JP2023027374A - 抗ｃｄ３抗体及び該抗体を含む分子 - Google Patents

抗ｃｄ３抗体及び該抗体を含む分子 Download PDF

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Abstract

【課題】 本発明は、ヒトＣＤ３に結合する新規な抗体、あるいは、該抗体を含む抗原結合性を有する分子を提供する。【解決手段】 ヒトＣＤ３に結合する新規な抗体、該抗体を含む抗原結合性を有する分子、該抗体又は該分子を有効成分として含み細胞傷害活性を有する医薬組成物の提供等。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトＣＤ３に結合し、且つ、カニクイザルＣＤ３に結合する新規な抗体、及び、該抗体を含む分子に関する。
１）抗ＣＤ３モノクローナル抗体は他の任意のモノクローナル抗体と同様、それらの標的分子に対する高度な認識により機能する。抗ＣＤ３抗体は、標的であるＣＤ３分子上における単一のエピトープだけを認識する。ＣＤ３複合体に特異的なモノクローナル抗体で最も広く用いられ、また、最もよく特徴づけられているのは、ＯＫＴ３である。
２）ＯＫＴ３はマウス由来の抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体である（非特許文献１）。臓器の同種移植片拒絶を防ぐために、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を投与し、抗体がヒトＴ細胞上のＴＣＲ複合体に結合しＴ細胞の活性化と増殖を抑えることで、移植臓器が拒絶されるのを防ぐ処置法が長い間用いられてきた(非特許文献２－４)。ＯＫＴ３はそのような処置に用いられた最初の抗ＣＤ３抗体である。ＯＫＴ３は強い免疫抑制効果を有する一方、その免疫原性及び***促進の潜在能力に関連する重篤な副作用が原因で、その臨床上の使用が阻まれている(非特許文献５－８)。
３）ＯＫＴ３はインビトロにおいてＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を誘導し、インビボにおいて大量のサイトカインを放出し、サイトカインシンドロームを引き起こした（非特許文献５）。これはＯＫＴ３が２価のＩｇＧであるため、Ｔ細胞とＦｃγ受容体発現細胞へのクロスリンクが生じ、結果としてＴ細胞の増殖が引き起こされることによる（非特許文献８）。またＯＫＴ３はマウス抗体であるため、長期投与によりヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）のような異好性抗体が生じることが知られている（非特許文献７）。抗ＣＤ３抗体の治療への応用と副作用の報告は以下にまとめられている（特許文献１）。
４）このような問題を解決するため、ＯＫＴ３のｓｃＦｖ（非特許文献９）、あるいはヒト化ＯＫＴ３（非特許文献１０）等が作製されている。またＯＫＴ３の更なる応用例として、Ｔ細胞活性化能を利用したＯＫＴ３の単鎖とがん細胞表面で発現する標的抗原に対する抗体の単鎖を結合させた二重特異性抗体が報告されている（特許文献２、非特許文献１１）。
５）当技術分野で説明される抗ＣＤ３抗体を用いた多重特異性抗体は、悪性疾患の治療に対して大きな治療的可能性を有することが期待される。例えば、ＴＲＯＰ２は種々の上皮細胞癌種において過剰発現していることが知られている（非特許文献１２－１６）。ヒトＴＲＯＰ２特異的な抗体の抗原結合性断片と抗ＣＤ３抗体の抗原結合性断片を遺伝子上でつなげて発現させた二重特異性抗体は、これまで報告されていない。
６）ＯＫＴ３は、チンパンジーのＣＤ３とは反応するが、カニクイザルなど他の霊長動物由来のＣＤ３とは反応しない（非特許文献１７）。抗ＣＤ３モノクローナル抗体であるＵＣＨＴ－１もまた、チンパンジーに由来するＣＤ３とは反応するがカニクイザル由来ＣＤ３とは反応しない（非特許文献１８）。他方、カニクイザル抗原は認識するが、それらのヒト対応物は認識しないモノクローナル抗体の例も見られる。この群の一例は、カニクイザルに由来するＣＤ３を指向するモノクローナル抗体であるＦＮ－１８である（非特許文献１９）。
７）ＯＫＴ３及びＯＫＴ３を改変した一連の抗体の限界は、ヒトＣＤ３のみに特異的に結合することである。この限界はヒトの疾患を治療する治療薬剤として開発するにあたり、重大な障害となり得る。なぜならば、開発候補薬品は市場の承認を得るために、前臨床試験を実施する必要があり、前臨床試験では動物、特に高等霊長類であるカニクイザルを用いて行うことが望まれているからである。したがって、抗ＣＤ３抗体を用いた候補薬品の場合、ヒトとカニクイザル両方のＣＤ３に結合可能な抗ＣＤ３抗体を用いることが非常に望ましい。
８）ヒトとカニクイザル両方と結合する抗体は、特許文献３、４、及び非特許文献２０で報告されている。またこのような抗ＣＤ３抗体の単鎖と、がん細胞表面で発現する標的抗原に対する抗体の単鎖を結合させた二重特異性抗体が報告されている（特許文献５、非特許文献２１）。しかし、多様性に富む癌標的に適応可能な多重特異性抗体や多重特異性分子を利用可能とするために、上述のものとは異なるエピトープと結合し、かつヒトとカニクイザル両方に結合する抗ＣＤ３抗体が望まれている。
国際公開第２０１２／１６２０６７号 国際公開第２００７／１０８１５２号 米国特許公開８２３６３０８号明細書 国際公開第２００８／１１９５６７号 国際公開第２０１５／０２６８９２号
Ｓａｌｍｅｒｏｎ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７，３０４７－３０５２ Ｃｏｓｍｉ ＡＢ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９８１）３２，５３５－５３９ Ｇｉｌｂｅｒｔ ＥＭ． ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８７）８２，２０２－２０６ Ｔｈｉｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ ＪＲ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎａｔｉｏｎ（１９８７）４３，１７６－１８４ Ａｂｒａｍｏｗｉｃｚ Ｄ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎａｔｉｏｎ（１９８９）４７，６０６－６０８ Ｔｏｕｓｓａｉｎｔ Ｄ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎａｔｉｏｎ（１９８９）４８，５２４－５２６ Ｔｈｉｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ， ＪＲ． ｅｔ ａｌ．，Ａｍ． Ｊ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．（１９８８）１１，１１２－１１９ Ｍｅｕｅｒ， ＳＣ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３６，４１０６－４１１２ Ｇｅｏｒｇｅ ＡＪ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２（４），１８０２－１１ Ｗｏｏｄｌｅ ＥＳ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２） １４８（９），２７５６－６３ Ｙａｎｋｅｌｅｖｉｃｈ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ（２０１２）５９（７），１１９８－１２０５ Ｑｈｍａｃｈｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００６）１２（１８），３８５７－３８６３ ：Ｍｕｈｌｍａｎｎ Ｇ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ．（２００９）６２（２），１５２－１５８ ：Ｆｏｎｇ Ｄ．， ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ（２０００）９９（８），１２９０－１２９５． ：Ｆｏｎｇ Ｄ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄ． Ｐａｔｈｏｌ．（２０００）２１（２）（２０００），１８６－１９１ ：Ｎｉｎｇ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ．（２０１３）３４（１０），１７４５－１７５０ Ｓａｎｄｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｐｒｉｍａｔｏｌ．（１９８６）１５，４４１-４５１ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｈｐｒｅａｇｅｎｔｓ．ｏｒｇ／ＮＨＰ／ｃｌｏｎｅｌｉｓｔ．ａｓｐｘ？ＩＤ＝７７ Ｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．（２００１）３０，１４１-１４７ Ｃｏｎｒａｄ ＭＬ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．（２００７）７１（１１），９２５－３３ Ｌｕｍ ＬＧ． ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ（２０１１）２５（６），３６５－３７９．
本発明の目的は、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する新規な抗体又は該抗体の抗原結合性断片（以下、抗体等とも記す）、該抗体等と更に１つ又は２つ以上のさらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む分子、多重特異的である該分子、該抗体等又は該分子を有効成分として含み、細胞傷害活性を有する医薬組成物等を提供することである。
本発明者らは、標記課題を解決するために鋭意研究を行い、新規な抗ＣＤ３抗体、及び、該抗体を含む分子を創出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）重鎖配列が
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号９８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
軽鎖配列が
配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号９９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び、
配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
をそれぞれ含み；且つ、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合することを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２）前記ＣＤＲＨ２の
１番目のＸａａは、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され
且つ２番目のＸａａはＳであるか、又は、
１番目のＸａａはＮであり、
且つ２番目のＸａａは、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択され、
前記ＣＤＲＬ２の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択され、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合することを特徴とする前記（１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（３）前記ＣＤＲＨ２の
１番目のＸａａは、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、２番目のＸａａはＳであり、且つ
前記ＣＤＲＬ２の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合することを特徴とする前記（１）又は（２）に
記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（４）重鎖配列がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及び、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲＨ２は配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲＨ３は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなること；並びに
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、
前記ＣＤＲＬ１は配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲＬ２は配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲＬ３は配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなること；並びに、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合することを特徴とする、前記（１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（５） 重鎖可変領域配列が、配列番号１００に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記（１）乃至（４）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。（６） 配列番号１００に示されるアミノ酸配列の
１番目のＸａａは、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され
且つ２番目のＸａａはＳであるか、又は、
１番目のＸａａはＮであり
且つ２番目のＸａａは、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択される、
前記（５）に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
（７） 配列番号１００に示されるアミノ酸配列の
１番目のＸａａは、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、且つ２番目のＸａａはＳである、
前記（５）に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
（８） 軽鎖可変領域が、配列番号１０１、１０２、及び、１０３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記（１）乃至（７）のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合性断片。
（９） 配列番号１０１、１０２、及び、１０３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、前記（８）に記載の抗体又その抗原結合性断片。
（１０） 重鎖可変領域配列が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記（５）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１１） 軽鎖可変領域配列が、配列番号１７、２０、及び、２３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記（８）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１２） 配列番号１００に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０１、１０２、及び１０３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
配列番号１００で示されるアミノ酸配列の１番目のＸａａは、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、且つ、２番目のＸａａはＳであるか、又は、
１番目のＸａａはＮであり、且つ、２番目のＸａａは、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択され、
配列番号１０１、１０２、及び、１０３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、前記（１）又は（２）に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
（１３） 配列番号１００の
１番目のＸａａは、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、
２番目のＸａａはＳであり、且つ、
配列番号１０１、１０２、及び、１０３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、前記（１２）に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
（１４） 前記（１３）に記載の
配列番号６０の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号６０の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６４の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号６４の１３５乃至２４１のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６６の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号６６の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６８の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号６８の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７０の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７０の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７２の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７２の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７４の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７６の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７６の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７８の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７８の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号８０の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号８０の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号８２の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号８２の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号８４の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号８４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１５） 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、リンカーと、配列番号１７、２０、及び、２３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む前記（１）、（４）、（５）、（８）、（１０）、又は（１１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１６） 可変領域が、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合しており、又は、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合しており、任意で：ｉ）両可変領域の間にリンカーを有し；ｉｉ）アミノ末端側の可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有し；ｉｉｉ）カルボキシル末端側の可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、ＦＬＡＧタグ、及び／又は、Ｈｉｓタグが結合している：前記（１）乃至（１５）のいずれ
か１つに記載の抗体又はその抗原結合性断片。
（１７） 配列番号６０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６４の２乃至２４１番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６６の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６８の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７２の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７４の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７６の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７８の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号８０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号８２の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
又は、
配列番号８４の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を含む前記（１６）に記載の抗原又は該抗体の抗原結合性断片。
（１８） 配列番号１９の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号２２の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号２５の２乃至２６７のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６０の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６４の２乃至２６７のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６６の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６８の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７０の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７２の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７４の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７６の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７８の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号８０の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号８２の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、又は、
配列番号８４の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を含む前記（１６）に記載の抗原又は該抗体の抗原結合性断片。
（１９） 前記（１４）乃至（１８）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２０） 前記（１４）乃至（１８）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含む重鎖、及び、前記（１４）乃至（１８）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖のアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２１） 前記（１４）乃至（１８）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖が含むアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、前記（１４）乃至（１８）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖が含むアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２２） 前記（１４）乃至（１８）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトＣＤ３上の同一の部位に結合し、且つ、カニクイザルＣＤ３に結合
する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２３） 前記（１４）乃至（１８）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とヒトＣＤ３上への結合において競合し、且つ、カニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２４） 前記抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトＣＤ３上の部位が、配列番号１で示されるアミノ酸配列中の５５番目のセリン（Ｓｅｒ）、５６番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、５８番目のロイシン（Ｌｅｕ）、５９番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）、６５番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、６６番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）、７７番目のセリン（Ｓｅｒ）、７８番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、１０１番目のアルギニン（Ａｒｇ）、１０１番目のグリシン（Ｇｌｙ）、１０３番目のセリン（Ｓｅｒ）、１０４番目のリジン（Ｌｙｓ）、および１０５番目のプロリン（Ｐｒｏ）のうちの７アミノ酸以上から構成される、前記（２２）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２５） IｇＧである前記（１乃至１７）、（１９）乃至（２４）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２６） Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びｓｄＡｂからなる群から選択される前記（１）乃至（２３）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２７） ヒト免疫グロブリン定常領域を含むヒト化抗体又はヒト抗体である、前記（１）乃至（１７）、（１９）乃至（２５）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２８） 前記（１）乃至（２７）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
（２９） 配列番号１９の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号２２の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号２５の２乃至２４１番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６４の２乃至２４１番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６６の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６８の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７２の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７４の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７６の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７８の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号８０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号８２の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
又は、
配列番号８４の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列を含む、前記（２７）に記載のポリヌクレオチド。
（３０） 前記（２８）又は（２９）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（３１） 前記（２８）又は（２９）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド又は前記（３０）に記載のベクターを含むか、又は前記（１）乃至（２７）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を産生する細胞。
（３２） 前記（３１）に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を回収する工程を含む、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片の製造方法。
（３３） 前記（３２）に記載の方法により得られる、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（３４） 前記（１）乃至（２７）、（３３）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を有効成分として含有する医薬組成物。
（３５） 前記（１）乃至（２７）、（３３）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む抗原結合性を有する分子。
（３６） 多重特異的である前記（３５）に記載の分子。
（３７） 前記（１）乃至（２７）、（３３）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、１つ又は２つ以上のさらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む前記（３５）又は（３６）に記載の分子。
（３８） さらなる抗体の抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又は、ｓｄＡｂである、前記（３７）に記載の分子。
（３９） Ｆｃを含む前記（３８）に記載の分子。
（４０） さらなる抗体が、ヒト免疫グロブリン定常領域を含むヒト化抗体又はヒト抗体である、前記（３７）乃至（３９）のいずれか１つに記載の分子。
（４１） 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、前記（１）乃至（２７）、（３３）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる前記（３７）乃至（３８）のいずれか１つに記載の分子。
（４２） 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片の有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、リンカーとが結合しており、さらに該リンカーの有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、前記（１）乃至（２７）、（３３）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが結合してなる前記（４１）に記載の分子。
（４３） 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片の有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、リンカーとが結合しており、さらに該リンカーの有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、
配列番号１９の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２２の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号２５の２乃至２４１番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合してなるアミノ酸配列を含む前記（４２）に記載の分子。
（４４） 前記（１）乃至（２７）、（３３）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片において、可変領域が、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合しており、あるいは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合しており、任意で：ｉ）両可変領域の間にリンカーを有し：ｉｉ）アミノ末端側の可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有し；ｉｉｉ）カルボキシル末端側の可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、ＦＬＡＧタグ、及び／又は、Ｈｉｓタグが結合している：前記（３５）乃至（４２）のいずれか１つに記載の分子。適用可能な形態には、Ｈｙｂｒｉｄ型、Ｄｕａｌ型の二重特異的分子が含まれる。
（４５） 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、
配列番号１９の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２５の２乃至２４１番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
