TW202241944A - 新穎的抗ｇｒｅｍｌｉｎ１抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明在本文中提供抗gremlin1抗體或其抗原結合片段、編碼其之分離的聚核苷酸、包含其之醫藥組合物及其用途。

Description

新穎的抗GREMLIN1抗體
本發明大體上係關於與人類gremlin1特異性結合的新穎的抗gremlin1(GREM1)抗體。
Gremlin1(GREM1)為具有富含半胱胺酸的區域及半胱胺酸結的高度保守的分泌性蛋白質( Wordinger等人, 《實驗眼科研究( Exp Eye Res.)》 2008 年 8 月 ; 87(2): 78-79.)。其為成神經細胞瘤家族中差異篩選選擇的基因異常(differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma；DAN)的成員，其充當骨形態生成蛋白(bone morphogenetic protein；BMP)的拮抗劑( Wordinger等人 ,《實驗眼科研究》 2008 年 8 月 ; 87(2): 78-79.)。GREM1可與BMP-2、BMP-4或BMP-7物理結合以形成異二聚體且防止BMP配體與其對應BMP受體相互作用，且接著相繼地抑制BMP信號傳導路徑的活化。
GREM1與腎臟、肺、肝臟及視網膜的纖維化病灶以及若干腫瘤類型，包括胰臟癌、結腸癌、肺癌、神經膠質瘤、胃癌及***癌密切相關( Sneddon等人 ,《美國國家科學院院刊( PNAS)》 2006 年 10 月 ; 103(40): 14842-14847)。舉例而言，異常gremlin1上調賦予幹細胞生態位(stem cell niche)外部的結腸細胞具有致腫瘤性。亦發現腫瘤幹細胞高度表現且分泌gremlin1以維持其在神經膠質瘤中的幹細胞性( Yan, K.等人 ,《基因發展( Genes Dev)》 28, 1085-1100 (2014))。因此，gremlin1已在治療gremlin相關疾病中用作治療標靶。
然而，由於GREM1亦在其他正常組織中表現，因此由於包括對正常組織的毒性的副作用，目前沒有對GREM1相關疾病的有效治療。因此，需要具有降低的副作用的新穎的抗gremlin1抗體。
在整個本發明中，冠詞「一(a/an)」及「上述」在本文中用於指一個(種)或多於一個(種)(即，至少一個(種))上述冠詞的語法對象。舉例而言，「抗體」意謂一種抗體或多於一種抗體。
本發明尤其提供新穎的單株抗gremlin1(GREM1)抗體、編碼此類抗體的核苷酸序列及其用途。當相較於現有抗GREM1抗體時，本文所提供的抗GREM1抗體與GREM1的不同區域結合且對調節GREM1對骨形態發生蛋白質(BMP)結合的活性具有差異影響。確切而言，相對於非癌細胞，本文所提供的抗GREM1抗體能夠選擇性地降低癌細胞中GREM1介導之對BMP信號傳導的抑制。此係出人意料的，且解決了抗GREM1抗體由於gremlin在癌細胞以及非癌細胞中的普遍表現而引起的副作用這一長期存在的問題。
在一個態樣中，本發明提供一種抗人類gremlin1(hGREM1)的分離抗體或其抗原結合片段，其具有以下特徵中的至少一者： a)相對於非癌細胞，能夠選擇性地降低癌細胞中hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制； b)在非癌細胞中展現hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制降低不超過50%； c)能夠與包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的嵌合hGREM1結合； d)能夠與hGREM1結合而非與小鼠gremlin1特異性結合； e)在包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的抗原決定基處與hGREM1結合，其中殘基編號係根據SEQ ID NO: 69，或與包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的hGREM1片段結合，視情況上述hGREM1片段具有至少3個(例如，4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸殘基的長度； f)能夠以如藉由Fortebio所量測的不超過1 nM的K D與hGREM1結合； h)能夠以如藉由ELISA所量測的大於50%的最大阻斷百分比阻斷hGREM1與BMP7之結合； i)能夠阻斷GREM1與FGFR之相互作用；及/或 j)能夠與hGREM1及DAN兩者結合。
在某些實施例中，抗原決定基為直鏈或構型抗原決定基。
在另一態樣中，本發明提供一種抗人類gremlin1(hGREM1)的分離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變(VH)區及/或輕鏈可變(VL)區，其中上述重鏈可變區包含： a)HCDR1，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 1、11、21、31、114、119及123， b)HCDR2，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 2、12、22、32及115，及 c)HCDR3，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 3、13、23、33、116、120及124，及/或 其中上述輕鏈可變區包含： d)LCDR1，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 4、14、24、34、117、121、122及125， e)LCDR2，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 5、15、25及35，及 f)LCDR3，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 6、16、26、36及118。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區選自由以下組成之群： a)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 2的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 3的序列的HCDR3； b)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 12的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 13的序列的HCDR3； c)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 22的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 23的序列的HCDR3； d)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 32的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 33的序列的HCDR3； e)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 116的序列的HCDR3； f)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；及 g)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 124的序列的HCDR3。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區可選自由以下組成之群： a)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 5的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 6的序列的LCDR3； b)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 15的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 16的序列的LCDR3； c)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 25的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 26的序列的LCDR3； d)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 36的序列的LCDR3； e)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； f)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； g)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3；及 h)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3。
在某些實施例中，在本文所提供的抗體或其抗原結合片段中： a)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 2的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 3的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 5的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 6的序列的LCDR3； b)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 12的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 13的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 15的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 16的序列的LCDR3； c)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 22的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 23的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 25的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 26的序列的LCDR3； d)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 32的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 33的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 36的序列的LCDR3； e)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 116的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； f)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； g)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3；或 h)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 124的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 134，及與其具有至少80%序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的序列。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136及SEQ ID NO: 137，及與其具有至少80%序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的序列。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段包含： a)包含SEQ ID NO: 7的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 8的序列的輕鏈可變區；或 b)包含SEQ ID NO: 17的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 18的序列的輕鏈可變區；或 c)包含SEQ ID NO: 27的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 28的序列的輕鏈可變區；或 d)包含SEQ ID NO: 37的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 38的序列的輕鏈可變區；或 e)包含SEQ ID NO: 126的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 127的序列的輕鏈可變區；或 f)包含SEQ ID NO: 128的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 129的序列的輕鏈可變區；或 g)包含SEQ ID NO: 128的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 130的序列的輕鏈可變區；或 h)包含選自由SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43及SEQ ID NO: 45組成之群的序列的重鏈可變區，及包含選自由SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 49組成之群的序列的輕鏈可變區；或 i)選自由以下組成之群的一對重鏈可變區及輕鏈可變區序列：SEQ ID NO: 41/47、41/49、43/47、43/49、45/47及45/49；或 j)包含選自由SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55及SEQ ID NO: 57組成之群的序列的重鏈可變區，及包含選自由SEQ ID NO: 59及SEQ ID NO: 61組成之群的序列的輕鏈可變區；或 k)選自由以下組成之群的一對重鏈可變區及輕鏈可變區序列：SEQ ID NO: 51/59、51/61、53/59、53/61、55/59、55/61、57/59及57/61；或 l)包含選自由SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 134組成之群的序列的重鏈可變區，及包含選自由SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136及SEQ ID NO: 137組成之群的序列的輕鏈可變區；或 m)選自由以下組成之群的一對重鏈可變區及輕鏈可變區序列：SEQ ID NO: 131/135、131/136、131/137、132/135、132/136、132/137、133/135、133/136、133/137、134/135、134/136及134/137。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段進一步包含一或多個胺基酸殘基取代或修飾，但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力。
在某些實施例中，取代或修飾中的至少一者在VH或VL序列的一或多個CDR序列中，及/或在一或多個非CDR區中。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段亦包含免疫球蛋白恆定區，視情況人類Ig的恆定區，或視情況人類IgG的恆定區。
在某些實施例中，恆定區包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區。
在某些實施例中，恆定區包括包含SEQ ID NO: 138的序列的重鏈恆定區及/或包含SEQ ID NO: 139的序列的輕鏈恆定區。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段為人源化的。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段為雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv) 2、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單結構域抗體、奈米抗體、結構域抗體及二價結構域抗體。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段係雙特異性的。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段能夠與hGREM1的第一及第二抗原決定基特異性結合，或能夠與hGREM1及第二抗原兩者特異性結合。
在某些實施例中，本文所提供的第二抗原為免疫相關標靶。
在某些實施例中，第二抗原包含PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGF β、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16或CD83。
在某些實施例中，第二抗原包含腫瘤抗原。
在某些實施例中，腫瘤抗原包含腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原。
在某些實施例中，腫瘤抗原包含***特異性抗原(PSA)、CA-125、神經節苷脂G(D2)、G(M2)及G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、鈴蟾素樣肽、HER2/neu、表皮生長因子受體(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相關黏蛋白、VEGF、VEGFR(例如，VEGFR3)、***受體、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受體、EGFα、c-Kit受體、轉鐵蛋白受體、緊密連接蛋白18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、間皮素(methothelin)、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段對小鼠gremlin1不具有交叉反應性。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段對小鼠gremlin1具有交叉反應性。
在某些實施例中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段與一或多個結合部分連接。
在某些實施例中，結合部分包含清除調節劑、化學治療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記、酶-受質標記、DNA烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑或其他抗癌藥物，例如雄激素受體抑制劑。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其與本文所提供的抗體或其抗原結合片段競爭結合於hGREM1。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物或套組，其包含本文所提供的抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，醫藥組合物或套組進一步包含第二治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種分離的聚核苷酸，其編碼本文所提供的抗體或其抗原結合片段。
在另一態樣中，本發明提供一種載劑，其包含本文所提供的分離的聚核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含本文所提供的載劑。
在另一態樣中，本發明提供一種表現本文所提供的抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在可表現本文所提供的載劑的條件下培養本文所提供的宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種治療個體的GREM1相關疾病或病狀的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的本文所提供的抗體或其抗原結合片段，或本文所提供的醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供一種治療有需要之個體的GREM1相關疾病或病狀的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的抗人類GREM1抗體或其抗原結合片段，上述抗體或其抗原結合片段： a)能夠在包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的抗原決定基處與hGREM1結合，其中殘基編號係根據SEQ ID NO: 69，及/或 b)能夠與包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的hGREM1片段結合，視情況hGREM1片段具有至少3個(例如，4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸殘基的長度；及/或 c)相對於非癌細胞，能夠選擇性地降低癌細胞中hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制；及/或 d)在非癌細胞中展現hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制降低不超過50%；及/或 e)能夠與包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的嵌合hGREM1結合；及/或 f)能夠以如藉由Fortebio所量測的不超過1 nM的K D與hGREM1結合；及/或 h)能夠以如藉由ELISA所量測的大於50%的最大阻斷百分比阻斷hGREM1與BMP7之結合；及/或 i)能夠阻斷GREM1與FGFR之相互作用。
在某些實施例中，GREM1相關疾病或病狀選自由以下組成之群：癌症、纖維化疾病、血管生成、青光眼或視網膜疾病、腎病、肺動脈高血壓或骨關節炎(OA)。
在某些實施例中，癌症為表現GREM1的癌症。在某些實施例中，表現GREM1的癌症也是表現PD-L1的癌症。在某些實施例中，表現GREM1的癌症並非表現PD-L1的癌症。在某些實施例中，表現GREM1的癌症對用PD-1/PD-L1軸抑制劑的治療具有抗性或難治性。
在某些實施例中，個體鑑別為具有表現GREM1的癌細胞，或具有表現GREM1的癌症微環境。
在某些實施例中，癌症為實體腫瘤或血液癌。
在某些實施例中，實體腫瘤為腎上腺皮質癌瘤、肛門癌、星形細胞瘤、兒童小腦或大腦、基底細胞癌瘤、膽管癌、膀胱癌、骨骼腫瘤、腦癌、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、視路及下丘腦神經膠質瘤、乳癌、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、子宮頸癌、結腸癌、肺氣腫、子宮內膜癌、食道癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、成視網膜細胞瘤、胃癌(gastric/stomach cancer)、神經膠質瘤、頭頸癌、心臟癌症、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、胰島細胞癌瘤(內分泌胰腺)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎癌(腎細胞癌)、喉癌、肝癌、肺癌、成神經細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、***癌、直腸癌、腎細胞癌(腎癌)、成視網膜細胞瘤、尤文氏家族腫瘤(Ewing family of tumors)、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、喉癌、甲狀腺癌或***癌。
在某些實施例中，血液癌為白血病(例如急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤(例如，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia；WM)))或骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤(MM))。
在某些實施例中，癌症為***癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌)、肝癌、胰腺癌、乳癌、支氣管癌、骨癌、肝臟及膽管癌、卵巢癌、睪丸癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、脊柱癌、腦癌、宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、肛門癌、胃腸癌、皮膚癌、垂體癌、胃癌、***癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、星形細胞瘤、黑色素瘤、骨髓發育不良徵候群、肉瘤、畸胎瘤、神經膠質瘤或腺癌。
在某些實施例中，癌症選自由以下組成之群：***癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌)、肝癌、結腸癌、結腸直腸癌、神經膠質瘤、胰腺癌、膀胱癌及乳癌。在某些實施例中，癌症為三陰性乳癌。在某些實施例中，癌症為多發性骨髓瘤。
在某些實施例中，癌症為***癌。
在某些實施例中，纖維化疾病為肺、肝臟、腎臟、眼睛、皮膚、心臟、腸道或肌肉中的纖維化疾病。
在某些實施例中，個體為人類。
在某些實施例中，上述投與係經由口、鼻、靜脈內、皮下、舌下或肌肉內投與。
在某些實施例中，本文所提供的方法進一步包括投與治療有效量的第二治療劑。
在某些實施例中，第二治療劑包含抗癌療法，視情況上述抗癌療法選自化學治療劑(例如，順鉑(cisplatin))、抗癌藥物、放射療法、免疫治療劑(例如免疫檢查點調節劑，例如PD-1/PD-L1軸抑制劑及TGF-β抑制劑)、抗血管生成劑(例如，如VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3的VEGFR的拮抗劑)、靶向療法藥劑、細胞療法藥劑、基因療法藥劑、激素療法藥劑、細胞因子、姑息治療(palliative care)、用於治療癌症的手術(例如，腫瘤切除術)、一或多種抗嘔劑、由化學療法引起的併發症的治療、癌症患者的飲食補充劑(例如，吲哚-3-甲醇)、調節腫瘤微環境的藥劑(例如，包含PD-L1結合部分及TGF-β受體的胞外結構域的雙功能分子)或抗纖維化療法(例如，BMP7治療、ACE抑制劑(或ARB)、抗MASP2抗體、內皮素受體拮抗劑、NRF2抑制劑類固醇、CTLA4-IgG或TNF抑制劑)。在某些實施例中，第二治療劑包含順鉑。在某些實施例中，第二治療劑包含PD-1/PD-L1軸抑制劑。
在某些實施例中，抗癌療法包含抗***癌藥物。
在某些實施例中，抗***癌藥物包含雄激素軸抑制劑；雄激素合成抑制劑；聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制劑；或其組合。
在某些實施例中，雄激素軸抑制劑選自由以下組成之群：促黃體激素釋放激素(Luteinizing hormone-releasing hormone；LHRH)激動劑、LHRH拮抗劑及雄激素受體拮抗劑。
在某些實施例中，雄激素軸抑制劑為地加瑞克(degarelix)、比卡魯胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、阿帕魯胺(apalutamide)、達洛魯胺(darolutamide)、恩雜魯胺(enzalutamide)或阿比特龍(abiraterone)。在某些實施例中，雄激素合成抑制劑為乙酸阿比特龍(abiraterone acetate)或酮康唑(ketoconazole)。在某些實施例中，PARP抑制劑為奧拉帕尼(olaparib)或盧卡帕尼(rucaparib)。
在某些實施例中，抗***癌藥物選自由以下組成之群：乙酸阿比特龍、阿帕魯胺、比卡魯胺、卡巴他賽(Cabazitaxel)、康士得(Casodex)(比卡魯胺)、達洛魯胺、地加瑞克、多西他賽(Docetaxel)、艾利加德(Eligard)(乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、恩雜魯胺、艾利達(Erleada)(阿帕魯胺)、費蒙格(Firmagon)(地加瑞克)、氟他胺、乙酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)、傑塔納(Jevtana)(卡巴他賽)、乙酸亮丙瑞林、魯普隆(Lupron)(乙酸亮丙瑞林)、魯普隆貯存型(Lupron Depot)(乙酸亮丙瑞林)、利普卓(Lynparza)(奧拉帕尼)、鹽酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、尼蘭得隆(Nilandron)(尼魯米特)、尼魯米特、努貝卡(Nubeqa)(達洛魯胺)、奧拉帕尼、普洛韋格(Provenge)(西普亮塞-T(Sipuleucel-T))、鐳223二氯化物、魯布拉卡(Rubraca)(樟腦磺酸盧卡帕尼(Rucaparib Camsylate))、樟腦磺酸盧卡帕尼、西普亮塞-T、克癌易(Taxotere)(多西他賽)、多菲戈(Xofigo)(鐳223二氯化物)、安可坦(Xtandi)(恩雜魯胺)、諾雷德(Zoladex)(乙酸戈舍瑞林)及澤替加(Zytiga)(乙酸阿比特龍)。
在某些實施例中，第二治療劑包含吲哚-3-甲醇。
在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包含本文所提供的抗體或抗原結合片段。
在另一態樣中，本發明提供一種偵測樣品中GREM1的存在或量的方法，其包括使上述樣品與本文所提供的抗體或其抗原結合片段接觸，及測定上述樣品中GREM1的存在或量。
在另一態樣中，本發明提供本文所提供的抗體或其抗原結合片段在製造用於治療個體的GREM1相關疾病或病狀的藥劑中的用途。
在某些實施例中，GREM1相關疾病或病狀為癌症。
在某些實施例中，GREM1相關疾病或病狀為纖維化疾病、血管生成、青光眼、視網膜疾病、腎病、肺動脈高血壓或骨關節炎(OA)。
以下對本發明的描述僅打算說明本發明的各種實施例。因此，所論述的具體修改不應被解釋為對本發明的範圍的限制。熟習此項技術者將顯而易見的是，可在不悖離本發明的範圍的情況下作出各種等效物、變化及修改，且應理解，此等等效實施例將包括在本文中。本文所引用的所有參考文獻，包括出版物、專利及專利申請案均以全文引用的方式併入本文中。 定義
如本文中所使用，除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則本發明的上下文中(尤其在申請專利範圍的上下文中)所使用的術語「一(a/an)」、「上述(the)」及類似術語應解釋為涵蓋單數及複數。
如本文中所使用的術語「抗體」包括與特異性抗原結合的任何免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、二價抗體、單價抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。天然完整抗體包含兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。哺乳動物重鏈分類為α、δ、ε、γ及μ，每條重鏈由一個可變區(V H)及第一、第二及第三恆定區(分別為C H1、C H2、C H3)組成；哺乳動物輕鏈分類為λ或κ，而每條輕鏈由一個可變區(V L)及一個恆定區組成。抗體呈「Y」形，其中Y的主幹由經由二硫鍵結合在一起的兩條重鏈的第二及第三恆定區組成。Y的每個臂包括與單條輕鏈的可變區及恆定區結合的單條重鏈的可變區及第一恆定區。輕鏈及重鏈的可變區負責抗原結合。兩條鏈的可變區通常含有三個高度可變的環，稱為互補決定區(CDR)(輕鏈CDR包括LCDR1、LCDR2及LCDR3，重鏈CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所揭示之抗體及抗原結合結構域的CDR邊界可由Kabat、IMGT、AbM、Chothia或Al-Lazikani慣例來界定或鑑別(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., 《分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.)》, 273(4), 927 (1997)；Chothia, C.等人，《分子生物學雜誌》12月5日;186(3):651-63 (1985)；Chothia, C.及Lesk, A.M., 《分子生物學雜誌》, 196,901 (1987)；N. R. Whitelegg等人，《蛋白質工程(Protein Engineering)》, v13(12), 819-824 (2000)；Chothia, C.等人，《自然(Nature)》. 12月21-28日;342(6252):877-83 (1989)；Kabat E.A.等人，馬裡蘭州貝塞斯達美國國家衛生研究院(National Institutes of Health, Bethesda, Md.), (1991)；Marie-Paule Lefranc等人，《發展與比較免疫學(Developmental and Comparative Immunology)》, 27: 55-77 (2003)；Marie-Paule Lefranc等人，《免疫組學研究(Immunome Research)》, 1(3), (2005)；Marie-Paule Lefranc, 《B細胞分子生物學(第二版)(Molecular Biology of B cells (second edition))》, 第26章, 481-514, (2015))。三個CDR***於稱為框架區(FR)的側翼片段之間，上述框架區比CDR更高度保守且形成支撐高變環的支架。重鏈及輕鏈的恆定區不參與抗原結合，但展現各種效應功能。基於抗體重鏈恆定區的胺基酸序列，將抗體分類。抗體的五種主要類別或同種型為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其特徵在於分別存在α、δ、ε、γ及μ重鏈。將若干主要抗體類別劃分為子類，如IgG1(γ1重鏈)、IgG2(γ2重鏈)、IgG3(γ3重鏈)、IgG4(γ4重鏈)、IgA1(α1重鏈)或IgA2(α2重鏈)。在某些實施例中，本文所提供的抗體涵蓋其任何抗原結合片段。
如本文中所使用，術語「抗原結合片段」係指由包含一或多個CDR的抗體的片段，或與抗原結合但不包含完整的原生抗體結構的任何其他抗體部分形成的抗體片段。抗原結合片段的實例包括但不限於雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv) 2、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單結構域抗體、奈米抗體、結構域抗體及二價結構域抗體。抗原結合片段能夠與親本抗體所結合的相同抗原結合。在某些實施例中，抗原結合片段可包含一或多個來自特定親本抗體的CDR。
關於抗體的「Fab」係指抗體的單價抗原結合片段，其由單條輕鏈(可變區及恆定區)藉由二硫鍵與單條重鏈的可變區及第一恆定區結合而成。可藉由在接近鉸鏈區的重鏈之間的二硫鍵的N端的殘基處木瓜蛋白酶消化抗體來獲得Fab。
「Fab'」係指包括鉸鏈區的一部分的Fab片段，其可藉由在接近鉸鏈區的重鏈之間的二硫鍵的C端的殘基處胃蛋白酶消化抗體而獲得，且因此在鉸鏈區中的少量殘基(包括一或多個半胱胺酸)上與Fab不同。
「F(ab') 2」係指Fab'的二聚體，其包含兩條輕鏈及兩條重鏈的一部分。
關於抗體的「Fv」係指最小的帶有完整抗原結合位點的抗體片段。Fv片段由結合於單條重鏈的可變區的單條輕鏈的可變區組成。「dsFv」係指二硫鍵穩定的Fv片段，其中在單條輕鏈的可變區與單條重鏈的可變區之間的鍵聯是二硫鍵。
「單鏈Fv抗體」或「scFv」係指由輕鏈可變區及重鏈可變區直接或經由肽連接子序列彼此連接組成的工程改造抗體(Huston JS等人《美國國家科學院院刊( Proc Natl Acad Sci USA)》, 85:5879(1988))。「scFv二聚體」係指包含具有連接子的兩個重鏈可變區及兩個輕鏈可變區的單鏈。在某些實施例中，「scFv二聚體」為二價雙功能抗體或二價scFv(BsFv)，其包含V H-V L(由肽連接子連接)與另一個V H-V L部分二聚，使得一個部分的V H與另一個部分的V L配位且形成可靶向相同抗原(或抗原決定基)或不同抗原(或抗原決定基)的兩個結合位點。在其他實施例中，「scFv二聚體」為雙特異性雙功能抗體，其包含V H1-V L2(由肽連接子連接)與V L1-V H2(也由肽連接子連接)結合，使得V H1與V L1配位且V H2與V L2配位且每個配位對具有不同的抗原特異性。
「單鏈Fv-Fc抗體」或「scFv-Fc」係指由連接至抗體的Fc區的scFv組成的工程改造抗體。
「駱駝化單結構域抗體」、「重鏈抗體」、「奈米抗體」或「HCAb」係指含有兩個V H結構域且不含輕鏈的抗體(Riechmann L.及Muyldermans S., 《免疫學方法雜誌( J Immunol Methods)》. 12月10日;231(1-2):25-38 (1999)；Muyldermans S., 《生物技術雜誌( J Biotechnol)》. 6月;74(4):277-302 (2001)；WO94/04678；WO94/25591；美國專利第6,005,079號)。重鏈抗體最初是從駱駝科( Camelidae)(駱駝、單峰駝及美洲駝)獲得的。雖然不含輕鏈，但駱駝化抗體具有真實的抗原結合譜系(Hamers-Casterman C.等人, 《自然》. 6月3日;363(6428):446-8 (1993)；Nguyen VK.等人, 「駱駝科的重鏈抗體；進化創新的案例(Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation),」 《免疫遺傳學(Immunogenetics)》. 4月;54(1):39-47 (2002)；Nguyen VK.等人, 《免疫學( Immunology)》 .5月;109(1):93-101 (2003))。重鏈抗體的可變結構域(VHH結構域)代表由適應性免疫反應產生的已知最小的抗原結合單元(Koch-Nolte F.等人, 《美國實驗生物學學會聯合會雜誌( FASEB J.)》 11月;21(13):3490-8. 電子版2007年6月15日(2007))。「雙功能抗體」包括具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，其中上述片段包含在單一多肽鏈中連接至V L結構域的V H結構域(V H-V L或V L-V H)(參見例如Holliger P.等人, 《美國國家科學院院刊》 7月15日;90(14):6444-8 (1993)；EP404097；WO93/11161)。因為連接子太短，所以同一條鏈上的兩個結構域無法配對，因此，迫使上述結構域與另一條鏈的互補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點。抗原結合位點可靶向相同或不同的抗原(或抗原決定基)。
「結構域抗體」係指僅含有重鏈的可變區或輕鏈的可變區的抗體片段。在某些實施例中，兩個或更多個V H結構域藉由肽連接子共價接合以形成二價或多價結構域抗體。二價結構域抗體的兩個V H結構域可靶向相同或不同的抗原。
在某些實施例中，「(dsFv) 2」包含三條肽鏈：兩個V H部分藉由肽連接子連接，且藉由二硫橋與兩個V L部分結合。
在某些實施例中，「雙特異性ds雙功能抗體」包含經由V H1與V L1之間的二硫橋與V L1-V H2(也由肽連接子連接)結合的V H1-V L2(由肽連接子連接)。
在某些實施例中，「雙特異性dsFv」或「dsFv-dsFv'」包含三條肽鏈：V H1-V H2部分，其中重鏈由肽連接子(例如，長可撓性連接子)結合，且經由二硫橋分別與V L1及V L2部分配對。每條二硫鍵配對的重鏈及輕鏈具有不同的抗原特異性。
如本文中所使用的術語「人源化」意謂抗體或抗原結合片段包含來源於非人類動物的CDR、來源於人類的FR區，以及當適用時，來源於人類的恆定區。在某些實施例中，人源化gremlin抗體的可變區框架的胺基酸殘基經取代以用於序列優化。在某些實施例中，人源化gremlin抗體鏈的可變區框架序列與對應人類可變區框架序列至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。
如本文中所使用的術語「嵌合」係指重鏈及/或輕鏈的一部分來源於一個物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分來源於不同物種的抗體或抗原結合片段。在一說明性實例中，嵌合抗體可包含來源於人類的恆定區及來源於非人類物種(如小鼠)的可變區。
術語「生殖系序列」係指編碼可變區胺基酸序列或子序列的核酸序列，與所有其他已知的由生殖系免疫球蛋白可變區序列編碼的可變區胺基酸序列相比，上述序列與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高的確定胺基酸序列一致性。生殖系序列亦可指與所有其他評估的可變區胺基酸序列相比，與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高的胺基酸序列一致性的可變區胺基酸序列或子序列。生殖系序列可為框架區、僅互補決定區、框架區及互補決定區、可變區段(如上文所定義)或包含可變區的序列或子序列的其他組合。可使用本文所描述的方法，例如使用BLAST、ALIGN或此項技術中已知的另一種比對算法比對兩個序列來確定序列一致性。生殖系核酸或胺基酸序列可與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。可例如藉由可公開獲得的國際免疫遺傳學資料庫(international ImMunoGeneTics database；IMGT)及V-base確定生殖系序列。
「抗人類gremlin1抗體」、「抗hGREM1抗體」或「抗人類gremlin1的抗體」在本文中可互換使用且係指能夠與具有足夠特異性及/或親和力的人類gremlin1特異性結合以例如提供治療用途的抗體。
如本文中所使用的術語「親和力」係指免疫球蛋白分子(即，抗體)或其片段與抗原之間的非共價相互作用的強度。
如本文中所使用的術語「特異性結合(specific binding/specifically binds)」係指兩個分子之間，例如抗體與抗原之間的非隨機結合反應。在某些實施例中，本文所提供的抗體或抗原結合片段以≤10 -6M(例如，≤5×10 -7M、≤2×10 -7M、≤10 -7M、≤5×10 -8M、≤2×10 -8M、≤10 -8M、≤5×10 -9M、≤4×10 -9M、≤3×10 -9M、≤2×10 -9M或≤10 -9M之結合親和力(K D)與人類及/或非人類gremlin1特異性結合。本文所使用的K D係指解離速率與締合速率的比率(k off/k on)，其可藉由使用此項技術中已知的任何習知方法，包括但不限於表面電漿共振方法、微尺度熱泳法、HPLC-MS方法及流式細胞量測術(如FACS)方法來確定。在某些實施例中，可藉由使用流式細胞量測術方法適當地確定K D值。可使用各種免疫分析格式來選擇與特定蛋白質特異性免疫反應的抗體。舉例而言，固相ELISA免疫分析習知地用於選擇與蛋白質特異性免疫反應的抗體(關於可用於確定特異性免疫反應的免疫分析格式及條件的描述，參見例如Harlow及Lane, 《使用抗體，實驗指南(Using Antibodies, A Laboratory Manual)》 (1998))。典型地，特異性或選擇性結合反應將產生相對於背景信號至少兩倍，且更典型地相對於背景信號至少10倍至100倍的信號。
如本文中所使用的術語「胺基酸」係指含有胺(-NH 2)及羧基(-COOH)官能團以及每種胺基酸特有的側鏈的有機化合物。胺基酸的名稱在本發明中也以標準的單字母或三字母代碼表示，其概述如下。
名稱 三字母代碼 單字母代碼
丙胺酸 Ala A
精胺酸 Arg R
天冬醯胺 Asn N
天冬胺酸 Asp D
半胱胺酸 Cys C
麩胺酸 Glu E
麩胺醯胺 Gln Q
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異白胺酸 Ile I
白胺酸 Leu L
離胺酸 Lys K
甲硫胺酸 Met M
***酸 Phe F
脯胺酸 Pro P
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
纈胺酸 Val V
關於胺基酸序列的「保守取代」係指用具有類似生理化學特性的側鏈的不同胺基酸殘基替換胺基酸殘基。舉例而言，可在具有疏水性側鏈的胺基酸殘基(例如，Met、Ala、Val、Leu及Ile)中、在具有中性親水性側鏈的殘基(例如，Cys、Ser、Thr、Asn及Gln)中、在具有酸性側鏈的殘基(例如，Asp、Glu)中、在具有鹼性側鏈的胺基酸(例如，His、Lys及Arg)中或在具有芳香族側鏈的殘基(例如，Trp、Tyr及Phe)中進行保守取代。如此項技術中所已知，保守取代通常不會引起蛋白質構型結構的顯著變化，且因此可保留蛋白質的生物活性。
關於胺基酸序列(或核酸序列)的「序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且在必要時引入空位以實現最大對應性之後，與參考序列中的胺基酸(或核酸)殘基相同的候選序列中的胺基酸(或核酸)殘基的百分比。出於確定胺基酸(或核酸)序列一致性%的目的進行的比對可例如使用可公開獲得的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美國國家生物技術資訊中心(NCBI)的網站上獲得，另參見Altschul S.F.等人, 《分子生物學雜誌》, 215:403-410 (1990)；Stephen F.等人, 《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》, 25:3389-3402 (1997))、ClustalW2(可在歐洲生物資訊研究所(European Bioinformatics Institute)的網站上獲得，另參見Higgins D.G.等人, 《酶學方法(Methods in Enzymology)》, 266:383-402 (1996)；Larkin M.A.等人, 《生物資訊學(Bioinformatics)》 (英格蘭牛津(Oxford, England)), 23(21):2947-8 (2007))及ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件實現。熟習此項技術者可使用上述工具提供的默認參數，或可自定義適於比對的參數，例如藉由選擇合適算法進行。在某些實施例中，不相同的殘基位置可藉由保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」為其中胺基酸殘基經具有類似化學特性(例如，電荷或疏水性)的側鏈(R基團)的另一個胺基酸殘基取代的保守胺基酸取代。一般而言，保守胺基酸取代基本上不會改變蛋白質的功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同的情況下，百分比或類似性程度可以向上調整以校正取代的保守性質。進行此類調整的方式為熟習此項技術者熟知的。參見例如Pearson (1994) 《分子生物學方法(Methods Mol. Biol.)》24: 307-331，其以引用的方式併入本文中。
如本文中所使用，「同源序列」係指與另一序列視情況比對時具有至少80%(例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列一致性的聚核苷酸序列(或其互補鏈)或胺基酸序列。
「分離」的物質已藉由人工方式自天然狀態改變。若「分離」的組合物或物質存在於自然界中，則上述組合物或物質已自其原始環境改變或自其原始環境移除，或此兩種情況皆有。舉例而言，天然地存在於活動物體內的聚核苷酸或多肽並非「分離」的，但若相同的聚核苷酸或多肽已與其天然狀態的共存材料充分地分離從而以基本上純的狀態存在，則上述聚核苷酸或多肽是「分離」的。分離的「核酸」或「聚核苷酸」可互換使用，且係指分離的核酸分子的序列。在某些實施例中，「分離抗體或其抗原結合片段」係指如藉由電泳法(如SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳)或層析法(如離子交換層析或反相HPLC)所測定，純度為至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗體或抗原結合片段。
術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，如非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、貓、兔、羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除註明外，術語「患者」或「個體」在本文中可互換使用。
如本文中所使用的病狀的「治療(treating/treatment)」包括預防或減輕病狀，減緩病狀的發作或發展速率，降低罹患病狀的風險，預防或延遲與病狀相關的症狀的發展，減少或結束與病狀相關的症狀，產生病狀的完全或部分消退，治癒病狀或其某一組合。
如本文中所使用的術語「載劑」係指一種運載劑(vehicle)，可將基因元件可操作地***其中以便實現上述基因元件的表現，從而產生由上述基因元件編碼的蛋白質、RNA或DNA，或複製上述基因元件。載劑可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，以使其攜帶的基因元件在宿主細胞內表現。載劑的實例包括質粒；噬菌粒；黏粒；人工染色體，如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生的人工染色體(PAC)；噬菌體，如λ噬菌體或M13噬菌體；及動物病毒。載劑可含有多種用於控制表現的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、可選擇元件及報道基因。另外，載劑可含有複製起點。載劑亦可包括有助於其進入細胞的材料，包括但不限於病毒粒子、脂質體或蛋白質包衣。載劑可為表現載劑或選殖載劑。本發明提供含有本文所提供的編碼抗體或其抗原結合片段的核酸序列、至少一個可操作地連接至上述核酸序列的啟動子(例如，SV40、CMV、EF-1α)及至少一個選擇標記的載劑(例如表現載劑)。
如本文中所使用的「宿主細胞」係指已將外源聚核苷酸及/或載劑引入其中的細胞。
