要素の適用を以下に例証する。

本実施例の目標は、本開示のワークフローを使用して、抵抗性遺伝子である可能性がより低い遺伝子をフィルタリングして除外する排除プロセスを通して抵抗性遺伝子を富化することができるか否かを試験することであった。本実施例は、結果を検証することができるように公知の抵抗性遺伝子を使用するが、同じステップを任意の数の予測ＭＧＣに適用して、未知の抵抗性遺伝子を同定することができる。

ボレリジン（ＡＪ５８０９１５）、チオマリノール（ＦＮ６８９５２４）、カリマンタシン（ＧＵ４７９９７９）、エポノマイシン（ＫＦ６４７２２０）、ベンガミド（ＫＰ１４３７７０）、グリセリマイシン（ＫＰ２１１４１４）、サリノスポラミド（ＮＣ＿００９３８０）、ペンタレノラクトン（ＮＺ＿ＢＪＴＶ０１０００００７）、およびアルボマイシン（ＮＺ＿ＣＰ０２９３６１）遺伝子クラスターを含有するＤＮＡ配列を、ａｎｔｉＳＭＡＳＨに提出した。これらの全ては、標的コピー抵抗性遺伝子を含有することが公知である。これによって、全体で３８８個の遺伝子による９個の遺伝子クラスターが同定された。それらの３８８個の遺伝子の中で、そのうち９個が抵抗性遺伝子であり、このことは抵抗性遺伝子が遺伝子全体の２．３％を構成することを意味する。

最初に、全ての遺伝子を解析し、生合成能スコア、輸送関連能および調節能スコアを割り当てた。ａｎｔｉＳＭＡＳＨによって、生合成機能（部分的生合成能スコア）、輸送関連機能、または調節遺伝子機能を有するとアノテートされた全ての遺伝子に、低い優先順位スコアを与え、完全に検討から除外した。上記で注目したように、生合成能輸送関連能および調節能は、ＭｉＢｉｇデータベースを使用してａｎｔｉＳＭＡＳＨによって与えられたアノテーションによって計算した。これによって、元の３８８個中１４９個の遺伝子が残った。これらの１４９個の遺伝子のうち、８個が抵抗性遺伝子であり、このことは、抵抗性遺伝子が残りの遺伝子の５．４％を構成することを意味している。このステップは、抵抗性遺伝子の２倍より多くの富化をもたらした。

次に、残りの１４９個の遺伝子を解析し、生合成能スコア、生合成オペロンスコア、コア生合成遺伝子距離スコア、および必須遺伝子スコアを与え、次にこれらを、図２９に示すように組合せスコアに組み合わせた。本実施例の目的に関して、データセットは、フィルタリングによって除外されている公知の抵抗性遺伝子を含んだことから、抵抗性遺伝子スコアを与えなかった。全ての遺伝子は、低い優先順位スコアを与えられる生合成機能を有するとアノテートされ、および／または検討から完全に除外された。生合成能を、ＭｉＢｉｇデータベースを使用してａｎｔｉＳＭＡＳＨによって与えられたアノテーションによって計算した。ＭｉＢｉｇ遺伝子（より高い生合成能）を有するより多くのＢＬＡＳＴヒットを有する遺伝子は、より少ないヒットを有する遺伝子（生合成能を有する可能性がより低い）より低いスコアを与えられた。０．８５未満の組合せスコアを排除し、０．８５より高い組合せスコアを保持した。本発明者らのスコアリングから残った１０個の遺伝子のうち、６個は、本実施例で使用した９個のＭＧＣの公知の抵抗性遺伝子である（遺伝子の約６０％が、抵抗性遺伝子である）。このように、本開示の標的化されないワークフローは、本開示のスコアリング因子を使用して抵抗性遺伝子の発生率を３０倍より多く富化することができた。
（実施例１８）
抵抗性遺伝子ワークフロー（ＨＤＡＣ１）標的遺伝子の追加の例

本実施例は、特異的治療標的を標的とする天然物コード多重遺伝子クラスターを同定するために本開示の抵抗性遺伝子ワークフローを使用することができることを例証する。本実施例は、ヒトＨＤＡＣ１遺伝子を標的化する天然物を産生することが予測される候補ＭＧＣの同定を示す。

ＨＤＡＣ１は、コアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４）のＮ末端部分におけるリシン残基の脱アセチル化に関与する。ヒストン脱アセチル化は、エピジェネティック抑制のためのタグを与え、転写調節、細胞周期進行、および発達事象において重要な役割を果たす。ＨＤＡＣ酵素は、広範囲のヒト障害の潜在的に有用な治療標的であると認識されている。新規研究は、異なる型のＨＤＡＣ阻害剤が神経障害の様々な実験モデルにおいて有益な効果を示すことを実証している。

ＨＤＡＣ１を標的とする天然物をコードするＭＧＣを同定するために、本発明者らは、標的抵抗性遺伝子としてＨＤＡＣ１（ＰＦＡＭ ＰＦ００８５０）を使用して抵抗性遺伝子ワークフローを適用した。このＰＦＡＭに対応するＨＭＭを、本明細書に開示されるように構築した。得られたＨＭＭモデルを使用して実施例３のメタゲノムデータベースを検索して、ビットスコアカットオフ５０を使用して相同なアミノ酸配列を返した。このカットオフにマッチする配列を「候補抵抗性遺伝子」と称し、これは、「天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルに関してデジタルメタゲノミクスライブラリーを問い合わせる」ステップを介して同定された。

候補抵抗性遺伝子を含有するコンティグは、「複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セット」と呼ばれる。これらの多重遺伝子クラスターデジタル特色セットは、上記のＨＭＭ検索からの予測されるＨＤＡＣ１ホモログをコードし、次にこれをａｎｔｉＳＭＡＳＨ ｖ５を通して実行すると、予測されたＢＧＣを含有する、コンピューターによって決定された天然物多重遺伝子クラスター特色内である特色セットが同定された（「シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定し、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）特色セットをデジタル処理でアセンブルすること」）が同定された。

このワークフローは、ａｎｔｉＳＭＡＳＨによって予測されるＭＧＣの境界内であるかまたは境界に直接隣接する候補ＨＤＡＣ１遺伝子を含有する８７個の潜在的ＭＧＣを同定した。本発明者らは、下流の解析のために内部でＺＧＣＨＤＡＣ１１７８９と名付けられるクラスターを選択した。

ＺＧＣＨＤＡＣ１１７８９をコードする所望のＭＧＣを含有する個々のＥ．ｃｏｌｉ単離体を、メタゲノムライブラリーの物理的コピーから首尾よく取得した後、目的の生合成経路をコードするＤＮＡを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＴＡＲ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）クローニングを介してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ／Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓシャトルベクターにクローニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＤＮＡ形質転換および組換え後、アセンブルしたプラスミドＤＮＡを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから抽出し、増殖のためにＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。得られたプラスミドの配列を、次世代配列決定によって確認した。

次に、このプラスミドを、異種発現宿主Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ Ｊ１０７４（野生型または操作された株）に接合伝達によって導入した。具体的には、目的のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７株を、Ｓ．ａｌｂｕｓの胞子と同時培養して、接合プロセスを刺激した。所望の抗生物質マーカーを含有する固相媒体での成長選択後、Ｓ．ａｌｂｕｓエキソ接合体コロニーを増殖させて、グリセロール胞子ストックを生成し、遺伝子クラスターの存在をコロニーＰＣＲによって確認した。

新規化合物産生を検出するための最初の小規模プレートスクリーニングでは、２４ディープウェルプレートの各々の単一のウェルに、適切な選択抗生物質を含有する３ｍＬのＴＳＢシード培養物を加え、クラスターを有するおよび有しないＳ．ａｌｂｕｓ胞子を、最終ＯＤ_４５０が約０．０５となるように接種した。プレートを２層の空気透過性シールによって密封し、３０℃、２５０ｒｐｍ（２．５ｃｍスロー）および８０～８５％湿度で密度の高い培養物が形成されるまで２～３日間培養した。次に培養物を、新しいセットの２４ディープウェルプレートにおいて適切な選択抗生物質を含有する各３ｍＬの発酵培地（ｍＯ４２、Ｏ４２、Ｒ５Ａ、およびＩＳＰ４）中に１０％（体積／体積）接種物で接種した。この主なプレート培養物を、採取の前に７日間インキュベーションした。

発酵の完了後、プレート中の培養物を等量の酢酸エチルによって２回抽出し、合わせた有機層を乾固するまで濃縮した後、ＬＣ／ＭＳ解析に供して、新規分子の産生を確認した。

新規分子産生が確認された後、本発明者らは、ＤＡＳＧＩＰバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）での大規模発酵を利用して、半精製材料を生成した。胞子（０．０５ＯＤ）を最初に、各々が７５ｍｌ Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）、ＡＰＲＡ（５０μｇ／ｍＬ）、および消泡剤（ＰＤ－６０２）を含有する２５０ｍＬバッフル付きフラスコ（×８）に接種し、３０℃で２４時間成長させた。次に、各シード培養物を、２つのＤＡＳＧＩＰ（全体で１６個）へと等量に分割し、２００～８００ＲＰＭの範囲で撹拌しながら、３０℃で９６時間成長させた。個々のリアクターからの発酵ブロスをプールし、４０００ＲＰＭ（４℃）で２０分間遠心分離した。清澄化したブロスを、細胞沈降物から注意深くデカントし、その後活性化ＤｉａｎｉｏｎＨＰ２０樹脂（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）（５％ｗ／ｖ）によっておよそ１６時間抽出した。水性培地を、チーズクロスを通して濾過することによって樹脂から除去し、捨てた。樹脂を超純水（約１２Ｌ）によって十分に洗浄して、高度に水溶性のいかなる培地構成成分も確実に除去した。次に洗浄した樹脂を、溶媒を樹脂に直接加え、１５～３０分間穏やかに撹拌することによって、２ＬのＨＰＬＣアセトンによって２回抽出後、２×Ｌ ＨＰＬＣメタノールによって抽出した。減圧濾過を介して、有機溶媒を樹脂から濾過し、プールし、水のみが残るまで真空で濃縮した。この水性層を等量の酢酸エチルによって３回抽出した。有機層をプールし、無水ＭｇＳＯ_４によって乾燥させ、濾過し、真空下で完全に乾燥させて茶色の油（８５５．１ｍｇ）を得た。

この粗抽出物を、最少のメタノール（約２ｍＬ）に溶解し、シリカにロードし、その後、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｆａｒ Ｓｉｌｉｃａ ＨＣ－Ｄ高容量デュオカラム（１０ｇ）および２４０ｍＬ収集ボトルと適合性のＢｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａトレイラックを固定したＢｉｏｔａｇｅ Ｓｅｌｅｋｔ自動クロマトグラフィー機器を使用して分画した。分画は、ヘプタン（溶媒Ａ）、酢酸エチル（溶媒Ｂ）、およびメタノール（溶媒Ｃ）からなる３溶媒の段階的勾配を使用して達成した。材料を流速２０ｍＬ・分^－１で溶出し、各ステップに関して４ＣＶ画分（６０ｍＬ）を収集した。勾配の最初のステップは、７：３（Ａ：Ｂ）からなり、この後に１：１（Ａ：Ｂ）、１：４（Ａ：Ｂ）、１００％Ｂ、１：９（Ｂ：Ｃ）、３：７（Ｂ：Ｃ）、および最後に１：４（Ｂ：Ｃ）からなる６つの追加のステップが続き、極性が増加する７つの画分（Ｆ１～Ｆ７）を得た。画分を真空下で濃縮し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳおよび分析用のＡｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ２．１×５０ｍｍ Ｃ１８カラムによるｖａｎｑｕｉｓｈ ＬＣを使用するＬＣＭＳを介して流速０．５ｍＬ・分^－１で目的のイオン（ｍ／ｚ ８１１．５８２８）に関して解析した。化合物は、Ｆ６（２４５．８ｍｇ）において同定された。

Ｆ６を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩシリーズ分取ＨＰＬＣにおいて逆相Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ １０μｍ Ｃ１８（２）１００Åカラム（２５０×１０．００ｍｍ）での流速８ｍＬ／分での実行によってさらに分画し、１２ｍＬの画分を収集した。試料を、ＨＰＬＣ等級のメタノールに、最終濃度１００ｍｇ・ｍＬ^－１となるように溶解した。この溶液の５００μＬアリコート（５００μＬループを使用して）を注入することによって精製を達成した。材料を、Ｈ_２Ｏ（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）を使用して溶出した。勾配は、１０％アセトニトリルの２分間の初回均一濃度ステップを使用した。この後に、１０％～９５％アセトニトリルの２８分間（全体で３０分間）の線形増加勾配が続いた。カラムを、９５％アセトニトリルの均一濃度ステップによってさらに１０分間（全体で４０分間）洗浄し、最後に１０％アセトニトリルの均一濃度平衡ステップによって１０分間（全体で５０分間）洗浄した。画分を、ＬＣＭＳ（すでに記載したとおり）によって目的のイオンに関して解析した。適切なｍ／ｚを含有する画分をプールし、乾燥させて３．７ｍｇのオフホワイト色固体を得た。精製化合物を、純度の評価のために、ＬＣＭＳおよびＥＬＳＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣ－ＥＬＳＤ）検出を介して解析した。

ＨＤＡＣ１活性を、市販の蛍光発生活性アッセイキット（ＨＤＡＣ１蛍光発生キット、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。対照および試験反応を以下のように設定した。全ての関連する試薬を実験前に室温まで融解した。ＨＤＡＣ１をＨＤＡＣアッセイ緩衝液によって１．４ｎｇ／μｌとなるように希釈し、２５×ＨＤＡＣ基質３を２００μＭ溶液となるように希釈した。酵素は、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ展開剤が使用されていない時間を制限するために、アッセイを開始する直前に調製した。市販の阻害剤であるトリコスタチンＡもまたＨＤＡＣアッセイ緩衝液で１０倍希釈した。３つの対照を調製した：３５μＬのＨＤＡＣアッセイ緩衝液＋５μＬのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）＋５μＬのＨＤＡＣ基質３＋５μＬの１００％ＤＭＳＯ（ブランク）、３０μＬのＨＤＡＣアッセイ緩衝液＋５μＬのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）＋５μＬのＨＤＡＣ基質３＋５μＬのＨＤＡＣ１＋５μＬの１００％ＤＭＳＯ（陽性対照）、および３０μＬのＨＤＡＣアッセイ緩衝液＋５μＬのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）＋５μＬのＨＤＡＣ基質３＋５μＬのＨＤＡＣ１＋５μＬのトリコスタチンＡ（阻害剤対照）。追加の対照を設定して阻害剤の蛍光をモニターした：４５μＬのＨＤＡＣアッセイ緩衝液＋５μＬの試験化合物。最後に、３０μＬのＨＤＡＣアッセイ緩衝液＋５μＬのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）＋５μＬのＨＤＡＣ基質３＋５μＬのＨＤＡＣ１＋５μＬの試験化合物（阻害試料）を含有する阻害試料を３連で調製した。

全ての対照および試料を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、５０μＬの２×ＨＤＡＣ展開剤を各反応に加え、２２℃で１５分間インキュベートした；次に蛍光測定を行った。このアッセイの結果を図３０に示す。

ＨＤＡＣ１活性は、ＺＧＣＨＤＡＣ１１７８９に由来する半精製分子の増加濃度によって阻害された。このように、本開示の抵抗性遺伝子ワークフローは、所望の治療標的に影響を及ぼす／標的化することが可能な天然物をコードするＭＧＣを同定することができた。
（実施例１９）
ＳＯＤ２（スーパーオキシドジスムターゼ）の抵抗性遺伝子ワークフローの追加の実施例

本実施例は、本開示の抵抗性遺伝子ワークフローを使用して特異的治療標的を標的化する天然物コード多重遺伝子クラスターを同定する方法の別の例証を提供する。本実施例は、ヒトＳＯＤ２遺伝子を標的とする天然物を産生すると予測される候補ＭＧＣの同定を示す。

スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）は、鉄／マンガンスーパーオキシドジスムターゼファミリーのメンバーである。これは、ホモ４量体を形成し、サブユニット当たり１つのマンガンイオンに結合するミトコンドリアタンパク質をコードする。このタンパク質は、酸化的リン酸化のスーパーオキシド副産物に結合し、それらを過酸化水素および酸素２原子に変換する。この遺伝子の変異は、特発性心筋症（ＩＤＣ）、早老症、孤発性運動ニューロン疾患、およびがんに関連している。

ＳＯＤ２を標的とする天然物をコードするＭＧＣを同定するために、本発明者らは、標的抵抗性遺伝子としてＳＯＤ２（ＰＦＡＭ ＰＦ０００８１）を使用して抵抗性遺伝子ワークフローを適用した。このＰＦＡＭに対応するＨＭＭを、本明細書に開示されるように構築した。得られたＨＭＭモデルを使用して、実施例３のメタゲノムデータベースを検索して、ビットスコアカットオフ５０を使用して相同なアミノ酸配列を返した。このカットオフにマッチする配列は、「候補抵抗性遺伝子」と称され、これらは、「デジタルメタゲノミクスライブラリーを、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルについて問い合わせる」ステップを介して同定された。

候補抵抗性遺伝子を含有したコンティグを、「複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セット」と呼ぶ。これらの多重遺伝子クラスターデジタル特色セットは、上記のＨＭＭ検索から予測されるＳＯＤ２ホモログをコードし、次にａｎｔｉＳＭＡＳＨ ｖ５を通して実行して、コンピューターによって決定した天然物多重遺伝子クラスター特色セット内である特色セットを同定した（「シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定し、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）特色セットをデジタル処理でアセンブルすること」）。

このワークフローは、ａｎｔｉＳＭＡＳＨによって予測されたＭＧＣの境界内であるまたは境界に直接隣接するＳＯＤ２のホモログを含有する９６個の潜在的ＭＧＣを同定した。本発明者らは、下流の解析のためにＺＧＣＳＯＤ２１７８９と名付けられるクラスターを選択した。

ＺＧＣＳＯＤ２１７８９をコードする所望のコスミドを含有する個々のＥ．ｃｏｌｉ単離物を、メタゲノムライブラリーから首尾よく取得した後、目的の生合成経路をコードするＤＮＡを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＴＡＲ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）クローニングを介してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ／Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓシャトルベクターにクローニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＤＮＡ形質転換および組換え後、アセンブルしたプラスミドＤＮＡをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから抽出し、増殖のためにＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。得られたプラスミドの配列を、次世代配列決定によって確認した。

次に、このプラスミドを、接合伝達を介して、異種発現宿主Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ Ｊ１０７４（野生型または操作された株）に導入した。具体的には、目的のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７株を、Ｓ．ａｌｂｕｓの胞子と同時培養して、接合プロセスを刺激した。所望の抗生物質マーカーを含有する固相培地での成長の選択後、Ｓ．ａｌｂｕｓエキソ接合体コロニーを増殖させてグリセロール胞子ストックを生成し、遺伝子クラスターの存在をコロニーＰＣＲによって確認した。