配列番号６０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、配列番号６４の２乃至２４１番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、配列番号６６の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６８の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７２の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７４の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７６の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７８の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号８０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号８２の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号８４の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む前記（４４）に記載の分子。適用可能な形態には、Ｈｙｂｒｉｄ型、Ｄｕａｌ型の二重特異的分子が含まれる。
（４６） 該さらなる抗体が抗癌標的抗体である前記（３６）乃至（４５）のいずれかに記載の分子。
（４７） 二重特異的である前記（３６）乃至（４６）のいずれか１つに記載の分子。
（４８） ポリペプチドである前記（３５）乃至（４７）のいずれか１つに記載の分子。（４９） 前記（４８）に記載の分子の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
（５０） 前記（４９）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（５１） 前記（４９）に記載のポリヌクレオチド若しくは前記（５０に記載のベクター、又は、前記（４８に記載の分子を産生する細胞。
（５２） 前記（５１）に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトＣＤ３に結合する分子を回収する工程を含む、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する分子の製造方法。
（５３） 前記（５２）に記載の方法により得られる、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する分子。
（５４） 前記（３５）乃至（４８）、（５３）のいずれか１つに記載の分子を有効成分として含有する医薬組成物。
（５５） 標的細胞へのＴ細胞リダイレクションによって、該標的細胞への細胞傷害を誘導することを特徴とする前記（５４）に記載の医薬組成物。
本発明によれば、ヒトＣＤ３に結合し且つカニクイザルＣＤ３に結合する新規な抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、該抗体等を含み抗原結合性を有する新規な分子が得られる。また、そのような抗体等又は分子を有効成分として含有する新規な医薬組成物が得られる。該抗体等、あるいは、該分子は、Ｔ細胞依存的な細胞傷害活性を有しており、各種疾患、例えば癌等の治療剤又は予防剤として有用である。
ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列を示した図である。 ヒトＣＤ３δのアミノ酸配列を示した図である。 ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原のアミノ酸配列を示した図である。 重鎖遺伝子増幅用センスプライマーＮｈｅ－ｐｏｌｙＣ－Ｓのヌクレオチド配列を示した図である。 重鎖遺伝子増幅用1回目アンチセンスプライマーｒＩｇγ－ＡＳ１のヌクレオチド配列を示した図である。 重鎖遺伝子増幅用２回目アンチセンスプライマーｒＩｇγ－ＡＳ２のヌクレオチド配列を示した図である。 軽鎖遺伝子増幅用センスプライマーＮｈｅ－ｐｏｌｙＣ－Ｓ２のヌクレオチド配列を示した図である。 軽鎖遺伝子増幅用１回目アンチセンスプライマーｒＩｇＬ－ＡＳ１のヌクレオチド配列を示した図である。 軽鎖遺伝子増幅用２回目アンチセンスプライマーｒＩｇＬ－ＡＳ２のヌクレオチド配列を示した図である。 重鎖シーケンス用センスプライマーｒＩｇγ－ｓｅｑのヌクレオチド配列を示した図である。 軽鎖シーケンス用アンチセンスプライマー１ｒＩｇＬ－ｓｅｑ１のヌクレオチド配列を示した図である。 軽鎖シーケンス用アンチセンスプライマー２ｒＩｇＬ－ｓｅｑ２のヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３－１４７の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３－１４７の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３－１４７の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３－１４７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 Ｇ４Ｓ ｌｉｎｋｅｒセンス鎖のオリゴヌクレオチド配列を示した図である。 Ｇ４Ｓ ｌｉｎｋｅｒアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０００をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０００のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３４の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０００のＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０００のＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０００のＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０００のＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０００のＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０００のＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３５のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３６のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３４をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３５をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３６をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 ヒトＣＤ３γのアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０３４のアミノ酸配列を示した図である。 ＣＤ３εγとＣ３Ｅ－７０３４の複合体構造を示した図である。 ＣＤ３εγとＣ３Ｅ－７０３４の重鎖及び軽鎖との相互作用を示した図である。 Ａは、Ｃ３Ｅ－７０３４の軽鎖可変領域とＣＤ３εにつき、互いに４Å以内の距離にあるＣＤ３εのアミノ酸残基を太いスティックモデルで、それ以外のアミノ酸を細いスティックモデルで表示した図である。 Ｂは、Ｃ３Ｅ－７０３４の重鎖可変領域とＣＤ３εにつき、互いに４Å以内の距離にあるＣＤ３εのアミノ酸残基を太いスティックモデルで、それ以外のアミノ酸を細いスティックモデルで表示した図である。 ヒトＣＤ３εとＣ３Ｅ－７０３４の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列上における相互作用部位を示した図である。 ＯＫＴ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－３００７の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 ＯＫＴ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－３００７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－３００７ ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－３００７ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖであるＣ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６のヒトＣＤ３（ＰＢＭＣ）への結合性を示した図である。 ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖであるＣ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６のカニクイザルＣＤ３（ＰＢＭＣ）への結合性を示した図である。 Ａは、ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖであるＣ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－３００７の、ヒトＣＤ８陽性細胞に対する活性化作用を示した図である。Ｂは、ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖであるＣ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－３００７のカニクイザルのＣＤ８陽性細胞活性化作用を示した図である。 ＨＴ１－１１ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示した図である。 ＨＴ１－１１ ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を示した図である。 ＨＴ１－１１ ｓｃＦｖが、ヒトＴＲＯＰ２陽性細胞株に結合することを示した図である。Ａは、咽頭扁平上皮癌細胞株ＦａＤｕに対する結合を示した図である。Ｂは、膵臓癌細胞株ＨＰＡＦ－ＩＩに対する結合を示した図である。 Ｔ２Ｃ－０００１をコードするＯＲＦヌクレオチド配列を示した図である。 Ｔ２Ｃ－０００３をコードするＯＲＦヌクレオチド配列を示した図である。 Ｔ２Ｃ－０００５をコードするＯＲＦヌクレオチド配列を示した図である。 Ｔ２Ｃ－０００６をコードするＯＲＦヌクレオチド配列を示した図である。 Ｔ２Ｃ－０００１のアミノ酸配列を示した図である。 Ｔ２Ｃ－０００３のアミノ酸配列を示した図である。 Ｔ２Ｃ－０００５のアミノ酸配列を示した図である。 Ｔ２Ｃ－０００６のアミノ酸配列を示した図である。 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子、Ｔ２Ｃ－０００１、Ｔ２Ｃ－０００３、Ｔ２Ｃ－０００５、Ｔ２Ｃ－０００６のＴＲＯＰ２陽性細胞株に結合することを示した図である。 Ａは、咽頭扁平上皮癌細胞株ＦａＤｕに対する結合を示した図である。 Ｂは、膵臓癌細胞株ＨＰＡＦ－ＩＩに対する結合を示した図である。 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子、Ｔ２Ｃ－０００１、Ｔ２Ｃ－０００３、Ｔ２Ｃ－０００５、Ｔ２Ｃ－０００６のヒトＣＤ３（ＰＢＭＣ）に対する結合性を示した図である。 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子、Ｔ２Ｃ－０００１、Ｔ２Ｃ－０００３、Ｔ２Ｃ－０００５、Ｔ２Ｃ－０００６のカニクイザルＣＤ３（ＰＢＭＣ）に対する結合性を示した図である。 Ａは、咽頭扁平上皮癌細胞株ＦａＤｕにおいて、ＴＲＯＰ２が発現していることを示す図である。 Ｂは、膵臓癌細胞株ＨＰＡＦ－ＩＩにおいて、ＴＲＯＰ２が発現していることを示す図である。 Ｃは、肺癌細胞株Ｃａｌｕ－６において、ＴＲＯＰ２が発現していないことを示す図である。 Ａは、抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子、Ｔ２Ｃ－０００１、Ｔ２Ｃ－０００３、Ｔ２Ｃ－０００５、Ｔ２Ｃ－０００６が、咽頭扁平上皮癌細胞株ＦａＤｕに対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。 Ｂは、抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子、Ｔ２Ｃ－０００１、Ｔ２Ｃ－０００３、Ｔ２Ｃ－０００５、Ｔ２Ｃ－０００６が、膵臓癌細胞株ＨＰＡＦ－ＩＩに対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。 Ｃは、抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子、Ｔ２Ｃ－０００１、Ｔ２Ｃ－０００３、Ｔ２Ｃ－０００５、Ｔ２Ｃ－０００６が、ヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ－６に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。 Ｃ３Ｅ－７０７８をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０７８のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０７９をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０７９のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８５をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８５のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８６をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８６のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８７をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８７のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８８をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８８のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８９をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０８９のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９０をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９０のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９１をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９１のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９２をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９２のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９３をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９３のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９４をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９４のアミノ酸配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９５をコードするヌクレオチド配列を示した図である。 Ｃ３Ｅ－７０９５のアミノ酸配列を示した図である。 プライマー ＨＮ５３Ｒ Ｆｗをコードするヌクレオチド配列を示した図である。 プライマー ＨＮ５３Ｒ Ｒｖをコードするヌクレオチド配列を示した図である。 プライマー ＨＮ５３Ｓ Ｆｗをコードするヌクレオチド配列を示した図である。 プライマー ＨＮ５３Ｓ Ｒｖをコードするヌクレオチド配列を示した図である。 ＡＸＣ－０００１をコードするＯＲＦヌクレオチド配列を示した図である。 ＡＸＣ－０００１のアミノ酸配列を示した図である。 ＡＸＣ－０００２をコードするＯＲＦヌクレオチド配列を示した図である。 ＡＸＣ－０００２のアミノ酸配列を示した図である。 ＭＧＣ－０００１をコードするＯＲＦヌクレオチド配列を示した図である。 ＭＧＣ－０００１のアミノ酸配列を示した図である。 ＭＧＣ－０００２をコードするＯＲＦヌクレオチド配列を示した図である。 ＭＧＣ－０００２のアミノ酸配列を示した図である。 抗ＣＤ３抗体ＣＤＲ改変体の作製に用いたプライマーのリストである。 各種抗ＣＤ３抗体ＣＤＲ改変体のヒトおよびカニクイザルＣＤ３（ＰＢＭＣ）に対する結合性を示した図である。 各種抗ＣＤ３抗体ＣＤＲ改変体のヒトおよびカニクイザルＣＤ３（ＰＢＭＣ）に対する結合性を示した図である。 ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（Ａ）、ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ－１（Ｂ）、ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２（Ｃ）、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６Ｂ１（Ｄ）、マントル細胞リンパ腫細胞株Ｊｅｋｏ－１（Ｅ）におけるＡｘｌの発現を示した図である。 Ａ、Ｂ、Ｃは抗Ａｘｌ－ＣＤ３二重特異性分子、ＡＸＣ－０００１、ＡＸＣ－０００２がＡｘｌ発現細胞株：ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（Ａ）、ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ－１（Ｂ）、ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２（Ｃ）に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。Ｄ、Ｅ、は抗Ａｘｌ－ＣＤ３二重特異性分子、ＡＸＣ－０００１、ＡＸＣ－０００２がＡｘｌ非発現細胞株：ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６Ｂ１（Ｄ）、マントル細胞リンパ腫細胞株Ｊｅｋｏ－１（Ｅ）に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さない事を示した図である。 ＭＡＧＥＣ１ペプチド（Ａ）、もしくはＤＭＳＯを添加した（Ｂ）ヒトリンパ芽球細胞融合細胞株Ｔ２細胞におけるＭＡＧ－０３２ｓｃＦｖの結合性を示した図である。 Ａは抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子、ＭＧＣ－０００１、ＭＧＣ－０００２がＭＡＧＥＣ１ペプチドを添加したＴ２細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。Ｂは抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子、ＭＧＣ－０００１、ＭＧＣ－０００２がＤＭＳＯを添加したＴ２に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さない事を示した図である。 ＭＡＧＥＣ１ペプチドのアミノ酸配列を示した図である。 ＣＤＲ改変体のＣＤＲＨ２領域のアミノ酸配列を示した図である。１番目のＸａａと２番目のＸａａは、それぞれ、任意の天然のアミノ酸残基である。 ＣＤＲ改変体のＣＤＲＬ２領域のアミノ酸配列を示した図である。Ｘａａは、任意の天然のアミノ酸残基である。 Ｃ３Ｅ－７０３４のＣＤＲ改変体の重鎖アミノ酸配列を示した図である。１番目のＸａａと２番目のＸａａは、それぞれ、任意の天然のアミノ酸残基である。 Ｃ３Ｅ－７０３４のＣＤＲ改変体の軽鎖アミノ酸配列を示した図である。ＣＤＲＬ２のＸａａは、任意の天然のアミノ酸残基である。 Ｃ３Ｅ－７０３５のＣＤＲ改変体の軽鎖アミノ酸配列を示した図である。ＣＤＲＬ２のＸａａは、任意の天然のアミノ酸残基である。 Ｃ３Ｅ－７０３６のＣＤＲ改変体の軽鎖アミノ酸配列を示した図である。ＣＤＲＬ２のＸａａは、任意の天然のアミノ酸残基である。
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチド又はその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチド又はその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明において塩基配列とヌクレオチド配列は
同義である。
本発明において、「ポリヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」は同義であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、プライマー等も「ポリヌクレオチド」の意味に含まれる。かかるポリヌクレオチドは一本鎖、二本鎖又は三本以上の鎖からなるポリヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のポリヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本以上の鎖の会合体も「ポリヌクレオチド」の意味に含まれる。
本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」は同義である。
本発明において、「抗原」を「免疫原」の意味に用いることがある。
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞及び微生物等も含まれる。
本発明において、「抗体」は免疫グロブリンと同義である。ただし、本発明の抗ＣＤ３抗体という場合の「抗体」は、定常領域と可変領域とを有する免疫グロブリンの意味で用いる。抗体は、天然のものであるか、又は、部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンであるかは特に限定されない。本発明の抗ＣＤ３抗体は後述の「分子」に含まれる。
基本的な４鎖抗体の構造は、２つの同一な軽（Ｌ）鎖、及び、２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される。軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する。２つの重鎖は、重鎖のアイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれの軽鎖、重鎖は規則的な間隔を持つ鎖内ジスルフィド結合を持つ。重鎖と軽鎖には、アミノ酸配列が非常に高い類似性を示す定常領域とアミノ酸配列の類似性が低い可変領域とが存在する。軽鎖は、定常領域（ＣＬ）が続く可変領域（ＶＬ）をアミノ末端に有する。重鎖は３つの定常領域（ＣＨ１／ＣＨ２／ＣＨ３）が続く可変領域（ＶＨ）をアミノ末端に有する。ＶＬとＶＨは対となり、ＣＬは重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）と並んでいる。ＶＬとＶＨは対となって、単一の抗原結合部位を形成する。
本発明の抗体の定常領域としては、とくに限定されるものではないが、ヒトの疾患を治療又は予防するための本発明の抗体としては、好適にはヒト抗体のものが使用される。ヒト抗体の重鎖定常領域としては、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、Ｃε等を挙げることができる。ヒト抗体の軽鎖定常領域としては、例えば、Ｃκ、Ｃλ等を挙げることができる。
Ｆａｂは、重鎖のＣＨ１とそれに続くＶＨ、及び、軽鎖のＣＬとそれに続くＶＬからなる。ＶＨとＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
Ｆｃは、重鎖の定常領域のカルボキシル末端領域であって、ＣＨ２とＣＨ３を含み、二量体である。本発明のＦｃは、天然の配列のＦｃであっても、天然の配列に変異が加わった変異型のＦｃであってもよい。
可変領域は、超可変領域（ＨＶＲ：ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と称される極度の可変性を有する領域と、その領域により分離されたフレームワークリージョン（ＦＲ：Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる比較的不変の領域からなる。天然の重鎖と軽鎖の可変領域は、３つの超可変領域により接続される４つのＦＲを含み、各鎖の超可変領域はＦＲにより他の鎖の超可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の
抗原結合部位の形成に寄与している。
抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離している。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
本発明において、ＣＤＲの位置と長さは、ＩＭＧＴの定義（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７ （２００３） ５５－７７）により決定した。
フレームワークリージョン（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域である。可変領域は、一般にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の４つのＦＲを持つ。
ＣＤＲとＦＲの位置は、当技術分野で周知の様々な定義、例えば、ＩＭＧＴ以外にも、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔ等の定義により決定することもできる。
本発明において、「抗体の抗原結合性断片」とは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から構成される、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味する。「抗体の抗原結合性断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓｄＡｂ）等の抗原結合断片を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の抗原結合性断片は、抗体蛋白質の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。
本発明において、抗体が結合する「部位」、すなわち抗体が認識する「部位」とは、抗体が結合又は認識する抗原上の部分ペプチド又は部分高次構造を意味する。
本発明においては、かかる部位のことをエピトープ、抗体の結合部位とも呼ぶ。 本発明において、「抗体変異体」とは、元の抗体が有するアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加（付加には挿入が含まれる）（以下、「変異」と総称する）してなるアミノ酸配列を有し、且つ本発明のＣＤ３に結合するポリペプチドを意味する。かかる抗体変異体における変異アミノ酸の数は、１乃至２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０又は５０個である。かかる抗体変異体も本発明の「抗体」に包含される。
本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、２乃至１０個を指す。
本明細書中において、「分子」は、上述の抗体、抗体の抗原結合性断片を含む分子であり、さらに抗体又はそれらに由来する複数の抗原結合性断片より形成された多重特異的である分子を含む。
本明細書中において、「多重特異的である分子」「多重特異的（な）分子」及び「多重
特異性分子」は同義であり、１つの分子上の複数の互いに異なるエピトープ、及び／又は、２つ以上の分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能な分子であれば特に限定されない。多重特異的である分子としては、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体も含まれる。このような多重特異的な分子には、異なる２種類以上の重鎖及び軽鎖を有する完全長抗体分子、すなわちＩｇＧ型多重特異性分子、及び２種類以上のＶＬ及びＶＨを有する抗原結合性断片からなる分子、すなわち、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ等を組み合わせて派生する分子、すなわちタンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、トリアボディ等を含むが、これらに限定されない。その他抗原結合性断片に免疫グロブリン骨格を有さないで抗原結合性を有する蛋白質を遺伝子的、あるいは化学的に連結させることにより生じる分子も多重特異性分子として含まれる。
本発明の抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片、あるいは、本発明の多重特異的である分子が奏する活性・性質としては、例えば、生物学的活性、理化学的性質等を挙げることができ、具体的には、各種生物活性、抗原やエピトープに対する結合活性、製造や保存時における安定性、熱安定性等をあげることができる。
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、ならびに、０．２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭＮａＣｌ－１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。
本発明において「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことを指し、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞***装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を意味する。
本発明において「細胞傷害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。
本発明において「抗体依存性細胞傷害活性」とは、「ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）活性」を指し、ＮＫ細胞が抗体を介して腫瘍細胞等の標的細胞を傷害する作用活性を意味する。
本発明において「Ｔ細胞リダイレクションによる細胞傷害活性」とは抗腫瘍抗原抗体と抗ＣＤ３抗体とを含む多重特異的な分子を介して上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。すなわち抗腫瘍抗原抗体が標的腫瘍細胞と結合し、抗ＣＤ３抗体がＴ細胞に結合することにより標的腫瘍細胞とＴ細胞の距離を近づけ、Ｔ細胞活性化を介して細胞傷害を誘導することを意味する。該分子は、医薬組成物に含めることができる。
２．抗原蛋白質 ＣＤ３（ＣＤ３複合体）
本発明において、「ＣＤ３」は、ＣＤ３蛋白質と同じ意味で用いている。
ＣＤ３は、多分子Ｔ細胞レセプター複合体の一部分としてＴ細胞上に発現され、γ鎖、δ鎖、ε鎖、ζ鎖、η鎖の５種類のポリペプチド（分子量は順に２５０００－２８０００、２１０００、２００００、１６０００、２２０００）の複合体である。
本発明で用いるＣＤ３は、動物組織（体液を含む）、該組織由来の細胞もしくは該細胞培養物からの精製及び単離、遺伝子組換え、インビトロ翻訳、化学合成等により調製することができる。
ヒトＣＤ３εをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿０００７３３．３で登録されている。カニクイザルＣＤ３をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿００１２８３６１５．１で登録されている。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は配列表の配列番号１に記載されている。
ＣＤ３εのｃＤＮＡは例えば、ＣＤ３εのｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＣＤ３εのｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ． Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，４８７－４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
なお、ＣＤ３のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤ３と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、ＣＤ３遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。また、ＣＤ３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤ３と同等の生物活性を有する蛋白質もＣＤ３に含まれる。
また、ヒト又はカニクイザルのＣＤ３εをコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ＣＤ３εと同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＣＤ３εのｃＤＮＡに含まれる。さらに、ヒトもしくはカニクイザルＣＤ３ε遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、且つＣＤ３εと同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＣＤ３εのｃＤＮＡに含まれる。
３．抗ＣＤ３抗体
（３－１）抗体の分類
本発明の抗ＣＤ３抗体及び該抗体の抗原結合性断片（以下、本発明の抗体等とも記す）は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明のモノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体（非ヒト動物抗体）、ヒト抗体、キメラ化抗体（「キメラ抗体」ともいう）、ヒト化抗体などを挙げることができる。
非ヒト動物抗体としては、哺乳類、鳥類等の脊椎動物に由来する抗体などを挙げることができる。哺乳類由来の抗体としては、マウス抗体、ラット抗体などのげっ歯類由来の抗体などを挙げることができる。鳥類由来の抗体としては、ニワトリ抗体等を挙げることができる。抗ヒトＣＤ３ラットモノクローナル抗体としては、本発明のＣ３－１４７（実施例１）－７）等を挙げることができる。
キメラ化抗体としては、非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体（ヒト免疫グロブリン）定常領域とを結合してなる抗体などを挙げることができるが、それに限定されるものではない。
ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲをヒト抗体（ヒト免疫グロブリンの可変領域）に移植したもの、ＣＤＲに加え非ヒト動物抗体のフレームワーク領域の配列も一部ヒト抗体に移植したもの、それらのいずれかの非ヒト動物抗体由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸をヒト型のアミノ酸で置換したものなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲとしては、本発明のラット抗ＣＤ３抗体Ｃ３Ｅ－７０００由来の重鎖可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲ
Ｈ３及び軽鎖可変領域中のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３、それらのＣＤＲのアミノ酸配列において１又は２個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたもの等を例示することができる。
