KR20220038432A - FcRn 길항제를 이용한 항체-매개 장애의 치료 방법 - Google Patents

FcRn 길항제를 이용한 항체-매개 장애의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 FcRn 길항제, 예를 들어, 변형된 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 및/또는 면역어드헤신)를 사용하여 항체-매개 장애(예를 들어, 자가면역 질환)를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 FcRn 길항제를 사용하여 진단 영상을 증강시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 본원에 개시된 FcRn 길항제를 사용하여 진단 영상 동안 방사성표지된 항체에 대한 정상 조직의 노출을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 본원에 개시된 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다.

Description

FcRn 길항제를 이용한 항체-매개 장애의 치료 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 7월 25일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/878,541호로부터 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2020년 7월 23일자로 생성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 022548_WO062_SL.txt이고, 용량은 8,193 바이트이다.
배경 기술
항체와 신생 Fc 수용체(FcRn)의 상호작용은 항체 및 Fc-유래 치료제의 혈청 반감기를 유지 및 연장하는 데 있어서 결정 요인이다. FcRn은 다른 Fcγ 수용체(FcγR)와 구별되는 항체 Fc 도메인의 영역을 인식하는 MHC 클래스 I 유사 α-도메인 및 β2-마이크로글로불린(β2-m) 서브유닛의 이종이량체이다. FcRn은 다양한 조직에서 발현되지만, 주로 혈관내피 및 신장에서, 및 혈액 뇌 장벽에서 작용하는 것으로 생각된다.
FcRn에 대한 항체 결합은 pH 의존성이 높으며, 상호작용은 단지 낮은 pH(pH <6.5)에서 높은 친화도(높은 나노몰~낮은 마이크로몰)로 발생하며, 생리학적 pH(pH 약 7.4)에서는 발생하지 않는다. 엔도솜이 6.5 미만의 pH까지 산성화되면 IgG와 FcRn 사이의 상호작용이 매우 유리해지며, 상기 상호작용은 세포 표면으로의 FcRn-결합 항체의 재순환의 촉진 및 이의 분해의 억제를 직접적으로 담당한다. pH의 증가는 상기 상호작용을 약화시키고 항체의 혈류로의 방출을 촉진한다.
고처리량 돌연변이유발 접근법을 사용한 Fc 조작(engineering)이 FcRn 결합 친화도를 향상시키는 변이체를 식별하기 위해 광범위하게 추구되어 왔으며, 이는 향상된 결합성이 아마도, 야생형 IgG 항체와 비교하여 연장된 혈청 반감기의 직접적인 결과로서 치료용 항체에 있어서의 증가된 효능 및 감소된 투여 빈도를 초래할 수 있기 때문이다. 그러나 FcRn 결합 친화도를 향상시키는 변이체는 예상치 못한 결과가 있을 수 있다. 예를 들어, pH 6.0에서 FcRn 친화도의 큰 증가를 나타내는 특정 IgG 변이체, 예컨대 특히 N434W 또는 P257I/Q311I 치환이 있는 변이체는 인간 FcRn(hFcRn)에 대해 트랜스제닉인 마우스 및 시노몰구스 원숭이에서 야생형의 또는 심각하게 감소된 혈청 반감기를 갖는다(예를 들어, 문헌[Kuo et al., Mabs. (2011) 3(5):422-30]; 문헌[Datta-Mannan et al., J Biol Chem. (2007) 282:1709-17]; 및 문헌[Datta-Mannan et al., Metab Dispos. (2007) 35:86-94] 참조). T250Q/M428L(QL) 변이체는 동물 모델에서 Fv-특이적 결과를 나타냈다(예를 들어, 문헌[Datta-Mannan, 2007, 상기 문헌]; 및 문헌[Hinton et al., J Immunol. (2006) 176:346-56] 참조). M252Y/S254T/T256E(YTE, Eu 넘버링) 변이체는 시험관 내에서 10배 향상을 나타냈지만, FcγRIIIa 수용체에 대한 친화도가 2배 감소하여 생체 내에서 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)의 감소를 나타낸다(예를 들어, 문헌[Dall’Acqua et al., J Immunol. (2002) 169(9):5171-80] 참조).
향상된 친화성 및 감소된 pH 의존성으로 FcRn에 결합하는 Fc 변이체는 혈액 순환으로부터의 IgG의 제거를 증가시키는 데 사용될 수 있다. FcRn-매개 IgG 재순환은 인간에서 IgG 혈장 농도를 유지하기 위한 지배적인 과정임이 밝혀졌다(문헌[Xiao, J Biomed Biotechnol. (2012) 2012:282989]). 예를 들어 순환하는 자가반응성 항체가 병상을 야기하는 전신성 홍반성 루푸스와 같은 자가면역 질환과 IgG-복합 독소, 약물 또는 진단제가 신체로부터 빠르게 제거되어야 하는 상황에서 상기 순환으로부터의 IgG의 제거 증가가 바람직할 것이다. 원치 않는 항체의 증가된 제거는 FcRn에 높은 친화도로 결합하고 거의 중성인 pH에서 빠르게 해리되는 것이 아닌 조작된 Fc를 갖는 항체와 같은 FcRn 길항제를 사용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 조작된 항체는 IgG 분해를 향상시키는 항체에 대해 Abdeg로 칭해진다(문헌[Swiercz et al., J Nucl Med. (2014) 55(7):1204-7]). 그러한 FcRn 길항제는 세포로부터 방출되지 않을 것이며, 대신 FcRn에 결합된 채로 남아 있고 더 낮은 친화성의 다른 IgG의 결합을 차단할 것으로 예측될 것이다. 그 결과, FcRn 기능이 차단되고 내인성 IgG 또는 원치 않는 IgG가 분해를 위해 리소좀 경로로 보내질 것이다.
FcRn에 대한 향상된 결합 친화성을 보유하고 FcRn에 대한 결합에서 pH 의존성의 상실을 나타내는 Fc 변이체를 사용하여 IgG-매개 질환을 치료하는 방법이 필요하다.
본 발명은 항체-매개(예를 들어, IgG-매개) 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 항체-매개(예를 들어, IgG-매개) 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체(예를 들어, 인간)에게 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. FcRn 길항제의 치료적 유효량은 치료받는 대상체에서 혈청 IgG 제거율을 증가시킬 것이다.
일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E), 및 아미노산 위치 307의 트립토판(W) 또는 글루타민(Q)을 포함하고(여기서, 아미노산 위치 254는 트레오닌(T)이 아님), 아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y); 및 아미노산 위치 252의 티로신(Y)을 추가로 포함하는 적어도 4개의 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 기술된 모든 Fc 잔기 위치는 Eu 넘버링 시스템에 따른다.
일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기들의 조합을 포함한다: a) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y); b) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y); c) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y); d) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F); e) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D); 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y); f) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F); g) 아미노산 위치 252의 티로신(Y) 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y); h) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y); i) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y); 또는 j) 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y).
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다: M252Y/T256D/T307Q/N434Y, M252Y/T256E/T307W/N434Y, M252Y/T256E/T307Q/N434Y, M252Y/T256D/T307Q/N434F, M252Y/T256D/T307W/N434Y, M252Y/T256D/T307W/N434F, M252Y/N434Y, M252Y/T307W/N434Y, M252Y/T256D/N434Y, 및 T256D/307W/N434Y.
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 변형된 인간 IgG Fc 도메인, 예컨대 변형된 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 도메인, 또는 인간 Fc 도메인 중 하나 이상으로부터 유래된 Fc 도메인이다.
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 하나 이상의 종, 예컨대 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스 및 래트 유래의 FcRn에 대해 결합 친화성을 갖는다. 예를 들어, 변형된 Fc 도메인은 인간 FcRn(hFcRn) 및 래트 FcRn(rFcRn) 둘 다에 대해 결합 친화성을 갖는다.
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 향상된 FcRn 결합 친화도(예를 들어, hFcRn에 대한 향상된 결합 친화도)를 갖는다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 산성 pH(예를 들어, 약 6.0)에서 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖는다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 오중 돌연변이 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F("YTEKF")를 갖는 Fc 도메인과 비교하여 산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 비-산성 pH(예를 들어, 약 7.4)에서 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖는다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 YTEKF 돌연변이를 갖는 Fc 도메인과 비교하여 비-산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화도 및 비-산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖는다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 YTEKF 돌연변이를 갖는 Fc 도메인과 비교하여 산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화도 및 비-산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 감소된 FcγRIIIa 결합 친화도를 갖는다.
특정 실시 형태에서, FcRn 길항제는 결합 폴리펩티드, 예컨대 항체이거나 이의 항원-결합 단편(예를 들어, Fv 단편, 단쇄 항체(ScFv), Fab, Fab-H, Fab', 및 F(ab')2)을 포함한다. 결합 폴리펩티드는 FcRn이 아닌 하나 이상의 표적에 할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 치료될 IgG-매개 장애는 자가면역 질환이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 자가면역 질환은 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 중증 근무력증, 전신 경화증(SSc)/경피증, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 당뇨병, 다발성 경화증, 심상성 천포창, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 알러지, 특발성 폐 섬유증(IPF), 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP) 및 화농성 한선염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 발명은 진단 영상을 증강시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 본원에 기술된 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 방법은 유효량의 방사성표지된 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시 형태에서, FcRn 길항제는 방사성표지된 항체 후에 투여되고 방사성표지된 항체에 대한 콘트라스트를 증강시킨다.
특정 양태에서, 본 발명은 진단 영상 동안 방사성표지된 항체에 대한 비-표적 조직의 노출을 감소시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 본원에 기술된 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 치료 및 진단 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서의 본원의 FcRn 길항제의 용도, 및 본 발명의 치료 및 진단 방법에 사용하기 위한 FcRn 길항제가 제공된다.
본 발명은 또한 FcRn 길항제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 이 폴리펩티드를 제조하기 위한 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포, 및 본원에 개시된 FcRn 길항제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 질환을 치료하기 위해 본 발명의 FcRn 길항제를 사용하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 장점은 첨부 도면과 함께 아래의 예시적인 실시 형태의 상세한 설명으로부터 보다 충분히 이해될 것이다.
도 1의 A 및 도 1의 B는 IgG1 Fc 영역과 상호작용하는 FcRn의 구조를 도시한다. 도 1의 A는 α-도메인(회색) 및 β2-m(연한 회색) hFcRn 서브유닛과의 복합체 형태의, "글리칸"으로 라벨링된 스틱(stick)으로 나타낸 글리코실화를 포함하는, 하나의 Fc 단량체(짙은 회색 리본)를 나타내는 hFcRn과 IgG1 Fc(pdb: 4n0u) 사이의 상호작용을 도시한다. FcRn과의 상호작용에 관여하는 항체 잔기의 대다수는 CH2-CH3 경계면(점선)에 직접적으로 인접하고 글리코실화 부위 반대편에 있는 루프에 위치한다. 도 1의 B는 도 1의 A에 대해 75° 회전된 IgG1 Fc 결정 구조(pdb: 5d4q)의 표면 표시를 도시한다. FcRn 결합 경계면은 CH2 및 CH3 도메인의 잔기로 구성된다. 포화 라이브러리는 스틱으로 나타낸 11개 위치에서 구축되었고 이는 다음으로 표시되는 바와 같다: M252; I253; S254; T256; K288; T307; K322; E380; L432; N434 및 Y436. 이들 잔기는 모두 FcRn과 매우 근접한 상태로 또는 직접적 접촉 상태로 있다. pH 의존성을 담당하는 중요한 히스티딘 잔기(H310, H433, H435)의 표면은 관심 위치 근처에 클러스터링되어 있으며, 표시된 바와 같다.
도 2a~도 2d는 Octet 스크리닝 분석 및 결과를 도시한다. 도 2a는 Octet 스크리닝 분석을 개략적으로 나타낸다. NiNTA 바이오센서는 히스티딘-태그 항원을 포획하고, 후속적으로, 래트 FcRn(rFcRn) 결합 동역학을 위한 항체 변이체를 포획한다. 도 2b는 pH 6.0에서 야생형(실선), T307A/E380A/N434A(AAA) 변이체(짧은 대시), LS(단일 점이 산재된 짧은 대시), YTE(긴 대시), H435A(단일 점이 산재된 긴 대시) 및 H310A/H435Q(2개의 점이 산재된 긴 대시) 항체(rFcRn 결합 단계의 시작 부분에 정렬됨)의 rFcRn 결합 동역학 프로파일을 도시한다. H435A 및 H310A/H435Q 변이체는 FcRn 결합을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. YTE 변이체는 Octet rFcRn 결합 분석에서 조사할 경우 가장 느린 FcRn 오프 속도(off-rate)를 갖는다. 도 2c는 Octet 스크린으로부터 수득된 돌연변이체의 하위세트에 의한 pH 6.0에서의 FcRn 결합 동역학의 정규화를 그래프로 도시한다. 대부분의 돌연변이체는 rFcRn에 대한 상당한 결합성을 유지했지만, 몇몇은 모크 대조군(점선)과 유사하며, 이는 모든 rFcRn 결합의 손실을 나타낸다(긴 대시, 점선(모크) 아래에 위치). 2가지의 변이체(N434F 및 N434Y; 실선)는 더 느린 rFcRn 오프 속도를 가졌다. 2가지의 변이체(실선)는 야생형 항체(굵고 긴 대시)보다 더 느린 rFcRn 오프 속도를 가졌다. 도 2d는 모든 점 돌연변이에 대한 rFcRn 오프 속도의 산점도 분석을 도시하며, 이때 관찰가능한 rFcRn 결합 동역학은 잔기 위치에 따라 구분된다. 포화 변이체는 하기 4가지 rFcRn 오프 속도 체제 중 하나에 속한다: 결합 없음(예시되지 않음), 더 빠른 결합(흑색), 야생형 유사 결합(백색), 더 느린 결합(회색). 18가지의 돌연변이체(E380C, K288D, K288N, M252Y, T256D, T256E, N434F, N434P, N434Y, T307A, T307E, T307F, T307M, T307Q, T307W, Y436H, Y436N 및 Y436W)는 야생형 항체(흑색 파선)보다 유의하게 더 느린 오프 속도를 보여주었다.
도 3은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 인간 및 래트 FcRn을 갖는 벤치마크 및 야생형 변이체의 BiacoreTM 동역학을 그래프로 도시한다. 야생형(좌측 위), AAA 변이체(우측 위), M428/N434S(LS) 변이체(좌측 아래) 및 M252Y/S254T/T256E(YTE) 변이체(우측 아래)의 농도 시리즈에 대한 모든 FcRn 결합 곡선이 pH 6.0(첫 번째 및 세 번째 행) 및 pH 7.4(두 번째 및 네 번째 행)에서 각각의 인간(첫 번째 및 세 번째 열) 및 래트(두 번째 및 네 번째 열) FcRn에 대해 예시되어 있다. AAA, LS 및 YTE 변이체는 야생형 항체보다 더 느린 FcRn으로부터의 오프 속도를 나타냈다. 일반적으로, 항체는 야생형과 비교하여 약 10배 증가된 친화도로 rFcRn에 결합한다. LS 변이체는 pH 7.4에서 가장 긴밀한 친화성을 갖고, pH 7.4에서 hFcRn에 대한 가장 큰 잔존 결합성을 가졌던 반면, rFcRn은 YTE 변이체에 가장 긴밀하게 결합하였다.
도 4a는 pH 6.0에서 인간 및 래트 FcRn을 이용한 리드(lead) 포화 변이체의 BiacoreTM 동역학을 그래프로 도시한다. 18가지의 리드 포화 변이체에 대한 농도 시리즈의 FcRn 결합 동역학 자취가 예시된다. M252Y, T256D, T256E, N434F, N434P, N434Y, T307A, T307E, T307F, T307Q 및 T307W는 인간 및 래트 FcRn 둘 다로부터의 더 느린 오프 속도를 가졌다. 나머지 변이체는 단지 래트 FcRn에 특이적이었다.
도 4b는 pH 6.0에서 인간 FcRn을 이용한 WT, 벤치마크 및 리드 단일 포화 변이체의 FcRn 결합 동역학을 그래프로 도시한다. pH 6.0에서 인간 FcRn을 이용한 WT, LS, YTE 및 18가지의 포화 변이체의 농도 시리즈를 이용한 FcRn 결합 센서그램. 조합 라이브러리에 사용된 단일 포화 변이체는 밑줄 및 볼드체로 표시된다.