新規化合物産生を検出するために最初の小規模プレートスクリーニングに関して、２４ディープウェルプレートの各々の単一のウェルに、適切な選択抗生物質を含有する３ｍＬのＴＳＢシード培養物を加え、クラスターの存在下および非存在下でＳ．ａｌｂｕｓ胞子を、最終ＯＤ_４５０が約０．０５となるように接種した。プレートを２層の空気透過性シールによって密封し、３０℃、２５０ｒｐｍ（２．５ｃｍスロー）および８０～８５％湿度で密度の高い培養物が形成されるまで２～３日間培養した。次に培養物を、新しいセットの２４ディープウェルプレートにおいて適切な選択抗生物質を含有する各３ｍＬの発酵培地（ｍＯ４２、Ｏ４２、Ｒ５Ａ、およびＩＳＰ４）中に１０％（体積／体積）接種物で接種した。この主なプレート培養物を、採取の前に７日間インキュベーションした。

発酵の完了後、プレート中の培養物を等量の酢酸エチルによって２回抽出し、合わせた有機層を乾固するまで濃縮した後、ＬＣ／ＭＳ解析に供して、新規分子の産生を確認した。

新規分子産生が確認された後、本発明者らは、２．８Ｌ ＵｌｔｒａＹｉｅｌｄ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）振とうフラスコ中での大規模発酵を利用して、アッセイのための粗ライセートを生成した。これを行うために、シードトレインを、２５０ｍＬバッフル付き振とうフラスコ中の２５ｍＬのＴＳＢ培地において開始した。培養物に胞子ストックをＯＤ_４５０が約０．０４となるように接種した後、シードフラスコを３０℃、１７５ｒｐｍ（５ｃｍスロー）および８０～８５％湿度で、密度の高い培養物が形成されるまで少なくとも２４時間インキュベートした。次に、このシード培養物全体を、２．８ＬのＵｌｔｒａＹｉｅｌｄ振とうフラスコ中の０．５Ｌの発酵培地に５％接種で接種した。ＵｌｔｒａＹｉｅｌｄ振とうフラスコを、ベントキャップまたは二重気密性シールで密封し、同じ条件下で採取の前に７日間インキュベートした。

発酵ブロスを、採取の１６時間前に培養物に５％ｗ／ｖを加えることによってＤｉａｎｉｏｎ ＨＰ２０樹脂（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を使用して抽出した。樹脂およびバイオマスを、培養内容物を５００ｍＬ遠心ボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移すことによって収集した後、Ａｖａｎｔｉ Ｊ－Ｅ遠心分離器を使用して３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。培養上清をデカントし、捨てた。細胞および樹脂沈降物を、２５０ｍＬの超純水を直接ボトルに加えて振とうすることによって２回洗浄し、遠心分離し、次に上清廃棄物をデカントして捨てた。次に、洗浄した細胞および樹脂沈降物を、溶媒を直接ボトルに加え、１５分間超音波処理し、遠心分離し、デカントし、全ての溶媒抽出物をプールすることによって、２５０ｍＬのＨＰＬＣアセトンによって２回および２５０ｍＬメタノールによって２回、逐次的に抽出した。有機抽出物を真空下で水性抽出物が残るまで濃縮した。この水性抽出物を等量の酢酸エチルによって２回抽出し、ｐＨを５に調整し、酢酸エチルによってさらに２回抽出した。プールした酢酸エチル抽出物を真空下で濃縮した。

スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）活性を、市販の比色測定活性キット（スーパーオキシドジスムターゼ比色活性キット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して決定した。対照および試験反応を以下のように設定した。全ての関連する試薬を室温まで融解した後に混合した。１０×基質濃縮液および２５×キサンチンオキシダーゼ濃縮物を、キットに供給されたそのそれぞれの緩衝液中で希釈した；ＳＯＤ２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、供給されたアッセイ緩衝液によって１Ｕ／ｍＬに希釈した。酵素を、ＳＯＤ２およびキサンチンオキシダーゼを使用していない時間を限定するためにアッセイを開始する直前に希釈した。２種の市販の阻害剤、２－メトキシエストラジオールおよびＬＣＳ－１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）もまた、アッセイ緩衝液中で３０μＭに希釈した。３つの対照を調製した：８μＬのＳＯＤ２＋５０μＬの１Ｘ基質＋２μＬのアッセイ緩衝液（陽性対照）、１００％ＤＭＳＯ（媒体対照）、または市販の阻害剤（阻害剤対照）。加えて、１０μＬのアッセイ緩衝液＋５０μＬの１Ｘ基質（基質対照）、または５８μｌのアッセイ緩衝液＋２μＬの試験化合物（試験化合物対照）を含有する２つの対照を調製した。最後に８μＬのＳＯＤ２＋５０μＬの１Ｘ基質＋２μＬの試験化合物（ＺＧＣＳＯＤ２１７８９粗ライセートまたはＷＴ粗ライセート）を調製した；全ての対照および試料を３連で行った。全ての対照および試料の準備ができると、２５μＬの１×キサンチンオキシダーゼを加えてスーパーオキシド生成を開始し、反応物を２２℃で２０分間インキュベートした。

吸光度の測定を０分（キサンチンオキシダーゼを加える前）および２０分に得た。このアッセイの結果を図３１に示す。

ＺＧＣＳＯＤ２１７８９発酵ブロスからの粗ライセートは、ＳＯＤ２活性を阻害したが、ＷＴ対照からの粗ライセートは、阻害しなかった。このように、本開示の抵抗性遺伝子ワークフローは、所望の治療標的に影響を及ぼす／標的化することが可能である天然物をコードするＭＧＣを同定することができた。
（実施例２０）
メタゲノムライブラリーアセンブリーおよびバージョニング

次世代配列決定（ＮＧＳ）の進歩により、科学者は、微生物ＤＮＡの直接配列決定によって微生物群集を試験し、プロファイルを調べることが可能となった。配列リードとして公知である生のＮＧＳデータを、参照配列と直接比較して、目的の特色および遺伝子をコンピューターによって同定することができる。配列リードはまた、それらの配列における重複を同定することによって、コンティグとして知られるより長い配列にアセンブルすることもできる。その後コンティグをアノテートして、目的の遺伝子および特色を同定することができる。微生物群集に由来する配列のコレクションはしばしば、メタゲノムライブラリーと呼ばれる。

直接配列決定の代わりに、メタゲノムライブラリーはまた、微生物ＤＮＡをコスミドにパッケージングすることによっても構築することができ、次にこれをクローニングし、宿主生物、しばしばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによって複製させ、複数の物理的試料にわたって分割し、これにより、任意の単一の物理的試料の複雑性を低下させる。物理的コスミドメタゲノムライブラリーの調製後、コスミドおよび微生物群集ＤＮＡを配列決定し、試料毎に解析し、結果をコンピューターにより組み合わせて物理的メタゲノムライブラリーのデジタル表示を産生することができる（図１９）。

メタゲノミクスライブラリーを解析および構築する場合の重要な難題は、経時的に生成される大量の配列データに比例する規模でコンピューター解析を通してデータの起源を追跡することである。

本明細書に記載される方法は、各々の個々の配列が、データ、配列決定された特定の物理的試料、および試験中の微生物群集を生成するために使用される特定のバイオインフォマティクスツールにリンクすることができる一貫した配列のコレクションを産生するように大規模にメタゲノムアセンブリーおよびアノテーションパイプラインを実行するプログラムに対処する。

本実施例は、メタゲノムコスミドライブラリーを大規模にアセンブルおよびアノテートするように設計されたコンピューターによる基礎構造およびシステムを記載するが、いかなるメタゲノムまたは単離された配列データも同じ機序で処理することができる。
ＮＧＳデータ処理パイプライン

プロセスは５つのステップを通して生配列データを処理することからなる。
１）データ調製および試料ＩＤの割り当て

生ＮＧＳデータは、配列決定の前にＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑなどのＮＧＳシーケンサーを使用して生成される。配列決定の前に、個々の試料および配列決定ランに特有のＩＤのラベルを付ける。新しいＮＧＳデータが生成されると、それらを、自社運用のクラスターとして保存するか、またはクラウドプロバイダー、例えばＡｍａｚｏｎ Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｉｃｅｓのいずれかで保存する。重要なことに、本発明は、このデータを、その後のステップがそのデータを大規模に消費することができるように、ラベル付けする方法および保存する方法を指定する。すなわち、データを、ＮＧＳ配列決定ランによって構築し、次に、個々のデータファイル（ＦＡＳＴＱ）に、自動で生成されたまたは手動で割り当てられた特有の試料ＩＤによってラベルを付ける。

加えて、試料のメタデータは、個々の試料ＩＤを元の微生物群集起源の特有の識別子にマッピングする個別のファイルで提供され、これを後に使用して各試料の環境または実験条件に関連させることができる。

このステップでは、処理の間に共に全ての中間データおよび最終データファイルを関連させる特有の「データビルド」ＩＤもまた、生成される。本発明の構成成分を追跡するファイルおよびデータに関する詳細に関しては以下の「データアーティファクト追跡システム」を参照されたい。
２）再処理およびＮＧＳリードフィルタリング

各配列決定試料の生ＮＧＳデータを、再処理して、データ品質または混入に基づいてリードをフィルタリングによって除外する。広範囲のバイオインフォマティクスツール、例えばＦａｓｔＱＣまたはｂｂｔｏｏｌｓを、特定のメタゲノムを、特定のメタゲノム調製物に応じてこのステップのために使用することができる。本発明は全体として、それが試料のために新しいＦＡＳＴＱファイルを生成する限り、ツールの選択に関して同じである。

このステップを大規模に（何百またはそれより多くの試料）実行するために、バイオインフォマティクスツールをコンテナ（具体的にはＤｏｃｋｅｒによってだが、バージョン化された画像を有する任意のコンテナ化システムが作用する）において実行する。作業量は、最初に配列決定ランおよびデータビルドＩＤを同定し、処理されるそれらの試料のメタデータにアクセスし、次にバッチ実行システムを使用して試料当たりに同時に実行するように作業を分配することによってバッチ化される。どのバッチ実行システムを使用するかの特定の選択は、個々のコンピュータノードが配列データおよび共有ファイルシステムまたはストアにアクセスする限り、本発明にとって重要ではない。

本発明の重要な部分は、各試料に関する起源の情報が、前処理ステップで提供されることであり、これは、どの入力データファイルが処理されるか、および使用されるツールのバージョン、および各試料を記載するメタデータも示している。次に、その情報を、前処理ステップの出力ファイルと共に保存した後、索引をつけ、後に記載される「データアーティファクト追跡システム」を使用してバージョン化する。次に、このステップの組合せ出力は、下流の処理および手動での検査の両方に利用可能である。
３）配列アセンブリー

次に、フィルタリングした生配列データを、試料毎に個別にアセンブルして、コンティグとして知られるより長いコンセンサス配列を産生することができる。ＳｐａｄｅｓおよびＭｅｇａＨｉｔを含む、配列リードをコンティグにアセンブルすることができる多くのバイオインフォマティクスツールが存在する。

このステップは、最初にデータビルドＩＤを同定し、データアーティファクト追跡システムを使用して入力を同定し、バッチ実行システムを使用して全ての試料にわたって大量に同時に実行するコンテナを起動することによって誘発される。次に、アセンブルされたコンティグを、ファイルセットにおいてメトリクスと共に保存した後、データアーティファクト追跡システムによって索引を形成する。

本発明の別の重要な態様は、個々のコンティグが中央のＩＤプロバイダを伴うことなく同時に生成することができ、なおも特有であると保証される汎用の特有のＩＤ（ＵＵＩＤ）によってラベルされることであり、これは、大規模アセンブリーにおいて重要な検討である。
４）配列アノテーション

次に、コンティグを解析して、予測される遺伝子の位置またはプロモーター部位などの他のゲノム特色を同定することができる。コンティグをまた解析して、生物の予測される分類学を割り当てることもできる。以前のステップと同様に、Ｐｒｏｄｉｇａｌおよびｋａｉｊｕを含む、ＤＮＡ配列をアノテートするために利用可能な多くのバイオインフォマティクスツールが存在する。

配列アセンブリーと同様に、このステップは、データビルドＩＤを使用して進行中のデータビルドを最初に同定し、データアーティファクト追跡システムを使用して入力を同定し、バッチ実行システムを使用して全ての試料にわたって大量に同時に実行されるコンテナを起動することによって誘発される。

同様に以前のステップのように、出力データを、データアーティファクト追跡システムによって索引をつけ、バージョン化する。
５）バージョン化データビルドへの配列の融合

最終ステップは、データビルドのための単一のコレクションへの試料全体のデータの集合である。このステップも同様に、特有のデータビルドＩＤを使用して複数のステップからの出力ファイルを、システムの最終出力を形成する単一のファイルセットに組み合わせるコンテナを起動することによって開始される。これらのファイルは、各コンティグ配列、ＧｅｎＢａｎｋ、およびゲノム特色アノテーションに関するＦＡＳＴＡファイルの組み合わせたＦＡＳＴＡファイル、各コンティグ配列を分類学的に予測するためのＣＳＶファイル、ならびに各コンティグならびに特有のデータビルドＩＤ、試料ＩＤ、およびメタゲノムライブラリーに対するアノテーションを、利用可能であり得る任意の追加のメタデータに関連させるＣＳＶファイルセットを含む。

この時点で、データビルドは、データのこのコレクションおよびデータビルドＩＤに関して完全かつ不変であると考えられる。
データアーティファクト追跡システム

システムを動作させるコア構成成分の１つは、ファイルの群を、出力データが迅速にカテゴリー化され、入力データを容易に同定することができるように検索可能にメタデータに関連させるデータアーティファクト追跡システムである。

データアーティファクト追跡システムは、起源メタデータ（他の情報の中でも、創出タイムスタンプ、データビルドＩＤ、含まれるファイルのチェックサム、およびファイルを生成するために使用されるバイオインフォマティクスツールのコンテナのバージョンを含む）を含有するＪＳＯＮファイルおよびファイルのセットを特有に同定するＵＵＩＤと共にファイルのセットをグループにする。次に、このグループのファイルをデータアーティファクトと呼ぶ。

データアーティファクトは、一度索引を付けられると、不変であると考えられ、したがってどのデータがそのデータと共にどのように生成されるかに関しての検索可能な記録を提供する。

データアーティファクトは、２ステッププロセスで創出される。計算ジョブによって書き込むことが可能な一般的なファイルシステムは、出力をフォルダに書き込んでグループ分けすることを可能にする。この仮想空間が、データアーティファクトステージング領域であると考えられる。これは、ファイルが同時にこのファイルシステムに書き込まれて創出されることを可能にする。これらのデータアーティファクトはまだ検索可能ではないが、必要なメタデータ情報を含有する「ａｒｔｉｆａｃｔ．ｊｓｏｎ」ファイルが創出されるや否や、索引可能であると考えられる。

第２のステップでは、インデクサは、関連する「ａｒｔｉｆａｃｔ．ｊｓｏｎ」ファイルを有する任意の新しいデータアーティファクトに関してデータアーティファクトステージング領域をクロールする。このインデクサは、手動でまたは一部の定期的な時間間隔で起動される個別のジョブとして実行される。索引形成の間、メタデータおよびファイルが検証される。有効であれば、次に、データアーティファクトファイルを、ファイルシステムの個別の永続的な位置へと移動させ、適宜他のクラウドストレージの位置にバックアップし、メタデータを文書に基づくデータベース、例えばＭｏｎｇｏＤＢにおいて索引をつける。重要なことに、これは今や他のコンピュータジョブが各々のデータアーティファクトを特有に同定することを可能にし、その文書データベースを問い合わせることによって、データに関して検索することを可能にする。

例によって例証するために、アセンブリータスクは、具体的な試料に関してフィルタリングしたＦＡＳＴＱ配列データを含有する全てのデータアーティファクトを調べ、アセンブリーツールを実行し、次にデータアーティファクトステージング領域に出力フォルダを創出して、得られたＦＡＳＴＡファイルを保存する。最後に、タスクは、「ａｒｔｉｆａｃｔ．ｊｓｏｎ」ファイルを書き込み、このことはデータアーティファクトが処理の準備ができたことを示している。次に、インデクサタスクはデータアーティファクトを永続的な位置に移動させて、それらのファイルを下流のステップで利用できるようにする。次に、アノテーションタスクは、データアーティファクトデータベースからの１個または複数の試料に関するアセンブルされたコンティグを調べ、同様にそれらのコンティグを処理して遺伝子または他のゲノム特色を同定する。
アセンブリーおよびアノテーションパイプラインの経時的な操作

数百個の試料に及ぶ複雑なメタゲノムライブラリーを構築する場合しばしば、個々の試料は、通常の実験の変動、実験の誤り、または類似の問題により配列決定されていなくてもよく、ならびに望ましくなくてもよい。この規模での配列決定はなおも比較的費用が高く、そのため、ライブラリー全体を再度配列決定または再調製することは莫大な費用がかかり得る。その代わりに、コスミドＤＮＡの個々の試料を、再調製するか、または単に再度配列決定して追加のデータを追加し、最終アセンブリーの品質を改善してもよい。これは、再配列決定が必ずしも一次解析の間に直ちに行われず、特定の試料に新しい関心がある場合、またはある特定の試料が十分に高い品質ではないことが後に決定された場合に、数ヶ月または数年後に行われ得るという事実によって複雑となる。

これは、本発明が取り組むデータ追跡および処理におけるコンピューター上の難題を呈する。試料、コンティグ、または遺伝子レベルで有効なバージョニングのための起源または手段が備えられていない伝統的なシステムは、既存のデータの完全性を維持するが最近の新しいデータによって結果をなおも強化するように、多くのメタゲノムライブラリーにわたって結果を経時的に組み合わせることに苦労している。

しかし、本明細書に記載される本発明は、データアーティファクト追跡システムを使用することによって経時的に有効にメタゲノムライブラリーの構築の漸増を可能にする。新しい試料が再配列決定される場合、新しいデータビルドＩＤを創出し、パイプラインステップを再度実行して、新しいデータまたは適宜新しいデータと古いデータの組合せを共に使用して試料を選択する。最終的なデータ集合ステップでは、情報の選択を前回のデータビルドからプルダウンし、非接触試料を保存するが新しい結果と置き換えるように、または直ちに使用することができる新しいデータビルドに新しい結果を集合させるように組み合わせる。

このプロセスを図２０に例証する。プレートセットの数百の試料に対してコスミドライブラリーとして調製されたＭＧ３と名付けられたメタゲノムライブラリーを得る。次に、それらのプレート上の各試料を配列決定する。試料が多数であるために、これらの試料を遠隔の配列決定センターで２回の配列決定実行に分割する。システムは、特有のＩＤ ＳＥＱＲ＿０００５３１およびＳＥＱＲ＿０００５３２を割り当てて、どの試料がどの配列決定実行で配列決定されるかを特有に同定する。再処理、アセンブリー、およびアノテーションステップを、そのデータを単一のデータビルドに組み合わせて実行し、Ｄａｔａ Ｂｕｉｌｄ ＩＤ ＭＧ３＿ＢＵＩＬＤ＿１を与える。その結果は今や、配列検索または他の適用のために下流で使用可能である。将来に、後に検出されたデータ品質問題のために数ダースの試料が再配列決定されるように要請されていると仮定しよう。それらの試料は、異なる配列決定センターで再調製され、再配列決定される。その新しい配列決定の実行は、同様に特有のＩＤを割り当てられ、パイプラインは、それらの試料を、それらの試料からの過去の情報と共に処理して、改善されたアセンブリーおよび新しいアノテーションを創出する。今やデータはまとめて、ＭＧ３＿ＢＵＩＬＤ＿１および新しい試料に関する結果と集合されてＭＧ３＿ＢＵＩＬＤ＿２を生成し、次にこれは、下流の解析のために利用可能である。このプロセスを、本発明によって無限に繰り返して、なおも各々の特異的コンティグの起源、ならびに特定のパイプラインバージョン、配列決定ラン、およびメタゲノムライブラリーに対するアノテーションを追跡しながら、単一または組み合わせたメタゲノムまたは他のライブラリーを経時的にますます生成することができる。
発明のさらなる実施形態