ヒト抗体としては、好適には、ヒトＣＤ３に結合し、より好適には、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体であれば特に限定されるものではない。本発明のヒト化抗体と同一の部位に結合するヒト抗体等も例示することができる。たとえば、Ｃ３Ｅ－７０３４と同一の部位に結合するヒト抗体が例示される。
本発明の好適な抗体等は、ヒトＣＤ３に結合する。さらに、本発明のより好適な抗体等は、カニクイザルのＣＤ３との結合活性を併せ持つ。
本発明の抗体等は、ヒトＣＤ３に結合し、カニクイザルのＣＤ３とも結合するならば、複数の異なる抗体に由来する部分から構成される抗体であってもよく、例えば、複数の異なる抗体間で重鎖及び／又は軽鎖を交換したもの、重鎖及び／又は軽鎖の全長を交換したもの、可変領域のみ又は定常領域のみを交換したもの、ＣＤＲの全部又は一部のみを交換したもの等を挙げることができる。キメラ化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、異なる本発明の抗体に由来してもよい。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は、２種又はそれ以上の本発明の抗体に由来してもよい。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は、２種又はそれ以上の本発明の抗体が有するＣＤＲの組合せであってもよい。
本発明のモノクローナル抗体のアイソタイプは特に限定されるものではないが、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等をあげることができる。
モノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスは、例えば、オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法、Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｏａｓｓａｙ（ＲＩＡ）法等で決定することができる、市販の同定用のキット（Ｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）等）も利用することができる。
（３－２）抗ＣＤ３抗体の結合特異性
本発明の抗体等はＣＤ３を認識する。すなわち、本発明の抗体等はＣＤ３に結合する。本発明の抗体等は、好適には、ヒトＣＤ３、サルＣＤ３等に結合し、より好適には、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する。
より詳細には、本発明の抗体、その抗原結合性断片及びその可変領域は、ヒトＣＤ３複合体のε鎖（図１、配列番号１）の細胞外領域に存在するＩｇ-ｌｉｋｅドメインに結合する。さらにカニクイザルＣＤ３複合体のε鎖の細胞外領域に存在するＩｇ－ｌｉｋｅドメインにも結合する。
本発明の抗体等が結合するヒトＣＤ３複合体のε鎖（図１、配列番号１）の細胞外領域に存在するエピトープは、次のアミノ酸を含む；
Ｓｅｒ５５、Ｇｌｕ５６、Ｌｅｕ５８、Ｔｒｐ５９、Ａｓｎ６５、Ｉｌｅ６６、Ｓｅｒ７７、Ａｓｐ７８、Ａｒｇ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｌｙｓ１０４、及びＰｒｏ１０５。
本発明の抗体等は、好ましくは、これらの１３個のアミノ酸から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むエピトープ領域に結合することでヒトＣＤ３と結合を維持することができる。
抗体が、上述のアミノ酸と４Å以内の距離で隣接している場合、そのような抗体は本発明の抗体等と同一のエピトープ特異性を有すると判断することができる。一方、上述のエピトープのアミノ酸のうち、Ａｒｇ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｌｙｓ１０４、及びＰｒｏ1０５は、公知の抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３やＵＣＨＴ１と相互作用するエピトープ残基でもある（Ｌａｒｓ Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００４）（Ｋｅｌｌｙ Ｌ Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００４））。しかし、ＯＫＴ３とＵＣＨＴ１はヒトＣＤ３に結合するが、カニクイザルＣＤ３には結合しない。
本発明において「認識」、すなわち「結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。認識しているか否か、すなわち、結合しているか否の判定基準としては、例えば、解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ：以下、「ＫＤという」）を挙げることができる。本発明の好適な抗体等のＣＤ３に対するＫＤ値は１×１０－５Ｍ以下、５×１０－６Ｍ以下、２×１０－６Ｍ以下又は１×１０－６Ｍ以下である。
本発明における抗原と抗体の結合は、ＳＰＲ法、ＢＬＩ法等の生体分子間相互作用解析システム、あるいはＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等により測定又は判定することができる。細胞表面上の発現している抗原と抗体との結合は、フローサートメトリー法等により測定することができる。
ＳＰＲ法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ解析法）は、反応速度論的（カイネティクス）解析により結合速度定数（Ｋａ値）と解離速度定数（Ｋｄ値）を計測することによりアフィニティーの指標となる解離定数（ＫＤ値）等を求める分析手法として用いられている。ＳＰＲ解析に用いる機器としては、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥヘルスケア社製）、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）（ＢｉｏＲａｄ社製）、ＳＰＲ－Ｎａｖｉ（商標）（ＢｉｏＮａｖｉｓ社製）、Ｓｐｒｅｅｔａ（商標）（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳＰＲｉ－ＰｌｅｘＩＩ（商標）（ホリバ社製）、Ａｕｔｏｌａｂ ＳＰＲ（商標）（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）等を例示することができる。
ＢＬＩ法（ＢｉｏＬａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）は、バイオレイヤー干渉を用いた生体分子間相互作用を計測する方法である。ＢＬＩ法を用いた相互作用解析に用いる機器としては、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）等を例示することができる。
ＥＬＩＳＡ法は、試料溶液中に含まれる目的の抗原あるいは抗体を、特異抗体あるいは抗原で捕捉するとともに、酵素反応を利用して検出・定量する方法である。酵素標識した抗原あるいは抗体を反応系に組込んで、酵素活性を検出する。酵素活性の検出には、反応によって吸光スペクトルが変化する基質が用いられ、吸光度測定で数値化する。
Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡでは、細胞表面にある測定対象を細胞ごと補足するとともに、酵素反応を利用して検出・定量する方法である。
ＲＩＡ法（Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）では、放射性物質を使って抗体を標識し、抗体からの放射能を測定することで、抗体の定量をすることができる。
フローサイトメトリーは、微細な細胞を流体中に分散させ、その流体を細く流して、個
々の細胞を光学的に分析する手法である。蛍光色素で標識された抗体が、抗原抗体反応により細胞表面抗原に結合し、抗体が結合した細胞数を蛍光強度を用いて測定することにより、抗体の抗原結合性を測定する。
上述の通り、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体等は、医薬品の非臨床開発（前臨床開発）に必須な霊長類、特にカニクイザルを用いた有効性や安全性に関する各種試験に供することができ好ましい。また、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体等は、細胞傷害活性を有し、単独で又は本発明の分子として、ヒト及びカニクイザルにおける癌等の疾患の治療又は予防に有用である。医薬組成物については後述する。
また、本発明のヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体等は、マウスＣＤ３には結合しないため、ヒトＣＤ３遺伝子が導入されたマウスの細胞、組織、個体（トランスジェニック動物、ノックアウト動物、ノックイン動物を含む）及び該抗体等を用いた各種アッセイ、免疫組織化学等を、宿主であるマウスのＣＤ３による影響無しに実施することができ、該抗体等を含む医薬、動物薬又は診断薬等のマウスを用いた研究及び非臨床開発上好ましい。
（３－３）モノクローナル抗体
本発明はモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体には、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、魚類抗体等の非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの抗原結合性断片、それらの抗体変異体、それらの修飾体等が含まれる。
例えば、実施例１に記載の方法により得られたＣ３－１４７は、抗ＣＤ３ラットモノクローナル抗体である。
Ｃ３－１４７の重鎖可変領域をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は配列表の配列番号６（図１４）に、アミノ酸配列は配列番号７（図１５）に記載されている。Ｃ３－１４７の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は配列表の配列番号８（図１６）に、アミノ酸配列は配列番号９（図１７）に記載されている。
本発明の抗体変異体には、好適には、蛋白質の分解もしくは酸化に対する感受性の低下、生物活性や機能の維持、改善もしくは低下や変化の抑制、抗原結合能の改善もしくは調節、又は理化学的性質もしくは機能的性質の付与等がなされ得る。蛋白質は、その表面にある特定のアミノ酸側鎖が変化して当該蛋白質の機能や活性が変化することが知られ、そのような例には、アスパラギン側鎖の脱アミド化、アスパラギン酸側鎖の異性化等が含まれる。そのようなアミノ酸側鎖の変化を防ぐために別のアミノ酸に置き換えたものも、本発明の抗体変異体の範囲に含まれる。
本発明の抗体変異体の例として、抗体の有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換されてなるアミノ酸配列を有する抗体を挙げることができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。
好適なアミノ酸グループは、以下のとおりである：酸性グループ＝アスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；
並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかる抗体変異体におけるアミノ酸置換は、元の抗体が有する抗原結合活性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
本発明のＣ３－１４７を含む上記（１）記載の抗体又はその抗原結合性断片が有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換及び／又はその他の変異がなされたアミノ酸配列を有する抗体変異体、ならびに、Ｃ３－１４７を含む上記（１）記載の抗体又はその抗原結合性断片が含むＣＤＲＨ１乃至ＣＲＤＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換及び／又はその他の変異がなされたアミノ酸配列を有する該ＣＤＲを含むマウス抗体、ラット抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの抗原結合性断片、それらを含む分子等も本発明に包含される。
（３－４）抗ＣＤ３抗体の抗原結合性断片
本発明の一つの態様として、本発明の抗ＣＤ３抗体の抗原結合性断片を提供する。抗体の抗原結合性断片とは、該抗体の有する機能のうち少なくとも抗原結合性を保持する断片又はその修飾物を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性、抗原の活性を調節する活性、抗体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞傷害活性等を挙げることができる。本発明の抗体等及び本発明の抗体等を含む多重特異的な分子とした場合の機能としては、例えばＴ細胞のリダイレクション、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞を活性化することによる癌細胞の細胞傷害活性を挙げることができる。
抗体の抗原結合性断片としては、該抗体の有する活性のうち少なくとも抗原結合性を保持している該抗体の断片であれば特に限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。リンカー部分を保有するｓｃＦｖのように、本発明の抗体の抗原結合性断片以外の部分を含む分子も、本発明の抗体の抗原結合性断片の意味に包含される。
抗体蛋白質のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端のアミノ酸が１乃至数個又はそれ以上を欠失してなり、且つ該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持している分子も、抗体の抗原結合性断片の意味に包含される。そのような抗体の抗原結合性断片の修飾体も、本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片、又はその修飾体（後述）に包含される。
本発明の抗体の抗原結合性断片の一つの態様は、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２６９－３１５（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，１１２６－１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるタンデムｓｃＦｖも二重特異性分子として使用することができる。さらに３つ以上のｓｃＦｖより成るトリアボディ等も多特異性分子として使用することができる。
本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であってもよい。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８），４４６－４４８）。これらの抗体も、本発明における抗体の抗原結合性断片の意味に包含される。
また、本発明には、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結した一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）が含まれる（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２（１），１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。
（３－５）抗原結合性を有する分子
本発明の分子は、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性断片を含む。
本発明の分子はさらに、後述する、シグナル配列、精製等のためのタグ、アミノ末端のＧｌｙ、ＡＤＣのドラッグリンカー部分、アルブミン結合ポリペプチド、ＰＥＧ等のポリマー、抗ＣＤ３抗体以外の抗体、その抗原結合性断片、免疫グロブリン骨格を有さないで抗原結合性を有する蛋白質、抗癌作用、細胞傷害活性、その他の薬理活性を有する化合物（の部分）等を含むことができる。
本発明の分子は、ヒトＣＤ３とカニクイザルＣＤ３に結合する。
本発明の分子には、後述する多重特異的な分子が含まれる。
本発明の分子は、ＣＡＲ－Ｔ等、細胞に導入された形態、細胞表面上に提示された形態であってもよい。
（３－６）多重特異的な分子、二重特異的な分子
本発明の多重特異的な分子は、２以上の抗原結合部位を持つ分子である。すなわち、１つの分子上の２つ以上の互いに異なるエピトープ又は２つ以上の分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能な分子であり、複数の互いに異なる抗原結合性断片を包む。このような多重特異的な分子には、ＩｇＧ型多重特異性分子、２種類以上の可変領域を有する多重特異性分子、例えばタンデムｓｃＦｖ、一本鎖ダイアボディ、ダイアボディ、及びトリアボディのような抗体断片、共有結合又は非共有結合して連結されている抗体断片を含むが、これらに限定されない。多重特異的な分子はＦｃを含んでいてもよい。
本発明の多重特異的な分子は、本発明の抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む。本発明の多重特異的な分子は、本発明の抗体等と、１つ又は２つ以上のさらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む。さらなる抗体の抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂを挙げることができる。
本発明の多重特異的な分子は、ＣＤ３に特異的に結合し、あるいは更に、エフェクター細胞上のＦｃ受容体といった標的に結合してもよい。
本発明の多重特異的な分子の好適な例として、二重特異的な分子を挙げることができる。「二重特異的」とは、同一分子の２つの互いに異なるエピトープ又は２つ分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能であることを意味し、このような二重特異性を有する抗体又は抗原結合性断片を包含する。本発明の二重特異的な分子は、ＣＤ３に結合し、且つＣＤ３は有さず他の抗原にあるエピトープに結合する。より具体的には、かかる二重特異的な分子は、（ｉ）ＣＤ３上のあるエピトープ（エピトープ１）に結合し、且つ、（ｉｉ）ＣＤ３にあるエピトープ１とは異なるエピトープ（エピトープ２）に結合するか、又は、ＣＤ３以外の抗原にあるエピトープ（エピトープ３）に結合する。
たとえばＢｉＴＥに代表されるタンデムｓｃＦｖ型の二重特異性分子では、第一の抗体の重鎖可変領域の抗原結合部位と、第一の抗体の軽鎖可変領域の抗原結合部位とが、リンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されて第一のポリペプチドを形成しており、また、第二の抗体の重鎖可変領域の抗原結合部位と、第二の抗体の軽鎖可変領域の抗原結合部位とが、リンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されて第二のポリペプチドを形成しており、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとが、リンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。また、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドが別の分子を介して結合されていても良い。
ダイアボディ型の二重特異性分子では、第一の抗体の重鎖可変領域の抗原結合部位と第二の抗体の軽鎖可変領域の抗原結合部位がリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されており、また、第一の抗体の軽鎖可変領域の抗原結合部位と第二の抗体の重鎖可変領域の抗原結合部位とが、リンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。またダイアボディ型二重特異性分子をさらに二量体化させた二重特異性分子も作製しうる。その他ダイアボディ型二重特異性分子をＦｃの一方の単鎖のみあるいは両鎖とリンカーにて連結させても良い（ダイアボディ－Ｆｃ型二重特異性分子）。
デュアルｓｃＦｖ型の二重特異性分子では、異なるエピトープに結合する２種のｓｃＦｖが、二量体のＦｃの一方とそれぞれリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。あるいは、異なるエピトープに結合する２種類のｓｃＦｖがそれぞれＣＨ、ＣＬにリンカーにて連結され、さらに二量体のＦｃの一方とそれぞれリンカーにて連結されている。デュアルｓｃＦｖ型の二重特異性分子を、以下Ｄｕａｌ型二重特異性分子、又は単にＤｕａｌ型とも記す。
ＩｇＧ型の二重特異性分子では、異なるエピトープに結合する２種のＦａｂが、二量体のＦｃの一方とそれぞれリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。ＩｇＧ型の二重特異性分子を、以下、Ｆｕｌｌ－Ｓｉｚｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＦＳＡ）型二重特異性分子、又は単にＦＳＡ型とも記す。
あるいは、本発明の二重特異性分子として、異なるエピトープに結合するＦａｂとｓｃＦｖが、二量体のＦｃの一方とそれぞれリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている二重特異性抗体であってもよい。あるいは二量体のＦｃの一方に第一の抗体のＦａｂ，もう一方に第二の抗体のｓｃＦｖをリンカーを介して結合させた二重特異性分子であっても良い。このような二重特異性分子を、以下Ｈｙｂｒｉｄ型二重特異性分子、又はＨｙｂｒｉｄ型とも記す。
本発明の二重特異性分子に含まれるｓｃＦｖ及びＦａｂは、好ましくは、ヒト化抗体又はヒト抗体のｓｃＦｖ及びＦａｂであり、Ｆｃは、好ましくは、ヒト抗体のＦｃである。
本発明の二重特異性分子に含まれる可変領域においては、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合していてもよく、あるいは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合していてもよい。両可変領域の間に、任意で、リンカーを有する。また、アミノ末端側の可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有していてもよい（任意で）。タンデムｓｃＦｖ型の二重特異性分子では、カルボキシル末端側の可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、ＦＬＡＧタグ、及び／又は、Ｈｉｓタグが結合していてもよい（任意で）。好適な態様の一つとして、アミノ末端から、重鎖可変領域、第１のリンカー、軽鎖可変領域、第２のリンカー、ＦＬＡＧタグ、及び、Ｈｉｓタグの順に結合したものを例示することができる。
リンカーは、一本鎖ポリペプチド又は一本鎖オリゴペプチド、あるいは、ＰＥＧ、ヌクレオチド、糖鎖、化合物等の合成品も含まれる。その他、二つのポリペプチドを結合する
ものであれば特に限定されず、公知のリンカーを使用することが可能である。
リンカーの長さとしては、たとえばペプチドリンカーの場合５～３０アミノ酸である。二重特異性分子に複数のリンカーが含まれる場合、すべて同じ長さのペプチドリンカーを用いてもよいし、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい。
ペプチドリンカーとしては、たとえば、（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）の繰り返しが例示されるが、これらに１乃至数個のＧｌｙ、Ｓｅｒとは異なるアミノ酸残基が付加していてもよい。
（３－７）ヒト化抗ＣＤ３抗体
本発明はその一つの態様において、ヒト化抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
本発明のヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，５２２－５２５）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際特許公開ＷＯ１９９０／００７８６１号）を挙げることができる。
本発明の好適なヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖可変領域は、
配列番号２６（図２４）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＶＴＦＮＹＹＧ）、
配列番号９８（図１１２）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＩＴＸａａＸａａＧＧＲＩ）（ここで、１番目のＸａａと２番目のＸａａは、それぞれ、任意の天然のアミノ酸残基である。以下、ＣＤＲＨ２の１番目のＸａａをＸ１、２番目のＸａａを、それぞれＸ１、Ｘ２とも記す。）、
及び、
配列番号２８（図２６）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＴＬＤＧＲＤＧＷＶＡＹ）を保有している。
また、本発明の好適なヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖可変領域は、
配列番号２９（図２７）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＴＧＮＩＧＳＮＹ）、
配列番号９９（図１１３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＸａａＤ）（ここで、Ｘａａは、任意の天然のアミノ酸残基である。以下、ＣＤＲＬ２のＸａａをＸ３とも記す。）、
及び、
配列番号３１（図２９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＳＹＳＳＧＦＩ）を保有している。
上述のＣＤＲＨ２（ＩＴＸ１Ｘ２ＧＧＲＩ）において、好ましくは、Ｘ１は、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、且つ、Ｘ２はＳであるか；又は、Ｘ１はＮであり、且つＸ２は、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択され、
上述のＣＤＲＬ２（ＲＸ３Ｄ）において、好ましくは、Ｘ３は、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される。
上述のＣＤＲＨ２（ＩＴＸ１Ｘ２ＧＧＲＩ）において、更に好ましくは、Ｘ１は、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、且つ、Ｘ２はＳであり、
上述のＣＤＲＬ２（ＲＸ３Ｄ）において、更に好ましくは、Ｘ３は、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される。
このような本発明の好適なヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖可変領域の事例としては、
配列番号１００（図１１４）に示されるアミノ酸残基を含む重鎖可変領域を挙げることができる。
また、本発明の好適なヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖可変領域の事例としては、
配列番号１０１（図１１５）、配列番号１０２（図１１６）、配列番号１０３（図１１７）に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を挙げることができる。
本発明の好適なヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖可変領域の具体例として、
配列番号２６（図２４）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＶＴＦＮＹＹＧ）、
配列番号２７（図２５）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＩＴＮＳＧＧＲＩ）、及び
配列番号２８（図２６）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＴＬＤＧＲＤＧＷＶＡＹ）を保有している重鎖可変領域が挙げられる。
また、本発明の好適なヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖可変領域の具体例として、
配列番号２９（図２７）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＴＧＮＩＧＳＮＹ）、
配列番号３０（図２８）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＤＤ）、及び
配列番号３１（図２９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＳＹＳＳＧＦＩ）を保有している軽鎖可変領域が挙げられる。
本発明において、ＣＤＲの位置と長さは、ＩＭＧＴの定義（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７ （２００３） ５５－７７）により決定した。
本発明の重鎖可変領域の具体例としては、配列番号１６に示されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を挙げることができる。
本発明の軽鎖可変領域の具体例としては、配列番号１７，２０、及び、２３に示されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を挙げることができる。
本発明のヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる好適な具定例としては、
配列番号６０の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号６０の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６４の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号６４の１３５乃至２４１のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６６の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号６６の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６８の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号６８の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７０の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７０の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７２の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７２の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７４の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７６の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７６の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７８の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号７８の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号８０の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号８０の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号８２の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号８２の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号８４の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号８４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。
また、本発明のヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる具定例としては、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、リンカーと、配列番号１７、２０、及び、２３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片を挙げることもできる。
本発明の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる可変領域は、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合していてもよく、又は、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合していてもよい。また、可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有していてもよく、可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、ＦＬＡＧ、及び、Ｈｉｓタグが結合していてもよい。
本発明のヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる好適な具体例としては、
配列番号１９の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２２の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２５の２乃至２４１番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片
を挙げることができる。
本発明のヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる更に好適な具体例としては、
配列番号６０（図６８）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０７８）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６４（図７２）の１乃至２４１番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０８５）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６６（図７４）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０８６）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号６８（図７６）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０８７）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７０（図７８）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０８８）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７２（図８０）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０８９）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７４（図８２）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０９０）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７６（図８４）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０９１）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号７８（図８６）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０９２）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号８０（図８８）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０９３）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号８２（図９０）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０９４）又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号８４（図９２）の１乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：Ｃ３Ｅ－７０９５）又は該抗体の抗原結合性断片