도 5a~도 5d는 다중 변이체가 pH 6.0에서 인간 및 래트 FcRn 둘 다로부터의 더 느린 오프 속도를 가짐을 보여주는 데이터를 도시한다. 도 5a 및 도 5b는 다양한 변이체의 BiacoreTM 센서그램을 도시한다. 도 5a는 YTE 변이체(단일 점이 산재된 긴 대시), LS 변이체(2개의 점이 산재된 긴 대시), 야생형(WT; 점선) 및 리드 포화 변이체(리드 E380C, K288D, K288N, M252Y, T256D, T256E, N434F, N434P, N434Y, T307A, T307E, T307F, T307M, T307Q, T307W, Y436H, Y436N, 및 Y436W; 다양한 음영의 실선)에 대한 pH 6.0에서의 인간 FcRn의 오프 속도를 도시한다. 도 5a에서, WT와 비교하여 개선된 hFcRn 오프 속도를 나타내는 정규화된 센서그램이 도시되어 있다. 도 5b는 AAA 변이체(점선), LS 변이체(2개의 점이 산재된 대시), YTE 변이체(단일 점이 산재된 대시), 야생형(실선) 및 18가지의 리드 포화 변이체(다양한 빈도 및 두께의 파선)에 대한 pH 6.0에서의 래트 FcRn의 오프 속도를 도시한다. 명확성을 위해 11가지의 리드 항체 각각의 대표적인 주입이 예시된다. 이들 리드 단일 변이체는 야생형과 비교하여 인간 및 래트 FcRn 둘 다로부터의 개선된 오프 속도 동역학을 보여주었다. 도 5c 및 도 5d는 BiacoreTM 동역학 측정으로부터 수득된 온 속도 및 오프 속도를 사용하여 인간(도 5c) 및 래트(도 5d) FcRn에 대한 18가지의 리드 포화(백색 원) 및 야생형(흑색 원) 항체 변이체에 대한 결합 친화도 플롯을 도시한다. 다음의 벤치마크 변이체가 예시된다: AAA(우측 하단을 향한 대각선), LS(점선) 및 YTE(좌측 하단을 향한 대각선). FcRn 오프 속도의 개선에도 불구하고, 대다수의 변이체는, 더 느린 결합 동역학으로 인해 인간 또는 래트 FcRn에 대해 더 긴밀한 친화성을 갖지 않았다. 11가지의 변이체는 두 종의 FcRn 모두로부터 더 느린 오프 속도를 가졌다.
도 6a~도 6d는 리드 포화 돌연변이들의 조합이 FcRn 오프 속도 및 결합 친화도를 추가로 개선했음을 보여주는 데이터를 도시한다. 도 6a 및 도 6b는 각각 인간 및 래트 FcRn에 대한 FcRn 오프 속도를 보여주는 대표적인 BiacoreTM 센서그램을 도시한다. 도 6a는 야생형(점선) 및 LS 변이체(2개의 점이 산재된 긴 대시)와 비교된, 대표적인 단일 변이체(T256E; 파선), 이중(변이체 YETN(M252Y/T256E); 연한 회색 실선), 삼중(변이체 MDQY(T256D/T307Q/N434Y); 회색 실선) 및 사중(변이체 YEQY(M252Y/T256E/T307Q/N434Y); 흑색 실선) 조합 변이체의 인간 FcRn에 대한 정규화된 센서그램을 도시한다. 도 6b는 야생형(점선) 및 YTE 변이체(실선)와 비교된, 대표적인 단일 변이체(2개의 점이 산재된 긴 대시), 이중(변이체 METF; 단일 점이 산재된 긴 대시), 삼중(변이체 MEWY; 긴 대시) 및 사중(변이체 YDWF; 짧은 대시) 조합 변이체의 래트 FcRn에 대한 정규화된 센서그램을 도시한다. 다중 돌연변이의 혼입은 벤치마크 변이체보다 더 큰 정도로 FcRn에 대한 결합 친화도를 향상시키고 오프 속도를 감소시켰다. 도 6c 및 도 6d는 인간(도 6c) 또는 래트(도 6d) FcRn에 대한 오프 속도의 함수로서 온 속도를 보여주는 조합 포화 변이체의 플롯을 도시하며, 이는 대다수의 변이체가 벤치마크 변이체와 비교하여 pH 6.0에서 FcRn에 대한 향상된 결합성을 보유함을 나타냈다. 인간 및 래트 FcRn에 대한 가장 긴밀한 결합 변이체는 각각 사중(hFcRn의 경우 변이체 YDWY, YDQY, YDWF, YEWY 및 YEQY) 및 이중 조합(rFcRn의 경우 변이체 YTTY, YTTF, MDTY, YDTF 및 MTWY)이었다.
도 7a~도 7d는 pH 6.0에서 향상된 FcRn 결합이 상기 상호작용의 pH 의존성을 파괴함을 보여주는 데이터를 도시한다. 도 7a 및 도 7b는 야생형(점선), 및 LS 변이체(도 7a, 실선) 및 YTE 변이체(도 7b, 실선)와 비교된, 단일(2개의 점이 산재된 긴 대시), 이중(단일 점이 산재된 긴 대시), 삼중(긴 대시) 및 사중(짧은 대시) 조합 변이체의 pH 7.4에서의 BiacoreTM FcRn 결합 동역학의 대표적인 센서그램을 도시한다. FcRn 결합-향상 돌연변이의 수를 증가시키면 생리학적 pH에서 더 큰 잔존 결합이 초래되었으며, 이때 대부분의 이중, 삼중 및 사중 변이체는 두 종의 FcRn 모두에 대한 강력한 결합을 보여주었다. 도 7c 및 도 7d는 pH 6.0에서의 결합 친화도의 함수로서 pH 7.4에서의 인간(도 7c) 또는 래트(도 7d) FcRn에 대한 모든 포화 변이체의 정상 상태 공명 단위(RU;
Figure pct00001
(식 2))의 플롯을 도시한다. 도 7c에서, pH 7.4에서의 잔존 FcRn 결합과 pH 6.0에서의 FcRn 결합 친화도의 비교가 예시된다. 개선된 FcRn 결합 특성을 갖는 리드 조합(MDQN, MDWN, YETN, YTWN, YDQN 및 YEQN)은 LS 벤치마크 변이체(마름모)에 의해 정의된 좌측 하단 사분면을 차지한다. 도 7d에서, LS(마름모) 및 YTE(삼각형) 변이체는 각각 리드 검증을 위한 컷오프로서의 역할을 한다. 이들 2개의 변이체는 각각 인간 및 래트 FcRn에 대해 pH 6.0에서 가장 긴밀한 결합 친화도 및 pH 7.4에서 가장 큰 잔존 결합을 가졌다. 도 7c 및 도 7d 둘 다에서, 단일(백색 원), 이중(연한 회색 원), 삼중(짙은 회색 원) 및 사중(흑색 원) 변이체와 YTE 변이체(삼각형)가 예시된다.
도 8a~도 8c는 벤치마크 변이체의 FcRn 친화성 크로마토그래피 및 시차 주사 형광측정법(DSF)으로부터 얻어진 데이터를 도시한다. 도 8a는 WT(흑색 실선), AAA(점선), Ls(2개의 점이 산재된 긴 대시), YTE(단일 점이 산재된 긴 대시), H435A(연한 회색 실선) 및 H310A/H435Q(AQ; 짙은 회색 실선) 변이체에 대한 정규화된 용출 프로파일을 도시한다. pH는 그래프 상단에 표시되어 있다. FcRn 결합 무효화(null) 변이체(H435A, H310A/H435Q)는 컬럼에 결합하지 않고 통과액(<10 mL) 형태로 용출된다. AAA, LS 및 YTE 변이체는 WT 항체보다 더 높은 pH에서 용출된다. 도 8b는 WT(흑색), LS(회색) 및 YTE(짙은 회색) 변이체의 DSF 프로파일을 도시한다. YTE는 WT 및 LS와 비교하여 불안정화되었다. 도 8c는 WT 및 LS 변이체(수직 점선)와 비교하여 조합 변이체에 사용된 7가지의 리드 단일 변이체의 FcRn 친화성 컬럼 용출 프로파일을 도시한다. 2가지 변이체(N434F/Y)는 LS보다 더 높은 pH에서 용출되며, 이는 이러한 돌연변이를 포함하는 변이체에 있어서의 FcRn과의 상호작용에 대한 pH 의존성의 감소를 의미한다.
도 9a~도 9d는 조합 변이체가 pH 의존성 및 열 안정성을 상당히 교란시켰음을 보여주는 데이터를 도시한다. 도 9a는 단일(2개의 점이 산재된 긴 대시), 이중(단일 점이 산재된 긴 대시), 삼중(긴 대시) 및 사중 변이체(짧은 대시)의 대표적인 FcRn 친화성 크로마토그램을 도시한다. FcRn 결합-향상 돌연변이의 수를 증가시키면 용출이 더 높은 pH 값 쪽으로 이동하였다(LS 변이체(작은 점선 수직선)). 도 9b는 FcRn 증강 돌연변이체의 수가 증가함에 따라 더 높은 pH 값 쪽으로 향하는 경향을 나타내는, 단일(백색 원), 이중(가로선), 삼중(수직선) 및 사중(체크무늬) 돌연변이체를 포함하는 리드 포화 변이체 및 조합 변이체에 대한 용출 pH의 박스 플롯을 도시한다. 도 9c는 FcRn 친화성 크로마토그래피로부터의 용출 pH와 BiacoreTM를 사용한 hFcRn 오프 속도 사이의 높은 상관관계(R2 = 0.94)가 항체-FcRn 상호작용의 pH 의존성의 손실(이때 FcRn 해리 동역학이 개선됨)을 드러냈음을 보여준다. AAA(우측 하단을 향한 대각선), LS(점선) 및 YTE(좌측 하단을 향한 대각선) 변이체는 이중 변이체와 유사한 hFcRn 오프 속도 및 용출 pH 값을 가졌다. 도 9d는 조합 포화 변이체의 DSF로부터 수득된 Tm의 박스 플롯을 도시하며, 이는 추가의 FcRn 결합 향상 돌연변이가 WT, 단일 또는 벤치마크 변이체와 비교하여 항체를 불안정화시킴을 나타냈다.
도 10a 및 도 10b는 7가지의 리드 변이체의 FcRn 친화성 크로마토그래피 및 DSF로부터 수득된 데이터를 도시한다. 도 10a는 M252Y(실선), T256D(단일 점이 산재된 짧은 대시), T256E(긴 대시), T307Q(단일 점이 산재된 긴 대시), T307W(2개의 점이 산재된 긴 대시), N434F(점선) 및 N434Y(짧은 대시) 변이체의 FcRn 친화성 크로마토그래피를 도시한다. 크로마토그램은 야생형 및 LS 항체(수직 점선)와 비교하여 용출 pH의 변화를 나타냈다. N434F 및 N434Y는 LS 변이체(수직 점선)보다 더 높은 용출 pH(pH 약 8.3)를 가졌다. 특정 용출 부피에서의 pH는 참조용 크로마토그램 위에 표시된다. 도 10b는 7가지의 리드 변이체의 DSF 프로파일을 도시하며, 이는 상기 7가지의 리드 단일 변이체 중 어느 것도 YTE 변이체(수직 점선)와 동일한 정도로 항체를 불안정화시키지는 않음을 보여주었다. T307Q(단일 점이 산재된 긴 대시)를 제외한 모든 변이체는 WT(수직 점선)와 비교하여 불안정화되었다.
도 11a~도 11c는 FcγRIIIa 결합이 M252Y-함유 조합 변이체에서 감소되었음을 보여주는 데이터를 도시한다. 도 11a는 WT(흑색), LS(회색) 및 YTE(짙은 회색) 변이체의 FcγRIIIa 결합 센서그램이 YTE 변이체에 의한 감소된 결합 반응을 나타냄을 보여준다. 도 11b는 표시된 바와 같이 벤치마크, 단일 및 조합 변이체의 FcγRIIIa 결합 반응의 박스 플롯을 도시한다. 모든 사중 변이체를 비롯하여 M252Y 돌연변이를 포함하는 변이체는 FcγRIIIa에 대한 감소된 결합 반응을 포함한다. N434F/Y와의 조합은 전형적으로 FcγRIIIa에 의한 증가된 반응을 나타낸다. 도 11c는 WT 및 YTE 변이체(가로 점선)와 비교하여 7가지의 리드 단일 변이체의 FcγRIIIa 결합 반응을 도시한다. M252Y 돌연변이는 WT와 비교하여 감소된 FcγRIIIa 결합을 나타내는 반면, 6가지는 이 수용체에 대한 WT-유사 결합 또는 증가된 결합을 나타낸다.
도 12a~도 12d는 7가지의 리드 조합 변이체의 FcRn 친화성 크로마토그래피, DSF, 및 FcγRIIIa 결합으로부터 수득된 데이터를 도시한다. 도 12a는 야생형 항체 및 LS 변이체(각각 수직 점선 및 수직 실선)와 비교하여 7가지의 리드 조합 변이체의 FcRn 친화성 크로마토그램을 도시한다. 각각의 리드 변이체는 LS 변이체 근처의 용출 pH를 가졌다. 도 12b는 YTE 및 야생형 변이체와 비교한 리드 조합 변이체의 DSF 프로파일을 보여준다(표시된 수직 점선). 7가지의 리드 변이체 중 다음의 6가지의 Tm이 YTE 변이체와 유사하거나 이보다 더 불안정화되었다: MDWN(2개의 점이 산재된 긴 대시); YTWN(긴 대시); YDTN(실선); YETN(단일 점이 산재된 긴 대시); YDQN(점선); YEQN(단일 점이 산재된 짧은 대시). MDQN 변이체는 야생형 항체와 유사한 Tm을 가졌다(짧은 대시). 도 12c는 야생형(더 큰 점선) 및 YTE 변이체(굵고 긴 대시)와 비교한 7가지의 리드 변이체의 FcγRIIIa 결합 동역학의 BiacoreTM 센서그램을 도시한다. M252Y-함유 변이체인 YDTN(실선), YDQN(단일 점이 산재된 짧은 대시), YTWN(긴 대시), YETN(단일 점이 산재된 긴 대시) 및 YEQN(더 작은 점선)은 각각 YTE와 유사한 방식으로 감소된 정상 상태 RU를 보유하였다. 도 12d는 7가지의 리드 변이체, 야생형 및 YTE 변이체의 정상 상태 RU를 보여준다. MDWN 및 MDQN 변이체만이 FcγRIIIa에 대해 야생형 항체와 유사한 친화도를 보유하였다.
도 12e~도 12h는 3가지의 리드 변이체가 일련의 주요 항체 속성을 나타냄을 보여주는 데이터를 도시한다. 도 12e는 WT 및 LS(수직 점선)와 비교한 DQ(실선), DW(점선) 및 YD(대시) 변이체의 FcRn 친화성 크로마토그래피 용출 프로파일을 보여준다. 각각의 이중 변이체는 WT와 LS 사이의 용출 pH를 보여주었다. 도 12f는 YTE 및 WT 변이체(수직 점선)와 비교하여 3가지의 변이체의 DSF 형광 프로파일을 도시하며, 이는 YD(대시) 및 DW(점선)가 YTE와 비교하여 약간 불안정화되었지만 DQ(실선)는 WT와 유사함을 나타냈다. 도 12g는 WT 및 YTE(가로 점선)와 비교한 FcγRIIIa 결합 센서그램을 도시한다. YD(대시)는 YTE와 유사한 결합 반응을 보인 반면, DQ(실선) 및 DW(점선)는 WT와 비교하여 약간의 감소를 보였다. 도 12h는 균일 가교 RF ELISA가 3가지의 리드 변이체를 나타냈고 YTE는 LS와 달리 상당히 감소된 RF 결합 또는 WT-유사 RF 결합을 나타냈음을 보여주는 데이터를 도시한다. **p<0.001, *p<0.01.
도 13a~도 13d는 pH 6.0 및 pH 7.4에서 리드 조합 변이체의 FcRn 결합 동역학의 비교를 보여주는 데이터를 도시한다. 도 13a 및 도 13b는 pH 6.0에서 야생형(점선) 및 LS(hFcRn, 도 13a, 두껍고 긴 대시) 또는 YTE( rFcRn, 도 13b, 두껍고 긴 대시)와 비교한 인간 FcRn(도 13a) 또는 래트 FcRn(도 13b)에 대한 리드 조합 변이체의 BiacoreTM FcRn 결합 센서그램을 보여준다. 각각의 조합 변이체는 변경된 온 및 오프 속도에도 불구하고 각각의 FcRn에 대해 전체적으로 더 긴밀한 결합 친화성을 가졌다. 도 13c 및 도 13d는 pH 7.4에서의 BiacoreTM FcRn 센서그램을 보여준다. 각각의 hFcRn 리드 변이체는 LS 변이체와 비교하여 유사하거나 감소된 정상 상태 FcRn 결합 반응을 가졌다. MDQN 및 MDWN 변이체만이 pH 7.4에서 YTE 변이체보다 더 적은 rFcRn 결합을 보였다.
도 14는 단일 돌연변이를 갖는 특정 실시 형태에 따른 포화 라이브러리의 Octet rFcRn 결합 오프 속도 나타내는 표이다. 야생형(WT) 및 야생형 유사(WT-유사) 종은 백색 직사각형으로 표시되며; WT 종은 표시된 바와 같다. 야생형과 비교하여 rFcRn 결합이 거의 없거나 또는 전혀 없는 변이체는 짙은 회색 직사각형으로 표시된다. 야생형과 비교하여 더 빠른 rFcRn 오프 속도를 갖는 변이체는 연한 회색 직사각형으로 표시되고, 야생형과 비교하여 더 느린 rFcRn 오프 속도를 갖는 변이체는 흑색 직사각형으로 표시된다.