本開示によって企図される他の主題を、以下の番号が付けられた実施形態に提示する：

１． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索し、目的の天然物を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、

ａ）デジタルメタゲノミクスライブラリーを、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルについて問い合わせるステップと、

ｂ）前記問い合わせの出力を、複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットとして供給するステップと、

ｃ）以下によって、生物学的関連性を決定し、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットに割り当てるステップ：

シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定し、１個もしくは複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）特色セットをデジタル処理でアセンブルすること、および／または

シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定して、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定すること、と、

ｄ）デジタル処理でアセンブルされた生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットの閾値パラメーター内に位置している、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子に基づき、目的の天然物をコードするＭＧＣを同定するステップと
を含む、方法。

２． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂまたは４０ｋｂのＮ５０長を含む長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーである、実施形態１に記載の方法。

３． デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、６００Ｍｂ、７００Ｍｂ、８００Ｍｂ、９００Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１３００Ｍｂまたは１４００Ｍｂのサイズである、実施形態１～２のいずれか一つに記載の方法。

４． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５００ＭＢのサイズである、実施形態１に記載の方法。

５． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１ＴＢのサイズである、実施形態１に記載の方法。

６． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされた配列を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、約５００ＭＢ～約１ＴＢのサイズである、実施形態１に記載の方法。

７． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおけるアセンブルされた配列の大部分が、無培養微小生物に由来する、実施形態１に記載の方法。

８． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の実質的に全てが、無培養微小生物に由来する、実施形態１に記載の方法。

９． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せの、ライブラリーに配置されている、実施形態１に記載の方法。

１０． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、無培養微小生物の少なくとも一部が、土壌試料に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミドライブラリーに配置されている、実施形態１に記載の方法。

１１． ステップａ）における問い合わせるステップが、ＨＭＭモデルを利用して、目的の遺伝子についてデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１１．１． ステップａ）における問い合わせるステップが、目的の遺伝子のホモログを含有するデジタルメタゲノミクスライブラリー内のコンティグを同定するステップを含み、相同性が、目的の遺伝子と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％の配列同一性を示す候補配列に基づき決定され、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１２． ステップａ）における問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、目的の遺伝子のホモログについてデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１３． ステップａ）における問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、目的の遺伝子（単数または複数）のホモログについてデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ここで前記遺伝子のコードされるタンパク質が、目的の天然物を産生することにおける生合成機能を有さず、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１３．１． 予測モデルが、長・短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくもの等の回帰型ニューラルネットワークを含む、ＨＭＭ、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、双方向性ＬＳＴＭ（長・短期記憶）、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）、ＲＮＮ（回帰型ニューラルネットワーク）、動的ベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク、およびそれらの組合せからなる群より選択される、実施形態１２または１３のいずれかに記載の方法。

１３．１．１． 予測モデルが、ＨＭＭである、実施形態１２または１３に記載の方法。

１３．２． ホモログが、ＨＭＭモデルにおいて３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０を超えるビットスコアを示す、実施形態１３．１．１に記載の方法。

１３．３． ステップａ）における問い合わせるステップが、目的の遺伝子のホモログを含有するデジタルメタゲノミクスライブラリー内のコンティグを同定するステップを含み、相同性が、目的の遺伝子と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％の配列同一性を示す候補配列に基づき決定され、前記目的の遺伝子のコードされるタンパク質が、目的の天然物を産生することにおける生合成機能を有さず、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１４． ステップａ）における問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、公知の抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログについてデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１４．１． 予測モデルが、長・短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくもの等の回帰型ニューラルネットワークを含む、ＨＭＭ、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、双方向性ＬＳＴＭ（長・短期記憶）、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）、ＲＮＮ（回帰型ニューラルネットワーク）、動的ベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク、およびそれらの組合せからなる群より選択される、実施形態１４に記載の方法。

１４．１．１． 予測モデルが、ＨＭＭである、実施形態１４に記載の方法。

１４．２． ホモログが、ＨＭＭモデルにおいて３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０を超えるビットスコアを示す、実施形態１４．１．１に記載の方法。

１４．３． ステップａ）における問い合わせるステップが、公知の抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログのホモログを含有するデジタルメタゲノミクスライブラリー内のコンティグを同定するステップを含み、相同性が、公知の抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログと少なくとも９５％、９０％、８５％または８０％の配列同一性を示す候補配列に基づき決定され、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１５． ステップａ）における問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、コンピューターにより予測または仮定される抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログについてデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１５．１． 予測モデルが、長・短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくもの等の回帰型ニューラルネットワークを含む、ＨＭＭ、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、双方向性ＬＳＴＭ（長・短期記憶）、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）、ＲＮＮ（回帰型ニューラルネットワーク）、動的ベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク、およびそれらの組合せからなる群より選択される、実施形態１５に記載の方法。

１５．１．１． 予測モデルが、ＨＭＭである、実施形態１５に記載の方法。

１５．２． ホモログが、ＨＭＭモデルにおいて３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０を超えるビットスコアを示す、実施形態１５．１．１に記載の方法。

１５．３． ステップａ）における問い合わせるステップが、コンピューターにより予測または仮定される抵抗性遺伝子のホモログを含有するデジタルメタゲノミクスライブラリー内のコンティグを同定するステップを含み、相同性が、コンピューターにより予測または仮定される抵抗性遺伝子と少なくとも９５％、９０％、８５％または８０％の配列同一性を示す候補配列に基づき決定され、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１６． ステップａ）における問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、単一のコンティグに含有される目的の遺伝子についてデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

１６．１． 予測モデルが、長・短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくもの等の回帰型ニューラルネットワークを含む、ＨＭＭ、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、双方向性ＬＳＴＭ（長・短期記憶）、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）、ＲＮＮ（回帰型ニューラルネットワーク）、動的ベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク、およびそれらの組合せからなる群より選択される、実施形態１６に記載の方法。

１６．１．１． 予測モデルが、ＨＭＭである、実施形態１６に記載の方法。

１６．２． ホモログが、ＨＭＭモデルにおいて３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０を超えるビットスコアを示す、実施形態１６．１．１に記載の方法。

１７． シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットが、１個または複数の生合成オペロンを含む多重遺伝子クラスターを含有することがコンピューターにより予測される複数のコンティグのデータベースを含む、実施形態１に記載の方法。

１８． ステップａ）における問い合わせるステップが、１個または複数の生合成オペロンを含む多重遺伝子クラスターを含有する（例えば、ＭＧＣを含む）ことがコンピューターにより予測される全ての配列を同定するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定して、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定するステップを含む、実施形態１に記載の方法。

１９． シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットが、推定上の抵抗性遺伝子を含有する複数の単一のコンティグのデータベースを含む、実施形態１に記載の方法。

２０． シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットがフィルタリングされて、サイズが約１５ｋｂ未満のコンティグを排除する、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。

２１． シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットがフィルタリングされて、サイズが約１５ｋｂ未満のコンティグを排除し、また、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セット内の第１のコンティグと約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％超の配列同一性を共有する重複コンティグ結果を排除する、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。

２１．１． 目的の天然物をコードするＭＧＣがフィルタリングされて、ステップ（ｄ）において同定された第１の同定されたＭＧＣと約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％超の配列同一性を共有する重複ＭＧＣを排除する、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。

２２． ステップｃ）における、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、遺伝的アルゴリズムにより行われる、実施形態１～２１．１のいずれか一つに記載の方法。

２３． ステップｃ）における、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、遺伝的クラスター予測アルゴリズムにより行われる、実施形態１～２１．１のいずれか一つに記載の方法。

２４． ステップｃ）における、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）予測アルゴリズム（例えば、表１に収載されているもの等）により行われる、実施形態１～２１．１のいずれか一つに記載の方法。

２５． １個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、抗生物質および二次代謝物解析シェル（ＡｎｔｉＳＭＡＳＨ）アルゴリズムおよびパイプライン、またはＤｅｅｐＢＧＣアルゴリズムおよびパイプラインにより行われる、実施形態１～２１．１のいずれか一つに記載の方法。

２６． シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定して、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定するステップが、生合成遺伝子クラスター（ＢＧＣ）予測アルゴリズムを利用して、生合成オペロンを含むコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルした後に行われる、実施形態１～２５のいずれか一つに記載の方法。

２６．１． 生合成遺伝子クラスター（ＢＧＣ）予測アルゴリズムを利用して、生合成オペロンを含むコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定して、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定した後に行われ、生合成オペロンを含むコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットは、生合成遺伝子クラスター（ＢＧＣ）予測アルゴリズムを利用してアセンブルされた、実施形態１～２５のいずれか一つに記載の方法。

２７． 以下をさらに含む、実施形態１～２６．１のいずれか一つに記載の方法：

ｅ）コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含まないデジタルメタゲノミクスライブラリー内の複数のコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットを同定するステップ。

２８． 以下をさらに含む、実施形態１～２６．１のいずれか一つに記載の方法：

ｅ）コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含まないが、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含むコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットに対して所定の程度の遺伝的関連性を有する、複数のコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットを同定して、これにより、推移的な抵抗性遺伝子天然物多重遺伝子クラスター特色セットを創出するステップ。

２９． 以下をさらに含む、実施形態１～２６．１のいずれか一つに記載の方法：

ｅ）コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含まないが、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含む同定されたコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットに対して予測される程度の遺伝的関連性を有する、複数のコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットを同定して、これにより、推移的な抵抗性遺伝子天然物多重遺伝子クラスター特色セットを創出するステップと、

ｆ）推移的な抵抗性遺伝子天然物多重遺伝子クラスター特色セットから目的の天然物を同定するステップ。

２９．１． コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子が、多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロンの調節制御下にある、実施形態１～２９のいずれか一つに記載の方法。

２９．２． 以下のステップを含む、実施形態１～２９．１のいずれか一つに記載の方法：

ｅ）宿主細胞を製造するステップであって、宿主細胞が、ステップ（ｄ）において同定された目的の天然物をコードするＭＧＣ、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ。

２９．３． 以下のステップを含む、実施形態２９．２に記載の方法：

ｆ）ステップ（ｅ）の製造された宿主細胞を培養するステップ。

２９．４． 以下のステップを含む、実施形態２９．３に記載の方法：

ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、製造された宿主細胞中に存在するＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ。

２９．５． デジタルメタゲノミクスライブラリーが、実施形態３２～６１のいずれか一つに記載の方法に従って産生された、実施形態１～２９．４のいずれか一つに記載の方法。

２９．６． 以下のステップを含む、実施形態２７～２８のいずれか一つに記載の方法：

ｆ）宿主細胞を製造するステップであって、宿主細胞が、ステップ（ｅ）において同定されたコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セット、またはそのリファクタリングされたバージョンのうち少なくとも１種を含む、ステップ。

２９．７． 以下のステップを含む、実施形態２９．６に記載の方法：

ｇ）ステップ（ｆ）の製造された宿主細胞を培養するステップ。

２９．８． 以下のステップを含む、実施形態２９．７に記載の方法：

ｈ）ステップ（ｇ）の培養物由来の使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、製造された宿主細胞中に存在するＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ。

３０． 未知の推定上の抵抗性遺伝子を有するまたは抵抗性遺伝子を有さない候補多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）特色セットを同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、

ａ）デジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測するステップと、

ｂ）予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子をアノテートするステップであって、各多重遺伝子クラスター特色セットが、左および右境界を含み、アノテーションステップが、前記多重遺伝子クラスター特色セットの境界の１～２個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に位置する遺伝子をアノテートするステップを必要に応じて含む、ステップと、

ｃ）予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セットから、アノテートされた遺伝子をフィルタリングして、

ｉ）予測される生合成機能を有さず、

ｉｉ）必要に応じて、公知の標的抵抗性遺伝子に対するホモログではない、
遺伝子のみを残し、これにより、複数のフィルタリングされた目的の遺伝子を産生するステップと、

ｄ）複数のフィルタリングされた目的の遺伝子のうち少なくとも１個を含む天然物多重遺伝子クラスター特色セットを選択し、これにより、推定上の抵抗性遺伝子を有するまたは抵抗性遺伝子を有さない候補ＭＧＣ配列を同定するステップと
を含む、方法。

３０．１． 予測される抵抗性遺伝子を有する候補多重遺伝子クラスター特色セットを同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、

ａ）デジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測するステップと、

ｂ）生合成潜在性スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成潜在性スコアが、遺伝子が生合成酵素であることの計算された尤度に基づく、ステップと、

ｃ）公知の抵抗性遺伝子スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記公知の抵抗性スコアが、公知の抵抗性遺伝子との遺伝子の共有される配列同一性に基づく、ステップと、

ｄ）予測される抵抗性遺伝子を含む候補多重遺伝子クラスター特色セットを選択するステップであって、前記予測される抵抗性遺伝子が、予め設定された組合せスコア閾値を示し、前記組合せスコアが、生合成潜在性スコアおよび公知の抵抗性遺伝子スコアの組合せに基づく、ステップと
を含む、方法。

３０．２． 生合成オペロンスコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成オペロンスコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロンに対する遺伝子の近接に基づき、組合せスコアがまた、生合成オペロンスコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１に記載の方法。

３０．３． コア生合成遺伝子距離スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記コア生合成遺伝子距離スコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内のコア生合成遺伝子に対する遺伝子の近接に基づき、組合せスコアがまた、コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１および３０．２のいずれか一つに記載の方法。

３０．４． 必須遺伝子スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記必須遺伝子スコアが、公知の必須遺伝子配列のリストに対する遺伝子の最高の配列同一性に基づき、組合せスコアがまた、必須遺伝子スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１～３０．３のいずれか一つに記載の方法。

３０．５ 選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子が、公知の抵抗性遺伝子と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％未満の配列同一性を共有する、実施形態３０．１～３０．４のいずれか一つに記載の方法。

３０．６． 選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子が、生合成酵素と９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％未満の配列同一性を共有する、実施形態３０．１～３０．５のいずれか一つに記載の方法。

３０．６．１． 生合成酵素が、予測される抵抗性遺伝子を含有する多重遺伝子クラスター特色セットによってコードされる天然物のための生合成酵素である、実施形態３０．１～３０．６のいずれか一つに記載の方法。

３０．６．２． 生合成酵素が、多重遺伝子クラスター特色セット（例えば、ＭｉＢｉｇ）によってコードされる天然物に関連する生合成酵素のホモログである、実施形態３０．１～３０．６．１のいずれか一つに記載の方法。

３０．７． 選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子が、ａｎｔｉｓｍａｓｈによって評価される場合、ｍｉＢＩＧにおける８、６、４または２未満のＢＬＡＳＴヒットを返す、実施形態３０．１～３０．６．２のいずれか一つに記載の方法。

３０．８． 選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子が、組合せスコアを有し、それぞれ公知の生合成酵素または公知の抵抗性遺伝子と比較した場合、遺伝子が生合成酵素であることの計算された尤度が低く、公知の抵抗性遺伝子との共有される配列同一性が低い、実施形態３０．１～３０．７のいずれか一つに記載の方法。

３０．９． 選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子が、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロン内にまたはそれに直接隣接して位置する（すなわち、その間に他のＯＲＦがない）、実施形態３０．１～３０．８のいずれか一つに記載の方法。

３０．１０． 選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子が、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セットに含有される生合成オペロンの内部にまたは生合成オペロンの５００ｂｐ以内に位置する、実施形態３０．１～３０．９のいずれか一つに記載の方法。

３０．１１． 選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子が、コア生合成酵素の１ｋＢ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂまたは５ｋｂ以内に位置する、実施形態３０．１～３０．１０のいずれか一つに記載の方法。

３０．１２． 選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子が、必須遺伝子と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％の配列同一性を共有する、実施形態３０．１～３０．１１のいずれか一つに記載の方法。

３０．１２．１． 輸送遺伝子潜在性スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記輸送遺伝子潜在性スコアが、輸送関連遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、組合せスコアがまた、コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１～３０．１２のいずれか一つに記載の方法。

３０．１２．２． 調節遺伝子潜在性スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記調節遺伝子潜在性スコアが、調節遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、組合せスコアがまた、コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１～３０．１２．１のいずれか一つに記載の方法。

３０．１２．３． 抵抗性機構スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、所望の抵抗性機構とは異なる抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、組合せスコアがまた、抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１～３０．１２．２のいずれか一つに記載の方法。

３０．１２．４． 抵抗性機構スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、所望の抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、組合せスコアがまた、抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１～３０．１２．３のいずれか一つに記載の方法。

３０．１２．５． 所望の抵抗性機構が、標的バリアントに基づく抵抗性である、実施形態３０．１～３０．１２．４に記載の方法。

３０．１３． 多重遺伝子クラスターによってコードされる天然物のための抵抗性遺伝子を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、

ａ）デジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスターをコンピューターにより予測するステップと、

ｂ）生合成潜在性スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成潜在性スコアが、遺伝子が生合成酵素であることの計算された尤度に基づく、ステップと、

ｃ）公知の抵抗性遺伝子スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記公知の抵抗性スコアが、公知の抵抗性遺伝子との遺伝子の共有される配列同一性に基づく、ステップと、

ｄ）予め設定された組合せスコア閾値を示す予測される抵抗性遺伝子を選択するステップであって、前記組合せスコアが、生合成潜在性スコアおよび公知の抵抗性遺伝子スコアの組合せに基づく、ステップと
を含む、方法。

３０．１４． 生合成オペロンスコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成オペロンスコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロンに対する遺伝子の近接に基づき、組合せスコアがまた、生合成オペロンスコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１３に記載の方法。

３０．１５． コア生合成遺伝子距離スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記コア生合成遺伝子距離スコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内のコア生合成遺伝子に対する遺伝子の近接に基づき、組合せスコアがまた、コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１３および３０．１４のいずれか一つに記載の方法。

３０．１６． 必須遺伝子スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記必須遺伝子スコアが、公知の必須遺伝子配列のリストに対する遺伝子の最高の配列同一性に基づき、組合せスコアがまた、必須遺伝子スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１３～３０．１５のいずれか一つに記載の方法。

３０．１７． 予測される抵抗性遺伝子が、公知の抵抗性遺伝子と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％未満の配列同一性を共有する、実施形態３０．１３～３０．１６のいずれか一つに記載の方法。

３０．１８． 予測される抵抗性遺伝子が、生合成酵素と９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％未満の配列同一性を共有する、実施形態３０．１３～３０．１７のいずれか一つに記載の方法。