術語「gremlin1」或「GREM1」係指gremlin的變體1，且涵蓋不同物種中，例如人類、小鼠、猴等中的gremlin1。GREM1為進化上保守的且人類gremlin1基因( hGREM1)已定位到染色體15q13-q15(Topol L Z等人, (1997) 《分子細胞生物學( Mol. Cell Biol.)》, 17: 4801-4810；Topol L Z等人, 《細胞發生學細胞遺傳學( Cytogenet Cell Genet.)》, 89: 79-84)。hGREM1的胺基酸序列可藉由基因庫資料庫以寄存編號NP-037504或Uniprot資料庫經由寄存編號O60565訪問，且在本文中提供為SEQ ID NO: 66。術語「人類gremlin1」及術語「hGREM1」在本發明中可互換使用。
如本文中所使用的「gremlin1相關」或「GREM1相關」疾病或病狀係指由GREM1的表現或活性增加所引起、加劇或以其他方式與其有關的任何疾病或病狀。在一些實施例中，GREM1相關病狀為例如青光眼、癌症、纖維化疾病、血管生成、視網膜疾病、腎病、肺動脈高血壓或骨關節炎(OA)。
如本文中所使用的「癌症」係指特徵在於惡性細胞生長或贅瘤、異常增殖、浸潤或轉移的任何醫學病狀，且可為良性的或惡性的，且包括實體腫瘤及非實體癌症(例如惡性血液病)，如白血病。如本文中所使用，「實體腫瘤」係指贅生性及/或惡性細胞的實體塊。
術語「醫藥學上可接受之」指示指定的載劑、媒劑、稀釋劑、賦形劑及/或鹽通常在化學上及/或物理上與包含調配物的其他成分相容，且在生理上與其接受者相容。
本文中提及「約」一值或參數包括(且描述)針對上述值或參數本身的實施例。舉例而言，提及「約X」的描述包括「X」的描述。數值範圍包括定義上述範圍的數字。一般而言，術語「約」係指變量的指示值及在指示值的實驗誤差內(例如，在平均值的95%置信區間內)或在指示值的10%內(以較大者為準)的所有變量值。當在時間段(年、月、週、日等)的情形內使用術語「約」時，術語「約」意謂時間段加上或減去下一個下級時間段的一個量(例如，約1年意謂11-13個月；約6個月意謂6個月加上或減去1週；約1週意謂6-8天等)，或在指示值的10%內，以較大者為準。
抗人類 gremlin1 抗體
本發明提供抗人類gremlin1(hGREM1)抗體及其抗原結合片段。本文所提供的抗hGREM1抗體及抗原結合片段與現有抗hGREM1抗體的唯一差別在於以下態樣：a)相對於非癌細胞，能夠選擇性地降低癌細胞中hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制；b)在非癌細胞中展現hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制降低不超過50%；c)能夠與包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的嵌合hGREM1結合；d)能夠與hGREM1結合而非與小鼠gremlin1特異性結合；e)在包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的抗原決定基處與hGREM1結合，其中殘基編號係根據SEQ ID NO: 69，或與包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的hGREM1片段結合，視情況hGREM1片段具有至少3個(例如，4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸殘基的長度；f)能夠降低hGREM1介導之對MAPK信號傳導的活化；g)能夠以如藉由Fortebio所量測的不超過1 nM的Kd與hGREM1結合；h)能夠以如藉由ELISA所量測的至少50%的最大阻斷百分比阻斷hGREM1與BMP7之結合；i)能夠阻斷GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)與FGFR(例如FGFR1，較佳為人類FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))之相互作用及/或j)能夠與hGREM1及DAN兩者結合。
骨形態發生蛋白質(BMP)(如BMP 2、BMP 4及BMP 7)稱為轉化生長因子β(TGF-β)超家族的糖基化胞外基質(ECM)相關成員，且在形態發生、一般器官發生、軟骨及肢體形成、細胞增殖、分化以及細胞凋亡期間具有關鍵作用。BMP信號傳導係藉由BMP配體(例如，BMP 2、BMP 4及BMP7)與BMP受體之結合而活化以觸發受體磷酸化，從而引起R-Smad(例如，Smad1/5/9)的磷酸化及與co-Smad4的複合形成。所形成的Smad複合物接著易位到細胞核以調節BMP靶基因的表現。因此，可以藉由例如量測smad的磷酸化水準及/或BMP靶基因的表現量分析BMP信號傳導的活化。亦可藉由量測分化標記物基因(例如鹼性磷酸酶，其為成骨細胞分化的早期標記物)的表現量分析BMP信號傳導的活化。 已知BMP信號傳導由BMP拮抗劑，例如頭蛋白(noggin)、脊索蛋白(chordin)、gremlin1及纏繞的原腸形成1抑制。GREM1可與BMP配體(例如BMP-2、BMP-4或BMP-7)物理結合以形成異二聚體且防止此等BMP配體與其對應BMP受體相互作用，由此抑制BMP信號傳導路徑的活化。因此，預期消除GREM1及/或降低GREM1的活性將逆轉或降低對BMP信號傳導的抑制。
i. 結合親和力
在某些實施例中，本文所提供的抗GREM1抗體能夠以如藉由Fortebio所量測的不超過1 nM的Kd與hGREM1結合。本文所提供的抗GREM1抗體及抗原結合片段之結合親和力可由K D值表示，K D值表示當抗原與抗原結合分子之間之結合達到平衡時，解離速率與締合速率的比率(k off/k on)。抗原結合親和力(例如K D)可使用此項技術中已知的任何合適方法，包括例如動力學排除分析(KinExA)、Biacore、Fortebio或流式細胞量測術來適當地確定。
在某些實施例中，根據本發明的「K D」或「K D值」在一實施例中係藉由Biacore或Fortebio分析，如藉由量測抗GREM1抗體的溶液結合親和力的以下分析所描述使用抗GREM1抗體及GREM1執行來量測的。一般而言，Biacore的工作原理是將恆定量的一種結合伴侶(CBP)與不同濃度的另一種結合伴侶(滴定劑)進行平衡，且接著在較短的接觸時間內藉由螢光標記的二級抗體捕獲一部分游離CBP，上述接觸時間小於預先形成的CBP-滴定劑複合物解離所需的時間。由捕獲的CBP產生的螢光信號與平衡樣品中游離CBP的濃度成正比，且用於生成一系列量測時之結合曲線(游離CBP百分比與總滴定劑濃度)。更多細節可自Schreiber, G., Fersht, A.R. 《自然·結構生物學(Nature Structural Biology.)》 1996, 3(5), 427-431獲得。當抗GREM1抗體以恆定量用作CBP時，則GREM1蛋白可用作滴定劑，反之亦然。Fortebio通常以與Biacore類似的方式，亦藉由將恆定量的CBP(例如，GREM 1蛋白)與不同濃度的滴定劑(例如，抗GREM1抗體)進行平衡而起作用。CBP與滴定劑之間之結合動力學(k on及k off)的資訊可從由Fortebio所使用的生物感測器產生的干擾圖案的變化獲得。更多細節可自Charles Wartchow, Frank Podlaski, Shirley Li, Karen Rowan, Xiaolei Zhang, David Mark, Kuo-Sen Huang 「利用生物膜干涉法的基於生物感測器的小分子片段篩選(Biosensor-based Small Molecule Fragment Screening with Biolayer Interferometry): 《計算機輔助分子設計雜誌(J Comput Aided Mol Des)》 2011, 25(7), 669-76獲得。
在某些實施例中，本文所提供的抗GREM1抗體的K D係根據如本發明中的實例14中所描述的方法測定。
在適用的情況下，亦可使用其他適合於量測K D的方法，例如放射性標記的抗原結合分析(參見例如Chen等人, (1999) 《分子生物學雜誌》 293:865-881)，或除Biacore以外的表面電漿共振分析。
在某些實施例中，本文所提供的抗GREM1抗體及其抗原結合片段以如藉由Biacore分析所量測的不超過100 nM(或不超過90、80、70、60、50、40、30、29、27、20、19或18 nM)的K D值與人類GREM1特異性結合。在某些實施例中，本文所提供的抗GREM1抗體及其抗原結合片段以如藉由Fortebio分析所量測的不超過10 nM(或不超過9、8、7、6、5、4、3、2或1 nM)的K D值與人類GREM1特異性結合。
或者，本文所提供的抗GREM1抗體及抗原結合片段與人類GREM1之結合親和力亦可由「半數最大有效濃度」(EC 50)值表示，上述值係指觀測到其最大作用(例如結合)的50%的抗體的濃度。可藉由此項技術中已知的方法，例如夾心分析，如ELISA、蛋白質印跡、流式細胞量測術分析及其他結合分析來量測EC 50值。在某些實施例中，本文所提供的抗GREM1抗體及其片段以如藉由ELISA所量測的不超過120 ng/ml(或不超過100、90、80、60、40、30、20、14.5、14、13.5、13、12.5、12、11.5、11、10.5、10、9、8、7、6、5.5、5、4.5、4、3、2或1 ng/ml)的EC50值與人類GREM1(例如，表現人類GREM1的細胞)特異性結合。
在某些實施例中，本文所提供的一些抗體及其抗原結合片段能夠以如藉由ELISA所量測的不超過20 ng/ml的EC50值與小鼠GREM1特異性結合。在某些實施例中，抗體及其抗原結合片段以如藉由ELISA所量測的4 ng/ml至20 ng/ml(例如，4 ng/ml至9 ng/ml、5 ng/ml至8 ng/ml、6 ng/ml至7 ng/ml、6 ng/ml至14 ng/ml、6 ng/ml至12 ng/ml、4.564 ng/ml、7.713 ng/ml、8.512 ng/ml或17.2 ng/ml)的EC50與小鼠GREM1結合。
在某些實施例中，本文所提供的一些抗體及其抗原結合片段不與小鼠GREM1特異性結合。
在某些實施例中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段不與GREM2特異性結合。
抗體序列
在一個態樣中，本發明提供本文所提供的抗GREM1抗體或其抗原結合片段，其中重鏈可變區包含： a)HCDR1，其包含選自以下的序列：SEQ ID NO: 1、11、21、31、114、119及123， b)HCDR2，其包含選自以下的序列：SEQ ID NO: 2、12、22、32及115，及 c)HCDR3，其包含選自以下的序列：SEQ ID NO: 3、13、23、33、116、120及124，及/或 輕鏈可變區包含： d)LCDR1，其包含SEQ ID NO: 4、14、24、34、117、121、122及125的序列， e)LCDR2，其包含SEQ ID NO: 5、15、25及35的序列，及 f)LCDR3，其包含選自以下的序列：SEQ ID NO: 6、16、26、36及118。
在某些實施例中，本文提供抗體或其抗原結合片段，其中重鏈可變區選自由以下組成之群： a)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 2的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 3的序列的HCDR3； b)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 12的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 13的序列的HCDR3； c)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 22的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 23的序列的HCDR3； d)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 32的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 33的序列的HCDR3； e)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 116的序列的HCDR3； f)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；及 g)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 124的序列的HCDR3。
在某些實施例中，本文提供抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區選自由以下組成之群： a)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 5的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 6的序列的LCDR3； b)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 15的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 16的序列的LCDR3； c)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 25的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 26的序列的LCDR3； d)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 36的序列的LCDR3； e)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； f)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； g)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3；及 h)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3。
在某些實施例中，本文提供抗體或其抗原結合片段，其中： a)重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 2的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 3的序列的HCDR3；且輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 5的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 6的序列的LCDR3； b)重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 12的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 13的序列的HCDR3；且輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 15的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 16的序列的LCDR3； c)重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 22的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 23的序列的HCDR3；且輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 25的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 26的序列的LCDR3； d)重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 32的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 33的序列的HCDR3；且輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 36的序列的LCDR3； e)重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 116的序列的HCDR3；且輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； f)重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；且輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； g)重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；且輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3；及 h)重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 124的序列的HCDR3；且輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3。
在某些實施例中，本文所提供的抗體包含抗hGREM1抗體14E3、69H5、22F1、56C11、36F5、42B9及67G11的一或多個(例如，1、2、3、4、5或6)CDR序列。
如本文中所使用的「14E3」係指具有SEQ ID NO: 7的重鏈可變區及SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區的小鼠抗體。
如本文中所使用的「69H5」係指具有SEQ ID NO: 27的重鏈可變區及SEQ ID NO: 28的輕鏈可變區的小鼠抗體。
如本文中所使用的「22F1」係指具有SEQ ID NO: 17的重鏈可變區及SEQ ID NO: 18的輕鏈可變區的小鼠抗體。
如本文中所使用的「56C11」係指具有SEQ ID NO:37的重鏈可變區及SEQ ID NO: 38的輕鏈可變區的小鼠抗體。
如本文中所使用的「36F5」係指具有SEQ ID NO: 126的重鏈可變區及SEQ ID NO: 127的輕鏈可變區的小鼠抗體。
如本文中所使用的「42B9」係指具有SEQ ID NO: 128的重鏈可變區及SEQ ID NO: 129的輕鏈可變區的小鼠抗體。
如本文中所使用的「67G11」係指具有SEQ ID NO: 128的重鏈可變區及SEQ ID NO: 130的輕鏈可變區的小鼠抗體。
表1顯示此等抗hGREM1抗體的CDR序列。CDR係根據Kabat編號進行確定。技術人員將理解，用於CDR確定的其他已知方法亦可應用於本文所提供的抗體，且彼等CDR序列亦涵蓋於本發明內。重鏈及輕鏈可變區序列亦提供於下表2中。
表 1. 抗 hGREM1 抗體的 CDR 區的序列
抗體 區域 CDR1 CDR2 CDR3
14E3 HCDR SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3
TYGMA WINTLSGEPTYADDFKG EPMDY
LCDR SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
KSSQSLLDSDGKTYLS LVSKLDS WQGAHFPLT
22F1 HCDR SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13
D YYM N DINPKDGDSGYSHKFKG GFTTVVARGDY
LCDR SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16
KSSQSLLDSDGKTYLN LVSKLDS WQGTHFPYT
69H5 HCDR SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23
D DYM H WIDPENGDTEYASKFQG WATVPDFDY
LCDR SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26
KSSQSLLNRSNQKNYLA FTSTRES QQHYSTPFT
56C11 HCDR SEQ ID NO: 31DFYMN SEQ ID NO: 32DINPNNGGTSYNQKFKG SEQ ID NO: 33DPIYYDYDEVAY
LCDR SEQ ID NO: 34RSSQSLVHSNGNTYLH SEQ ID NO: 35KVSNRFS SEQ ID NO: 36SQSTHVPLT
36F5 HCDR SEQ ID NO: 114S S GIG SEQ ID NO: 115EIYPRSGNTYNNEKFKG SEQ ID NO: 116E A YS HH YYAMDY
LCDR SEQ ID NO: 117 R SSQSL L HSNGNTYLE SEQ ID NO: 35KVSNRFS SEQ ID NO: 118FQGSHVPFT
42B9 HCDR SEQ ID NO: 119S Y GIG SEQ ID NO: 115EIYPRSGNTYNNEKFKG SEQ ID NO: 120E G YS NN YYAMDY
LCDR SEQ ID NO: 121 I SSQSL V HSNGNTYLE SEQ ID NO: 35KVSNRFS SEQ ID NO: 118FQGSHVPFT
67G11 HCDR SEQ ID NO: 119S Y GIG SEQ ID NO: 115EIYPRSGNTYNNEKFKG SEQ ID NO: 120E G YS NN YYAMDY
LCDR SEQ ID NO: 122 R SSQSL V HSNGNTYLE SEQ ID NO: 35KVSNRFS SEQ ID NO: 118FQGSHVPFT
36F5/ 42B9/ 67G11 HCDR SEQ ID NO: 123S X 32 GIG SEQ ID NO: 124E X 27 YS X 28X 29 YYAMDY
LCDR SEQ ID NO: 125 X 30 SSQSL X 31 HSNGNTYLE
其中X 32為S或Y；X 27為A或G；X 28為H或N；X 29為H或N；X 30為R或I；X 31為L或V。
表 2. 小鼠抗體 VH/VL 的序列
VH VL
14E3 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGSTFTTYGMAWMKQAPGKGLTWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFAFSLKTSANTAYLQINNLKNEDAATYFCAREPMDYWGQGTSVIVSS DVVMTQTPLTLSITIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLSWLLQRPDQSPKRLISLVSKLDSGVPDRITGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGAHFPLTFGAGTKLELK
22F1 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
EAQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYYMNWLKQSHGKSLEWIGDINPKDGDSGYSHKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTLTVSS DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGFPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK
69H5 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO: 28
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKRRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTTWATVPDFDYWGQGTTLTVSS DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVHFTSTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISNLQAEDLADYFCQQHYSTPFTFGSGTKLEIK
56C11 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO: 38
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDFYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSA DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK
36F5 SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 127
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYSFTSSGIGWVKQRSGQGLEWIGEIYPRSGNTYNNEKFKGKATLTADKSSSTVYMELRSLTSEDSAVYFCVREAYSHHYYAMDYWGQGTSVTVFS DVLMTQTPLSLPVSLGGQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRLSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIN
42B9 SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 129
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGIGWVKQRTGQGLEWIGEIYPRSGNTYNNEKFKGKATLTADKSSRTVYMELRSLISEDSAVYFCAREGYSNNYYAMDYWGQGTSVTVFS DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCISSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGLSPKLLIYKVSNRFSGVPDRLSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK
67G11 SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 130
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGIGWVKQRTGQGLEWIGEIYPRSGNTYNNEKFKGKATLTADKSSRTVYMELRSLISEDSAVYFCAREGYSNNYYAMDYWGQGTSVTVFS DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRLSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK
本文所提供的抗hGREM1抗體或其抗原結合片段可為單株抗體、多株抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、雙特異性抗體、標記抗體、二價抗體或抗個體基因型抗體。重組抗體為使用重組方法在活體外而非在動物中製備的抗體。
已知CDR負責抗原結合，然而，已發現並非所有6個CDR均一定為必不可少的或不可改變的。換言之，有可能替換或改變或修飾抗hGREM1抗體14E3、69H5、22F1、56C11、36F5、42B9或67G11(對應於SEQ ID NO: 1至36及114至125中的任一者)中的1、2或3個CDR，但仍基本上保持與hGREM1的特定結合親和力。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體及抗原結合片段包含抗hGREM1抗體14E3、69H5、22F1、56C11、36F5、42B9或67G11中的一者的重鏈CDR3序列。在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體及抗原結合片段包含SEQ ID NO: 3、13、23、33、116、120及124的重鏈CDR3序列。重鏈CDR3區位於抗原結合位點的中心，且因此被認為與抗原接觸最多，且為抗體與抗原的親和力提供最多的自由能。亦認為藉由多種多樣化機制，重鏈CDR3在長度、胺基酸組成及構型方面係迄今為止抗原結合位點中最具多樣性的CDR(Tonegawa S. 《自然》. 302:575-81)。重鏈CDR3的多樣性足以產生大多數抗體特異性(Xu JL, Davis MM. 《免疫(Immunity.)》 13:37-45)以及所需的抗原結合親和力(Schier R等, 《分子生物學雜誌》 263:551-67)。
在一些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體及抗原結合片段包含重鏈可變結構域的全部或一部分及/或輕鏈可變結構域的全部或一部分。在一個實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體及抗原結合片段為由本文所提供的重鏈可變結構域的全部或一部分組成的單結構域抗體。此單結構域抗體的更多資訊可在此項技術中獲得(參見例如美國專利第6,248,516號)。
在某些實施例中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段包含合適的構架區(FR)序列，只要抗體及其抗原結合片段可與GREM1特異性結合即可。表1中提供的CDR序列係自小鼠抗體獲得的，但其可使用此項技術中已知的合適方法(如重組技術)移植至任何合適的物種(如小鼠、人類、大鼠、兔等)的任何合適的FR序列。
在某些實施例中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段係嵌合的。將VH/VL移植至人類IgG1及人類κ序列。
在某些實施例中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段係人源化的。人源化抗體或抗原結合片段在其降低人類的免疫原性態樣是合乎需要的。人源化抗體在其可變區中是嵌合的，因為非人類CDR序列移植至人類或基本上人類FR序列。抗體或抗原結合片段的人源化可基本上藉由用人類免疫球蛋白基因中的對應人類CDR基因取代非人類(如鼠類)CDR基因來進行(參見例如Jones等人(1986) 《自然》 321:522-525；Riechmann等人(1988) 《自然》 332:323-327；Verhoeyen等人(1988) 《科學(Science)》 239:1534-1536)。可在此之前或之後對親本非人類抗體的可變區或可變結構域的三維結構進行模擬。
可使用此項技術中已知的方法選擇合適的人類重鏈及輕鏈可變結構域以實現CDR移植。在一說明性實例中，可以使用「最佳擬合」方法，其中針對已知的人類可變結構域生殖系序列的資料庫(例如蛋白質資料庫，http://www.rcsb.org/)篩選或BLAST化非人類(例如嚙齒動物)抗體可變結構域序列，且鑑別最接近非人類查詢序列的人類序列且將其用作移植非人類CDR序列的人類支架(參見例如Sims等人, (1993) 《免疫學雜誌(J. Immunol.)》 151:2296；Chothia等人(1987) 《分子生物學雜誌》 196:901)。或者，自所有人類抗體的共有序列衍生的構架可用於非人類CDR的移植(參見例如Carter等人(1992) 《美國國家科學院院刊》, 89:4285；Presta等人(1993) 《免疫學雜誌》,151:2623)。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或抗原結合片段除CDR序列為非人類序列外，基本上全部由人類序列構成。在一些實施例中，可變區FR及恆定區若存在則完全或基本上來自人類免疫球蛋白序列。人類FR序列及人類恆定區序列可來源於不同的人類免疫球蛋白基因，例如FR序列來源於一種人類抗體，而恆定區來源於另一種人類抗體。在一些實施例中，人源化抗體或抗原結合片段包含人類重鏈/輕鏈FR1-4。
下表 3 顯示 22F1 、 14E3 及 56C11 的 人源化抗體的 HFR 胺基酸序列。
抗體 FR1 FR2 FR3 FR4
hu22F1 Ha SEQ ID NO: 73Q V QLVQSG A E V KKPGASVKVSCKASG YS FT SEQ ID NO: 74W VR QAPG Q GL E W M G SEQ ID NO: 75R V T M T R D T STSTVYMEL S SLRSEDTAVYYCAS SEQ ID NO: 76WGQGT T VTVSS
Hb SEQ ID NO: 73Q V QLVQSG A E V KKPGASVKVSCKASG YS FT SEQ ID NO: 74W VR QAPG Q GL E W M G SEQ ID NO: 78R V T M T V D K STSTVYMEL S SLRSEDTAVYYCAS SEQ ID NO: 76WGQGT T VTVSS
Hc SEQ ID NO: 77Q A QLVQSG A E V KKPGASVKVSCKASG YS FT SEQ ID NO: 74W VR QAPG Q GL E W M G SEQ ID NO: 79R V T L T V D K STSTVYMEL R SLRSEDTAVYYCAS SEQ ID NO: 76WGQGT T VTVSS
Hd SEQ ID NO: 77Q A QLVQSG A E V KKPGASVKVSCKASG YS FT SEQ ID NO: 80W LR QAPG Q GL E W I G SEQ ID NO: 81R A T L T V D K STSTVYMEL R SLRSEDTAVYYCAS SEQ ID NO: 76WGQGT T VTVSS
hu14E3 Ha SEQ ID NO: 82Q V QLVQSG S E L KKPGASVKVSCKASG YT FT SEQ ID NO: 83W MR QAPG Q GL E W M G SEQ ID NO: 84RF V FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO: 85WGQGT M VTVSS
Hb SEQ ID NO: 86Q I QLVQSG S E L KKPGASVKVSCKASG YT FT SEQ ID NO: 83W MR QAPG Q GL E W M G SEQ ID NO: 87RF A FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO: 85WGQGT M VTVSS
Hc SEQ ID NO: 88Q I QLVQSG S E L KKPGASVKVSCKASG ST FT SEQ ID NO: 89W MK QAPG Q GL T W M G SEQ ID NO: 87RF A FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO: 85WGQGT M VTVSS
hu56C11 H0 SEQ ID NO: 90Q V QLVQSG A E V KKPGASVKVSCKASG YT FT SEQ ID NO: 74W VR QAPG Q GL E W M G SEQ ID NO: 91RVT M T R D T SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR SEQ ID NO: 92WGQGT L VTVSS
Ha SEQ ID NO: 90Q V QLVQSG A E V KKPGASVKVSCKASG YT FT SEQ ID NO: 74W VR QAPG Q GL E W M G SEQ ID NO: 93RVT M T V D K SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR SEQ ID NO: 92WGQGT L VTVSS
Hb SEQ ID NO: 90Q V QLVQSG A E V KKPGASVKVSCKASG YT FT SEQ ID NO: 95W VR QAPG Q GL E W I G SEQ ID NO: 94RVT L T V D K SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR SEQ ID NO: 92WGQGT L VTVSS
Hc SEQ ID NO: 90Q V QLVQSG A E V KKPGASVKVSCKASG YT FT SEQ ID NO: 96W VK QAPG K GL E W I G SEQ ID NO: 94RVT L T V D K SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR SEQ ID NO: 92WGQGT L VTVSS
      SEQ ID NO: 97Q X 1 QLVQSG X 2 E X 3 KKPGASVKVSCKASG X 4X 5 FT SEQ ID NO: 98W X 6X 7 QAPG X 8 GL X 9 W X 10 G hu22F1 (SEQ ID NO: 99)R X 11 T X 12 T X 13 D X 14 STSTVYMEL X 15 SLRSEDTAVYYCAS hu14E3 (SEQ ID NO: 140)RF X 16 FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR hu56C11 (SEQ ID NO: 141)RVT X 17 T X 18 D X 19 SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR SEQ ID NO: 100WGQGT X 20 VTVSS
下表 4 顯示 22F1 、 14E3 及 56C11 的 人源化抗體的 LFR 胺基酸序列。
hu22F1 La SEQ ID NO: 101DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC SEQ ID NO: 102W L QQRPGQSPR R LI Y SEQ ID NO: 103G V PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SEQ ID NO: 104FG G GTK V EIK
Lb SEQ ID NO: 101DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC SEQ ID NO: 102W L QQRPGQSPR R LI Y SEQ ID NO: 105G F PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SEQ ID NO: 104FG G GTK V EIK
hu14E3 La SEQ ID NO: 101DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC SEQ ID NO: 102W L QQRPGQSPR R LI Y SEQ ID NO: 103G V PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SEQ ID NO: 106FG Q GTK L EIK
Lb SEQ ID NO: 101DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC SEQ ID NO: 107W L QQRPGQSPR R LI S SEQ ID NO: 103G V PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SEQ ID NO: 106FG Q GTK L EIK
hu56C11 L0 SEQ ID NO: 101DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC SEQ ID NO: 108W F QQRPGQSPR R LI Y SEQ ID NO: 103G V PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SEQ ID NO: 106FG Q GTK L EIK
La SEQ ID NO: 101DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC SEQ ID NO: 109W F QQRPGQSPR L LI Y SEQ ID NO: 103G V PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SEQ ID NO: 106FG Q GTK L EIK
Lb SEQ ID NO: 101DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC SEQ ID NO: 110W Y QQRPGQSPR L LI Y SEQ ID NO: 103G V PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SEQ ID NO: 106FG Q GTK L EIK
         SEQ ID NO: 111W X 21 QQRPGQSPR X 22 LI X 23 SEQ ID NO: 112G X 24 PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SEQ ID NO: 113FG X 25 GTK X 26 EIK
其中X 1為V、I或A；X 2為A或S；X 3為V或L；X 4為Y或S；X 5為T或S；X 6為V、L或M；X 7為R或K；X 8為Q或K；X 9為E或T；X 10為M或I；X 11為V或A；X 12為M或L；X 13為R或V；X 14為T或K；X 15為S或R；X 16為V或A；X 17為M或L；X 18為R或V；X 19為T或K；X 20為T、M或L；X 21為L、F或Y；X 22為R或L；X 23為Y或S；X 24為V或F；X 25為G或Q；X 26為V或L。
在一些實施例中，來源於人類的FR區可包含與其所來源的人類免疫球蛋白相同的胺基酸序列。在一些實施例中，人類FR的一或多個胺基酸殘基經來自親本非人類抗體的對應殘基取代。在某些實施例中，此可能是合乎需要的，以使得人源化抗體或其片段緊密地接近非人類親本抗體結構，以降低或避免免疫原性及/或改善或保留結合活性或結合親和力。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或抗原結合片段在每個人類FR序列中包含不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代，或在重鏈或輕鏈可變結構域的所有FR中包含不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代。在一些實施例中，此類胺基酸殘基的變化可僅存在於重鏈FR區，僅存在於輕鏈FR區，或存在於兩條鏈中。在某些實施例中，使一或多個胺基酸殘基突變，例如CDR序列所來源的非人類親本抗體(例如，在小鼠框架區)中發現的對應殘基的回復突變。可由技術人員根據此項技術中已知的原則選擇合適的突變位置。舉例而言，可選擇突變位置：其中1)人類生殖系序列的框架中的殘基是罕見的(例如在人類可變區序列中少於20%或少於10%)；2)上述位置緊鄰人類生殖繫鏈的一級序列中的3個CDR中的一或多個，因為其有可能與CDR中的殘基相互作用；或3)上述位置在3維模型中接近CDR，且因此可以有極佳的概率與CDR中的胺基酸相互作用。所選位置處的殘基可回復突變為親本抗體中的對應殘基，或突變為既不為人類生殖系序列中的對應殘基亦不為親本抗體中的對應殘基的殘基，但突變為人類序列的典型殘基，即在與人類生殖系序列屬於同一亞組的在已知人類序列中的上述位置處出現頻率較高的殘基(參見美國專利第5,693,762號)。在某些實施例中，對於hu14E3，重鏈變體Ha、Hb及Hc係藉由將三個CDR直接移植至其生殖系序列而獲得，其中相應地對於重鏈變體Ha的回復突變為V37M，對於重鏈變體Hb的回復突變為V37M、V68A、V2I，且對於重鏈變體Hc的回復突變為V37M、V68A、V2I、Y27S、R38K、E46T，所有突變基於Kabat編號；輕鏈變體係藉由將三個CDR直接移植至其生殖系序列而獲得，其中相應地對於輕鏈變體La的回復突變為F36L且對於輕鏈變體Lb的回復突變為F36L、Y49S，所有突變基於Kabat編號。在某些實施例中，對於hu22F1，重鏈變體Ha、Hb、Hc及Hd係藉由將三個CDR直接移植至其生殖系序列而獲得，相應地對於重鏈變體Ha不具有回復突變，對於重鏈變體Hb的回復突變為R72V、T74K、T28S、R98S，對於重鏈變體Hc的回復突變為R71V、T73K、T28S、R94S、S82 AR、M69L、V2A，且對於重鏈變體Hd的回復突變為R71V、T73K、T28S、R94S、S82 AR、M69L、V2A、V67A、M48I、V37L，所有突變基於Kabat編號；輕鏈變體係藉由將三個CDR直接移植至其生殖系序列而獲得，其中相應地對於輕鏈變體La的回復突變為F36L且對於輕鏈變體Lb的回復突變為F36L、V58F，所有突變基於Kabat編號。在某些實施例中，對於hu56C11，重鏈(HC)變體1、2、3及4係藉由將三個CDR直接移植至生殖系序列而獲得，相應地對於重鏈變體H0不具有回復突變，對於重鏈變體Ha的回復突變為R71V、T73K，對於重鏈變體Hb的回復突變為R71V、T73K、M69L、M48I，且對於重鏈變體Hc的回復突變為R71V、T73K、M69L、M48I、Q43K、R38K，所有突變基於Kabat編號；輕鏈(LC)變體1、2及3係藉由將三個CDR直接移植至生殖系序列而獲得，相應地對於輕鏈變體L0不具有回復突變，對於輕鏈變體La的回復突變為R46L，且對於輕鏈變體Lb的回復突變為F36Y、R46L，所有突變基於Kabat編號。
在某些實施例中，本發明的人源化輕鏈及重鏈在人類中為基本上非免疫原性的，且保留與親本抗體對hGREM1的親和力基本上相同的親和力或甚至更高的親和力。具體而言，預期本文所提供的人源化抗體(例如，Hu22F1及Hu56C11)及來源於69H5、36F5、42B9及67G11的人源化抗hGREM1抗體顯示相比於其親本抗體類似的特性(例如，與人類gremlin 1及/或小鼠gremlin 1的高結合親和力、對gremlin介導之對BMP4信號傳導的抑制的高阻斷作用、對gremlin 1與FGFR1之結合的高阻斷活性及/或高抗腫瘤作用)或甚至更好。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體及其抗原結合片段在具有或不具有回復突變的情況下包含人類生殖系構架序列IGKV/2-30的一或多個輕鏈FR序列，及/或人類生殖系構架序列IGHV/7-4或IGHV/1-46或IGHV1-2的一或多個重鏈FR序列。必要時，可將回復突變引入到人類生殖系構架序列中。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 134，及與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的同源序列。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或其抗原結合片段進一步包含輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136及SEQ ID NO: 137，及與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的同源序列。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43及SEQ ID NO: 45，及與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的同源序列；及輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 49，及與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的同源序列。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或其抗原結合片段進一步包含一對重鏈可變區及輕鏈可變區序列，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 41/47、41/49、43/47、43/49、45/47及45/49，或與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的一對序列。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55及SEQ ID NO: 57，及與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的同源序列；及輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 59及SEQ ID NO: 61，及與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的同源序列。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或其抗原結合片段進一步包含一對重鏈可變區及輕鏈可變區序列，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 51/59、51/61、53/59、53/61、55/59、55/61、57/59及57/61，或與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的一對序列。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 134，及與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的同源序列；及輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136及SEQ ID NO: 137，及與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的同源序列。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體或其抗原結合片段進一步包含一對重鏈可變區及輕鏈可變區序列，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 131/135、131/136、131/137、132/135、132/136、132/137、133/135、133/136、133/137、134/135、134/136及134/137，或與其具有至少80%(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力的一對序列。
表 5. 人源化 14E3(Hu14E3) 、人源化 22F1(Hu22F1) 及人源化 56C11 ( Hu56C11 ) 的序列
抗體鏈 序列
Hu14E3-Ha VH QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMAWMRQAPGQGLEWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSS ( SEQ ID NO: 41 )