도 15a~도 15c는 CM5 센서 칩을 사용하여 개발된 새로운 결합 어세이(assay)를 도시한다. 도 15a는 상기 어세이의 개략도이다. 도 15b는 FcRn의 직접적 고정화를 보여준다. 도 15c는 비오티닐화 FcRn의 스트렙타비딘 포획을 보여준다.
도 16a 및 도 16b는 pH 6.0에서의 mAb2의 FcRn 결합을 도시한다. 도 16a는 인간 FcRn을 도시한다. 도 16b는 마우스 FcRn을 도시한다.
도 17a 및 도 17b는 pH 7.4에서의 mAb2의 FcRn 결합을 도시한다. 도 17a는 인간 FcRn을 도시한다. 도 17b는 마우스 FcRn을 도시한다.
도 18은 다양한 mAb2 변이체의 pH 의존성을 그래프로 도시한다. 리드 변이체는 pH 6에서 LS보다 더 높은 결합 친화도를 유지하고 pH 7.4에서 LS보다 더 낮은 잔존 결합을 유지하였다.
도 19는 mAb1 및 mAb2의 백본을 사용한 FcRn 결합 pH 의존성의 비교를 도시한다. mAb1 및 mAb2는 2가지의 관련 없는 항원을 표적화하는 인간 IgG1 항체이다.
도 20은 mAb1 및 mAb2의 백본을 사용한 열 안정성의 비교를 도시한다.
도 21은 mAb1 및 mAb2의 백본을 사용한 FcγRIIIa 결합의 비교를 도시한다.
도 22는 DQ, DW 및 YD 변이체가 IgG1 백본 사이에서 이동가능하였음을 보여주는 플롯의 패널이다. 패널 a~c는 3가지의 IgG1 백본에서의 pH 6.0에서의 정규화된 FcRn 결합 센서그램을 도시하며, 이때 WT(연한 회색), LS(짙은 회색), DQ(흑색 실선), DW(점선) 및 YD(대시) 변이체는 낮은 pH에서 유사한 동역학을 보여준다. 이들 3가지 변이체, DQ, DW 및 YD는 LS 변이체보다 약간 더 빠른 온 및 오프 속도를 갖지만 더 긴밀한 FcRn 결합 친화성을 유지하였다. 패널 d~f는 pH 7.4에서의 FcRn 결합 센서그램을 도시한다; LS 벤치마크 변이체(흑색 실선). 패널 g~i는 WT(회색), LS(짙은 회색), DQ(흑색), DW(공백(empty)) 및 YD(빈 사각형) 변이체를 포함하는 각각의 항체 백본에 대한 pH 6.0에서의 결합 친화도와 비교한 pH 7.4에서의 FcRn 결합 반응을 도시한다. DQ, DW 및 YD는 개선된 FcRn 특성을 보여주며, 이때 pH 6.0에서 결합이 향상되고 pH 7.4에서 결합이 최소이다.
도 23a~도 23c는 mAb2 백본에서의 상기 3가지 리드 변이체가 시노몰구스 FcRn에 대한 결합을 유사하게 개선함을 보여준다. 도 23a는 WT(회색), Ls(짙은 회색), DQ(흑색 실선), DW(점선) 및 YD(대시)(hFcRn과 유사한 결합 동역학 및 친화도를 나타냄)의 pH 6.0에서의 정규화된 cFcRn 결합 센서그램을 도시한다. 도 23b는 3가지의 변이체에 대한 cFcRn 결합 반응이 생리학적 pH에서 극적으로 감소되었지만; LS(짙은 회색)는 hFcRn과 유사한 방식으로 WT(회색)보다 더 큰 결합성을 보였음을 도시한다. 도 23c는 WT(회색), Ls(짙은 회색), Dq(흑색 실선), DW(공백) 및 YD(빈 사각형)의 pH 7.4에서의 잔존 cFcRn 결합 반응과 pH 6.0에서의 cFcRn 결합 친화도를 비교한 것을 도시하며, 이는 3가지 변이체 모두가 hFcRn에서 관찰된 개선된 FcRn 결합 특성을 유지함을 나타냈다.
도 24a 및 도 24b는 리드 변이체가 항체 혈청 반감기를 연장시켰음을 보여준다. WT(흑색 실선이 있는 흑색 원), LS(흑색 파선이 있는 백색 원), DQ(연한 회색 실선이 있는 연한 회색 원), DW(짙은 회색 실선이 있는 짙은 회색 원) 및 YD(흑색 점선이 있는 흑색 원) 항체의 시노몰구스 원숭이(도 24a) 및 hFcRn 트랜스제닉 마우스(도 24b)에서의 시간의 함수로서의 혈장 항체 농도의 약동학적 프로파일. 3가지 리드 변이체 모두는 WT와 비교하여 항체 반감기를 연장시킨다.
도 25는 pH 6.0에서의 결합 친화도의 함수로서의 pH 7.4에서의 인간 FcRn에 대한 모든 포화 변이체의 정상 상태 RU의 플롯을 도시한다. pH 7.4에서의 잔존 FcRn 결합과 pH 6.0에서의 FcRn 결합 친화성의 비교가 예시된다. pH 6.0 및 pH 7.4 둘 다에서 개선된 FcRn 결합 특성을 갖는 사중 조합은 플롯의 우측 상단 사분면에 박스로 표시되어 있다. 단일(백색 원), 이중(연한 회색 원), 삼중(짙은 회색 원) 및 사중(흑색 원) 변이체와 벤치마크 AAA, LS 및 YTE 변이체(표시된 바와 같음)가 예시된다.
도 26은 비오티닐화 FcRn을 포획하기 위해 사용된 Biotin CAPture 방법의 개략도를 도시한다.
도 27a~도 27g는 표시된 바와 같이 YTEKF(ABDEGTM) 벤치마크 및 FcRn 길항제의 pH 6.0, pH 7.4, 및 pH 8.0에서의 인간 및 시노 FcRn 결합 동역학을 보여주는 플롯을 도시한다. 도 27a 및 도 27b는 각각, WT, YTEKF 및 FcRn 길항제의 pH 6.0에서의 인간 및 시노 FcRn에 대한 농도 의존적 결합을 보여준다. 도 27c 및 도 27d는 각각, WT, YTEKF 및 FcRn 길항제의 pH 7.4에서의 인간 및 시노 FcRn에 대한 농도 의존적 결합을 보여준다. 도 27e 및 도 27f는 각각, WT, YTEKF 및 FcRn 길항제의 pH 8.0에서의 인간 및 시노 FcRn에 대한 농도 의존적 결합을 보여준다. 도 27g는 YEQF 및 YEWF 변이체의 pH 6.0에서의 인간 및 래트 FcRn에 대한 농도 의존적 결합을 보여준다.
도 28a~도 28h는 다양한 pH 수준에서 YTEKF 벤치마크와 비교하여 예시적인 FcRn 길항제(YDQY, YEWY, YEQY, YDQF, YDWY, YTWY, YDWF, YDTY, MDWY, 및 YTTY)의 인간 FcRn 결합 동역학을 보여준다. 도 28a는 WT(파선) 및 YTEKF(점선)와 비교하여 pH 6.0에서 hFcRn으로부터의 오프 속도가 유의하게 개선된 FcRn 길항제(실선)의 정규화된 센서그램을 보여준다. 도 28b는 pH 7.4에서의 hFcRn 결합에 대한 센서그램을 보여주며, 이는 YTEKF 및 WT(결합 없음)와 비교하여 FcRn 길항제에 있어서의 상승된 pH에서의 유의한 결합을 입증한다. 도 28c는 pH 7.4에서의 센서그램의 정규화를 나타내며, 이는 YTEKF와 비교하여 FcRn 길항제에 대한 유의한 오프 속도를 입증한다. 도 28d는 pH 8.0에서의 hFcRn 결합에 대한 센서그램을 보여주며, 이는 YTEKF 및 WT(결합 없음)와 비교하여 FcRn 길항제에 있어서의 생리학적 조건보다 더 큰 pH에서의 유의한 결합을 입증한다. 도 28e는 pH 8.0에서의 센서그램의 정규화를 보여주며, 이는 FcRn 길항제 및 YTEKF에 대한 측정가능한 오프 속도 및 친화도를 입증한다. 도 28f는 pH 9.0이 FcRn 길항제 변이체의 hFcRn 결합을 유의하게 손상시키기에 충분하고 이 pH에서 WT 결합과 유사함을 보여준다. 도 28g는 pH 6.0(흑색), 7.4(회색) 및 8.0(연한 회색)에서의 FcRn 길항제, YTEKF(오픈 사각형) 및 WT(단지 pH 6.0)의 hFcRn 결합 친화도의 등가친화도(isoaffinity) 플롯을 보여준다. 다수의 변이체는 모든 pH에서 YTEKF보다 더 큰 hFcRn 결합 친화도를 보유하였다. 도 28h는 pH의 함수로서의 FcRn 길항제의 결합 친화도를 보여주고, pH 단위당 hFcRn 결합 친화도의 감소 정도를 나타낸다.
도 29a~29h는 다양한 pH 수준에서 YTEKF 벤치마크와 비교한 도 28a~도 28h에서 테스트된 FcRn 길항제의 시노 FcRn(cFcRn) 결합 동역학을 보여준다. 도 29a는 WT(파선) 및 YTEKF(점선)와 비교하여 pH 6.0에서 cFcRn으로부터의 오프 속도의 유의한 개선을 보여주는 FcRn 길항제(실선)의 정규화된 센서그램을 보여준다. 도 29b는 pH 7.4에서의 cFcRn 결합에 대한 센서그램을 보여주며, 이는 YTEKF 및 WT(결합 없음)와 비교하여 FcRn 길항제에 있어서의 상승된 pH에서의 유의한 결합을 보여준다. 도 29c는 pH 7.4에서의 센서그램의 정규화를 나타내며, 이는 YTEKF와 비교하여 FcRn 길항제에 대한 유의한 오프 속도를 입증한다. 도 29d는 pH 8.0에서의 hFcRn 결합에 대한 센서그램을 보여주며, 이는 YTEKF 및 WT(결합 없음)와 비교하여 FcRn 길항제에 있어서의 생리학적 조건보다 더 큰 pH에서의 유의한 결합을 보여준다. 도 29e는 FcRn 길항제 및 YTEKF에 대한 측정가능한 오프 속도 및 친화도를 보여주는 pH 8.0에서의 센서그램의 정규화를 보여준다. 도 29f는 pH 9.0이 FcRn 길항제의 cFcRn 결합을 유의하게 손상시키기에 충분하고 이 pH에서 WT 결합과 유사함을 보여준다. 도 29g는 pH 6.0(흑색), 7.4(회색) 및 8.0(연한 회색)에서의 FcRn 길항제, YTEKF(오픈 사각형) 및 WT(단지 pH 6.0)의 cFcRn 결합 친화도의 등가친화도 플롯을 보여준다. 다수의 변이체는 모든 pH에서 YTEKF보다 더 큰 cFcRn 결합 친화도를 보유하였다. 도 29h는 pH의 함수로서의 FcRn 길항제의 결합 친화도를 보여주고, pH 단위당 cFcRn 결합 친화도의 감소 정도를 나타낸다.
도 30a~30c는 표시된 용량의 YDQY 또는 YTEKF hIgG1 변이체 후 시간 경과에 따른 트레이서(WT) hIgG 농도를 보여주는 그래프이다. 도 30a는 모든 군에 있어서의 제거 프로파일을 보여준다. 도 30b는 단지 군 2(대조군) 및 군 6에 대한 프로파일을 보여준다. 도 30c는 군 2(대조군), 군 4(YDQY hIgG1), 및 군 7(YTEKF hIgG1)에 대한 프로파일을 보여준다.
도 31a 및 도 31b는 표시된 용량으로 마우스에 투여한 후 시간 경과에 따른 YDQY hIgG1 변이체(도 31a) 또는 YTEKF hIgG1 변이체(도 31b)의 단백질 농도를 보여주는 그래프이다.
도 32는 잔기 231~447(Eu 넘버링)로부터의 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역의 서열 정렬을 보여준다. 본원에 기술된 FcRn 돌연변이 유발 위치(M252, T256, T307, 및 N434)는 4개의 모든 하위클래스에서 보존된다.
도 33은 다중 pH 조건 하에 FcRn-결합 Fc 변이체의 시험관 내 인간 FcRn 결합 특성화 파라미터를 보여준다. 각각의 변이체에 있어서, WT 서열(M252/T256/T307/N434; MTTN)에 대한 치환 돌연변이는 볼드체 및 밑줄로 표시된다(예를 들어, MDWY는 T256D, T307W 및 N434Y 돌연변이를 갖는 변이체를 나타냄).
도 34는 다중 pH 조건 하에 FcRn-결합 Fc 변이체의 시험관 내 시노 결합 특성화 파라미터를 보여준다.
본 발명은 변경된 FcRn 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드(예를 들어, 단클론 항체 또는 이의 단편)를 제공한다. 이들 폴리펩티드는 산성 및 비산성 조건 둘 다에서 야생형 IgG(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) Fc 도메인과 비교하여 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖는 변형 IgG Fc 도메인을 함유한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 IgG Fc 도메인과는 달리 pH 의존성이 덜한 방식으로 FcRn에 결합한다. 이들 폴리펩티드는 상이한 pH 조건을 갖는 세포 표면과 세포질 사이를 FcRn이 트래피킹함에 따라 FcRn에 결합된 채로 남아 있다. 그 결과, 야생형(더 낮은) FcRn 결합 친화도를 갖는 다른 IgG 분자(예를 들어, 혈청 IgG)는 FcRn에 대한 결합이 차단되고 분해를 위한 리소좀 경로 내로 증가된 속도로 향하게 되며, 이는 신체로부터의 IgG 분자의 더 빠른 제거를 초래한다.
본 발명의 폴리펩티드는, IgG 재순환을 매개하고 혈청 IgG 수준을 유지하는 FcRn의 정상적인 기능을 방해하기 때문에, "FcRn 길항제"로 칭해진다. 본 발명의 FcRn 길항제는 항체, 면역어드헤신(immunoadhesin) 또는 또 다른 형태의 Fc 융합 단백질, 또는 이의 Fc 단편 또는 부분일 수 있다. FcRn 길항제는 예를 들어, 단량체성 단백질 또는 이량체성(헤테로- 또는 호모-이량체성) 단백질일 수 있다. FcRn 길항제는 신체로부터의 혈청 IgG 제거를 향상시키기 때문에 IgG-매개 질환 또는 장애(예를 들어, 자가면역 질환)를 앓고 있는 환자를 치료하거나 원하지 않는 IgG(예를 들어, 더 이상 필요하지 않거나 유익하지 않은 치료 또는 진단 항체)를 신체로부터 제거하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 기술된 방법은 본원에 개시된 특정 방법 및 실험 조건이 변할 수 있으므로 이러한 방법 및 조건에 한정되지 않음이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어가 오직 특정 실시 형태를 기술할 목적이고, 제한하고자 하는 것이 아님이 또한 이해되어야 한다.
또한, 본원에 기술된 실험은, 달리 지시되지 않는 한, 본 기술 분야의 기술 내의 통상적인 분자 및 세포 생물학 및 면역학 기술을 사용한다. 이러한 기술은 숙련된 작업자에게 잘 알려져 있으며 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008)(모든 증보판 포함)], 문헌[Green et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition); Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition)]을 참조한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 임의의 잠재적인 모호성이 있는 경우 본원에 제공된 정의가 임의의 사전 또는 외부 정의보다 우선한다. 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함하는"과, "포함하다" 및 "포함하였다"와 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 용어 "갖는다" 및 "포함하다", 또는 "갖다", "갖는", "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수군을 포함하되, 임의의 기타 정수 또는 정수군을 배제하지 않는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용된다. 본원에 제공된 방법 및 기술은 일반적으로, 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이, 그리고 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 사양서에 따라 수행되거나, 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 본원에서 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 이용되는 명명법 및 이들의 실험실 절차 및 기술은 당업계에서 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 것들이다. 화학 합성, 화학 분석, 제약 제제, 제형화 및 전달 및 환자의 치료를 위해 표준 기술이 사용된다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 선택된 용어들이 하기에 정의된다.
용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 임의의 중합체 사슬을 지칭하고 문맥상 달리 모순되지 않는 한 천연 또는 인공 단백질, 폴리펩티드 유사체 또는 단백질 서열의 변이체, 또는 이들의 단편을 포함한다. 폴리펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있으며; 즉, 상기 용어는 하나 이상의 공유 커플링된 또는 비공유 커플링된 폴리펩티드 사슬을 갖는 단백질을 포함한다. 폴리펩티드 단편은 예를 들어 약 5개 이상의 연속 아미노산, 약 10개 이상의 연속 아미노산, 약 15개 이상의 연속 아미노산, 또는 약 20개 이상의 연속 아미노산을 포함한다.