３０．１９． 生合成酵素が、予測される抵抗性遺伝子を含有する多重遺伝子クラスター特色セットによってコードされる天然物のための生合成酵素である、実施形態３０．１３～３０．１８のいずれか一つに記載の方法。

３０．１９．１． 生合成酵素が、多重遺伝子クラスター特色セット（例えば、ＭｉＢｉｇ）によってコードされる天然物に関連する生合成酵素である、実施形態３０．１３～３０．１９のいずれか一つに記載の方法。

３０．２０． 予測される抵抗性遺伝子が、ａｎｔｉｓｍａｓｈによって評価される場合、ｍｉＢＩＧにおける８、６、４または２未満のＢＬＡＳＴヒットを返す、実施形態３０．１３～３０．１９．１のいずれか一つに記載の方法。

３０．２１． 予測される抵抗性遺伝子が、組合せスコアを有し、遺伝子が生合成酵素であることの計算された尤度が低く、公知の抵抗性遺伝子との共有される配列同一性が低い、実施形態３０．１３～３０．２０のいずれか一つに記載の方法。

３０．２２． 予測される抵抗性遺伝子が、選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロン内にまたはそれに直接隣接して位置する（すなわち、その間に他のＯＲＦがない）、実施形態３０．１３～３０．２１のいずれか一つに記載の方法。

３０．２３． 予測される抵抗性遺伝子が、生合成オペロンの内部にまたは生合成オペロンの５００ｂｐ以内に位置する、実施形態３０．１３～３０．２２のいずれか一つに記載の方法。

３０．２４． 予測される抵抗性遺伝子が、コア生合成酵素の１ｋＢ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂまたは５ｋｂ以内に位置する、実施形態３０．１３～３０．２３のいずれか一つに記載の方法。

３０．２５． 選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の予測される抵抗性遺伝子が、必須遺伝子と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％の配列同一性を共有する、実施形態３０．１３～３０．２４のいずれか一つに記載の方法。

３０．２６． 輸送遺伝子潜在性スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記輸送遺伝子潜在性スコアが、輸送関連遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、組合せスコアがまた、コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１３～３０．２５のいずれか一つに記載の方法。

３０．２７． 調節遺伝子潜在性スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記調節遺伝子潜在性スコアが、調節遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、組合せスコアがまた、コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１３～３０．２６のいずれか一つに記載の方法。

３０．２８． 抵抗性機構スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、所望の抵抗性機構とは異なる抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、組合せスコアがまた、抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１３～３０．２７のいずれか一つに記載の方法。

３０．２９． 抵抗性機構スコアを、多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、所望の抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、組合せスコアがまた、抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む、実施形態３０．１３～３０．２７のいずれか一つに記載の方法。

３０．３０． 所望の抵抗性機構が、標的バリアントに基づく抵抗性である、実施形態３０．２８または３０．２９に記載の方法。

３１． デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂまたは４０ｋｂのＮ５０長を含む長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーである、実施形態３０～３０．３０のいずれか一つに記載の方法。

３１．１． デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、６００Ｍｂ、７００Ｍｂ、８００Ｍｂ、９００Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１３００Ｍｂまたは１４００Ｍｂのサイズである、実施形態３０～３１のいずれか一つに記載の方法。

３１．２． デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５００ＭＢのサイズである、実施形態３０～３０．３０のいずれか一つに記載の方法。

３１．３． デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１ＴＢのサイズである、実施形態３０～３０．３０のいずれか一つに記載の方法。

３１．４． デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされた配列を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、約５００ＭＢ～約１ＴＢのサイズである、実施形態３０～３０．３０のいずれか一つに記載の方法。

３１．５． デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記アセンブルされたコンティグ配列、ライブラリーにおける配列の大部分が、無培養微小生物に由来する、実施形態３０～３０．３０のいずれか一つに記載の方法。

３１．６． デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の実質的に全てが、無培養微小生物に由来する、実施形態３０～３０．３０のいずれか一つに記載の方法。

３１．７． デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せの、ライブラリーに配置されている、実施形態３０～３０．３０のいずれか一つに記載の方法。

３１．８． デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、無培養微小生物の少なくとも一部が、土壌試料に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミドライブラリーに配置されている、実施形態３０～３０．３０のいずれか一つに記載の方法。

３１．９． ステップ（ｃ）が、ｉｉｉ）予測される生合成機能を有する多重遺伝子クラスター特色セット内の別の遺伝子と同時調節される遺伝子のみを残すように、アノテートされた遺伝子をさらにフィルタリングする、実施形態３０～３１．８のいずれか一つに記載の方法。

３１．１０． 以下のステップを含む、実施形態３０～３１．９のいずれか一つに記載の方法：

ｅ）宿主細胞を製造するステップであって、宿主細胞が、ステップ（ｄ）の候補ＭＧＣ配列、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ。

３１．１０．１． 以下のステップを含む、実施形態３０～３１．９のいずれか一つに記載の方法：

ｅ）宿主細胞を製造するステップであって、宿主細胞が、ステップ（ｄ）の選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ。

３１．１０．２． 以下のステップを含む、実施形態３０～３１．９のいずれか一つに記載の方法：

ｅ）宿主細胞を製造するステップであって、宿主細胞が、ステップ（ｄ）の選択された予測される抵抗性遺伝子を含む多重遺伝子クラスター特色セット、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ。

３１．１１． 以下のステップを含む、実施形態３１．１０～３１．１０．２に記載の方法：

ｆ）ステップ（ｅ）の製造された宿主細胞を培養するステップ。

３１．１２． 以下のステップを含む、実施形態３１．１１に記載の方法：

ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、製造された宿主細胞中に存在する候補ＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ。

３１．１３． デジタルメタゲノミクスライブラリーが、実施形態３２～６１のいずれか一つに記載の方法に従って産生された、実施形態３０～３１．１２のいずれか一つに記載の方法。

３２． 長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーをアセンブルするための方法であって、

ａ）特有の全ゲノムを含む配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料を提供するステップと、

ｂ）メタゲノムＤＮＡ試料のゲノム複雑性を低下させるステップであって、以下：

ｉ）メタゲノムＤＮＡ試料から複数のベクターへとＤＮＡ断片をクローニングして、メタゲノムベクター断片ライブラリーを創出すること、

ｉｉ）メタゲノムベクター断片ライブラリーから、それぞれ約１，０００～約３０，０００個のプールされたベクターを含む複数の別々のミニメタゲノムサブユニットへとベクターをプールして、複数のミニメタゲノムサブユニット内に、配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料由来のＤＮＡを含むミニメタゲノムライブラリーを創出すること、によって低下させるステップと、

ｃ）ミニメタゲノムライブラリーの複数の別々のミニメタゲノムサブユニットに存在するプールされたベクターに含有されるメタゲノムＤＮＡのプール内配列決定およびアセンブリーを行って、配列決定され、かつアセンブルされたＤＮＡコンティグを含む第１のパスの長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーを創出するステップであって、第１のパスの長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂのＮ５０長を有する、ステップと
を含む、方法。

３２．１． 以下のステップを含む、実施形態３２に記載の方法：

ｄ）第１のパスの長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリー由来の複数の配列決定され、かつアセンブルされたＤＮＡコンティグをさらにアセンブルすることによって、プール間ＤＮＡコンティグアセンブリーを行って、第２のパスの（ｓｅｃｏｎｄ－ｐａｓｓ）長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーを創出するステップ。

３３． 配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料が、少なくとも約５０、１００、５００、１０００または１００００種の特有の全ゲノムを含む、実施形態３２または３２．１に記載の方法。

３４． 配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料における特有の全ゲノムの平均サイズが、少なくとも約１ＭＢ、２ＭＢ、３ＭＢ、４ＭＢもしくは５ＭＢ、または１～５ＭＢの間である、実施形態３２～３３のいずれか一つに記載の方法。

３５． 長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂまたは１００ｋｂの長さを有する複数の配列決定され、かつアセンブルされたＤＮＡコンティグを含む、実施形態３２～３４のいずれか一つに記載の方法。

３６． 長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂまたは１００ｋｂのＮ５０長を有する、実施形態３２～３５のいずれか一つに記載の方法。

３６．１． ミニメタゲノムサブユニット由来のＤＮＡを配置するステップを含む、実施形態３２～３６のいずれか一つに記載の方法。

３７． 長いアセンブリーＤＮＡコンティグ長メタゲノムライブラリーの物理的コピーを配置するステップを含む、実施形態３２～３６のいずれか一つに記載の方法。

３８． 細菌細胞中にまたはＤＮＡ形態で、中間のＤＮＡコンティグ長ミニメタゲノムライブラリーまたは長いＤＮＡコンティグ長メタゲノムライブラリーの物理的コピーを配置するステップを含む、実施形態３２～３６のいずれか一つに記載の方法。

３９． 複数の別々のミニメタゲノムサブユニットを現実の座標空間に配置するステップと、識別子を各サブユニットに割り当てるステップとを含む、実施形態３２～３６のいずれか一つに記載の方法。

４０． 複数の別々のミニメタゲノムサブユニットをマルチウェルマイクロタイタープレートに配置するステップを含む、実施形態３２～３６のいずれか一つに記載の方法。

４１． 複数の別々のミニメタゲノムサブユニットを９６ウェルマイクロタイタープレートに配置するステップを含む、実施形態３２～３６のいずれか一つに記載の方法。

４２． ベクターが、プラスミドを含む、実施形態３２～４１のいずれか一つに記載の方法。

４３． ベクターが、コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せを含む、実施形態３２～４１のいずれか一つに記載の方法。

４４． ベクターが、コスミドを含む、実施形態３２～４１のいずれか一つに記載の方法。

４５． ステップ（ｂ）におけるメタゲノムベクター断片ライブラリーが、少なくとも約１Ｍまたは１０Ｍのベクターを含む、実施形態３２～４４のいずれか一つに記載の方法。

４６． ベクターが、コスミドを含み、ステップ（ｂ）におけるメタゲノムベクター断片ライブラリーが、少なくとも約１０Ｍのコスミドを含む、実施形態３２～４４のいずれか一つに記載の方法。

４７． ベクターが、コスミドを含み、ステップ（ｂ）におけるメタゲノムベクター断片ライブラリーが、少なくとも約２０Ｍのコスミドを含む、実施形態３２～４４のいずれか一つに記載の方法。

４８． ステップ（ｂ）において、メタゲノムライブラリーから複数のベクターへと、約２００ｋｂ未満のＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、実施形態３２～４７のいずれか一つに記載の方法。

４９． ステップ（ｂ）において、メタゲノムＤＮＡ試料から複数のベクターへと、約１００ｋｂ未満のＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、実施形態３２～４７のいずれか一つに記載の方法。

５０． ステップ（ｂ）において、メタゲノムＤＮＡ試料から複数のベクターへと、約５０ｋｂ未満のＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、実施形態３２～４７のいずれか一つに記載の方法。

５１． ステップ（ｂ）において、メタゲノムＤＮＡ試料から複数のベクターへと、約２０ｋｂ～約５０ｋｂのＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、実施形態３２～４７のいずれか一つに記載の方法。

５２． ステップ（ｂ）において、メタゲノムＤＮＡ試料から複数のコスミドへと、約３０ｋｂ～約４５ｋｂのＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、実施形態３２～４７のいずれか一つに記載の方法。

５３． ステップ（ｂ）における別々のミニメタゲノムサブユニットが、それぞれ約３，０００～約１５，０００個のプールされたベクターを含む、実施形態３２～５２のいずれか一つに記載の方法。

５４． ステップ（ｂ）における別々のミニメタゲノムサブユニットが、それぞれ約５，０００～約１２，０００個のプールされたコスミドベクターを含む、実施形態３２～５２のいずれか一つに記載の方法。

５５． 第２のパスの長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂまたは３０ｋｂのＮ５０長を有する、実施形態３２～５４のいずれか一つに記載の方法。

５６． ステップ（ｃ）が、複数の別々のミニメタゲノムサブユニット由来の個々の別々のミニメタゲノムサブユニットに存在するプールされたベクターに含有されるＤＮＡコンティグの全てを同時にアセンブルするステップを含む、実施形態３２～５５のいずれか一つに記載の方法。

５７． ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、単一分子配列決定を利用して行われる、実施形態３２～５６のいずれか一つに記載の方法。

５８． ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、合成による配列決定（ＳＢＳ）を利用して行われる、実施形態３２～５６のいずれか一つに記載の方法。

５９． ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定を利用して行われる、実施形態３２～５６のいずれか一つに記載の方法。

６０． ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、ナノポア配列決定を利用して行われる、実施形態３２～５６のいずれか一つに記載の方法。

６０．１． ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、合成長リード配列決定を利用して行われる、実施形態３２～５６のいずれか一つに記載の方法。

６０．２． 合成長リードが、近接ライゲーション戦略および／または光学マッピングに基づく、実施形態６０．１に記載の方法。

６０．３． ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、Ｈｉ－Ｃ配列決定である、実施形態３２～５６のいずれか一つに記載の方法。

６１． ステップｂ）における別々のミニメタゲノムサブユニットが、それぞれ約５，０００～約１２，０００個のプールされたコスミドベクターを含み、ステップ（ｃ）が、複数の別々のミニメタゲノムサブユニット由来の個々の別々のミニメタゲノムサブユニット中に存在する配列決定されたＤＮＡの全てを同時にアセンブルするステップを含む、実施形態３２～６０．３のいずれか一つに記載の方法。

６２． 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、

ａ）標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される複数の酵素を提供し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、

ｂ）アナログ化酵素パネル由来の個々の酵素を、標的天然物または標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、

ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物のうち少なくとも１種を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、

ｄ）アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｃ）の解析によって決定される通り、選択された酵素が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップと
を含む、方法。

６３． ステップ（ａ）の酵素が、前記酵素を異種的に発現する微生物株由来のライセートの形態で提供される、実施形態６２に記載の方法。

６４． 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、

ａ）標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれ発現する、複数の微生物株を提供し、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、

ｂ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を、標的天然物または標的天然物の前駆体と接触させ、これにより、混合物を創出するステップと、

ｃ）ステップ（ｂ）の混合物を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、

ｄ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｃ）の解析によって決定される通り、選択された微生物株が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化し、選択された微生物株によって発現される酵素が、選択された酵素である、ステップと
を含む、方法。

６５． 選択された酵素を発現するように第１の基礎微生物株のゲノムを撹乱するステップであって、第１の基礎微生物株が、標的天然物を合成することができる、ステップをさらに含む、実施形態６２～６４のいずれか一つに記載の方法。

６６． 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、

ａ）標的天然物の第１のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれコードする、複数の遺伝的配列を提供するステップと、

ｂ）ステップ（ａ）の複数の遺伝的配列のうち１種または複数によってコードされる酵素をそれぞれ発現するように、第１の基礎微生物株の１個または複数の細胞のゲノムを撹乱するステップであって、第１の基礎微生物株が、標的天然物を合成することができ、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、

ｃ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、

ｄ）ステップ（ｃ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、

ｅ）微生物株のアナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｄ）の解析によって決定される通り、選択された微生物株が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップと
を含む、方法。

６７． 以下のステップをさらに含む、実施形態６６に記載の方法：

ｆ）標的天然物またはステップ（ｅ）の所望のアナログの第２のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれコードする第２の複数の遺伝的配列を提供するステップと、

ｇ）ステップ（ｆ）の第２の複数の遺伝的配列のうち１種または複数によってコードされる酵素をそれぞれ発現するように、第２の基礎微生物株の１個または複数の細胞のゲノムを撹乱するステップであって、第２の基礎微生物株が、ステップ（ｅ）の所望のアナログを合成することができ、これにより、微生物株の第２のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、

ｈ）微生物株の第２のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、

ｉ）ステップ（ｈ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、

ｊ）微生物株の第２のアナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｉ）の解析によって決定される通り、本ステップの選択された微生物株が、標的天然物の第２の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップ。

６８． 標的天然物が、第１または第２の基礎微生物株における生合成経路によって産生され、前記生合成経路が、複数の生合成遺伝子を含み、ステップ（ｂ）および／または（ｇ）が、生合成遺伝子のうち１種または複数を、それぞれステップ（ａ）または（ｆ）の第１または第２の複数の遺伝的配列のうち１種または複数に置き換えるステップを含む、実施形態６６または６７に記載の方法。

６９．実施形態６２～６８のいずれか一つに記載の方法であって、
酵素のうち少なくとも１種が、配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に由来し、遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットを投入された機械学習モデルによって、ある型の反応を触媒することが予測されており、

ｉ）遺伝的配列入力変数が、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒する酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、

ｉｉ）表現型性能出力変数が、１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、方法。

７０． 実施形態６９に記載の方法であって、訓練データセットが、

ｉ）標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが経験的に示された、または

ｉｉ）高度の信頼度で、他の機構により、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが予測された、
のいずれかであるタンパク質のアミノ酸配列を含む、方法。

７１． 酵素が、雑多な酵素である、実施形態６２～７０のいずれか一つに記載の方法。

７１．１． 選択された酵素が、１種より多い基質を改変することができる、実施形態６２～７０のいずれか一つに記載の方法。

７２． 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、

ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、

ｉ）遺伝的配列入力変数が、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、

ｉｉ）表現型性能出力変数が、１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、

ｂ）訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、

ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒すると予測される、ステップと、

ｄ）第１の信頼度スコアの第２の信頼度スコアに対する比が、予め選択された閾値から外れる場合、候補配列のプールから、第２の信頼度スコアによる第２の予測的機械学習モデルによって、異なる機能を果たすことが予測されるあらゆる配列を除去し、これにより、候補配列のフィルタリングされたプールを産生するステップと、

ｅ）ステップ（ｄ）由来の候補配列のフィルタリングされたプール由来の配列をそれぞれ発現するように１個または複数の微生物細胞を製造するステップと、

ｆ）ステップ（ｅ）の製造された宿主細胞を培養し、培養された細胞を溶解し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、

ｇ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の酵素を、標的天然物または標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、

ｈ）ステップ（ｇ）の反応混合物のうち少なくとも１種を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、

ｉ）アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｈ）の解析によって決定される通り、選択された酵素が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップと
を含む、方法。

７２．１． 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、

ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、

ｉ）遺伝的配列入力変数が、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、

ｉｉ）表現型性能出力変数が、１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、

ｂ）訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、

ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒すると予測され、これにより、候補配列のプールを生成する、ステップと、

ｄ）ステップ（ｃ）由来の候補配列のプール由来の配列をそれぞれ発現するように１個または複数の微生物細胞を製造するステップと、

ｅ）ステップ（ｄ）の製造された宿主細胞を培養し、培養された細胞を溶解し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、

ｆ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の酵素を、標的天然物または標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、

ｇ）ステップ（ｆ）の反応混合物のうち少なくとも１種を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、

ｈ）アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の解析によって決定される通り、選択された酵素が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップと
を含む、方法。