を挙げることができる。
本発明のヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれ、アミノ酸末端側から、重鎖可変領域、第１のリンカー、及び、軽鎖可変領域の順に結合し、さらに軽鎖可変領域のカルボキシル末端に、第２のリンカー、ＦＬＡＧタグ、及び、Ｈｉｓタグが結合している好適な具体例としては、
配列番号２２の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号２５の２乃至２６７のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６０の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６４の２乃至２６７のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６６の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号６８の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７０の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７２の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７４の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７６の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号７８の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号８０の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号８２の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、又は、
配列番号８４の２乃至２６９のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を含む前記（１６に記載の抗原又は該抗体の抗原結合性断片が挙げられる。
本発明の抗体等としては、重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び／又は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、上述の本発明の抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び／又は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上同一であって、且つヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体等を含む分子であってもよい。
本発明の抗体等としては、上記のヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に変異を導入して、ＣＤ３に対する結合能を最適化させたものであっても良い。変異を導入する具体的な方法として、エラープローンＰＣＲ法を用いたランダム突然変異誘発法、ＮＮＫライブラリーを用いた部位特異的アミノ酸変異導入、構造情報を利用した部位特異的変異導入、及びそれら組み合わせを挙げることができる。
本発明の抗体等としては、抗体のエフェクター活性を低くするために、定常領域を置換して、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を低減させたものであってもよい。
正常なヒトＣＤ３発現細胞への細胞傷害を回避するために、抗体のエフェクター活性は低いことが望ましい。エフェクター活性は抗体のサブクラスによって異なることが知られている。ＩｇＧ４はＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性が低く、ＩｇＧ２はＣＤＣ活性を有するが、ＡＤＣＣ活性は低い、などの特徴が見られる。この特徴より、ＩｇＧ１の定常領域をＩｇＧ２、４の定常領域に置換することによってＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を低減させた抗体を作製することが可能である。また、ＩｇＧ１の定常領域の一部の配列をＩｇＧ２、４を参考にして置換することにより、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を低減させたＩｇＧ１抗体を作製することが可能である。一例として、Ｍａｒｊａｎ Ｈｅｚａｒｅｈ ｅｔ． ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７５（２４）：１２１６１－１２１６８（２００１）によれば、ＩｇＧ１の２３４番目、２３５番目のロイシン残基（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックス）をそれぞれアラニン残基に置換すると、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性が低下することが示されている。
（３－８）同一の部位に結合し、且つカニクイザルＣＤ３にも結合する抗体
本発明の提供する抗体等と「同一の部位に結合し、且つカニクイザルＣＤ３にも結合する抗体」も本発明の抗体等に含まれる。ある抗体と「同一の部位に結合する抗体」とは、該抗体が認識する抗原分子上の部位に結合する他の抗体を意味する。第一抗体が結合する抗原分子上の部分ペプチド又は部分立体構造に第二抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体は同一の部位に結合すると判定することができる。
また、第一抗体の抗原に対する結合に対して第二抗体が競合する、すなわち、第二抗体が第一抗体と抗原の結合を妨げることを確認することによって、具体的な結合部位のペプチド配列又は立体構造が決定されていなくても、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合すると判定することができる。
さらに、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合し、且つ第一抗体が細胞傷害活性といった本発明の抗体の一つの態様に特徴的な効果を有する場合、第二抗体も同様の活性を有する蓋然性は極めて高い。
従って、第一の抗ＣＤ３抗体の結合する部位に第二の抗ＣＤ３抗体が結合し且つ第二の抗ＣＤ３抗体がカニクイザルＣＤ３に結合すれば、第一抗体と第二抗体がＣＤ３蛋白質上の同一の部位に結合すると判定することができる。本発明の抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトＣＤ３上の同一の部位に結合し且つカニクイザルＣＤ３に結
合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片も、本発明の抗体等に含まれる。
また、第一の抗ＣＤ３抗体のＣＤ３蛋白質への結合に対して第二の抗ＣＤ３抗体が競合し且つ第二の抗ＣＤ３抗体がカニクイザルＣＤ３に結合することを確認できれば、第一抗体と第二抗体がＣＤ３蛋白質上の同一の部位に結合する抗体と判定することができる。本発明の抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片とヒトＣＤ３上への結合において競合し且つカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片も、本発明の抗体等に含まれる。
抗体の結合部位は、免疫アッセイ法など当業者に周知の方法により決定することができる。例えば、抗原のアミノ酸配列をカルボキシル末端又はアミノ末端から適宜削ってなる一連のペプチドを作製し、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドへの抗体の反応性を検討することにより、結合部位を決定することができる。抗原断片ペプチドは、遺伝子組換、ペプチド合成等の技術を用いて調製することができる。
本発明の抗体等はＣＤ３のうち立体構造を形成する領域、すなわちＩｇ－ｌｉｋｅ ドメインを認識、結合している。かかる抗体の結合部位（エピトープ）は、Ｘ線構造解析を用いて、当該抗体に隣接する抗原上のアミノ酸残基を特定することにより決定することができる。
（３－９）抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性断片の修飾体
本発明は、抗体又はその抗原結合性断片の修飾体を提供する。本発明の抗体又はその抗原結合性断片の修飾体とは、本発明の抗体又はその抗原結合性断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合又はＯ－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合又はＯ－結合への糖鎖付加、アミノ末端領域又はカルボキシル末端領域のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりアミノ末端にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティー標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体又はその抗原結合性断片の修飾物は、元の本発明の抗体又はその抗原結合性断片の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
化学的修飾体に含まれる化学部分としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを例示することができる。
生物学的な修飾物としては、酵素処理や細胞処理等により修飾が施されたもの、遺伝子組換えによりタグ等他のペプチドが付加された融合体、ならびに内因性又は外来性の糖鎖修飾酵素を発現する細胞を宿主として調製されたもの等を挙げることができる。
かかる修飾は、抗体又はその抗原結合性断片における任意の位置に、又は所望の位置において施されてもよく、１つ又は２つ以上の位置に同一又は２種以上の異なる修飾がなされてもよい。
本発明において「抗体の抗原結合性断片の修飾体」は「抗体の修飾体の断片」もその意味に含むものである。
また、例えば、哺乳類培養細胞で生産される抗体は、重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。 さらにまた、抗体の作製時に、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端のグルタミン又はグルタミン酸残基がピログルタミル化修飾されることが知られており、本発明の抗体はそのような修飾を有していてもよい（国際特許公開ＷＯ２０１３／１４７１５３号）。
しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター抗原結合性（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）にはあまり影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体及び当該抗体の抗原結合性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）、重鎖又は軽鎖のアミノ末端残基がピログルタミル化された抗体等も含まれる（それらをまとめて「欠失体」と呼ぶ）。但し、抗原結合能の全部又は一部が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖及び軽鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体が２本以上の鎖（例えば重鎖）を含む場合、当該２本以上の鎖（例えば重鎖）は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか２種以上を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比又は分子数比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件等の影響を受け得るが、本発明に係る抗体の欠失体としては、例えば、２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。これらも全て本発明の抗体変異体、抗体の抗原結合性断片又はそれらの修飾体の意味に包含される。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、国際特許公開ＷＯ９９／５４３４２号、ＷＯ００／６１７３９号、ＷＯ０２／３１１４０号等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体及び当該抗体の抗原結合性断片には当該糖鎖修飾を調節された抗体及び当該抗体の抗原結合性断片も含まれる。
本発明において、「抗体又はその抗原結合性断片」の範囲には、「抗体又はその抗原結合性断片」の「欠失体」、「修飾体」、及び、これらとの混合物も含まれる。また、（３－５）及び（３－６）に記載された本発明の抗原結合性を有する分子、多重特異的な分子、二重特異的分子等が含む「抗体又はその抗原結合性断片」の範囲には「抗体又はその抗原結合性断片」の「欠失体」「修飾体」、及びこれらとの混合物も含まれる。
４．抗体の製造
（４－１）ハイブリドーマを用いる方法
本発明の一つの態様として、抗ＣＤ３抗体は、例えば、コーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＣＤ３蛋白質で免疫した動物の脾臓より抗ＣＤ３抗体の産生細胞を単離し、該細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、かかるハイブリドーマの培養物からモノクローナル抗体を取得することができる。
（４－１－１）抗原の調製
抗ＣＤ３抗体を作製するための抗原は、天然型又は組換え型のＣＤ３蛋白質（ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原）の調製法等に従って取得することができる。そのようにして調製し得る抗原としては、ＣＤ３蛋白質若しくはＣＤ３蛋白質断片、又はそれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体等（以下、まとめて「ＣＤ３」とよぶ）を挙げることができる。
天然型ＣＤ３は、例えば、ヒト組織由来の細胞、又は該細胞の培養物から精製、単離することができる。組換え型ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原は、ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原の有するアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれる遺伝子を宿主細胞に導入し、該細胞の培養物から該抗原を回収することにより、調製することができる。また、ＣＤ３抗原のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれる遺伝子をインビトロ（ｉｎ ｖｉｒｔｏ）翻訳系により無細胞蛋白質合成で得られるＣＤ３も本発明の「ＣＤ３抗原」に含まれる。
（４－１－２）抗ＣＤ３モノクローナル抗体の製造
モノクローナル抗体の製造は、通常、下記のような工程を経る。
（ａ）抗原を調製する工程、
（ｂ）抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）を調製する工程、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとを融合させる工程、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群を選別する工程、及び
（ｆ）単一細胞クローンを得る工程（クローニング）。
必要に応じてさらに、（ｇ）ハイブリドーマの培養工程、ハイブリドーマを移植した動物の飼育工程等、（ｈ）モノクローナル抗体の生物活性の測定工程・判定工程等が加わる。
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾臓細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
（ａ）抗原を調製する工程
本発明のＣＤ３蛋白質は、動物組織（体液を含む）、該組織由来の細胞もしくは該細胞培養物からの精製及び単離、遺伝子組換え、無細胞蛋白質合成、化学合成等により調製することができる。
（ｂ）抗体産生細胞を調製する工程
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、例えば、Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、ラットの場合には、例えば、Ｗｉｓｔａｒ、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。
これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ－ルスリバー等の実験動物飼育販売業者より入手することができる。
このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではＷｉｓｔａｒ及びＬｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。
また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５乃至１２週齢、さらに好ましくは６乃至８週齢である。
ＣＤ３蛋白質で動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ， Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４） 等の法を用いることができる。
抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫アッセイを挙げることができるが、それらの方法に限定されるものではない。
免疫された動物から分離された脾臓細胞又はリンパ球に由来する抗体産生細胞は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５，；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７７）６，５１１，；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，５５０，；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，４９５，）等の公知の方法に従って調製することができる。
脾臓細胞の場合には、脾臓を細切して細胞をステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）等に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
（ｃ）ミエローマを調製する工程
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の限定はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができるが、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株、すなわちマウス由来のＸ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１－ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１－４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ－００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ－Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９－６、ＬＩＣＲ－ＬＯＷ－ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４－１（ＮＰ４１）等を用いるのが好ましい。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）等から入手することができる。
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８－アザグアニン培地［ＲＰＭＩ－１６４０培地にグルタミン、２－メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８－アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕ
ｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％ ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させる工程
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で実施することができる。例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群を選別する工程
細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，５５０）が用いられる。この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
（ｆ）単一細胞クローンを得る工程（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えば、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができるが（例えば、Ｂａｒｂａｒａ， Ｂ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ， Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０））、好適には限界希釈法である。
（ｇ）ハイブリドーマの培養工程、ハイブリドーマを移植した動物の飼育工程
選択されたハイブリドーマを培養することにより、モノクローナル抗体を産生することができるが、好適には所望のハイブリドーマをクローニングしてから抗体の産生に供する。
かかるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、該ハイブリドーマの培養物から回収することができる。また、該モノクローナル抗体遺伝子が導入された細胞の培養物から組換え抗体として回収することもできる。さらに、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド－マを増殖させることにより、その腹水から回収することもできる。
（ｈ）モノクローナル抗体の生物活性の測定工程・判定工程
各種生物試験を目的に応じて選択し、適用することができる。
（４－２）細胞免疫法
天然型のＣＤ３を発現する細胞、組換え型ＣＤ３又はその断片を発現する細胞等を免疫原として使用することにより、前記のハイブリドーマ法により抗ＣＤ３抗体を調製することができる。
天然型のＣＤ３を発現する細胞としては、ヒト胸腺細胞、Ｔリンパ球等を挙げることが
できる。それらのＣＤ３発現細胞は、１×１０５乃至１×１０９個、好適には１×１０６乃至１×１０８個、より好適には０．５乃至２×１０７個、より一層好適には１×１０７個を１回の免疫に用いるが、ＣＤ３の発現量に応じて免疫に供する細胞数を変えることができる。かかる免疫源は、一般的には腹腔内に投与するが、皮内等に投与することもできる。ハイブリドーマの作製手法としては（４－１－２）記載の方法を適用することができる。
（４－３）ＤＮＡ免疫法
本発明の抗ＣＤ３抗体は、ＤＮＡ免疫法を使用して得ることもできる。抗原発現プラスミドをマウスやラットなどの動物個体に遺伝子導入し、抗原を個体内で発現させることによって、抗原に対する免疫を誘導する。遺伝子導入の手法には、直接プラスミドを筋肉に注射する方法や、リポソームやポリエチレンイミンなどの導入試薬を静脈注射する方法、ウイルスベクターを用いる手法、プラスミドを付着させた金粒子をＧｅｎｅ Ｇｕｎにより射ち込む手法、急速に大量のプラスミド溶液を静脈注射するＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ法などが存在する。
このようにして樹立されたラット抗ヒトＣＤ３抗体の実例としては、Ｃ３－１４７を挙げることができる。Ｃ３－１４７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９（図１７）に示されている。 またＣ３－１４７の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７（図１５）に示されている。
（４－４）遺伝子組換え
本発明の抗体は、その重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド（重鎖ヌクレオチド）及びその軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド（軽鎖ヌクレオチド）、又は、かかる重鎖ヌクレオチドが挿入されたベクター及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されたベクターを宿主細胞に導入し、該細胞を培養した後その培養物からかかる抗体を回収することにより調製することができる。一つのベクターに重鎖ヌクレオチド及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されていてもよい。
宿主細胞としては、原核細胞又は真核細胞を用いることができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。
動物細胞としては、例えば、哺乳類由来の細胞、すなわち、ヒト胎児由来腎臓細胞ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｓｕｂｅｄｉ ＧＰ eｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（２０１５）１０６）ザル腎. 由来のＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ． Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，１７５－１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、そのジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ＣＨＯｄｈｆｒ－：Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ． ＰＮＡＳ（１９８０）７７，４１２６－４２２０）、ニワトリ等鳥類由来の細胞、昆虫由来の細胞等を挙げることができる。
また、糖鎖構造の改変により、抗体の生物活性を高められるよう改変された細胞も宿主として用いることができる。例えば、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上になるよう改変されたＣＨＯ細胞を用いることにより、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性が高められた抗体を調製することが可能である（国際特許公開ＷＯ０２／３１１４０号）。
真核微生物としては、例えば、酵母等を挙げることができる。原核細胞としては、例え
ば、大腸菌、枯草菌等を挙げることができる。
本発明の抗体（各種動物由来のモノクローナル抗体、ラット抗体、マウス抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等）を分泌させるためのシグナルペプチドとしては、当該抗体と同種、同タイプ及び同サブタイプの抗体の分泌シグナル、ならびに、当該抗体自体の分泌シグナルに限定されるものではなく、他のタイプもしくはサブタイプの抗体の分泌シグナル、又は、他の真核生物種もしくは原核生物由来の蛋白質の分泌シグナルであれば、任意のものを選択して利用することができる。
シグナルペプチドを含んで分泌された抗体等も、本発明の抗体等又は本発明の分子に包含される。
（４－５）ヒト化抗体のデザイン法及び調製法
ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体のＣＤＲのみがヒト由来の抗体に組込まれ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によりＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（ＷＯ９０／０７８６１号、ＵＳ６９７２３２３号公報参照）、それらのいずれかにおける非ヒト動物抗体の１つ又は２つ以上のアミノ酸がヒト型のアミノ酸で置換されてなる抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
（４－６）ヒト抗体の調製法
本発明の抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。ヒト抗ＣＤ３抗体とは、ヒト由来の抗体のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体を意味する。ヒト抗ＣＤ３抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡ断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，１３３－１４３，； Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６，３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ ｖｏｌ．１０，６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，
Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，７２２－７２７等を参照。）によって取得することができる。
このようなヒト抗体産生動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座を破壊し、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座を導入することによって作製することができる。また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＨＥＫ２９３F細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を用いることができる。
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域をｓｃＦｖとしてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗
原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，４３３－４５５）。
（４－７）抗体の抗原結合性断片の調製法
ｓｃＦｖを作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９８８），８５，５８７９－５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。
可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば５乃至３０残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。あるいは、ｓｃＦｖ全領域をコードするＤＮＡを全合成で得ることもある。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを用いて、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を常法に従って調製することができ、また、その宿主細胞を培養することにより、常法に従ってかかる培養物から該ｓｃＦｖを回収することができる。
その他の抗体の抗原結合性断片も、前記の方法に準じて該抗原結合性断片をコードする遺伝子を取得して細胞に導入し、該細胞の培養物から該抗原結合性断片を回収することにより、得ることができる。
本発明の抗体等は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックス－ターン－へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
本発明の抗体等は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＣＤ３抗体の混合物、すなわちポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体としては、例えば、ＣＤＲセットの一部又は全部が異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体は、異なる抗体の産生細胞を混合培養し、該培養物から回収することができる（ＷＯ２００４／０６１１０４号）。また、別個に調製した抗体を混合することも可能である。さらに、ポリクローナル抗体の一つの態様である抗血清は、動物を所望の抗原で免疫し、定法に従って、該動物から血清を回収することにより調製することができる。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
本発明の抗体等は、これらの抗体と他の分子がリンカーでつながれた複合体（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物（薬物）と結合している抗体－薬物複合体の例としては、ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を挙げることができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１３）１０４５：１－２７）。
本発明の抗体等は、更にこれらの抗体と他の機能性ポリペプチドを繋げてもよい。このような抗体－ペプチド複合体の例としては、該抗体がアルブミン結合ポリペプチドと複合体を挙げることができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ． （２０１２） （２）：８１－８）。
（４－８）抗体及び抗体の抗原結合性断片の精製
得られた抗体及び抗体の抗原結合性断片は、該抗体等以外を含まないよう均一に精製することができる。抗体及び抗体の抗原結合性断片の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。
例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができるが、これらに限定されるものではない。
好適な分離・精製法としては、たとえば、ＨｉｓタグやＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ配列を抗体可変領域のカルボキシル末端に付加させて発現ベクターを作製し、このベクターで細胞を形質転換させ、さらに細胞を培養することで当該抗体及び抗体の抗原結合性断片発現させ、培養終了後、培養上清を抽出し、Ｎｉ、Ｃｏ等の金属アフィニティークロマトグラフィー、抗ＦＬＡＧタグ抗体カラム、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等で精製することができる。