용어 "단리된 단백질", 또는 "단리된 폴리펩티드"는 이의 기원 또는 유래 원천으로 인해, 이의 원상태에서 수반되는 자연적으로 연관된 성분과 연관되지 않거나; 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 실질적으로 없거나; 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나; 자연에서 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 자연적으로 유래되는 세포와 상이한 세포계에서 합성되는 단백질 또는 폴리펩티드는 이의 자연적으로 연관된 성분으로부터 "단리될" 것이다. 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 당업계에 널리 알려진 단백질 정제 기술을 사용하여 단리에 의해 자연적으로 연관된 성분이 실질적으로 없도록 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합 단백질" 또는 "결합 폴리펩티드"는 관심 표적 항원(예를 들어, 인간 표적 항원)에 선택적으로 결합하는 것을 담당하는 적어도 하나의 결합 부위를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 면역어드헤신)를 지칭한다. 예시적 결합 부위는 항체 가변 도메인, 수용체의 리간드 결합 부위, 또는 리간드의 수용체 결합 부위를 포함한다. 특정 양태에서, 결합 단백질 또는 결합 폴리펩티드는 다수의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 또는 그 초과의) 결합 부위를 포함한다. 특정 양태에서, 결합 단백질 또는 결합 폴리펩티드는 치료 효소가 아니다.
용어 "리간드"는 다른 물질에 결합할 수 있거나 결합될 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 이와 유사하게, 용어 "항원"은 항체가 생성될 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. "항원"은 일반적으로 항체 결합 기질과 관련하여 사용되며 "리간드"는 수용체 결합 기질을 언급할 때 종종 사용되지만, 이러한 용어는 서로 구별되지 않으며 넓은 범위의 중첩 화학 엔티티를 포함한다. 의심의 여지를 피하기 위해, 항원 및 리간드는 본원 전반에 걸쳐 상호교환가능하게 사용된다. 항원/리간드는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 압타머, 다당류, 당 분자, 탄수화물, 지질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 합성 분자, 무기 분자, 유기 분자 및 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하다"는 최대 약 1 x 10-6 M, 약 1 x 10-7 M, 약 1 x 10-8 M, 약 1 x 10-9 M, 약 1 x 10-10 M, 약 1 x 10-11 M, 약 1 x 10-12 M, 또는 그 미만의 해리 상수(Kd)로 항원에 결합하고/하거나, 비특이적 항원에 대한 친화성보다 적어도 약 2배 더 큰 친화성으로 항원에 결합하는 항체 또는 면역어드헤신의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 관심 항원에 대해 유의한 공지된 특이적 면역반응 활성을 갖는 그러한 조립체(assembly)(예를 들어, 온전한 항체 분자, 면역어드헤신, 또는 이의 변이체)를 지칭한다. 항체 및 면역글로불린은 경쇄와 중쇄 사이에 사슬간 공유 결합을 갖거나 갖지 않는 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 척추동물계에서의 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다.
하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 일반 용어 "항체"는 생화학적으로 구별될 수 있는 항체의 5가지의 별개의 클래스를 포함한다. 항체의 모든 5가지의 클래스는 본 발명의 범주 내에 명백히 속하지만, 본원에서의 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 관한 것이다. IgG와 관련하여, 면역글로불린은 분자량이 약 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄 및 분자량이 53,000~70,000인 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 상기 4개의 사슬은 "Y" 구성으로 디술피드 결합에 의해 연결되며, 여기서, 경쇄는 중쇄를 브라켓하고(bracket) 이는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속된다.
면역글로불린의 경쇄는 카파(κ) 또는 람다(λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 2개의 중쇄의 "테일" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포, 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우 공유 디술피드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 구성의 포크형(forked) 말단의 N-말단으로부터 각각의 사슬의 하부의 C-말단으로 진행한다. 당업자는 중쇄가 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 또는 엡실론(ε)으로 분류되며, 이때 일부 하위클래스(예를 들어, γ1~γ4)가 이들 중에 있음을 인지할 것이다. 각각 IgG, IgM, IgA, IgG, 또는 IgE로 항체의 "클래스" 또는 이소타입을 결정하는 것이 이 사슬의 특성이다. 면역글로불린 이소타입 하위클래스 또는 하위타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등)은 잘 특성화되어 있으며, 기능적 전문화를 제공하는 것으로 공지되어 있다. 이들 클래스 및 이소타입 각각의 변형된 버전은 본 발명의 개시 내용에 비추어 당업자가 용이하게 식별할 수 있으며, 따라서, 본 발명의 범주 내에 있다.
경쇄 및 중쇄 둘 모두는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나누어진다. 용어 "영역"은 면역글로불린 또는 항체 사슬의 부분 또는 일부를 지칭하며, 불변 영역 또는 가변 영역과, 상기 영역의 더욱 개별적인 부분 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역은 본원에서 정의되는 바와 같이, "프레임워크 영역" 또는 "FR" 사이에 산재된 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"을 포함한다.
면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 영역은 "불변 영역"의 경우에 다양한 클래스의 구성원의 영역 내의 서열 변화의 상대적 결여를 기반으로 하여, 또는 "가변 영역"의 경우에 다양한 클래스의 구성원의 영역 내의 유의한 변화를 기반으로 하여 "불변"(C) 영역 또는 "가변"(V) 영역으로 정의될 수 있다. 용어 "불변 영역" 및 "가변 영역"은 또한 기능적으로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 면역글로불린 또는 항체의 가변 영역이 항원 인식 및 특이성을 결정함이 인지될 것이다. 역으로, 면역글로불린 또는 항체의 불변 영역은 중요한 이펙터 기능, 예를 들어, 분비, 태반경유 이동, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 제공한다. 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 구성이 잘 알려져 있다.
면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 및 가변 영역은 도메인으로 폴딩된다. 용어 "도메인"은, 예를 들어, β-플리티드 시트(β-pleated sheet) 및/또는 사슬내 디술피드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프를 포함하는(예를 들어, 3 내지 4개의 펩티드 루프를 포함하는) 중쇄 또는 경쇄의 구상 영역을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 상의 불변 영역 도메인은 "경쇄 불변 영역 도메인", "CL 영역" 또는 "CL 도메인"으로 상호교환가능하게 지칭된다. 중쇄 상의 불변 도메인(예를 들어, 힌지, CH1, CH2 또는 CH3 도메인)은 "중쇄 불변 영역 도메인", "CH" 영역 도메인 또는 "CH 도메인"으로 상호교환가능하게 지칭된다. 경쇄 상의 가변 도메인은 "경쇄 가변 영역 도메인", "경쇄 가변 영역", "VL 영역 도메인" 또는 "VL 도메인"으로 상호교환가능하게 지칭된다. 중쇄 상의 가변 도메인은 "중쇄 가변 영역 도메인", "중쇄 가변 영역", "VH 영역 도메인" 또는 "VH 도메인"으로 상호교환가능하게 지칭된다.
관례적으로, 가변 불변 영역 도메인의 아미노산의 넘버링은 이들이 면역글로불린 또는 항체의 아미노-말단 또는 항원 결합 부위로부터 더 멀어질수록 증가한다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 각각의 N-말단은 가변 영역이고 C-말단은 불변 영역이다. CH3 및 CL 도메인은 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다. 따라서, 경쇄 면역글로불린의 도메인은 VL-CL 배향으로 배열되는 반면, 중쇄의 도메인은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3 배향으로 배열된다.
각각의 가변 영역 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)]의 정의에 따른다. Kabat는 또한 상이한 중쇄 가변 영역들 사이 또는 상이한 경쇄 가변 영역들 사이의 상응하는 잔기에 동일한 번호가 할당되는 널리 사용되는 넘버링 규칙(Kabat 넘버링)을 제공한다. VL 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본원에서 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 또는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 지칭된다. VH 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본원에서 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 지칭된다. 명시되는 경우, CDR의 할당은 Kabat 대신에 IMGT®(문헌[Lefranc et al., Dev Comp Immunol. (2003) 27:55-77)]에 따를 수 있다. 중쇄 불변 영역의 넘버링은 Kabat의 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991]에 기재된 바와 같이 Eu 인덱스를 통해 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고, 용어 "VL 도메인"은 면역글로불린 경쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CH1 도메인"은, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템에서 대략 위치 114~223(Eu 위치 118~215)에 걸쳐 있는 면역글로불린 중쇄의 첫 번째(아미노 최말단)의 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하여 있고, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단에 있으며, 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 부분을 형성하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결시키는 중쇄 분자의 일부를 포함한다. 힌지 영역은 약 25개의 잔기를 포함하고, 가요성이어서, 2개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 움직이는 것을 가능케 한다. 힌지 영역은 다음의 3개의 고유한 도메인으로 세분될 수 있다: 상부, 중간 및 하부 힌지 도메인(문헌[Roux et al., J. Immunol. (1998) 161:4083]).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CH2 도메인"은, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템에서 대략 위치 244~360(Eu 위치 231~340)에 걸쳐 있는 중쇄 면역글로불린 분자의 일부를 포함한다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-결합된 분지형 탄수화물 사슬은 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 삽입되어 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 IgG1 분자(예를 들어, 인간 IgG1 분자)로부터 유래된 CH2 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CH3 도메인"은, CH2 도메인의 N-말단으로부터의, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템의 대략 위치 361~476(Eu 위치 341~447)으로부터의 약 110개의 잔기에 걸쳐 있는 중쇄 면역글로불린 분자의 일부를 포함한다. CH3 도메인은 전형적으로 항체의 C-말단 일부를 형성한다. 그러나, 일부 면역글로불린에서, 추가 도메인이 CH3 도메인으로부터 연장되어 이 분자의 C-말단 일부(예를 들어, IgM의 μ 사슬 및 IgE의 ε 사슬 내 CH4 도메인)를 형성할 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 IgG1 분자(예를 들어, 인간 IgG1 분자)로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CL 도메인"은, 예를 들어, 대략 Kabat 위치 107A 내지 대략 Kabat 위치 216에 걸쳐 있는 면역글로불린 경쇄의 불변 영역 도메인을 포함한다. CL 도메인은 VL 도메인에 인접하여 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 카파 경쇄(예를 들어, 인간 카파 경쇄)로부터 유래된 CL 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FcRn 길항제"는 Fc 영역을 통해 FcRn에 특이적으로 결합하고 FcRn에 대한 면역글로불린의 결합을 억제하는 Fc 영역(예를 들어, 본원에 개시된 변이형 Fc 영역)을 포함하는 임의의 약제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc", "Fc 도메인", "Fc 영역", 또는 "Fc 단편"은 상호교환가능하게 사용되며, 파파인 절단 부위(즉, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기를 114로 간주했을 때의 IgG 내의 잔기 216)의 바로 N-말단의 힌지 영역에서 시작하여 중쇄의 C-말단에서 종료되는 중쇄 불변 영역의 일부로 정의된다. 따라서, 완전한 Fc, Fc 도메인, Fc 영역 또는 Fc 단편은 적어도 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 예시적인 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 Fc 도메인의 부분(CH2 및 CH3 도메인, 잔기 231 내지 447, Eu 넘버링)의 서열 정렬이 도 32에 도시되어 있다. 이 용어는 본원에 기술된 천연/야생형 Fc 및 Fc 변이체를 포괄하며, 전체 항체로부터 분해되었거나 재조합 기술과 같은 다른 수단에 의해 생성된 것인, 단량체 또는 다량체(예를 들어, 이량체) 형태의 분자를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Ying et al., JBC (2013) 288:25154-164]; 및 문헌[Yang et al., JBC (2019) 294:10638-48]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 변형된 Fc는 도 32에 예시된 서열 번호 1, 2, 3, 또는 4의 FcRn 결합 부분 또는 전체(또는 이의 천연 발생 변이체)를 포함하며, 여기서, 상기 서열은 본원에 기술된 아미노산 치환을 포함하도록 변형되었다.
천연 Fc의 원래의 면역글로불린 공급원은 전형적으로 인간 기원이며, 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG1 및 IgG2일 수 있다. 천연 Fc 분자는 공유(즉, 디술피드 결합) 및 비-공유 회합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩티드로 구성된다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 디술피드 결합의 수는 클래스(예를 들어, IgG, IgA, 및 IgE) 또는 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, 및 IgA2)에 따라 1 내지 4개의 범위이다. 천연 Fc의 한 예로는 IgG의 파파인 분해로부터 발생하는 디술피드-결합된 이량체가 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "천연 Fc"는 단량체, 이량체, 및 다량체 형태의 총칭이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 변이체", "변형된 Fc", 또는 "변형된 Fc 도메인"은 천연/야생형 Fc로부터 변형되었지만 FcRn에 대한 결합 부위를 여전히 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. Fc 변이체 또는 변형된 Fc 도메인은 또한 천연 Fc보다 짧거나 길 수 있고(예를 들어, 인간 IgG의 잔기 216 내지 447(Eu 넘버링)에 걸쳐 있는 서열보다 짧거나 길 수 있음); 예를 들어, Fc 변이체 또는 변형된 Fc는 천연 Fc의 특정 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 잔기가 결여될 수 있거나, 또는 천연 Fc와 비교하여 N-말단 및/또는 C-말단에 추가 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 변형된 Fc 도메인 그 자체는 항체 또는 항체 변이체의 항원 결합 도메인, 또는 면역어드헤신의 표적 결합 도메인을 포함하지 않지만, 변형된 Fc 도메인은 비-FcRn 표적에도 결합하는 FcRn 길항제를 형성하도록 하는 도메인에 연결될 수 있다. 상기 용어는 비-인간 천연 Fc 유래의 인간화된 분자 또는 서열을 포함한다. 또한, 천연 Fc는 제거될 수 있는 영역을 포함하는데, 이는 상기 영역이 본원에 기술된 FcRn 길항제(예를 들어, 항체-유사 결합 폴리펩티드)에 필요하지 않은 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문이다. 따라서, 상기 용어는 하나 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기가 결여되어 있거나 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형된 분자 또는 서열을 포함하고, 이는 (1) 디술피드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 불상용성, (3) 선택된 숙주 세포에서의 발현시의 N-말단 이종성(heterogeneity), (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 샐비지(salvage) 수용체 이외의 Fc 수용체(FcγR)에 대한 결합, 또는 (7) 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC)에 영향을 미치거나 이들에 관여한다.
상기 나타낸 바와 같이, 항체의 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 것을 가능케 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인은 조합되어 3차원 항원 결합 부위를 규정하는 가변 영역(Fv)을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각각의 아암(arm) 말단에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 더욱 구체적으로, 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각 상의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 규정된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 부위"는 항원(예를 들어, 세포 표면 또는 가용성 항원)에 특이적으로 결합하는(상기 항원과 면역반응하는) 부위를 포함한다. 항원 결합 부위는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 가변 영역에 의해 형성된 결합 부위는 항체의 특이성을 결정한다. 항원 결합 부위는 항체마다 다양한 가변 영역에 의해 형성된다. 본 발명의 항체와 같은 FcRn-길항 결합 폴리펩티드는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 결합 폴리펩티드와 선택된 항원의 회합을 제공하는 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인은 동일한 면역글로불린 분자로부터 유래될 필요는 없다. 이와 관련하여, 가변 영역은 체액성 반응을 개시시키고, 요망되는 항원에 대한 면역글로불린을 발생시키기 위해 유도될 수 있는 임의의 유형의 동물의 가변 영역일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 이와 같이, 결합 폴리펩티드의 가변 영역은, 예를 들어, 포유동물 기원일 수 있고, 예를 들어, 인간, 쥣과, 래트, 염소, 양, 비-인간 영장류(예컨대 시노몰구스 원숭이, 붉은털 원숭이, 짧은꼬리 원숭이(macaques) 등), 이리, 또는 낙타과(예를 들어, 낙타, 라마 및 관련 종)일 수 있다.
천연 발생 항체에서, 각각의 항체 상에 존재하는 6개의 CDR은 특이적으로 배치되어 항체가 수성 환경에서 이의 3차원 형태를 취함에 따라 항원 결합 부위를 형성하는 짧은 비연속적인 아미노산 서열이다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 나머지는 아미노산 서열에 있어서 덜한 분자간 변동성을 나타내며, 프레임워크 영역으로 언급된다. 프레임워크 영역은 주로 β-시트 형태를 채택하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 이들 프레임워크 영역은 사슬간 비-공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 6개의 CDR의 배치를 제공하는 스캐폴드를 형성시키는 작용을 한다. 상기 배치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 규정한다. 이러한 상보적 표면은 면역반응성 항원 에피토프에 대한 항체의 비-공유 결합을 촉진한다.