７３． 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、

ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、

ｉ）遺伝的配列入力変数が、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、

ｉｉ）表現型性能出力変数が、１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、

ｂ）訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、

ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒すると予測される、ステップと、

ｄ）第１の信頼度スコアの第２の信頼度スコアに対する比が、予め選択された閾値から外れる場合、候補配列のプールから、第２の信頼度スコアによる第２の予測的機械学習モデルによって、異なる機能を果たすことが予測されるあらゆる配列を除去し、これにより、候補配列のフィルタリングされたプールを産生するステップと、

ｅ）ステップ（ｄ）由来の候補配列のフィルタリングされたプール由来の配列をそれぞれ発現するように、基礎微生物株の１個または複数の微生物細胞のゲノムを撹乱するステップであって、基礎微生物株が、標的天然物を合成することができ、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、

ｆ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、

ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、

ｈ）微生物株のアナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の解析によって決定される通り、選択された微生物株が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップと
を含む、方法。

７３．１． 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、

ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、

ｉ）遺伝的配列入力変数が、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、

ｉｉ）表現型性能出力変数が、１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、

ｂ）訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、

ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒すると予測され、これにより、候補配列のプールを産生する、ステップと、

ｄ）ステップ（ｃ）由来の候補配列のプール由来の配列をそれぞれ発現するように、基礎微生物株の１個または複数の微生物細胞のゲノムを撹乱するステップであって、基礎微生物株が、標的天然物を合成することができ、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、

ｅ）微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、

ｆ）ステップ（ｅ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、

ｇ）微生物株のアナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｆ）の解析によって決定される通り、選択された微生物株が、標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、標的天然物をアナログ化する、ステップと
を含む、方法。

７３．２． 天然物をアナログ化することができる酵素を同定するための方法であって、

ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、

ｉ）遺伝的配列入力変数が、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、

ｉｉ）表現型性能出力変数が、１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、

ｂ）訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、

ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒すると予測され、これにより、天然物をアナログ化することができると予測される候補配列のプールを産生する、ステップと
を含む、方法。

７３．３． 多重遺伝子クラスターを含有することがコンピューターにより予測される配列ライブラリー内の全ての配列を同定するステップと、予測される多重遺伝子クラスター内に位置していない配列を、ステップ（ｃ）の候補配列のプールから除去するステップとを含む、実施形態７２～７３．２のいずれか一つに記載の方法。

７３．４． 以下のステップを含む、実施形態７３．２または７３．３に記載の方法：

ｄ）候補配列のプール由来の配列をそれぞれ発現するように、１個または複数の微生物細胞を製造するステップ。

７３．５． 以下のステップを含む、実施形態７３．４に記載の方法：

ｅ）ステップ（ｄ）の製造された宿主細胞を培養し、培養された細胞を溶解し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップ。

７３．６． 以下のステップを含む、実施形態７３．５に記載の方法：

ｆ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の酵素を、標的天然物または標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップ。

７３．７． 以下のステップを含む、実施形態７３．６に記載の方法：

ｇ）ステップ（ｆ）の反応混合物のうち少なくとも１種を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップ。

７３．８． 以下のステップを含む、実施形態７３．７に記載の方法：

ｈ）アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の解析によって決定される通り、選択された酵素が、標的天然物の所望のアナログを産生する、ステップ。

７４． 実施形態７２および７３．８のいずれか一つに記載の方法であって、ステップ（ａ）の訓練データセットに、

ｉ）ステップ（ｅ）の微生物細胞において発現された配列のうち少なくとも１種、および

ｉｉ）ステップ（ｈ）において測定される通り、（ｉ）の少なくとも１種の配列に対応する表現型性能測定値
を加え、これにより、アップデートされた訓練データセットを創出するステップをさらに含む、方法。

７５． 実施形態７２．１～７３のいずれか一つに記載の方法であって、ステップ（ａ）の訓練データセットに、

ｉ）ステップ（ｄ／ｅ）の微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーにおいて発現された配列のうち少なくとも１種、および

ｉｉ）ステップ（ｇ）において測定される通り、（ｉ）の少なくとも１種の配列に対応する表現型性能測定値
を加え、これにより、アップデートされた訓練データセットを創出するステップをさらに含む、方法。

７５．１． 実施形態７３．１に記載の方法であって、ステップ（ａ）の訓練データセットに、

ｉ）ステップ（ｄ）の微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーにおいて発現された配列のうち少なくとも１種、および

ｉｉ）ステップ（ｆ）において測定される通り、（ｉ）の少なくとも１種の配列に対応する表現型性能測定値
を加え、これにより、アップデートされた訓練データセットを創出するステップをさらに含む、方法。

７６． 表現型性能測定値が、存在した標的天然物のアナログの量を示す、実施形態７４～７５．１のいずれか一つに記載の方法。

７７． 最後から２番目のステップが、以前のステップの全てを、アップデートされた訓練データセットにより少なくとも１回反復するステップである、実施形態７４～７５．１のいずれか一つに記載の方法。

７８． 実施形態７２～７７のいずれか一つに記載の方法であって、訓練データセットが、

ｉ）標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが経験的に示された、または

ｉｉ）高度の信頼度で、他の機構により、標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが予測された、
のいずれかであるタンパク質のアミノ酸配列を含む、方法。

７８．１． 予測的機械学習モデルが、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）である、実施形態７２～７８のいずれか一つに記載の方法。

７９． 標的天然物のアナログを産生するための方法であって、

ａ）標的天然物を産生することが公知である第１の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、

ｂ）前記第１の多重遺伝子クラスターに基づき予測モデルを開発するステップと、

ｃ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、デジタルメタゲノミクスライブラリーを新たな多重遺伝子クラスターについて問い合わせるステップであって、前記新たな多重遺伝子クラスターが、予測モデルによって、標的天然物または標的天然物のバリアントを産生することが予測され、これにより、候補多重遺伝子クラスターのプールを産生する、ステップと、

ｄ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、アノテーションエンジンにより、ステップ（ｃ）の候補多重遺伝子クラスターのプールの新たな多重遺伝子クラスターの１個または複数内の生合成酵素をコードする個々の遺伝子を同定し、これにより、新たな多重遺伝子クラスターから、生合成遺伝子を含むアナログ化酵素パネルライブラリーを産生するステップと、

ｅ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の遺伝子を発現するように基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱するステップであって、基礎微生物宿主細胞が、第１の多重遺伝子クラスターを含む、ステップと、

ｆ）ステップ（ｅ）において製造された微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、

ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、

ｈ）ステップ（ｆ）において培養された微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の解析によって決定される通り、選択された微生物宿主細胞が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物のアナログを産生する、ステップと
を含む、方法。

８０． 標的天然物のアナログを産生するための方法であって、

ａ）標的天然物を産生することが公知である第１の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、

ｂ）前記第１の多重遺伝子クラスターに基づき予測モデルを開発するステップと、

ｃ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、デジタルメタゲノミクスライブラリーを新たな多重遺伝子クラスターについて問い合わせるステップであって、前記新たな多重遺伝子クラスターが、予測モデルによって、標的天然物または標的天然物のバリアントを産生することが予測され、これにより、候補多重遺伝子クラスターのプールを産生する、ステップと、

ｄ）候補多重遺伝子クラスターのプール由来の少なくとも１種の多重遺伝子クラスターをそれぞれ発現するように、１個または複数の微生物宿主細胞を製造するステップと、

ｅ）ステップ（ｄ）において製造された微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、

ｆ）ステップ（ｅ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または標的天然物のアナログについて解析するステップと、

ｇ）ステップ（ｅ）において培養された微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｆ）の解析によって決定される通り、選択された微生物宿主細胞が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物のアナログを産生する、ステップと
を含む、方法。

８１． 以下のステップをさらに含む、実施形態８０に記載の方法：

ｈ）ステップ（ｇ）の選択された微生物宿主細胞内に含まれる候補多重遺伝子クラスター由来の遺伝子を発現するように基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱するステップであって、基礎微生物宿主細胞が、第１の多重遺伝子クラスターを含み、これにより、改変された基礎宿主細胞を産生する、ステップ。

８２． ステップ（ｈ）が、第１の多重遺伝子クラスター由来の本来の遺伝子を、候補多重遺伝子クラスター由来の対応する遺伝子に置き換えるステップを含む、実施形態８１に記載の方法。

８３． ステップ（ｈ）が、第１の多重遺伝子クラスター由来の本来の遺伝子をノックアウトするステップを含む、実施形態８１に記載の方法。

８４． 標的天然物のアナログを産生するための方法であって、

ａ）標的天然物を産生することが公知の多重遺伝子クラスターを含む基礎微生物宿主細胞を提供するステップと、

ｂ）多重遺伝子クラスター内の１個または複数の遺伝子の発現を変異させるまたはノックアウトするように、基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱し、これにより、変異された微生物宿主細胞のライブラリーを創出するステップと、

ｃ）変異された微生物宿主細胞のライブラリー由来の微生物宿主細胞を培養するステップと、

ｄ）ステップ（ｃ）の培養物由来の使用済み培地を、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、

ｅ）ステップ（ｃ）において培養された微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｄ）の解析によって決定される通り、選択された微生物宿主細胞が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物のアナログを産生する、ステップと
を含む、方法。

８４．１． 標的天然物のアナログを産生するための方法であって、

ａ）標的天然物または関連天然物を産生することが公知のまたは予測される複数の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、

ｂ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、アノテーションエンジンにより、ステップ（ａ）の複数の多重遺伝子クラスター内の生合成酵素をコードする個々の遺伝子を同定し、これにより、複数の多重遺伝子クラスターから生合成遺伝子を含むアナログ化酵素パネルライブラリーを産生するステップと、

ｃ）アナログ化酵素パネルライブラリー由来の遺伝子を発現するように基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱するステップであって、基礎微生物宿主細胞が、標的天然物を産生することができる第１の多重遺伝子クラスターを含み、これにより、微生物細胞を製造する、ステップと、

ｄ）ステップ（ｃ）において製造された微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、

ｅ）ステップ（ｄ）の培養物由来の使用済み培地またはライセートを、標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、

ｆ）ステップ（ｄ）において培養された微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｅ）の解析によって決定される通り、選択された微生物宿主細胞が、標的天然物のアナログを産生し、これにより、標的天然物のアナログを産生する、ステップと
を含む、方法。

８４．２． デジタルメタゲノミクスライブラリーが、実施形態３２～６１のいずれか一つに記載の方法に従って産生された、実施形態６２～８４．１のいずれか一つに記載の方法。

８５． 公知の抵抗性遺伝子をコードしない候補多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、

ａ）公知のまたは予測されるＭＧＣの配列を提供するステップと、

ｂ）長いアセンブリーデジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測し、複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットとして前記予測の出力を供給するステップと、

ｃ）ステップ（ｂ）の複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットの中から候補ＭＧＣを選択するステップであって、前記候補ＭＧＣが、以下からなる群より選択される少なくとも１種の類似性因子：

ｉ）公知のまたは予測されるＭＧＣおよび候補ＭＧＣ内の１、２、３、４、５、６、７または８種の生合成酵素の配列相同性、

ｉｉ）公知のまたは予測されるＭＧＣおよび候補ＭＧＣ内の同数の各型の生合成モジュール、ならびに

ｉｉｉ）公知の／予測されるＭＧＣおよび候補ＭＧＣによって産生される天然物の予測される化学構造の類似性

を含み、これにより、公知の抵抗性遺伝子をコードしない候補ＭＧＣを同定する、ステップと
を含む、方法。

８６． 公知のまたは予測されるＭＧＣが、推定上の抵抗性遺伝子を含む、実施形態８５に記載の方法。

８７． ステップ（ｃ）（ｉ）の類似性因子が、公知のまたは予測されるＭＧＣの生合成酵素のうち少なくとも１種との、候補ＭＧＣにおける生合成酵素の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の配列相同性を含む、実施形態８５～８６のいずれか一つに記載の方法。

８８． 生合成酵素の相同性が、配列同一性により決定される、実施形態８５～８７のいずれか一つに記載の方法。

８９． 公知のまたは予測されるＭＧＣ内の生合成酵素と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す場合、候補ＭＧＣにおける生合成酵素が、ホモログである、実施形態８８に記載の方法。

９０． 生合成酵素の相同性が、ＨＭＭツールにより決定される、実施形態８５～８７のいずれか一つに記載の方法。

９１． その候補ビットスコアの最良のマッチのビットスコアに対する比が、０．６、０．７、０．８または０．９を超える場合、候補ＭＧＣにおける生合成酵素が、ホモログである、実施形態９０に記載の方法。

９２． 生合成酵素が、コア生合成酵素である、実施形態８５～９１のいずれか一つに記載の方法。

９３． 候補ＭＧＣおよび公知のまたは予測されるＭＧＣにおける予測される化学構造の類似性が、Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数によって決定される、実施形態８５～９２のいずれか一つに記載の方法。

９４． 少なくとも０．７、０．８、０．９または０．９５のＴａｎｉｍｏｔｏ係数を示す場合、候補ＭＧＣの予測される化学構造が、公知のまたは予測されるＭＧＣの公知のまたは予測される化学構造と同様である、実施形態９３に記載の方法。

９５． 推定上の抵抗性遺伝子が、予測されるＭＧＣ内に位置し、天然物の合成に関与しない、実施形態８５～９４のいずれか一つに記載の方法。

９６． 長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂまたは４０ｋｂのＮ５０長を含む、実施形態８５～９５のいずれか一つに記載の方法。

９７． デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、６００Ｍｂ、７００Ｍｂ、８００Ｍｂ、９００Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１３００Ｍｂまたは１４００Ｍｂのサイズである、実施形態８５～９６のいずれか一つに記載の方法。

９８． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５００ＭＢのサイズである、実施形態８５～９５のいずれか一つに記載の方法。

９９． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１ＴＢのサイズである、実施形態８５～９５のいずれか一つに記載の方法。

１００． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされた配列を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、約５００ＭＢ～約１ＴＢのサイズである、実施形態８５～９５のいずれか一つに記載の方法。

１０１． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおけるアセンブルされた配列の大部分が、無培養微小生物に由来する、実施形態８５～９５のいずれか一つに記載の方法。

１０２． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の実質的に全てが、無培養微小生物に由来する、実施形態８５～９５のいずれか一つに記載の方法。

１０３． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せの、ライブラリーに配置されている、実施形態８５～９５のいずれか一つに記載の方法。

１０４． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、無培養微小生物の少なくとも一部が、土壌試料に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミドライブラリーに配置されている、実施形態８５～９５のいずれか一つに記載の方法。

１０５． 以下のステップを含む、実施形態８５～１０４のいずれか一つに記載の方法：

ｄ）宿主細胞を製造するステップであって、製造された宿主細胞が、ステップ（ｃ）において同定された候補ＭＧＣ、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ。

１０６． 以下のステップを含む、実施形態１０５に記載の方法：

ｅ）ステップ（ｄ）の製造された宿主細胞を培養するステップ。

１０７． 以下のステップを含む、実施形態１０６に記載の方法：

ｆ）ステップ（ｅ）の培養物由来のライセートおよび／または使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、製造された宿主細胞中に存在する候補ＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ。

１０８． 候補多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、

ａ）公知のまたは予測されるＭＧＣのコア生合成酵素を同定するステップと、

ｂ）長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーを、（ａ）において同定されたコア生合成酵素のそれぞれのホモログについて問い合わせるステップであって、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、デジタル処理でアセンブルされたコンティグを含む、ステップと、

ｃ）デジタルメタゲノミクスライブラリーの単一のコンティグ内のコア生合成酵素のホモログの存在に基づき新たなＭＧＣを同定するステップと
を含む、方法。

１０９． 公知のまたは予測されるＭＧＣのコア生合成酵素のうち少なくとも１種と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の配列相同性を示す場合、デジタルメタゲノミクスライブラリーにおいてコードされる酵素が、ホモログとみなされる、実施形態１０８に記載の方法。

１０９．１． コア生合成酵素の相同性が、配列同一性により決定される、実施形態１０８～１０９のいずれか一つに記載の方法。

１０９．２． 公知のまたは予測されるＭＧＣ内の生合成酵素と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す場合、新たなＭＧＣにおける遺伝子が、ホモログである、実施形態１０９．１に記載の方法。

１１０． 生合成酵素の相同性が、ＨＭＭツールにより決定される、実施形態１０８に記載の方法。

１１１． そのコア生合成ビットスコアの最良のマッチのビットスコアに対する比が、０．６、０．７、０．８または０．９を超える場合、デジタルメタゲノミクスライブラリーにおける酵素が、ホモログである、実施形態１１０に記載の方法。

１１２． 長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂまたは４０ｋｂのＮ５０長を含む、実施形態１０８～１１１のいずれか一つに記載の方法。

１１２．１． デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、６００Ｍｂ、７００Ｍｂ、８００Ｍｂ、９００Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１３００Ｍｂまたは１４００Ｍｂのサイズである、実施形態１０８～１１２のいずれか一つに記載の方法。

１１３． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５００ＭＢのサイズである、実施形態１０８～１１１のいずれか一つに記載の方法。

１１４． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１ＴＢのサイズである、実施形態１０８～１１１のいずれか一つに記載の方法。

１１５． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされた配列を含み、デジタルメタゲノミクスライブラリーが、約５００ＭＢ～約１ＴＢのサイズである、実施形態１０８～１１１のいずれか一つに記載の方法。

１１６． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおけるアセンブルされた配列の大部分が、無培養微小生物に由来する、実施形態１０８～１１１のいずれか一つに記載の方法。

１１７． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の実質的に全てが、無培養微小生物に由来する、実施形態１０８～１１１のいずれか一つに記載の方法。

１１８． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せの、ライブラリーに配置されている、実施形態１０８～１１１のいずれか一つに記載の方法。

１１９． 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、ライブラリーにおける配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、無培養微小生物の少なくとも一部が、土壌試料に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミドライブラリーに配置されている、実施形態１０８～１１１のいずれか一つに記載の方法。

１２０． 以下のステップを含む、実施形態１０８～１１９のいずれか一つに記載の方法：

ｄ）１個または複数の宿主細胞を製造するステップであって、各製造された宿主細胞が、ステップ（ｃ）において同定された新たなＭＧＣを含む、ステップ。

１２１． 以下のステップを含む、実施形態１２０に記載の方法：

ｅ）ステップ（ｄ）の製造された宿主細胞を培養するステップ。

１２２． 以下のステップを含む、実施形態１２１に記載の方法：

ｆ）ステップ（ｅ）の培養物由来のライセートおよび／または使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、製造された宿主細胞中に存在する新たなＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ。

１２３． デジタルメタゲノミクスライブラリーが、実施形態３２～６１のいずれか一つに記載の方法に従って産生された、実施形態８５～１２２のいずれか一つに記載の方法。
参照による援用

本明細書に引用されているあらゆる参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開および特許出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。しかし、本明細書に引用されているいかなる参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開および特許出願の言及も、これらが、有効な先行技術を構成する、または世界の任意の国における共通の一般知識の一部を形成することの承認または任意の形態の示唆ではなく、また、そうであるとして解釈されるべきではない。

Claims (222)

1. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーを検索し、目的の天然物を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、
   ａ）デジタルメタゲノミクスライブラリーを、天然物多重遺伝子クラスター特色セットを示すシグナルについて問い合わせるステップと、
   ｂ）前記問い合わせの出力を、複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットとして供給するステップと、
   ｃ）シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定し、１個もしくは複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）特色セットをデジタル処理でアセンブルすること、および／または
   シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定して、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定すること
   により、生物学的関連性を決定し、前記シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットに割り当てるステップと、
   ｄ）デジタル処理でアセンブルされた生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットの閾値パラメーター内に位置している、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子に基づき、前記目的の天然物をコードするＭＧＣを同定するステップと
   を含む、方法。
2. 前記多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂまたは４０ｋｂのＮ５０長を含む長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーである、請求項１に記載の方法。
3. 前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、６００Ｍｂ、７００Ｍｂ、８００Ｍｂ、９００Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１３００Ｍｂまたは１４００Ｍｂのサイズである、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５００ＭＢのサイズである、請求項１に記載の方法。
5. 前記多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１ＴＢのサイズである、請求項１に記載の方法。
6. 前記多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされた配列を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、約５００ＭＢ～約１ＴＢのサイズである、請求項１に記載の方法。
7. 前記多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記アセンブルされた配列の大部分が、無培養微小生物に由来する、請求項１に記載の方法。
8. 前記多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の実質的に全てが、無培養微小生物に由来する、請求項１に記載の方法。
9. 前記多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せの、ライブラリーに配置されている、請求項１に記載の方法。
10. 前記多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記無培養微小生物の少なくとも一部が、土壌試料に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミドライブラリーに配置されている、請求項１に記載の方法。
11. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、ＨＭＭモデルを利用して、目的の遺伝子について前記デジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
12. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、目的の遺伝子のホモログを含有する前記デジタルメタゲノミクスライブラリー内のコンティグを同定するステップを含み、相同性が、前記目的の遺伝子と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％の配列同一性を示す候補配列に基づき決定され、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
13. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、目的の遺伝子のホモログについて前記デジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
14. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、目的の遺伝子（単数または複数）のホモログについて前記デジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ここで前記遺伝子のコードされるタンパク質が、前記目的の天然物を産生することにおける生合成機能を有さず、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記予測モデルが、長・短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくもの等の回帰型ニューラルネットワークを含む、ＨＭＭ、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、双方向性ＬＳＴＭ（長・短期記憶）、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）、ＲＮＮ（回帰型ニューラルネットワーク）、動的ベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 前記予測モデルが、ＨＭＭである、請求項１３または１４に記載の方法。
17. 前記ホモログが、前記ＨＭＭモデルにおいて３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０を超えるビットスコアを示す、請求項１６に記載の方法。
18. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、目的の遺伝子のホモログを含有する前記デジタルメタゲノミクスライブラリー内のコンティグを同定するステップを含み、相同性が、前記目的の遺伝子と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％の配列同一性を示す候補配列に基づき決定され、前記目的の遺伝子のコードされるタンパク質が、前記目的の天然物を産生することにおける生合成機能を有さず、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
19. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、公知の抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログについて前記デジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
20. 前記予測モデルが、長・短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくもの等の回帰型ニューラルネットワークを含む、ＨＭＭ、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、双方向性ＬＳＴＭ（長・短期記憶）、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）、ＲＮＮ（回帰型ニューラルネットワーク）、動的ベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記予測モデルが、ＨＭＭである、請求項１９に記載の方法。
22. 前記ホモログが、前記ＨＭＭモデルにおいて３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０を超えるビットスコアを示す、請求項２１に記載の方法。
23. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、公知の抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログのホモログを含有する前記デジタルメタゲノミクスライブラリー内のコンティグを同定するステップを含み、相同性が、前記公知の抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログと少なくとも９５％、９０％、８５％または８０％の配列同一性を示す候補配列に基づき決定され、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
24. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、コンピューターにより予測または仮定される抵抗性遺伝子またはそのバリアントもしくはホモログについて前記デジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
25. 前記予測モデルが、長・短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくもの等の回帰型ニューラルネットワークを含む、ＨＭＭ、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、双方向性ＬＳＴＭ（長・短期記憶）、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）、ＲＮＮ（回帰型ニューラルネットワーク）、動的ベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記予測モデルが、ＨＭＭである、請求項２４に記載の方法。
27. 前記ホモログが、前記ＨＭＭモデルにおいて３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０を超えるビットスコアを示す、請求項２６に記載の方法。
28. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、コンピューターにより予測または仮定される抵抗性遺伝子のホモログを含有する前記デジタルメタゲノミクスライブラリー内のコンティグを同定するステップを含み、相同性が、前記コンピューターにより予測または仮定される抵抗性遺伝子と少なくとも９５％、９０％、８５％または８０％の配列同一性を示す候補配列に基づき決定され、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
29. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、予測モデルを利用して、単一のコンティグに含有される目的の遺伝子について前記デジタルメタゲノミクスライブラリーを検索するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、複数の遺伝子のコンピューターにより予測される生合成機能性を決定するステップと、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをデジタル処理でアセンブルするステップとを含む、請求項１に記載の方法。
30. 前記予測モデルが、長・短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくもの等の回帰型ニューラルネットワークを含む、ＨＭＭ、ＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）、双方向性ＬＳＴＭ（長・短期記憶）、ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）、ＲＮＮ（回帰型ニューラルネットワーク）、動的ベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
31. 前記予測モデルが、ＨＭＭである、請求項２９に記載の方法。
32. 前記ホモログが、前記ＨＭＭモデルにおいて３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０を超えるビットスコアを示す、請求項３１に記載の方法。
33. 前記シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットが、１個または複数の生合成オペロンを含む多重遺伝子クラスターを含有することがコンピューターにより予測される複数のコンティグのデータベースを含む、請求項１に記載の方法。
34. ステップａ）における前記問い合わせるステップが、１個または複数の生合成オペロンを含む多重遺伝子クラスターを含有する（例えば、ＭＧＣを含む）ことがコンピューターにより予測される全ての配列を同定するステップを含み、ステップｃ）が、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定して、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
35. 前記シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットが、推定上の抵抗性遺伝子を含有する複数の単一のコンティグのデータベースを含む、請求項１に記載の方法。
36. 前記シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットがフィルタリングされて、サイズが約１５ｋｂ未満のコンティグを排除する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットがフィルタリングされて、サイズが約１５ｋｂ未満のコンティグを排除し、また、前記シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セット内の第１のコンティグと約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％超の配列同一性を共有する重複コンティグ結果を排除する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記目的の天然物をコードする前記ＭＧＣがフィルタリングされて、ステップ（ｄ）において同定された第１の同定されたＭＧＣと約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％超の配列同一性を共有する重複ＭＧＣを排除する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
39. ステップｃ）における、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、遺伝的アルゴリズムにより行われる、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. ステップｃ）における、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、遺伝的クラスター予測アルゴリズムにより行われる、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
41. ステップｃ）における、１個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）予測アルゴリズム（例えば、表１に収載されているもの等）により行われる、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
42. １個または複数の生合成オペロンを含む、コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、抗生物質および二次代謝物解析シェル（ＡｎｔｉＳＭＡＳＨ）アルゴリズムおよびパイプライン、またはＤｅｅｐＢＧＣアルゴリズムおよびパイプラインにより行われる、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
43. シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定して、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定するステップが、生合成遺伝子クラスター（ＢＧＣ）予測アルゴリズムを利用して、生合成オペロンを含むコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルした後に行われる、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 生合成遺伝子クラスター（ＢＧＣ）予測アルゴリズムを利用して、生合成オペロンを含むコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットをアセンブルするステップが、シグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットから、少なくとも１個の遺伝子のコンピューターにより予測される生物学的抵抗性遺伝子機能性を決定して、これにより、コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を同定した後に行われ、生合成オペロンを含むコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットは、生合成遺伝子クラスター（ＢＧＣ）予測アルゴリズムを利用してアセンブルされた、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
45. ｅ）前記コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含まない前記デジタルメタゲノミクスライブラリー内の複数のコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットを同定するステップ
    をさらに含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. ｅ）前記コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含まないが、前記コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含むコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットに対して所定の程度の遺伝的関連性を有する、複数のコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットを同定して、これにより、推移的な抵抗性遺伝子天然物多重遺伝子クラスター特色セットを創出するステップ
    をさらに含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
47. ｅ）前記コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含まないが、前記コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子を含む同定されたコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットに対して予測される程度の遺伝的関連性を有する、複数のコンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セットを同定して、これにより、推移的な抵抗性遺伝子天然物多重遺伝子クラスター特色セットを創出するステップと、
    ｆ）前記推移的な抵抗性遺伝子天然物多重遺伝子クラスター特色セットから目的の天然物を同定するステップと
    をさらに含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記コンピューターにより決定された生物学的抵抗性遺伝子が、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロンの調節制御下にある、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. ｅ）宿主細胞を製造するステップであって、前記宿主細胞が、ステップ（ｄ）において同定された前記目的の天然物をコードする前記ＭＧＣ、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ
    を含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
50. ｆ）ステップ（ｅ）の前記製造された宿主細胞を培養するステップ
    を含む、請求項４９に記載の方法。
51. ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、前記製造された宿主細胞中に存在する前記ＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ
    を含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、請求項１１０～１４４のいずれか一項に記載の方法に従って産生された、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. ｆ）宿主細胞を製造するステップであって、前記宿主細胞が、ステップ（ｅ）において同定された前記コンピューターにより決定された天然物多重遺伝子クラスター特色セット、またはそのリファクタリングされたバージョンのうち少なくとも１種を含む、ステップ
    を含む、請求項４５～４６のいずれか一項に記載の方法。
54. ｇ）ステップ（ｆ）の前記製造された宿主細胞を培養するステップ
    を含む、請求項５３に記載の方法。
55. ｈ）ステップ（ｇ）の培養物由来の使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、前記製造された宿主細胞中に存在する前記ＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ
    を含む、請求項５４に記載の方法。
56. 未知の推定上の抵抗性遺伝子を有するまたは抵抗性遺伝子を有さない候補多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）特色セットを同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、
    ａ）デジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測するステップと、
    ｂ）前記予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子をアノテートするステップであって、各多重遺伝子クラスター特色セットが、左および右境界を含み、前記アノテーションステップが、前記多重遺伝子クラスター特色セットの前記境界の１～２個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に位置する遺伝子をアノテートするステップを必要に応じて含む、ステップと、
    ｃ）前記予測される天然物多重遺伝子クラスター特色セットから、アノテートされた遺伝子をフィルタリングして、
    ｉ）予測される生合成機能を有さず、
    ｉｉ）必要に応じて、公知の標的抵抗性遺伝子に対するホモログではない、
    遺伝子のみを残し、これにより、複数のフィルタリングされた目的の遺伝子を産生するステップと、
    ｄ）前記複数のフィルタリングされた目的の遺伝子のうち少なくとも１個を含む天然物多重遺伝子クラスター特色セットを選択し、これにより、推定上の抵抗性遺伝子を有するまたは抵抗性遺伝子を有さない候補ＭＧＣ配列を同定するステップと
    を含む、方法。
57. 予測される抵抗性遺伝子を有する候補多重遺伝子クラスター特色セットを同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、
    ａ）デジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測するステップと、
    ｂ）生合成潜在性スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成潜在性スコアが、遺伝子が生合成酵素であることの計算された尤度に基づく、ステップと、
    ｃ）公知の抵抗性遺伝子スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記公知の抵抗性スコアが、公知の抵抗性遺伝子との遺伝子の共有される配列同一性に基づく、ステップと、
    ｄ）予測される抵抗性遺伝子を含む候補多重遺伝子クラスター特色セットを選択するステップであって、前記予測される抵抗性遺伝子が、予め設定された組合せスコア閾値を示し、前記組合せスコアが、前記生合成潜在性スコアおよび前記公知の抵抗性遺伝子スコアの組合せに基づく、ステップと
    を含む、方法。
58. 生合成オペロンスコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成オペロンスコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロンに対する遺伝子の近接に基づき、前記組合せスコアがまた、前記生合成オペロンスコアに基づく、ステップを含む、請求項５７に記載の方法。
59. コア生合成遺伝子距離スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記コア生合成遺伝子距離スコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内のコア生合成遺伝子に対する遺伝子の近接に基づき、前記組合せスコアがまた、前記コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、請求項５７および５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 必須遺伝子スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記必須遺伝子スコアが、公知の必須遺伝子配列のリストに対する遺伝子の最高の配列同一性に基づき、前記組合せスコアがまた、前記必須遺伝子スコアに基づく、ステップを含む、請求項５７～５８のいずれか一項に記載の方法。
61. 前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の前記予測される抵抗性遺伝子が、生合成酵素と９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％未満の配列同一性を共有する、請求項５７～６０のいずれか一項に記載の方法。
62. 生合成酵素が、前記予測される抵抗性遺伝子を含有する多重遺伝子クラスター特色セットによってコードされる前記天然物のための生合成酵素である、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 生合成酵素が、多重遺伝子クラスター特色セット（例えば、ＭｉＢｉｇ）によってコードされる天然物に関連する生合成酵素のホモログである、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の前記予測される抵抗性遺伝子が、ａｎｔｉｓｍａｓｈによって評価される場合、ｍｉＢＩＧにおける８、６、４または２未満のＢＬＡＳＴヒットを返す、請求項５７～６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の前記予測される抵抗性遺伝子が、組合せスコアを有し、それぞれ公知の生合成酵素または公知の抵抗性遺伝子と比較した場合、遺伝子が生合成酵素であることの前記計算された尤度が低く、公知の抵抗性遺伝子との前記共有される配列同一性が低い、請求項５７～６４のいずれか一項に記載の方法。
66. 前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の前記予測される抵抗性遺伝子が、前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロン内にまたはそれに直接隣接して位置する（すなわち、その間に他のＯＲＦがない）、請求項５７～６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の前記予測される抵抗性遺伝子が、前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セットに含有される生合成オペロンの内部にまたは生合成オペロンの５００ｂｐ以内に位置する、請求項５７～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の前記予測される抵抗性遺伝子が、コア生合成酵素の１ｋＢ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂまたは５ｋｂ以内に位置する、請求項５７～６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の前記予測される抵抗性遺伝子が、必須遺伝子と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％の配列同一性を共有する、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の方法。
70. 輸送遺伝子潜在性スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記輸送遺伝子潜在性スコアが、輸送関連遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、前記組合せスコアがまた、前記コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、請求項５７～６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 調節遺伝子潜在性スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記調節遺伝子潜在性スコアが、調節遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、前記組合せスコアがまた、前記コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、請求項５７～７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 抵抗性機構スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、所望の抵抗性機構とは異なる抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、前記組合せスコアがまた、前記抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む、請求項５７～７１のいずれか一項に記載の方法。
73. 抵抗性機構スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、前記所望の抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、前記組合せスコアがまた、前記抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む、請求項５７～７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記所望の抵抗性機構が、標的バリアントに基づく抵抗性である、請求項５７～７３に記載の方法。
75. 多重遺伝子クラスターによってコードされる天然物のための抵抗性遺伝子を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、
    ａ）デジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスターをコンピューターにより予測するステップと、