ＨｉｓタグやＦＬＡＧタグ等のタグをコードするアミノ酸配列を含んで発現された抗体及び抗体の抗原結合性断片も、本発明の抗体等又は本発明の分子に包含される。
（４－９）多重特異性分子、二重特異性分子
本発明の二重特異性分子及び多重特異的分子は、宿主細胞へ発現プラスミドを導入し、一過性で発現させる方法、宿主細胞にプラスミドを導入後、薬剤選択により安定発現細胞株を選び、恒常的に発現させる方法、無細胞的に合成する方法、それぞれの抗体あるいは抗原結合性断片を上記の方法で作製後、合成ペプチドリンカーを用いて化学的に結合させる方法が挙げられる。
抗体可変領域を用いた二重特異性分子では、２つの１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をペプチドリンカーで結合させる（タンデムｓｃＦｖ）、特異性の異なる２つの抗体におけるお互いのドメインを入れ替えて非共有結合的に二量体を形成する（ダイアボディ）、特異性の異なる２つの抗体におけるお互いのドメインを入れ替え、一本鎖化する（一本鎖ダイアボディ）、ダイアボディを１本鎖化した上で非共有結合的に二量体を形成する（ＴａｎｄＡｂ、米国特許 ＵＳ７１２９３３０）等の方法がある。
本発明は、本発明の抗体若しくは該抗体の抗原結合性断片、又は抗原等の修飾物をコードする遺伝子、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子又はベクターが導入され
た細胞、その他本発明の抗体を産生する細胞をも提供する。
５．医薬組成物
本発明は抗ＣＤ３抗体、その抗原結合性断片あるいはその修飾体、及び／又は、それらを含む本発明の分子、例えば、多重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。
本発明において、疾患の治療及び／又は予防には、かかる疾患の発症の予防、増悪化又は進行の抑制又は阻害、かかる疾患に罹患した個体が呈する一つ又は二つ以上の症状の軽減、増悪化若しくは進行の抑制又は寛解、二次性疾患の治療又は予防等が含まれるが、それらに限定されるものではない。疾患としては、例えば、前記分子の場合、癌が挙げられる。
本発明の医薬組成物には、治療又は予防に有効な量の抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含有せしめることができる。
「治療又は予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態及び投与径路につき治療又は予防効果を奏する量を意味する。
本発明の医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物又はそれに含まれる抗体の安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性又は低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。
製剤用の物質として、例えば、以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない；グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルビテート２０やポリソルビテート８０等ポリソルビテート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールやソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。
これらの製剤用の物質の添加量は、抗ＣＤ３抗体、その抗原結合性断片あるいはその修飾体、又は、本発明の分子、例えば、多重特異性分子の重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。
本発明の抗ＣＤ３抗体、その抗原結合性断片あるいはその修飾体、又は、本発明の分子、例えば、多重特異性分子をリポソーム中に含有せしめたイムノリポソーム、抗体とリポソームとが結合してなる抗体修飾体（米国特許第６２１４３８８号等）を含有する医薬組成物も、本発明の医薬組成物に含まれる。
賦形剤や担体は、通常液体又は固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与又は非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等を挙げることができる。
緩衝剤としては、医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。
本発明の医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。凍結乾燥製剤を挙げることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。
本発明の医薬組成物の投与径路としては、経腸投与、局所投与及び非経口投与のいずれでもよく、対象となる疾患によって、好適な投与経路を選択すればよい。具体的には、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等を挙げることができる。
かかる医薬組成物の組成は、投与方法、抗体のＣＤ３蛋白質結合親和性等に応じて決定することができる。
本発明は抗ＣＤ３抗体、その抗原結合性断片あるいはその修飾体、又は、本発明の分子、例えば、多重特異性分子の投与量は、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該抗体のＣＤ３蛋白質結合親和性又はその生物活性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、又は１日２回若しくは３回以上投与することができる。
医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
本発明は抗ＣＤ３抗体、その抗原結合性断片あるいはその修飾体、及び／又は、それらを含む本発明の分子、例えば多重特異性分子(以下、抗ＣＤ３抗体等と記す)は、他剤と組み合わせて用いることができる。抗ＣＤ３抗体等、又はそれを有効成分として含む医薬組成物は、他剤、すなわち抗ＣＤ３抗体等以外の薬剤を有効成分として含む医薬組成物と同時にあるいは個別に投与することができる。例えば、他剤を投与した後に抗ＣＤ３抗体等を有効成分として含む医薬組成物を投与するか、抗ＣＤ３抗体等を有効成分として含む医薬組成物を投与した後に、他剤を投与するか、又は、抗ＣＤ３抗体等を有効成分として含む医薬組成物と他剤とを同時に投与してもよい。単一の医薬組成物中に抗ＣＤ３抗体等及び他剤の両方の有効成分が含まれる場合と、両有効成分が複数の医薬組成物に分かれて含まれる場合のいずれも、本発明においては「抗ＣＤ３抗体等及び他剤を含む医薬組成物」という。本発明において、かかる「医薬組成物」は「抗ＣＤ３抗体等と他剤を組み合わせて投与される医薬組成物」と同義である。
本発明において、抗ＣＤ３抗体等と他剤を「組み合わせて投与される」とは、ある一定
期間において、被投与対象の体内に、抗ＣＤ３抗体等と他剤が取り込まれることを意味する。抗ＣＤ３抗体等と他剤が単一製剤中に含まれた製剤が投与されてもよく、またそれぞれが別々に製剤化され、別々に投与されても良い。別々に製剤化される場合、その投与の時期は特に限定されず、同時に投与されてもよく、時間を置いて異なる時間に、又は、異なる日に、投与されても良い。抗ＣＤ３抗体等と他剤が、それぞれ異なる時間又は日に投与される場合、その投与の順番は特に限定されない。通常、それぞれの製剤は、それぞれの投与方法に従って投与されるため、それらの投与は、同一回数となる場合もあり、異なる回数となる場合もある。また、それぞれが別々に製剤化される場合、各製剤の投与方法（投与経路）は同じであってもよく、異なる投与方法（投与経路）で投与されてもよい。また、抗ＣＤ３抗体等と他剤が同時に体内に存在する必要は無く、ある一定期間（例えば一ヶ月間、好ましくは１週間、さらに好ましくは数日間、さらにより好ましくは１日間）の間に体内に取り込まれていればよく、いずれかの投与時にもう一方の有効成分が体内から消失していてもよい。
「抗ＣＤ３抗体等と他剤を組み合わせて投与される医薬組成物」の投与形態としては、例えば、１）抗ＣＤ３抗体等と他剤を含む単一の製剤の投与、２）抗ＣＤ３抗体等と他剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、３）抗ＣＤ３抗体等と他剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、４）抗ＣＤ３抗体等と他剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、５）抗ＣＤ３抗体等と他剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与などを挙げることができる。「抗ＣＤ３抗体等と他剤を組み合わせて投与される医薬組成物」の投与量、投与間隔、投与形態、製剤等は、抗ＣＤ３抗体を含有する医薬組成物のそれらに準ずるが、それらに限定されるものではない。
かかる医薬組成物は、それが２種の異なる製剤にされた場合には、それらを含むキットであってもよい。
本発明において、抗ＣＤ３抗体等及び他剤の「組合せ」とは、抗ＣＤ３抗体等及び他剤を「組み合わせて投与される」ことを意味する。
本発明の組合せ又は医薬組成物には、さらに他の医薬を使用することができる。
本発明はＣＤ３に関わる疾患の治療方法又は予防方法、該疾患の治療用又は予防用医薬組成物を調製するための本発明の抗体の使用、該疾患の治療又は予防のための本発明の抗体の使用、をも提供する。本発明の抗体を含む治療用又は予防用キットも本発明に含まれる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
（実施例１）ラット抗ヒトＣＤ３抗体の作製
１）－１ ヒトＣＤ３εδ発現ベクターの構築
Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によりＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒに改変したコントロールベクターｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴを作製した。図１（配列番号１）に示すヒトＣＤ３ε蛋白質（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０００７２４．１）をコードするｃＤＮＡはＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌより購入し、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴベクターにクローニングしｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１を構築した。図２（配列番号２）に示すヒトＣＤ３δ蛋白質（ＮＰ＿０００７２３．１）をコードするｃＤＮＡは、当業者に公知な方法に従いヒトＴ細胞由来ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にクローニングすることで発現ベクターｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１を構築した。各発現ベクターの大量調製には、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。
１）－２ 免疫
免疫にはＷＫＹ／Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）を使用した。まずラット両足下腿部をＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）にて前処理後、同部位に実施例１）－ １で作製したｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを筋注した。続けて、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ社）を使用し、２ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。約二週間に一度、同様のインビボエレクトロポレーションを繰り返した後、ラットのリンパ節又は脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
１）－３ ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマＳＰ２／０－ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ, Ｎｏ.ＣＲＬ－１ ５８１）とをＬＦ３０１ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｕｎｉｔ（ＢＥＸ社）を用いて電気細胞融合し、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーをＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて培養し、得られたハイブリドーマ培養上清を用いて抗ヒトＣＤ３抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
１）－４ Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法による抗体スクリーニング
１）－４－１ Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ用抗原遺伝子発現細胞の調製
ＨＥＫ２９３α細胞（インテグリンαｖ及びインテグリンβ３を発現するＨＥＫ２９３由来の安定発現細胞株） を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中７．５×１０５細胞／ｍＬになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた形質移入手順に従い、ｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１、もしくはコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴを導入し、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ分注し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡに使用した。
１）－４－２ Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ
実施例１）－ ４－ １で調製した発現ベクター導入ＨＥＫ２９３α細胞の培養上清を除去後、ｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１、又はｐｃＤ
ＮＡ３．１－ＤＥＳＴ導入ＨＥＫ２９３α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ， ＨＲＰ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｗｈｏｌｅ Ａｂ Ｇｏａｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加えて、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５ Ｍ クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム・１２水 ｐＨ４．５）にｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するヒトＣＤ３に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴ導入ＨＥＫ２９３α細胞と比較し、ｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター導入ＨＥＫ２９３α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ヒトＣＤ３抗体産生陽性として選択した。
１）－５ ヒトＴ細胞活性化による抗体スクリーニング
得られたハイブリドーマが産生する抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞の活性化を、ＣＤ６９活性化マーカーの検出を指標に評価した。ヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ,Ｎｏ.ＴＩＢ－１５２）を、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中５×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製して、９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１００μＬずつ播種した。遠心して上清を除去したＪｕｒｋａｔ細胞に、実施例１）－４のＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡで抗ヒトＣＤ３抗体産生陽性として選択したハイブリドーマの培養上清、あるいはラットＩｇＧアイソタイプコントロール抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔａｍｓ社）終濃度５μｇ／ｍＬを添加し、３７℃で３０分間静置した。その後、クロスリンカーＧｏａｔ Ａｎｔｉ－ｒａｔ ＩｇＧ ＦｃγＦｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を終濃度１０μｇ／ｗｅｌｌで添加し３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、上清を除去し、ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄後、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ６９抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加して４℃で３０分間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行った。ＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成し、ラットＩｇＧアイソタイプコントロール抗体の蛍光強度ヒストグラムに対しＰＥの蛍光強度のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをヒトＴ細胞活性化能陽性抗ヒトＣＤ３抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
１）－６ フローサイトメトリーによるヒト又はサルＣＤ３への選択的結合性スクリーニング
１）－６－１ ヒト抗原遺伝子発現細胞の調製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（ＴＡＫＡＲＡ社,Ｃａｔ＃６３２１８０）を５．３×１０４細胞／ｃｍ２になるよう２２５ｃｍ２フラスコに播種し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１又は、コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴをそれぞれＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で処理し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
１）－６－２ ヒトＣＤ３への結合性フローサイトメトリー解析
実施例１）－５でヒトＴ細胞活性化能陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトＣＤ３に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例１）－６－１で調製したＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。ｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞及びｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴ導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ
ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社）を加えて懸濁し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ ７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターで検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏで行った。７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴ導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しｈＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをヒトＣＤ３に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
１）－６－３ サルＣＤ３εδ発現ベクターの構築
サルＣＤ３ε蛋白質（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１２７０５４４．１）及びサルＣＤ３δ蛋白質（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１２７４６１７．１）をコードするｃＤＮＡは、当業者に公知な方法に従いサルＴ細胞由来ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にクローニングすることで発現ベクターｃｙｎｏＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｃｙｎｏＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１を構築した。
１）－６－４ サル抗原遺伝子発現細胞の調製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を５．３×１０４細胞／ｃｍ２になるよう２２５ｃｍ２フラスコに播種し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｃｙｎｏＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｃｙｎｏＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１又は、コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴをそれぞれＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて導入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで処理し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
１）－６－５ サルＣＤ３への結合性フローサイトメトリー解析
実施例１）－６－２でヒトＣＤ３に結合する抗体産生ハイブリドーマと判定されたハイ
ブリドーマが産生する抗体のサルＣＤ３に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例１）－６－４で調製したＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。ｃｙｎｏＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｃｙｎｏＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞及びｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴ導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを加えて懸濁し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ ７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄを含む５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターで検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏで行った。７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴ導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しｃｙｎｏＣＤ３ε－ｐｃＤＮＡ３．１及びｃｙｎｏＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをサルＣＤ３に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
１）－６－６ ヒトＣＤ３δ遺伝子発現細胞の調製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞を５．３×１０４細胞／ｃｍ２になるよう２２５ｃｍ２フラスコに播種し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１又は、コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴをそれぞれＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで処理し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
１）－６－７ ヒトＣＤ３δへの結合性フローサイトメトリー解析
実施例１）－６－５でサルＣＤ３に結合する抗体産生ハイブリドーマと判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトＣＤ３δに対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例１）－６－６で調製したＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。ｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞及びｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴ導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを加えて懸濁し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ ７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄを含む５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターで検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏで行った。７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１－ＤＥＳＴ導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しｈＣＤ３δ－ｐｃＤＮＡ３．１導入Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをヒトＣＤ３δに結合する抗体産生ハイブリドーマとして除外した。
１）－６－８ サルＴ細胞株への結合性フローサイトメトリー解析
実施例１）－６－７で除外されなかった抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体のサルＴ細胞株への結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。カニクイザルＴ細胞株であるＨＳＣ－Ｆ（ＪＣＲＢ細胞バンク,Ｎｏ.ＪＣＲＢ１１６４）を、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中５×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製して、９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１００μＬずつ播種した。遠心して上清を除去したＨＳＣ－Ｆ細胞に、実施例１）－５－ ７で除外されなかった抗体産生ハイブリドーマの培養上清、あるいはラットＩｇＧアイソタイプコントロール抗体を添加し、４℃で１時間静置した。その後、上清を除去し、ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで３回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ ７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄを含む５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターで検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏで行った。７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成し、ラットＩｇＧアイソタイプコントロール抗体の蛍光強度ヒストグラムに対しＦＩＴＣの蛍光強度のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをサルＴ細胞株にも結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
１）－７ 抗体のアイソタイプ決定
実施例１）－６で取得したラット抗ＣＤ３抗体産生ハイブリドーマの中から、ヒト及びサルＣＤ３εに結合し、サルＴ細胞株にも結合、ならびに高いヒトＴ細胞活性化能を有することが示唆されたＣ３－１４７を選抜し、抗体アイソタイプを同定した。アイソタイプは、Ｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により決定された。その結果、ラット抗ＣＤ３モノクローナル抗体Ｃ３－１４７のアイソタイプはＩｇＧ２ｂ、λ鎖であることが確認された。
（実施例２）ラット抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｃ３－１４７）のヒトＣＤ３への結合性検討
２）－１ ハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体の調製
２）－１－１ Ｃ３－１４７を産生するハイブリドーマの培養
ラット抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。まず、Ｃ３－１４７産生ハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で十分量まで増殖させた後、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２０％添加した、５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）含有Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に培地交換し、７日間培養した。本培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を通して滅菌した。
２）－１－２ 精製
実施例２）－１－１で調製したハイブリドーマの培養上清から抗体をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーで精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に抗体を吸着させ、ＰＢＳでカラムを洗浄後に０．１Ｍ グリシン／塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出した。溶出液に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えてｐＨ７．０～７．５に調整した後に、Ｃｅｎｔｒｉ
ｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ３０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にてＰＢＳへのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を２ｍｇ／ｍＬに調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
２）－２ 取得ラット抗ＣＤ３抗体（Ｃ３－１４７）のヒト一本鎖抗原への結合
２）－２－１ ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原の調製
ＣＤ３εあるいはＣＤ３γをコードするアミノ酸配列は蛋白質データバンクに投稿されたＯＴＫ３－ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原複合体の結晶構造（ＰＤＢＩＤ：１ＳＹ６）において用いられた配列を用いた。ＣＤ３εのカルボキシル末端とＣＤ３γのアミノ末端をつなぐリンカーは参考文献（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．， （２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ３０２，８９９－９１６）で報告されたものと同じ２６アミノ酸から成るペプチドリンカーを用いた。図３（配列番号４）に示すヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原をコードする遺伝子は５‘末端、３’末端それぞれに制限酵素サイトＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ IIIを付加させて合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。プラスミドｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社）を制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ IIIで消化して得られる約４．８ｋｂのフラグメントと、ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原遺伝子をＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ IIIで消化して得られる約０．６ｋｂのフラグメントをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて結合させ、大腸菌発現用プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ｓｃＣＤ３εγを作製した。生成するｓｃＣＤ３εγのアミノ酸配列は、図４（配列番号５）に記載されている。発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現用プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ｓｃＣＤ３εγで形質転換し、得られたコロニーを１Ｌ ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）／Ｕｌｔｒａｙｉｅｌｄフラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ社）に植菌し、３０℃、２５０ ｒｐｍで２１時間振盪培養した。培養後の菌体を回収し、１％Ｔｒｉｔｏｎ溶液を含むＴｒｉｓ緩衝液存在下で超音波ホモジナイザーによる菌体破砕と凍結融解を繰り返し、最終的に４℃、１５０００ ｒｐｍ、１５分間遠心して、インクルージョンボディを回収した。インクルージョンボディーからの巻き戻しから精製までは参考文献（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４） ＰＮＡＳ ｖｏｌ． １０１， ｎｏ． ２０，７６７５－７６８０）の手法に従って行なった。ただし、抗体カラムに用いた抗ＣＤ３抗体は文献で用いられた２Ｃ１１ではなく、マウス抗ＣＤモノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｓｇｒｏ、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ
１０５（１９９５）、２３～２９、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ、Ｊａｎｓｓｅｎ－Ｃｉｌａｇ社）を用いた。
２）－２－２ ＳＰＲによるヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原への結合性
抗体と抗原との結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用し、固定化した抗マウスＩｇＧ抗体に抗体をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて測定した。抗原には、２）－２－１にて調製したヒトＣＤ３εγを使用した。抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）は、センサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）へアミンカップリング法にて約１１０００ＲＵ共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を用いた。抗マウスＩｇＧ抗体を固定化したチップ上に、抗体を約１分間添加しリガンドとして捕捉した後、１００ｎＭの抗原を流速３０μｌ／分で１２０秒間添加し、抗原の結合をモニターした。再生溶液として、１０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ ｐＨ１．７を流速１０μｌ／分で３分間添加した。その結果、Ｃ３－１４７では、１２０秒後の結合シグナルは３４ＲＵであった。
２）－３ ＳＰＲによる取得ラット抗ＣＤ３抗体（Ｃ３－１４７）の抗原結合部位の確認
抗原結合部位の確認方法は、２）－２－２に準じた。その結果、Ｃ３－１４７では、３４ＲＵの結合シグナルを得た。一方、比較例として、公知の抗ＣＤ３抗体であるＳＰ３４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）についても同様に抗原結合部位の確認を行った。ＳＰ３４では、３４ＲＵの結合シグナルが見られなかった。従って、Ｃ３－１４７が認識するＣＤ３εγ表面の結合部位は、ＳＰ３４とは異なることが示された。
（実施例３） ラット抗ＣＤ３抗体（Ｃ３－１４７）の可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列の決定
ラット抗ＣＤ３抗体（Ｃ３－１４７）の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、以下の方法により決定した。
３）－１ ｃＤＮＡ合成
ラット抗ＣＤ３抗体（Ｃ３－１４７）産生ハイブリドーマの細胞溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＬｉＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、０．５％ドデシル硫酸Ｌｉ（ＬｉＤＳ）、２．５ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ））を、オリゴｄＴ２５が結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の磁気ビーズと混合し、ｍＲＮＡを磁気ビーズに結合させた。次に磁気ビーズをｍＲＮＡ洗浄溶液Ａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＬｉＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＬｉＤＳ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）とｃＤＮＡ合成用溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１．２ｕｎｉｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で１回ずつ洗浄した後、１２ｕｎｉｔ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加えたｃＤＮＡ合成用溶液でｃＤＮＡ合成を行った。続いて３’テーリング反応溶液（５０ｍＭ リン酸カリウム、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１．２ｕｎｉｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で洗浄した後、４８ｕｎｉｔ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を加えた反応溶液で３’テーリング反応を行った。
３）－２ ラット免疫グロブリン重、軽鎖可変領域遺伝子断片の増幅及び配列決定
磁気ビーズをＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）にて洗浄後、５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲ法を用いてラット免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子の増幅を行った。即ち、磁気ビーズをＰＣＲ反応溶液（０．２μＭ プライマー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２５ｕｎｉｔ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社））に移し、９４℃ ３０秒－６８℃ ９０秒の反応を３５サイクル行った。用いたプライマーセットは下記の通りである。
重鎖遺伝子増幅用 ＰＣＲプライマーセット
センスプライマー Ｎｈｅ－ｐｏｌｙＣ－Ｓ
５’－ＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＤＮ－３’図５（配列番号５０）
1回目アンチセンスプライマー ｒＩｇγ－ＡＳ１
５’－ＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＧＣＣＣ－３’図６（配列番号５１）
２回目アンチセンスプライマー ｒＩｇγ－ＡＳ２
５’－ＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＣＣ－３’図７（配列番号５２）
軽鎖遺伝子増幅用 ＰＣＲプライマーセット
センスプライマー Ｎｈｅ－ｐｏｌｙＣ－Ｓ２
５’－ＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＤＮ－３’図８（配列番号５３）
１回目アンチセンスプライマー ｒＩｇＬ－ＡＳ１
５’－ＴＴＣＣＡＣＡＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＡＧＡＡＡＴＣＡＧ－３’図９（配列番号５４）
２回目アンチセンスプライマー ｒＩｇγ－ＡＳ２
５’－ＴＡＡＣＡＣＣＡＧＧＧＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴ－３’図１０（配列番号５５）
上記ＰＣＲ反応により増幅した断片について、塩基配列のシーケンス解析を実施した。用いたプライマーは下記の通りである。
重鎖シーケンス用センスプライマー ｒＩｇγ－ｓｅｑ
５’－ＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡＧＣＣ－３’図１１（配列番号５６）、
軽鎖用シーケンス用アンチセンスプライマー ｒＩｇＬ－ｓｅｑ１
５’－ＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＴ－３’図１２（配列番号５７）
軽鎖用シーケンス用アンチセンスプライマー ｒＩｇＬ－ｓｅｑ２
５’－ＧＣＣＴＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＡＧＣ－３’図１３（配列番号５８）
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて実施し、シークエンス反応は、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＧｅｎｅＡｍｐ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
シーケンス解析により決定されたＣ３－１４７重鎖可変領域の塩基配列を図１４（配列番号６）、アミノ酸配列を図１５（配列番号７）、Ｃ３－１４７軽鎖可変領域の塩基配列を図１６（配列番号８）、アミノ酸配列を図１７（配列番号９）にそれぞれ記す。
（実施例４） ラット抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０００）、及びそのヒト化体（Ｃ３Ｅ－７０３４）の作製
４）－１ ラット抗ＣＤ３抗体（Ｃ３－１４７） ｓｃＦｖの作製
４）－１－１ ラット抗体ＣＤ３ ｓｃＦｖ発現ベクター（ｐＣ３Ｅ－７０００）の構築
Ｃ３－１４７重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の間に挿入するリンカーをコードするＤＮＡ配列の前後に１５塩基の付加配列を有するＤＮＡ断片のセンス鎖オリゴヌクレオチド図１８（配列番号１０）及び、そのアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド図１９（配列番号１１）を合成し（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社 カスタムオリゴ受託合成サービス）、１００ ｐｍｏｌ／μＬに調整した後、それぞれ２０μＬずつ混合し、９６℃で１０分、７０℃で２分、６０℃で２分、４０℃で２分、３０℃で２分静置することにより、両者をアニーリングさせＶＨとＶＬの間に挿入するリンカー断片を作製した。次に動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ－３．３ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）由来のベクター骨格にヒトＩｇＧ重鎖シグナル配列を付加するようにＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片と、図１４（配列番号６）に示すラット抗ＣＤ３抗体Ｃ３－１４７のＶＨをＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片、ＶＨとＶＬの間に挿入するリンカー断片、図１６（配列
番号８）に示すＣ３－１４７のＶＬを含む領域にＦＬＡＧ－ＨｉｓタグをコードするＤＮＡ配列をカルボキシル末端に付加させＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ
ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合させ、図２０（配列番号１４）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むｓｃＦｖ発現ベクターｐＣ３Ｅ－７０００を作製した。
４）－１－２ ラット抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０００）の発現・精製
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）はマニュアルに従い、継代、培養を行った。対数増殖期のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に上記のｓｃＦｖ発現ベクターを導入して一過性発現させ、フィルターろ過した後、精製に用いた。精製はＨｉｓ Ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたＮｉアフィニティークロマトグラフィーと、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたゲルろ過の２段階工程で行い、ｓｃＦｖモノマー分子量に相当するピークを回収し、精製蛋白質サンプルとした。精製にはＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムを用い、全ての工程を4℃下で行なった。精製蛋白質のバッファーはＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ５．０）を用いた。精製蛋白質サンプルは分析用ＳＥＣに供し、純度と濃度を決定したのち、各種アッセイに用いた。Ｃ３Ｅ－７０００のアミノ酸配列は、図２１（配列番号１５）に記載されている。
４）－２ ラット抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０００）のヒト化
４）－２－１ 抗ＣＤ３抗体のヒト化設計
ラット抗体の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１－１５３，（１９９１））に従い、市販の蛋白質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ３．５（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。
ヒト化はＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、ＫＡＢＡＴ ｅｔ ａｌ． （Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．
Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されるヒトのサブグループ・コンセンサス配列やＧｅｒｍｌｉｎｅ配列からフレームワーク領域内のアミノ酸同一性や期待される免疫原性予測スコアや物性などに基づいて選択された。また、上記の手法で構築した３次元構造モデルを利用して、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ（１９８９）８６，１００２９－１００３３）によって与えられる基準などを参考に、戻し変異を選択した。
４）－２－２ Ｃ３Ｅ－７０００のヒト化アミノ酸配列の設計
実施例４）－２－１に記載の手法に基づき、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のγ３及びλ６をアクセプターとして、Ｃ３Ｅ－７０００のヒト化体となるＣ３Ｅ－７０３４のアミノ酸配列を設計した。図１５（配列番号７）に示されるＣ３－１４７ＶＨのアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１６番目のアルギニンをグリシンに、アミノ酸番号１７番目のアラニンをセリンに、アミノ酸番号１９番目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号２３番目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号２４番目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号８８番目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号９３番目のスレオニンをバリンに、置き換えることを伴い設計されたＣ３Ｅ－７０３４ＶＨのアミノ酸配列は、図２２（配列番
号１６）に記載されている。
図１７（配列番号９）に示されるＣ３－１４７ＶＬのアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１番目のグルタミンをアスパラギンに、アミノ酸番号３番目のバリンをメチオニンに、アミノ酸番号８番目のアスパラギンをヒスチジンに、アミノ酸番号１２番目のスレオニンをグルタミン酸に、アミノ酸番号１３番目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号１４番目のロイシンをプロリンに、アミノ酸番号１６番目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号１９番目のグルタミン酸をスレオニンに、アミノ酸番号２０番目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号４３番目のアルギニンをセリンに、アミノ酸番号７５番目のロイシンをセリンに、アミノ酸番号７９番目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８１番目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号８２番目のグルタミンをリジンに、置き換えることを伴い設計されたＣ３Ｅ－７０３４ＶＬのアミノ酸配列は、図２３（配列番号１７）に記載されている。
ＩＭＧＴのＣＤＲ定義におけるＣ３Ｅ－７０００及びＣ３Ｅ－７０３４のＣＤＲ配列はそれぞれ、ＣＤＲ－Ｈ１は図２４（配列番号２６）に、ＣＤＲ－Ｈ２は図２５（配列番号２７）に、ＣＤＲ－Ｈ３は図２６（配列番号２８）に、ＣＤＲ－Ｌ１は図２７（配列番号２９）に、ＣＤＲ－Ｌ２は図２８（配列番号３０）に、ＣＤＲ－Ｌ３は図２９（配列番号３１）に記載されている。
４）－２－３ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖＣ３Ｅ－７０３４の改変
サルＣＤ３εへの交差性を維持しつつ、結合活性や細胞傷害性活性に差を有するバリアントを作製するために、Ｃ３Ｅ－７０３４のＶＬに対して、実施例４）－２－１に記載の手法と同様にＶＬのフレームワーク領域のアミノ酸を、ｓｃＦｖのＶＬ（ＩＧＬＶ１－４０＊０１にＡ２Ｓ， Ｓ８Ｐ， Ｖ１３Ａ， Ｆ８０Ｌの４変異が入った配列）に置き換えたバリアントを設計した。
４）－２－３－１ Ｃ３Ｅ－７０３５のアミノ酸配列設計
Ｃ３Ｅ－７０３４の改変体となるＣ３Ｅ－７０３５のアミノ酸配列を設計した。図２３（配列番号１７）に示されるＣ３Ｅ－７０３４の軽鎖のうち可変領域のアミノ酸番号１番目のアスパラギンをグルタミンに、アミノ酸番号２番目のフェニルアラニンをアラニンに、アミノ酸番号３番目のメチオニンをバリンに、アミノ酸番号８番目のヒスチジンをセリンに、アミノ酸番号１２番目のグルタミン酸をグリシンに、アミノ酸番号１３番目のセリンをバリンに、アミノ酸番号１６番目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号１７番目のスレオニンをアルギニンに、アミノ酸番号４０番目のヒスチジンをロイシンに、アミノ酸番号４１番目のグルタミン酸をプロリンに、アミノ酸番号４３番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号４４番目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号４６番目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号４７番目のスレオニンをロイシンに、アミノ酸番号４８番目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号５７番目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号６０番目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号６７番目のイソロイシンをリジンに、アミノ酸番号６８番目のアスパラギン酸を欠損に、アミノ酸番号６９番目のアルギニンを欠損に、アミノ酸番号７１番目のセリンをグリシンに、アミノ酸番号７２番目のリジンをスレオニンに、アミノ酸番号７７番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号７９番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号８０番目のアスパラギンをグリシンに、アミノ酸番号８１番目のロイシンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８２番目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号８３番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号９０番目のフェニルアラニンをチロシンに、置き換えることを伴い設計されたＣ３Ｅ－７０３５軽鎖のアミノ酸配列は、図３０（配列番号２０）に記載されており、軽鎖の可変領域の直前にメチオニンとアラニンが挿入されたＣ３Ｅ－７０３５の全長配列は図３１（配列番号２２）に
記載されている。
４）－２－３－２ Ｃ３Ｅ－７０３６のアミノ酸配列設計
Ｃ３Ｅ－７０３４の改変体となるＣ３Ｅ－７０３６のアミノ酸配列を設計した。図２３（配列番号１７）に示されるＣ３Ｅ－７０３４の軽鎖のうち可変領域のアミノ酸番号８番目のヒスチジンをセリンに、アミノ酸番号１２番目のグルタミン酸をグリシンに、アミノ酸番号１３番目のセリンをバリンに、アミノ酸番号１６番目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号１７番目のスレオニンをアルギニンに、アミノ酸番号２３番目のリジンをスレオニンに、アミノ酸番号２４番目のアルギニンをグリシンに、アミノ酸番号４０番目のヒスチジンをロイシンに、アミノ酸番号４１番目のグルタミン酸をプロリンに、アミノ酸番号４３番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号４４番目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号４６番目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号４７番目のスレオニンをロイシンに、アミノ酸番号４８番目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号５７番目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号６０番目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号６７番目のイソロイシンをリジンに、アミノ酸番号６８番目のアスパラギン酸を欠損に、アミノ酸番号６９番目のアルギニンを欠損に、アミノ酸番号７１番目のセリンをグリシンに、アミノ酸番号７２番目のリジンをスレオニンに、アミノ酸番号７７番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号７９番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号８０番目のアスパラギンをグリシンに、アミノ酸番号８１番目のロイシンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８２番目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号８３番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号９０番目のフェニルアラニンをチロシンに、置き換えることを伴い設計されたＣ３Ｅ－７０３６軽鎖のアミノ酸配列は、図３２（配列番号２３）に記載されており、Ｃ３Ｅ－７０３６の全長アミノ酸配列は図３３（配列番号２５）に記載されている。
４）－２－３－３ ＣＤＲ改変体のアミノ酸配列設計
Ｃ３Ｅ－７０３４のＣＤＲＨ２（図２５、配列番号２７）に存在する脱アミノ化部位を除去する目的で、図２２（配列番号１６）に示されるＣ３Ｅ－７０３４の重鎖可変領域のアミノ酸番号５３番目のアスパラギンをアルギニンに置き換えたＣ３Ｅ－７０７８、およびセリンに置き換えたＣ３Ｅ－７０７９を設計した。また、Ｃ３Ｅ－７０３６の重鎖可変領域のアミノ酸番号５３番目のアスパラギンをアルギニンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８５を設計した。Ｃ３Ｅ－７０７８の全長アミノ酸配列は図_６８（配列番号６０）に、Ｃ３Ｅ－７０７９の全長アミノ酸配列は図７０（配列番号６２）に、Ｃ３Ｅ－７０８５の全長アミノ酸配列は図７２（配列番号６４）に記載されている。
さらにＣ３Ｅ－７０７８のヒトＣＤ３親和性を低下させる目的で、Ｃ３Ｅ－７０７８の軽鎖可変領域のアミノ酸番号５２番目のアスパラギン酸をグリシンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８６、グルタミンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８７、アスパラギンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８８、セリンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８９、アラニンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９０を設計した。同様に、Ｃ３Ｅ－７０７９のヒトＣＤ３親和性を低下させる目的で、Ｃ３Ｅ－７０７９の軽鎖可変領域のアミノ酸番号５２番目のアスパラギン酸をグリシンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９１、グルタミンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９２、アスパラギンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９３、セリンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９４、アラニンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９５を設計した。Ｃ３Ｅ－７０８６の全長アミノ酸配列は図７４（配列番号６６）に、Ｃ３Ｅ－７０８７の全長アミノ酸配列は図７６（配列番号６８）に、Ｃ３Ｅ－７０８８の全長アミノ酸配列は図７８（配列番号７０）に、Ｃ３Ｅ－７０８９の全長アミノ酸配列は図８０（配列番号７２）に、Ｃ３Ｅ－７０９０の全長アミノ酸配列は図８２（配列番号７４）に、Ｃ３Ｅ－７０９１の全長アミノ酸配列は図８４（配列番号７６）に、Ｃ３Ｅ－７０９２の全長アミノ酸配列は図８６（配列番号７８）に、Ｃ３Ｅ－７０９３の全長アミノ酸配列は図８８（配列番号８０）に、Ｃ３Ｅ－７０９４の全長アミノ酸配列
は図９０（配列番号８２）に、Ｃ３Ｅ－７０９５の全長アミノ酸配列は図９２（配列番号８４）に記載されている。
４）－３ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５， Ｃ３Ｅ－７０３６）の作製
４）－３－１ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０３４）発現ベクターｐＣ３Ｅ－７０３４の構築
図２２（配列番号１６）に示すＣ３Ｅ－７０３４重鎖のカルボキシル末端に１５アミノ酸フレキシブルリンカーを介して図２３（配列番号１７）に示すＣ３Ｅ－７０３４軽鎖を含む領域をつなげたｓｃＦｖＤＮＡ配列、及び前後１５塩基の付加配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。これを鋳型としてＣ３Ｅ－７０３４と前後の付加配列を含む領域をＰＣＲ法を用いて増幅し、インサートＤＮＡ断片を得た。また実施例４）－１－１で作製した発現ベクターｐＣ３Ｅ－７０００を鋳型として、ｓｃＦｖ領域を除いたベクター領域をＰＣＲ法を用いて増幅し、ベクター断片を得た。それぞれのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合させ、図３４（配列番号１８）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ発現ベクターｐＣ３Ｅ－７０３４を作製した。
４）－３－２ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０３５）発現ベクターｐＣ３Ｅ－７０３５の構築
図２２（配列番号１６）に示すＣ３Ｅ－７０３４重鎖のカルボキシル末端に１７アミノ酸から成るフレキシブルリンカーを介して図３０（配列番号２０）に示すＣ３Ｅ－７０３５軽鎖をつなげたｓｃＦｖＤＮＡ配列及び前後１５塩基の付加配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）－３－１と同様の方法で図３５（配列番号２１）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むＣ３Ｅ－７０３５発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ－７０３５」と命名した。
４）－３－２ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０３６）発現ベクターｐＣ３Ｅ－７０３６の構築
図２２（配列番号１６）に示すＣ３Ｅ－７０３４重鎖のカルボキシル末端に１５アミノ酸から成るフレキシブルリンカーを介して図３２（配列番号２３）に示すＣ３Ｅ－７０３６軽鎖をつなげたｓｃＦｖＤＮＡ配列及び前後１５塩基の付加配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）－３－１と同様の方法で図３６（配列番号２４）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むＣ３Ｅ－７０３６発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ－７０３６」と命名した。
４）－３－４ＣＤＲ改変ヒト化抗体ＣＤ３ ｓｃＦｖの発現ベクターの構築
図３４（配列番号１８）に示すＣ３Ｅ－７０３４のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むｐＣ３Ｅ－７０３４を鋳型とし、図９３、９４（配列番号８５、８６）に示す塩基配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲを用いた部位特異的変異導入を行い、Ｃ３Ｅ－７０３４の重鎖可変領域のアミノ酸番号５３番目のアスパラギンをアルギニンに置き換えたＣ３Ｅ－７０７８のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むＣ３Ｅ－７０７８発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ－７０７８」と命名した。同様にｐＣ３Ｅ－７０３４を鋳型とし、図９５、９６（配列番号８７、８８）をプライマーとして、ＰＣＲを用いた部位特異的変異導入を行い、Ｃ３Ｅ－７０３４の重鎖可変領域のアミノ酸番号５３番目のアスパラギンをセリンに置き換えたＣ３Ｅ－７０７９のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むＣ３Ｅ－７０７９発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ－７０７９」と命名した。同様にｐＣ３Ｅ－７０３６を鋳型とし、図９３，９４（配列番号８５、８６）をプライマーとして、ＰＣＲを用いた部位特異的変異導入を行い、Ｃ３Ｅ－７０３６の重鎖可変領域のアミノ酸番号５３番目のアスパラギンをアルギニンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８５のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むＣ３Ｅ－７０８５発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ－７０８５」と命名した。
Ｃ３Ｅ－７０７８の軽鎖可変領域のアミノ酸番号５２番目のアスパラギン酸をグリシンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８６、グルタミンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８７、アスパラギンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８８、セリンに置き換えたＣ３Ｅ－７０８９、アラニンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９０の各ヌクレオチド配列をＯＲＦに含む発現ベクター、およびＣ３Ｅ－７０７９の軽鎖可変領域のアミノ酸番号５２番目のアスパラギン酸をグリシンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９１、グルタミンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９２、アスパラギンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９３、セリンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９４、アラニンに置き換えたＣ３Ｅ－７０９５の各ヌクレオチド配列をＯＲＦに含む発現ベクターも同様の手法で作製した。作製したベクター名、テンプレート、プライマーの一覧を表１に、プライマーリストを図１０５にそれぞれまとめて記載した。
Figure 2023027374000001
４）－３－５ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの発現・精製
Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６の発現・精製は、実施例４）－１－２と同様の方法で行なった。
４）－３－６ ＣＤＲ改変ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの発現・精製
Ｃ３Ｅ－７０７８、Ｃ３Ｅ－７０７９、Ｃ３Ｅ－７０８５、Ｃ３Ｅ－７０８６、Ｃ３Ｅ－７０８７、Ｃ３Ｅ－７０８８、Ｃ３Ｅ－７０８９、Ｃ３Ｅ－７０９０、Ｃ３Ｅ－７０９１、Ｃ３Ｅ－７０９２、Ｃ３Ｅ－７０９３、Ｃ３Ｅ－７０９４、Ｃ３Ｅ－７０９５の各ＣＤＲ改変体の発現・精製は、実施例４）－１－２と同様の方法で行なった。
（実施例５） ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０３４）の結晶構造解析
５）－１ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０３４）－ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原複合体の調製
実施例２）－２－１で作製したＣＤ３εγと実施例４）－３－１で作製したＣ３Ｅ－７０３４をモル比１：２で混合し、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５ ＭＷＣＯ １０キロ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌに緩衝液を置換し、３．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。これをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、複合体の画分をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５ＭＷＣＯ １０キロ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて約４．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
５）－２ 結晶化
得られたＣＤ３εγとＣ３Ｅ－７０３４の複合体を蒸気拡散法により結晶化した。蛋白質溶液０．５μＬに沈殿剤溶液（０．１Ｍ ＭＥＳ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（ｐＨ ６．５）、１．６Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ、１０％ ｖ／ｖ １，４－Ｄｉｏｘａｎｅ）を等量加えた溶液を、０．０５ｍＬの沈殿剤溶液を入れた密閉容器に両溶液が触れ合わないように収め、２５℃で静置した。1ヶ月後に０．１ｍｍ×０．０５ｍｍ×０．０５ｍｍの棒状晶が得られた。