예시적 결합 폴리펩티드는 항체 변이체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 변이체"는 항체가 천연 발생이 아니도록 변경된 합성 및 조작 형태의 항체, 예를 들어, 적어도 2개의 중쇄 부분을 포함하지만, 2개의 완전한 중쇄가 아닌 항체(예컨대 도메인 결실된 항체 또는 미니바디(minibody)); 2개 이상의 상이한 항원 또는 단일 항원 상의 상이한 에피토프들에 결합하도록 변경된 다중특이성 형태의 항체(예를 들어, 이중특이성, 삼중특이성 등)); scFv 분자에 연결된 중쇄 분자 등을 포함한다. 또한, 용어 "항체 변이체"는 동일 항원의 3개, 4개 또는 그 초과의 카피에 결합하는 다가 형태의 항체(예를 들어, 3가, 4가 등의 항체)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합가"는 폴리펩티드 내의 잠재적 표적 결합 부위의 수를 지칭한다. 각각의 표적 결합 부위는 하나의 표적 분자 또는 표적 분자 상의 특정 부위에 특이적으로 결합한다. 폴리펩티드가 1개 초과의 표적 결합 부위를 포함하는 경우, 각각의 표적 결합 부위는 동일하거나 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있다(예를 들어, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일 항원 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다). 본 발명의 결합 폴리펩티드는 전형적으로 인간 항원 분자에 특이적인 적어도 하나의 결합 부위를 갖는다.
용어 "특이성"은 제공된 표적 항원(예를 들어, 인간 표적 항원)에 특이적으로 결합하는(예를 들어, 면역반응하는) 능력을 지칭한다. 결합 폴리펩티드는 단일특이적일 수 있고, 표적에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 함유할 수 있거나, 폴리펩티드는 다중특이적일 수 있고, 동일하거나 상이한 표적에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 함유할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 동일 표적의 2개의 상이한(예를 들어, 중첩되지 않는) 부분에 특이적이다. 특정 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 1개 초과의 표적에 특이적이다. 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 예시적 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체)는 당업계에 공지되어 있으며, 상기 항체로부터의 하나 이상의 CDR이 본원에 기술된 항체에 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "표적 항원"은 결합 폴리펩티드의 결합 부위에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 표적 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 약 20% 이내, 예컨대 약 10% 이내, 약 5% 이내, 또는 약 1% 이하 이내를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "투여하다" 또는 "투여"는, 예컨대 폐(예를 들어, 흡입), 점막(예를 들어, 비강내), 피내, 정맥내, 근육내, 피하 전달 및/또는 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해(그러나 이에 한정되지는 않음), 신체 밖에 존재하는 물질(예를 들어, 본원에 제공된 FcRn 길항제)을 환자 내로 주사하는 행위 또는 달리 물리적으로 전달하는 행위를 지칭한다. 질환 또는 이의 증상이 관리 또는 치료 중에 있을 때, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발병 후에 일어난다. 질환 또는 이의 증상이 예방 중인 경우, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발병 전에 일어나며, 만성적으로 계속되어 질환-관련 증상의 출현 또는 크기를 지연 또는 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조성물"은, 선택적으로, 명시된 양으로 특정 성분(예를 들어, 본원에 제공된 FcRn 길항제)을 함유하는 제품뿐만 아니라, 선택적으로, 명시된 양으로 명시된 성분들의 조합으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생기는 임의의 제품을 포함하는 것으로 의도된다.
"유효량"은 의약품(pharmaceutical agent)을 필요로 하는 개체에서 원하는 생리학적 결과를 달성하기에 충분한 활성 의약품(예를 들어, 본 발명의 FcRn 길항제)의 양을 의미한다. 유효량은 치료받는 개체의 건강 및 신체 상태, 조성물의 제형, 개체의 의학적 상태의 평가 및 기타 관련 요인에 따라 개체마다 다를 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체는 포유동물, 예컨대 비영장류(예를 들어, 마우스, 래트, 소, 돼지, 말, 고양이, 개 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간)이다. 바람직한 실시 형태에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료법"은 질환 또는 이와 관련된 증상의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜, 방법 및/또는 약제를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 용어 "치료법"은 대상체의 IgG-매개 질환(예를 들어, 자가면역 반응) 또는 병태 또는 이와 관련된 증상의 조절에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜, 방법 및/또는 약제를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 용어 "치료법들" 및 "치료법"은 당업자, 예컨대 의료인에게 알려져 있는 질환 또는 이와 관련된 증상의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 유용한 생물학적 치료법, 지지 요법 및/또는 다른 치료법을 지칭한다. 다른 실시 형태에서, 용어 "치료법들" 및 "치료법"은 당업자, 예컨대 의료인에게 알려져 있는, 대상체에서의 면역 반응 또는 이와 관련된 증상의 조절에 유용한 생물학적 치료법, 지지 요법 및/또는 다른 치료법을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법제의 투여(하나 이상의 예방제 또는 치료제, 예컨대 본원에 제공된 FcRn 길항제의 투여를 포함하지만, 이에 한정되지 않음)로부터 야기되는, 질환 또는 이와 관련된 증상의 진행, 중증도, 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는"은 또한 치료받는 대상체의 질환 경과를 변경하는 것을 지칭할 수 있다. 치료의 치료 효과는 제한 없이, 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상(들)의 경감, 질환의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함한다.
FcRn 길항제
본 발명의 FcRn 길항제는 변형된 Fc 도메인을 포함하고(이로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 것을 포함), 예를 들어 항체, 항체 변이체 또는 단편, 예컨대 Fc 단편, 면역어드헤신, 및 Fc 융합 단백질일 수 있다. FcRn 길항제는 단량체형 또는 이량체형 Fc 단편을 포함할 수 있다.
임의의 IgG 하위유형으로부터의 Fc 도메인을 사용하여 본 발명의 FcRn을 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 도메인으로부터 유래되고 야생형 기원에 대해 본원에 기술된 치환을 포함한다. 특정한 다른 실시 형태에서, 변형된 Fc는 하나 초과의 IgG 하위유형으로부터 유래된 인공 Fc이다. 다른 실시 형태에서, Fc 도메인은 키메라 힌지(즉, 상이한 항체 이소타입의 힌지 도메인, 예를 들어, IgG4 분자로부터의 상부 힌지 도메인 및 IgG1 중간 힌지 도메인으로부터 유래된 힌지 부분을 포함하는 힌지)를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인으로부터 유래된다. 다른 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 인간 IgG4 Fc 도메인으로부터 유래된다. 다른 하위유형의 Fc 도메인의 경우, 당업자는 본원에 기술된 임의의 아미노산 치환이 그에 따라 수정될 수 있음을 인식할 것이다(도 32 참조). 달리 표시되지 않는 한, 본원에서 언급된 Fc 잔기 위치는 Eu Ig 넘버링 시스템에 따른다. 도 32에 도시된 바와 같이, 인간 IgG CH2 및 CH3 도메인은 4가지의 상이한 하위 유형 중에서 고도로 보존되어 있다. Eu 넘버링 시스템은 모든 하위유형에 적용된다.
일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252, I253, S254, T256, K288, T307, K322, E380, L432, N434, 또는 Y436, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252, I253, S254, T256, K288, T307, K322, E380, L432, N434, 및 Y436으로부터 선택되는 임의의 2개의 아미노산 위치에서 이중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252, I253, S254, T256, K288, T307, K322, E380, L432, N434, 및 Y436으로부터 선택되는 임의의 3개의 아미노산 위치에서 삼중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252, I253, S254, T256, K288, T307, K322, E380, L432, N434, 및 Y436으로부터 선택되는 임의의 4개의 아미노산 위치에서 사중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252, I253, S254, T256, K288, T307, K322, E380, L432, 또는 Y436, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 임의의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 치환되지 않는다(즉, 아미노산 위치 N434는 야생형임).
일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252Y(즉, 아미노산 위치 252의 티로신), T256D, T256E, K288D, K288N, T307A, T307E, T307F, T307M, T307Q, T307W, E380C, N434F, N434P, N434Y, Y436H, Y436N, 또는 Y436W, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252(여기서, 치환은 M252Y임); T256(여기서, 치환은 T256D, 또는 T256E임); K288(여기서, 치환은 K288D, 또는 K288N임); T307(여기서, 치환은 T307A, T307E, T307F, T307M, T307Q, 또는 T307W임); E380(여기서, 치환은 E380C임); N434(여기서, 치환은 N434F, N434P, 또는 N434Y임); Y436(여기서, 치환은 Y436H, Y436N, 또는 Y436W임)으로부터 선택되는 이중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252(여기서, 치환은 M252Y임); T256(여기서, 치환은 T256D, 또는 T256E임); K288(여기서, 치환은 K288D, 또는 K288N임); T307(여기서, 치환은 T307A, T307E, T307F, T307M, T307Q, 또는 T307W임); E380(여기서, 치환은 E380C임); N434(여기서, 치환은 N434F, N434P, 또는 N434Y임); Y436(여기서, 치환은 Y436H, Y436N, 또는 Y436W임)으로부터 선택되는 삼중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252(여기서, 치환은 M252Y임); T256(여기서, 치환은 T256D, 또는 T256E임); K288(여기서, 치환은 K288D, 또는 K288N임); T307(여기서, 치환은 T307A, T307E, T307F, T307M, T307Q, 또는 T307W임); E380(여기서, 치환은 E380C임); N434(여기서, 치환은 N434F, N434P, 또는 N434Y임); Y436(여기서, 치환은 Y436H, Y436N, 또는 Y436W임)으로부터 선택되는 사중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252Y, T256D, T256E, K288D, K288N, T307A, T307E, T307F, T307M, T307Q, T307W, E380C, Y436H, Y436N, 또는 Y436W, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 임의의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)으로 치환되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252Y, T256D, T256E, K288D, K288N, T307A, T307E, T307F, T307M, T307Q, T307W, E380C, Y436H, Y436N, 또는 Y436W, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 임의의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 티로신(Y)으로 치환되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252Y, T256D, T256E, K288D, K288N, T307A, T307E, T307F, T307M, T307Q, T307W, E380C, Y436H, Y436N, 또는 Y436W, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 임의의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 치환되지 않는다(즉, 아미노산 위치 N434는 야생형임).
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252, T256, T307, 또는 N434, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252, T256, T307, 및 N434로부터 선택되는 임의의 2개의 아미노산 위치에서 이중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252, T256, T307, 및 N434로부터 선택되는 임의의 3개의 아미노산 위치에서 삼중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 아미노산 위치 M252, T256, T307, 및 N434에서 사중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252, T256, 또는 T307, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 치환되지 않는다(즉, 아미노산 위치 N434는 야생형임).
예시적인 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252(여기서, 치환은 M252Y임); T256(여기서, 치환은 T256D, 또는 T256E임); T307(여기서, 치환은 T307Q, 또는 T307W임); 또는 N434(여기서, 치환은 N434F, 또는 N434Y임), 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252(여기서, 치환은 M252Y임); T256(여기서, 치환은 T256D, 또는 T256E임); T307(여기서, 치환은 T307Q, 또는 T307W임); 또는 N434(여기서, 치환은 N434F, 또는 N434Y임)로부터 선택되는 임의의 2개의 아미노산 위치에서 이중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252(여기서, 치환은 M252Y임); T256(여기서, 치환은 T256D, 또는 T256E임); T307(여기서, 치환은 T307Q, 또는 T307W임); 또는 N434(여기서, 치환은 N434F, 또는 N434Y임)로부터 선택되는 임의의 3개의 아미노산 위치에서 삼중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252(여기서, 치환은 M252Y임); T256(여기서, 치환은 T256D, 또는 T256E임); T307(여기서, 치환은 T307Q, 또는 T307W임); 또는 N434(여기서, 치환은 N434F, 또는 N434Y임)로부터 선택되는 아미노산 위치에서 사중 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252Y, T256D, T256E, T307Q, 또는 T307W, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)으로 치환되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252Y, T256D, T256E, T307Q, 또는 T307W, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 티로신(Y)으로 치환되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252Y, T256D, T256E, T307Q, 또는 T307W, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 치환되지 않는다(즉, 아미노산 위치 N434는 야생형임).
특정 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 T256D, 또는 T256E, 및/또는 T307W, 또는 T307Q로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, N434F, 또는 N434Y, 또는 M252Y로부터 선택되는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 T256D, 또는 T256E, 및/또는 T307W, 또는 T307Q로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 치환 M252Y를 추가로 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)으로 치환되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 T256D, 또는 T256E, 및/또는 T307W, 또는 T307Q로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 치환 M252Y를 추가로 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 티로신(Y)으로 치환되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 T256D, 또는 T256E, 및/또는 T307W, 또는 T307Q로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 치환 M252Y를 추가로 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 아미노산 위치 N434는 치환되지 않는다(즉, 아미노산 위치 N434는 야생형임).
일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 도 33에 나타낸 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 Fc 도메인은 이중 아미노산 치환 M252Y/N434Y(YY); 또는 M252Y/T307W/N434Y(YWY), M252Y/T256D/N434Y(YDY), 및 T256D/307W/N434Y(DWY)로부터 선택되는 삼중 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 M252Y/T256D/T307Q/N434F(YDQF), M252Y/T256D/T307W/N434F(YDWF), M252Y/T256D/T307Q/N434Y(YDQY), M252Y/T256E/T307Q/N434Y(YEQY), M252Y/T256D/T307W/N434Y(YDWY), 및 M252Y/T256E/T307W/N434Y(YEWY)로부터 선택되는 사중 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 변형된 Fc 도메인은 본원에 개시된 바와 같은 1개 이상, 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
변형된 Fc는 산성 pH(예를 들어, 약 7.0 미만, 약 6.5 이하, 또는 약 6.0 이하) 및 비-산성 pH(예를 들어, 약 7.0 이상, 또는 약 7.4 이상) 둘 다에서, 그의 야생형 대응물과 비교하여 향상된 FcRn 결합 친화도를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "향상된"은 주어진 파라미터의 10% 증가를 지칭하고, 대조군, 기준선 또는 이전의 값에 비해 적어도 20% 증가, 30% 증가, 40% 증가, 50% 증가, 60% 증가, 70% 증가, 80% 증가, 90% 증가, 95% 증가, 97% 증가, 99% 또는 심지어 100% 증가를 포함할 수 있다. 용어 "향상된"은 대조군, 기준선, 또는 이전의 값에 비해 주어진 파라미터의 적어도 1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 50배, 100배, 1000배 증가를 지칭할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 용어 "향상된"은 야생형 표준, 예를 들어 야생형 Fc 도메인에 대한 증가를 지칭한다. 다른 실시 형태에서, 용어 "향상된"은 FcRn 길항제, 예를 들어 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F를 포함하는 FcRn 길항제("YTEKF hIgG1"; 예를 들어, Swiercz 등의 상기 문헌 참조)에 대한 증가를 지칭한다.
일부 실시 형태에서, FcRn 길항제는 종-특이적 FcRn 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 일부 실시 형태에서, FcRn 길항제는 인간 및 시노 FcRn 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 일 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 래트 및/또는 마우스 FcRn 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 일부 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 종간 교차 FcRn 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 이러한 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 상이한 종에 걸쳐 교차 반응성이라고 한다. 일 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 인간 및 래트 FcRn 결합 친화성 둘 다를 나타낼 수 있다.
신생 Fc 수용체(FcRn)는 항체의 Fc 영역과 상호작용하여 정상적인 리소좀 분해로부터의 구조를 통한 재순환을 촉진한다. 이 과정은 산성 pH(예를 들어, pH 6.5 미만)에서 엔도솜에서 발생하지만 혈류의 생리학적 pH 조건(예를 들어, 비-산성 pH) 하에서는 발생하지 않는 pH 의존적 과정이다. 본 발명의 FcRn 길항제는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 산성 및 비-산성 조건 둘 다에서 향상된 FcRn 결합 친화도 또는 더 느린 FcRn 오프 속도를 갖는다. 산성 pH는 약 7.0 미만의 pH, 예를 들어, 대략 pH 6.5, 대략 pH 6.0, 대략 pH 5.5, 대략 pH 5.0이다. 상승된 비-산성 pH는 약 7 이상의 pH. 예컨대 대략 pH 7.4, 대략 pH 7.6, 대략 pH 7.8, 대략 pH 8.0, 대략 pH 8.5 또는 대략 pH 9.0이다. 특정 실시 형태에서, 본원에 기술된 변형된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 FcRn 결합에서의 pH 의존성의 손실을 나타내고; 즉, 야생형 Fc와 달리 이 폴리펩티드는 산성 조건과 비교하여 비-산성 조건 하에서 FcRn에 대한 결합 친화도가 현저히 더 낮은 것이 아니다. 따라서 이러한 폴리펩티드는 순환계로부터 야생형 FcRn 결합 특성을 갖는 IgG를 제거하는 것을 촉진하기 위한 FcRn 길항제로서 유용하며, 그 이유는 FcRn 길항제가 pH 비의존적 방식으로 또는 pH에 덜 의존적인 방식으로 FcRn에 긴밀하게 결합함으로써 야생형(즉, 더 낮은) FcRn 결합 친화도를 갖는 IgG의 FcRn-매개 재순환을 방해하기 때문이다.