    ｂ）生合成潜在性スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成潜在性スコアが、遺伝子が生合成酵素であることの計算された尤度に基づく、ステップと、
    ｃ）公知の抵抗性遺伝子スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記公知の抵抗性スコアが、公知の抵抗性遺伝子との遺伝子の共有される配列同一性に基づく、ステップと、
    ｄ）予め設定された組合せスコア閾値を示す予測される抵抗性遺伝子を選択するステップであって、前記組合せスコアが、前記生合成潜在性スコアおよび前記公知の抵抗性遺伝子スコアの組合せに基づく、ステップと
    を含む、方法。
76. 生合成オペロンスコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記生合成オペロンスコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロンに対する遺伝子の近接に基づき、前記組合せスコアがまた、前記生合成オペロンスコアに基づく、ステップを含む、請求項７５に記載の方法。
77. コア生合成遺伝子距離スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記コア生合成遺伝子距離スコアが、その多重遺伝子クラスター特色セット内のコア生合成遺伝子に対する遺伝子の近接に基づき、前記組合せスコアがまた、前記コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、請求項７５および７６のいずれか一項に記載の方法。
78. 必須遺伝子スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記必須遺伝子スコアが、公知の必須遺伝子配列のリストに対する遺伝子の最高の配列同一性に基づき、前記組合せスコアがまた、前記必須遺伝子スコアに基づく、ステップを含む、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の方法。
79. 前記予測される抵抗性遺伝子が、公知の抵抗性遺伝子と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％未満の配列同一性を共有する、請求項７５～７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記予測される抵抗性遺伝子が、生合成酵素と９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％未満の配列同一性を共有する、請求項７５～７９のいずれか一項に記載の方法。
81. 生合成酵素が、前記予測される抵抗性遺伝子を含有する多重遺伝子クラスター特色セットによってコードされる前記天然物のための生合成酵素である、請求項７５～８０のいずれか一項に記載の方法。
82. 生合成酵素が、多重遺伝子クラスター特色セット（例えば、ＭｉＢｉｇ）によってコードされる天然物に関連する生合成酵素である、請求項７５～８１のいずれか一項に記載の方法。
83. 前記予測される抵抗性遺伝子が、ａｎｔｉｓｍａｓｈによって評価される場合、ｍｉＢＩＧにおける８、６、４または２未満のＢＬＡＳＴヒットを返す、請求項７５～８２のいずれか一項に記載の方法。
84. 前記予測される抵抗性遺伝子が、組合せスコアを有し、遺伝子が生合成酵素であることの前記計算された尤度が低く、公知の抵抗性遺伝子との前記共有される配列同一性が低い、請求項７５～８３のいずれか一項に記載の方法。
85. 前記予測される抵抗性遺伝子が、前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の生合成オペロン内にまたはそれに直接隣接して位置する（すなわち、その間に他のＯＲＦがない）、請求項７５～８４のいずれか一項に記載の方法。
86. 前記予測される抵抗性遺伝子が、生合成オペロンの内部にまたは生合成オペロンの５００ｂｐ以内に位置する、請求項７５～８５のいずれか一項に記載の方法。
87. 前記予測される抵抗性遺伝子が、コア生合成酵素の１ｋＢ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂまたは５ｋｂ以内に位置する、請求項７５～８６のいずれか一項に記載の方法。
88. 前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット内の前記予測される抵抗性遺伝子が、必須遺伝子と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％または７０％の配列同一性を共有する、請求項７５～８７のいずれか一項に記載の方法。
89. 輸送遺伝子潜在性スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記輸送遺伝子潜在性スコアが、輸送関連遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、前記組合せスコアがまた、前記コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、請求項７５～８８のいずれか一項に記載の方法。
90. 調節遺伝子潜在性スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記調節遺伝子潜在性スコアが、調節遺伝子である遺伝子の尤度（例えば、配列同一性により）に基づき、前記組合せスコアがまた、前記コア生合成遺伝子距離スコアに基づく、ステップを含む、請求項７５～８９のいずれか一項に記載の方法。
91. 抵抗性機構スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、所望の抵抗性機構とは異なる抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、前記組合せスコアがまた、前記抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む、請求項７５～９０のいずれか一項に記載の方法。
92. 抵抗性機構スコアを、前記多重遺伝子クラスター特色セット内の遺伝子に割り当てるステップであって、前記抵抗性機構スコアが、前記所望の抵抗性機構を有する抵抗性遺伝子に対する遺伝子の類似性に基づき割り当てられ、前記組合せスコアがまた、前記抵抗性機構スコアに基づく、ステップを含む、請求項７５～９０のいずれか一項に記載の方法。
93. 前記所望の抵抗性機構が、標的バリアントに基づく抵抗性である、請求項９１または９２に記載の方法。
94. 前記デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂまたは４０ｋｂのＮ５０長を含む長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーである、請求項５６～９３のいずれか一項に記載の方法。
95. 前記デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、６００Ｍｂ、７００Ｍｂ、８００Ｍｂ、９００Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１３００Ｍｂまたは１４００Ｍｂのサイズである、請求項５６～９４のいずれか一項に記載の方法。
96. 前記デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５００ＭＢのサイズである、請求項５６～９３のいずれか一項に記載の方法。
97. 前記デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１ＴＢのサイズである、請求項５６～９３のいずれか一項に記載の方法。
98. 前記デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされた配列を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、約５００ＭＢ～約１ＴＢのサイズである、請求項５６～９３のいずれか一項に記載の方法。
99. 前記デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記アセンブルされたコンティグ配列、前記ライブラリーにおける前記配列の大部分が、無培養微小生物に由来する、請求項５６～９３のいずれか一項に記載の方法。
100. 前記デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の実質的に全てが、無培養微小生物に由来する、請求項５６～９３のいずれか一項に記載の方法。
101. 前記デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せの、ライブラリーに配置されている、請求項５６～９３のいずれか一項に記載の方法。
102. 前記デジタルメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記無培養微小生物の少なくとも一部が、土壌試料に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミドライブラリーに配置されている、請求項５６～９３のいずれか一項に記載の方法。
103. ステップ（ｃ）が、ｉｉｉ）予測される生合成機能を有する前記多重遺伝子クラスター特色セット内の別の遺伝子と同時調節される遺伝子のみを残すように、アノテートされた遺伝子をさらにフィルタリングする、請求項５６～１０２のいずれか一項に記載の方法。
104. ｅ）宿主細胞を製造するステップであって、前記宿主細胞が、ステップ（ｄ）の前記候補ＭＧＣ配列、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ
     を含む、請求項５６～１０３のいずれか一項に記載の方法。
105. ｅ）宿主細胞を製造するステップであって、前記宿主細胞が、ステップ（ｄ）の前記選択された候補多重遺伝子クラスター特色セット、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ
     を含む、請求項５６～１０３のいずれか一項に記載の方法。
106. ｅ）宿主細胞を製造するステップであって、前記宿主細胞が、ステップ（ｄ）の前記選択された予測される抵抗性遺伝子を含む前記多重遺伝子クラスター特色セット、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ
     を含む、請求項５６～１０３のいずれか一項に記載の方法。
107. ｆ）ステップ（ｅ）の前記製造された宿主細胞を培養するステップ
     を含む、請求項１０４～１０６に記載の方法。
108. ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、前記製造された宿主細胞中に存在する前記候補ＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ
     を含む、請求項１０７に記載の方法。
109. 前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、請求項１１０～１４４のいずれか一項に記載の方法に従って産生された、請求項５６～１０８のいずれか一項に記載の方法。
110. 長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーをアセンブルするための方法であって、
     ａ）特有の全ゲノムを含む配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料を提供するステップと、
     ｂ）ｉ）前記メタゲノムＤＮＡ試料から複数のベクターへとＤＮＡ断片をクローニングして、メタゲノムベクター断片ライブラリーを創出すること、
     ｉｉ）前記メタゲノムベクター断片ライブラリーから、それぞれ約１，０００～約３０，０００個のプールされたベクターを含む複数の別々のミニメタゲノムサブユニットへと前記ベクターをプールして、前記複数のミニメタゲノムサブユニット内に、前記配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料由来のＤＮＡを含むミニメタゲノムライブラリーを創出することによって、
     前記メタゲノムＤＮＡ試料のゲノム複雑性を低下させるステップと、
     ｃ）前記ミニメタゲノムライブラリーの前記複数の別々のミニメタゲノムサブユニットに存在する前記プールされたベクターに含有される前記メタゲノムＤＮＡのプール内配列決定およびアセンブリーを行って、配列決定され、かつアセンブルされたＤＮＡコンティグを含む第１のパスの長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーを創出するステップであって、前記第１のパスの長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂのＮ５０長を有する、ステップと
     を含む、方法。
111. ｄ）前記第１のパスの長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリー由来の複数の配列決定され、かつアセンブルされたＤＮＡコンティグをさらにアセンブルすることによって、プール間ＤＮＡコンティグアセンブリーを行って、第２のパスの長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーを創出するステップ
     を含む、請求項１１０に記載の方法。
112. 前記配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料が、少なくとも約５０、１００、５００、１０００または１００００種の特有の全ゲノムを含む、請求項１１０または１１１に記載の方法。
113. 前記配列決定されておらず、かつアセンブルされていないメタゲノムＤＮＡ試料における前記特有の全ゲノムの平均サイズが、少なくとも約１ＭＢ、２ＭＢ、３ＭＢ、４ＭＢもしくは５ＭＢ、または１～５ＭＢの間である、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。
114. 前記長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂまたは１００ｋｂの長さを有する複数の配列決定され、かつアセンブルされたＤＮＡコンティグを含む、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。
115. 前記長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂまたは１００ｋｂのＮ５０長を有する、請求項１１０～１１４のいずれか一項に記載の方法。
116. 前記ミニメタゲノムサブユニット由来の前記ＤＮＡを配置するステップを含む、請求項１１０～１１５のいずれか一項に記載の方法。
117. 長いアセンブリーＤＮＡコンティグ長メタゲノムライブラリーの物理的コピーを配置するステップを含む、請求項１１０～１１５のいずれか一項に記載の方法。
118. 細菌細胞中にまたはＤＮＡ形態で、中間のＤＮＡコンティグ長ミニメタゲノムライブラリーまたは長いＤＮＡコンティグ長メタゲノムライブラリーの物理的コピーを配置するステップを含む、請求項１１０～１１５のいずれか一項に記載の方法。
119. 前記複数の別々のミニメタゲノムサブユニットを現実の座標空間に配置するステップと、識別子を各サブユニットに割り当てるステップとを含む、請求項１１０～１１５のいずれか一項に記載の方法。
120. 前記複数の別々のミニメタゲノムサブユニットをマルチウェルマイクロタイタープレートに配置するステップを含む、請求項１１０～１１５のいずれか一項に記載の方法。
121. 前記複数の別々のミニメタゲノムサブユニットを９６ウェルマイクロタイタープレートに配置するステップを含む、請求項１１０～１１５のいずれか一項に記載の方法。
122. 前記ベクターが、プラスミドを含む、請求項１１０～１２１のいずれか一項に記載の方法。
123. 前記ベクターが、コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せを含む、請求項１１０～１２１のいずれか一項に記載の方法。
124. 前記ベクターが、コスミドを含む、請求項１１０～１２１のいずれか一項に記載の方法。
125. ステップ（ｂ）における前記メタゲノムベクター断片ライブラリーが、少なくとも約１Ｍまたは１０Ｍのベクターを含む、請求項１１０～１２４のいずれか一項に記載の方法。
126. 前記ベクターが、コスミドを含み、ステップ（ｂ）における前記メタゲノムベクター断片ライブラリーが、少なくとも約１０Ｍのコスミドを含む、請求項１１０～１２４のいずれか一項に記載の方法。
127. 前記ベクターが、コスミドを含み、ステップ（ｂ）における前記メタゲノムベクター断片ライブラリーが、少なくとも約２０Ｍのコスミドを含む、請求項１１０～１２４のいずれか一項に記載の方法。
128. ステップ（ｂ）において、前記メタゲノムライブラリーから複数のベクターへと、約２００ｋｂ未満のＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、請求項１１０～１２７のいずれか一項に記載の方法。
129. ステップ（ｂ）において、前記メタゲノムＤＮＡ試料から複数のベクターへと、約１００ｋｂ未満のＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、請求項１１０～１２７のいずれか一項に記載の方法。
130. ステップ（ｂ）において、前記メタゲノムＤＮＡ試料から複数のベクターへと、約５０ｋｂ未満のＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、請求項１１０～１２７のいずれか一項に記載の方法。
131. ステップ（ｂ）において、前記メタゲノムＤＮＡ試料から複数のベクターへと、約２０ｋｂ～約５０ｋｂのＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、請求項１１０～１２７のいずれか一項に記載の方法。
132. ステップ（ｂ）において、前記メタゲノムＤＮＡ試料から複数のコスミドへと、約３０ｋｂ～約４５ｋｂのＤＮＡ断片をクローニングするステップを含む、請求項１１０～１２７のいずれか一項に記載の方法。
133. ステップ（ｂ）における前記別々のミニメタゲノムサブユニットが、それぞれ約３，０００～約１５，０００個のプールされたベクターを含む、請求項１１０～１３２のいずれか一項に記載の方法。
134. ステップ（ｂ）における前記別々のミニメタゲノムサブユニットが、それぞれ約５，０００～約１２，０００個のプールされたコスミドベクターを含む、請求項１１０～１３２のいずれか一項に記載の方法。
135. 前記第２のパスの長いアセンブリーＤＮＡコンティグメタゲノムライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂまたは３０ｋｂのＮ５０長を有する、請求項１１０～１３４のいずれか一項に記載の方法。
136. ステップ（ｃ）が、前記複数の別々のミニメタゲノムサブユニット由来の個々の別々のミニメタゲノムサブユニットに存在する前記プールされたベクターに含有される前記ＤＮＡコンティグの全てを同時にアセンブルするステップを含む、請求項１１０～１３５のいずれか一項に記載の方法。
137. ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、単一分子配列決定を利用して行われる、請求項１１０～１３６のいずれか一項に記載の方法。
138. ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、合成による配列決定（ＳＢＳ）を利用して行われる、請求項１１０～１３６のいずれか一項に記載の方法。
139. ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定を利用して行われる、請求項１１０～１３６のいずれか一項に記載の方法。
140. ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、ナノポア配列決定を利用して行われる、請求項１１０～１３６のいずれか一項に記載の方法。
141. ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、合成長リード配列決定を利用して行われる、請求項１１０～１３６のいずれか一項に記載の方法。
142. 前記合成長リードが、近接ライゲーション戦略および／または光学マッピングに基づく、請求項１４１に記載の方法。
143. ステップ（ｃ）において、プール内配列決定が、Ｈｉ－Ｃ配列決定である、請求項１１０～１３６のいずれか一項に記載の方法。
144. ステップｂ）における前記別々のミニメタゲノムサブユニットが、それぞれ約５，０００～約１２，０００個のプールされたコスミドベクターを含み、ステップ（ｃ）が、前記複数の別々のミニメタゲノムサブユニット由来の個々の別々のミニメタゲノムサブユニット中に存在する前記配列決定されたＤＮＡの全てを同時にアセンブルするステップを含む、請求項１１０～１４３のいずれか一項に記載の方法。
145. 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、
     ａ）前記標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される複数の酵素を提供し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、
     ｂ）前記アナログ化酵素パネル由来の個々の酵素を、前記標的天然物または前記標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、
     ｃ）ステップ（ｂ）の前記反応混合物のうち少なくとも１種を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、
     ｄ）前記アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｃ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された酵素が、前記標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物をアナログ化する、ステップと
     を含む、方法。
146. ステップ（ａ）の前記酵素が、前記酵素を異種的に発現する微生物株由来のライセートの形態で提供される、請求項１４５に記載の方法。
147. 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、
     ａ）前記標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれ発現する、複数の微生物株を提供し、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、
     ｂ）微生物株の前記アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を、前記標的天然物または前記標的天然物の前駆体と接触させ、これにより、混合物を創出するステップと、
     ｃ）ステップ（ｂ）の前記混合物を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、
     ｄ）微生物株の前記アナログ化酵素パネルライブラリーから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｃ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された微生物株が、前記標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物をアナログ化し、前記選択された微生物株によって発現される前記酵素が、選択された酵素である、ステップと
     を含む、方法。
148. 前記選択された酵素を発現するように第１の基礎微生物株のゲノムを撹乱するステップであって、前記第１の基礎微生物株が、前記標的天然物を合成することができる、ステップをさらに含む、請求項１４５～１４７のいずれか一項に記載の方法。
149. 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、
     ａ）前記標的天然物の第１のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれコードする、複数の遺伝的配列を提供するステップと、
     ｂ）ステップ（ａ）の前記複数の遺伝的配列のうち１種または複数によってコードされる酵素をそれぞれ発現するように、第１の基礎微生物株の１個または複数の細胞のゲノムを撹乱するステップであって、前記第１の基礎微生物株が、前記標的天然物を合成することができ、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、
     ｃ）微生物株の前記アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、
     ｄ）ステップ（ｃ）の培養物由来の使用済み培地を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、
     ｅ）微生物株の前記アナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｄ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された微生物株が、前記標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物をアナログ化する、ステップと
     を含む、方法。
150. ｆ）前記標的天然物またはステップ（ｅ）の前記所望のアナログの第２のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素をそれぞれコードする第２の複数の遺伝的配列を提供するステップと、
     ｇ）ステップ（ｆ）の前記第２の複数の遺伝的配列のうち１種または複数によってコードされる酵素をそれぞれ発現するように、第２の基礎微生物株の１個または複数の細胞のゲノムを撹乱するステップであって、前記第２の基礎微生物株が、ステップ（ｅ）の前記所望のアナログを合成することができ、これにより、微生物株の第２のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、
     ｈ）微生物株の前記第２のアナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、
     ｉ）ステップ（ｈ）の培養物由来の使用済み培地を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、
     ｊ）微生物株の前記第２のアナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｉ）の前記解析によって決定される通り、本ステップの前記選択された微生物株が、前記標的天然物の第２の所望のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物をアナログ化する、ステップと
     をさらに含む、請求項１４９に記載の方法。
151. 前記標的天然物が、前記第１または第２の基礎微生物株における生合成経路によって産生され、前記生合成経路が、複数の生合成遺伝子を含み、ステップ（ｂ）および／または（ｇ）が、前記生合成遺伝子のうち１種または複数を、それぞれステップ（ａ）または（ｆ）の前記第１または第２の複数の遺伝的配列のうち１種または複数に置き換えるステップを含む、請求項１４９または１５０に記載の方法。
152. 前記酵素のうち少なくとも１種が、配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に由来し、遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットを投入された機械学習モデルによって、前記ある型の反応を触媒することが予測されており、
     ｉ）前記遺伝的配列入力変数が、前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒する酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、
     ｉｉ）前記表現型性能出力変数が、前記１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、
     請求項１４５～１５１のいずれか一項に記載の方法。
153. 前記訓練データセットが、
     ｉ）前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒することが経験的に示された、または
     ｉｉ）高度の信頼度で、他の機構により、前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒することが予測された、
     のいずれかであるタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１５２に記載の方法。
154. 前記酵素が、雑多な酵素である、請求項１４５～１５３のいずれか一項に記載の方法。
155. 前記選択された酵素が、１種より多い基質を改変することができる、請求項１４５～１５３のいずれか一項に記載の方法。
156. 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、
     ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
     ｉ）前記遺伝的配列入力変数が、前記標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、
     ｉｉ）前記表現型性能出力変数が、前記１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、
     ｂ）前記訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、
     ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、前記第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、前記メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、前記第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒すると予測される、ステップと、
     ｄ）前記第１の信頼度スコアの第２の信頼度スコアに対する比が、予め選択された閾値から外れる場合、前記候補配列のプールから、前記第２の信頼度スコアによる第２の予測的機械学習モデルによって、異なる機能を果たすことが予測されるあらゆる配列を除去し、これにより、候補配列のフィルタリングされたプールを産生するステップと、
     ｅ）ステップ（ｄ）由来の前記候補配列のフィルタリングされたプール由来の配列をそれぞれ発現するように１個または複数の微生物細胞を製造するステップと、
     ｆ）ステップ（ｅ）の前記製造された宿主細胞を培養し、培養された細胞を溶解し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、
     ｇ）前記アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の酵素を、前記標的天然物または前記標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、
     ｈ）ステップ（ｇ）の前記反応混合物のうち少なくとも１種を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、
     ｉ）前記アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｈ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された酵素が、前記標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物をアナログ化する、ステップと
     を含む、方法。
157. 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、
     ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
     ｉ）前記遺伝的配列入力変数が、前記標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、
     ｉｉ）前記表現型性能出力変数が、前記１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、