５）－３ Ｘ線結晶構造解析とエピトープの同定
得られた結晶をＰｅｒｆｌｕｏｒｏｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ＰＦＯ－Ｘ１７５／０８ （Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に浸し、続いて液体窒素で凍結した。ビームラインＢＬ４１ＸＵ （ＳＰｒｉｎｇ－８， Ｈｙｏｇｏ）にてＸ線回折デ―タを収集した。得られた回折像からソフトウェアｉｍｏｓｆｌｍ（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．４）を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。結晶は六方晶系で空間群はＰ６２、結晶の単位格子はａ＝１９３．５４ Å、ｂ＝１９３．５４ Å、ｃ＝４３．８８ Åであった。
得られた構造因子とホモロジーモデルの三次元構造座標を用いて分子置換法を行い、位相を決定した。計算にはソフトウェアｐｈａｓｅｒ（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．４）を使用した。結晶は非対称単位に1つの複合体を含んでいた。
ソフトウェアＲｅｆｍａｃ５（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．４）を用いて構造の精密化を行い、ソフトウェアｃｏｏｔを用いてモデルの修正を行った。この操作を繰り返し行い、３．３ Å分解能で最終のＲ値２２．１％、ｆｒｅｅ Ｒ値２７．０％を得た。最終のモデルはＣ３Ｅ－７０３４の軽鎖領域（図２３、配列番号１７）のアミノ酸残基１－１０８、Ｃ３Ｅ－７０３４の重鎖領域（図２２、配列番号１６）のアミノ酸残基１－１１８、ＣＤ３ε領域(図１、配列番号１)のアミノ酸残基３３－６７及び７１－１１８、及びＣＤ３γ領域（図３７、配列番号３）のアミノ酸残基２３－１０３を含む。ＣＤ３ε領域（図１、配列番号１）のアミノ酸残基６８－７０、及びＣ３Ｅ－７０３４ (図３８、配列番号１９)のアミノ末端領域(アミノ酸残基1)、リンカー部分（アミノ酸残基１２０－１３４）、及びカルボキシル末端領域（アミノ酸残基２４３－２６９）はそれぞれ電子密度が明瞭でなかったためモデル構築していない。図３９に複合体全体のリボンモデルと表面を示す。
図４０にＣＤ３εとＣ３Ｅ－７０３４の軽鎖及び重鎖との相互作用を示す。パネルＡはＣ３Ｅ－７０３４の軽鎖可変領域から４Å以内の距離にあるＣＤ３εのアミノ酸残基を太いスティックモデルで、それ以外のアミノ酸残基を細いスティックモデルで表示した図である。図中において四角内に残基名と残基番号が標識されたＳｅｒ５５、Ｇｌｕ５６、Ａｒｇ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｌｙｓ１０４、及びＰｒｏ１０５はＣ３Ｅ－７０３４の軽鎖可変領域から４Å以内の距離にあるＣＤ３εのアミノ酸残基であり、各アミノ酸番号は配列表の配列番号１に対応している。パネルＢはＣ３Ｅ－７０３４の重鎖可変領域から４Å以内の距離にあるＣＤ３εのアミノ酸残基を太いスティックモデルで、それ以外のアミノ酸を細いスティックモデルで表示した図である。図中において四角内に残基名と残基番号が標識されたＳｅｒ５５、Ｇｌｕ５６、Ｌｅｕ５８、Ｔｒｐ５９、Ａｓｎ６５、Ｉｌｅ６６、Ｓｅｒ７７、Ａｓｐ７８、及びＡｒｇ１０１はＣＤ３εのアミノ酸であり、各アミノ酸番号は配列表の配列番号１に対応している。Ｃ３Ｅ－７０３４から４Å以内の距離にあり、Ｃ３Ｅ－７０３４に対するＣＤ３εのエピトープと解釈されるアミノ酸残基は次のとおりであった：Ｓｅｒ５５、Ｇｌｕ５６、Ｌｅｕ５８、Ｔｒｐ５９、Ａｓｎ６５、Ｉｌｅ６６、Ｓｅｒ７７、Ａｓｐ７８、Ａｒｇ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｌｙｓ１０４、及びＰｒｏ１０５。
Ｃ３Ｅ－７０３４に対するＣＤ３εのエピトープのうち、Ａｒｇ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｌｙｓ１０４、及びＰｒｏ１０５はＯＫＴ３とＵＣＨＴ１に対するＣＤ３εの共通しエピトープ残基でもある（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０１ （２００４）， ｐ． ７６７５－８０； Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０１ （２００４）， ｐ． １６２６８－７３）。また、Ｃ３Ｅ－７０３４は、ＷＯ２００８／１１９５６５Ａ２に記載されているＩ２ＣやＨ２Ｃなどを含む抗ＣＤ３抗体のエピトープに該当する配列番号１におけるアミノ酸番号２２から４８とは、相互作用しないことが判明した。図４１ではＣＤ３εの配列上に相互作用残基を示す。ＣＤ３εのシグナル配列はイタリックで示し、Ｃ３Ｅ－７０３４から４Å以内の距離にあるアミノ酸に下線が引かれている。
（実施例６） ヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖの作製
６）－１ ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ発現ベクターｐＣ３Ｅ－３０００の構築
実施例４）－１－１と同様の手法でマウス抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｓｇｒｏ、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １０５（１９９５）、２３～２９、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ、Ｊａｎｓｓｅｎ－Ｃｉｌａｇ社）のｓｃＦｖを作製し、ｐｃＤＮＡ３．３由来動物細胞発現ベクターに導入した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ－３０００」と命名した。
６）－２ ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３０００）のヒト化アミノ酸配列の設計
実施例４）－２－１に記載の手法に基づき、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のｇａｍｍａ１及びｋａｐｐａ４をアクセプターとして、ＯＫＴ３のヒト化体となるＣ３Ｅ－３００７のアミノ酸配列を設計した。なお、免疫原性スコア及び物性への影響を勘案して、一部の箇所においてはｋａｐｐａ１のアミノ酸を導入した。図４２（配列番号３６）に示されるＯＫＴ３の重鎖のうち可変領域のアミノ酸番号５番目のグルタミンをバリンに、アミノ酸番号１１番目のロイシンをセリンに、アミノ酸番号１２番目のアラニンをリジンに、アミノ酸番号１３番目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号２０番目のメチオニンをバリンに、アミノ酸番号３８番目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号４０番目のアルギニンをアラニンに、アミノ酸番号４８番目のイソロイシンをメチオニンに、アミノ酸番号６７番目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号６８番目のアラニンをバリンに、アミノ酸番号７０番目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号７２番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号７６番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号８２番目のグルタミンをグルタミン酸に、アミノ酸番号８７番目のスレオニンをアルギニンに、アミノ酸番号９１番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号１１４番目のスレオニンをロイシンに、アミノ酸番号１１５番目のロイシンをバリンに、置き換えることを伴い設計されたＣ３Ｅ－３００７重鎖のアミノ酸配列は、図４３（配列番号３８）に記載されている。
図４４（配列番号３７）に示されるＯＫＴ３の軽鎖可変領域のうちアミノ酸番号３番目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号４番目のロイシンをメチオニンに、アミノ酸番号９番目のアラニンをセリンに、アミノ酸番号１０番目のイソロイシンをセリンに、アミノ酸番号１１番目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１２番目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号１３番目のアラニンをバリンに、アミノ酸番号１５番目のプロリンをロイシンに、アミノ酸番号１８番目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号１９番目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号２１番目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号３９番目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号４１番目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号４２番目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号５９番目のアラニンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号６０番目のヒスチジンをアルギニンに、アミノ酸番号６２番目のアルギニンをセリンに、アミノ酸番号６９番目のセリンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号７０番目のチロシンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号７１番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号７６番目のグリシンをセリンに、アミノ酸番号７７番目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号７８番目のグルタミン酸をグルタミンに、アミノ酸番号８２番目のアラニンをバリンに、アミノ酸番号９９番目のセリンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３番目のロイシンをバリンに、置き換えることを伴い設計されたＣ３Ｅ－３００７軽鎖のアミノ酸配列は図４５（配列番号３９）に記載されている。
６）－３ ヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７）発現ベクターｐＣ３Ｅ－３００７の構築
図４３（配列番号３８）に示すＣ３Ｅ－３００７重鎖のカルボキシル末端に１５アミノ酸フレキシブルリンカーを介して図４５（配列番号３９）に示すＣ３Ｅ－３００７軽鎖を含む領域をつなげたｓｃＦｖＤＮＡ配列及び前後１５塩基の付加配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例４）－３－１と同様の方法で図４６（配列番号３４）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むＣ３Ｅ－３００７発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ－３００７」と命名した。
６）－４ ヒト化ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７）の発現・精製
Ｃ３Ｅ－３００７の発現・精製は、実施例４）－１－２と同様の方法で行なった。Ｃ３Ｅ－３００７のアミノ酸配列は、図４７（配列番号３５）に記載されている。
（実施例７） ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性７）－ １ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６）のヒトＣＤ３との結合性検討
７）－１－１ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６）のフローサイトメトリーによるヒトＣＤ３への結合性検討
市販ヒトＰＢＭＣ（ＣＴＬ社）を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と抗ＣＤ１９抗体（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で６０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＰｅｎｔａ－Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＱＩＡＧＥＮ社）を３０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ(商標) ＩＩ：ＢＤ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行い、死細胞とＣＤ１９陽性細胞を除去した画分のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、ｓｃＦｖ添加サンプルのＭＦＩ値から抗体未添加サンプルのＭＦＩ値を引いて、ＭＦＩ値の相対値（ｒＭＦＩ）を計算した。図４８に示す通り、ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖはヒトＣＤ３に結合することが示された。
７）－１－２ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３
Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６）のＳＰＲによるヒトＣＤ３への結合性検討
ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６）のＣＤ３に対するアフィニティーはＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ－２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた表面プラズモン共鳴法により決定した。センサーチップ上に固定化したＣＤ３に異なる５つの濃度の該ｓｃＦｖを流し、得られたレスポンスからＲｍａｘを推定して、その１／２を与える抗体濃度を該ｓｃＦｖのＣＤ３に対する解離定数とした。その結果、該ｓｃＦｖのＣＤ３に対する解離定数はそれぞれ４００、４．５、２２、２５ｎＭであった。
７）－２ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３６）のカニクイザルＣＤ３との結合性検討
７）－２－１ カニクイザルＰＢＭＣの調製
ＳｅｐＭａｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）とＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社）を使用して、カニクイザルの血液からＰＢＭＣを定法に従い採取した。
７）－２－２ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６）のフローサイトメトリーによるカニクイザルＣＤ３への結合性検討
実施例７）－２－１で取得したカニクイザルＰＢＭＣを５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、実施例７）－１－１と同様の方法で染色、解析を実施した。図４９に示す通り、ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０３４、Ｃ３Ｅ－７０３５、Ｃ３Ｅ－７０３６）はカニクイザルＣＤ３に結合することが示された。
７）－３ ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４）のＴ細胞活性化
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ－Ｈ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社）を用いた濃度勾配密度分離法により、無作為のドナーの新鮮なバフィーコートより単離した。ＬＲ１０（１０％ ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））で１００ｎＭに希釈したヒ
ト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－３００７、Ｃ３Ｅ－７０３４）と、同濃度のＡｎｔｉ－Ｈｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）を同量混和した。ヒトあるいはサルＰＢＭＣをＬＲ１０にて２×１０５細胞に調製し、９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに、Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙを混和したヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖと同量混和し、３７℃で２４時間、５％ＣＯ２条件下にて培養した。反応終了後、遠心し、ｓｏｒｔｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＢＳＳ（―）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、０．１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、０．１％ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社））を添加し、遠心後、細胞にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、４℃で２０分静置した。Ｓｏｒｔｅｒ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ｓｏｒｔｅｒ ｂｕｆｆｅｒで希釈したＰＥラベル抗ＣＤ６９抗体（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）、ＦＩＴＣラベル抗ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を添加し、４℃で２０分静置した。Ｓｏｒｔｅｒ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、１％ ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ含有ＰＢＳ（和光純薬工業社）で再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行い、死細胞を除去した画分から、ＣＤ８高発現かつＰＥ高発現画分の割合を母集団からの百分率（％ ｏｆ ｐａｒｅｎｔｓ）として算出した。図５０に示す通り、ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖはヒト及びサルＣＤ８高発現細胞を活性化することが示された。
７）－４ ＣＤＲ改変ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのフローサイトメトリーによるヒト及びカニクイザルＣＤ３への結合性比較
実施例７）－１－１で取得したヒトＰＢＭＣ、及び７）－２－１で取得したカニクイザルＰＢＭＣを５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、実施例７）－１－１と同様の方法で染色、解析を実施した。図１０６で示す通り、ＣＤＲ改変ヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのヒト及びサルＣＤ３に対する結合性が確認された。
（実施例８） ヒト化抗ＴＲＯＰ２ ｓｃＦｖの作製
８）－１ ＨＴ１－１１ ｓｃＦｖ発現ベクターｐＨＴ１－１１ｓｃＦｖの構築
図５１（配列番号４１）に示すＨＴ１－１１ ｓｃＦｖのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐｃＤＮＡ－３．３ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）由来のベクターに合成したＤＮＡ断片を挿入することにより図５２（配列番号４０）に示すヌクレオチド配列をＯＲＦに含むヒト化抗ＴＲＯＰ２ ｓｃＦｖ発現ベクターｐＨＴ１－１１ｓｃＦｖを構築した。
８）－２ ＨＴ１－１１ ｓｃＦｖの発現・精製
ＨＴ１－１１ｓｃＦｖの発現・精製は、実施例４）－１－２と同様の方法で行なった。
（実施例９） ヒト化抗ＴＲＯＰ２ ｓｃＦｖ（ＨＴ１－１１ｓｃＦｖ）のフローサイトメトリーによるヒトＴＲＯＰ２への結合性評価
咽頭扁平上皮癌細胞株ＦａＤｕ（ＡＴＣＣ）と膵臓癌細胞株ＨＰＡＦ－ＩＩ（ＡＴＣＣ）を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したヒト化抗ＴＲＯＰ２ ｓｃＦｖ（ＨＴ１－１１ｓｃＦｖ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で６０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＰｅｎｔａ－Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を３０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ(商標) ＩＩ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏで行い、死細胞を除去した画分のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、ｓｃＦｖ添加サンプルのＭＦＩ値から抗体未添加サンプルのＭＦＩ値を引いて、ＭＦＩ値の相対値（ｒＭＦＩ）を計算した。図５３に示す通り、ヒト化抗ＴＲＯＰ２ ｓｃＦｖはヒトＴＲＯＰ２に結合することが示された。
（実施例１０） 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子の作製
１０）－１ 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの構築
１０）－１－１ ＨＴ１－１１ｓｃＦｖ／Ｃ３Ｅ－７０３４二重特異性分子（Ｔ２Ｃ－０００１）発現ベクターの構築
実施例８）－１で作製したｐＨＴ１－１１ｓｃＦｖを鋳型として５’側にＨＴ１－１１ｓｃＦｖとヒト抗体重鎖シグナル配列の一部、３’側にｓｃＦｖ間を繋ぐリンカーが付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、インサートＤＮＡ断片を得た。また４）－３－１で作製した発現ベクターｐＣ３Ｅ－７０３４を鋳型として、シグナル配列、及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのアミノ末端配列をコードするプライマーを用いてＰＣＲを行い、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むベクター全領域を含むベクターＤＮＡ断片を得た。それぞれのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合させ、図５４（配列番号４２）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターｐＴ２Ｃ－０００１を作製した。
１０）－１－２ ＨＴ１－１１ｓｃＦｖ／Ｃ３Ｅ－３００７二重特異性分子（Ｔ２Ｃ－０００３）発現ベクターの構築
実施例１０）－１－１と同様の方法で図５５（配列番号４４）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてｐＣ３Ｅ－３００７を用いた。得られた発現ベクターを「ｐＴ２Ｃ－０００３」と命名した。
１０）－１－３ ＨＴ１－１１ｓｃＦｖ／Ｃ３Ｅ－７０３５二重特異性分子（Ｔ２Ｃ－０００５）発現ベクターの構築
実施例１０）－１－１と同様の方法で図５６（配列番号４６）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてｐＣ３Ｅ－７０３５を用いた。得られた発現ベクターを「ｐＴ２Ｃ－０００５」と命名した。
１０）－１－４ ＨＴ１－１１ｓｃＦｖ／Ｃ３Ｅ－７０３６二重特異性分子（Ｔ２Ｃ－０００６）発現ベクターの構築
実施例１０）－１－１と同様の方法で図５７（配列番号４８）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてｐＣ３Ｅ－７０３６を用いた。得られた発現ベクターを「ｐＴ２Ｃ－０００６」と命名した。
１０）－２ 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子の発現・精製
Ｔ２Ｃ－０００１、Ｔ２Ｃ－０００３、Ｔ２Ｃ－０００５、Ｔ２Ｃ－０００６の発現・精製は、実施例４）－１－２と同様の方法で行なった。Ｔ２Ｃ－０００１のアミノ酸配列は、図５８（配列番号４３）に記載されている。Ｔ２Ｃ－０００３のアミノ酸配列は、図５９（配列番号４５）に記載されている。Ｔ２Ｃ－０００５のアミノ酸配列は、図６０（配列番号４７）に記載されている。Ｔ２Ｃ－０００６のアミノ酸配列は、図６１（配列番号４９）に記載されている。
（実施例１１） 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価
１１）－１ ＳＰＲによる結合活性評価
１１）－１－１ 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子のＴＲＯＰ２への結合
二重特異性分子とＴＲＯＰ２との結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用し、抗ヒトＩｇＧ抗体にて捕捉（キャプチャー）した抗原に対して、二重特異性分子をアナライトとして測定するキャプチャー法にて測定した。抗原は、組み換えヒトＴＲＯＰ－２／ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合体（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用した。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）は、センサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）へアミンカップリング法にて約２０００ＲＵ共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を用いた。二重特異性分子は、２００ｎＭから２倍希釈にて１ｎＭまで調製した。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化したチップ上に、１μｇ／ｍｌの抗原を約３０秒間添加した後、各濃度の二重特異性分子を流速３０μｌ／分で３００秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ塩化マグネシウム溶液を３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ， ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１．１）の １：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。
１１）－１－２ 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子のヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原への結合
二重特異性分子とＣＤ３εγ抗原との結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用し、固定化した抗原に対して、抗体をアナライトとして測定する方法にて測定した。抗原には、２）－２－１にて調製したヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原を使用し、センサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）へアミンカップリング法にて約１００ＲＵ共有結合させた。リファレンスセルには抗原蛋白を添加せず固定化処理のみ行った。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を用いた。二重特異性分子は、最高濃度１μＭから２倍希釈にて４ｎＭまで、あるいは２００ｎＭから２倍希釈にて１ｎＭまで調製した。抗原を固定化したチップ上に、各濃度の二重特異性分子を流速１０μｌ／分で２５分間添加し、結合量をモニターした。再生溶液として、１０ｍＭグリシン塩酸溶液ｐＨ１．５を３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ， ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１．１）を用いて、各濃度における結合量から解離定数ＫＤを算出した。結果を表２、表３に記載した。
Figure 2023027374000002
Figure 2023027374000003
１１）－２ フローサイトメトリーによる結合活性評価
１１）－２－１ 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子のＴＲＯＰ２への結合
実施例９と同様の癌細胞株を用いて、同様の方法で染色、解析を実施した。図６２に示す通り、抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子はＴＲＯＰ２に結合することが示された。
１１）－２－２ 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子のヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原への結合
実施例７）－１－１と同様の方法で染色、解析を実施した。図６３に示す通り、抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子はヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原に結合することが示された。
１１）－２－３ 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＣＤ３抗原への結合
実施例７）－２－１で取得したカニクイザルＰＢＭＣを５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、実施例７）－１－１と同様の方法で染色、解析を実施した。図６４に示す通り、抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子（Ｔ２Ｃ－０００１、Ｔ２Ｃ－０００５、Ｔ２Ｃ－０００６）はカニクイザルＣＤ３抗原に結合することが示された。
１１）－３ 抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子の細胞傷害活性評価
１１）－３－１ 標的細胞におけるＴＲＯＰ２の発現解析
咽頭扁平上皮癌細胞株ＦａＤｕ（ＡＴＣＣ）、膵臓癌細胞株ＨＰＡＦ－ＩＩ（ＡＴＣＣ）、及びヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ－６を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＴＲＯＰ２ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及びＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行い、死細胞除去画分のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の幾何学的平均蛍光強度（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ＭＦＩ）を算出した。図６５ （Ａ、Ｂ、Ｃ）に示す通り、ＦａＤｕ、及びＨＰＡＦ－ＩＩにおいてＴＲＯＰ２の発現が認められ、Ｃａｌｕ－６においては発現が認められなかった。
１１）－３－２ 標的細胞の調製
ＦａＤｕ、ＨＰＡＦ－ＩＩ、及びＣａｌｕ－６を１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、細胞懸濁液１ｍＬあたり１００μＬのＣｈｒｏｍｉｕｍ－５１ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２時間培養した。１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０５細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。
１１）－３－３ エフェクター細胞の調製
市販の凍結ＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を３７℃で解凍し、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＡｎｔｉ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈ試薬（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を添加した溶液に移して２回洗浄した後に１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６細胞／ｍＬになるよう調製し、エフェクター細胞とした。
１１）－３－４ 細胞傷害アッセイ
実施例１１）－３－２で取得したＦａＤｕ、ＨＰＡＦ－ＩＩ、及びＣａｌｕ－６を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに各濃度に調製した各種抗ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、１１）－３－１－３で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０００ｒｐｍ×１分間遠心後、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２０－２４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で約２時間乾燥させた後、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：バックグラウンド（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ培地を５０μＬ添加した。界面活性剤は１００μＬ添加し、サンプルウェルと同様に５０μＬ分をＬｕｍａＰｌａｔｅに移して測定を実施した。
図６６ （Ａ、Ｂ、Ｃ）に示す通り、ＦａＤｕ、及びＨＰＡＦ－ＩＩに対する各種ＴＲＯＰ２－ＣＤ３二重特異性分子の細胞傷害活性が示された）。一方Ｃａｌｕ－６に対する細胞傷害活性は認められなかった。
（実施例１２） 抗Ａｘｌ－ＣＤ３二重特異性分子の作製
１２）－１ 抗Ａｘｌ－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの構築
１２）－１－１ １１Ｄ５－Ｔ３ｓｃＦｖ／Ｃ３Ｅ－７０３４二重特異性分子（ＡＸＣ－０００１）発現ベクターの構築
ｈ＃１１Ｄ５－Ｔ３Ｈ（欧州特許出願公開第２２７００５３号明細書のＦｉｇｕｒｅ １２に記載）のＮ末端にグリシンを加えた配列と、ｈ＃１１Ｄ５－Ｔ３Ｌ（欧州特許出願公開第２２７００５３号明細書のＦｉｇｕｒｅ ６に記載）の配列を、（ＧＧＧＧＳ）を三回繰り返した配列からなるポリペプチドリンカーを介して連結した抗Ａｘｌ一本鎖抗体、１１Ｄ５－Ｔ３ｓｃＦｖのアミノ酸配列を設計し、これをコードするヌクレオチド配列を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ,ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）。これを鋳型として５‘側にヒト抗体重鎖シグナル配列の一部、３’側にｓｃＦｖ間を繋ぐリンカーが付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、インサートＤＮＡ断片を得た。また４）－３－１で作製した発現ベクターｐＣ３Ｅ－７０３４を鋳型として、ヒト抗体重鎖シグナル配列、及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むベクター全領域をＰＣＲ法により増幅し、ベクターＤＮＡ断片を得た。それぞれのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合させ、図９７（配列番号８９）に示すヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗Ａｘｌ－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターｐＡＸＣ－０００１を作製した。