Hu14E3-Hb VH QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMAWMRQAPGQGLEWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSS ( SEQ ID NO: 43 )
Hu14E3-Hc VH QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGSTFTTYGMAWMKQAPGQGLTWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSS  (SEQ ID NO: 45)
Hu14E3-La VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLSWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGAHFPLTFGQGTKLEIK ( SEQ ID NO: 47)
Hu14E3-Lb VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLSWLQQRPGQSPRRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGAHFPLTFGQGTKLEIK ( SEQ ID NO: 49 )
Hu22F1-Ha VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPKDGDSGYSHKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTVTVSS ( SEQ ID NO: 51 )
Hu22F1-Hb VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPKDGDSGYSHKFKGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTVTVSS ( SEQ ID NO: 53 )
Hu22F1-Hc VH QAQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPKDGDSGYSHKFKGRVTLTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 55)
Hu22F1-Hd VH QAQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMNWLRQAPGQGLEWIGDINPKDGDSGYSHKFKGRATLTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 57)
Hu22F1-La VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKVEIK ( SEQ ID NO: 59)
Hu22F1-Lb VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGFPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKVEIK ( SEQ ID NO: 61 )
Hu56C11-H0 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTSYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 131 )
Hu56C11-Ha VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTSYNQKFKGRVTMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 132)
Hu56C11-Hb VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMNWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 133)
Hu56C11-Hc VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMNWVKQAPGKGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 134)
Hu56C11-L0 VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKLEIK ( SEQ ID NO: 135)
Hu56C11-La VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKLEIK ( SEQ ID NO: 136)
Hu56C11-Lb VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKLEIK ( SEQ ID NO: 137)
本文所提供的人源化抗hGREM1抗體保持與hGREM1的特異性結合親和力，且在上述態樣中至少與親本抗體相當或甚至優於親本抗體。在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體及其片段進一步包含免疫球蛋白恆定區，視情況人類Ig的恆定區，或視情況人類IgG的恆定區。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區包含重鏈及/或輕鏈恆定區。重鏈恆定區包含CH1、鉸鏈及/或CH2-CH3區。在某些實施例中，重鏈恆定區包含Fc區。在某些實施例中，輕鏈恆定區包含Cκ或Cλ。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體及其片段進一步包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區。在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體及其抗原結合片段包含IgG1同種型的恆定區。在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體及其抗原結合片段包含IgG2b同種型的恆定區。
在某些實施例中，本文所提供的人源化抗體可包含與人類IgG1同種型的恆定區融合的重鏈可變區及與人類κ鏈的恆定區融合的輕鏈可變區。
抗體變體
本文所提供的抗hGREM1抗體及其抗原結合片段亦涵蓋本文所提供的抗體序列的各種類型的變體。
在某些實施例中，變體包含如表1中提供的1、2或3個CDR序列、一或多個FR序列、本文所提供的重鏈或輕鏈可變區序列及/或恆定區(例如Fc區)中的一或多個修飾或取代。此類抗體變體保留其親本抗體對hGREM1的特異性結合親和力，但具有由修飾或取代所賦予的一或多種所需特性。舉例而言，抗體變體可具有提高的抗原結合親和力、改善的糖基化模式、降低的糖基化風險、減少的脫胺基作用、降低或增加的效應功能、提高的FcRn受體結合、增加的藥代動力學半衰期、pH敏感性及/或與結合物(例如，一或多個引入的半胱胺酸殘基)的相容性等等。
可使用此項技術中已知的方法，例如「丙胺酸掃描突變誘發」(參見例如Cunningham及Wells (1989) 《科學》, 244:1081-1085)篩選親本抗體序列，以鑑別合適的或較佳的殘基進行修飾或取代。簡言之，可鑑別標靶殘基(例如帶電荷的殘基，如Arg、Asp、His、Lys及Glu)，且用中性或帶負電荷的胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)替換，且產生經修飾的抗體且針對關注的特性進行篩選。若在特定胺基酸位置的取代顯示出關注的功能變化，則上述位置可鑑別為用於修飾或取代的潛在殘基。可藉由用不同類型的殘基(例如，半胱胺酸殘基、帶正電荷的殘基等)取代來進一步評估潛在殘基。 i. 親和力變體
親和力變體保留親本抗體對hGREM1的特異性結合親和力，或甚至具有相對於親本抗體提高的hGREM1特異性結合親和力。此項技術中已知的各種方法可用於實現此目的。舉例而言，可產生抗體變體(如Fab或scFv變體)庫且用噬菌體呈現技術表現，且隨後針對對人類GREM1之結合親和力進行篩選。對於另一實例，可使用計算機軟件以虛擬地模擬抗體與人類GREM1之結合，且鑑別形成結合界面的抗體上的胺基酸殘基。此類殘基可避免進行取代以便防止結合親和力的降低，或作為取代的目標以實現較強結合。
在某些實施例中，CDR序列、FR序列或可變區序列中的取代中的至少一者(或全部)包含保守取代。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體或抗原結合片段包含一或多個CDR序列及/或一或多個FR序列中的一或多個胺基酸殘基取代。在某些實施例中，親和力變體包含在一或多個CDR序列及/或FR序列中總共不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個取代。
在某些實施例中，抗hGREM1抗體及其抗原結合片段包含與表1中所列的序列(或彼等序列)具有至少80%(例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列一致性的1、2或3個CDR序列，且同時保留與其親本抗體類似或甚至更高的水準的對hGREM1之結合親和力。 ii. 糖基化變體
本文所提供的抗hGREM1抗體及抗原結合片段亦涵蓋糖基化變體，其可被獲得以增加或降低抗體或抗原結合片段的糖基化程度。如本文中所使用，術語「糖基化」係指將如岩藻糖、木糖、甘露糖或GlcNAc磷酸絲胺酸聚糖的聚糖連接至蛋白質、脂質或其他有機分子上的酶促過程。取決於與聚糖連接的碳，糖基化可分為五個類別，包括：N-連接的糖基化、O-連接的糖基化、磷酸糖基化、C-連接的糖基化及糖基磷脂醯肌醇化。
抗體的糖基化典型為N-連接的或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基(例如三肽序列，如天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸中的天冬醯胺殘基，其中X為除脯胺酸外的任何胺基酸)的側鏈的連接。O-連接的糖基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者與羥基胺基酸的連接，最常見地為與絲胺酸或蘇胺酸的連接。
在某些實施例中，抗體糖基化變體可藉由例如移除天然糖基化位點(例如，藉由N297A取代)獲得，使得用於N-連接的糖基化位點的三肽序列或用於O-連接的糖基化位點的絲胺酸或蘇胺酸殘基不再存在於抗體或Fc序列中。或者，在某些實施例中，可藉由在宿主細胞株中產生抗體來獲得抗體糖基化變體，上述宿主細胞株在將所選擇的糖基團添加到抗體的成熟核心碳水化合物結構中時是有缺陷的。 iii. 半胱胺酸工程改造之變體
本文所提供的抗hGREM1抗體及抗原結合片段亦涵蓋半胱胺酸工程改造之變體，其包含一或多個引入的游離半胱胺酸胺基酸殘基。
游離半胱胺酸殘基為並非二硫橋鍵的一部分的半胱胺酸殘基。半胱胺酸工程改造之變體適用於藉由例如順丁烯二醯亞胺或鹵乙醯基在工程改造之半胱胺酸的位點處與例如細胞毒性及/或成像化合物、標記或放射性同位素等結合。用於工程改造抗體或抗原結合片段以引入游離半胱胺酸殘基的方法為此項技術中已知的，參見例如WO2006/034488。
抗原結合片段
本文亦提供抗hGREM1抗原結合片段。各種類型的抗原結合片段為此項技術中已知的，且可基於本文所提供的抗hGREM1抗體進行開發，包括例如其CDR序列顯示於表1中的示例性抗體及其不同變體(如親和力變體、糖基化變體、Fc變體、半胱胺酸工程改造之變體等)。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗原結合片段為雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv) 2、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單結構域抗體、奈米抗體、結構域抗體或二價結構域抗體。
各種技術可用於產生此類抗原結合片段。說明性方法包括完整抗體的酶促消化(參見例如Morimoto等人, 《生物化學與生物物理學方法雜誌(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)》 24:107-117 (1992)；及Brennan等人, 《科學》, 229:81 (1985))、由宿主細胞，例如大腸桿菌(E. Coli)重組表現(例如對於Fab、Fv及scFv抗體片段)、如上文所論述從噬菌體展示庫篩選(例如對於scFv)以及將兩個Fab'-SH片段化學偶聯以形成F(ab') 2片段(Carter等人, 《生物技術(Bio/Technology)》 10:163-167 (1992))。用於產生抗體片段的其他技術對於熟練的技術人員將是顯而易見的。
在某些實施例中，抗原結合片段為scFv。scFv的產生描述於例如WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；及第5,587,458號中。scFv可在胺基或羧基端與效應蛋白融合以提供融合蛋白(參見例如《抗體工程(Antibody Engineering)》, Borrebaeck編)。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體及其抗原結合片段為二價、四價、六價或多價的。如本文中所使用的術語「價數」係指在給定分子中存在指定數量的抗原結合位點。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示在抗原結合分子中存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。任何大於二價的分子被視為多價的，涵蓋例如三價、四價、六價等。
若兩個結合位點均對與相同抗原或相同抗原決定基之結合具有特異性，則二價分子可為單特異性的。在某些實施例中，此提供比單價對應物更強的與抗原或抗原決定基之結合。類似地，多價分子亦可為單特異性的。在某些實施例中，在二價或多價抗原結合部分中，結合位點的第一價及結合位點的第二價在結構上是相同的(即具有相同的序列)，或在結構上是不同的(即具有不同的序列，儘管具有相同的特異性)。
若兩個結合位點對不同的抗原或抗原決定基具有特異性，則二價亦可為雙特異性的。此亦適用於多價分子。舉例而言，當兩個結合位點對於第一抗原(或抗原決定基)為單特異性的且第三結合位點對第二抗原(或抗原決定基)具有特異性時，三價分子可為雙特異性的。
抗原決定基
在另一態樣中，本發明提供與本文所提供的抗體或其抗原結合片段所結合的相同抗原決定基結合的抗體。在另一態樣中，本發明提供與本文所提供的抗體或其抗原結合片段競爭結合於hGREM1的抗體。
如本文中所使用的術語「抗原決定基」係指抗體所結合的抗原上特定的一組原子或胺基酸。抗原決定基可包括直接接觸抗體的特定胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基。熟習此項技術者應認識到，有可能在無過度實驗的情況下，藉由確定抗體與本發明的抗體(例如，雜交瘤/嵌合或人源化抗體14E3、69H5、22F1、56C11、36F5、42B9及67G11以及其本文所提供的任何嵌合及人源化變體)是否競爭結合於GREM1抗原多肽，來確定二者是否結合相同或重疊或相鄰的抗原決定基。
如本文中所使用，關於兩種抗原結合蛋白(例如抗體)的術語「結合競爭」意謂一種抗原結合蛋白阻斷或降低另一種抗原結合蛋白與抗原(例如人類/小鼠GREM1)之結合，如藉由競爭性結合分析所測定。競爭性結合分析是此項技術中熟知的，包括例如直接或間接放射免疫分析(RIA)、直接或間接酶免疫分析(EIA)、Fortebio、競爭性ELISA分析及夾心競爭分析(參見例如Stahli等人, 1983, 《酶學方法》 9:242-253)。典型地，此分析涉及使用結合到固體表面的純化抗原或帶有抗原的細胞、未經標記的測試抗體及經標記的參考抗體。藉由測定在測試抗體的存在下結合到固體表面或細胞的標記的量來量測競爭性抑制。通常測試抗體過量存在。若兩種抗體競爭結合於hGREM1，則兩種抗體與相同或重疊的抗原決定基結合，或與另一種抗體結合的抗原決定基足夠近的相鄰抗原決定基結合，從而發生位阻。通常，當競爭性抗體過量存在時，其將使測試抗體與共同抗原的特異性結合抑制(例如降低)至少50%到55%、55%到60%、60%到65%、65%到70%、70%到75%、75%到80%、80%到85%、85%到90%或更多。
藉由生物特性分類的抗體的群組
本文所提供的抗體具有某些獨特的生物特性。共有某些獨特的生物特性的抗體可因此分類成多個群組。
i) 具有 hGREM1 介導之對 BMP 信號傳導的抑制的癌細胞選擇性降低的抗體
在某些實施例中，相對於非癌細胞，本文所提供的抗體能夠選擇性地降低癌細胞中hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制，且包含選自由以下組成之群的抗體的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3：14E3、22F1、56C11、69H5、42B9、36F5及67G11。此等抗體特別適用於治療癌症的方法。
本發明意外地發現使用本文所提供的某些抗GREM1抗體中和GREM1選擇性地抑制癌細胞中GREM1介導之對BMP信號傳導的抑制，但不顯示此抑制或僅在非癌細胞中顯示極有限的抑制。
消除GREM1及/或降低癌細胞中GREM1的活性是較佳的，因為此將對癌細胞增殖及球體形成具有抑制性影響，且亦誘導癌細胞凋亡。然而，對GREM1的抑制一般可為非所要的，因為小鼠中的 GREM1的習知基因敲除造成腸道及造血系統的病症的異常發展( Rowan, S. C.等人《體內的 Gremlin 1耗竭造成嚴重腸病及骨髓衰竭( Gremlin 1 depletion in vivo causes severe enteropathy and bone marrow failure)》 .《病理學雜誌( J Pathol)》 251, 117-122)。此表明GREM1的習知消除及/或其活性的降低將不可避免地造成對其他正常組織的不利影響。在這點上，GREM1介導之本文所提供的抗GREM1抗體對BMP信號傳導的抑制的未預期的癌症特異性調節藉由避免對正常組織的非所要副作用而為有利的。
在某些實施例中，本文所提供的抗GREM1抗體在非癌細胞中展現GREM1介導之對BMP信號傳導的抑制降低不超過50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%。
如本文中所使用的短語「BMP信號傳導」意謂可由GREM1抑制的一或多個BMP配體的信號傳導。在某些實施例中，BMP信號傳導為BMP-2信號傳導及/或BMP-4信號傳導。
如本文中所使用的短語「非癌細胞」係指不為癌細胞的細胞。非癌細胞可為細胞株，一種自個體分離的初級細胞。
可藉由在存在及不存在GREM1的情況下分別量測BMP配體的BMP信號傳導來確定GREM1介導之對BMP信號傳導的抑制，其中差異指示GREM1介導之抑制。然而，抗GREM1抗體可降低GREM1介導之對BMP信號傳導的抑制，或換言之，恢復BMP信號傳導。GREM1介導之對BMP信號傳導的抑制降低或恢復可計算為在抗GREM1抗體的存在下的BMP信號傳導相對於不存在抗GREM1抗體的情況下的BMP信號傳導的增加。此降低或此恢復的百分比可計算為GREM1介導之抑制的降低與總GREM1介導之抑制的比率。GREM1介導之對BMP信號傳導的抑制的100%降低將意謂BMP信號傳導恢復到與不存在GREM1的情況下的水準基本上相同的水準，且0%降低將意謂BMP信號傳導並未恢復。
ii) 與嵌合 hGREM1( 即 ， XM5) 結合的抗體
在某些實施例中，本文所提供的某些抗GREM1抗體在BMP結合環外部的抗原決定基處與GREM1結合。在某些實施例中，BMP結合環包含SEQ ID NO: 63的胺基酸序列。
在某些實施例中，本文所提供的抗GREM1抗體能夠與包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的嵌合GREM1(在本文中亦稱為「XM5」)結合。嵌合GREM1 XM5包含hGREM1的突變版本，其中BMP之結合環(即，hGREM1的第123至第143胺基酸殘基(NSFYIPRHIRKEEGSFQSCSF，SEQ ID NO: 63))用DAN的第63至第83胺基酸(FSYSVPNTFPQSTESLVHCDS，SEQ ID NO: 64)替換，上述突變版本不與BMP結合。因此，此嵌合hGREM1不與BMP結合。某些現有抗GREM1抗體不能與此嵌合hGREM1結合，表明其與hGREM1之結合需要hGREM1中的BMP結合環。相反，本文所提供的抗GREM1抗體能夠與此嵌合hGREM1結合，表明其在此BMP結合環外部的抗原決定基處與hGREM1結合。
在某些實施例中，本文所提供的抗體能夠與包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的嵌合hGREM1結合，且包含選自由以下組成之群的抗體的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3：14E3、42B9、67G11、36F5、56C11、22F1及69H5。
基準抗體6245P不能夠與X5結合。
iii ) 與小鼠 GREM1 具有交叉反應性或不具有交叉反應性的抗體
在某些實施例中，一些本文所提供的抗GREM1抗體能夠與hGREM1結合而非與小鼠GREM1特異性結合。
hGREM1及小鼠GREM1共有98%的序列一致性，且僅在hGREM1的N端部分中發現不同的胺基酸殘基，包括hGREM1的Gln27及Asn33，其中殘基編號係根據SEQ ID NO: 69。因此，對於不與小鼠GREM1交叉反應的抗GREM1抗體，預期其可在包含hGREM1的Gln27及/或Asn33的抗原決定基處與hGREM1結合，其中殘基編號係根據SEQ ID NO: 69，或與包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的hGREM1片段結合，視情況hGREM1片段具有至少3個(例如，4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸殘基的長度。抗原決定基可為構型抗原決定基或線性抗原決定基。
在某些實施例中，本文所提供的抗體能夠與hGREM1結合而非與小鼠gremlin1特異性結合，且包含選自由69H5、22F1及14E3組成之群的抗體的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體對小鼠GREM1具有交叉反應性，且包含選自由以下組成之群的抗體的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3：56C11、42B9、36F5及67G11。
基準抗體6245P對小鼠GREM1具有交叉反應性。
iv) 阻斷 hGREM1 與 BMP7 之結合的抗體
在某些實施例中，本文所提供的抗體能夠以如藉由ELISA所量測的至少50%的最大阻斷百分比阻斷hGREM1與BMP7之結合。
如本文中所使用，術語「阻斷百分比」係指相對於在不存在阻斷劑的情況下兩種蛋白質之間的相互作用，在阻斷劑(例如，抗gremlin 1抗體)的存在下兩種蛋白質之間的相互作用降低(例如，人類gremlin 1與BMP7之結合降低)的百分比。
如本文中所使用，術語「最大阻斷百分比」係指可藉由阻斷劑(例如，抗gremlin 1抗體)阻斷兩種蛋白質(例如，人類gremlin 1及BMP7)之間的相互作用達成的最高(即，平線區)阻斷百分比。一般而言，阻斷的百分比隨著阻斷劑(例如，抗gremlin 1抗體)的濃度增加而增加，然而，其可達到穩定期，其中儘管阻斷劑(例如，抗gremlin 1抗體)的濃度進一步增加，但無法實現更多阻斷。最大阻擋百分比越高，阻斷更有效。最大阻斷百分比可在一定程度上視不同分析，例如競爭性ELISA分析及競爭性FACS分析而變化。
在某些實施例中，本文所提供的某些抗gremlin 1抗體對hGREM1-BMP7相互作用的最大阻斷百分比為至少50%，如藉由競爭性ELISA分析所量測。分析條件可類似於本發明的實例6中所提供的彼等條件(人類gremlin 1的濃度為1 μg/ml，且BMP7的濃度為0.5 μg/ml)。對於hGREM1-BMP7相互作用具有上文提及的阻斷活性的示例性抗gremlin 1抗體包括14E3(例如，14E3HaLa)、42B9、36F5及67G11。
在某些實施例中，本文所提供的某些抗gremlin 1抗體對hGREM1-BMP7相互作用的最大阻斷百分比為至少60%、至少70%或至少75%，如藉由競爭性ELISA分析所量測。分析條件可類似於本發明的實例6中所提供的彼等條件(人類gremlin 1的濃度為1 μg/ml，且BMP7的濃度為0.5 μg/ml)。對於hGREM1-BMP7相互作用具有上文提及的阻斷活性的示例性抗gremlin 1抗體包括42B9、36F5及67G11。
BMP-7是具有半胱胺酸結的同源二聚體蛋白質，其僅在若干成年器官，包括腎臟中選擇性表現( Rui等人 ,《腎纖維化中的骨形態生成蛋白-7的作用( Role of bone morphogenetic protein-7 in renal fibrosis)》 ,《生理學前沿( Front. Physiol.)》 , 2015 年 4 月 23 日)。BMP-7在正常腎臟中的表現在成年器官中是最高的，且在患有局部缺血再灌注損傷、糖尿病性腎病變及高血壓腎硬化的患者的腎臟中下調( Dudley等人 ,《在哺乳動物腎臟及眼睛的發育期間需要骨形態生成蛋白-7( A requirement for bone morphogenetic protein-7 during development of the mammalian kidney and eye)》 .《基因發展》 9, 2795-2807, 1995 ； Luo等人 ,《BMP-7是腎發生的誘導劑，且還是眼睛發育及骨骼模式化所需的( BMP-7 is an inducer of nephrogenesis, and is also required for eye development and skeletal patterning)》 .《基因發展》 9, 2808-2820. 1995 ； Simon等人 ,《正常及缺血性成年大鼠腎臟中骨形態生成蛋白-7 mRNA的表現( Expression of bone morphogenetic protein-7 mRNA in normal and ischemic adult rat kidney)》 . 《美國生理學雜誌( Am. J. Physiol.)》 276, F382-F389, 1999 ； Wang等人 ,《糖尿病性腎病變中的管狀骨形態生成蛋白-7的損失( Loss of tubular bone morphogenetic protein-7 in diabetic nephropathy)》 .《美國腎臟病學會雜誌( J. Am. Soc. Nephrol.)》 12, 2392-2399, 2001 ； Bramlage等人 ,《在人類高血壓腎硬化中降低骨形態生成蛋白(BMP)-7表現( Bone morphogenetic protein (BMP)-7 expression is decreased in human hypertensive nephrosclerosis)》 .《BMC腎病學( BMC Nephrol.)》 11:31., 2010 ； Vukicevic等人 ,《成骨蛋白質-1(骨形態生成蛋白-7)在大鼠中降低缺血性急性腎衰竭之後的損傷的嚴重程度( Osteogenic protein-1 (bone morphogenetic protein-7) reduces severity of injury after ischemic acute renal failure in rat)》 .《臨床研究雜誌( J. Clin. Invest.)》 102, 202-214., 1998 ； Simon等人 ,《正常及缺血性成年大鼠腎臟中骨形態生成蛋白-7 mRNA的表現》 .《美國生理學雜誌》 276, F382-F389., 1999)。
作為TGFβ超家族中的關鍵細胞因子中的一者，BMP7在慢性腎病中藉由平衡TGF-β信號傳導路徑起抗纖維化作用，此藉由增加胞外基質(ECM)產生及減少其降解來介導腎纖維發生( Rui等人 ,《腎纖維化中的骨形態生成蛋白-7的作用》 ,《生理學前沿》 , 2015 年 4 月 23 日)。據報道腎臟損傷的若干動物模型中的BMP7治療逆轉腎纖維化且恢復腎功能( Hruska等人 ,《成骨蛋白質-1防止與輸尿管阻塞相關的腎纖維發生( Osteogenic protein-1 prevents renal fibrogenesis associated with ureteral obstruction)》 .《美國生理學腎生理學雜誌( Am. J. Physiol. Renal Physiol.)》 279, F130-F143.(2000) ； Jeremiah等人 ,《骨形態生成蛋白 -7改善腎纖維化且加快腎功能的恢復( Bone morphogenetic protein-7 improves renal fibrosis and accelerates the return of renal function)》 ,《美國腎臟病學會雜誌》 2002 年 1 月；)。
然而，腎臟中BMP7的活性不僅藉由BMP7自身的可用性確定，而且藉由激動劑與拮抗劑(例如，gremlin)的平衡確定。當BMP7用於治療腎纖維化及其他腎病(例如，急性及慢性腎損傷)時，BMP7拮抗劑(例如，gremlin)的存在必須考慮到其治療功效( Michael等人, 《藉由BMP7逆轉實驗性腎纖維化提供慢性腎病的新穎治療策略的深刻見解( Reversal of experimental renal fibrosis by BMP7 provides insights into novel therapeutic strategies for chronic kidney disease)》 ,《小兒腎臟病雜誌( Pediatr Nephrol.)》 2008 年 9 月 ; 23(9): 1395-8)。
本發明顯示gremlin 1與BMP7結合，且與基準抗體相比，本文所提供的抗gremlin 1抗體(例如，42B9、36F5、67G11及14E3HaLa)對於gremlin 1與BMP7之結合具有更有效的阻斷活性。如本文中所使用，術語「基準抗體」係指任何現有抗GREM1抗體(如6245P)，其係根據WO2014159010中所揭示之H4H6245P的序列產生，上述專利的公開內容以全文引用的方式併入本文中。換言之，本文所提供的抗gremlin 1抗體(例如，42B9、36F5、67G11及14E3HaLa)能夠在表現BMP7的器官(例如，腎臟)功能中恢復BMP7活性。因此，可以合理地預期本文所提供的抗gremlin 1抗體(例如，42B9、36F5、67G11及14E3HaLa)可提高對纖維化疾病及腎病(例如腎纖維化)的治療的功效。
在某些實施例中，本文所提供的抗體能夠以如藉由ELISA所量測的至少50%的最大阻斷百分比阻斷hGREM1與BMP7之結合，且包含選自由42B9、36F5及67G11組成之群的抗體的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3。在某些實施例中，本文所提供的抗體能夠以如藉由ELISA所量測的30%至50%的最大阻斷百分比阻斷hGREM1與BMP7之結合，且包含抗體14E3的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3。
v) 阻斷 FGFR 與 GREM1 之結合的抗體
在某些實施例中，本文所提供的抗體能夠阻斷GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)與FGFR(例如FGFR1，較佳為人類FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))的阻斷相互作用之結合，且包含選自由以下組成之群的抗體的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3：14E3、42B9、67G11及36F5。此等抗體特別適用於治療與GREM1結合FGFR或FGFR活性相關的病狀或疾病的方法。
在某些實施例中，本文所提供的抗體不阻斷GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)與FGFR(例如FGFR1，較佳為人類FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))的阻斷相互作用之結合，且包含選自由56C11組成之群的抗體的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3。
在某些實施例中，本文所提供的抗體部分地阻斷(具有至少2nM、至少3nM、至少4nM、至少5nM、至少6nM、或至少7nM的IC50)GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)與FGFR(例如，FGFR1，較佳為人類FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))的阻斷相互作用之結合，且包含抗體22F1或69H5的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3。
vi) 降低 GREM1 介導之對 MAPK 信號傳導的活化的抗體
在某些實施例中，本文所提供的抗GREM1抗體能夠降低GREM1介導之對MAPK信號傳導的活化。此項技術中熟知，MAPK信號傳導是維持腫瘤細胞增殖、遷移、血管生成及上皮-間葉細胞轉變(epithelial-mesenchymal transition；EMT)的關鍵信號路徑。此項技術中已知MAPK信號傳導可經由表皮生長因子(EGF)受體被其稱為EGF的配體活化，或經由成纖維細胞生長因子(FGF)受體被其稱為FGF的配體活化。本發明意外地發現GREM1似乎在MAPK信號傳導的活化中發揮作用，且可能充當FGFR的新穎配體。本發明進一步發現本文所提供的抗GREM1抗體能夠降低GREM1介導之對MAPK信號傳導的活化，尤其能夠阻斷GREM1與FGFR之相互作用。
vii) 與 hGREM1 及 DAN 兩者結合的抗體
本發明中提供的抗體可與包括GREM1的一或多個(例如，1、2、3個或更多個)DAN家族成員特異性結合。在某些實施例中，本文所提供的抗體能夠與hGREM1及DAN兩者結合。如本文中所使用，術語「DAN」係指DAN家族的初始成員(亦稱為NbI1及DAND1)，此係一種調節BMP信號的適度拮抗劑。DAN最初在成神經細胞瘤中作為腫瘤抑制基因。BMP信號傳導及DAN抑制之間的平衡失調可導致多種病況，包括癌症、腎病及肺動脈高血壓。Gremlin充當強效拮抗劑，DAN起中等強度拮抗劑的作用。儘管二者都能拮抗BMP2、BMP4及BMP7，但僅有約20%的一致性。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體能夠與hGREM1及DAN兩者結合，且包含選自由36F5、42B9及67G11組成之群的抗體的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3。此等抗體特別適用於治療與GREM1及DAN兩者相關的病狀或疾病的方法。
在某些實施例中，本文所提供的抗hGREM1抗體能夠與hGREM1而非與DAN結合，且包含抗體14E3、22F1、56C11或69H5的重鏈CDR1(HCDR1)、HCDR2及HCDR3以及輕鏈CDR1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3。
雙特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段為雙特異性的。如本文中所使用的術語「雙特異性」涵蓋具有超過兩種特異性的分子及具有超過兩種特異性，即多特異性的分子。在某些實施例中，本文所提供的雙特異性抗體及其抗原結合片段能夠與hGREM1的第一及第二抗原決定基特異性結合，或能夠與hGREM1及第二抗原特異性結合。在某些實施例中，hGREM1的第一抗原決定基及第二抗原決定基彼此不同或不重疊。在某些實施例中，雙特異性抗體及其抗原結合片段可同時與第一抗原決定基及第二抗原決定基兩者結合。在某些實施例中，第二抗原不同於hGREM1。
在某些實施例中，第二抗原為免疫相關標靶。如本文中所使用，免疫相關標靶涵蓋參與免疫反應(視情況，細胞免疫反應)的產生、抑制或調節的生物分子。免疫相關標靶的一實例為免疫檢查點分子。
免疫檢查點分子可介導共刺激信號以增強免疫反應，或可介導共抑制信號以抑制免疫反應。免疫檢查點分子的實例包括例如PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGF β、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16及CD83。在某些實施例中，第二抗原包含PD-1、PD-L1、CTLA-4或LAG-3。
在某些實施例中，第二抗原包含腫瘤抗原。如本文中所使用的「腫瘤抗原」係指腫瘤特異性抗原(例如，腫瘤細胞特有的且通常在非腫瘤細胞上不存在的彼等抗原)，以及腫瘤相關抗原(例如在腫瘤及非腫瘤細胞中都存在但在腫瘤細胞中不同地表現，或在腫瘤微環境中發現)。腫瘤特異性抗原亦可包括腫瘤新抗原(例如，其由於改變蛋白質序列或在兩個不相關序列之間產生融合蛋白的體細胞突變而在癌細胞中表現)。
腫瘤抗原的實例包括但不限於***特異性抗原(PSA)、CA-125、神經節苷脂G(D2)、G(M2)及G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、鈴蟾素樣肽、HER2/neu、表皮生長因子受體(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相關黏蛋白、VEGF、VEGFR(例如，VEGFR3)、***受體、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受體、EGFα、c-Kit受體、轉鐵蛋白受體、緊密連接蛋白18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、間皮素、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
在某些實施例中，腫瘤抗原包含***特異性抗原(PSA)、CA-125、神經節苷脂G(D2)、G(M2)及G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、鈴蟾素樣肽、HER2/neu、表皮生長因子受體(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相關黏蛋白、VEGF、VEGFR(例如，VEGFR3)、***受體、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受體、EGFα、c-Kit受體、轉鐵蛋白受體、緊密連接蛋白18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、間皮素、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
本文所提供的雙特異性抗體及其抗原結合片段可為此項技術中已知的合適格式。舉例而言，示例性雙特異性格式可為雙特異性雙功能抗體、基於scFv的雙特異性格式、IgG-scFv融合物、雙可變結構域(DVD)-Ig、四源雜交瘤、杵臼(knobs-into-holes)、共同輕鏈(例如，具有杵臼的共同輕鏈等)、BiTE、CrossMab、CrossFab、Duobody、SEEDbody、白胺酸拉鏈、雙作用Fab(DAF)-IgG及Mab 2雙特異性格式(參見例如Brinkmann等人2017, 《單抗(Mabs)》, 9(2): 182-212)。雙特異性分子可呈對稱或不對稱的架構。
本文所提供的雙特異性抗體及抗原結合片段可用此項技術中已知的任何合適方法製備。
在一個實施例中，將兩個具有不同抗原特異性的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對在宿主細胞中共表現，從而以重組方式產生雙特異性抗體(參見例如Milstein及Cuello, 《自然》, 305: 537 (1983))，隨後藉由親和層析法純化。
在另一實施例中，編碼針對兩種特異性的抗體重鏈可變結構域的序列分別與免疫球蛋白恆定結構域序列融合，隨後***到一或多種表現載劑，上述表現載劑與針對輕鏈序列的表現載劑共轉染到合適的宿主細胞中以重組表現雙特異性抗體(參見例如WO 94/04690；Suresh等人, 《酶學方法(Methods in Enzymology)》, 121:210 (1986))。類似地，scFv二聚體亦可重組地構建且由宿主細胞表現(參見例如，Gruber等人, 《免疫學雜誌》, 152:5368 (1994))。
在另一方法中，可以藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白質的白胺酸拉鏈肽連接至兩種不同抗體的Fab'部分。所連接的抗體在鉸鏈區還原為四種半抗體(即，單體)，且接著再氧化以形成異源二聚體(Kostelny等人, 《免疫學雜誌》, 148(5):1547-1553 (1992))。
亦可綴合或交聯兩個抗原結合結構域以形成雙特異性抗體或抗原結合片段。舉例而言，一種抗體可偶聯至生物素，而另一種抗體偶聯至抗生物素蛋白，且生物素與抗生物素蛋白之間的強締合將使兩種抗體複合在一起以形成雙特異性抗體(參見例如美國專利第4,676,980號；WO 91/00360、WO 92/00373及EP 03089)。對於另一實例，可藉由此項技術中已知的，例如如美國專利第4,676,980號中所揭示之習知方法交聯兩種抗體或抗原結合片段。
雙特異性抗原結合片段可例如藉由蛋白水解裂解或藉由化學連接由雙特異性抗體產生。舉例而言，可製備抗體的抗原結合片段(例如，Fab')且將其轉化為Fab'-硫醇衍生物，且接著與具有不同抗原特異性的另一種轉化的Fab'衍生物混合且反應以形成雙特異性抗原結合片段(參見例如Brennan等人, 《科學》, 229: 81 (1985))。
在某些實施例中，本文所提供的雙特異性抗體或其抗原結合片段可在界面處工程改造以使得可形成杵臼締合以促進兩種不同的抗原結合位點的異源二聚體化。此可最大化從重組細胞培養物回收的異源二聚體的百分比。如本文中所使用，「杵臼」係指兩種多肽(如Fc)之間的相互作用，其中一種多肽由於存在具有龐大側鏈的胺基酸殘基(例如，酪胺酸或色胺酸)而具有突起(即，「杵」)，且另一種多肽具有空腔(即，「臼」)，其中小側鏈胺基酸殘基駐留(例如，丙胺酸或蘇胺酸)，且突起可定位於空腔中以便促進兩種多肽之相互作用從而形成異源二聚體或複合物。產生具有杵臼的多肽的方法為此項技術中已知的，例如如美國專利第5,731,168號中所描述。
綴合物
在一些實施例中，將抗hGREM1抗體及其抗原結合片段連接至一或多個結合部分。綴合物為可連接至抗體或其抗原結合片段的部分。可以想到，多種綴合物可連接至本文所提供的抗體或抗原結合片段(參見例如「綴合物疫苗(Conjugate Vaccines)」, 《微生物學及免疫學的貢獻(Contributions to Microbiology and Immunology)》, J. M. Cruse及R. E. Lewis, Jr. (編), Carger Press, New York, (1989))。此等綴合物可藉由共價結合、親和力結合、嵌入、配位結合、複合、締合、摻合或添加等方法連接至抗體或抗原結合片段。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段係藉由連接子連接至一或多個綴合物。在某些實施例中，連接子為腙連接子、二硫鍵連接子、雙官能連接子、二肽連接子、葡萄糖苷酸連接子、硫醚連接子。
在某些實施例中，可以工程改造本文所揭示之抗hGREM1抗體及抗原結合片段以在抗原決定基結合部分之外含有特異性位點，上述位點可用於與一或多個綴合物結合。舉例而言，此位點可包括一或多個反應性胺基酸殘基，例如半胱胺酸或組胺酸殘基，以有助於與綴合物的共價鍵聯。
綴合物可為清除調節劑、治療劑(例如，化學治療劑)、毒素、放射性同位素、可偵測標記(例如，鑭系元素、發光標記、螢光標記或酶-受質標記)、藥代動力學調節部分、DNA烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑、稱為例如雄激素受體抑制劑的其他抗癌藥物。
可偵測標記的實例可包括螢光標記(例如，螢光素、羅丹明(rhodamine)、丹醯(dansyl)、藻紅蛋白(phycoerythrin)或德克薩斯紅(Texas Red))、酶-受質標記(例如，辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素、其他鑭系元素、發光標記、發色部分、地高辛(digoxigenin)、生物素/抗生物素蛋白、DNA分子或偵測用金。
放射性同位素的實例可包括 123I、 124I、 125I、 131I、 35S、 3H、 111In、 112In、 14C、 64Cu、 67Cu、 86Y、 88Y、 90Y、 177Lu、 211At、 186Re、 188Re、 153Sm、 212Bi及 32P。放射性同位素標記的抗體適用於受體靶向成像實驗。
在某些實施例中，綴合物可為藥代動力學調節部分(如PEG)，其有助於增加抗體的半衰期。其他合適的聚合物包括例如羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。
在某些實施例中，綴合物可為純化部分，如磁珠或奈米粒子。
醫藥組合物
本發明提供醫藥組合物，其包含抗hGREM1抗體或其抗原結合片段及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
用於本文所揭示之醫藥組合物中的醫藥學上可接受之載劑可包括例如醫藥學上可接受之液體、凝膠或固體載劑、水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮劑/分散劑、螯合劑(sequestering/chelating agents)、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒輔助物質、此項技術中已知的其他組分，或其各種組合。
合適的組分可包括例如抗氧化劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝劑、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑，如糖及環糊精。合適的抗氧化劑可包括例如甲硫胺酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱胺酸、硫代甘油、巰基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯及/或沒食子酸丙酯。如本文所揭示，在包含如本文所提供的抗體或抗原結合片段及綴合物的組合物中包括一或多種抗氧化劑(如甲硫胺酸)減少抗體或抗原結合片段的氧化。此氧化的減少防止或減少結合親和力的損失，由此提高抗體穩定性且使儲存壽命最大化。因此，在某些實施例中，提供包含一或多種如本文所揭示之抗體或抗原結合片段及一或多種抗氧化劑(如甲硫胺酸)的組合物。進一步提供藉由將抗體或抗原結合片段與一或多種抗氧化劑(如甲硫胺酸)混合來防止如本文所提供的抗體或抗原結合片段的氧化、延長其保存期及/或提高其功效的方法。
為了進一步說明，醫藥學上可接受之載劑可包括例如水性媒劑，如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液或右旋糖及乳酸林格氏注射液；非水性媒劑，如植物來源的非揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；抑制細菌或抑制真菌濃度的抗微生物劑；等滲劑，如氯化鈉或右旋糖；緩衝劑，如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑；抗氧化劑，如硫酸氫鈉；局部麻醉劑，如鹽酸普魯卡因(procaine hydrochloride)；懸浮劑及分散劑，如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯啶酮；乳化劑，如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)；螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。可將用作載劑的抗微生物劑添加到多劑量容器中的醫藥組合物中，上述抗微生物劑包括苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯紮氯銨(benzalkonium chloride)及苄索氯銨(benzethonium chloride)。合適的賦形劑可包括例如水、生理鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。合適的無毒輔助物質可包括例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解度增強劑或如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精的試劑。
醫藥組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、丸劑、膠囊、片劑、持續釋放調配物或散劑。口服調配物可包括標準載劑，如藥用級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
在某些實施例中，醫藥組合物調配成可注射組合物。可注射的醫藥組合物可以任何習知形式製備，例如液體溶液、懸浮液、乳液或適用於產生液體溶液、懸浮液或乳液的固體形式。注射用製劑可包括準備好用於注射的無菌及/或無熱原質溶液；僅在使用之前準備與溶劑組合的無菌乾燥可溶性產品，如凍乾粉末，包括皮下片劑；準備好用於注射的無菌懸浮液；僅在使用之前準備與媒劑組合的無菌乾燥不溶性產品；及無菌及/或無熱原質乳液。溶液可為水性或非水性的。
在某些實施例中，單位劑量的腸胃外製劑被包裝在安瓿、小瓶或帶針頭的注射器中。所有用於腸胃外投與的製劑均應為無菌的且無熱原質的，正如此項技術中已知及實踐的那樣。
在某些實施例中，無菌凍乾粉末係藉由將如本文中所揭示之抗體或抗原結合片段溶解於合適溶劑中製備。溶劑可含有提高粉末或由粉末製備的復原溶液的穩定性或其他藥理學組分的賦形劑。可使用的賦形劑包括但不限於水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合適的試劑。溶劑可含有緩衝劑，如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或熟習此項技術者已知的其他此類緩衝劑，在一個實施例中，上述緩衝劑為約中性pH。隨後無菌過濾溶液，接著在熟習此項技術者已知的標準條件下凍乾，得到所需調配物。在一實施例中，將所得溶液分配到小瓶中以凍乾。每個小瓶可含有單劑量或多劑量的抗hGREM1抗體或其抗原結合片段或其組合物。使小瓶過量填充高於一個劑量或一組劑量所需的少量(例如約10%)是可接受的，以便有助於準確樣品抽取及準確給藥。凍乾粉末可在適當條件下儲存，例如在約4℃到室溫下。
用注射用水復原凍乾粉得到用於腸胃外投與的調配物。在一個實施例中，為了復原，將無菌及/或無熱原質水或其他合適的液體載劑添加到凍乾粉末中。精確量取決於所給定的所選療法，且可憑經驗確定。
在某些實施例中，醫藥組合物進一步包含第二治療劑。
在某些實施例中，第二治療劑可為用於治療癌症的藥劑，例如化學治療劑、抗癌藥物、放射療法、免疫療法、抗血管生成劑(例如，如VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3的VEGFR的拮抗劑)、靶向療法、細胞療法、基因療法藥劑、激素療法藥劑、細胞因子、姑息治療、用於治療癌症的手術(例如，腫瘤切除術)或一或多種抗嘔劑或由化學療法引起的併發症的其他治療。