     ｂ）前記訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、
     ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、前記第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、前記メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、前記第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒すると予測され、これにより、候補配列のプールを生成する、ステップと、
     ｄ）ステップ（ｃ）由来の前記候補配列のプール由来の配列をそれぞれ発現するように１個または複数の微生物細胞を製造するステップと、
     ｅ）ステップ（ｄ）の前記製造された宿主細胞を培養し、培養された細胞を溶解し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップと、
     ｆ）前記アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の酵素を、前記標的天然物または前記標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップと、
     ｇ）ステップ（ｆ）の前記反応混合物のうち少なくとも１種を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、
     ｈ）前記アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された酵素が、前記標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物をアナログ化する、ステップと
     を含む、方法。
158. 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、
     ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
     ｉ）前記遺伝的配列入力変数が、前記標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、
     ｉｉ）前記表現型性能出力変数が、前記１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、
     ｂ）前記訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、
     ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、前記第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、前記メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、前記第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒すると予測される、ステップと、
     ｄ）前記第１の信頼度スコアの第２の信頼度スコアに対する比が、予め選択された閾値から外れる場合、前記候補配列のプールから、前記第２の信頼度スコアによる第２の予測的機械学習モデルによって、異なる機能を果たすことが予測されるあらゆる配列を除去し、これにより、候補配列のフィルタリングされたプールを産生するステップと、
     ｅ）ステップ（ｄ）由来の前記候補配列のフィルタリングされたプール由来の配列をそれぞれ発現するように、基礎微生物株の１個または複数の微生物細胞のゲノムを撹乱するステップであって、前記基礎微生物株が、前記標的天然物を合成することができ、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、
     ｆ）微生物株の前記アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、
     ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培地を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、
     ｈ）微生物株の前記アナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された微生物株が、前記標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物をアナログ化する、ステップと
     を含む、方法。
159. 標的天然物の生合成によるアナログ化のための方法であって、
     ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
     ｉ）前記遺伝的配列入力変数が、前記標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、
     ｉｉ）前記表現型性能出力変数が、前記１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、
     ｂ）前記訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、
     ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、前記第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、前記メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、前記第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒すると予測され、これにより、候補配列のプールを産生する、ステップと、
     ｄ）ステップ（ｃ）由来の前記候補配列のプール由来の配列をそれぞれ発現するように、基礎微生物株の１個または複数の微生物細胞のゲノムを撹乱するステップであって、前記基礎微生物株が、前記標的天然物を合成することができ、これにより、微生物株のアナログ化酵素パネルライブラリーを創出する、ステップと、
     ｅ）微生物株の前記アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の微生物株を培養するステップと、
     ｆ）ステップ（ｅ）の培養物由来の使用済み培地を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、
     ｇ）微生物株の前記アナログ化酵素パネルから微生物株を選択するステップであって、ステップ（ｆ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された微生物株が、前記標的天然物の所望のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物をアナログ化する、ステップと
     を含む、方法。
160. 天然物をアナログ化することができる酵素を同定するための方法であって、
     ａ）遺伝的配列入力変数および表現型性能出力変数を含む訓練データセットにアクセスするステップであって、
     ｉ）前記遺伝的配列入力変数が、前記標的天然物のアナログ化のためのある型の反応を触媒することが公知であるかまたは予測される酵素の１種または複数のアミノ酸配列を含み、
     ｉｉ）前記表現型性能出力変数が、前記１種または複数のアミノ酸配列に関連する１種または複数の表現型性能特色を含む、ステップと、
     ｂ）前記訓練データセットを投入された第１の予測的機械学習モデルを開発するステップと、
     ｃ）コンピュータプロセッサーを使用して、前記第１の予測的機械学習モデルを、１種または複数の生物由来のアミノ酸配列を含有する配列ライブラリー（例えば、メタゲノムライブラリー）に適用して、前記メタゲノムライブラリー内の候補配列のプールを同定するステップであって、前記第１の予測的機械学習モデルによって、前記候補配列が、それぞれの第１の信頼度スコアにより、前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒すると予測され、これにより、天然物をアナログ化することができると予測される候補配列のプールを産生する、ステップと
     を含む、方法。
161. 多重遺伝子クラスターを含有することがコンピューターにより予測される前記配列ライブラリー内の全ての配列を同定するステップと、予測される多重遺伝子クラスター内に位置していない配列を、ステップ（ｃ）の前記候補配列のプールから除去するステップとを含む、請求項１５６～１６０のいずれか一項に記載の方法。
162. ｄ）前記候補配列のプール由来の配列をそれぞれ発現するように、１個または複数の微生物細胞を製造するステップ
     を含む、請求項１６０または１６１に記載の方法。
163. ｅ）ステップ（ｄ）の前記製造された宿主細胞を培養し、培養された細胞を溶解し、これにより、アナログ化酵素パネルライブラリーを創出するステップ
     を含む、請求項１６２に記載の方法。
164. ｆ）前記アナログ化酵素パネルライブラリー由来の個々の酵素を、前記標的天然物または前記標的天然物の前駆体と共にインキュベートし、これにより、反応混合物を産生するステップ
     を含む、請求項１６３に記載の方法。
165. ｇ）ステップ（ｆ）の前記反応混合物のうち少なくとも１種を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップ
     を含む、請求項１６４に記載の方法。
166. ｈ）前記アナログ化酵素パネルから酵素を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された酵素が、前記標的天然物の所望のアナログを産生する、ステップ
     を含む、請求項１６５に記載の方法。
167. ステップ（ａ）の前記訓練データセットに、
     ｉ）ステップ（ｅ）の前記微生物細胞において発現された前記配列のうち少なくとも１種、および
     ｉｉ）ステップ（ｈ）において測定される通り、（ｉ）の前記少なくとも１種の配列に対応する表現型性能測定値
     を加え、これにより、アップデートされた訓練データセットを創出するステップをさらに含む、請求項１５６および１６６のいずれか一項に記載の方法。
168. ステップ（ａ）の前記訓練データセットに、
     ｉ）ステップ（ｄ／）の微生物株の前記アナログ化酵素パネルライブラリーにおいて発現された前記配列のうち少なくとも１種、および
     ｉｉ）ステップ（ｇ）において測定される通り、（ｉ）の前記少なくとも１種の配列に対応する表現型性能測定値
     を加え、これにより、アップデートされた訓練データセットを創出するステップをさらに含む、請求項１５７～１５８のいずれか一項に記載の方法。
169. 前記表現型性能測定値が、存在した前記標的天然物の前記アナログの量を示す、請求項１６７または１６８に記載の方法。
170. 最後から２番目のステップが、以前のステップの全てを、前記アップデートされた訓練データセットにより少なくとも１回反復するステップである、請求項１６７または１６８に記載の方法。
171. 前記訓練データセットが、
     ｉ）前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒することが経験的に示された、または
     ｉｉ）高度の信頼度で、他の機構により、前記標的天然物のアナログ化のための前記ある型の反応を触媒することが予測された、
     のいずれかであるタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１５６～１７０のいずれか一項に記載の方法。
172. 前記予測的機械学習モデルが、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）である、請求項１５６～１７１のいずれか一項に記載の方法。
173. 標的天然物のアナログを産生するための方法であって、
     ａ）前記標的天然物を産生することが公知である第１の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、
     ｂ）前記第１の多重遺伝子クラスターに基づき予測モデルを開発するステップと、
     ｃ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、デジタルメタゲノミクスライブラリーを新たな多重遺伝子クラスターについて問い合わせるステップであって、前記新たな多重遺伝子クラスターが、前記予測モデルによって、前記標的天然物または前記標的天然物のバリアントを産生することが予測され、これにより、候補多重遺伝子クラスターのプールを産生する、ステップと、
     ｄ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、アノテーションエンジンにより、ステップ（ｃ）の前記候補多重遺伝子クラスターのプールの前記新たな多重遺伝子クラスターの１個または複数内の生合成酵素をコードする個々の遺伝子を同定し、これにより、前記新たな多重遺伝子クラスターから、生合成遺伝子を含むアナログ化酵素パネルライブラリーを産生するステップと、
     ｅ）前記アナログ化酵素パネルライブラリー由来の遺伝子を発現するように基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱するステップであって、前記基礎微生物宿主細胞が、前記第１の多重遺伝子クラスターを含む、ステップと、
     ｆ）ステップ（ｅ）において製造された前記微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、
     ｇ）ステップ（ｆ）の培養物由来の使用済み培地を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、
     ｈ）ステップ（ｆ）において培養された前記微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｇ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された微生物宿主細胞が、前記標的天然物のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物のアナログを産生する、ステップと
     を含む、方法。
174. 標的天然物のアナログを産生するための方法であって、
     ａ）前記標的天然物を産生することが公知である第１の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、
     ｂ）前記第１の多重遺伝子クラスターに基づき予測モデルを開発するステップと、
     ｃ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、デジタルメタゲノミクスライブラリーを新たな多重遺伝子クラスターについて問い合わせるステップであって、前記新たな多重遺伝子クラスターが、前記予測モデルによって、前記標的天然物または前記標的天然物のバリアントを産生することが予測され、これにより、候補多重遺伝子クラスターのプールを産生する、ステップと、
     ｄ）前記候補多重遺伝子クラスターのプール由来の少なくとも１種の多重遺伝子クラスターをそれぞれ発現するように、１個または複数の微生物宿主細胞を製造するステップと、
     ｅ）ステップ（ｄ）において製造された前記微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、
     ｆ）ステップ（ｅ）の培養物由来の使用済み培地を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、
     ｇ）ステップ（ｅ）において培養された前記微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｆ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された微生物宿主細胞が、前記標的天然物のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物のアナログを産生する、ステップと
     を含む、方法。
175. ｈ）ステップ（ｇ）の前記選択された微生物宿主細胞内に含まれる前記候補多重遺伝子クラスター由来の遺伝子を発現するように基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱するステップであって、前記基礎微生物宿主細胞が、前記第１の多重遺伝子クラスターを含み、これにより、改変された基礎宿主細胞を産生する、ステップ
     をさらに含む、請求項１７４に記載の方法。
176. ステップ（ｈ）が、前記第１の多重遺伝子クラスター由来の本来の遺伝子を、前記候補多重遺伝子クラスター由来の対応する遺伝子に置き換えるステップを含む、請求項１７５に記載の方法。
177. ステップ（ｈ）が、前記第１の多重遺伝子クラスター由来の本来の遺伝子をノックアウトするステップを含む、請求項１７５に記載の方法。
178. 標的天然物のアナログを産生するための方法であって、
     ａ）前記標的天然物を産生することが公知の多重遺伝子クラスターを含む基礎微生物宿主細胞を提供するステップと、
     ｂ）前記多重遺伝子クラスター内の１個または複数の遺伝子の発現を変異させるまたはノックアウトするように、前記基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱し、これにより、変異された微生物宿主細胞のライブラリーを創出するステップと、
     ｃ）前記変異された微生物宿主細胞のライブラリー由来の微生物宿主細胞を培養するステップと、
     ｄ）ステップ（ｃ）の培養物由来の使用済み培地を、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログの存在について解析するステップと、
     ｅ）ステップ（ｃ）において培養された前記微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｄ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された微生物宿主細胞が、前記標的天然物のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物のアナログを産生する、ステップと
     を含む、方法。
179. 標的天然物のアナログを産生するための方法であって、
     ａ）前記標的天然物または関連天然物を産生することが公知のまたは予測される複数の多重遺伝子クラスターを提供するステップと、
     ｂ）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、アノテーションエンジンにより、ステップ（ａ）の前記複数の多重遺伝子クラスター内の生合成酵素をコードする個々の遺伝子を同定し、これにより、前記複数の多重遺伝子クラスターから生合成遺伝子を含むアナログ化酵素パネルライブラリーを産生するステップと、
     ｃ）前記アナログ化酵素パネルライブラリー由来の遺伝子を発現するように基礎微生物宿主細胞のゲノムを撹乱するステップであって、前記基礎微生物宿主細胞が、前記標的天然物を産生することができる第１の多重遺伝子クラスターを含み、これにより、微生物細胞を製造する、ステップと、
     ｄ）ステップ（ｃ）において製造された前記微生物宿主細胞のうち少なくとも１個を培養するステップと、
     ｅ）ステップ（ｄ）の培養物由来の使用済み培地またはライセートを、前記標的天然物および／または前記標的天然物のアナログについて解析するステップと、
     ｆ）ステップ（ｄ）において培養された前記微生物宿主細胞から微生物宿主細胞を選択するステップであって、ステップ（ｅ）の前記解析によって決定される通り、前記選択された微生物宿主細胞が、前記標的天然物のアナログを産生し、これにより、前記標的天然物のアナログを産生する、ステップと
     を含む、方法。
180. 前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、請求項２２０～１４４のいずれか一項に記載の方法に従って産生された、請求項１４５～１７９のいずれか一項に記載の方法。
181. 公知の抵抗性遺伝子をコードしない候補多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、
     ａ）公知のまたは予測されるＭＧＣの配列を提供するステップと、
     ｂ）長いアセンブリーデジタルメタゲノムライブラリー内の天然物多重遺伝子クラスター特色セットをコンピューターにより予測し、複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットとして前記予測の出力を供給するステップと、
     ｃ）ステップ（ｂ）の前記複数のシグナル関連の多重遺伝子クラスターデジタル特色セットの中から候補ＭＧＣを選択するステップであって、前記候補ＭＧＣが、
     ｉ）前記公知のまたは予測されるＭＧＣおよび前記候補ＭＧＣ内の１、２、３、４、５、６、７または８種の生合成酵素の配列相同性、
     ｉｉ）前記公知のまたは予測されるＭＧＣおよび前記候補ＭＧＣ内の同数の各型の生合成モジュール、ならびに
     ｉｉｉ）前記公知の／予測されるＭＧＣおよび前記候補ＭＧＣによって産生される天然物の予測される化学構造の類似性
     からなる群より選択される少なくとも１種の類似性因子を含み、これにより、公知の抵抗性遺伝子をコードしない前記候補ＭＧＣを同定する、ステップと
     を含む、方法。
182. 前記公知のまたは予測されるＭＧＣが、推定上の抵抗性遺伝子を含む、請求項１８１に記載の方法。
183. ステップ（ｃ）（ｉ）の前記類似性因子が、公知のまたは予測されるＭＧＣの生合成酵素のうち少なくとも１種との、前記候補ＭＧＣにおける生合成酵素の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の配列相同性を含む、請求項１８１～１８２のいずれか一項に記載の方法。
184. 前記生合成酵素の相同性が、配列同一性により決定される、請求項１８１～１８３のいずれか一項に記載の方法。
185. 前記公知のまたは予測されるＭＧＣ内の生合成酵素と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す場合、前記候補ＭＧＣにおける生合成酵素が、ホモログである、請求項１８４に記載の方法。
186. 前記生合成酵素の相同性が、ＨＭＭツールにより決定される、請求項１８１～１８３のいずれか一項に記載の方法。
187. その候補ビットスコアの最良のマッチのビットスコアに対する比が、０．６、０．７、０．８または０．９を超える場合、前記候補ＭＧＣにおける生合成酵素が、ホモログである、請求項１８６に記載の方法。
188. 前記生合成酵素が、コア生合成酵素である、請求項１８１～１８７のいずれか一項に記載の方法。
189. 前記候補ＭＧＣおよび前記公知のまたは予測されるＭＧＣにおける前記予測される化学構造の類似性が、Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数によって決定される、請求項１８１～１８８のいずれか一項に記載の方法。
190. 少なくとも０．７、０．８、０．９または０．９５のＴａｎｉｍｏｔｏ係数を示す場合、候補ＭＧＣの予測される化学構造が、公知のまたは予測されるＭＧＣの公知のまたは予測される化学構造と同様である、請求項１８９に記載の方法。
191. 前記推定上の抵抗性遺伝子が、前記予測されるＭＧＣ内に位置し、前記天然物の合成に関与しない、請求項１８１～１９０のいずれか一項に記載の方法。
192. 長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂまたは４０ｋｂのＮ５０長を含む、請求項１８１～１９１のいずれか一項に記載の方法。
193. 前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、６００Ｍｂ、７００Ｍｂ、８００Ｍｂ、９００Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１３００Ｍｂまたは１４００Ｍｂのサイズである、請求項１８１～１９２のいずれか一項に記載の方法。
194. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５００ＭＢのサイズである、請求項１８１～１９１のいずれか一項に記載の方法。
195. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１ＴＢのサイズである、請求項１８１～１９１のいずれか一項に記載の方法。
196. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされた配列を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、約５００ＭＢ～約１ＴＢのサイズである、請求項１８１～１９１のいずれか一項に記載の方法。
197. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記アセンブルされた配列の大部分が、無培養微小生物に由来する、請求項１８１～１９１のいずれか一項に記載の方法。
198. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の実質的に全てが、無培養微小生物に由来する、請求項１８１～１９１のいずれか一項に記載の方法。
199. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せの、ライブラリーに配置されている、請求項１８１～１９１のいずれか一項に記載の方法。
200. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記無培養微小生物の少なくとも一部が、土壌試料に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミドライブラリーに配置されている、請求項１８１～１９１のいずれか一項に記載の方法。
201. ｄ）宿主細胞を製造するステップであって、前記製造された宿主細胞が、ステップ（ｃ）において同定された前記候補ＭＧＣ、またはそのリファクタリングされたバージョンを含む、ステップ
     を含む、請求項１８１～２００のいずれか一項に記載の方法。
202. ｅ）ステップ（ｄ）の前記製造された宿主細胞を培養するステップ
     を含む、請求項２０１に記載の方法。
203. ｆ）ステップ（ｅ）の培養物由来のライセートおよび／または使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、前記製造された宿主細胞中に存在する前記候補ＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ
     を含む、請求項２０２に記載の方法。
204. 候補多重遺伝子クラスター（ＭＧＣ）を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法であって、
     ａ）公知のまたは予測されるＭＧＣのコア生合成酵素を同定するステップと、
     ｂ）長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーを、（ａ）において同定された前記コア生合成酵素のそれぞれのホモログについて問い合わせるステップであって、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、デジタル処理でアセンブルされたコンティグを含む、ステップと、
     ｃ）前記デジタルメタゲノミクスライブラリーの単一のコンティグ内の前記コア生合成酵素のホモログの存在に基づき新たなＭＧＣを同定するステップと
     を含む、方法。
205. 前記公知のまたは予測されるＭＧＣの前記コア生合成酵素のうち少なくとも１種と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の配列相同性を示す場合、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーにおいてコードされる酵素が、ホモログとみなされる、請求項２０４に記載の方法。
206. 前記コア生合成酵素の相同性が、配列同一性により決定される、請求項２０４～２０５のいずれか一項に記載の方法。
207. 前記公知のまたは予測されるＭＧＣ内の生合成酵素と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す場合、前記新たなＭＧＣにおける遺伝子が、ホモログである、請求項２０６に記載の方法。
208. 前記生合成酵素の相同性が、ＨＭＭツールにより決定される、請求項２０４に記載の方法。
209. そのコア生合成ビットスコアの最良のマッチのビットスコアに対する比が、０．６、０．７、０．８または０．９を超える場合、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーにおける酵素が、ホモログである、請求項２０８に記載の方法。
210. 前記長いアセンブリーデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂまたは４０ｋｂのＮ５０長を含む、請求項２０４～２０９のいずれか一項に記載の方法。
211. 前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、６００Ｍｂ、７００Ｍｂ、８００Ｍｂ、９００Ｍｂ、１０００Ｍｂ、１１００Ｍｂ、１２００Ｍｂ、１３００Ｍｂまたは１４００Ｍｂのサイズである、請求項２０４～２１０のいずれか一項に記載の方法。
212. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約５００ＭＢのサイズである、請求項２０４～２０９のいずれか一項に記載の方法。
213. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１ＴＢのサイズである、請求項２０４～２０９のいずれか一項に記載の方法。
214. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされた配列を含み、前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、約５００ＭＢ～約１ＴＢのサイズである、請求項２０４～２０９のいずれか一項に記載の方法。
215. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記アセンブルされた配列の大部分が、無培養微小生物に由来する、請求項２０４～２０９のいずれか一項に記載の方法。
216. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の実質的に全てが、無培養微小生物に由来する、請求項２０４～２０９のいずれか一項に記載の方法。
217. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはそれらの組合せの、ライブラリーに配置されている、請求項２０４～２０９のいずれか一項に記載の方法。
218. 多重遺伝子クラスター特色セットデジタルメタゲノミクスライブラリーが、少なくとも約１０ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂのＮ５０長を有する配列決定され、かつデジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列を含み、前記ライブラリーにおける前記配列の大部分が、無培養微小生物に由来し、前記無培養微小生物の少なくとも一部が、土壌試料に由来し、前記デジタル処理でアセンブルされたコンティグ配列の物理的コピーが、対応する物理的コスミドライブラリーに配置されている、請求項２０４～２０９のいずれか一項に記載の方法。
219. ｄ）１個または複数の宿主細胞を製造するステップであって、各製造された宿主細胞が、ステップ（ｃ）において同定された前記新たなＭＧＣを含む、ステップ
     を含む、請求項２０４～２１８のいずれか一項に記載の方法。
220. ｅ）ステップ（ｄ）の前記製造された宿主細胞を培養するステップ
     を含む、請求項２１９に記載の方法。
221. ｆ）ステップ（ｅ）の培養物由来のライセートおよび／または使用済み培養物を、天然物の存在について解析するステップであって、前記天然物が、前記製造された宿主細胞中に存在する前記新たなＭＧＣ配列を欠く対照宿主細胞の培養物中には存在しない、ステップ
     を含む、請求項２２０に記載の方法。
222. 前記デジタルメタゲノミクスライブラリーが、請求項１１０～１４４のいずれか一項に記載の方法に従って産生された、請求項１８１～２２１のいずれか一項に記載の方法。

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