１２）－１－２ １１Ｄ５－Ｔ３ｓｃＦｖ／Ｃ３Ｅ－７０３６二重特異性分子（ＡＸＣ－０００２）発現ベクターの構築
実施例１０）－１－１と同様の方法で図９９（配列番号９１）に示すヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗Ａｘｌ－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてｐＣ３Ｅ－７０３６を用いた。得られた発現ベクターを「ｐＡＸＣ－０００２」と命名した。
１２）－２ 抗Ａｘl－ＣＤ３二重特異性分子の発現・精製
ＡＸＣ－０００１、ＡＸＣ－０００２の発現・精製は、実施例４）－１－２と同様の方法で行なった。ＡＸＣ－０００１のアミノ酸配列は、図９８（配列番号９０）に記載されている。ＡＸＣ－０００２のアミノ酸配列は、図１００（配列番号９２）に記載されている。
（実施例１３） 抗Ａｘｌ－ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価
１３）－１ 標的細胞におけるＡｘｌの発現解析
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ）、ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ－１（ＡＴＣＣ）、ＭＩＡ ＰａＣａ－２（ＡＴＣＣ）、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６Ｂ１（ＡＴＣＣ）、マントル細胞リンパ腫細胞株Ｊｅｋｏ－１（ＡＴＣＣ）を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗Ａｘｌ抗体（ＲＤ－ＳＹＳＴＥＭＳ社）及びＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ＲＤ－ＳＹＳＴＥＭＳ社）を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行い、死細胞除去画分のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の幾何学的平均蛍光強度（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ＭＦＩ）を算出した。図１０７（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）に示す通り、Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１、及びＭＩＡ ＰａＣａ－２においてＡｘｌの発現が認められ、Ｕ２６６Ｂ１、Ｊｅｋｏ－１においては発現が認められなかった。
１３）－２ 標的細胞の調製
Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１、ＭＩＡ ＰａＣａ－２、Ｕ２６６Ｂ１、及びＪｅｋｏ－１を１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、細胞懸濁液１ｍＬあたり１００μＬのＣｈｒｏｍｉｕｍ－５１ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２時間培養した。１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０５細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。
１３）－３ エフェクター細胞の調製
市販の凍結ＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を３７℃で解凍し、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＡｎｔｉ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈ試薬（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を添加した溶液に移して２回洗浄した後に１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６細胞／ｍＬになるよう調製し、エフェクター細胞とした。
１３）－４ 細胞傷害アッセイ
実施例１３）－２で取得したＡ５４９、ＰＡＮＣ－１、ＭＩＡ ＰａＣａ－２、Ｕ２６６Ｂ１、及びＪｅｋｏ－１を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに各濃度に調製した各種抗Ａｘｌ－ＣＤ３二重特異性分子を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、１３）－３で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０００ｒｐｍ×１分間遠心後、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２０－２４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で約２時間乾燥させた後、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：バックグラウンド（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ培地を５０μＬ添加した。界面活性剤は１００μＬ添加し、サンプルウェルと同様に５０μＬ分をＬｕｍａＰｌａｔｅに移して測定を実施した。
図１０８ （Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）に示す通り、Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１、及びＭＩＡ
ＰａＣａ－２に対する各種抗Ａｘｌ－ＣＤ３二重特異性分子の細胞傷害活性が示された。一方Ｕ２６６Ｂ１、及びＪｅｋｏ－１に対する細胞傷害活性は認められなかった。
（実施例１４） 抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの作製
１４）－１ 抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの構築１４）－１－１ ＭＡＧ－０３２ｓｃＦｖ／Ｃ３Ｅ－７０３４二重特異性分子（ＭＧＣ－０００１）発現ベクターの構築
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１特異的に結合するＭＡＧ－０３２ ｓｃＦｖはヒト抗体ファージライブラリーより取得した。ＭＡＧ－０３２ ｓｃＦｖのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、５‘側にヒト抗体重鎖シグナル配列の一部、３’側にｓｃＦｖ間を繋ぐリンカー、及びＣ３Ｅ－７０３４の一部をコードするヌクレオチド配列が付加するようにデザインしたプライマーを用いたＰＣＲ法により、ＭＡＧ－０３２ ｓｃＦｖのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むインサートＤＮＡ断片を得た。また４）－３－１で作製した発現ベクターｐＣ３Ｅ－７０３４を鋳型として、ヒト抗体重鎖シグナル配列、及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのアミノ末端配列をコードするヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むベクター全領域をＰＣＲ法により増幅し、ベクターＤＮＡ断片を得た。それぞれのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合させ、図１０１（配列番号９３）に示すヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターｐＭＧＣ－０００１を作製した。
１４）－１－２ ＭＡＧ－０３２ｓｃＦｖ／Ｃ３Ｅ－７０３６二重特異性分子（ＭＧＣ－０００２）発現ベクターの構築
実施例１４）－１－１と同様の方法で図１０３（配列番号９５）に示すヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてｐＣ３Ｅ－７０３６を用いた。得られた発現ベクターを「ｐＭＧＣ－０００２」と命名した。
１４）－２ 抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子の発現・精製
ＭＧＣ－０００１、ＭＧＣ－０００２の発現・精製は、実施例４）－１－２と同様の方法で行なった。ＭＧＣ－０００１のアミノ酸配列は、図１０２（配列番号９４）に記載されている。ＭＧＣ－０００２のアミノ酸配列は、図１０４（配列番号９６）に記載されている。
（実施例１５） 抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価
１５）－１ 標的細胞におけるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１の発現解析
ヒトリンパ芽球細胞融合細胞株Ｔ２（ＡＴＣＣ）細胞を２０％ＦＢＳ含有ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で適当な濃度に調整し、図１０６（配列番号９７）ＭＡＧＥＣ１ペプチド（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ社）、もしくはＤＭＳＯを添加し、３７℃で４時間インキュベートした。２０％ＦＢＳ含有ＡＩＭ－Ｖ培地で２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１抗体（ＭＡＧ０３２ ｓｃＦｖ）を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＰｅｎｔａ－Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＱＩＡＧＥＮ社）を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行い、死細胞除去画分のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の幾何学的平均蛍光強度（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ＭＦＩ）を算出した。図１０９ （Ａ、Ｂ）に示す通り、ＭＡＧＥＣ１ペプチドを添加したＴ２細胞においてＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１の発現が認められ、ＤＭＳＯを添加したＴ２細胞においては発現が認められなかった。
１５）－２ 標的細胞の調製
Ｔ２細胞を２０％ＦＢＳ含有ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ社）で適当な濃度に調整し、ＭＡＧＥＣ１ペプチド、もしくはＤＭＳＯを添加し、３７℃で４時間インキュベートした。１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、細胞懸濁液１ｍＬあたり１００μＬのＣｈｒｏｍｉｕｍ－５１ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２時間培養した。１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０５細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。
１５）－３ エフェクター細胞の調製
市販の凍結ＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を３７℃で解凍し、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＡｎｔｉ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈ試薬（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を添加した溶液に移して２回洗浄した後に１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６細胞／ｍＬになるよう調製し、エフェクター細胞とした。
１５）－４ 細胞傷害アッセイ
実施例１５）－２で取得したＴ２細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに各濃度に調製した各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、１５）－３で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０００ｒｐｍ×１分間遠心後、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２０－２４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で約２時間乾燥させた後、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：バックグラウンド（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ培地を５０μＬ添加した。界面活性剤は１００μＬ添加し、サンプルウェルと同様に５０μＬ分をＬｕｍａＰｌａｔｅに移して測定を実施した。
図１１０（Ａ、Ｂ）に示す通り、ＭＡＧＥＣ１ペプチドを添加したＴ２細胞に対する各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＣ１－ＣＤ３二重特異性分子の細胞傷害活性が示された。一方ＤＭＳＯを添加したＴ２細胞に対する細胞傷害活性は認められなかった。
本発明のヒト化抗ＣＤ３抗体は、ヒトＣＤ３に結合するとともに、カニクイザルＣＤ３にも結合するため、医薬の開発のための非臨床試験に、好適に用いることができる。
配列番号１：ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列
配列番号２：ヒトＣＤ３δのアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＣＤ３γのアミノ酸配列
配列番号４：ヒトＣＤ３εγ一本鎖抗原をコードするヌクレオチド配列
配列番号５：Ｈｉｓ－ｓｃＣＤ３抗原のアミノ酸配列
配列番号６：Ｃ３－１４７の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号７：（Ｃ３－１４７＿ＶＨ ＡＡ）：Ｃ３－１４７の重鎖可変領域のアミノ酸配
列
配列番号８：（Ｃ３－１４７＿ＶＬ ＤＮＡ）：Ｃ３－１４７の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号９：（Ｃ３－１４７＿ＶＬ ＡＡ）：Ｃ３－１４７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０：（Ｇ４Ｓ ｌｉｎｋｅｒ センス）：
配列番号１１：（Ｇ４Ｓ ｌｉｎｋｅｒ アンチセンス）：
配列番号１２：（Ｃ３Ｅ－７０００＿ＶＨ ＡＡ）：Ｃ３Ｅ－７０００の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３：（Ｃ３Ｅ－７０００＿ＶＬ ＡＡ）：Ｃ３Ｅ－７０００の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４：（Ｃ３Ｅ－７０００ ＯＲＦ）：Ｃ３Ｅ－７０００をコードするヌクレオチド配列
配列番号１５：（Ｃ３Ｅ－７０００ ＡＡ）：Ｃ３Ｅ－７０００のアミノ酸配列
配列番号１６：（Ｃ３Ｅ－７０３４＿ＶＨ ＡＡ）：Ｃ３Ｅ－７０３４の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７：Ｃ３Ｅ－７０３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１８：（Ｃ３Ｅ－７０３４ ＯＲＦ）：Ｃ３Ｅ－７０３４をコードするヌクレオチド配列
配列番号１９：（Ｃ３Ｅ_７０３４ ＡＡ）：Ｃ３Ｅ－７０３４のアミノ酸配列
配列番号２０：（Ｃ３Ｅ－７０３５＿ＶＬ ＡＡ）：Ｃ３Ｅ－７０３５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１：（Ｃ３Ｅ－７０３５ ＯＲＦ）：Ｃ３Ｅ－７０３５をコードするヌクレオチド配列
配列番号２２：（Ｃ３Ｅ_７０３５ ＡＡ）：Ｃ３Ｅ－７０３５のアミノ酸配列
配列番号２３：（Ｃ３Ｅ－７０３６＿ＶＬ＿ＡＡ）：Ｃ３Ｅ－７０３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４：（Ｃ３Ｅ－７０３６ ＯＲＦ）：Ｃ３Ｅ－７０３６をコードするヌクレオチド配列
配列番号２５：（Ｃ３Ｅ_７０３６ ＡＡ）：Ｃ３Ｅ－７０３６のアミノ酸配列
配列番号２６：（７０００＿ＣＤＲ－Ｈ１）：Ｃ３Ｅ－７０００系のＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号２７：（７０００＿ＣＤＲ－Ｈ２）：Ｃ３Ｅ－７０００系のＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号２８：（７０００＿ＣＤＲ－Ｈ３）：Ｃ３Ｅ－７０００系のＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号２９：（７０００＿ＣＤＲ－Ｌ１）：Ｃ３Ｅ－７０００系のＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号３０：（７０００＿ＣＤＲ－Ｌ２）：Ｃ３Ｅ－７０００系のＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号３１：（７０００＿ＣＤＲ－Ｌ３）：Ｃ３Ｅ－７０００系のＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号３２：（Ｃ３Ｅ－３０００ ＯＲＦ）： ＯＫＴ３ ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列
配列番号３３：（Ｃ３Ｅ－３０００ ＡＡ）： ＯＫＴ３ ｓｃＦｖのアミノ酸配列
配列番号３４：（Ｃ３Ｅ－３００７ ＯＲＦ）： Ｃ３Ｅ－３００７ ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列
配列番号３５：（Ｃ３Ｅ－３００７ ＡＡ）: Ｃ３Ｅ－３００７ ｓｃＦｖのアミノ酸配列
配列番号３６：（Ｃ３Ｅ－３０００＿ＶＨ ＡＡ）: ＯＫＴ３の重鎖可変領域のアミノ
酸配列
配列番号３７：（Ｃ３Ｅ－３０００＿ＶＬ ＡＡ）: ＯＫＴ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３８：（Ｃ３Ｅ－３００７＿ＶＨ ＡＡ）： Ｃ３Ｅ－３００７の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３９：（Ｃ３Ｅ－３００７＿ＶＬ ＡＡ）： Ｃ３Ｅ－３００７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４０：（ＨＴ１－１１ ＯＲＦ）：ＨＴ１－１１ ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列
配列番号４１：（ＨＴ１－１１ ＡＡ）：ＨＴ１－１１ ｓｃＦｖのアミノ酸配列
配列番号４２：（Ｔ２Ｃ－０００１ ＯＲＦ）：Ｔ２Ｃ－０００１をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号４３：（Ｔ２Ｃ－０００１ ＡＡ）：Ｔ２Ｃ－０００１のアミノ酸配列
配列番号４４：（Ｔ２Ｃ－０００３ ＯＲＦ）：Ｔ２Ｃ－０００３をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号４５：（Ｔ２Ｃ－０００３ ＡＡ）：Ｔ２Ｃ－０００３のアミノ酸配列
配列番号４６：（Ｔ２Ｃ－０００５ ＯＲＦ）：Ｔ２Ｃ－０００５をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号４７：（Ｔ２Ｃ－０００５ ＡＡ）：Ｔ２Ｃ－０００５のアミノ酸配列
配列番号４８：（Ｔ２Ｃ－０００６ ＯＲＦ）：Ｔ２Ｃ－０００６をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号４９：（Ｔ２Ｃ－０００６ ＡＡ）：Ｔ２Ｃ－０００６のアミノ酸配列
配列番号５０：重鎖遺伝子増幅用 センスプライマーのアミノ酸配列
配列番号５１：重鎖遺伝子増幅用 1回目アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号５２：重鎖遺伝子増幅用 ２回目アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号５３：軽鎖遺伝子増幅用 センスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号５４：軽鎖遺伝子増幅用 １回目アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号５５：軽鎖遺伝子増幅用 ２回目アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号５６：重鎖シーケンス用センスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号５７：軽鎖シーケンス用アンチセンスプライマー１のヌクレオチド配列
配列番号５８：軽鎖シーケンス用 アンチセンスプライマー２のヌクレオチド配列
配列番号５９：Ｃ３Ｅ－７０７８をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号６０：Ｃ３Ｅ－７０７８のアミノ酸配列
配列番号６１：Ｃ３Ｅ－７０７９をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号６２：Ｃ３Ｅ－７０７９のアミノ酸配列
配列番号６３：Ｃ３Ｅ－７０８５をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号６４：Ｃ３Ｅ－７０８５のアミノ酸配列
配列番号６５：Ｃ３Ｅ－７０８６をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号６６：Ｃ３Ｅ－７０８６のアミノ酸配列
配列番号６７：Ｃ３Ｅ－７０８７をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号６８：Ｃ３Ｅ－７０８７のアミノ酸配列
配列番号６９：Ｃ３Ｅ－７０８８をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号７０：Ｃ３Ｅ－７０８８のアミノ酸配列
配列番号７１：Ｃ３Ｅ－７０８９をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号７２：Ｃ３Ｅ－７０８９のアミノ酸配列
配列番号７３：Ｃ３Ｅ－７０９０をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号７４：Ｃ３Ｅ－７０９０のアミノ酸配列
配列番号７５：Ｃ３Ｅ－７０９１をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号７６：Ｃ３Ｅ－７０９１のアミノ酸配列
配列番号７７：Ｃ３Ｅ－７０９２をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号７８：Ｃ３Ｅ－７０９２のアミノ酸配列
配列番号７９：Ｃ３Ｅ－７０９３をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号８０：Ｃ３Ｅ－７０９３のアミノ酸配列
配列番号８１：Ｃ３Ｅ－７０９４をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号８２：Ｃ３Ｅ－７０９４のアミノ酸配列
配列番号８３：Ｃ３Ｅ－７０９５をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号８４：Ｃ３Ｅ－７０９５のアミノ酸配列
配列番号８５：ＨＮ５３Ｒ Ｆｗのヌクレオチド配列
配列番号８６：ＨＮ５３Ｒ Ｒｖのヌクレオチド配列
配列番号８７：ＨＮ５３Ｓ Ｆｗのヌクレオチド配列
配列番号８８：ＨＮ５３Ｓ Ｒｖのヌクレオチド配列
配列番号８９：（ＡＸＣ－０００１ ＯＲＦ）：ＡＸＣ－０００１をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号９０：（ＡＸＣ－０００１ ＡＡ）：ＡＸＣ－０００１のアミノ酸配列
配列番号９１：（ＡＸＣ－０００２ ＯＲＦ）：ＡＸＣ－０００２をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号９２：（ＡＸＣ－０００２ ＡＡ）：ＡＸＣ－０００２のアミノ酸配列
配列番号９３：（ＭＧＣ－０００１ ＯＲＦ）：ＭＧＣ－０００１をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号９４：（ＭＧＣ－０００１ ＡＡ）：ＭＧＣ－０００１のアミノ酸配列
配列番号９５：（ＭＧＣ－０００２ ＯＲＦ）：ＭＧＣ－０００２をコードするＯＲＦヌクレオチド配列
配列番号９６：（ＭＧＣ－０００２ ＡＡ）：ＭＧＣ－０００２のアミノ酸配列
配列番号９７：（ＭＡＧＥＣ１ペプチド）：ＭＡＧＥＣ１ペプチドのアミノ酸配列
配列番号９８：（ＣＤＲＨ２ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔｓ）：ＣＤＲ改変体ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号９９：（ＣＤＲＬ２ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔｓ）：ＣＤＲ改変体ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号１００：（ＶＨ ｏｆ Ｃ３Ｅ－７０３４ ｖａｒｉａｎｔｓ）：Ｃ３Ｅ－７０３４のＣＤＲ改変体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０１：（ＶＬ ｏｆ Ｃ３Ｅ－７０３４ ｖａｒｉａｎｔｓ）：Ｃ３Ｅ－７０３４のＣＤＲ改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０２：（ＶＬ ｏｆ Ｃ３Ｅ－７０３５ ｖａｒｉａｎｔｓ）：Ｃ３Ｅ－７０３５のＣＤＲ改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０３：（ＶＬ ｏｆ Ｃ３Ｅ－７０３６ ｖａｒｉａｎｔｓ）：Ｃ３Ｅ－７０３６のＣＤＲ改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列

Claims (33)

  1. 重鎖配列が
    配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
    配列番号９８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び、
    配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；
    軽鎖配列が
    配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
    ＲＸａａＤ（図１１３）に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び、
    配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３
    をそれぞれ含み
    前記ＣＤＲＨ２の
    １番目のＸａａは、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、２番目のＸａａはＳであり、
    且つ、軽鎖可変領域配列が、配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列に含まれるＸａａは、（Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ａ）からなる群より選択されること又は軽鎖可変領域配列が、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列に含まれるＸａａは、Ｄであることを特徴とする、
    ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合することを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
  2. 重鎖可変領域配列が、配列番号１００に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
  3. 軽鎖可変領域配列が、配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列に含まれるＸａａは、（Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ａ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
  4. 軽鎖可変領域配列が、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列に含まれるＸａａは、Ｄであることを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
  5. ＩｇＧである請求項１乃至４のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
  6. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される請求項１乃至５のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
  7. ヒト免疫グロブリン定常領域を含むヒト化抗体である、請求項１乃至５のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
  8. 請求項１乃至７のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  10. 請求項８に記載のポリヌクレオチド若しくは請求項９に記載のベクターを含むか、又は請求項１乃至７のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を産生する細胞。
  11. 請求項１０に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトＣＤ３に結合する抗
    体又は該抗体の抗原結合性断片を回収する工程を含む、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片の製造方法。
  12. 請求項１１に記載の方法により得られる、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
  13. 請求項１乃至７及び１２のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を有効成分として含有する医薬組成物。
  14. 請求項１乃至７及び１２のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む抗原結合性を有する分子。
  15. 多重特異的である請求項１４に記載の分子。
  16. 請求項１乃至７及び１２のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、１つ又は２つ以上のさらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項１４又は１５に記載の分子。
  17. 該さらなる抗体の抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又は、ｓｄＡｂである、請求項１６に記載の分子。
  18. Ｆｃを含む請求項１７に記載の分子。
  19. 該さらなる抗体が、ヒト免疫グロブリン定常領域を含むヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１６乃至１８のいずれか１つに記載の分子。
  20. 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、請求項１乃至７及び１２のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる請求項１４乃至１９のいずれか１つに記載の分子。
  21. 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片の有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、リンカーとが結合しており、さらに該リンカーの有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、請求項１乃至７及び１２のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが結合してなる請求項２０に記載の分子。
  22. 請求項１乃至７及び１２のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片において、可変領域が、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合しており、あるいは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合しており、任意で：ｉ）両可変領域の間にリンカーを有し：ｉｉ）アミノ末端側の可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有し；ｉｉｉ）カルボキシル末端側の可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、ＦＬＡＧタグ、及び／又は、Ｈｉｓタグが結合している：請求項１４乃至２１のいずれか１つに記載の分子。
  23. 該さらなる抗体が抗癌標的抗体である請求項１６乃至２２のいずれかに記載の分子。
  24. 二重特異的である請求項１５乃至２３のいずれか１つに記載の分子。
  25. ポリペプチドである請求項１４乃至２４のいずれか１つに記載の分子。
  26. 請求項２５に記載の分子の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポ
    リヌクレオチド。
  27. 請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  28. 請求項２６に記載のポリヌクレオチド若しくは請求項２７に記載のベクターを含むか、又は、請求項２５に記載の分子を産生する細胞。
  29. 請求項２８に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトＣＤ３に結合する分子を回収する工程を含む、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する分子の製造方法
    。
  30. 請求項２９に記載の方法により得られる、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する分子。
  31. 請求項１４乃至２５及び３０のいずれか１つに記載の分子を有効成分として含有する医薬組成物。
  32. 標的細胞へのＴ細胞リダイレクションによって、該標的細胞への細胞傷害を誘導することを特徴とする請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 癌の治療又は予防剤である請求項１４乃至２５及び３０のいずれか１つに記載の分子又は請求項３１若しくは３２記載の医薬組成物。
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