在某些實施例中，第二治療劑包含抗血管生成劑，例如VEGFR或VEGF的拮抗劑。在某些實施例中，第二治療劑包含抗VEGFR抗體或抗VEGF抗體。在某些實施例中，第二治療劑包含抗VEGFR-2抗體。
在某些實施例中，第二治療劑可為用於治療纖維化疾病的藥劑。
在某些實施例中，第二治療劑管理或治療至少一種與纖維化或癌症相關的併發症。
聚核苷酸及重組方法
本發明提供編碼抗hGREM1抗體及其抗原結合片段的分離的聚核苷酸。如本文中所使用的術語「核酸」或「聚核苷酸」係指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非另外指示，否則特定聚核苷酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如簡併密碼子取代)、等位基因、直系同源物、SNP及互補序列，以及明確指示的序列。具體而言，簡併密碼子取代可藉由產生其中一或多個選定(或全部)密碼子的第三位置被經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(參見Batzer等人, 《核酸研究(Nucleic Acid Res.)》 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, 《生物化學雜誌(J. Biol. Chem.)》 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人, 《分子細胞探針(Mol. Cell. Probes)》 8:91-98(1994))。
在某些實施例中，分離的聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 9、10、19、20、29、30、39、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62及142至147中所示的一或多個核苷酸序列，及/或與其具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性的序列，及/或其僅具有簡併取代的變體，且編碼本文所提供的示例性抗體的可變區。
編碼單株抗體的DNA極容易使用習知程序(例如，藉由使用能夠與編碼抗體的重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)進行分離且測序。亦可藉由合成方法獲得編碼DNA。
本發明提供包含本文所提供的分離的聚核苷酸的載劑(例如表現載劑)。在某些實施例中，本文所提供的表現載劑包含編碼本文所提供的抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸、至少一個可操作地連接至聚核苷酸序列的啟動子(例如，SV40、CMV、EF-1α)及至少一個選擇標記。載劑的實例包括但不限於逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌體及M13噬菌體、質粒，如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
可將包含編碼抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸序列的載劑引入宿主細胞中以進行選殖或基因表現。用於選殖或表現本文載劑中的DNA的合適宿主細胞為上文所描述的原核生物、酵母或更高等真核生物細胞。用於此目的的合適的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性生物體(Gram-negative organism)或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科( Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬( Escherichia)，例如大腸桿菌；腸桿菌屬( Enterobacter)；歐文氏菌屬( Erwinia)；克雷伯氏菌屬( Klebsiella)；變形桿菌屬( Proteus)；沙門氏菌屬( Salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌( Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌屬( Serratia)，例如黏質沙雷氏菌( Serratia marcescans)；及志賀桿菌屬( Shigella)，以及芽孢桿菌屬( Bacilli)，如枯草芽孢桿菌( B. subtilis)及地衣芽孢桿菌( B. licheniformis)；假單胞菌屬( Pseudomonas)，如綠膿桿菌( P. aeruginosa)；及鏈黴菌屬( Streptomyces)。
除原核生物以外，真核微生物，如絲狀真菌或酵母係抗hGREM1抗體編碼載劑的合適的選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常見的烘焙酵母係低級真核宿主微生物中最常用的。然而，多種其他屬、物種及菌株在本文中是常用的且適用的，如粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬( Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克魯維酵母( K. lactis)、脆壁克魯維酵母( K. fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母( K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克魯維酵母( K. wickeramii)(ATCC 24,178)、克魯維雄酵母( K. waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母( K. drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母( K. thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母( K. marxianus)；耶氏酵母屬( yarrowia)(EP 402,226)；畢赤酵母( Pichia pastoris)(EP 183,070)；假絲酵母屬( Candida)；瑞氏木黴( Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脈孢菌( Neurospora crassa)；許旺酵母屬( Schwanniomyces)，如西方許旺酵母( Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌，例如脈孢菌屬( Neurospora)、青黴菌屬( Penicillium)、彎頸黴屬( Tolypocladium)及麴黴屬( Aspergillus)宿主，如構巢麴黴( A. nidulans)及黑麴黴( A. niger)。
用於表現本文所提供的糖基化抗體或抗原片段的合適的宿主細胞來源於多細胞生物體，如無脊椎動物細胞，例如植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株及變體以及來自如下宿主的對應容許的昆蟲宿主細胞：草地貪夜蛾( Spodoptera frugiperda)(毛蟲(caterpillar))、埃及伊蚊( Aedes aegypti)(蚊子(mosquito))、白紋伊蚊( Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶( Bombyx mori)。多種用於轉染的病毒株是可公開獲得的，例如苜蓿銀紋夜蛾( Autographa californica)NPV的L-1變體及家蠶NPV的Bm-5菌株，且此類病毒可根據本發明用作本文中的病毒，尤其用於轉染草地貪夜蛾細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸草的植物細胞培養物亦可用作宿主。
然而，對脊椎動物細胞的興趣最大，且在培養物(組織培養物)中脊椎動物細胞的繁殖已成為習知程序。適用的哺乳動物宿主細胞株的實例為由SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎系(亞選殖以在懸浮培養物中生長的293或293細胞，Graham等人, 《普通病毒學雜誌( J. Gen Virol.)》 36:59 (1977))；幼小倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人, 《美國國家科學院院刊》 77:4216 (1980))；小鼠支持細胞(TM4，Mather, 《生殖生物學( Biol. Reprod.)》 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人, 《紐約科學院年報( Annals N.Y. Acad. Sci.)》 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝瘤系(Hep G2)。在一些較佳實施例中，宿主細胞為哺乳動物培養細胞株，如CHO、BHK、NS0、293及其衍生物。
用上述用於產生抗hGREM1抗體的表現或選殖載劑轉化宿主細胞，且在按需要改良的習知營養培養基中培養，以誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼所需序列的基因。在另一實施例中，可藉由此項技術中已知的同源重組產生抗體。
用於產生本文所提供的抗體或抗原結合片段的宿主細胞可在各種培養基中培養。市售培養基，如Ham's F10(西格瑪(Sigma))、最小必需培養基(MEM)(西格瑪)、RPMI-1640(西格瑪)及杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM，西格瑪)適用於培養宿主細胞。另外，Ham等人, 《酶學方法(Meth. Enz.)》 58:44(1979)；Barnes等人, 《分析生物化學(Anal. Biochem.)》 102:255 (1980)；美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國再頒專利第30,985號中所描述的任何培養基都可以用作宿主細胞的培養基。此等培養基中的任一者都可以視需要補充激素及/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝劑(如HEPES)、核苷酸(如腺苷及胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN TM藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍內的最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量源。亦可包括熟習此項技術者已知的適當濃度的任何其他必要的補充劑。培養條件(如溫度、pH等)是先前與選擇用於表現的宿主細胞一起使用的彼等條件，且對於一般技術者將是顯而易見的。
當使用重組技術時，抗體可以在細胞內、在周質空間中產生，或直接分泌至培養基中。若在細胞內產生抗體，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾移除微粒碎片(宿主細胞或裂解片段)。Carter等人, 《生物技術》 10:163-167 (1992)描述一種用於分離分泌至大腸桿菌的周質空間的抗體的程序。簡言之，將細胞糊狀物在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)的存在下解凍約30分鐘。細胞碎片可藉由離心移除。在抗體分泌至培養基中的情況下，來自此類表現系統的清液層一般首先使用市售的蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)進行濃縮。如PMSF的蛋白酶抑制劑可包括在任何前述步驟中，以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物的生長。
由細胞製備的抗hGREM1抗體及其抗原結合片段可使用例如羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換層析法、硫酸銨沈澱、鹽析及親和層析法純化，其中親和層析法是較佳的純化技術。
在某些實施例中，固定於固相上的蛋白質A用於抗體及其抗原結合片段的免疫親和純化。蛋白質A作為親和配體的適合性取決於抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結構域的種類及同種型。蛋白質A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等人, 《免疫學方法雜誌》 62:1-13 (1983))。推薦蛋白質G用於所有小鼠同種型及人類γ3(Guss等人, 《歐洲分子生物學雜誌(EMBO J.)》 5:1567 1575 (1986))。親和配體所附接的基質通常係瓊脂糖，但亦可使用其他基質。如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯的機械穩定性基質允許相比於可用瓊脂糖實現更快的流速及更短的處理時間。當抗體包含CH3結構域時，Bakerbond ABX.TM.樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)適用於純化。視待回收的抗體而定，亦可使用用於蛋白質純化的其他技術，如離子交換柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、二氧化矽上的層析法、肝素SEPHAROSE TM上的層析法、陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬胺酸柱)上的層析法、層析焦聚、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟之後，可使用pH在約2.5-4.5之間的溶離緩衝液對包含所關注的抗體及污染物的混合物進行低pH疏水相互作用層析，較佳在低鹽濃度(例如約0-0.25 M鹽)下進行。
使用的方法
在一個態樣中，本發明提供本文所提供的抗體的治療用途。
在某些實施例中，本發明提供治療或預防有需要之個體的GREM1相關疾病或病狀的方法，其包括：投與治療有效量的如本文所提供的抗體或抗原結合片段及/或本文所提供的醫藥組合物，由此治療或預防GREM1相關疾病或病狀。
在另一態樣中，本發明提供治療有需要之個體的GREM1相關疾病或病狀的方法，其包括向個體投與治療有效量的抗人類GREM1抗體或其抗原結合片段，上述抗體或其抗原結合片段： a)能夠在包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的抗原決定基處與hGREM1結合，其中殘基編號係根據SEQ ID NO: 69，及/或 b)能夠與包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的hGREM1片段結合，視情況hGREM1片段具有至少3個(例如，4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸殘基的長度；及/或 c)相對於非癌細胞，能夠選擇性地降低癌細胞中hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制；及/或 d)在非癌細胞中展現hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制降低不超過50%；及/或 e)能夠與包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的嵌合hGREM1結合；及/或 g)能夠以如藉由Fortebio所量測的不超過1 nM的K D與hGREM1結合；及/或 h)能夠以如藉由ELISA所量測的大於50%的最大阻斷百分比阻斷hGREM1與BMP7之結合；及/或 i)能夠阻斷GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)與FGFR(例如FGFR1，較佳為人類FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))之相互作用。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制有需要之個體中的FGFR1活化的方法，或一種治療與由GREM1介導之FGFR1活化相關的疾病或病狀的方法，其包括向個體投與治療有效量的抗人類GREM1抗體或其抗原結合片段，其中抗人類GREM1抗體或其抗原結合片段包含： a)包含SEQ ID NO: 1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 2的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 3的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 5的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 6的序列的LCDR3； b)包含SEQ ID NO: 11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 12的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 13的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 15的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 16的序列的LCDR3； c)包含SEQ ID NO: 21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 22的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 23的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 25的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 26的序列的LCDR3； d)包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 33的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 36的序列的LCDR3； e)包含SEQ ID NO: 114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 116的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； f)包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3；或 g)包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制有需要之個體中的FGFR1活化的方法，或一種治療與由GREM1介導之FGFR1活化相關的疾病或病狀的方法，其包括向個體投與治療有效量的抗人類GREM1抗體或其抗原結合片段，其中抗人類GREM1抗體或其抗原結合片段包含： a)包含SEQ ID NO: 123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO: 124的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3， b)包含SEQ ID NO: 114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO: 116的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； c)包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3；或 d)包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3。
GREM1相關疾病或病狀可為受益於調節GREM1活性(例如，GREM1活性降低)的疾病或病狀。在一些實施例中，GREM1相關疾病或病狀之特徵在於GREM1表現或過度表現。
如本文中所使用的關於GREM1的術語「過度表現」係指相對於參考水準增加的表現量。參考水準可為相同組織類型的正常細胞中發現的GREM1表現的水準，視情況標準化為另一種基因(例如，管家基因(house keeping gene))的表現量。替代地，參考量可為健康個體中發現的GREM1表現的量。在一些實施例中，表現GREM1的癌症的GREM1表現量比參考水準高至少10%(例如，至少15%、20%、30%、35%、40%、50%或1倍、2倍、3倍或甚至更高)。
可基於核酸水準或蛋白質水準確定GREM1的表現。可在核酸水準下藉由此項技術中已知的任何方法，例如但不限於擴增分析(如聚合酶鏈反應、定量實時PCR、滾環式複製、等溫擴增等)、雜交分析(例如，RNA印跡法(Northern blotting)、微陣列、螢光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization；FISH)等)或測序分析(例如RNA測序)量測GREM1的表現量。替代地，可在蛋白質水準下藉由此項技術中已知的任何方法，例如但不限於免疫分析(如蛋白質印跡法(Western blotting)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、夾心分析、競爭性分析、免疫螢光染色及成像、免疫組織化學(IHC)及螢光活化細胞分選(FACS))量測GREM1的表現量。
在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，個體鑑別為具有GREM1表現或過度表現，視情況在自個體獲得的生物樣品中。
在一些實施例中，GREM1相關疾病或病狀選自由以下組成之群：癌症、纖維化疾病、血管生成、青光眼或視網膜疾病、腎病、肺動脈高血壓及骨關節炎(OA)。GREM1水準的增加已與許多此等疾病及病狀，如硬皮病、糖尿病性腎病變、神經膠質瘤、頭頸癌、***癌及結腸直腸癌相關。
i. 癌症治療
在某些實施例中，本發明提供使用本文所提供的抗體治療或預防癌症的方法。
在一些實施例中，癌症為表現GREM1的癌症。如本文中所使用的短語「表現GREM1的癌症」係指特徵在於具有表現GREM1的癌細胞，及/或在癌症微環境中具有GREM1表現的癌症。在一些實施例中，表現GREM1的癌症在癌細胞及/或癌症微環境中具有GREM1過度表現。
GREM1可經由自分泌方式起作用以促進表現GREM1的腫瘤細胞的生長。GREM1亦可由駐留於癌症微環境內或包圍癌症微環境的非癌細胞分泌，以產生適用於癌細胞生長或存活的生態位，即使癌細胞本身可能不一定表現GREM1。
如本文中所使用，癌症微環境係指包圍癌細胞的組織、細胞及環境。癌症微環境可包含基質細胞，如成纖維細胞、周細胞、內皮細胞、脂肪細胞及骨髓間充質基質細胞(MSC)。癌症微環境亦可包含與癌細胞相關或與包圍癌細胞的基質細胞相關的胞外基質。胞外基質主要由基質(ground substance)(主要由蛋白聚糖聚集物製成的多孔水合凝膠)及結締組織纖維構成。可在例如基質細胞或胞外基質中觀測到GREM1在癌症微環境中的表現。在某些實施例中，表現GREM1的癌症在基質(如促結締組織增生基質)或基質細胞中具有GREM1表現或過度表現。
在某些實施例中，個體鑑別為具有表現GREM1的癌細胞，或在癌症微環境中具有GREM1表現。癌細胞上或癌症微環境中的GREM1的存在及/或表現量可藉由此項技術中已知或本文所提供的各種方法，使用自個體獲得的生物樣品來確定。含有或疑似含有癌細胞或來自癌症微環境的生物樣品可以獲自或來源於個體，例如福爾馬林固定的石蠟包埋(formalin fixed paraffin embedded；FFPE)組織、新鮮活檢體、血液(疑似含有循環腫瘤細胞)或其他體液。在一些實施例中，癌細胞、基質細胞及/或胞外基質可以從生物樣品中分離。在某些實施例中，可進一步處理生物樣品以例如分離如核酸或蛋白質的分析物。
表現GREM1的癌症可為任何類型的癌症。在某些實施例中，癌症選自實體腫瘤或血液腫瘤。在某些實施例中，實體腫瘤為腎上腺皮質癌瘤、肛門癌、星形細胞瘤、兒童小腦或大腦、基底細胞癌瘤、膽管癌、膀胱癌、骨骼腫瘤、腦癌、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、視路及下丘腦神經膠質瘤、乳癌、伯基特氏淋巴瘤、子宮頸癌、結腸癌、肺氣腫、子宮內膜癌、食道癌、尤文氏肉瘤、成視網膜細胞瘤、胃癌(gastric/stomach cancer)、神經膠質瘤、頭頸癌、心臟癌症、霍奇金淋巴瘤、胰島細胞癌瘤(內分泌胰腺)、卡波西肉瘤、腎癌(腎細胞癌)、喉癌、肝癌、肺癌、成神經細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、***癌、直腸癌、腎細胞癌(腎癌)、成視網膜細胞瘤、尤文氏家族腫瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、喉癌、甲狀腺癌或***癌。
在某些實施例中，表現GREM1的癌症亦為表現PD-L1的癌症。在某些實施例中，表現GREM1的癌症並非表現PD-L1的癌症。如本文中所使用的關於癌症的術語「表現PD-L1」係指使用此項技術中已知的任何偵測方法(例如免疫組織化學(IHC)、流式細胞量測術(如FACS)等)對PD-L1表現呈陽性的癌症。舉例而言，表現PD-L1的癌症可以指使用基於IHC資料的簡單二進制陽性/陰性表徵方法對PD-L1表現呈陽性的癌症，其中若展現PD-L1的細胞表面膜染色的腫瘤組織部分中的癌細胞的百分比為總癌細胞的至少1%、2%、3%、4%或5%，則定義陽性結果。詳細描述可見於 Thompson, R.H.等人 ,《美國國家科學院院刊》 101 (49); 17174-17179 (2004) ； Thompson, R. H.等人 ,《癌症研究( Cancer Res.)》 66:3381-3385 (2006) ； Gadiot, J.等人 ,《癌症( Cancer)》 117:2192-2201 (2011) ； Taube, J. M.等人 ,《科學·轉化醫學( Sci Transl Med)》 4, 127ra37 (2012)；及 Toplian, S. L.等人 ,《新英格蘭醫學雜誌( New Eng. J Med.)》 366 (26): 2443-2454 (2012)中。表現PD-L1的癌症亦可指使用WO2014165422A1中所描述的評分方法對PD-L1表現呈陽性的癌症。在某些實施例中，表現GREM1的癌症對用PD-1/PD-L1軸抑制劑的治療具有抗性或難治性。
在某些實施例中，血液腫瘤為白血病(例如急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤(例如，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)))或骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤(MM))。
在某些實施例中，癌症為***癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌)、肝癌、胰腺癌、乳癌、支氣管癌、骨癌、肝臟及膽管癌症、卵巢癌、睪丸癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、脊柱癌、腦癌、宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、肛門癌、胃腸癌、皮膚癌、垂體癌、胃癌、***癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、星形細胞瘤、黑色素瘤、骨髓發育不良徵候群、肉瘤、畸胎瘤、神經膠質瘤、腺癌、白血病(例如急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(例如，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)))或骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤(MM))。
在某些實施例中，癌症選自由以下組成之群：***癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌)、肝癌、結腸癌、結腸直腸癌、神經膠質瘤、胰腺癌、膀胱癌及乳癌。在某些實施例中，癌症為三陰性乳癌。在某些實施例中，癌症為多發性骨髓瘤。
在某些實施例中，癌症為轉移性的。在某些實施例中，本發明進一步提供使用本文所提供的抗體治療或預防癌症轉移的方法。癌症轉移為癌細胞自其原始部位擴散至身體內的另一部位的過程。
在某些實施例中，癌症為***癌、乳癌或肝癌。
在某些實施例中，乳癌為三陰性乳癌。術語「三陰性乳癌」或「TNBC」係指對***受體、孕酮受體及過量HER2蛋白質進行測試呈陰性的乳癌。TNBC可對激素療法或靶向HER2的藥物無反應性。
在某些實施例中，癌症為多發性骨髓瘤(MM)。發現GREM1由骨髓(BM)間充質基質細胞的亞群大量分泌，且視為在MM疾病發展中起關鍵作用。藉由定量型PCR對人類及小鼠BM基質樣品的分析表明，相較於健康對照，GREM1/Grem1表現在攜帶MM腫瘤的隊列中顯著更高。抗GREM1抗體已顯示減少小鼠中的MM腫瘤負荷(K. Clark等人, 《癌症》 2020, 12, 2149)。
ii. 治療纖維化疾病
在一些實施例中，GREM1相關疾病或病狀為纖維化疾病。纖維化疾病為涉及纖維化的疾病或病狀。纖維化為作為慢性器官損傷的共同特徵的疤痕過程，例如在肺、肝臟、腎臟、皮膚、心臟、腸道或肌肉中。纖維化之特徵在於轉化生長因子-β(TGF-β)的活性升高，引起胞外基質及其他纖維化相關蛋白質的沈積增加及改變。已在許多纖維化疾病中發現升高的GREM1表現，表明GREM1可為纖維化的重要標記物(Costello等人, 2010, 《美國呼吸系統細胞與分子生物學雜誌(Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.)》 42: 517-523；Lappin等人, 2002, 《腎臟病與透析腎移植(Nephrol. Dial. Transplant.)》 17: 65-67；Boers等人, 2006, 《生物化學雜誌》 281: 16289-16295)。
纖維化疾病可包括肺、肝臟、腎臟、眼睛、皮膚、心臟、腸道或肌肉中的纖維化疾病。肺中的纖維化疾病的實例包括肺纖維化、囊性纖維化、肺高血壓、進行性塊狀纖維化、阻塞性細支氣管炎、與慢性哮喘或特發性肺相關的氣道重塑。肝臟中的纖維化疾病的實例包括肝硬化或非酒精性脂肪變性肝炎。腎臟中的纖維化疾病的實例包括例如腎纖維化、缺血性腎損傷、小管間質性纖維化、糖尿病性腎病變、腎硬化或腎毒性。眼睛中的纖維化疾病的實例包括例如角膜纖維化、視網膜下纖維化。皮膚中的纖維化疾病的實例包括例如腎源性系統性纖維化、瘢痕瘤或硬皮病。心臟中的纖維化疾病的實例包括心內膜心肌纖維化或陳舊性心肌梗塞。
在另一態樣中，本發明亦提供一種在治療有需要之個體的纖維化疾病(例如，腎纖維化)中提高BMP7治療的功效的方法，其包括向個體投與治療有效量的本文所提供的抗gremlin 1抗體。在某些實施例中，個體正經受BMP7治療。在另一態樣中，本發明亦提供一種治療有需要之個體的纖維化疾病(例如，腎纖維化)的方法，其包括向個體投與治療有效量的本文所提供的抗gremlin 1抗體與BMP7治療的組合。如本文中所使用的術語「BMP7治療」可為涉及增加有需要之個體中BMP7的含量的任何治療。舉例而言，BMP7治療可投與重組BMP7或BMP7的肽模擬物。BMP7治療亦可涉及恢復內源性BMP7，如藉由降低BMP7的拮抗劑(例如，頭蛋白或子宮致敏相關基因-1(USAG-1))的水準及/或活性或藉由增加(例如Kielin/chordin樣蛋白(KCP)或BMP受體)BMP7的激動劑的水準及/或活性進行( Michael等人, 《藉由BMP7逆轉實驗性腎纖維化提供慢性腎病的新穎治療策略的深刻見解》 ,《小兒腎臟病雜誌》 2008 年 9 月 ; 23(9): 1395-8)。
在另一態樣中，本發明亦提供一種治療疾病的方法，上述疾病可受益於增加BMP7活性或降低gremlin介導之對BMP7活性的抑制，其包括向個體投與治療有效量的本文所提供的抗gremlin 1抗體。在某些實施例中，疾病為纖維化疾病及/或腎病。在某些實施例中，疾病選自由以下組成之群：局部缺血再灌注損傷、缺血性急性腎衰竭、糖尿病性腎病變及高血壓腎硬化、腎纖維化、慢性腎病、急性腎病、高血壓腎硬化、免疫球蛋白A腎病變(IgAN)及其他自身免疫疾病，如狼瘡腎炎或全身性紅斑狼瘡(SLE)。
iii. 治療其他疾病
在一些實施例中，GREM1相關疾病或病狀為肺動脈高血壓(PAH)。術語「肺動脈高血壓」(「PAH」)係指特徵在於肺動脈壓力持續升高的進行性肺病症。已發現GREM1在低氧期間在小鼠的小肺內血管的壁中升高。已發現抗GREM1抗體緩解或改善與PAH相關的一或多種症狀，例如抑制肺動脈的增厚、增加心搏出量及/或心搏出量與收縮末期容積比(「SV/ESV」)、增加右心室心輸出量及/或心臟指數(CI)、改善患有PAH的個體中的其他血流動力學量測，例如右心房壓力、肺動脈壓力、在呼氣末期壓力(end expiratory pressure)的存在下的肺毛細血管楔壓、全身動脈壓力、心跳、肺血管阻力及/或全身血管阻力(對於細節，參見美國專利申請US20180057580A1)。
在一些實施例中，GREM1相關疾病或病狀為骨關節炎(OA)。據報道GREM1為軟骨細胞中的機械負載誘導性因子，且在循環應變或流體靜壓力負載後在軟骨的中間層及深度層中偵測到高含量的GREM1。據報道在骨關節炎中上調GREM1，且血清及滑液中的GREM1濃度與膝部OA的發作及嚴重程度相關(J. Yi等人, 《醫學科學監測(Med Sci Monit)》, 2016; 22: 4062-4065)。GREM1活化核因子-κB信號傳導，從而導致分解代謝酶的後續誘導。據報道小鼠中關節內投與GREM1抗體或GREM1的軟骨細胞特異性缺失減緩骨關節炎發展(參見S.H. Chang等人, 《自然通信(Nature Communications)》, (2019) 10: 1442)。
在一些實施例中，GREM1相關疾病或病狀為血管生成。GREM1為主要促血管生成受體血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)的激動劑。硫酸乙醯肝素(HS)及肝素(以其抗凝血劑作用聞名的葡糖胺聚糖(GAG))已證明與GREM1結合。GREM1與肝素結合且以BMP非依賴性方式活化VEGFR-2(Chiodelli等人2011; 《動脈硬化血栓、血管生物學雜誌(Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.)》 31: e116-e127)。已發現抗GREM1抗體緩解或改善與血管生成或肝素介導之血管生成相關的一或多種症狀(對於細節，參見美國專利申請US20200157194)。
在一些實施例中，GREM1相關疾病或病狀為青光眼。青光眼可由眼睛中的一或多種BMP家族基因的表現改變所引起，此導致眼內壓升高增加及/或青光眼視神經病變。已發現GREM1在青光眼小樑網細胞中具有增加的表現。已發現GREM1拮抗劑緩解或改善與血管生成或青光眼相關的一或多種症狀(對於細節，參見美國專利US7744873)。
在一些實施例中，GREM1相關疾病或病狀為視網膜疾病。在一些實施例中，GREM1相關疾病或病狀為腎病。
投與途徑及劑量方案
如本文所提供的抗體或抗原結合片段可治療有效劑量投與。如本文所提供的抗體或抗原結合片段的治療有效量將取決於此項技術中已知的各種因素，例如個體的體重、年齡、既往病史、目前的藥物治療、健康狀況及交叉反應的可能性、過敏性、敏感性及不良副作用，以及投與途徑及疾病發展的程度。如由此等及其他情況或要求所指示，一般技術者(例如，醫生或獸醫)可按比例減少或增加劑量。
在某些實施例中，如本文所提供的抗體或抗原結合片段可以約0.01 mg/kg至約100 mg/kg的治療有效劑量投與。在某些實施例中，可在治療過程中改變投與劑量。在某些實施例中，取決於個體的反應，可在治療過程中改變投與劑量。
可以調整劑量方案以提供最優的期望反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單次劑量，或可隨時間推移投與若干分次劑量。
本文所揭示之抗體及抗原結合片段可藉由此項技術中已知的任何途徑投與，例如腸胃外(例如，皮下、腹膜內、靜脈內(包括靜脈內輸注)、肌肉內或皮內注射)或非腸胃外(例如，口服、鼻內、眼內、舌下、經直腸或局部)途徑。
組合療法
在一些實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段可單獨投與或與一或多種額外的治療手段或藥劑組合投與，上述治療手段或藥劑可基於待治療的疾病或病狀來選擇。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段可與第二抗癌藥物組合投與以治療癌症，上述第二抗癌藥物例如化學治療劑、抗癌藥物、放射療法、免疫療法、抗血管生成劑、靶向療法、細胞療法、基因療法藥劑、激素療法藥劑、細胞因子、姑息治療、用於治療癌症的手術(例如，腫瘤切除術)、一或多種抗嘔劑、由化學療法引起的併發症的治療或癌症患者的飲食補充劑或調節腫瘤微環境的藥劑。
術語「化學治療藥物」為可用於治療癌症的生物(大分子)或化學(小分子)化合物。化學治療藥物的類型包括但不限於組蛋白脫乙醯基酶抑制劑(HDACI)、烷基化劑、抗代謝物、生物鹼、細胞毒性/抗癌抗生素、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白抑制劑、蛋白質、抗體、激酶抑制劑等。化學治療藥物的實例包括埃羅替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、多西他賽(docetaxel)、阿德力黴素(adriamycin)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、帕比司他(panobinostat)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、貝伐單抗(bevacizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、二甲雙胍(metformin)、替莫唑胺(temozolomide)、他莫昔芬(tamoxifen)、小紅莓(doxorubicin)、雷帕黴素(rapamycin)、拉帕替尼(lapatinib)、羥基喜樹鹼(hydroxycamptothecin)、曲美替尼(trimetinib)。在某些實施例中，化學治療藥物為順鉑。
如本文中所使用，術語「免疫療法」係指一種刺激免疫系統對抗疾病，如癌症或以一般方式增強免疫系統的療法。免疫療法包括被動免疫療法，其藉由遞送具有已建立的腫瘤免疫反應性的藥劑(如效應細胞)，可直接或間接介導抗腫瘤作用，且不一定依賴於完整的宿主免疫系統(如抗體療法或CAR-T細胞療法)。免疫療法可進一步包括主動免疫療法，其中治療依賴於體內刺激內源性宿主免疫系統以藉由投與免疫反應調節劑對病變細胞作出反應。
免疫療法的實例包括但不限於檢查點調節劑、過繼性細胞轉移、細胞因子、溶瘤病毒及治療性疫苗。
檢查點調節劑可干擾癌細胞避免免疫系統攻擊的能力，且幫助免疫系統對腫瘤做出更強烈的反應。免疫檢查點分子可介導共刺激信號以增強免疫反應，或可介導共抑制信號以抑制免疫反應。檢查點調節劑的實例包括但不限於PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGF β、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16及CD83的調節劑。在某些實施例中，免疫檢查點調節劑包含PD-1/PD-L1軸抑制劑。
過繼性細胞轉移，此係一種試圖增強T細胞對抗癌症的天然能力的治療。在此治療中，T細胞取自患者，且在活體外擴增及激活。在某些實施例中，T細胞在活體外修飾為CAR-T細胞。在活體外大批量培養抗癌最活躍的T細胞或CAR-T細胞持續2至8週。在此期間，患者將接受治療，如化學療法及放射療法以降低身體的免疫力。在此等治療之後，活體外培養的T細胞或CAR-T細胞將回給予患者。在某些實施例中，免疫療法為CAR-T療法。
細胞因子療法亦可用於增強腫瘤抗原向免疫系統的呈遞。用於治療癌症的兩種主要類型的細胞因子為干擾素及白細胞介素。細胞因子療法的實例包括但不限於干擾素，如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ、集落刺激因子，如巨噬細胞CSF、粒細胞巨噬細胞CSF及粒細胞CSF、胰島素生長因子(IGF-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(TGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、白細胞介素，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11及IL-12、腫瘤壞死因子，如TNF-α及TNF-β，或其任何組合。
溶瘤病毒為可殺死癌細胞的基因修飾的病毒。溶瘤病毒可特異性地感染腫瘤細胞，從而導致腫瘤細胞裂解，隨後釋放大量的腫瘤抗原，觸發免疫系統靶向且消除具有此類腫瘤抗原的癌細胞。溶瘤病毒的實例包括但不限於塔力拉赫(talimogene laherparepvec)。
治療性疫苗藉由增強免疫系統對癌細胞的反應來對抗癌症。治療性疫苗可包含非致病性微生物(例如牛分枝桿菌( Mycobacterium bovis)卡介苗，BCG)、靶向腫瘤細胞的基因修飾的病毒或一或多種免疫原性組分。舉例而言，BCG可利用導管直接***膀胱中，且可引起針對膀胱癌細胞的免疫反應。
抗血管生成劑可阻斷支持腫瘤生長的血管的生長。一些抗血管生成劑靶向VEGF或其受體VEGFR。抗血管生成劑的實例包括但不限於阿西替尼(Axitinib)、貝伐單抗、卡博替尼(Cabozantinib)、依維莫司(Everolimus)、來那度胺(Lenalidomide)、甲磺酸樂伐替尼(Lenvatinib mesylate)、帕唑帕尼(Pazopanib)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、瑞格非尼(Regorafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、沙立度胺(Thalidomide)、凡德他尼(Vandetanib)及阿柏西普(Ziv-aflibercept)。
「靶向療法」為一種作用於與癌症相關的特定分子的療法，上述特定分子例如存在於癌細胞而非正常細胞中或在癌細胞中更豐富的特定蛋白質，或癌症微環境中有助於癌症生長及存活的靶分子。靶向療法使治療劑靶向腫瘤，從而使正常組織免受治療劑的影響。
靶向療法可靶向例如酪胺酸激酶受體及核受體。此類受體的實例包括erbB1(EGFR或HER1)、erbB2(HER2)、erbB3、erbB4、FGFR、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)及胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、***受體(ER)、核受體(NR)及PR。
靶向療法可靶向酪胺酸激酶或核受體信號級聯中的分子，如Erk及PI3K/Akt、AP-2α、AP-2β、AP-2γ、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PTEN、p53、p19ARF、Rb、Apaf-1、CD-95/Fas、TRAIL-R1/R2、胱天蛋白酶-8、叉頭盒03A、MDM2、IAPs、NF-kB、Myc、P13K、Ras、FLIP、調節蛋白(HRG)(亦稱為gp30)、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak、Bad、Bok、Bik、Blk、Hrk、BNIP3、BimL、Bid及EGL-1。
靶向療法亦可靶向腫瘤相關的配體，如***(estrogen)、***(E2)、孕酮、***(oestrogen)、雄激素、糖皮質激素、催乳素、甲狀腺激素、胰島素、P70 S6激酶蛋白(PS6)、存活素、成纖維細胞生長因子(FGF)、EGF、Neu分化因子(NDF)、轉化生長因子α(TGF-α)、IL-1A、TGF-β、IGF-1、IGF-II、IGFBP、IGFBP蛋白酶及IL-10。
在某些實施例中，第二治療劑調節腫瘤微環境。在某些實施例中，第二治療劑為包含PD-L1結合部分及TGF-β受體的胞外結構域的雙功能分子。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段可與第二抗癌藥物組合投與以治療***癌。在某些實施例中，抗癌藥物包含抗***癌藥物。在一些實施例中，抗***癌藥物包含雄激素軸抑制劑；雄激素合成抑制劑；ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制劑；或其組合。
在某些實施例中，雄激素軸抑制劑選自由以下組成之群：促黃體激素釋放激素(LHRH)激動劑、LHRH拮抗劑及雄激素受體拮抗劑。
在某些實施例中，雄激素軸抑制劑為地加瑞克、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、阿帕魯胺、達洛魯胺、恩雜魯胺或阿比特龍。
在某些實施例中，雄激素合成抑制劑為乙酸阿比特龍或酮康唑。
在某些實施例中，PARP抑制劑為奧拉帕尼或盧卡帕尼。
在某些實施例中，抗***癌藥物選自由以下組成之群：乙酸阿比特龍、阿帕魯胺、比卡魯胺、卡巴他賽、康士得(比卡魯胺)、達洛魯胺、地加瑞克、多西他賽、艾利加德(乙酸亮丙瑞林)、恩雜魯胺、艾利達(阿帕魯胺)、費蒙格(地加瑞克)、氟他胺、乙酸戈舍瑞林、傑塔納(卡巴他賽)、乙酸亮丙瑞林、魯普隆(乙酸亮丙瑞林)、魯普隆貯存型(乙酸亮丙瑞林)、利普卓(奧拉帕尼)、鹽酸米托蒽醌、尼蘭得隆(尼魯米特)、尼魯米特、努貝卡(達洛魯胺)、奧拉帕尼、普洛韋格(西普亮塞-T)、鐳223二氯化物、魯布拉卡(樟腦磺酸盧卡帕尼)、樟腦磺酸盧卡帕尼、西普亮塞-T、克癌易(多西他賽)、多菲戈(鐳223二氯化物)、安可坦(恩雜魯胺)、諾雷德(乙酸戈舍瑞林)及澤替加(乙酸阿比特龍)。
在某些實施例中，癌症患者的飲食補充劑可為具有針對癌症的保護作用的合適補充劑。在某些實施例中，飲食補充劑包含吲哚-3-甲醇或包含其在攝入之後產生吲哚-3-甲醇的衍生物。認為吲哚-3-甲醇具有針對癌症的保護作用且亦可對癌變前病狀具有預防性。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段可與吲哚-3-甲醇或其在攝入之後產生吲哚-3-甲醇的衍生物組合投與。在某些實施例中，此組合適用於治療gremlin相關疾病。在某些實施例中，此組合適用於治療癌症，例如乳癌、肝細胞癌及結腸直腸癌。在某些實施例中，此組合適用於治療乳癌，例如三陰性乳癌。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段可與第二治療劑，例如第二抗纖維化劑(例如，重組BMP7或BMP7的肽模擬物)組合投與以治療纖維化疾病。在某些實施例中，第二抗纖維化劑為ACE抑制劑(或ARB)、抗MASP2抗體、內皮素受體拮抗劑、NRF2抑制劑類固醇、CTLA4-IgG或TNF抑制劑。
在另一實施例中，第二治療劑選自由以下組成之群：如吡非尼酮(pirfenidone)的抗纖維化藥劑、抗炎藥物、NSAID、如潑尼松(prednisone)的皮質類固醇、營養補充劑、血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑[例如，「VEGF-捕獲劑」，如阿柏西普(aflibercept)或如美國專利第7,087,411號中所闡述的其他VEGF-抑制融合蛋白，或抗VEGF抗體或其抗原結合片段(例如，貝伐單抗或蘭比珠單抗(ranibizumab))]、針對細胞因子(如IL-1、IL-6、IL-13、IL-4、IL-17、IL-25、IL-33或TGF-β)的抗體、TGF-β/Smad信號傳導路徑的負調節子(重組BMP7或BMP7的肽模擬物)，及任何其他適用於減輕至少一種與纖維變性相關病狀或癌症相關的症狀的姑息性療法。在某些實施例中，第二治療劑為抗整合素抑制劑。
在一些實施例中，可投與第二治療劑以管理或治療至少一種與纖維變性或癌症相關的併發症。
在此等實施例中的某些實施例中，與一或多種額外治療劑組合投與的如本文所揭示之抗體或抗原結合片段可以與上述一或多種額外治療劑同時投與，且在此等實施例中的某些實施例中，上述抗體或抗原結合片段及上述額外治療劑可以作為同一醫藥組合物的一部分投與。然而，與另一種治療劑「組合」投與的抗體或抗原結合片段不必與上述藥劑同時投與或以同一組合物投與。在另一種藥劑之前或之後投與的抗體或抗原結合片段被認為與上述藥劑「組合」投與，如本文中所使用的短語，即使抗體或抗原結合片段及第二藥劑係藉由不同途徑投與的。當可能時，根據額外治療劑的產品資訊表單中列出的時間表或根據主治醫師案頭參考2003(Physicians'Desk Reference 2003)(主治醫師案頭參考(Physicians'Desk Reference),第57版；醫學經濟學公司(Medical Economics Company)；ISBN: 1563634457; 第57版(2002年11月))或所屬領域中熟知的方案，投與與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段組合投與的額外治療劑。
在另一態樣，本發明提供套組或醫藥組合物，其包含可以配製在一種組合物中或配製在不同組合物中的本文所提供的抗體或其抗原結合片段及第二治療劑。可以進一步包括使用或適應症的說明書，以提供關於如何進行組合療法的資訊。
偵測及 / 或診斷的方法
在一些實施例中，本發明提供偵測來源於個體的樣品中GREM1的存在或量的方法，其包括使上述樣品與抗體或其抗原結合片段接觸，及測定上述樣品中GREM1的存在或量。
亦可藉由使用包括但不限於以下技術量測GREM1的mRNA含量來偵測樣品中GREM1的存在或量：RNA測序(RNA-seq)及RNAscope(Wang, Z., Gerstein, M., & Snyder, M. (2009). RNA-seq：一種用於轉錄組學的革命性工具(RNA-seq: a revolutionary tool for transcriptomics).《自然綜述遺傳學(Nature Reviews Genetics)》, 10(1), 57-63；Wang等人, RNAscope：一種用於福馬林固定石蠟包埋組織的新型原位RNA分析平台(RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues),《分子診斷性雜誌(J Mol Diagn.)》 2012年1月; 14(1): 22-9)。簡言之，RNA-seq包括將標靶mRNA逆轉錄至cDNA中，使cDNA片段化及測序且分析序列資料以進行mRNA定量；RNAscope包括使標靶mRNA與一或多種與螢光探針結合的寡核苷酸原位雜交，且藉由量測螢光強度來偵測mRNA的水準。
在某些實施例中，生物樣品包含癌細胞或來自腫瘤微環境的樣品(例如，基質細胞或基質)。
在一些實施例中，本發明提供偵測樣品中GREM1的存在或量，或診斷個體的GREM1相關疾病或病狀的方法，其包括：a)使自個體獲得的樣品與本文所提供的抗體或其抗原結合片段接觸；b)測定樣品中GREM1的存在或量；及視情況c)使GREM1的存在或量與個體的GREM1相關疾病或病狀的存在或狀態相關聯。在某些實施例中，生物樣品包含癌細胞、基質細胞、基質或纖維化細胞。
在一些實施例中，本發明提供包含本文所提供的視情況與可偵測部分結合的抗體或其抗原結合片段的套組。套組可適用於偵測生物樣品中GREM1的存在或量，或可適用於本文所提供的診斷方法。
在一些實施例中，本發明提供包含本文所提供的抗體或其抗原結合片段及第二治療劑的套組。套組可適用於治療、預防及/或改善GREM1相關疾病。
在一些實施例中，本發明亦提供本文所提供的抗體或其抗原結合片段在製造用於治療或診斷個體的GREM1相關疾病或病狀的藥劑中的用途。 實例