면역글로불린의 Fc 도메인은 비-항원 결합 기능에 관여하고 Fc 수용체에 대한 결합, 예를 들어 FcRn의 결합에 의해 매개되는 여러 이펙터 기능을 갖는다. 도 1의 A에 도시된 바와 같이, Fc 도메인은 CH2 도메인과 CH3 도메인으로 구성된다. FcRn과의 상호작용에 관여하는 Fc 잔기의 대다수는 CH2-CH3 경계면(도 1의 A, 점선)에 직접적으로 인접하고 글리코실화 부위 반대편에 있는 루프에 위치한다. 도 1의 B는 IgG1 Fc 결정 구조(pdb: 5d4q)의 표면 표현을 예시하고 FcRn 결합 경계면을 포함하는 CH2 및 CH3 도메인의 잔기를 보여준다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 FcRn 길항제는 상응하는 야생형, 예를 들어 야생형 Fc 도메인을 갖는 것을 제외하고는 상기 FcRn 길항제와 동일한 구조를 갖는 분자와 비교하여 Fc 도메인의 이펙터 기능(예를 들어, ADCC 또는 CDC 기능)을 변경하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이(예를 들어, 치환)를 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 항체 FcRn 길항제에 있어서, 이의 상응하는 야생형 분자는 대략적으로 동일한 면역원성의 항체를 비롯하여 전체의 변경되지 않은 항체일 수 있다. 예를 들어, ADCC 및/또는 CDC 이펙터 기능이 감소된 FcRn 길항제(예를 들어, LALA 돌연변이를 포함하는 것)는 환자에게 투여될 때 원하지 않는 부작용을 야기할 가능성이 더 적을 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 FcRn 길항제는 상응하는 야생형 분자와 비교하여 FcRn 길항제의 순환 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이(예를 들어, 치환)를 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 혈청 반감기의 감소는 FcRn 길항제가 장기간 환자의 체내에 존재하는 것을 원하지 않을 경우 유리할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 FcRn 길항제는 하나 이상의 원하는 생화학적 특성, 예컨대 단량체를 유지하는 능력, 비공유적으로 이량체화하는 능력, 증가된 표적 부위에서의 국소화 능력, 및 글리코실화 패턴(상응하는 야생형 분자와 비교하여)을 제공하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 치환)를 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 Fc 도메인은 감소된 글리코실화(예를 들어, N- 또는 O-결합 글리코실화)를 가질 수 있다. 감소되거나 변경된 글리코실화를 부여하는 예시적인 아미노산 치환은 PCT 국제 공개 번호 WO 2005/018572에 개시되어 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 도메인은 글리코실화를 제거하도록 변형된다(예를 들어, "agly" 항체). "agly" FcRn 길항제는 생체 내에서 개선된 안전성 및 안정성 프로파일을 가질 수 있다. "agly" 항체 또는 변경된 글리칸을 갖는 항체를 제조하기 위해 당업계에서 인정된 많은 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 변형된 글리코실화 경로(예를 들어, 글리코실-트랜스퍼라아제 결실)를 갖는 유전자 조작 숙주 세포(예를 들어, 변형된 효모, 예를 들어 피키아(Picchia) 또는 CHO 세포)를 사용하여 이러한 항체를 생성할 수 있다.
특정 실시 형태에서, Fc 도메인은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 이펙터 기능을 감소시키도록 돌연변이될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원의 변형된 Fc는 또한 Fc-감마 수용체(FcγR)에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는다. FcγR은 여러 구성원, 예를 들어 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb를 포함하는 패밀리에 속한다. 일부 실시 형태에서, 본원의 변형된 Fc는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 향상된 FcRn 결합 친화성을 갖는 한편 감소된 FcγRIIIa 결합 친화성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, FcRn 길항제는 항체이다. 적합한 항체는 제한 없이 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체를 포함하고, 전장 항체 또는 단쇄 항체일 수 있다. 항체는 질환 상태와 관련된 가용성 표적(예를 들어, 사이토카인 및 분비형 순환 단백질)을 표적화할 수 있다.
열역학적 안정성이 낮은 항체를 포함한 단백질은 미스폴딩 및 응집 경향이 증가하고 유용한 치료제로서의 단백질의 활성, 효능 및 잠재력을 제한하거나 방해한다. 특정 실시 형태에서, FcRn 길항제는 삼중 아미노산 치환 M252Y/S254T/T256E(YTE)를 갖는 변형된 Fc 도메인 또는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 대략 동일하거나 비견되는 열 안정성을 갖는다.
변형의 결과적인 생리학적 프로파일, 생체이용성 및 다른 생화학적 효과, 예컨대 국소화, 생체분포, 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 잘 알려진 면역학적 기술들을 사용하여 쉽게 측정되고 정량화될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 FcRn 길항제는 단리된 결합 폴리펩티드이고, 항체로부터 유래된 항원-결합 단편이 변형 Fc 도메인에 융합된 것을 포함한다. 용어 "항원-결합 단편"은 항원에 결합하거나, 항원 결합(즉, 특이적 결합)에 대해 온전한 항체(즉, 항원-결합 단편이 유래되는 온전한 항체)와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 지칭한다.
일부 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 본원의 변형된 Fc에 융합된 단쇄 가변 영역 서열(ScFv)을 포함한다. 단쇄 가변 영역 서열은 하나 이상의 항원 결합 부위, 예를 들어, 가요성 링커에 의해 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 갖는 단일 폴리펩티드를 포함한다. ScFv 분자는 VH-링커-VL 배향 또는 VL-링커-VH 배향으로 구축될 수 있다. 항원 결합 부위를 구성하는 VL 및 VH 도메인을 연결시키는 가요성 힌지는 약 10 내지 약 50개의 아미노산 잔기를 포함한다. 연결 펩티드는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 항체를 코딩하는 DNA 서열과 ScFv 분자(예를 들어, 변경된 ScFv 분자)를 융합시킴으로써 생성되는 다가(예를 들어, 4가) 항체이다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 이들 서열은 ScFv 분자(예를 들어, 변경된 ScFv 분자)가 이의 N-말단 또는 C-말단에서 가요성 링커(예를 들어, gly/ser 링커)를 통해 항체의 Fc 단편에 연결되도록 조합된다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 4가 항체는 ScFv 분자를 연결 펩티드에 융합시킴으로써 제조될 수 있는데, 이는 변형된 Fc 도메인에 융합되어 ScFv-Fab 4가 분자를 구축한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 변경된 미니바디이다. 본 발명의 변경된 미니바디는 연결 펩티드를 통해 변형 Fc 도메인에 융합된 ScFv 분자를 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 이량체 분자이다. 미니바디는 당업계에 기술된 방법을 사용하여 ScFv 구성요소를 구축하고 펩티드 구성요소들을 연결함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 5,837,821 또는 WO 94/09817 참조). 또 다른 실시 형태에서, 4가 미니바디가 구축될 수 있다. 4가 미니바디는 2개의 ScFv 분자가 가요성 링커를 이용하여 연결되는 것을 제외하고는 미니바디와 동일한 방식으로 구축될 수 있다. 그 후, 연결된 scFv-scFv 구축물은 변형된 Fc 도메인에 연결된다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 디아바디(diabody)를 포함한다. 디아바디는 이량체형 4가 분자로서, 각각 scFv 분자와 유사한 폴리펩티드를 갖지만, 보통 양 가변 도메인을 연결시키는 짧은(10개 미만, 예를 들어 약 1 내지 약 5개) 아미노산 잔기의 링커를 가져, 동일 폴리펩티드 사슬 상의 VL 및 VH 도메인이 상호작용할 수 없는 이량체형 4가 분자이다. 대신, 하나의 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 VH 및 VL 도메인과 (각각) 상호작용한다(예를 들어, WO 02/02781 참조). 본 발명의 디아바디는 변형된 Fc 도메인에 융합된 scFv-유사 분자를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 동일 폴리펩티드 사슬 상에 하나 이상의 가변 도메인을 연속하여 포함하는 다중특이성 또는 다가 항체, 예를 들어, 탠덤 가변 도메인(tandem variable domain; TVD) 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 TVD 폴리펩티드는 미국 특허 제5,989,830호에 기술된 "이중 헤드" 또는 "이중-Fv" 구성을 포함한다. 이중-Fv 구성에서, 2가지의 상이한 항체의 가변 도메인은 2개의 별개의 사슬(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄) 상에서 탠덤 배향으로 발현되고, 여기서, 하나의 폴리펩티드 사슬은 펩티드 링커에 의해 분리된 2개의 VH 도메인을 연속하여 가지며(VH1-링커-VH2), 다른 하나의 폴리펩티드 사슬은 펩티드 링커에 의해 연속하여 연결된 상보적 VL 도메인들로 이루어진다(VL1-링커-VL2). 교차하는 더블 헤드 구성에서, 2가지의 상이한 항체의 가변 도메인은 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄) 상에서 탠덤 배향으로 발현되고, 여기서, 하나의 폴리펩티드 사슬은 펩티드 링커에 의해 분리된 2개의 VH 도메인을 연속하여 가지며(VH1-링커-VH2), 다른 하나의 폴리펩티드 사슬은 반대 배향으로 펩티드 링커에 의해 연속하여 연결된 상보적 VL 도메인들로 이루어진다(VL2-링커-VL1). "이중-Fv" 형식을 기반으로 하는 추가의 항체 변이체는 이중 가변 도메인 IgG(DVD-IgG) 이중특이성 항체를 포함한다(미국 특허 제7,612,181호 참조) 및 TBTI 형식(US 2010/0226923 A1 참조)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 변형된 Fc 도메인에 융합된 동일 폴리펩티드 사슬 상에 하나 이상의 가변 도메인을 연속하여 포함하는 다중특이성 또는 다가 항체를 포함한다.
또 다른 예시적 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 "더블 헤드" 구성을 기반으로 하는 교차 이중 가변 도메인 IgG(CODV-IgG) 이중특이성 항체를 포함한다(US20120251541 A1 참조).
또 다른 예시적인 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 면역어드헤신이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "면역어드헤신"은 면역글로불린 불변 도메인(즉, Fc 영역)에 연결된 하나 이상의 결합 도메인(예를 들어, 수용체, 리간드 또는 세포-부착 분자 유래)을 포함하는 결합 폴리펩티드를 지칭한다(예를 들어, 문헌[Ashkenazi et al., Methods (1995) 8(2):104-15], 및 문헌[Isaacs, Brit J Rheum. (1997) 36:305-7]을 참조하며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 면역어드헤신의 예로는 수용체의 리간드 결합 도메인과 IgG Fc 도메인 사이의 키메라 분자가 있다. 일부 실시 형태에서, FcRn 길항제는 염증에 관여하는 사이토카인에 결합하여 이를 격리하는 면역어드헤신이다.
면역어드헤신은 국제 일반명(International Nonproprietary Name; INN)에서 접미어 "-셉트(cept)"로 식별된다. 항체와 마찬가지로, 면역어드헤신은 순환 반감기가 길고, 친화성 기반 방법에 의해 쉽게 정제되며, 2가에 의해 부여되는 친화력 상의 장점이 있다. 구매가능한 치료용 면역어드헤신의 예는 에타너셉트(ENBREL®), 아바타셉트(ORENCIA®), 릴로나셉트(ARCALYST®), 애플리버셉트(ZALTRAP® / EYLEA®) 및 벨라타셉트(NULOJIX®)를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 단리된 결합 폴리펩티드는 본원에 기술된 변형된 Fc 도메인에 융합된 항체 모방체, 예컨대 아피바디, 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPin, Fynomer, Kunitz 도메인 펩티드, 모노바디 및 nanoCLAMP이다.
특정 실시 형태에서, 결합 폴리펩티드는 면역글로불린-유사 도메인을 포함한다. 적합한 면역글로불린-유사 도메인은 제한 없이, 피브로넥틴 도메인(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Koide et al., Methods Mol Biol. (2007) 352:95-109] 참조), DARPin(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Stumpp et al., Drug Discov Today (2008) 13 (15-16):695-701] 참조), 단백질 A의 Z 도메인(전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Nygren et al., FEBS J. (2008) 275 (11):2668-76] 참조), Lipocalin(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11):2677-83] 참조), Affilin(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Ebersbach et al., J Mol Biol. (2007) 372 (1):172-85] 참조), Affitin(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Krehenbrink et al., (2008) J Mol Biol. 383 (5):1058-68] 참조), Avimer(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Silverman et al., (2005) Nat Biotechnol. 23 (12):1556-61] 참조), Fynomer(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Grabulovski et al., J Biol Chem. (2007) 282 (5):3196-3204] 참조) , , 및 Kunitz 도메인 펩티드(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Nixon et al., (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2):261-8] 참조)를 포함한다.
본원에 기술된 변형된 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 결합 폴리펩티드는 공지된 "모" 항체의 CDR 서열 또는 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 모 항체 및 본 발명의 항체는 본원에 개시된 바와 같은 Fc 도메인에 대한 변형을 제외하고는 유사하거나 동일한 서열을 공유할 수 있다.
핵산 및 발현 벡터
본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 원하는 양의 기술된 폴리펩티드, 예컨대 항체, 이의 단편, 또는 면역어드헤신을 생성하기 위해 사용될 수 있는 숙주 세포 내로의 도입을 위한 발현 벡터 내에 삽입된다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 벡터 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본원에서, 원하는 유전자를 세포 내로 도입하고 세포 내에서 발현시키는 데 사용되는 벡터를 의미하기 위해, 명세서 및 청구범위를 위하여 사용된다. 이러한 벡터는 플라스미드, 파지 및 바이러스(예를 들어, 배큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 레트로바이러스)로 이루어진 군으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로, 벡터는 선발 마커, 및 원하는 유전자의 클로닝을 돕기에 적절한 제한효소 부위 및 진핵 또는 원핵 세포로 진입하고/하거나 상기 세포에서 복제하는 벡터의 능력을 포함할 것이다.
많은 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 부류의 벡터는 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 이용한다. 다른 것들은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론 시스템의 사용을 수반한다. 추가적으로, DNA가 세포의 염색체 내로 통합된 세포를 형질감염된 숙주 세포의 선발을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선발할 수 있다. 이러한 마커는 영양요구성 숙주에 독립영양을 제공하거나, 살생물제(예를 들어, 항생제) 내성, 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선발가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결되거나 공동형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 추가적인 요소가 또한 mRNA의 최적 합성을 위해 필요할 수 있다. 이러한 요소들은 신호 서열, 스플라이싱 신호와, 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 위에서 논의된 바와 같이 합성된 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(예컨대 인간 유전자)를 따라 발현 벡터 내에 삽입된다.
다른 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 결합 폴리펩티드는 폴리시스트론 구축물을 이용하여 발현될 수 있다. 이러한 발현 시스템에서, 다수의 관심 유전자 생성물, 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄가 단일 폴리시스트론 구축물로부터 생성될 수 있다. 이러한 시스템은 진핵 숙주 세포 내에서 비교적 높은 수준의 폴리펩티드를 제공하기 위해 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES)를 유리하게 사용한다. 양립가능한 IRES 서열이 미국 특허 제6,193,980호에 개시되어 있다.
더욱 일반적으로, 일단 본 발명의 FcRn 길항제를 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되었으면, 발현 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 숙주 세포 내로의 플라스미드의 도입은 다양한 기술, 예컨대 형질감염(전기영동 및 전기천공을 포함함), 원형질 융합, 인산칼슘 침전, 외피 DNA를 이용한 세포 융합, 미세주입, 및 온전한 바이러스를 이용한 감염에 의해 달성될 수 있다. 형질전환된 세포를 본 발명의 결합 폴리펩티드의 생성에 적절한 조건 하에서 성장시키고, 그의 합성에 대해 분석한다. 예시적인 분석 기술은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 또는 형광 활성화 세포 분류 분석법(FACS), 면역조직화학법 등을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현에 사용되는 숙주 세포는 진핵생물(예를 들어, 포유동물, 곤충, 효모 또는 식물) 또는 원핵생물 기원일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드의 발현에 사용되는 숙주 세포주는 포유동물 기원이며, 당업자는 그 내부에서 발현되는 원하는 유전자 생성물에 최고로 적합한 특정 숙주 세포주를 결정할 수 있다. 예시적인 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, DG44 및 DUXB11, CHO 주, DHFR 음성), HELA(인간 자궁경부암종), CVI(원숭이 신장 주), COS(SV40 T 항원이 있는 CVI의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3(마우스 섬유모세포), HAK(햄스터 신장 주), SP2/O(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일 실시 형태에서, 세포주는 그로부터 발현된 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체)의 변경된 글리코실화, 예를 들어, 비푸코실화를 제공한다(예를 들어, PER.C6.RTM. (Crucell) 또는 FUT8-녹아웃 CHO 세포주(POTELLIGENTTM 세포)(Biowa, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재)). 일 실시 형태에서, NS0 세포가 사용될 수 있다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스인 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 이용가능하다. 조직 배양 조건 하에서의 포유동물 세포 배양을 위한 기술은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 이는, 예를 들어, 공기부양 반응기 또는 연속 교반 반응기 중에서의 균일 현탁 배양, 또는, 예를 들어, 중공 섬유, 마이크로캡슐 내, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정되거나 포획된 세포 배양을 포함한다. 필요하고/하거나 요망되는 경우, 폴리펩티드의 용액은 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스 상에서의 크로마토그래피 및/또는 (면역-) 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
치료 방법
일 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 환자)의 치료 방법을 제공하며, 본 방법은 유효량의 본원에 개시된 FcRn 길항제를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명은 이러한 치료 방법에 사용하기 위한 제조 물품(예를 들어, 키트)을 제공한다. 환자는 IgG-매개 질환 또는 장애를 갖고 있으며 본 발명의 FcRn 길항제로 치료함으로써 혈청 IgG의 더 빠른 제거로부터 이익을 얻을 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체-관련", "항체-매개" 및 "항체-반응성" 장애, 병태, 또는 질환은 원하지 않는 항체(예를 들어, 특정 자가반응성 IgG, 또는 환자에게 더 이상 필요하지 않거나 유익하지 않은 외인성으로 제공된 치료 또는 진단 IgG)의 제거에 의해 개선될 수 있는 장애, 병태, 또는 질환을 지칭한다.