雖然本發明已經參照特定實施例(其中一些為較佳實施例)具體地顯示及描述，但上述領域的技術人員應理解，可以在其中進行形式及細節上的各種改變而不悖離如本文所揭示之本發明的精神及範圍。 實例 1 ： 抗原的製備
HGREM1-His(R&D) ：在NS-0細胞中表現重組HGREM1蛋白質(寄存編號O60565)。簡言之，來自C端具有10×his標籤的Lys25-Asp184的hGREM1基因的編碼區用於轉染。使用His-標籤親和柱純化清液層。使用SDS PAGE凝膠表徵所得到的純化蛋白質。上述蛋白質購自安迪生物公司(R&D systems)(目錄號5190-GR)。
小鼠 Gremlin-His(R&D) ：重組小鼠Gremlin(寄存編號O70326)Lys25-Asp184與C端的10×His標籤融合且產生於NS-0細胞中。使用His-標籤親和柱純化轉染清液層。使用SDS PAGE凝膠表徵所得到的純化蛋白質。上述蛋白質購自安迪生物公司(目錄號956-GR)。
HGREM1-His(ACRO) ：重組hGREM1蛋白質Lys25-Asp184(寄存編號NP_037504)與C端的多組胺酸標籤融合且產生於人類293細胞(HEK293)中。使用His-標籤親和柱純化來自HEK293細胞的轉染清液層。使用SDS page凝膠表徵所得到的純化蛋白質。此蛋白質購自百普賽斯(ACRO Biosystems)(目錄號GR1-H52H3)。
HGREM1-Fc(ACRO) ：重組hGREM1蛋白質Lys25-Asp184(寄存編號NP_037504)與C端的hIgG1 Fc標籤融合且產生於人類293細胞(HEK293)中。使用SDS PAGE凝膠表徵所得到的純化蛋白質。此蛋白質購自百普賽斯(目錄號GR1-H5254)。
將上述Gremlin蛋白質用於下述實驗中。 實例 2 ： 抗體產生
1. 抗原結合及免疫接種
針對免疫接種，使重組hGremlin-His蛋白質與各種MabSpace免疫增強肽結合。簡言之，將2至8倍莫耳過量的肽與Sulfo-SMCC(4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺酯，皮爾斯公司(Pierce)，目錄號22322)活化的hGremlin蛋白質混合且在室溫下培育一小時。停止反應且使用SDS-PAGE凝膠分析結合蛋白質且進行QC。
使用完全弗氏佐劑(皮爾斯公司，目錄號77140)以1:1比率分別乳化以上結合的hGremlin-His蛋白質，且接著皮下及腹膜內免疫接種至C57B/L6小鼠中。使用CpG及礬進行額外免疫以保持蛋白質的天然構形。至少每2週發生免疫，且在第1次免疫之後取得小鼠的抗血清以用於藉由ELISA分析進行抗hGremlin效價分析。
為確定血清效價，自每隻免疫小鼠中製備20 µl的小鼠血清。用100微升/孔的含1µg/ml由hGREM1-His組成的溶液的高pH塗佈緩衝液(0.16% Na 2CO 3，0.3%NaHCO 3，pH9.8)塗佈高度結合透明的聚苯乙烯96孔板(Nunc)。將培養板在4℃下培育隔夜，且接著在自動板洗滌器上使用洗滌緩衝液PBS + 0.1% Tween 20(西格瑪(Sigma))洗滌一次。將200µl阻斷緩衝液(PBS + 1% BSA + 1%山羊血清+ 0.05% Tween 20)添加到每個孔中且在室溫下培育2小時。接著抽吸阻斷緩衝液，且將100 µl於稀釋緩衝液(PBS + 1%BSA + 1%山羊血清+ 0.01% Tween 20)中連續稀釋的血清轉移至ELISA板的每個孔中且將其在室溫下培育60 min。接著使用上文所描述的方法洗滌培養板3次。接著將100微升/孔的於稀釋緩衝液中稀釋的HRP結合山羊抗小鼠Fc抗體溶液(艾博抗(Abcam)，目錄號Ab98808)添加至培養板的每個孔中。之後，將ELISA培養板在室溫下培育60 min，用250微升/孔洗滌緩衝液洗滌培養板3次。最後，將100微升/孔的TMB添加至每個孔中且使用0.64M H 2SO 4終止反應。在Thermo Multiscan FC上在450nM下讀取培養板。
2. 融合
在融合前四天，每隻小鼠用含未結合的hGremlin-His蛋白質的PBS溶液進行腹膜內增強。在融合當天，無菌地移除脾臟且將器官加工成單細胞懸浮液。裂解紅細胞，且將脾細胞用DMEM(吉畢科公司(Gibco))洗滌。將活的對數生長期骨髓瘤細胞(SP2/0)與鼠類脾細胞以1:4比率混合。接著在融合之前用PEG洗滌細胞2次。融合後細胞用DMEM洗滌且懸浮於補充有10% FBS + HFCS + OPI + 1× HAT的細胞生長培養基中。將200微升/孔的此細胞懸浮液接種至96孔細胞培養板中且在37℃潮濕的10% CO 2培育箱中培育隔夜。將培養物培育7天且接著從孔中抽吸出生長培養基且更換為新鮮生長培養基。在培養基更換後2至3天開始雜交瘤清液層的篩選。
3. 藉由 ELISA 分析進行的抗體篩選
使用以上確定血清效價的相同方案。簡言之，在4℃下塗佈1µg/ml hGremlin-His隔夜。洗滌之後，添加100 µl雜交瘤清液層且使其完全結合。接著添加HRP結合的山羊抗小鼠Fc抗體以偵測結合的Gremlin抗體。最後，在TMB反應及H 2SO 4終止之後，在Thermo Multiscan FC上在450nM下讀取培養板。隨後將來自ELISA陽性雜交瘤孔的細胞在細胞培養物中擴增以用於進一步表徵研究。 實例 3 ： 陽性雜交瘤選殖株的亞選殖及小規模抗體生產
1. 陽性雜交瘤選殖株的亞選殖
選擇來自具有所需結合特徵及阻斷活性的ELISA陽性雜交瘤孔的細胞且使用有限的稀釋液將每一者接種於96孔板中。使此等細胞生長7天。一旦達到足夠的細胞團，收集每個孔的清液層且針對抗原結合能力進行再篩選(參見實例2中的篩檢)。
根據每個96孔板，鑑別出具有最高抗原結合活性的選殖株，且用有限的稀釋液進一步擴增至96孔板中，每孔具有200μl雜交瘤生長培養基。7天之後，測試來自96孔板的細胞的抗原結合。進行亞選殖多於2次。當超過90個孔顯示陽性結合信號時，鑑別出具有最高抗原結合活性的兩種選殖株且將其轉移至具有培養基的24孔板中且使其再生長2天。匯合24孔板之後，將細胞轉移至6孔板中。培育5天之後，將一部分細胞冷凍。將其餘細胞轉移至燒瓶中且使其擴增。匯合燒瓶之後，將一半細胞冷凍(每選殖株3瓶)以用於額外備份。使另一半在具有用於抗體生產的培養基的燒瓶中進一步擴增。使用標準方法確定同種型。
2. 小規模抗體生產
將雜交瘤細胞接種至滾瓶中且用200至300 ml的雜交瘤培養基(英傑(Invitrogen))培養14天。如下自雜交瘤細胞培養物中純化Gremlin單株抗體(mAb)。全部純化過程是在室溫下進行。使用一種純化流程以純化各種mAb且使用親和層析法。
將宿主細胞培養液(CCF)離心以移除細胞碎片。接著將CCF清液層過濾，稀釋且以柱、蛋白質G高效(伯樂(Bio-Rad))形式裝載於蛋白質G層析介質上且平衡。
裝載之後，洗滌蛋白質G柱直到流過物在280 nm下的吸光度返回至基線。接著使用甘胺酸pH 2.5從柱中溶離Gremlin mAb且立即藉由添加50 μL 1 M Tris Base儲備溶液/mL溶離體積進行中和。監測溶離物在280 nm下的吸光度且收集含有蛋白質的溶離份以製成蛋白質A池。
純化之後，使用10,000 MWCO膜(皮爾斯Slide-A-Lyzer或透析管)藉由透析將Gremlin mAb調配於PBS溶液中。調配之後，過濾Gremlin mAb。 實例 4 ： 藉由 ELISA 進行的 純化雜交瘤抗 gremlin1 抗體與捕獲的人類及小鼠 gremlin 之結合 分析
用100微升/孔的含0.5 μg/ml hGREM1(ACRO)及小鼠gremlin(R&D)的高pH塗佈緩衝液塗佈透明聚苯乙烯培養板(BEAVER)4℃隔夜。接著在自動培養板洗滌器上使用PBS + 0.1% Tween 20(西格瑪)洗滌培養板一次。將100 μl的由PBS +1% BSA +1%標準山羊血清+ 0.5% Tween 20(西格瑪)組成的阻斷溶液添加至每個孔中且在室溫下培育2小時。接著將100 μl於含有PBS + 1% BSA +1%標準山羊血清+0.01% Tween 20的抗體稀釋緩衝液中的抗體(以2 μg/ml開始且連續稀釋)添加至培養板的每個孔中且在室溫下培育1小時。隨後，用200 μl的PBS+0.1% Tween20洗滌培養板三次，接著添加100微升/孔的1:10000山羊抗小鼠IgG-HRP(艾博抗)，且在室溫下培育1小時。接著用PBS+0.1% Tween20將其洗滌3次。最後，將100微升/孔的TMB(皮爾斯)添加至每個孔中，且在若干分鐘之後，向每個孔中添加50 μl的停止溶液。在Multiscan FC微板讀數儀(賽默飛世爾科技公司(Thermo Scientific))上在450nM下讀取培養板。如圖1所示，56C11、42B9、36F5及67G11示出與hGREM1及小鼠gremlin兩者的高結合親和力(針對56C11，EC50值分別為13.42 ng/ml及17.2 ng/ml；針對42B9，EC50值分別為8.058 ng/ml及8.512 ng/ml；針對36F5，EC50值分別為5.869 ng/ml及4.564 ng/ml；以及針對67G11，EC50值分別為7.841 ng/ml及7.713 ng/ml)，而69H5、22F1及14E3顯示相對於小鼠gremlin，選擇性地與hGREM1之結合親和力(EC50值分別為105.9 ng/ml、14.13 ng/ml及13.6 ng/ml)。
本文中提供的人源化抗體(例如，Hu14E3、Hu22F1及Hu56C11)顯示與hGREM1及/或mGREM1的類似高結合親和力。 實例 5 ：藉由 ELISA 表徵 雜交瘤抗體結合於捕獲的 hGREM1 或相關家族蛋白質之結合特異性
另外，使用ELISA評定14E3及基準抗體之結合特異性。簡言之，用100微升/孔的含0.5μg/ml hGREM1(ACRO)或人類gremlin-2(R&D)、人類COCO(R&D)及人類DAN蛋白質(R&D)的高pH塗佈緩衝液塗佈透明聚苯乙烯培養板(BEAVER)4℃隔夜。接著在自動培養板洗滌器上使用PBS + 0.1% Tween 20(西格瑪)洗滌培養板一次。將100 μl的由PBS +1% BSA +1%標準山羊血清+ 0.5% Tween 20(西格瑪)組成的阻斷溶液添加至每個孔中且在室溫下培育2小時。接著將100 μl於含有PBS + 1% BSA +1%標準山羊血清+0.01% Tween 20的抗體稀釋緩衝液中的抗體(以2 μg/ml開始且進行5倍連續稀釋)添加至培養板的每個孔中且在室溫下培育1小時。隨後，用200 μl的PBS+0.1% Tween20洗滌培養板三次，接著添加100微升/孔的1:10000山羊抗小鼠IgG-HRP(艾博抗)，且在室溫下培育1小時。接著用PBS+0.1% Tween20將其洗滌3次。最後，將100微升/孔的TMB(皮爾斯)添加至每個孔中，且在5分鐘之後，向每個孔中添加50 μl的停止溶液。在Multiscan FC微板讀數儀(賽默飛世爾科技公司)上在450nM下讀取培養板。結果顯示14E3特異性結合於hGREM1而非在結構上共享高度同源性的人類gremlin-2、COCO及DAN蛋白質(圖2)。 實例 6 ： 阻斷 Gremlin 結合於捕獲 BMP 2/4/7 中的 抗體活性的 表徵
已知Gremlin能夠結合於BMP蛋白質且藉由本發明驗證。簡言之，測試gremlin-Fc與固定於培養板上的BMP 2/4/7之結合能力。簡言之，用0.5μg/ml的重組人類BMP2、BMP4(hBMP4，派普泰克(Peprotech))或人類BMP7(R&D)塗佈培養板隔夜且將野生型gremlin-1添加至塗佈的培養板中且在室溫下再培育一小時。接著洗滌培養板且用與HRP(賽默飛世爾)結合的中性抗生物素蛋白偵測培養板結合的生物素-hGremlin。接著將培養板用TMB溶液顯色，藉由添加終止溶液使其終止。在板讀數儀上在450 nm下讀取培養板。圖3A及圖3D顯示野生型gremlin可結合於BMP 2、BMP 4及BMP 7，且與BMP 2及4之結合親和力比與BMP7之結合親和力更強。
另外測試gremlin XM5的突變型與BMP 2/4/7之結合能力，與gremlin頭對頭。藉由Mabspace構建且表現XM5，其中gremlin的123-143胺基酸(NSFYIPRHIRKEEGSFQSCSF，SEQ ID NO: 63)(其已知為BMP之結合環)被DAN的63-83胺基酸(FSYSVPNTFPQSTESLVHCDS，SEQ ID NO: 64)(其不結合於BMP)置換。在蛋白質的C端構建His-標籤或Fc-標籤。針對XM5及gremlin的黏著性，將未純化的清液層用於此分析。簡言之，塗佈抗人類Fc抗體(1μg/ml)且添加XM5-Fc或Gremlin-Fc的清液層(1:32稀釋)。培育之後，添加連續稀釋的具有his-標籤的BMP(BMP2/4/7)且接著使用二級抗體抗his-HRP以偵測結合。
如圖3A所示，與gremlin相反，BMP未結合於XM5，預測且驗證包含gremlin上的SEQ ID NO: 63的BMP之結合環中的至少一個胺基酸對於其結合於BMP而言至關重要。經由ELISA偵測抗體阻斷Gremlin結合於人類骨形態生成蛋白2及4(hBMP2、hBMP4)的能力。用重組人類BMP 2及BMP 4(0.25 μg/ml)(hBMP2、hBMP4，派普泰克)塗佈培養板隔夜且接著在室溫下將抗體的連續稀釋液與0.1 μg/ml的經生物素標籤修飾的hGREM1(派普泰克)一起培育1h，之後將此複合物添加至塗佈培養板中且將其在室溫下再培育一小時。接著洗滌培養板且用與HRP(賽默飛世爾)結合的中性抗生物素蛋白偵測培養板結合的生物素-hGremlin。接著將培養板用TMB溶液顯色，藉由添加終止溶液使其終止。在板讀數儀上在450 nm下讀取培養板。結果如圖3B及圖3C中所示，表明本文中提供的抗gremlin 1抗體(例如14E3、56C11及69H5，以及根據WO2014159010中公開的H4H6245P序列產生的基準抗體6245P，其公開內容以全文引用的方式併入本文中)可以劑量依賴性方式不同程度地抑制gremlin與BMP2及BMP4之結合。
另外，亦經由ELISA偵測本文中提供的抗體的連續稀釋液阻斷Gremlin結合於人類BMP2/4/7的能力。用重組人類BMP2/4/7(0.5 μg/ml)塗佈培養板隔夜且接著在室溫下將抗體的連續稀釋液與1 μg/ml的修飾的人類Gremlin-his一起培育1h，之後將此複合物添加至塗佈培養板中且將其在室溫下再培育一小時。接著洗滌培養板且添加抗his HRP(金斯瑞(GenScript))。接著將培養板用TMB溶液顯色，藉由添加終止溶液使其終止。在板讀數儀上在450 nm下讀取培養板。結果如圖3E至圖3H中所示，表明本文中提供的抗gremlin 1抗體(例如，42B9、36F5、67G11及14E3 HaLa)以及基準抗體6245P可以抑制gremlin與BMP2(參見圖3E)、BMP4(參見、圖3F)及BMP 7(參見圖3G)之結合。嵌合抗gremlin 1抗體(69H5-chi)亦可抑制gremlin與BMP2及BMP4之結合(參見圖3E)。嵌合抗gremlin 1抗體(56C11-chi)可以抑制gremlin與BMP2之結合(參見圖3F)。
具體言之，如圖3G所示，本文中提供的抗gremlin 1抗體(42B9、36F5、67G11及14E3 HaLa)可以顯著地阻斷gremlin與BMP7之結合，且顯示至少50%或甚至至少70%的最大阻斷百分比。相反地，基準抗體6245P僅顯示小於30%的對人類gremlin與BMP7之結合的最大阻斷，從而表明6245P在阻斷BMP7時不太有效。 實例 7 ： 使用 BMP 反應性報道子分析表徵阻斷 Gremlin 介導之 BMP 信號傳導中的抗體活性
在BRITER(BMP反應性成骨細胞報道子細胞株，Abmgood，T3105)中亦使用BMP4誘導的螢光素酶報道子分析測試此等純化雜交瘤抗體降低gremlin介導之BMP信號傳導抑制的能力。簡言之，將BRITER細胞以10000個細胞/孔接種於96孔板中且在37℃及5% CO 2下培育隔夜。第二天，用對照培養基或具有30 ng/ml BMP 4(BMP4 30)或30 ng/ml BMP 4加Gremlin 200ng/ml(B 30 + Gremlin 200)；或30 ng/ml BMP 4加gremlin 200 ng/ml以及不同濃度的本文所提供的抗體(B + G + 0.096/0.048/0.24/1.2/6/30 μg/ml)的培養基刺激細胞，如圖4的x軸所示。在37℃及5% CO 2下培育3小時後，使用板讀數儀(Thermo Scientific Varioskan Flash)量測每個孔中的細胞的螢光素酶活性。
如圖4中所示，與基準抗體相比，上述抗體顯示在降低報道子細胞中的gremlin介導之BMP信號傳導抑制中無活性，上述報道子細胞並非癌細胞來源，而基準抗體可以降低或逆轉gremlin介導之BMP信號傳導抑制。 實例 8 ： 降低 Gremlin 介導之 BMP 信號傳導抑制中的抗體活性的表徵及細胞分化
亦使用BMP4誘導的ATDC-5細胞分化測試純化雜交瘤抗體降低gremlin介導之對BMP信號傳導的抑制的能力。ATDC-5為軟骨形成細胞株且可響應於BMP4信號傳導而分化。可以藉由Gremlin(已知的BMP抑制劑)阻斷軟骨形成細胞株的分化。在此分析中，Gremlin的阻斷引起BMP4抑制的逆轉。可以藉由使用偵測鹼性磷酸酶(ALP)(成骨細胞分化的早期標記)的內源性表現的基質在色度上量測分化。分化程度可以正面地反映BMP4信號傳導的活性。
將ATDC-5細胞以3000個細胞/孔接種於96孔板中且在體積為100微升/孔的DMEM/F12、10% FBS+1% PS中生長，且在37℃及5% CO 2下培育隔夜。第二天，將hGREM1與連續稀釋的抗體混合於無血清培養基中且在37℃下培育30 min。將於無血清培養基中稀釋的人類BMP4(派普泰克)添加至Gremlin/抗體混合物中且接著在37℃下再培育30 min。培育之後，將100ul混合物添加至接種於100ul完全培養基中的ATDC-5細胞中。每個孔中的細胞上的hBMP4及hGremlin的最終濃度分別為100ng/ml及400ng/ml。在37℃及5% CO 2下生長3天之後，抽吸培養基且用冷的PBS洗滌兩次。用M-PER緩衝液(賽默飛世爾)+蛋白質抑制劑(羅氏(Roche))裂解細胞。使用磷酸對硝基苯酯(PNPP)(西格瑪)量測ALP。在Multiscan FC微板讀數儀(賽默飛世爾科技公司)上量測OD405。
如圖5所示，雖然基準抗體6245P可降低細胞分化中的gremlin介導之對BMP信號傳導的抑制，但抗體14E3(圖5A)、22F1(圖5B)、56C11(圖5C)及69H5(圖5D)未顯示此類作用。換言之，本文中提供的抗體不能夠恢復細胞分化中涉及的對BMP信號傳導的gremlin抑制，上述細胞分化並非癌症來源。 實例 9 ： PC3 ***癌細胞中 gremlin 介導之 BMP 信號傳導抑制的表徵及對本文所提供的抗體逆轉 PC3 細胞中 gremlin 介導之 BMP 信號傳導抑制的評估
將PC3***癌細胞以100000個/孔接種於12孔板中的DMEM/10% FBS、1% PS(完全培養基)中且在37℃及5% CO 2下生長達至90%匯合。用無血清培養基使其饑餓隔夜之後，用具有或不具有gremlin的BMP4刺激PC3細胞30min。將細胞在RIPA緩衝液(CST)中裂解以用於蛋白質印跡分析。使用4%-12% SDS-PAGE(金斯瑞)分離細胞裂解物且將其轉移至PVDF膜(密理博(Millipore))。將膜分別與對smad磷酸化(p-smad1/5/9)(1:1000，CST)(正面地反映BMP信號傳導的活性)具有特異性的抗體及對β-肌動蛋白(1:5000，Abbkine)具有特異性的抗體作為對照在4℃下一起培育隔夜，接著與對應二級抗體一起培育。使用皮爾斯ECL蛋白質印跡基質(賽默飛世爾科技公司)進行顯色且使用Cheniluminescent成像儀(MiniChemi，賽智(Sagecreation))觀測。
結果顯示gremlin以劑量依賴性方式降低BMP誘導的p-smad1/5/9水準，從而表明gremlin確實會抑制BMP信號傳導(圖6A)。
進一步評估本文所提供的不同抗體阻斷gremlin介導之對BMP誘導的p-smad1/5/9的抑制的能力。將Gremlin與本文所提供的不同濃度的抗體在37℃下一起培育30min，且將gremlin及抗體的混合物與BMP4在37℃下一起培育30min，之後添加至接種的PC3細胞中。30 min之後，將細胞在RIPA緩衝液(CST)中裂解以使用上述方案進行蛋白質印跡分析。
如圖6B中所示，隨著本文所提供的抗hGREM1抗體的濃度(例如，14E3、22F1、56C11、69H5)增加，自GREM1介導之抑制中回收的p-smad 1/5/9或pSMAD1/5/9的強度增加。此實驗顯示本文所提供的此等抗體可以劑量依賴性方式調節(例如，降低)gremlin介導之對BMP信號傳導的抑制。 實例 10 ： 不同細胞類型中本文所提供的抗 gremlin1 抗體差異性逆轉 gremlin 介導之對 BMP 信號傳導的抑制的表徵
因為gremlin在多種生理組織中表現且對多種細胞類型具有影響，針對響應於gremlin介導之對BMP信號傳導的抑制的不同細胞類型，吾人評估本文所提供的抗gremlin1抗體是否具有相似作用。簡言之，用BMP4或具有gremlin的BMP4刺激不同來源的多種細胞類型，包括成骨細胞ATDC-5、腎臟成纖維細胞NRK49F、腎臟上皮細胞HK2細胞以及腫瘤細胞PC3。用BMP4及gremlin兩者刺激的細胞接著加入1或10 μg/ml gremlin抗體或對照IgG。此處測試的抗體包括14E3及基準抗體6245P。如圖7中所示，雖然在所有測試的細胞類型中，gremlin可以強效地抑制BMP4誘導的pSMAD1/5/9，且基準抗體6245P可以逆轉gremlin介導之對BMP4誘導的pSMAD1/5/9的抑制，但14E3僅逆轉如PC3細胞的腫瘤細胞中gremlin介導之對BMP4信號傳導的抑制，而非其他細胞類型(例如，ATDC-5成骨細胞、NRK-49F腎臟成纖維細胞、HK-2-腎臟上皮細胞)中的上述抑制。此出人意料的結果表明本文所提供的抗gremlin1抗體(14E3、22F1、56C11、42B9、36F5、67G11及69H5、Hu14E3、Hu22F1及Hu56C11)在其生物活性態樣與基準抗體極其不同，如實例8中所描述在ATDC-5細胞中使用ALP分析符合其差異性活性。相對於非癌細胞，針對癌細胞中的BMP信號傳導逆轉的此選擇性表明本文所提供的抗hGREM1抗體(例如，14E3、22F1、56C11、42B9、36F5、67G11及69H5、Hu14E3、Hu22F1及Hu56C11)可以選擇性地影響癌細胞，同時對非癌細胞具有一點毒性。 實例 11 ： 雜交瘤抗體的選殖及測序
四種顯示所需特徵的前導抗體經選擇用於基因選殖。藉由稱為5' RACE(cDNA端的快速擴增)的聚合酶鏈反應(PCR)擴增技術獲得鼠類抗hGREM1輕鏈及重鏈可變區的序列。使用套組(英傑公司)分離產生雜交瘤細胞的gremlin抗體的總RNA且使用具有寡聚(dT)12-18引子的Superscript第一鏈合成系統(英傑公司)合成cDNA。藉由具有重鏈可變區的MuIgG VH3'-2及MuIg-5'前導引子及輕鏈可變區的MuIgK VL3'-1及MuIg-5"前導引子(諾傑公司(NOVAGEN))的PCR選殖小鼠IgG基因的可變區。將所得帶選殖至TOPO TA選殖載劑中且將來自超過10個選殖株的DNA用於測序且使用ABI DNA測序儀器(珀金埃爾默)進行確定。使用Vector NTI Advance 10軟件(英傑公司)確定共有序列。在測序分析及確認之後，將gremlin基因的可變區選殖至重組表現載劑中(將VL選殖至pCP-mCK中；將VH選殖至pCP-mCg2a中)以用於抗體生產及純化。此等雜交瘤抗體的序列如表10中所示。表10顯示本申請中所使用的所有序列。
抗體與小鼠IgG2b為同種型。為促進抗體分泌，在抗體的N端融合信號肽(MGWSCIILFLVATGVHS(SEQ ID NO: 65))。 實例 12 ： 293E6 細胞中重組抗體蛋白質的表現及純化。
藉由以下方法進行重組抗體蛋白質的表現及純化：將在具有10% Pluronic F-68的Freestyle 293表現培養基中培養的呈1×10 6個細胞/毫升的HEK293E細胞用最終濃度為0.5 μg/ml的等量重鏈載劑及輕鏈載劑DNA及1.0 μg/ml的PEI(聚乙烯亞胺-直鏈，Polyscience)轉染。DNA比PEI比率為1:2。具有最佳MEM的DNA與PEI複合物形成時段在室溫下應為15分鐘。將轉染的細胞在處於5% CO 2、37℃及125rpm振盪速度下的燒瓶中培養。在轉染後22至26小時添加1%蛋白腖培養基。在第6天收集條件培養基且將清液層在3,000 rpm下離心30分鐘。接著將澄清的條件培養基裝載至nProteinA柱(GE醫療集團(G.E.Healthcare))上，用PBS加0.1% triton-X100洗滌，且最後用pH 3.5的含有0.1M甘胺酸的溶液溶離結合的IgG。將溶離的抗體蛋白質透析至PBS中且存儲在-80℃下。為移除內毒素，藉由Hitrap DEAE Sepharose F.F.柱來進一步加工純化蛋白質且使用尺寸排阻層析法(Superdex 200 5/150 GL，GE醫療集團)分析所得抗體以確定純度水準。
根據上文所描述的方法製備的重組嵌合抗gremlin1抗體之結合分析如圖8中所示，其中抗體56C11-C(即，56C11的嵌合抗體)及14E3-C(即，14E3的嵌合抗體)顯示與基準抗體6245P(115.2 ng/ml)相比明顯更高之結合親和力以及更低的EC50值(對於14E3-C為5.240 ng/ml，且對於56C11-C為4.887 ng/ml)。 實例 13 ：選用於 活體內研究的抗體的大規模生產
此等選殖抗體中的每一種按比例擴大以生產大量的抗體用於腎衰竭模型中的活體內測試。
將雜交瘤細胞培養在具有活體外生產培養基的滾瓶中，接著對條件培養基中產生的單株抗體進行加工且藉由蛋白質A親和柱根據低內毒素程序進行純化。
簡言之，回收且擴增雜交瘤細胞，且使細胞適於在雜交瘤生產培養基(DMEM+2%低IgG FBS)中生長且將其接種至各自具有300 ml培養基的滾瓶中。接著在滾瓶中培養細胞2至3週且在純化之前收集及澄清培養基。接著藉由蛋白質A親和柱來純化自培養基中產生的mAb，相對於PBS、pH 7.4透析，且在需要時濃縮至1.0mg/ml或更高。針對質量控制，量測以下參數：抗體產物純度、內毒素水準、聚合水準以及與靶抗原之結合。
預期的產物規格： a. 緩衝液：磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、pH 7.2至7.4，無菌過濾且無防腐劑。 b. 濃度：1.0mg/ml或更高 c. 純度：藉由SDS-PAGE及HPLC為90%或更佳 d. 聚合：藉由HPLC小於10% e. 內毒素：3 EU/mg或更小 實例 14 ：所選 gremlin 抗體與捕獲 hGREM1 之結合 親和力量測的表徵
在25℃下藉由Biacore T200量測抗體的親和力。將HGREM1(派普泰克)固定於Biacore感測器芯片上。使用HBS-EP+作為運行緩衝液及樣品緩衝液進行動力學實驗。藉由在捕獲hGREM1表面上注入不同濃度(在12.5至400 nM範圍內，2-倍稀釋)的抗體量測抗體-抗原締合速率。監測抗體-抗原締合180s，同時監測緩衝液中的解離360s。使用Biacore T200評估軟件進行動力學分析以確定Ka及Kd值。根據KD=Kd/Ka由實驗上確定的Ka及Kd值計算KD。如圖9中所示，重組嵌合抗gremlin1抗體14E3(14E3-C)具有17.68 nM的KD值且嵌合抗gremlin1抗體22F1(22F1-C)具有27.28 nM的KD值。 實例 15 ： 抗原決定基研究
藉由競爭 ELISA 分析進行的抗原決定基分組分析
使用競爭ELISA分析進行抗gremlin雜交瘤抗體的抗原決定基分組。用100微升/孔的含0.5 μg/ml hGREM1(ACRO)的高pH塗佈緩衝液塗佈透明聚苯乙烯培養板(BEAVER)4℃隔夜。接著在自動培養板洗滌器上使用PBS + 0.1% Tween 20(西格瑪)洗滌培養板一次。將100 μl的由PBS + 1% BSA +1%標準山羊血清+ 0.05% Tween 20(西格瑪)組成的阻斷溶液添加至每個孔中且在室溫下培育2小時。接著將50微升/孔的含20 μg/ml飽和抗體(雜交瘤抗體)的抗體稀釋緩衝液(PBS + 1% BSA + 1%標準山羊血清+ 0.01% Tween 20)添加至培養板的每個孔中且培育1小時。接著，將50微升/孔的40 ng/ml競爭性抗體(嵌合抗體，例如14E3-C、22F1-C、56C11-C及69H5-C)添加至培養板的每個孔中且在室溫下再培育1小時。接著將其用PBS + 0.1% Tween20洗滌3次，接著添加100 μl 1:10000山羊抗人類IgG-HRP(艾博抗)，且在室溫下培育1小時。最後，將100微升/孔TMB(皮爾斯)添加至每個孔中，5分鐘之後，將50 μl停止溶液添加至每個孔中。在板讀數儀上在450 nm下讀取培養板。第二抗體在存在飽和量的第一抗體的情況下結合失敗表明兩種抗體均處於同一抗原決定基組(epitope bin)中；第二抗體在存在飽和量的第一抗體的情況下成功結合表明兩種抗體處於不同的抗原決定基組中。基於完整的資料集，存在多個抗體組。資料實例如圖10A中所示。
如圖10A中所示，14E3及22F1彼此競爭且其亦可阻斷69H5-C結合，從而表明此三種抗體處於一個抗原決定基組中。在另一態樣，56C11與gremlin之結合不與14E3、22F1或69H5競爭，從而表明56C11處於與14E3、22F1及69H5的抗原決定基組不同的抗原決定基組中。此結果與圖1中所示的56C11能夠結合於小鼠Gremlin而14E3、22F1及69H5卻不能結合的資料相呼應。
為分析14E3/22F1是否結合於與基準抗體6245P不同的抗原決定基，亦進行交叉競爭實驗。簡言之，添加固定量的嵌合抗體14E3-C/22F1-C或6245P，接著添加增加量的雜交瘤抗體14E3及22F1。確定結合於gremlin的嵌合抗體的量。如圖10B中所示，14E3及22F1彼此競爭但甚至在100×倍過量下不可與6245P結合競爭，從而表明14E3-C及22F1-C結合於與6245P不同的抗原決定基。
14E3 的 抗原決定基定位
比對人類Gremlin及小鼠Gremlin的序列且觀測到僅2個不同的胺基酸：Q27(人類)-P27(小鼠)及N33(人類)-T33(小鼠)，其中編號分別參考SEQ ID NO: 69及SEQ ID NO: 70。14E3結合於人類Gremlin但不結合於小鼠Gremlin，因此吾人推測此兩個不同胺基酸可能係影響抗體結合的關鍵胺基酸。為驗證對於14E3結合的兩個關鍵殘基，將具有信號肽(SEQ ID NO: 71)及C端His-標籤的4種變體(包括人類Gremlin_WT、人類Gremlin_Q27P、人類Gremlin N33T及人類Gremlin_Q27P/N33T)選殖至pcDNA3.1(+)載劑中，且藉由DNA測序確認全部構建體。藉由使用ExpiCHO轉染套組將藉由使用QIAGEN Plasmid Midi套組純化的四種構建體的質粒以3ml級別轉染至ExpiCHO細胞中。將經轉染的細胞在8% CO 2及37℃培育箱中在125 rpm下的搖瓶中培養。在第4天收集細胞培養物，且在8000 rpm下離心30分鐘，接著將清液層用於抗體結合分析。
不包括信號肽的人類Gremlin1序列：
Figure 02_image001
不包括信號肽的小鼠Gremlin1序列：
Figure 02_image003
應注意：人類Gremlin與小鼠Gremlin之間的兩個不同胺基酸為加粗且帶下劃線的。人類Gremlin1的信號肽序列如SEQ ID NO: 71所示，且小鼠Gremlin1的信號肽序列如SEQ ID NO: 72所示。
生物層干涉量測法(BLI)分析
人類gremlin Ab、14E3及6245p用動力學緩衝液(PBS pH 7.4，0.1% BSA + 0.2% Tween-20)稀釋，以在96孔半面積微量板(葛萊娜第一生化(Greiner Bio-one))的負載柱中得到濃度為100nM，每孔100微升。將待測試的Gremlin WT及突變體的清液層添加於培養板的締合柱中，每孔100微升。培養基或KD緩衝液用作參考對照。將AHC感測器放置於第1個基線柱中60s以得到第1基線，接著放置於負載柱中300s以捕獲Gremlin抗體。之後，將感測器放置於第2個基線柱中60s以得到第2基線。接著將其放置於締合柱中300s以使Gremlin/Gremlin Ab完全締合，將感測器放置於解離柱中300s。藉由ForteBio(Octet96)分析群組資料。
圖10D顯示14E3仍可結合於Asn33經Thr取代(即，N33T)的人類gremlin 1變體，但結合顯示部分降低。然而，人類gremlin 1中Gln27經Pro取代(即，Q27P)顯著地降低14E3結合，在具有N33T及Q27P取代的人類gremlin 1變體中亦觀測到上述降低。相比之下，人類gremlin 1中的N33T或Q27P單一突變均未顯著地降低6245P之結合，從而表明6245P結合於人類gremlin 1中不含N33或Q27的抗原決定基。此與在具有N33T及Q27P突變的人類gremlin 1變體中所觀測之結合結果一致。此等資料表明14E3結合於包含SEQ ID NO: 69的Q27的抗原決定基。14E3結合的抗原決定基可以在較小程度上包括SEQ ID NO: 69的N33。 實例 16 ： 與 Gremlin-Dan 融合蛋白 XM5 之結合
為進一步證實14E3結合於與6245P不同的抗原決定基，吾人評估此等抗體與如實例6中所描述的野生型gremlin蛋白質或XM5之結合。
使用上文所提及的類似ELISA方案，測試嵌合抗體14E3與XM5或Gremlin之結合。簡言之，塗佈14E3-C或6245P(1μg/ml)且添加連續稀釋的XM5-his清液層或Gremlin-his(2μg/ml至0.49μg/ml)以用於結合。將二級抗體抗his-HRP用於偵測。如圖10C中所示，14E3-C及6245P均可結合於Gremlin。然而，僅14E3-C可結合於XM5，但6245P不可結合於XM5。此表明14E3-C及6245P結合於不同抗原決定基，與上文所提及的抗原決定基分組結果一致。
另外比較與hGREM1及XM5之結合親和力。簡言之，塗佈XM5-Fc或Gremlin-his(1μg/ml)。將100 μl的由PBS +1% BSA +1%標準山羊血清+ 0.5% Tween 20(西格瑪)組成的阻斷溶液添加至每個孔中且在室溫下培育2小時。添加以2 μg/ml開始的4-倍連續抗體稀釋液。隨後，用200 μl的PBS+0.1% Tween20洗滌培養板三次，接著添加100微升/孔的1:10000山羊抗小鼠IgG-HRP(艾博抗)，且在室溫下培育1小時。接著用PBS+0.1% Tween20將其洗滌3次。最後，將100微升/孔的TMB(英創生物科技有限公司(InnoReagents))添加至每個孔中，且在2分鐘之後，向每個孔中添加50 μl的停止溶液。在Multiscan FC微板讀數儀(賽默飛世爾科技公司)上在450nM下讀取培養板。EC50值如下表中所示。
如圖10E及圖10F中所示，42B9、36F5及67G11以0.012 ng/ml至0.015 ng/ml的EC50值結合於hGREM1，且以0.006 ng/ml至0.008 ng/ml的EC50值結合於XM5。 實例 17 ：藉由 Fortebio 進行 抗原決定基分析
藉由Fortebio進一步執行對本文所提供的抗gremlin1抗體的抗原決定基分析。簡言之，將第一抗gremlin1抗體(第1 Ab)稀釋於微量板(葛萊娜第一生化)的負載柱中的動力學緩衝液(PBS)中，250微升/孔。將hGremlin-his加入培養板的締合柱中的動力學緩衝液中，250微升/孔；將AHC感測器放置於第1基線柱中60s以得到第1基線，且接著放置於負載柱中300s以捕獲第一抗gremlin1抗體。之後，將感測器放置於第2基線柱中180s以得到第2基線，且接著放置於締合柱中300s以使gremlin與第一抗gremlin1抗體完全締合。將感測器放置於第二抗gremlin1抗體(第2 Ab)柱中300s以使第二抗gremlin1抗體與第一抗體競爭或不與第一抗體競爭。藉由ForteBio(Octet96)分析資料。
若第二抗gremlin1抗體不結合於gremlin，則此表明其結合於與第一抗gremlin1抗體類似的抗原決定基；若第二抗gremlin1抗體可不受第一抗gremlin1抗體任何影響而結合，則此表明其抗原決定基是不同的。如圖11A中所示，作為第二抗gremlin1抗體的6245P仍可結合於gremlin，從而表明其不與14E3競爭且結合於不同抗原決定基；而22F1/69H5在存在14E3的情況下不結合於gremlin，從而表明22F1/69H5及14E3可以結合於類似的抗原決定基位點。相反地，作為第一抗gremlin1抗體的6245P不可阻斷14E3/22F1結合於抗原，但完全阻斷56C11/69H5與抗原之結合(圖11B)。因此，根據抗原決定基類型，可能存在3個群組：一個群組包括14E3及22F1，一個群組包括56C11及69H5，其抗原決定基可與6245P的抗原決定基重疊(表6)。
表6
      AHC感測器上的第一Ab
      14E3 22F1 56C11 69H5 6245P
溶液中的第2 Ab 14E3 + + - 部分 -
22F1 + + - 部分 -
56C11 + + + 部分 +
69H5 + + + + +
6245P - - + - +
附註：+：競爭者；-：非競爭者；部分：部分競爭者。 實例 18 ： 抗 GREM 1 抗體的人源化
人源化 14E3
在以下方案中使用三維結構模擬及藉由CDR移植進行人源化來設計14E3的人源化抗體。
抗體人源化的第一步驟是模擬14E3的可變結構域的三維結構。將鼠類抗體的每個可變結構域(Vk及Vh)的序列在PDB資料庫(蛋白質資料庫(Protein Data Bank)，http://www.rcsb.org/)中進行序列比對(blasted)以識別與已知高分辨率結構最同源的抗體序列。選用於建模14E3的結構模板具有與目標抗體最佳的類似性。吾人人工地改變結構的每個殘基以滿足目標序列。調節某些側鏈構形的同時保持主鏈構形。在母結構與模擬結構具有相同殘基的位置中，側鏈構形保持不變；若一些位置中模板結構與建模結構之間的殘基不同，則側鏈構形會根據模板結構及封裝考慮因素而突變及優化。
吾人亦模擬CDR移植14E3的結構以便引導回復突變設計及評估人源化抗體的可發展性及穩定性。以類似方式進行結構模擬。
藉由CDR移植進行人源化。在IMGT的人類免疫球蛋白基因資料庫進行鼠類14E3序列的序列比對之後，將人類生殖系構架序列重鏈的IGHV/7-4及輕鏈的IGKV/2-30分別用於CDR移植，且獲得不具有回復突變的人源化14E3。為進一步保持人源化14E3的活性，吾人對人源化抗體的構架序列及其對應鼠類抗體的構架序列進行比對。在鼠類抗體結構模型中對不同殘基進行雙重檢查：若其中任一者處於可能與CDR殘基相互作用且影響CDR殘基的位置中，則其應回復突變為鼠類殘基。本發明獲得具有不同回復突變的三個人源化重鏈可變區，分別標記為Hu14E3_Ha VH、Hu14E3_Hb VH及Hu14E3_Hc VH，以及具有不同回復突變的兩個人源化輕鏈可變區，標記為Hu14E3-La VL及Hu14E3-Lb VL(參見表5)。此等人源化重鏈及輕鏈可變區的cDNA融合至hIgG1及hKappa恆定區且***至哺乳動物載劑中。每個人源化重鏈與人源化輕鏈共表現以獲得6個版本的人源化抗體，即，Hu14E3_HaLa、Hu14E3_HaLb、Hu14E3_HbLa、Hu14E3_HbLb、Hu14E3_HcLa及Hu14E3_HcLb。表現及純化程序與嵌合抗體相同。
人源化 22F1
以類似的方案設計22F1的人源化抗體。簡言之，將人類生殖系構架序列重鏈的IGHV/1-46及輕鏈的IGKV/2-30分別用於CDR移植，接著使用計算機建模以設計具有CDR移植及回復突變的人源化變體。本發明獲得具有回復突變的四個人源化重鏈可變區，即，Hu22F1_Ha VH、Hu22F1_Hb VH、Hu22F1_Hc VH及Hu22F1_Hd VH，以及具有不同回復突變的兩個輕鏈可變區，即，Hu22F1-La VL及Hu22F1-Lb VL(參見表5)。每個人源化重鏈與人源化輕鏈共表現以獲得22F1的8個版本人源化抗體，即，Hu22F1_HaLa、Hu22F1_HaLb、Hu22F1_HbLa、Hu22F1_HbLb、Hu22F1_HcLa、Hu22F1_HcLb、Hu22F1_HdLa及Hu22F1_HdLb。表現及純化程序與嵌合抗體相同。
藉由一些步驟進行重組抗體蛋白質的表現及純化：將ExpiCHO細胞以5至6×10 6個細胞/毫升接種於ExpiCHO表現培養基中。隨後，使用ExpiCHO轉染套組用等量的重鏈載劑及輕鏈載劑DNA以1.0 μg/ml的最終濃度轉染ExpiCHO細胞。將經轉染的細胞在補充有8% CO 2的37℃培育箱中在125 rpm下的搖瓶中培養。在轉染後18至22小時之後添加ExpiCHO進料。在第10天收集細胞培養物。藉由離心獲得收集的細胞培養液(HCCF)。接著將HCCF裝載於rProteinA柱(GE醫療集團)上且用PBS洗滌。用含有20 mM檸檬酸的溶液，pH3.2溶離最終IgG抗體。最後，將溶離的抗體蛋白質中和且存儲在-80℃下以便長期使用。分析所得抗體以使用SDS-PAGE及尺寸排阻層析(TSKgel G3000SWXL，TOSOH)測定純度水準。
人源化 56C11
以類似的方案設計56C11的人源化抗體。簡言之，將人類生殖系構架序列重鏈的IGHV1-2*02及輕鏈的IGKV2-30*02分別用於CDR移植。
藉由將三個CDR直接移植至生殖系序列來獲得重鏈(HC)變體1、2、3及4。以上重鏈可變區及輕鏈可變區的組合產生以下人源化56C11抗體：56C11-H0L0、56C11-HaL0、56C11-HbL0、56C11-HcL0、56C11-H0La、56C11-HaLa、56C11-HbLa、56C11-HcLa、56C11-H0Lb、56C11-HaLb、56C11-HbLb、56C11-HcLb。
56C11的重鏈及輕鏈的人源化變體連接於人類IgG1重鏈恆定區及κ輕鏈恆定區，如下文所示：
人類IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO: 138)：
Figure 02_image005
Figure 02_image007
人類κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO: 139)：
Figure 02_image009
合成以上重鏈及輕鏈cDNA的可變區且使其與人類IgG1及人類κ的恆定區融合。將所選抗體基因的重鏈及輕鏈選殖至表現載劑中且使用來自Qiagen的Plasmid Maxiprep系統製備大規模DNA。使用來自英傑公司的ExpiFectamine™CHO試劑根據製造商的方案進行轉染。當細胞存活率為約60%時收集清液層。經由0.22 μm過濾囊過濾細胞培養物清液層以移除細胞碎片。將清液層裝載於預平衡的蛋白質-A親和柱上。接著用平衡緩衝液(PBS)洗滌柱內的蛋白質A樹脂，且使用25 mM檸檬酸鹽(pH 3.5)溶離抗體。用1M Tris-鹼(pH 9.0)將pH調節至約6.0至7.0。將內毒素控制在低於1EU/mg。接著藉由SDS-PAGE及SEC-HPLC表徵純化的抗體。 實例 19 ： ELISA 及 Fortebio 中 人源化抗體與 hGremlin 之結合
實例4的相同方案。如圖12A中所示，14E3的人源化變體保持與嵌合14E3(例如，14E3 hIgG1或14E3-C)類似之結合活性，從而表明生物活性可能不受人源化影響。然而，22F1的大多數人源化變體明顯地喪失結合，且僅22F1-HdLa及22F1-HdLb仍具有良好親和力(圖12B及圖12C)。
亦藉由Fortebio量測人源化抗體的親和力。人類gremlin蛋白質用動力學緩衝液稀釋以得到2μg/ml的濃度。0nM用作參考對照。待測試的抗體用ForteBio動力學緩衝液(PBS pH 7.4，0.1% BSA + 0.002% Tween-20)稀釋至100 nM、50nM及25nM的濃度。將人類gremlin-his固定於NTA生物感測器上。偵測基線60秒，且接著偵測抗gremlin抗體締合120秒以得到K on因子資料。接著在動力學緩衝液中解離90秒以得到K off因子資料。如圖12D中所示，人源化抗gremlin1抗體14E3具有小於1 nM的KD值，遠低於基準抗體的KD值。 實例 20 ： PC-3 異種移植腫瘤模型中人源化抗體 14E3 的 腫瘤生長抑制活性
簡言之，人***癌PC3細胞在RPMI1640培養基(賽默飛世爾(Thermo Fisher))中進行活體外單層培養，培養基補充有10%熱滅活胎牛血清(依科賽生物(ExCell Biology))、100 U/ml青黴素、100ug/ml鏈黴素(海克隆(Hyclone))及1ug/ml嘌呤黴素(吉畢科公司)，培養維持在37℃下、含有5% CO 2的空氣的氣體中。腫瘤細胞藉由胰蛋白酶-EDTA處理劑(海克隆)，習知地每週傳代培養兩次。收穫呈指數增長階段的細胞且計數，用於腫瘤接種。SPF級雄性裸鼠皮下接種與50%基質凝膠混合的1*10^6 PC3細胞。10天之後，對接種後的小鼠進行睪丸切除。當腫瘤大小達到200mm^3左右時，選擇腫瘤攜帶小鼠且隨機分為2組(n=8)。用10mg/kg hIgG1對照及10mg/kg Hu14E3_HaLa腹腔注射動物，每4天注射一次，持續3週。每4天用測徑規(INSIZE)在兩個維度量測一次腫瘤大小，體積用mm^3表示，公式為：V=0.5 a*b^2，其中a及b分別為腫瘤的長直徑及短直徑。使用Prism GraphPad分析結果且表示為均值±S.E.M。藉由T-測試進行兩個組之間的比較，且若p為*＜0.05及**＜0.01，則認為差異顯著。結果表明，Hu14E3_HaLa無論從體積亦或重量評估上均能有效抑制腫瘤生長(圖13A及圖13B)。 實例 21 ： 56C11 在 BALB/c 的 CT-26 腫瘤模型 (MSB-Pharm2018025) 中的功效
因為gremlin1可以在腫瘤細胞及基質纖維母細胞兩者中表現，所以吾人評估gremlin1在調節腫瘤微環境中的貢獻及其單獨或與檢查點抑制劑組合調節腫瘤生長的潛力。因此，吾人評估56C11在CT-26模型(同基因型腫瘤模型)中的抗腫瘤活性。簡言之，向24隻5至6週齡雌性Balb/c小鼠接種2×10 6個CT26腫瘤細胞。當腫瘤體積達到約100 mm 3時，將動物隨機化且分組如下：1)同種型對照20 mg/kg及2)56C11，20 mg/kg。腹膜內(IP)注射抗體，一週兩次，持續2週。圖14中所示的結果顯示單獨的抗GREM1抗體56C11(其對小鼠GREM1具有交叉反應性)可具有顯著的抗腫瘤活性而對總體重無顯著影響。預期本文所提供的人源化抗GREM1抗體(例如，Hu14E3、Hu14E3、Hu22F1及Hu56C11)在人類中顯示與其嵌合對應物在展現出顯著抗腫瘤活性而對總體重無顯著影響態樣類似的技術效果。 實例 22 ： MPDL-3820A 及 抗 GREM 1 抗體組合療法在 CT26 腫瘤模型 (MSB-Pharm2018004) 中的功效
為進一步測試抗GREM 1抗體與免疫檢查點抑制劑的組合的抗腫瘤功效，吾人評估了組合MPDL-3280A及替代物抗小鼠GREM 1抗體(抗mGREM 1抗體)在CT26腫瘤模型中的抗腫瘤活性。簡言之，向5至6週齡雌性Balb/c小鼠接種5×10 5/小鼠CT26細胞。將動物隨機化。當腫瘤體積達到約100mm 3時，將小鼠分為以下四個處理組：1)單獨的對照IgG1，10 mpk，2)單獨的MPDL3280A，3 mpk，3)單獨的抗mGREM 1抗體，10 mpk，或4)3 mpk的MPDL3280a及10 mpk的抗mGREM 1抗體的組合，IP一週兩次，持續2週。如圖15A及圖15B中所示，抗mGREM 1抗體與免疫檢查點抑制劑(例如，針對PD-L1的抗體)的組合引起與單獨的抗mGREM 1抗體或僅免疫檢查點抑制劑相比明顯更高的抗腫瘤活性(就腫瘤體積或腫瘤重量而言)。此表明抗mGREM 1抗體可以增強免疫檢查點抑制劑的抗腫瘤活性。 實例 23 ： 人源化 14E3 與 順鉑的組合在食道癌 PDX 模型中的功效
人類gremlin IHC，具體言之陽性食道腫瘤組織(E7)是獲自北京腫瘤醫院(Beijing Cancer Hospital)傳代的NOD/SCID小鼠及確立的PDX庫。吾人藉由免疫組織化學使用抗GREM1抗體(14E3)或抗PD-L1抗體(22C3)測試了E7食道PDX模型中的GREM1表現及PD-L1表現。圖16顯示食道癌PDX模型E7在GREM1表現中為陽性但不具有PD-L1表現。
向每隻小鼠皮下接種直徑大致為3 mm的小腫瘤組織塊，自攜帶腫瘤小鼠的整體腫瘤剝離物中剪切上述小腫瘤組織塊。接種之後18天，選擇腫瘤大小為約70 mm 3的動物且將其隨機分為4個組，每個組由8隻小鼠組成。接著，用同種型對照+PBS、20 mg/kg劑量的人源化14E3(hzd14E3)、3 mg/kg劑量的順鉑以及hzd14E3及順鉑的組合處理小鼠。藉由腹膜內注射及PBS投與同種型對照及hzd14E3，一週兩次且持續4週，而藉由靜脈內注射投與順鉑，一週一次且持續4週。在結束研究時利用CO 2吸入殺死動物。使用測徑規(INSIZE)在兩個維度量測腫瘤大小，一週兩次或三次，且使用下式以mm^3表示體積：V = 0.5 a×b2，其中a及b分別為腫瘤的長直徑及短直徑。使用Prism GraphPad分析結果且表示為均值±S.E.M。藉由T-測試進行兩個組之間的比較，且若p為*＜0.05及**＜0.01，則認為差異顯著。
圖17A及圖17B顯示與具有42.92% TGI的同種型對照相比，當此實驗中使用單獨的人源化14E3時顯著增強腫瘤生長抑制。與單獨的人源化14E3(63.97% TGI對比42.92% TGI)或單獨的順鉑(63.97% TGI對比59.79% TGI)相比時，人源化14E3及順鉑的組合進一步抑制腫瘤生長，從而表明人源化14E3及順鉑的組合治療對食道癌的協同效應。
到目前為止，用於食道癌的一線療法一般包括食管切除術、化學療法、靶向療法、免疫療法(例如，靶向PD-1或PD-L1)，及/或其組合。用於食道癌的二線療法及後續療法可以涉及靶向療法，如靶向血管內皮生長因子(VEGF)受體的雷莫蘆單抗或用於轉移性腺癌的過度表現HER2的曲妥珠單抗( NCCN 腫瘤學臨床實踐指南( NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology). 食道及食管胃連接部癌症 (Esophageal and Esophagogastric Junction Cancers). 美國國家綜合癌症網絡 (National Comprehensive Cancer Network). V1. 2020)。上文所描述的資料顯示本文所提供的抗GREM1抗體可有效地治療且不表現PD-L1的腫瘤，例如不過度表現PD-L1的食道癌，且在與化學療法(例如順鉑)組合時可進一步達成協同效應。此表明本文所提供的抗GREM1抗體可以充當用於食道癌的一線療法或二線療法的新選擇。 實例 24 ： hzd14E3( 與 DC101 組合 ) 及 6245P 在 食道癌 PDX 模型中的功效
人類gremlin IHC，具體言之陽性食道腫瘤組織(E7)係獲自北京腫瘤醫院(Beijing Cancer Hospital)傳代的NOD/SCID小鼠及確立的PDX庫。向每隻小鼠皮下接種直徑大致為3 mm的小腫瘤組織塊，自攜帶腫瘤小鼠的整體腫瘤剝離物中剪切上述小腫瘤組織塊。接種之後18天，選擇腫瘤大小為約70 mm 3的動物且將其隨機分為4個組，每個組由8隻小鼠組成。接著，用同種型對照、20 mg/kg劑量的hzd14E3及6245P、10 mg/kg劑量的DC101以及hzd14E3及DC101的組合處理小鼠。DC101為與小鼠VEGFR-2反應的單株抗體且為可商購的(例如，來自BioXell的目錄號BE0060)。藉由腹膜內注射投與對照物及測試品，一週兩次且持續4週。在結束研究時利用CO 2吸入殺死動物。使用測徑規(INSIZE)在兩個維度量測腫瘤大小，一週兩次或三次，且使用下式以mm^3表示體積：V = 0.5 a×b 2，其中a及b分別為腫瘤的長直徑及短直徑。使用Prism GraphPad分析結果且表示為均值±S.E.M。藉由T-測試進行兩個組之間的比較，且若p為*＜0.05及**＜0.01，則認為差異顯著。預期本文所提供的其他人源化抗GREM1抗體(例如，Hu22F1及Hu56C11)顯示類似的技術效果。 實例 25 ：表徵 阻斷 Gremlin 結合於捕獲 FGFR1 中的 抗體活性
測試gremlin-his與固定於培養板上的FGFR1之結合能力。簡言之，用重組人類2 μg/ml的FGFR1-Fc(北京義翹神州科技股份有限公司(Sino-Biological))塗佈培養板隔夜且接著將以2 μg/ml開始的gremlin-his的2倍連續稀釋液(ACRO)添加至塗佈培養板中且在室溫(RT)下培育1h。接著洗滌培養板且用抗his HRP(金斯瑞)偵測培養板結合的Gremlin-his。接著將培養板用TMB溶液顯色，藉由添加終止溶液使其終止。在板讀數儀上在450 nm下讀取培養板。培育時間為約20分鐘。如圖18A中所示，hGREM1可以結合於FGFR1。
接著，選擇0.25 μg/ml gremlin測試阻斷活性。經由ELISA偵測抗體阻斷Gremlin結合於人類FGFR1-Fc的能力。用重組FGFR1-Fc(2 μg/ml)塗佈培養板隔夜，接著在室溫下將抗體的連續稀釋液與0.25 μg/ml的修飾的人類Gremlin-his一起培育1h，之後將此複合物添加至塗佈培養板中且將其在室溫下再培育一小時。接著洗滌培養板且添加抗his HRP(金斯瑞)。接著將培養板用TMB溶液顯色，藉由添加終止溶液使其終止。在板讀數儀上在450 nm下讀取培養板。如圖18B及18C中所示，本文所提供的抗gremlin 1抗體(例如42B9、36F5、67G11及14E3 HaLa、嵌合抗體69H5(69H5-chi)、嵌合抗體36F5(36F5-chi)、嵌合抗體22F1(22F1-chi))可抑制或阻斷hGREM1與FGFR1之結合，而基準抗體6245P不阻斷hGREM1與FGFR1之結合。36F5-chi可以阻斷hGREM1與FGFR1之結合，IC50值為1.368nM。69H5-chi及22F1-chi具有部分阻斷活性，其中69H5-chi可以阻斷hGREM1與FGFR1之結合，IC50值為7.138nM，22F1-chi可以阻斷hGREM1與FGFR1之結合，IC50值為5.117nM。預期本文所提供的人源化抗GREM1抗體(例如，Hu14E3、Hu22F1)在阻斷hGREM1與FGFR1之結合中顯示與其嵌合對應物有類似的技術效果。 實例 26 ：藉由 ELISA 進行的 純化雜交瘤或嵌合抗 gremlin 抗體與捕獲人類 gremlin 及 DAN 蛋白質之結合分析
在4℃下用100微升/孔的含0.5 μg/ml人類gremlin(ACRO)及DAN(北京義翹神州科技股份有限公司)的高pH塗佈緩衝液塗佈透明聚苯乙烯培養板(BEAVER)隔夜。接著在自動培養板洗滌器上使用PBS + 0.1% Tween 20(西格瑪)洗滌培養板一次。將100 μl的由PBS +1% BSA +1%標準山羊血清+ 0.5% Tween 20(西格瑪)組成的阻斷溶液添加至每個孔中且在室溫下培育2小時。接著將100 μl於含有PBS + 1% BSA +1%標準山羊血清+0.01% Tween 20的抗體稀釋緩衝液中的抗體(雜交瘤或嵌合抗體36F5、嵌合抗體67G11、嵌合抗體42B9)(以2 μg/ml(13.33nM)開始且進行4倍連續稀釋)添加至培養板的每個孔中且在室溫下培育1小時。隨後，用200 μl的PBS+0.1% Tween20洗滌培養板三次，接著添加100微升/孔的1:10000山羊抗小鼠IgG-HRP或小鼠抗人類IgG-HRP(艾博抗)，且在室溫下培育1小時。接著用PBS+0.1% Tween20將其洗滌3次。最後，將100微升/孔的TMB(英創生物科技有限公司)添加至每個孔中，且在2分鐘之後，向每個孔中添加50 μl的停止溶液。在Multiscan FC微板讀數儀(賽默飛世爾科技公司)上在450nm下讀取培養板。EC50值亦如下圖19A、19B及19C中所示。因此，雜交瘤或嵌合抗體36F5、嵌合抗體67G11及嵌合抗體42B9具有類似的gremlin與DAN蛋白質之結合活性。 實例 27 ：表徵 阻斷 DAN 蛋白質結合於捕獲 BMP2/4 中的 抗體活性
用重組人類BMP2/4(0.5 μg/ml)塗佈培養板隔夜。接著在自動培養板洗滌器上使用PBS + 0.1% Tween 20(西格瑪)洗滌培養板一次。將100 μl的由PBS +1% BSA +1%標準山羊血清+ 0.5% Tween 20(西格瑪)組成的阻斷溶液添加至每個孔中且在室溫下培育2小時。接著將培養板洗滌三次。接著將分別於含有PBS+ 1% BSA+1%標準山羊血清+0.01% Tween 20的稀釋緩衝液中的55ul嵌合抗體36F5的連續稀釋液及55ul的0.5μg/ml人類DAN-his混合且在室溫下培育1h，之後將100ul此複合物添加至塗佈培養板中且將其在室溫下再培育一小時。接著洗滌培養板3次且添加100ul含抗his HRP(金斯瑞)的稀釋緩衝液。接著將培養板用TMB溶液顯色，藉由添加終止溶液使其終止。用洗滌緩衝液洗滌三次之後，在板讀數儀上在450 nm下讀取培養板。另外，與前述結果一致，除了阻斷gremlin活性以外，36F5亦可阻斷BMP2/4結合於DAN蛋白質。(圖20A及20B)。 實例 28 ： 雜交瘤 36F5 在 EMT6/hPD-L1 腫瘤模型中的功效
用篩檢穩定表現人類PD-L1的人類PD-L1基因轉染小鼠乳癌細胞株EMT6，命名為EMT6/hPD-L1。將EMT6/hPD-L1細胞以單層培養物形式維持於37℃下具有5% CO 2的空氣壓力下的試管內補充有10%熱滅活胎牛血清(依科賽生物)、100 U/ml青黴素、100ug/ml鏈黴素(海克隆)的DMEM培養基(海克隆)中。腫瘤細胞藉由胰蛋白酶-EDTA處理(海克隆)習知地每週傳代培養兩次。收集在指數生長階段中生長的細胞且對其計數以用於腫瘤接種。雌性SPF級BABL/c小鼠接種有與50%基質膠混合的2*10^6 EMT6/hPD-L1細胞。在第一研究中，當腫瘤大小為約80mm^3時，選擇腫瘤攜帶小鼠且隨機分成2個組(n=10)。藉由腹膜內注射用24.9mg/kg hIgG1對照及24.9mg/kg AM4B6處理動物，一週兩次且持續4週。在第二研究中，當腫瘤大小為約70mm^3時，選擇腫瘤攜帶小鼠且隨機分成2個組(n=8)。藉由腹膜內注射用10mg/kg hIgG1對照及10mg/kg 36F5處理動物，一週兩次且持續3週。使用測徑規(INSIZE)在兩個維度量測腫瘤大小，一週兩次，且使用下式以mm^3表示體積：V = 0.5 a×b^2，其中a及b分別為腫瘤的長直徑及短直徑。使用Prism GraphPad分析結果且表示為均值±S.E.M。藉由T-測試進行兩個組之間的比較，且若p為*＜0.05及**＜0.01，則認為差異顯著。表7及圖21A為第一研究的結果。結果顯示抗PD-L1抗體(AM4B6)在EMT6/hPD-L1腫瘤模型中不具有抗腫瘤活性。EMT6/hPD-L1腫瘤模型展現出對PD-L1抗體的不良反應。表8及圖21B為第二研究的結果。結果顯示抗Gemlin1抗體(36F5)在EMT6/hPD-L1腫瘤模型中具有希望的抗腫瘤活性，上述腫瘤模型展現出對PD-L1抗體的不良反應。
表 7 ： 第 29 天 AM4B6 在 EMT6/hPD-L1 腫瘤模型中的功效
處理 (n=10) 腫瘤大小 (mm^3，均值±S.E.M.) TGI(%) 相比於同種型對照的p值
同種型對照 1445.07±208.18 / /
AM4B6 1016.29±214.42 29.67 0.1685
表 8 ： 第 24 天 36F5 在 EMT6/hPD-L1 腫瘤模型中的功效
處理 (n=8) 腫瘤大小 (mm^3，均值±S.E.M.) TGI(%) 相比於同種型對照的p值
同種型對照 1060.76±141.45 / /
36F5 599.72±208.49 43.46 0.0886
實例 29 ： 雜交瘤 14E3 、雜交瘤 36F5 或納武單抗在 PBMC 人源化小鼠的 E7 腫瘤模型中的功效
E7為具有人類Gremlin高表現的食道癌PDX，其獲自北京腫瘤醫院傳代的NOD-SCID小鼠及確立的PDX庫。NOG小鼠為購自維通利華(Vital River)的重度免疫缺陷小鼠。向每隻小鼠皮下接種直徑大致為3 mm的小腫瘤組織塊，從攜帶腫瘤小鼠的整體腫瘤剝離物中剪切上述小腫瘤組織塊。接種之後27天，選擇腫瘤大小為約50mm^3的動物且靜脈內注射5*10^6/小鼠人類PBMC。一週後，針對重構特徵篩選動物且隨機分為6個組，每個組由8隻小鼠組成。藉由腹膜內注射用30mg/kg同種型對照、30mg/kg 14E3、30mg/kg 36F5、10mg/kg納武單抗處理動物，一週兩次且持續5週。使用測徑規(INSIZE)在兩個維度量測腫瘤大小，一週兩次，且使用下式以mm^3表示體積：V = 0.5 a×b^2，其中a及b分別為腫瘤的長直徑及短直徑。使用Prism GraphPad分析結果且表示為均值±S.E.M。藉由T-測試進行兩個組之間的比較，且若p為*＜0.05及**＜0.01，則認為差異顯著。表9、圖22A及圖22B為研究結果。結果顯示抗PD-L1抗體(納武單抗)在E7腫瘤模型中不具有抗腫瘤活性。抗Gemlin1抗體36F5及14E3在E7腫瘤模型中具有希望的抗腫瘤活性，上述腫瘤模型展現出對PD-1抗體的不良反應。
表 9 ： 第 35 天 14E3 或 36F5 相比於納武單抗在 PBMC 人源化小鼠的 E7 腫瘤模型中的功效
處理 (n=8) 腫瘤大小 (mm^3，均值±S.E.M.) TGI(%) 相比於同種型對照的p值
30mg/kg同種型對照 527.84±129.07 / /
30mg/kg 14E3 279.96±92.85 46.96 0.1606
30mg/kg 36F5 264.61±63.69 49.87 0.0888
10mg/kg納武單抗 440.71±84.33 16.51 0.5809
實例 30 ： 56C11 與 抗 PDL1 抗體的組合療法在 MC38/hPD-L1 腫瘤模型中的功效
用篩檢穩定表現人類PD-L1的人類PD-L1基因轉染小鼠結腸癌細胞株MC38，命名為MC38/hPD-L1。將MC38/hPD-L1細胞以單層培養物形式維持於37℃下具有5% CO 2的空氣壓力下的試管內補充有10%熱滅活胎牛血清(依科賽生物)、100 U/ml青黴素、100ug/ml鏈黴素(海克隆)的1640培養基(海克隆)中。腫瘤細胞藉由胰蛋白酶-EDTA處理(海克隆)習知地每週傳代培養兩次。收集在指數生長階段中生長的細胞且對其計數以用於腫瘤接種。雌性SPF級C57BL/6小鼠接種有與50%基質膠混合的2*10^6 MC38/hPD-L1細胞。當腫瘤大小為約120mm^3時，選擇腫瘤攜帶小鼠且隨機分成4個組(n=8)。藉由腹膜內注射用3mg/kg hIgG1對照、20mg/kg 56C11、3mg/kg 23F11(抗PDL1抗體)及20mg/kg 56C11與3mg/kg 23F11的組合處理動物，一週兩次且持續3週。使用測徑規(INSIZE)在兩個維度量測腫瘤大小，一週兩次，且使用下式以mm^3表示體積：V = 0.5 a×b^2，其中a及b分別為腫瘤的長直徑及短直徑。使用Prism GraphPad分析結果且表示為均值±S.E.M。藉由T-測試進行兩個組之間的比較，且若p為*＜0.05及**＜0.01，則認為差異顯著。56C11與抗PDL1抗體的組合增強了在MC38/hPD-L1腫瘤模型中的抗腫瘤活性(表10及圖23)。
表 10 ：第 22 天 56C11 組合 在 MC38/hPD-L1 腫瘤模型中的功效
處理 (n=8) 腫瘤大小 (mm^3，均值±S.E.M.) TGI(%) 相比於同種型對照的p值
hIgG1對照 849.22±109.77 / /
56C11 521.52±69.89 38.59 0.0246
抗PDL1抗體 522.04±74.92 38.53 0.0274
56C11+抗PDL1抗體 378.94±87.31 55.38 0.0047
表11.本申請案中提及或使用的序列
SEQ ID NO 序列 註釋
1 TYGMA 14E3/Hu14E3-Ha/ Hu14E3-Hb/ Hu14E3-Hc HCDR1
2 WINTLSGEPTYADDFKG 14E3/Hu14E3-Ha/ Hu14E3-Hb/ Hu14E3-Hc HCDR2
3 EPMDY 14E3/Hu14E3-Ha/ Hu14E3-Hb/ Hu14E3-Hc HCDR3
4 KSSQSLLDSDGKTYLS 14E3/Hu14E3-La/ Hu14E3-Lb LCDR1
5 LVSKLDS 14E3/Hu14E3-La/ Hu14E3-Lb LCDR2
6 WQGAHFPLT 14E3/Hu14E3-La/ Hu14E3-Lb LCDR3
7 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGSTFTTYGMAWMKQAPGKGLTWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFAFSLKTSANTAYLQINNLKNEDAATYFCAREPMDYWGQGTSVIVSS 14E3 VH
8 DVVMTQTPLTLSITIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLSWLLQRPDQSPKRLISLVSKLDSGVPDRITGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGAHFPLTFGAGTKLELK 14E3 VL
9 CAGATCCAGTTGGTACAGTCTGGACCTGAACTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGACTTCTGGATCTACGTTCACAACCTATGGAATGGCCTGGATGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAACGTGGATGGGCTGGATAAACACCCTCTCTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGAAAACCTCTGCCAACACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACGCGGCTACATATTTCTGTGCACGAGAACCAATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCATCGTCTCCTCA 14E3 VHnu
10 GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGATTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAATCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAGTTGGTTGTTACAGAGGCCAGACCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTCTCTGGTGTCCAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGATCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATTTGGGCATCTATTATTGCTGGCAAGGTGCACATTTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA 14E3 VLnu
11 DYYMN 22F1/Hu22F1-Ha/ Hu22F1-Hb/ Hu22F1-Hc/ Hu22F1-Hd HCDR1
12 DINPKDGDSGYSHKFKG 22F1/Hu22F1-Ha/ Hu22F1-Hb/ Hu22F1-Hc/ Hu22F1-Hd HCDR2
13 GFTTVVARGDY 22F1/Hu22F1-Ha/ Hu22F1-Hb/ Hu22F1-Hc/ Hu22F1-Hd HCDR3
14 KSSQSLLDSDGKTYLN 22F1/Hu22F1-La/ Hu22F1-Lb LCDR1
15 LVSKLDS 22F1/Hu22F1-La/ Hu22F1-Lb LCDR2
16 WQGTHFPYT 22F1/Hu22F1-La/ Hu22F1-Lb LCDR3
17 EAQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYYMNWLKQSHGKSLEWIGDINPKDGDSGYSHKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTLTVSS 22F1 VH
18 DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGFPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK 22F1 VL
19 GAGGCCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACTCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGCTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAAAGATGGTGATAGTGGTTACAGCCATAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGCGGATTTACCACGGTAGTAGCTAGGGGGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA 22F1 VHnu
20 GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATTTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGATTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA 22F1 VLnu
21 DDYMH 69H5 HCDR1
22 WIDPENGDTEYASKFQG 69H5 HCDR2
23 WATVPDFDY 69H5 HCDR3
24 KSSQSLLNRSNQKNYLA 69H5 LCDR1
25 FTSTRES 69H5 LCDR2
26 QQHYSTPFT 69H5 LCDR3
27 EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKRRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTTWATVPDFDYWGQGTTLTVSS 69H5 VH
28 DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVHFTSTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISNLQAEDLADYFCQQHYSTPFTFGSGTKLEIK 69H5 VL
29 GAGGTGCAGCTGCAACAGTCCGGCGCTGAACTGGTGAGGCCTGGAGCCTCCGTGAAGCTGTCCTGCACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACGACTACATGCACTGGGTGAAGAGGAGGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTGGATCGACCCCGAGAACGGCGACACCGAGTACGCCTCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCATCACCGCCGACACCTCCTCCAACACCGCCTACCTGCAGCTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCACCACCTGGGCCACCGTGCCCGACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCACCCTGACCGTGTCCAGC 69H5 VHnu
30 GATATCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCTCTCTGGCTATGTCAGTGGGACAGAAAGTGACCATGTCTTGCAAGTCCTCTCAGTCTCTGCTGAACAGGTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAGCTGCTGGTGCATTTTACCTCTACCAGGGAATCCGGAGTGCCAGATAGATTTATCGGCTCTGGCTCCGGCACAGATTTTACACTGACCATCTCCAATCTGCAGGCAGAAGATCTGGCTGACTACTTTTGCCAGCAGCACTACTCCACCCCTTTTACCTTTGGCTCCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 69H5 VLnu
31 DFYMN 56C11 HCDR1
32 DINPNNGGTSYNQKFKG 56C11 HCDR2
33 DPIYYDYDEVAY 56C11 HCDR3
34 RSSQSLVHSNGNTYLH 56C11 LCDR1
35 KVSNRFS 56C11/36F5/42B9/ 67G11 LCDR2
36 SQSTHVPLT 56C11 LCDR3
37 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDFYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSA 56C11 VH
38 DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK 56C11 VL
39 GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCCCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCCTCCGTGAAGATCTCCTGTAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGTCCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAATCCCAACAACGGCGGCACCTCCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACAGTGGACAAGTCCTCCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGGTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACCCCATCTACTACGACTACGACGAGGTGGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCCGCC 56C11 VHnu
40 GATGTGGTGATGACACAGACACCTCTGTCTCTGCCAGTGTCTCTCGGAGATCAGGCTTCTATCTCTTGCAGATCCTCTCAGTCTCTGGTGCATTCCAACGGAAACACCTACCTGCATTGGTACCTGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCAGATAGATTTTCCGGATCTGGATCTGGCACCGATTTTACCCTGAAGATCTCTAGAGTGGAAGCAGAGGATCTGGGAGTGTACTTTTGTAGCCAGTCTACCCACGTGCCTCTGACATTTGGAGCAGGAACAAAGCTGGAGCTGAAG 56C11 VLnu
41 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMAWMRQAPGQGLEWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSS Hu14E3-Ha VH
42 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCTCCGAGCTGAAGAAGCCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCACCTACGGCATGGCCTGGATGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCTGGATCAACACCCTGTCCGGCGAACCCACCTACGCCGACGACTTCAAGGGCAGGTTCGTGTTCTCCCTGGACACCAGCGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCTCCTCCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGCCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGTCCTCC Hu14E3-Ha VHnu
43 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMAWMRQAPGQGLEWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSS Hu14E3-Hb VH
44 CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCTAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACGGCATGGCCTGGATGAGGCAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCAACACCCTGTCCGGCGAGCCTACCTACGCCGACGACTTCAAGGGCAGGTTCGCCTTCTCCCTGGACACCTCCGTGAGCACCGCCTACCTGCAGATCTCCAGCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGCCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGTCCAGC Hu14E3-Hb VHnu
45 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGSTFTTYGMAWMKQAPGQGLTWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSS Hu14E3-Hc VH
46 CAGATCCAGCTGGTGCAGTCCGGCAGCGAGCTCAAGAAGCCCGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTCCACCTTCACCACATACGGCATGGCCTGGATGAAGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGACCTGGATGGGATGGATCAACACCCTGTCCGGCGAGCCTACCTACGCCGATGACTTCAAGGGCAGGTTCGCCTTCTCCCTGGACACCTCCGTGTCCACCGCTTACCTGCAGATCTCCTCCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGCCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGTCCTCC Hu14E3-Hc VHnu
47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLSWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGAHFPLTFGQGTKLEIK Hu14E3-La VL
48 GATGTGGTGATGACACAGTCTCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGCCAGCTTCTATCTCTTGCAAGTCCTCTCAGTCTCTGCTGGATTCCGACGGAAAGACCTATCTGTCTTGGCTGCAGCAGAGACCAGGACAGTCTCCTAGAAGACTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGATTCTGGAGTGCCAGATAGATTTTCCGGCTCCGGCTCTGGCACAGATTTCACCCTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCAGAAGACGTGGGAGTGTACTATTGTTGGCAGGGAGCTCACTTCCCTCTGACATTTGGACAGGGAACAAAGCTGGAGATCAAG Hu14E3-La VLnu
49 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLSWLQQRPGQSPRRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGAHFPLTFGQGTKLEIK Hu14E3-Lb VL
50 GATGTGGTGATGACACAGTCTCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGCCAGCTTCTATCTCTTGCAAGTCCTCTCAGTCTCTGCTGGATTCCGACGGAAAGACCTATCTGTCTTGGCTGCAGCAGAGACCAGGACAGTCTCCTAGAAGACTGATCTCCCTGGTGTCTAAGCTGGATTCCGGAGTGCCAGATAGATTTTCCGGATCTGGATCTGGCACCGATTTTACCCTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCAGAAGACGTGGGAGTGTACTATTGTTGGCAGGGAGCTCACTTCCCTCTGACATTTGGACAGGGAACAAAGCTGGAGATCAAG Hu14E3-Lb VLnu
51 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPKDGDSGYSHKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTVTVSS Hu22F1-Ha VH
52 CAAGTTCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGATTACTACATGAACTGGGTGAGGCAAGCTCCCGGTCAAGGTCTGGAGTGGATGGGCGACATCAACCCCAAGGACGGCGACTCCGGCTATTCCCACAAGTTCAAGGGTCGTGTGACCATGACCAGGGACACGTCCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGTCCTCTTTAAGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGATTCACCACCGTGGTGGCTAGGGGCGACTATTGGGGCCAAGGTACCACCGTGACAGTGTCCAGC Hu22F1-Ha VHnu
53 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPKDGDSGYSHKFKGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTVTVSS Hu22F1-Hb VH
54 CAAGTTCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGATTACTACATGAACTGGGTGAGGCAAGCTCCCGGTCAAGGTCTGGAGTGGATGGGCGACATCAACCCCAAGGACGGCGACTCCGGCTATTCCCACAAGTTCAAGGGTCGTGTGACCATGACCGTGGACAAGTCCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGTCCTCTTTAAGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGATTCACCACCGTGGTGGCTAGGGGCGACTATTGGGGCCAAGGTACCACCGTGACAGTGTCCAGC Hu22F1-Hb VHnu
55 QAQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPKDGDSGYSHKFKGRVTLTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTVTVSS Hu22F1-Hc VH
56 CAAGCTCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGGCAAGCTCCCGGTCAAGGTCTGGAGTGGATGGGCGACATCAACCCCAAGGACGGCGACAGCGGCTACTCCCACAAGTTCAAGGGTCGTGTGACTTTAACCGTGGACAAGTCCACCTCCACCGTCTACATGGAGCTGAGGTCTTTAAGGTCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGCGGCTTCACCACCGTGGTGGCTCGTGGCGATTACTGGGGACAAGGTACCACCGTGACCGTGTCCTCC Hu22F1-Hc VHnu
57 QAQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMNWLRQAPGQGLEWIGDINPKDGDSGYSHKFKGRATLTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCASGFTTVVARGDYWGQGTTVTVSS Hu22F1-Hd VH
58 CAAGCTCAACTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTTACCGACTACTACATGAACTGGCTGAGGCAAGCTCCCGGTCAAGGTCTGGAGTGGATCGGCGATATCAACCCCAAGGACGGCGACTCCGGCTACAGCCATAAGTTCAAGGGTCGTGCCACTTTAACCGTGGACAAGTCCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGGTCTTTAAGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTCCGGCTTCACCACAGTGGTGGCTCGTGGCGACTATTGGGGCCAAGGTACCACCGTGACCGTGAGCTCC Hu22F1-Hd VHnu
59 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKVEIK Hu22F1-La VL
60 GATGTGGTGATGACACAGTCTCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGCCAGCTTCTATCTCTTGCAAGTCCTCTCAGTCTCTGCTGGATTCCGACGGAAAGACCTACCTGAATTGGCTGCAGCAGAGACCAGGACAGTCTCCTAGAAGACTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGATTCTGGAGTGCCAGATAGATTTTCCGGCTCCGGCTCTGGCACAGATTTCACCCTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCAGAAGACGTGGGAGTGTACTATTGTTGGCAGGGAACCCACTTCCCTTACACATTTGGAGGAGGCACAAAGGTGGAGATCAAG Hu22F1-La VLnu
61 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGFPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKVEIK Hu22F1-Lb VL
62 GATGTGGTGATGACACAGTCTCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGCCAGCTTCTATCTCTTGCAAGTCCTCTCAGTCTCTGCTGGATTCCGACGGAAAGACCTACCTGAATTGGCTGCAGCAGAGACCAGGACAGTCTCCTAGAAGACTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGATTCTGGATTCCCAGATAGATTTTCCGGCTCCGGCTCTGGCACAGATTTCACCCTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCAGAAGACGTGGGAGTGTACTATTGTTGGCAGGGAACCCACTTCCCTTACACATTTGGAGGAGGCACAAAGGTGGAGATCAAG Hu22F1-Lb VLnu
63 NSFYIPRHIRKEEGSFQSCSF BMP-結合環
64 FSYSVPNTFPQSTESLVHCDS DAN的63至83胺基酸
65 MGWSCIILFLVATGVHS 信號肽
66 MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEGKKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD 人類gremlin1(hGREM1)
67 MNRTAYTVGALLLLLGTLLPTAEGKKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPPQPGSRTRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD 小鼠gremlin1(mGREM1)
68 MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEGKKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCFSYSVPNTFPQSTESLVHCDSCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD 嵌合hGREM1
69 KKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD 不具有信號肽的人類Gremlin 1序列
70 KKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPPQPGSRTRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD 不具有信號肽的小鼠Gremlin 1序列
71 MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEG 人類Gremlin 1信號肽
72 MNRTAYTVGALLLLLGTLLPTAEG 小鼠Gremlin 1信號肽
73 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT Hu22F1-Ha/Hb FR1
74 WVRQAPGQGLEWMG Hu22F1-Ha/Hb/Hc FR2 Hu56C11-H0/Ha FR2
75 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAS Hu22F1-Ha FR3
76 WGQGTTVTVSS Hu22F1-Ha/Hb/Hc/Hd FR4
77 QAQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT Hu22F1-Hc/Hd FR1
78 RVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAS Hu22F1-Hb FR3
79 RVTLTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCAS Hu22F1-Hc FR3
80 WLRQAPGQGLEWIG Hu22F1-Hd FR2
81 RATLTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCAS Hu22F1-Hd FR3
82 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT Hu14E3-Ha FR1
83 WMRQAPGQGLEWMG Hu14E3-Ha/Hb FR2
84 RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR Hu14E3-Ha FR3
85 WGQGTMVTVSS Hu14E3-Ha/Hb/Hc FR4
86 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT Hu14E3-Hb FR1
87 RFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR Hu14E3-Hb/Hc FR3
88 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGSTFT Hu14E3-Hc FR1
89 WMKQAPGQGLTWMG Hu14E3-Hc FR2
90 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT Hu56C11-H0/Ha/Hb/Hc FR1
91 RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR Hu56C11-H0 FR3
92 WGQGTLVTVSS Hu56C11-H0/Ha/Hb/Hc FR4
93 RVTMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR Hu56C11-Ha FR3
94 RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR Hu56C11-Hb/Hc FR3
95 WVRQAPGQGLEWIG Hu56C11-Hb FR2
96 WVKQAPGKGLEWIG Hu56C11-Hc FR2
97 Q X 1 QLVQSG X 2 E X 3 KKPGASVKVSCKASG X 4X 5 FT Hu22F1/Hu14E3/ Hu56C11 HFR1
98 W X 6X 7 QAPG X 8 GL X 9 W X 10 G Hu22F1/Hu14E3/ Hu56C11 HFR2
99 R X 11 T X 12 T X 13 D X 14 STSTVYMEL X 15 SLRSEDTAVYYCAS Hu22F1 HFR3
100 WGQGT X 20 VTVSS Hu22F1/Hu14E3/ Hu56C11 HFR4
101 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC Hu22F1-La/Lb FR1 Hu14E3-La/Lb FR1 Hu56C11-L0/La/Lb FR1
102 WLQQRPGQSPRRLIY Hu22F1-La/Lb FR2 Hu14E3-La FR2
103 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC Hu22F1-La FR3 Hu14E3-La/Lb FR3 Hu56C11-L0/La/Lb FR3
104 FGGGTKVEIK Hu22F1-La/Lb FR4
105 GFPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC Hu22F1- Lb FR3
106 FGQGTKLEIK Hu14E3-La/Lb FR4 Hu56C11-L0/La/Lb FR4
107 WLQQRPGQSPRRLIS Hu14E3-Lb FR2
108 WFQQRPGQSPRRLIY Hu56C11-L0 FR2
109 WFQQRPGQSPRLLIY Hu56C11-La FR2
110 WYQQRPGQSPRLLIY Hu56C11-Lb FR2
111 W X 21 QQRPGQSPR X 22 LI X 23 Hu22F1/Hu14E3/ Hu56C11-LFR2
112 G X 24 PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC Hu22F1/Hu14E3/ Hu56C11-LFR3
113 FG X 25 GTK X 26 EIK Hu22F1/Hu14E3/ Hu56C11-LFR4
114 SSGIG 36F5 HCDR1
115 EIYPRSGNTYNNEKFKG 36F5/42B9/67G11 HCDR2
116 EAYSHHYYAMDY 36F5 HCDR3
117 RSSQSLLHSNGNTYLE 36F5 LCDR1
118 FQGSHVPFT 36F5/42B9/67G11 LCDR3
119 SYGIG 42B9/67G11 HCDR1
120 EGYSNNYYAMDY 42B9/67G11 HCDR3
121 ISSQSLVHSNGNTYLE 42B9 LCDR1
122 RSSQSLVHSNGNTYLE 67G11 LCDR1
123 S X 32 GIG 36F5/42B9/67G11 HCDR1
124 E X 27 YS X 28X 29 YYAMDY 36F5/42B9/67G11 HCDR3
125 X 30 SSQSL X 31 HSNGNTYLE 36F5/42B9/67G11 LCDR1
126 QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYSFTSSGIGWVKQRSGQGLEWIGEIYPRSGNTYNNEKFKGKATLTADKSSSTVYMELRSLTSEDSAVYFCVREAYSHHYYAMDYWGQGTSVTVFS 36F5 VH
127 DVLMTQTPLSLPVSLGGQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRLSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIN 36F5 VL
128 QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGIGWVKQRTGQGLEWIGEIYPRSGNTYNNEKFKGKATLTADKSSRTVYMELRSLISEDSAVYFCAREGYSNNYYAMDYWGQGTSVTVFS 42B9/67G11 VH
129 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCISSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGLSPKLLIYKVSNRFSGVPDRLSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK 42B9 VL
130 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRLSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK 67G11 VL
131 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTSYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSS Hu56C11-H0 VH
132 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMNWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTSYNQKFKGRVTMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSS Hu56C11-Ha VH
133 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMNWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSS Hu56C11-Hb VH
134 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMNWVKQAPGKGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDPIYYDYDEVAYWGQGTLVTVSS Hu56C11-Hc VH
135 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKLEIK Hu56C11-L0 VL
136 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKLEIK Hu56C11-La VL
137 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKLEIK Hu56C11-Lb VL
138 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 人類IgG1重鏈恆定區
139 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 人類κ輕鏈恆定區
140 RF X 16 FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR Hu14E3 HFR3
141 RVT X 17 T X 18 D X 19 SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR Hu56C11 HFR3
142 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACTCCTTCACAAGCTCTGGTATAGGCTGGGTGAAGCAGAGATCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGAAGTGGTAATACTTACAACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGTGTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTTTGTGTAAGAGAGGCCTATAGTCACCATTACTATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTTCTCA 36F5 VHnu
143 GATGTTTTGATGACCCAAACTCCTCTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGGTCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTCTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGCTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAT 36F5 VLnu
144 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAGGCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGAAGTGGTAATACTTACAACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGAACAGTGTACATGGAGCTCCGCAGTCTGATATCTGAGGACTCTGCGGTCTACTTTTGTGCAAGAGAGGGCTATAGTAACAATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTTCTCA 42B9 VHnu