특정 실시 형태에서, IgG-매개 장애는 자가면역 질환, 예컨대 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 중증 근무력증, 전신 경화증(SSc)/경피증, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 당뇨병, 다발성 경화증, 심상성 천포창, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 알러지, 특발성 폐 섬유증(IPF), 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP) 및 화농성 한선염일 수 있다.
특정 실시 형태에서, IgG-매개 장애는 알러지일 수 있다. 알러지는 예를 들어 음식 알러지(예를 들어, 계란 알러지, 생선 알러지, 조개 알러지, 과일 알러지, 마늘 알러지, 고추 알러지, 귀리 알러지, 고기 알러지, 우유 알러지, 땅콩 알러지, 쌀 알러지, 참깨 알러지, 콩 알러지, 아황산염 알러지, 타르트라진 알러지, 나무 견과류 알러지, 밀 알러지 등), 약물 알러지(예를 들어, 테트라사이클린 알러지, 딜란틴 알러지, 테그레톨 알러지, 페니실린 알러지, 세팔로스포린 알러지, 술폰아미드 알러지, 비스테로이드성 항염증제 알러지, 정맥주사 조영제 알러지 등), 환경 알러지(예를 들어, 잔디 알러지, 꽃가루 알러지, 고양이 알러지, 개 알러지, 곤충 알러지, 곰팡이 알러지, 향수 알러지, 화장품 알러지, 정액 알러지, 라텍스 알러지, 물 알러지, 집먼지 진드기 알러지, 니켈 알러지, 금 알러지, 크롬 알러지, 염화코발트 알러지, 사진 현상제 알러지, 살진균제 알러지 등) 및 접촉성 알러지(예를 들어, 라텍스 알러지, 파라페닐렌디아민 알러지, 글리세릴 모노티오글리콜레이트 알러지, 톨루엔술파노미드 포름알데히드 알러지 등)일 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 FcRn 길항제는 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 FcRn 길항제를 포함하는 병용 요법제는 예를 들어 순환 전염증성 사이토카인에 결합하고 이로부터 제거함으로써 선천성 면역계 및/또는 적응 면역계를 표적화할 수 있다. 일부 실시 형태에서, FcRn 길항제 그 자체는 전염증성 사이토카인에 결합하고 이를 제거하여 자가반응성 혈청 IgG 및 전염증성 사이토카인을 제거하는 조합된 효과를 달성할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 FcRn 길항제를 포함하는 병용 요법제는 TLR-억제제, 예를 들어 IRAK-4 억제제를 포함할 수 있다.
특정 실시 형태에서, FcRn 길항제는 대상체에서 Fc-함유 약제(예를 들어, 치료제 또는 진단제)의 혈청 수준을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. Fc-함유 약제가 대상체에게 유해한(예를 들어, 독성인) 경우 또는 Fc-함유 시약이 단지 특정 기간 동안 대상체 내에 존재하는 것이 요구되는 경우(예를 들어, 각각, Fc-함유 약제가 면역원성일 때 또는 Fc-함유 약제가 항체-약물 콘쥬게이트일 때), Fc-함유 약제의 제거가 요구될 수 있다. 특정 실시 형태에서, Fc-함유 약제의 제거는 Fc-함유 약제에 대한 대상체의 노출의 양을 감소시킨다. 혈청 중 임의의 Fc-함유 약제의 수준은 본원에 기술된 FcRn 길항제를 사용함으로써 감소될 수 있다. 따라서, 특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 FcRn 길항제는 Fc-함유 약제가 투여된 대상체에서 Fc-함유 약제의 혈청 수준을 감소시키는 데 사용된다.
또 다른 양태에서, 진단 영상을 증강시키는 방법이 제공되며, 본 방법은 본원에 개시된 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 FcRn 길항제는 진단 영상 동안 방사성표지된 항체에 대한 전신 노출 및 배경 수준 둘 다를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 진단 영상은 제한 없이, 양전자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), PET와 컴퓨터 단층촬영(CT)의 조합 등을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 대상체에는 유효량의 방사성표지된 항체가 투여되고, 선택적으로, FcRn 길항제는 방사성표지된 항체의 투여 후에 투여된다. 특정 실시 형태에서, 방사성표지된 항체의 콘트라스트는 본원에 기술된 FcRn 길항제를 사용하여, 예를 들어 순환계로부터 비결합 방사성표지 항체를 제거하여 콘트라스트 증가(예를 들어, 배경 신호 감소) 및 방사성표지 항체에 대한 노출의 유해한 영향의 감소를 허용함으로써 대상체에서 증강된다. 따라서, 특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 진단 영상 동안 방사성표지된 항체에 대한 정상 조직의 노출을 감소시키는 방법이 제공된다.
특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 FcRn 길항제는 대상체로부터 치료제를 제거하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료제가 투여된 대상체는 투여된 치료제의 이용가능성 및/또는 효능을 감소시키는 항체, 예를 들어 항-약물 항체를 발생시킬 수 있다. 대상체에 항-약물 항체가 존재하면 원하지 않는 부작용이 발생할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 FcRn 길항제는 대상체에서 발생하는 항-약물 항체를 제거한다.
통상적인 실험에 의해, 당업자는 본원에 기술된 바와 같은 FcRn 길항제(예를 들어, pH 6.0 및 pH 7.4에서 FcRn 결합이 향상된 사중 변이체)의 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 특정 실시 형태에서, 유효량의 FcRn 길항제는 비독성이다. FcRn 길항제의 치료적 유효량은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, FcRn 길항제가 투여될 대상체의 연령, 성별, 질환 병기 및 병력은 FcRn 길항제의 치료적 유효량의 적절한 결정에 영향을 미칠 수 있다. 대상체에서 효과적인 치료 반응을 제공하기 위해 적합한 투여 요법이 결정될 수 있다. 투여량은 특정 기간에 걸쳐 나누어 투여될 수 있으며, 예를 들어 1주일 동안 매일 투여될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 장애, 예를 들어, IgG-매개 장애의 진단 및/또는 치료를 위한 키트 및 방법을 제공한다. 예시적인 실시 형태에서, 대상체는 인간이다.
제약 조성물 및 이의 투여
본 발명의 FcRn 길항제의 제조 방법 및 이의 대상체에의 투여 방법은 당업자에게 잘 알려져 있거나 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 투여 경로는 경구, 비경구, 국소 또는 흡입일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 비경구라는 용어는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 모든 이들 형태의 투여가 본 발명의 범주 내인 것으로 명백히 고려되나, 투여를 위한 형태는 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적주입을 위한 주사용수일 것이다. 보통, 주사에 적합한 제약 조성물은 완충액(예를 들어, 아세테이트, 히스티딘, 포스페이트, 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민), 보존제 등을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, FcRn 길항제는 유해한 세포 집단의 부위에 직접적으로 전달됨으로써 병든 조직을 치료제에 노출하는 것을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 살균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수용성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르가 있다. 수용성 담체는, 염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에서, 제약상 허용가능한 담체는 0.01 내지 0.1 M, 예를 들어 0.05 M 포스페이트 완충액 또는 0.8% 염수를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 흔한 비경구 비히클은 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산화 링거액(Ringer's), 또는 고정유를 포함한다. 정맥내용 비히클은 링거 덱스트로스에 기반한 것 등과 같은 전해질 보충물, 유체 및 영양 보충물 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성화 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제들이 또한 존재할 수 있다. 더 구체적으로, 주사용으로 적합한 제약 조성물은 살균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 살균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 살균 분말을 포함한다. 이러한 경우에, 조성물은 반드시 살균되어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도의 유체여야 한다. 조성물은 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하고, 전형적으로 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존될 것이다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨이 조성물에 포함될 것이다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 조성물 내에 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 발생될 수 있다.
임의의 경우, 살균 주사용 용액은 본원에 열거된 성분 중 하나 또는 본원에 열거된 성분들의 조합물을 포함하는 적절한 용매에 필요량의 활성 화합물(예를 들어, 단독의 또는 다른 활성제와 조합된 변형된 결합 폴리펩티드)을 혼입시킨 후, 필요시 여과 살균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 성분으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 살균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 살균 주사용 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 예시적인 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조(이는 이전에 살균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분 + 활성 성분의 분말을 생성함)를 포함한다. 주사용 제제는 본 기술 분야에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에서 프로세싱되고, 용기, 예컨대 앰풀, 백, 병, 시린지 또는 바이알 내로 충전되고, 밀봉된다. 또한, 제제는 패키징되어 키트의 형태로 판매될 수 있다. 상기 제조 물품은 전형적으로 관련 조성물이 IgG-매개 장애를 앓고 있거나 상기 장애에 걸리기 쉬운 대상체의 치료에 유용함을 나타내는 라벨 또는 패키지 인서트를 가질 것이다.
본 발명의 제약 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 건강 상태, 병력, 연령, 성별 및 체중을 포함하는 많은 상이한 요인에 따라 달라진다. 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 치료 투여량이 적정될 수 있다.
본 발명의 FcRn 길항제는 여러 번 투여될 수 있다. 단회 투여량 사이의 간격은, 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서의 IgG의 혈중 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1~1000 μg/ml 및 일부 방법에서는 약 25~300 μg/ml의 혈장 FcRn 길항제 농도를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, FcRn 길항제는 지속 방출 제형으로 투여될 수 있으며, 이러한 경우 빈도가 덜한 투여가 필요하다. 항체에 있어서, 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다.
본원의 제약 조성물은 본 발명의 FcRn 길항제 중 하나 이상의 종 및 제약상 허용가능한 비독성 살균 담체, 예컨대 생리식염수, 비독성 완충액 등을 포함할 수 있다. 투여의 빈도 및 투여량은 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, FcRn 길항제 또는 이의 칵테일을 함유하는 제약 조성물은 질환의 발병에 대한 환자의 저항성을 향상시키기 위해 아직 질환 상태가 아닌 환자(예를 들어, 유전적으로 민감한 환자)에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 이러한 용도에서, 정확한 양은, 다시, 환자의 건강 상태 및 일반적인 면역에 의존하지만, 일반적으로 용량당 약 0.1 내지 약 25 mg, 특히 용량당 약 0.5 내지 약 2.5 mg의 범위이다. 긴 기간에 걸쳐서 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 남은 일생 동안 치료를 받는 것을 계속한다. 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지, 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량(예를 들어, 용량당 약 1 내지 400 mg/kg의 항체, 예컨대 약 5 내지 25 mg의 투여량)이 때때로 필요하다. 그 후, 환자는 예방적 요법이 투여될 수 있다.
예시적인 실시 형태
본 발명의 예시적인 비제한적 실시 형태가 하기에 제공된다.
1. 항체-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 항체-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 변형된 Fc 도메인은
아미노산 위치 256의 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E), 및 아미노산 위치 307의 트립토판(W) 또는 글루타민(Q)을 포함하고(여기서, 아미노산 위치 254는 트레오닌(T)이 아님),
아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y); 및
아미노산 위치 252의 티로신(Y)을 추가로 포함하는 4개 이상의 아미노산 치환의 조합을 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링에 따른 것인, 방법.
2. 항체-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 항체-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
a) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y);
b) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y);
c) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y);
d) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F); 또는
e) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서의 아미노산 치환의 조합을 갖는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 아미노산 치환은 EU 넘버링에 따른 것인, 방법.
3. 항체-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 항체-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 M252Y/T256D/T307Q/N434Y, M252Y/T256E/T307W/N434Y, M252Y/T256E/T307Q/N434Y, M252Y/T256D/T307Q/N434F, 및 M252Y/T256D/T307W/N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 사중 아미노산 치환을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 아미노산 치환은 EU 넘버링에 따른 것인, 방법.
4. 항체-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 항체-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)(EU 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
5. 항체-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 항체-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)(EU 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
6. 항체-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 항체-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)(EU 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
7. 항체-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 항체-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F)(EU 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
8. 항체-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 항체-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)(EU 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
9. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, 변형된 Fc 도메인은 변형된 인간 Fc 도메인인, 방법.
10. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, 변형된 Fc 도메인은 변형된 IgG1 Fc 도메인인, 방법.
11. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 인간 FcRn 결합 친화성을 갖는, 방법.
12. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 인간 및 래트 FcRn 결합 친화성을 갖는, 방법.
13. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 향상된 FcRn 결합 친화성을 갖는, 방법.
14. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성을 갖는, 방법.
15. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(EU 넘버링에 따름)를 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성을 갖는, 방법.
16. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 비-산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성을 갖는, 방법.
17. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(EU 넘버링에 따름)를 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 비-산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성을 갖는, 방법.
18. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성 및 비-산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성을 갖는, 방법.
19. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(EU 넘버링에 따름)를 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성 및 비-산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성을 갖는, 방법.
20. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, 산성 pH는 약 6.0인, 방법.
21. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, 비-산성 pH는 약 7.4인, 방법.
22. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 감소된 혈청 반감기를 갖는, 방법.
23. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(EU 넘버링에 따름)를 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 감소된 혈청 반감기를 갖는, 방법.
24. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 감소된 FcγRIIIa 결합 친화성을 갖는, 방법.
25. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제와 비교하여 감소된 열 안정성을 갖는, 방법.
26. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 결합 폴리펩티드인, 방법.
27. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 Fv 단편, 단쇄 항체(ScFv), Fab, Fab-H, Fab', F(ab')2, Fd, dAb 및 이의 다량체 버전, 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, vNAR 및 비스-scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 단편인, 방법.
28. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, 항체는 단클론 항체인, 방법.
29. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, 항체는 키메라, 인간화, 또는 인간 항체인, 방법.
30. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, 항체는 전장 항체인, 방법.
31. 실시 형태 1~25 중 어느 하나에 있어서, FcRn 길항제는 아피바디, 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPin, Fynomer, Kunitz 도메인 펩티드, 모노바디, 및 nanoCLAMP로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 모방체인, 방법.
32. 실시 형태 31에 있어서, FcRn 길항제는 아피바디인, 방법.
33. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 알부민 결합 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
34. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, FcRn 길항제는 하나 이상의 표적에 특이적으로 결합하는, 방법.
35. 임의의 전술한 실시 형태에 있어서, 항체-매개 장애는 자가면역 질환인, 방법.
36. 실시 형태 35에 있어서, 자가면역 질환은 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 중증 근무력증, 전신 경화증(SSc)/경피증, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 당뇨병, 다발성 경화증, 심상성 천포창, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 알러지, 특발성 폐 섬유증(IPF), 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP) 및 화농성 한선염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
37. 진단 영상을 증강시키는 방법으로서, 상기 방법은 M252Y/T256D/T307Q/N434Y, M252Y/T256E/T307W/N434Y, M252Y/T256E/T307Q/N434Y, M252Y/T256D/T307Q/N434F, 및 M252Y/T256D/T307W/N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 사중 아미노산 치환을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 아미노산 치환은 EU 넘버링에 따른 것인, 방법.
38. 실시 형태 37에 있어서, 유효량의 방사성표지된 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
39. 실시 형태 38에 있어서, FcRn 길항제는 방사성표지된 항체 후에 투여되는, 방법.
40. 실시 형태 37 또는 38에 있어서, 상기 방법은 방사성표지된 항체에 대한 콘트라스트를 증강시키는, 방법.
41. 진단 영상 동안 방사성표지된 항체에 대한 비-표적 조직의 노출을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 M252Y/T256D/T307Q/N434Y, M252Y/T256E/T307W/N434Y, M252Y/T256E/T307Q/N434Y, M252Y/T256D/T307Q/N434F, 및 M252Y/T256D/T307W/N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 사중 아미노산 치환을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 아미노산 치환은 EU 넘버링에 따른 것인, 방법.
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본 발명은 이의 특정 실시 형태를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있고 균등물이 치환될 수 있음이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 본원에 개시된 실시 형태의 범주를 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 방법의 다른 적절한 변형 및 수정이 적절한 균등물을 사용하여 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 특정 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정 단계(들)를 본 발명의 목적, 사상 및 범주에 맞추기 위해 많은 변경이 이루어질 수 있다. 모든 그러한 변경은 첨부된 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 특정 실시 형태를 상세히 설명하였지만, 이는 예시의 목적으로만 포함되고 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예를 참조하여 보다 명확하게 이해될 것이다.