145 GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCATATCTAGTCAGAGCCTTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCTGTCTCCAAAACTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGCTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAGGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA 42B9 VLnu
146 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGTTATGGTATAGGCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGAAGTGGTAATACTTACAACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCGGACAAATCCTCCAGAACAGTGTACATGGAGCTCCGCAGTCTGATATCTGAGGACTCTGCGGTCTACTTTTGTGCAAGAGAGGGCTATAGTAACAATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTTCTCA 67G11 VHnu
147 GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGCTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA 67G11 VLnu
148 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYVFTDYYMNWVRQAPGQSLEWMGDINPNNAETLYNHKFKGRVTVTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCVKWGDGPFAYWGQGTLVTVSS AM4B6_VH
149 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYSVSDRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQYSNYPTFGQGTKLEIK AM4B6_VL
150 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIQPNSGGTKYNEKFKKKATLTVDKSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCARGAGTVDYFDYWGQGSTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 23F11重鏈(HC)
151 DIVLTQSPASLAVSVGQRATITCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEAQDTATYYCQQSTEDPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 23F11輕鏈(LC)
圖1分別顯示抗gremlin1抗體69H5、56C11、22F1及14E3與人類gremlin1(hGREM1)(圖1A、圖1C)及小鼠gremlin1(圖1B、圖1C)之結合，以及抗gremlin1抗體42B9、36F5及67G11與人類gremlin1(hGREM1)(圖1D、圖1F)及小鼠gremlin1(圖1E、圖1F)之結合，如藉由ELISA所量測。
圖2顯示相對於gremlin-2、COCO及DAN-hFc，抗gremlin1抗體14E3與gremlin-1之結合特異性，如藉由ELISA所量測。
圖3顯示gremlin1或XM5(gremlin 1-Dan融合蛋白)與BMP2/4/7之結合親和力(圖3A、圖3D)、抗gremlin1抗體69H5、56C11、14E3或基準抗體6245P對gremlin1與BMP2(圖3B)或BMP4(圖3C)之結合的阻斷活性，以及抗gremlin1抗體42B9、36F5、67G11及14E3 HaLa或基準抗體6245P對gremlin1與BMP2(圖3E、圖3H)或BMP4(圖3F、圖3H)或BMP7(圖3G、圖3H)之結合的阻斷活性，如藉由ELISA所量測。
圖4顯示抗gremlin1抗體69H5、56C11、22F1、14E3及基準抗體6245P阻斷gremlin介導之對BMP4信號傳導的抑制，如藉由BMP誘導的報道子分析所量測。
圖5顯示相對於基準抗體6245P，抗gremlin1抗體14E3(圖5A)、22F1(圖5B)、56C11(圖5C)及69H5(圖5D)阻斷gremlin介導之對BMP4信號傳導的抑制，如藉由BMP4誘導的ATDC-5細胞分化所量測。
圖6顯示gremlin1降低***癌細胞(PC-3細胞)中BMP 4誘導的smad磷酸化的水準(圖6A)，此藉由***癌細胞中的抗gremlin1抗體14E3、22F1、56C11及69H5恢復(圖6B)，如藉由蛋白質印跡(western blot)所量測。
圖7顯示在癌細胞及非癌細胞上抗gremlin1抗體14E3阻斷gremlin介導之對BMP4信號傳導的抑制。
圖8顯示如藉由ELISA所量測的嵌合抗gremlin1抗體56C11-C及14E3-C與hGREM1之結合親和力。
圖9顯示如藉由Biacore所量測的嵌合抗gremlin1抗體14E3-C及22F1-C與hGREM1之結合動力學。
圖10顯示來自抗原決定基研究的結果，其中圖10A至圖10C顯示如藉由競爭ELISA分析所量測的抗gremlin1抗體14E3、22F1、56C11及69H5的抗原決定基分組(epitope binning)結果(圖10A)、抗體14E3-C、22F1-C及基準抗體6245P的交叉競爭分析結果(圖10B)以及如藉由ELISA所量測的抗體14E3-C及基準抗體6245P與gremlin-DAN融合蛋白XM5之結合(圖10C)，且圖10D顯示如藉由生物膜干涉法(Biolayer Interferometry；BLI)分析所量測的14E3的抗原決定基定位，且圖10E及圖10F顯示如藉由ELISA所量測的抗體42B9、36F5及67G11與人類gremlin或gremlin-DAN融合蛋白XM5之結合。
圖11A及圖11B顯示如藉由Fortebio所量測的本文所提供的抗gremlin1抗體14E3、56C11、22F1、69H5及基準抗體6245P的抗原決定基分析結果。結果顯示相比於6245P的抗原決定基，14E3具有完全不重疊的抗原決定基，而56C11共有與6245P的抗原決定基類似的抗原決定基。
圖12顯示與基準抗體6245P相比，如藉由ELISA(圖12A至圖12C)或Fortebio(圖12D)所量測的人源化抗hGREM 1抗體14E3及22F1與hGREM1之結合親和力。
圖13顯示抗GREM1抗體14E3降低PC3異種移植模型中***癌的腫瘤體積(圖13A)及腫瘤重量(圖13B)。
圖14顯示抗GREM 1抗體56C11在CT-26結腸癌模型中的抗腫瘤作用。
圖15A及圖15B顯示具有抗mGREM1抗體及免疫檢查點抑制劑(例如，MPDL-3280A)的組合療法在CT-26模型中的協同抗腫瘤作用。
圖16顯示利用抗GREM1抗體(14E3)或抗PD-L1抗體(22C3)對E7 PDX腫瘤樣品中的GREM1或PD-L1的IHC染色。
圖17A及圖17B顯示單獨或與順鉑組合的人源化14E3(hzd 14E3)抑制gremlin陽性食道PDX模型中的腫瘤生長。單獨的人源化14E3達成約43%腫瘤生長抑制(TGI)。單獨的順鉑達成約60% TGI。人源化14E3及順鉑的組合達成約64% TGI。
圖18顯示Gremlin與FGFR1之結合(圖18A)，以及gremlin分別與huIgG1、hIgG4、抗gremlin1抗體42B9、36F5、67G11、69H5-chi、36F5-chi、22F1-chi、56C11-chi及14E3 HaLa以及基準抗體6245P之結合的阻斷活性(圖18B、圖18C)，如藉由ELISA所量測。
圖19顯示雜交瘤36F5(圖19A)及嵌合36F5(36F5-chi)(圖19B)與Gremlin-his及DAN-his的ELISA結合活性。
圖20顯示嵌合36F5(36F5-chi)阻斷BMP4與DAN蛋白質之結合(圖20A)及BMP2與DAN蛋白質之結合(圖20B)。
圖21顯示雜交瘤36F5在EMT6/hPD-L1腫瘤模型中的抗腫瘤活性。圖21A顯示EMT6/hPD-L1腫瘤模型對抗PD-L1抗體AM4B6具有不良反應性。圖21B顯示雜交瘤36F5在EMT6/hPD-L1腫瘤模型中展現出抗腫瘤活性。
圖22顯示雜交瘤14E3或36F5在E7腫瘤模型中的抗腫瘤活性。圖22A顯示E7腫瘤模型對抗PD-L1抗體納武單抗(Nivolumab)具有不良反應性，且雜交瘤14E3在E7腫瘤模型中展現出抗腫瘤活性。圖22B顯示E7腫瘤模型對抗PD-L1抗體納武單抗具有不良反應性，且雜交瘤36F5在E7腫瘤模型中展現出抗腫瘤活性。
圖23顯示具有抗PDL1抗體的56C11組合療法在MC38/hPD-L1腫瘤模型中的抗腫瘤活性。
 

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          Ala Ser Gly Phe Thr Thr Val Val Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Phe Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  360]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          gaggcccagc tgcaacaatc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata       60
          tcctgtaagg cttctggata ctcgttcact gactactaca tgaactggct gaagcagagc      120
          catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta aagatggtga tagtggttac      180
          agccataagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac      240
          atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagcggattt      300
          accacggtag tagctagggg ggactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca      360
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  336]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc       60
          atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg      120
          ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atttggtgtc taaactggac      180
          tctggattcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc      240
          agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg      300
          tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa                                336
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Asp Asp Tyr Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Trp Ala Thr Val Pro Asp Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met His Trp Val Lys Arg Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Thr Trp Ala Thr Val Pro Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Pro Lys Leu Leu Val His Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Asn Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  354]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          gaggtgcagc tgcaacagtc cggcgctgaa ctggtgaggc ctggagcctc cgtgaagctg       60
          tcctgcaccg ccagcggctt caacatcaag gacgactaca tgcactgggt gaagaggagg      120
          cctgagcagg gcctggagtg gatcggctgg atcgaccccg agaacggcga caccgagtac      180
          gcctccaagt tccagggcaa ggccaccatc accgccgaca cctcctccaa caccgcctac      240
          ctgcagctga gctccctgac ctccgaggac accgccgtgt actattgcac cacctgggcc      300
          accgtgcccg acttcgacta ctggggacag ggcaccaccc tgaccgtgtc cagc            354
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  339]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          gatatcgtga tgacccagtc tccttcctct ctggctatgt cagtgggaca gaaagtgacc       60
          atgtcttgca agtcctctca gtctctgctg aacaggtcca accagaagaa ctacctggct      120
          tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aagctgctgg tgcattttac ctctaccagg      180
          gaatccggag tgccagatag atttatcggc tctggctccg gcacagattt tacactgacc      240
          atctccaatc tgcaggcaga agatctggct gactactttt gccagcagca ctactccacc      300
          ccttttacct ttggctccgg caccaagctg gagatcaag                             339
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Asp Phe Tyr Met Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  363]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          gaggtgcagc tgcagcagtc cggccctgag ctggtgaagc ctggagcctc cgtgaagatc       60
          tcctgtaagg cctccggcta caccttcacc gacttctaca tgaactgggt gaagcagtcc      120
          cacggcaagt ccctggagtg gatcggcgac atcaatccca acaacggcgg cacctcctac      180
          aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagtggaca agtcctccag caccgcctac      240
          atggagctga ggtccctgac ctccgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagggacccc      300
          atctactacg actacgacga ggtggcctac tggggccagg gaaccctggt gacagtgtcc      360
          gcc                                                                    363
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  336]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          gatgtggtga tgacacagac acctctgtct ctgccagtgt ctctcggaga tcaggcttct       60
          atctcttgca gatcctctca gtctctggtg cattccaacg gaaacaccta cctgcattgg      120
          tacctgcaga aaccaggaca gtctcctaag ctgctgatct acaaggtgtc caacaggttc      180
          tccggagtgc cagatagatt ttccggatct ggatctggca ccgattttac cctgaagatc      240
          tctagagtgg aagcagagga tctgggagtg tacttttgta gccagtctac ccacgtgcct      300
          ctgacatttg gagcaggaac aaagctggag ctgaag                                336
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Ala Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Leu Ser Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser 
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  342]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          caggtgcagc tggtgcagtc cggctccgag ctgaagaagc ctggcgcctc cgtgaaggtg       60
          tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc acctacggca tggcctggat gaggcaggct      120
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          gccgacgact tcaagggcag gttcgtgttc tccctggaca ccagcgtgtc caccgcctac      240
          ctgcagatct cctccctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagccc      300
          atggactact ggggccaggg caccatggtg accgtgtcct cc                         342
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Ala Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Leu Ser Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser 
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  342]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          cagatccagc tggtgcagag cggcagcgag ctgaagaagc ccggcgctag cgtgaaggtg       60
          tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc acctacggca tggcctggat gaggcaggct      120
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          gccgacgact tcaagggcag gttcgccttc tccctggaca cctccgtgag caccgcctac      240
          ctgcagatct ccagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagcct      300
          atggactact ggggccaggg caccatggtg accgtgtcca gc                         342
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Ala Trp Met Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Thr Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Leu Ser Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
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                      100                 105                 110         
          Ser Ser 
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  342]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          cagatccagc tggtgcagtc cggcagcgag ctcaagaagc ccggagccag cgtgaaggtg       60
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          atggactact ggggccaggg caccatggtg accgtgtcct cc                         342
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          gatgtggtga tgacacagtc tcctctgtct ctgccagtga cactgggaca gccagcttct       60
          atctcttgca agtcctctca gtctctgctg gattccgacg gaaagaccta tctgtcttgg      120
          ctgcagcaga gaccaggaca gtctcctaga agactgatct acctggtgtc caagctggat      180
          tctggagtgc cagatagatt ttccggctcc ggctctggca cagatttcac cctgaagatc      240
          tctagagtgg aggcagaaga cgtgggagtg tactattgtt ggcagggagc tcacttccct      300
          ctgacatttg gacagggaac aaagctggag atcaag                                336
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          Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
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          gatgtggtga tgacacagtc tcctctgtct ctgccagtga cactgggaca gccagcttct       60
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          tctagagtgg aggcagaaga cgtgggagtg tactattgtt ggcagggagc tcacttccct      300
          ctgacatttg gacagggaac aaagctggag atcaag                                336
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asp Gly Asp Ser Gly Tyr Ser His Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Gly Phe Thr Thr Val Val Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
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          Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asp Gly Asp Ser Gly Tyr Ser His Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 
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          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Gly Phe Thr Thr Val Val Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asp Gly Asp Ser Gly Tyr Ser His Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 
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          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
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          Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 
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          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          gatgtggtga tgacacagtc tcctctgtct ctgccagtga cactgggaca gccagcttct       60
          atctcttgca agtcctctca gtctctgctg gattccgacg gaaagaccta cctgaattgg      120
          ctgcagcaga gaccaggaca gtctcctaga agactgatct acctggtgtc caagctggat      180
          tctggagtgc cagatagatt ttccggctcc ggctctggca cagatttcac cctgaagatc      240
          tctagagtgg aggcagaaga cgtgggagtg tactattgtt ggcagggaac ccacttccct      300
          tacacatttg gaggaggcac aaaggtggag atcaag                                336
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Phe Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  336]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          gatgtggtga tgacacagtc tcctctgtct ctgccagtga cactgggaca gccagcttct       60
          atctcttgca agtcctctca gtctctgctg gattccgacg gaaagaccta cctgaattgg      120
          ctgcagcaga gaccaggaca gtctcctaga agactgatct acctggtgtc caagctggat      180
          tctggattcc cagatagatt ttccggctcc ggctctggca cagatttcac cctgaagatc      240
          tctagagtgg aggcagaaga cgtgggagtg tactattgtt ggcagggaac ccacttccct      300
          tacacatttg gaggaggcac aaaggtggag atcaag                                336
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ser Cys Ser Phe 
                      20      
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  黑猩猩]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Phe Ser Tyr Ser Val Pro Asn Thr Phe Pro Gln Ser Thr Glu Ser Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val His Cys Asp Ser 
                      20      
          <![CDATA[<210>  65]]>
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          Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Gly Val His 
          1               5                   10                  15      
          Ser 
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  184]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala 
                      20                  25                  30          
          Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg 
              50                  55                  60                  
          Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr 
                          85                  90                  95      
          Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr 
                      100                 105                 110         
          Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro 
                  115                 120                 125             
          Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys 
              130                 135                 140                 
          Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys 
                          165                 170                 175     
          Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp 
                      180                 
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          <![CDATA[<400>  67]]>
          Met Asn Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Leu Pro Thr Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala 
                      20                  25                  30          
          Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Pro Pro Gln Pro Gly Ser Arg Thr Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg 
              50                  55                  60                  
          Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr 
                          85                  90                  95      
          Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr 
                      100                 105                 110         
          Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro 
                  115                 120                 125             
          Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys 
              130                 135                 140                 
          Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys 
                          165                 170                 175     
          Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp 
                      180                 
          <![CDATA[<210>  68]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala 
                      20                  25                  30          
          Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg 
              50                  55                  60                  
          Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr 
                          85                  90                  95      
          Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr 
                      100                 105                 110         
          Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Phe Ser Tyr Ser Val Pro 
                  115                 120                 125             
          Asn Thr Phe Pro Gln Ser Thr Glu Ser Leu Val His Cys Asp Ser Cys 
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          Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys 
                          165                 170                 175     
          Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp 
                      180                 
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          <![CDATA[<400>  69]]>
          Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln 
          1               5                   10                  15      
          His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg 
                      20                  25                  30          
          Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu 
                  35                  40                  45              
          Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly 
                          85                  90                  95      
          Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly 
                      100                 105                 110         
          Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met 
                  115                 120                 125             
          Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp 
          145                 150                 155                 160 
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          <![CDATA[<400>  70]]>
          Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln 
          1               5                   10                  15      
          His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln Ser Pro Pro Gln Pro Gly Ser Arg 
                      20                  25                  30          
          Thr Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu 
                  35                  40                  45              
          Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly 
                          85                  90                  95      
          Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly 
                      100                 105                 110         
          Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met 
                  115                 120                 125             
          Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly 
                      20                  
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小家鼠]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Met Asn Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Leu Pro Thr Ala Glu Gly 
                      20                  
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          Gln Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  83]]>
          Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Trp Met Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Thr Trp Met Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  90]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  95]]>
          Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  96]]>
          Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Val、Ile或Ala。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (9)..(9)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Ala或Ser。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (11)..(11)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Val或Leu。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (27)..(28)]]>
          <![CDATA[<223>  位置27處之Xaa為Tyr或Ser，且位置28處之Xaa為Thr或Ser。 ]]>
          <![CDATA[<400>  97]]>
          Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Xaa Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  位置2處之Xaa為Val、Leu或Met，且位置3處之Xaa為Arg或Lys。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222>  (11)..(11)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Glu或Thr。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (13)..(13)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Met或Ile。]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          Trp Xaa Xaa Gln Ala Pro Gly Xaa Gly Leu Xaa Trp Xaa Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  99]]>
          Arg Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Xaa Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  100]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Thr、Met或Leu。]]>
          <![CDATA[<400>  100]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  101]]>
          Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 
                      20              
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 
          1               5                   10                  15  
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          <![CDATA[<400>  110]]>
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          Trp Xaa Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Xaa Leu Ile Xaa 
          1               5                   10                  15  
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          <![CDATA[<400>  112]]>
          Gly Xaa Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Gly或Gln。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Val或Leu。]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
          Ser Ser Gly Ile Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Glu Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
          Glu Ala Tyr Ser His His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  117]]>
          Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  118]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  118]]>
          Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  119]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  119]]>
          Ser Tyr Gly Ile Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  120]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  120]]>
          Glu Gly Tyr Ser Asn Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  121]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  121]]>
          Ile Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  122]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  122]]>
          Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Ser或Tyr。]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
          Ser Xaa Gly Ile Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  124]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Ala或Gly。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  位置5處之Xaa為His或Asn，且位置6處之Xaa為His或Asn。]]>
          <![CDATA[<400>  124]]>
          Glu Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  125]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Arg或Ile。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Leu或Val。]]>
          <![CDATA[<400>  125]]>
          Xaa Ser Ser Gln Ser Leu Xaa His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  126]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Val Arg Glu Ala Tyr Ser His His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Phe Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  127]]>
          Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Arg Ser Leu Ile Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Asn Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Phe Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  129]]>
          Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Ile Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Leu Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  130]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  130]]>
          Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  131]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  131]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  132]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  132]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  133]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  133]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  134]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  134]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  135]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  135]]>
          Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  136]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  136]]>
          Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  137]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  137]]>
          Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  138]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  138]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  139]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  139]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  140]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Val或Ala。]]>
          <![CDATA[<400>  140]]>
          Arg Phe Xaa Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  141]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Met或Leu。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Arg或Val。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Thr或Lys。]]>
          <![CDATA[<400>  141]]>
          Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210>  142]]>
          <![CDATA[<211>  363]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  142]]>
          caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg       60
          tcctgcaagg cttctggcta ctccttcaca agctctggta taggctgggt gaagcagaga      120
          tctggacagg gccttgagtg gattggagag atttatccta gaagtggtaa tacttacaac      180
          aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagtgtac      240
          atggaactcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttttgtgt aagagaggcc      300
          tatagtcacc attactatgc tatggactat tggggtcaag gaacctcagt caccgtcttc      360
          tca                                                                    363
          <![CDATA[<210>  143]]>
          <![CDATA[<211>  336]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  143]]>
          gatgttttga tgacccaaac tcctctctcc ctgcctgtca gtcttggagg tcaagcctcc       60
          atctcttgca gatctagtca gagccttcta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg      120
          tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt      180
          tctggggtcc cagacaggct cagtggcagt ggatcaggga cagattttac actcaagatc      240
          agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca      300
          ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaat                                336
          <![CDATA[<210>  144]]>
          <![CDATA[<211>  363]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  144]]>
          caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg       60
          tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca agctatggta taggctgggt gaagcagaga      120
          actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatccta gaagtggtaa tacttacaac      180
          aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag aacagtgtac      240
          atggagctcc gcagtctgat atctgaggac tctgcggtct acttttgtgc aagagagggc      300
          tatagtaaca attactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtcttc      360
          tca                                                                    363
          <![CDATA[<210>  145]]>
          <![CDATA[<211>  336]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  145]]>
          gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc       60
          atctcttgca tatctagtca gagccttgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg      120
          tacctgcaga aaccaggcct gtctccaaaa ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt      180
          tctggggtcc cagacaggct cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaggatc      240
          agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca      300
          ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa                                336
          <![CDATA[<210>  146]]>
          <![CDATA[<211>  363]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  146]]>
          caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg       60
          tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca agttatggta taggctgggt gaagcagaga      120
          actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatccta gaagtggtaa tacttacaac      180
          aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcggaca aatcctccag aacagtgtac      240
          atggagctcc gcagtctgat atctgaggac tctgcggtct acttttgtgc aagagagggc      300
          tatagtaaca attactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtcttc      360
          tca                                                                    363
          <![CDATA[<210>  147]]>
          <![CDATA[<211>  336]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  147]]>
          gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc       60
          atctcttgca gatctagtca gagccttgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg      120
          tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt      180
          tctggggtcc cagacaggct cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc      240
          agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca      300
          ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa                                336
          <![CDATA[<210>  148]]>
          <![CDATA[<211>  117]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  148]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Ala Glu Thr Leu Tyr Asn His Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Val Lys Trp Gly Asp Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser 
                  115         
          <![CDATA[<210>  149]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  149]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ala Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Val Ser Asp Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  150]]>
          <![CDATA[<211>  449]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  150]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Met Ile Gln Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Ala Gly Thr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 
                  115                 120                 125             
          Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
                          245                 250                 255     
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val 
              290                 295                 300                 
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
              370                 375                 380                 
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 
                          405                 410                 415     
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
                      420                 425                 430         
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
                  435                 440                 445             
          Lys 
          <![CDATA[<210>  151]]>
          <![CDATA[<211>  218]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  151]]>
          Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Glu Ala Gln Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 
              130                 135                 140                 
          Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 
                  195                 200                 205             
          Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079

Claims (63)

  1. 一種抗人類gremlin1(hGREM1)的分離抗體或其抗原結合片段，其具有以下特徵中的至少一者： a)相對於非癌細胞，能夠選擇性地降低癌細胞中hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制； b)在非癌細胞中展現hGREM1介導之對BMP信號傳導的抑制降低不超過50%； c)能夠與包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的嵌合hGREM1結合； d)能夠與hGREM1結合而非與小鼠gremlin1特異性結合，或替代地對小鼠gremlin1具有交叉反應性； e)在包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的抗原決定基處與hGREM1結合，其中殘基編號係根據SEQ ID NO: 69，或與包含殘基Gln27及/或殘基Asn33的hGREM1片段結合，視情況上述hGREM1片段具有至少3個(例如，4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸殘基的長度； f)能夠以如藉由Fortebio所量測的不超過1 nM的K D與hGREM1結合； h)能夠以如藉由ELISA所量測的大於50%的最大阻斷百分比阻斷hGREM1與BMP7之結合； i)能夠阻斷GREM1與FGFR之相互作用；及/或 j)能夠與hGREM1及DAN兩者結合。
  2. 如請求項1之抗hGREM1的分離抗體或其抗原結合片段，其中上述抗原決定基為線性抗原決定基或構型抗原決定基。
  3. 一種抗人類gremlin1(hGREM1)的分離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變(VH)區及/或輕鏈可變(VL)區，其中上述重鏈可變區包含： a)HCDR1，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 1、11、21、31、114、119及123， b)HCDR2，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 2、12、22、32及115，及 c)HCDR3，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 3、13、23、33、116、120及124，及/或 其中上述輕鏈可變區包含： d)LCDR1，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 4、14、24、34、117、121、122及125， e)LCDR2，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 5、15、25及35，及 f)LCDR3，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 6、16、26、36及118。
  4. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中上述重鏈可變區選自由以下組成之群： a)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 2的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 3的序列的HCDR3； b)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 12的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 13的序列的HCDR3； c)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 22的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 23的序列的HCDR3； d)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 32的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 33的序列的HCDR3； e)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 116的序列的HCDR3；及 f)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；及 g)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 124的序列的HCDR3。
  5. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中上述輕鏈可變區選自由以下組成之群： a)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 5的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 6的序列的LCDR3； b)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 15的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 16的序列的LCDR3； c)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 25的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 26的序列的LCDR3； d)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 36的序列的LCDR3； e)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； f)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； i)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3；及 j)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3。
  6. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中： a)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 2的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 3的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 5的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 6的序列的LCDR3； b)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 12的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 13的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 15的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 16的序列的LCDR3； c)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 22的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 23的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 25的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 26的序列的LCDR3； d)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 32的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 33的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 36的序列的LCDR3； e)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 116的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； f)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； g)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； h)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 124的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； i)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 116的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3； j)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3；或 k)上述重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO: 115的序列的HCDR2及包含SEQ ID NO: 120的序列的HCDR3；且上述輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO: 35的序列的LCDR2及包含SEQ ID NO: 118的序列的LCDR3。
  7. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中上述重鏈可變區包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 134，及與其具有至少80%序列一致性但仍保持與gremlin的特定結合特異性或親和力的同源序列。
  8. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中上述輕鏈可變區包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136及SEQ ID NO: 137，及與其具有至少80%序列一致性但仍保持與gremlin的特定結合特異性或親和力的同源序列。
  9. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含： a)包含SEQ ID NO: 7的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 8的序列的輕鏈可變區；或 b)包含SEQ ID NO: 17的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 18的序列的輕鏈可變區；或 c)包含SEQ ID NO: 27的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 28的序列的輕鏈可變區；或 d)包含SEQ ID NO: 37的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 38的序列的輕鏈可變區；或 e)包含SEQ ID NO: 126的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 127的序列的輕鏈可變區；或 f)包含SEQ ID NO: 128的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 129的序列的輕鏈可變區；或 g)包含SEQ ID NO: 128的序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 130的序列的輕鏈可變區；或 h)包含選自由SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43及SEQ ID NO: 45組成之群的序列的重鏈可變區，及包含選自由SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 49組成之群的序列的輕鏈可變區；或 i)選自由以下組成之群的一對重鏈可變區及輕鏈可變區序列：SEQ ID NO: 41/47、41/49、43/47、43/49、45/47及45/49；或 j)包含選自由SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55及SEQ ID NO: 57組成之群的序列的重鏈可變區，及包含選自由SEQ ID NO: 59及SEQ ID NO: 61組成之群的序列的輕鏈可變區；或 k)選自由以下組成之群的一對重鏈可變區及輕鏈可變區序列：SEQ ID NO: 51/59、51/61、53/59、53/61、55/59、55/61、57/59及57/61；或 l)包含選自由SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 134組成之群的序列的重鏈可變區，及包含選自由SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136及SEQ ID NO: 137組成之群的序列的輕鏈可變區；或 m)選自由以下組成之群的一對重鏈可變區及輕鏈可變區序列：SEQ ID NO: 131/135、131/136、131/137、132/135、132/136、132/137、133/135、133/136、133/137、134/135、134/136及134/137。
  10. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其進一步包含一或多個胺基酸殘基取代或修飾，但仍保持與hGREM1的特定結合特異性或親和力。
  11. 如請求項10之抗體或其抗原結合片段，其中上述取代或修飾中的至少一者在上述VH或VL序列的一或多個CDR序列中，及/或在一或多個非CDR區中。
  12. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其進一步包含免疫球蛋白恆定區，視情況人類IgG的恆定區。
  13. 如請求項12之抗體或其抗原結合片段，其中上述恆定區包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區，且視情況上述恆定區包括包含SEQ ID NO: 138的序列的重鏈恆定區及/或包含SEQ ID NO: 139的序列的輕鏈恆定區。
  14. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其為人源化的或嵌合的。
  15. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其為雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv) 2、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單結構域抗體、奈米抗體、結構域抗體及二價結構域抗體。
  16. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其為雙特異性的。
  17. 如請求項16之抗體或其抗原結合片段，其能夠與gremlin的第一及第二抗原決定基特異性結合，或能夠與hGREM1及第二抗原兩者特異性結合。
  18. 如請求項17之抗體或其抗原結合片段，其中上述第二抗原包含免疫相關標靶。
  19. 如請求項18之抗體或其抗原結合片段，其中上述第二抗原包含PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGF β、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16或CD83。
  20. 如請求項17之抗體或其抗原結合片段，其中上述第二抗原包含腫瘤抗原。
  21. 如請求項20之抗體或其抗原結合片段，其中上述腫瘤抗原包含腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原。
  22. 如請求項20之抗體或其抗原結合片段，其中上述腫瘤抗原包含***特異性抗原(PSA)、CA-125、神經節苷脂G(D2)、G(M2)及G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、鈴蟾素樣肽、HER2/neu、表皮生長因子受體(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相關黏蛋白、VEGF、VEGFR(例如，VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)、***受體、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受體、EGFα、c-Kit受體、轉鐵蛋白受體、緊密連接蛋白18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、間皮素、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
  23. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其對小鼠gremlin1不具有交叉反應性。
  24. 如請求項1至22中任一項之抗體或其抗原結合片段，其對小鼠gremlin1具有交叉反應性。
  25. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其與一或多個結合部分連接。
  26. 如請求項25之抗體或其抗原結合片段，其中上述結合部分包含清除調節劑(clearance-modifying agent)、化學治療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記、酶-受質標記、DNA烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑或其他抗癌藥物，例如雄激素受體抑制劑。
  27. 一種抗體或其抗原結合片段，其與如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段競爭結合於hGREM1。
  28. 一種醫藥組合物或套組，其包含如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，及醫藥學上可接受之載劑。
  29. 如請求項28之醫藥組合物或套組，其進一步包含第二治療劑。
  30. 一種分離的聚核苷酸，其編碼如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  31. 一種載劑，其包含如請求項30之分離的聚核苷酸。
  32. 一種宿主細胞，其包含如請求項31之載劑。
  33. 一種表現如請求項1至27中任一項之抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在表現如請求項31之載劑的條件下培養如請求項32之宿主細胞。
  34. 一種治療個體的GREM1相關疾病或病狀的方法，或一種抑制有需要之個體的FGFR1活化的方法，或一種治療由GREM1介導之與FGFR1活化相關的疾病或病狀的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的如請求項1至27中任一項之抗體或其抗原結合片段，或如請求項28至29中任一項之醫藥組合物。
  35. 如請求項34之方法，其中上述GREM1相關疾病或病狀選自由以下組成之群：癌症、纖維化疾病、血管生成、青光眼或視網膜疾病、腎病、肺動脈高血壓或骨關節炎(OA)，或上述GREM1相關疾病或病狀與GREM1的含量增加相關，其選自由以下組成之群：硬皮病、特發性肺纖維化、糖尿病性腎病變、IgAN、狼瘡腎炎、奧爾波特徵候群、神經膠質瘤、頭頸癌、***癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、膀胱癌、乳癌及結腸直腸癌。
  36. 如請求項35之方法，其中上述癌症為表現GREM1的癌症，視情況為表現PD-L1的癌症或不為表現PD-L1的癌症，且進一步視情況對用PD-1/PD-L1軸抑制劑的治療具有抗性或難治性。
  37. 如請求項34之方法，其中上述個體鑑別為具有表現GREM1的癌細胞，或在癌症微環境中具有GREM1表現。
  38. 如請求項34至37中任一項之方法，其中上述癌症為實體腫瘤或血液癌。
  39. 如請求項38之方法，其中上述癌症為***癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌)、肝癌、胰腺癌、乳癌、支氣管癌、骨癌、肝臟及膽管癌症、卵巢癌、睪丸癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、脊柱癌、腦癌、宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、肛門癌、胃腸癌、皮膚癌、垂體癌、胃癌、***癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、星形細胞瘤、黑色素瘤、骨髓發育不良徵候群、肉瘤、畸胎瘤、神經膠質瘤、腺癌、白血病(例如急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(例如，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia；WM)))或骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤(MM))。
  40. 如請求項39之方法，其中上述癌症選自由以下組成之群：***癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌)、肝癌、結腸癌、結腸直腸癌、神經膠質瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳癌及多發性骨髓瘤。
  41. 如請求項40之方法，其中上述癌症為***癌、乳癌或肝癌。
  42. 如請求項40之方法，其中上述乳癌為三陰性乳癌。
  43. 如請求項40之方法，其中上述癌症為食道癌，視情況對用PD-1/PD-L1軸抑制劑的治療為耐藥或難治性，且進一步視情況對用抗PD-1抗體的治療為耐藥或難治性(例如，納武單抗)。
  44. 如請求項35之方法，其中上述纖維化疾病為肺、肝臟、腎臟、眼睛、皮膚、心臟、腸道或肌肉中的纖維化疾病。
  45. 如請求項34之方法，其中上述個體為人類。
  46. 如請求項34之方法，其中上述投與係經由口、鼻、靜脈內、皮下、舌下或肌肉內投與。
  47. 如請求項34至46中任一項之方法，其進一步包括投與治療有效量的第二治療劑。
  48. 如請求項47之方法，其中上述第二治療劑包含抗癌療法，視情況上述抗癌療法選自化學治療劑(例如，順鉑)、放射療法、免疫治療劑(例如免疫檢查點調節劑，例如PD-1/PD-L1軸抑制劑、TGF-β抑制劑)、抗血管生成劑(例如，如VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3的VEGFR的拮抗劑)、靶向療法藥劑、細胞療法藥劑、基因療法藥劑、激素療法藥劑、細胞因子、姑息治療、用於治療癌症的手術(例如，腫瘤切除術)、一或多種抗嘔劑、由化學療法引起的併發症的治療、癌症患者的飲食補充劑(例如，吲哚-3-甲醇)、調節腫瘤微環境的藥劑(例如，包含PD-L1結合部分及TGF-β受體的胞外結構域的雙功能分子)或抗纖維化療法(例如，BMP7治療、ACE抑制劑(或ARB)、抗MASP2抗體、內皮素受體拮抗劑、NRF2抑制劑類固醇、CTLA4-IgG或TNF抑制劑)。
  49. 如請求項48之方法，其中上述抗癌療法包含抗***癌藥物。
  50. 如請求項49之方法，其中上述抗***癌藥物包含雄激素軸抑制劑；雄激素合成抑制劑；PARP抑制劑；或其組合。
  51. 如請求項50之方法，上述雄激素軸抑制劑選自由以下組成之群：促黃體激素釋放激素(LHRH)激動劑、LHRH拮抗劑及雄激素受體拮抗劑。
  52. 如請求項50之方法，其中上述雄激素軸抑制劑為地加瑞克、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、阿帕魯胺、達洛魯胺、恩雜魯胺或阿比特龍。
  53. 如請求項50之方法，其中上述抗***癌藥物選自由以下組成之群：乙酸阿比特龍、阿帕魯胺、比卡魯胺、卡巴他賽、康士得(比卡魯胺)、達洛魯胺、地加瑞克、多西他賽、艾利加德(乙酸亮丙瑞林)、恩雜魯胺、艾利達(阿帕魯胺)、費蒙格(地加瑞克)、氟他胺、乙酸戈舍瑞林、傑塔納(卡巴他賽)、乙酸亮丙瑞林、魯普隆(乙酸亮丙瑞林)、魯普隆貯存型(乙酸亮丙瑞林)、利普卓(奧拉帕尼)、鹽酸米托蒽醌、尼蘭得隆(尼魯米特)、尼魯米特、努貝卡(達洛魯胺)、奧拉帕尼、普洛韋格(西普亮塞-T)、鐳223二氯化物、魯布拉卡(樟腦磺酸盧卡帕尼)、樟腦磺酸盧卡帕尼、西普亮塞-T、克癌易(多西他賽)、多菲戈(鐳223二氯化物)、安可坦(恩雜魯胺)、諾雷德(乙酸戈舍瑞林)及澤替加(乙酸阿比特龍)。
  54. 一種套組，其包含如請求項1至27中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  55. 一種偵測樣品中gremlin的存在或量的方法，其包括使上述樣品與如請求項1至27中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸，及測定上述樣品中gremlin的存在或量。
  56. 如請求項1至27中任一項之抗體或其抗原結合片段在製造用於治療個體的GREM1相關疾病或病狀的藥劑中的用途。
  57. 如請求項56之用途，其中上述GREM1相關疾病或病狀為癌症。
  58. 如請求項56之用途，其中上述GREM1相關疾病或病狀為纖維化疾病、血管生成、青光眼、視網膜疾病、腎病、肺動脈高血壓或骨關節炎(OA)。
  59. 一種治療可受益於增加BMP7活性或降低gremlin介導之對BMP7活性的抑制的疾病的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的如請求項1至27中任一項之抗體或其抗原結合片段，或如請求項28至29中任一項之醫藥組合物。
  60. 如請求項59之方法，其中上述疾病為纖維化疾病及/或腎病。
  61. 如請求項59之方法，其中上述疾病選自由以下組成之群：局部缺血再灌注損傷、缺血性急性腎衰竭、免疫球蛋白A腎病變、狼瘡腎炎、奧爾波特徵候群、糖尿病性腎病變及高血壓腎硬化、腎纖維化、慢性腎病、急性腎病及高血壓腎硬化。
  62. 一種增加有需要之個體的BMP7治療的功效的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的如請求項1至27中任一項之抗體或其抗原結合片段，或如請求項28或29醫藥組合物。
  63. 如請求項62之方法，其中上述個體診斷患有纖維化疾病及/或腎病且正經受BMP7治療。
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