실시예
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시한다. 이들은 추가의 제한으로서 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 재료 및 방법
단백질 시약
하기 단백질을 발현하고 단리하였다: C-말단 8x히스티딘 태그를 갖는 항원(서열 번호: 5); 래트(rFcRn, UniProt: P1359, p51 서브유닛: 잔기 23~298; UniProt: P07151, β2-m: 잔기 21~119); 비오티닐화 시노몰구스 FcRn(시노FcRn, UniProt: Q8SPV9, p51 서브유닛: C-말단 Avi-태그가 있는 잔기 24~297; UniProt: Q8SPW0, β2-m: 잔기 21~119); 비오티닐화 인간 FcRn(hFcRn, UniProt: P55899, p51 서브유닛: C-말단 Avi-태그가 있는 잔기 24~297; UniProt: P61769, β2-m: 잔기 21~119); 인간 CD16a(UniProt: P08637, FcγRIIIa: C-말단 HPC4 태그 및 위치 158에 발린이 있는 잔기 17~208(V158)). H435A 및 H310A/H435Q 중쇄 변이체는 HEK293 조절 배지에서 얻었다. mAb2(IgG1) 변이체를 Evitria에서 클로닝하고 mAbSelect™ SuRe™ 친화성 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 현탁액 CHO K1 조절 배지에서 정제하고 후속 실험을 위해 완충액을 인산염 완충 염수(PBS) pH 7.4로 교환하였다.
포화 라이브러리 구축
리더 DNA 서열이 있는 WT IgG1 mAb1(IgG1) 항체 중쇄 및 경쇄를 NcoI 및 HindIII 제한효소 부위를 사용하여 각각 pBH6414 및 pBH6368 포유동물 발현 플라스미드에 혼입시켰다. Lightning Site Directed Mutagenesis Kit(Agilent) 및 NNK(N= A/C/G/T, K = G/T) 및 WWC(W = A/T) 프라이머(IDT Technologies)로 포화 라이브러리를 생성하여 위치 M252, I253, S254, T256, K288, T307, K322, E380, L432, N434 및 Y436(Eu 넘버링)에서의 모든 가능한 아미노산을 도입시켰다. mAb1 백본, AAA(T307A/E380A/N434A), LS(M428L/N434S) 및 YTE(M252Y/S254T/T256E)의 3가지 대조군 변이체의 중쇄 DNA 서열은 LakePharma에 의해 pBH6414 벡터로 구축하였다.
조합 포화 라이브러리는 PCR 반응에서 WT 및 M252Y 주형과 함께 Q5 돌연변이유발 키트(NEBiolabs) 및 T256D, T256E, T307Q, T307W, N434F 및 N434Y 프라이머를 사용한 mAb1 중쇄의 부위 지정 돌연변이유발을 통해 얻었다. M252Y, T256D, T307Q 및 T307W 프라이머와 함께 Q5® 돌연변이유발 키트(NEBiolabs)를 사용하여 mAb3 백본으로의 돌연변이 혼입을 수행하였다. 모든 Fc 변이체의 생성은 Sanger Sequencing(Genewiz, Inc.)을 통해 확인하였다.
재조합 항체 발현 및 정제
조절 배지 스크리닝을 위해, mAb1의 돌연변이 중쇄 및 야생형 경쇄를 함유하는 DNA로 발현을 위해 1 mL의 Expi293 포유동물 세포(Invitrogen™)를 제조업체의 지침에 따라 형질감염시켰다. 세포를 2 mL 96웰 플레이트(Greiner Bio-One)에서 분당 900회전(RPM)으로 진탕하면서 37℃, 5% 이산화탄소 및 80% 습도에서 인큐베이션하고 폭기 막으로 밀봉하였다. 형질감염 5일 후에 컨디셔닝된 배지를 수집하고 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 백본 mAb1 및 mAb3의 리드 변이체를 0.2 μm 통기 캡(Corning)이 있는 125 mL 플라스크에서 30 mL 규모로 발현시켰다. 125 mL 배양 플라스크를 전체 발현 기간 동안 125 RPM에서 진탕하였다. 형질감염 5일 후에 조절 배지를 수집하고 0.22 μm, 50 mL 원뿔형 필터(Corning)를 통해 여과하고 정제할 때까지 4℃에서 보관하였다.
mAb1 및 mAb3의 단리는 1 mL mAbSelect™ SuRe™ HiTrap® 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 10 컬럼 용적에 대한 PBS pH 7.4의 세척 단계 후, 항체를 5 컬럼 용적의 0.1 M 시트르산 pH 3.0(Sigma)으로 용출하고 0.5 mL의 1M 트리스 염기 pH 9.0(Sigma)으로 중화하였다. 용출된 항체를 PBS pH 7.4에 대해 완충액 교환하고 후속 연구를 위해 30 kDa MWCO Amicon® Concentrator(Millipore®)를 사용하여 >1 mg mL-1로 농축하였다. 정제된 항체의 농도는 적절한 흡광 계수를 갖는 280 nm(UV280)에서의 UV 흡광도로부터 결정하였다.
Octet 조건 배지 스크리닝 및 분석
mAb1 변이체를 포함하는 조절 배지의 스크리닝을 Ni-NTA 바이오센서(PALL Life Sciences)가 있는 Octet QK 384에서 수행하였다. His 태그된 항원은 PBS, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma) 및 0.01% Tween-20(Sigma) pH 7.4(PBST-BSA 7.4)에서 300초 동안 15 μg mL-1에서 포획한 후 PBST-BSA pH 7.4로 20초 동안 세척하였다. 항체를 PBST-BSA pH 7.4로 1:1로 희석된 조절 배지에서 200초 동안 포획하였다. pH 6.0 완충액에서 완충액 세척 단계 후, pH 6.0에서 각각 150초 및 200초의 결합 및 해리 시간에 대해 200 nM rFcRn을 사용하여 FcRn 결합 동역학을 얻었다. Octet 스크리닝 중의 모든 단계에서, 온도는 30℃이고 1000 RPM의 진탕 속도였다. rFcRn 결합 동역학 프로파일을 FcRn 결합 단계의 개시로 보정하고 Octet 7.1 분석 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델로 모델링하였다.
FcRn 결합 동역학
다중 pH 조건(pH 6.0, 7.4, 8.0 및 9.0) 하에 FcRn 결합 동역학을 비오틴 CAPture 키트(GE Healthcare)를 사용하여 Biacore™ T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여 측정하였다(예를 들어, 문헌[Abdiche et al., MAbs (2015) 7:331-43]; 문헌[Karlsson et al., Anal. Biochem. (2016) 502:53-63] 참조). CAPture 시약을 >1500 RU의 표면 밀도까지 CAP 칩에 포획하고, 이어서 더 높은 pH에서 감소된 결합 친화도를 설명하기 위해 30 μL min-1로 가변 포획 시간 동안 FcRn이 뒤따랐다. 각 pH에 대한 FcRn 농도 및 포획 시간은 다음과 같다: pH 6.0: 24초 동안 0.1 μg mL-1 FcRn, pH 7.4 및 8.0: 60초 동안 1 μg mL-1 및 pH 9.0: 60초 동안 10μg mL-1. 모든 pH 조건에 대한 실행 완충액은 pH 6.0, 7.4, 8.0 및 9.0에 따라 조정된 pH를 갖는 20 mM Bis-Tris 프로판; 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20이었다. 3배 희석의 1000 nM부터 시작하는 각 항체 변이체의 농도 시리즈는 넓은 범위의 결합 친화도를 포괄하도록 설정되었다. 동역학 측정은 각각 180초 및 360초 결합 및 해리 시간 동안 수행하였으며, 이후 각 사이클마다 구아니딘 염산염 및 수산화나트륨으로 CAP 표면을 재생하였다. pH 7.4, 8.0 및 9.0에서 정상 상태 RU 측정값을 1000 nM에서 삼중으로 얻었다. 각 pH에서의 센서그램은 Biacore T200TM 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 또는 2가 결합 모델에 피팅(fitting)하였다. 2가 모델은 높은 FcRn 포획 수준 및 IgG당 2개의 FcRn 결합 부위에서 관찰되는 친화력 효과를 설명한다. 예를 들어, 문헌[Suzuki et al., J Immunol . (2010) 184:1968-76]을 참조한다. 평균 온/오프 속도 및 결합 친화도를 얻기 위해 각 농도 시리즈를 독립적으로 피팅하였다. 잔존 결합은 해리 단계의 시작 이전에 정상 상태 결합 반응으로부터 결정하고 평균을 냈다.
FcRn 친화성 크로마토그래피
한 실험에서, FcRn 친화성 컬럼은 문헌[Schlothauer et al., mAbs (2013) 5:576-86]에서 채택된 프로토콜에서 생성하였다. 1 mL Streptavidin HP HiTrap® 컬럼(GE Healthcare)은 5 컬럼 부피에 대해 1 mL min-1에서 결합 완충액(20 mM 인산나트륨(Sigma) pH 7.4, 150 mM 염화나트륨(NaCl; Sigma))으로 평형화한 후 4 mg의 비오티닐화 시노FcRn을 주입하였다. 컬럼을 결합 완충액으로 세척하고 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
FcRn 친화성 컬럼을 5 컬럼 부피에 대해 낮은 pH 완충액(20 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES; Sigma) pH 5.5; 150 mM NaCl)으로 평형화 한 후 300 ㎍의 각 항체를 주입하였다. 항체 용액의 pH를 낮은 pH 완충액으로 pH 5.5로 조정하였다. 낮은 pH 완충액으로 10 컬럼 부피 세척 후, 항체를 1 mL 분획에서 1 mL min-1로 30 컬럼 부피에 걸쳐 높은 pH 완충액(20 mM 1,3-비스(트리스(히드록시메틸)메틸아미노)프로판(비스 트리스 프로판; Sigma) pH 9.5; 150 mM NaCl)을 이용한 선형 pH 구배 및 UV280의 모니터링에 의해 용출하였다. FcRn 친화성 컬럼을 후속 실행을 위한 위한 낮은 pH 완충액 또는 보관을 위한 결합 완충액의 10 컬럼 부피로 재평형화하였다. 모든 변이체를 삼중으로 수행하였다. 각 변이체에 대한 FcRn 친화성 컬럼 용출 프로파일은 Sigmaplot 11(Systat Software, Inc.)의 식 1을 사용하여 단일 가우스 분포로 모델하여 UV280 최대값에서 용출 부피를 결정하였다.
Figure pct00002
(식 1)
여기서 x0은 UV280 피크 최대값에서 용출 부피이고, y0은 기준 UV280 흡광도이며, a와 b는 분포의 최대 절반에서 전체 너비와 관련된다. 각 분획의 pH는 Corning Pinnacle 540 pH 미터로 측정하였으며 선형 회귀를 사용하여 용출 부피와 연관시켰다.
다른 실험에서 FcRn 친화성 컬럼을 1 mL Streptavidin HP HiTrap® 컬럼(GE Healthcare)에서 비오틴화된 hFcRn을 사용하는 상기 문헌[Schlothauer et al.]로부터 채택하였다. AKTA Pure System(AKTA)에서 낮은 pH 완충액(20 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES; Sigma) pH 5.5; 150 mM NaCl) 중 300 ㎍의 각 항체를 컬럼에 주입하였다. 항체를 1 mL min-1로 30 컬럼 부피에 걸쳐 낮은 pH 완충액 및 높은 pH 완충액(20 mM 1,3-비스(트리스(히드록시메틸)메틸아미노)프로판(비스 트리스 프로판; Sigma) pH 9.5; 150 mM NaCl)을 이용한 선형 pH 구배, 및 흡광도 및 pH의 모니터링에 의해 용출하였다. 컬럼은 후속 실행을 위해 낮은 pH 완충액으로 재평형화하였다. 모든 변이체를 삼중으로 수행하였다. FcRn 친화성 컬럼 용출 프로파일은 Sigmaplot 11(Systat Software, Inc.)의 단일 가우시안 분포에 피팅하여 UV280 최대값에서 용출 부피 및 pH를 결정하였다.
시차 주사 형광 측정법
DSF(Differential Scanning Fluorimetry) 실험은 20 μL 반응에서 BioRad CFX96™ 실시간 시스템 열 순환기(BioRad)에서 수행하였다. 항체 샘플 및 Sypro™ Orange 염료(Invitrogen™)의 5000x 저장액을 PBS pH 7.4에 각각 0.4 mg mL-1 및 10x로 희석하였다. 항체와 Sypro™ Orange를 각 항체 및 5x Sypro™ Orange 염료의 최종 농도가 0.2 mg mL-1가 되도록 96웰 PCR 플레이트에서 1:1 비로 혼합하고 접착성 microseal®(BioRad)로 밀봉하였다. 모든 항체 변이체를 삼중으로 수행하였다. 열 순환기 프로그램은 20℃에서 2분간 평형화 단계, 이어서 100℃의 최종 온도로 5℃/5초의 일정한 온도 상승으로 이루어졌다. Sypro™ orange 형광에 적합한 FAM 여기 파장(485 nm) 및 ROX 방출(625 nm) 검출기를 사용하여 각 웰의 형광 측정값을 획득하였다(예를 들어, Biggar et al., Biotechniques (2012) 53:231-38) 참조). DSF 형광 강도 프로파일과 1차 도함수를 BioRad CFX™ Manager로부터 내보내 Sigmaplot 11에서 분석하였다. Tm은 형광 강도 프로파일에서 첫 번째 전환의 중간점으로 정의하였다.
FcγRIIIa 결합 동역학
결합 동역학 및 친화도는 Biacore™ T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여 측정하였다(문헌[Zhou et al., Biotechnol Bioeng. (2008) 99:652-65]). 아세테이트 pH 4.5 중 50 μg mL-1의 항-HPC4 항체(Roche)를 아민 화학을 사용하여 10 μl min-1에서 600초 동안 CM5 센서 칩의 표면에 >20,000RU의 최종 밀도까지 커플링하였다. FcγRIIIa 결합 동역학 실험을 위한 실행 완충액은 pH 7.4에서 0.05% 계면활성제 P-20(HBS-P+, GE Healthcare) 및 2 mM 염화칼슘(CaCl2, Fluka)이 포함된 HEPES 완충 염수였다. 각 동역학 추적은 5 μl min-1에서 30초 동안 1.25 μg mL-1 HPC4 태그된 FcγRIIIa-V158의 포획으로 초기화하였다. 각 변이체의 300 nM에서 결합 및 해리 동역학을 5 μl min-1에서 각 단계에 대해 120~180초 동안 각 변이체에 대해 측정하였다. 동역학 측정이 완료되면, CM5 칩은 10 mM EDTA(Ambion®)가 보충된 HBS-P+ 완충액으로 재생하였다. 다음 동역학 측정 전에, CM5 칩을 CaCl2가 포함된 HBS-P+로 120초 동안 세척하였다.
한 실험에서, FcγRIIIa 동역학 실험은 pH 7.4에서 FcRn 결합에 대해 기술된 바와 유사한 방식으로 분석하였다. WT, 벤치마크, 리드 단일 및 조합 변이체에 대해, 1000 nM을 3배 연속 희석한 시리즈에서의 동역학을 도출하여 FcγRIIIa에 대한 결합 친화도를 결정하였다. 각 농도 및 복제물에서 정상 상태 RU를 결정하고, 항체 농도의 함수로 플로팅하고, 식 2에 표시된 대로 정상 상태 모델에 피팅하였다.
Figure pct00003
(식 2)
여기서 오프셋은 0 nM 항체에서 기준선 RU이고, Rmax는 높은 항체 농도에서 안정기 RU이고, [항체]는 항체의 농도이고 및 KD.app는 변이체와 FcγRIIIa 간의 상호작용의 겉보기 결합 친화도이다.
다른 실험에서, FcγRIIIa 동역학 실험은 평균 정상 상태 결합 반응을 사용하여 pH 7.4에서 FcRn 결합에 대해 기술된 바와 유사한 방식으로 분석하였다. 모든 변이체에 대해, 300 nM 항체의 정상 상태 RU를 삼중으로 측정하고 평균화하였다. 각 백본의 변이체 간의 비교를 위해 WT에 대한 반응 변화의 배수 변화(반응 변화 배수)를 결정하였다.
등전 초점
리드 변이체의 등전점(pI)은 Maurice C(Protein Simple)에서 모세관 전기영동을 사용하여 결정하였다. 각 200 μL 샘플에는 0.35% 메틸 셀룰로오스(Protein Simple), 4% pharmalyte 3-10(GE Healthcare), 10 mM 아르기닌(Protein Simple), 0.2 mg mL-1 항체 및 4.05 및 9.99 pI 마커(Protein Simple)가 포함되었다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안 모세관에 로딩한 다음, 3000 V에서 6분 동안 분리 단계를 수행하고 트립토판 형광을 사용하여 모니터하였다. 각 변이체에 대한 pI는 Maurice C 소프트웨어를 사용하여 결정하였고 주요 종에 대한 형광 최대값에서의 pH로 정의하였다.
균질한 가교 류마티스 인자(RF) ELISA
항체는 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 및 Mix-n-Stain™ Digoxigenin 항체 표지 키트(Biotium)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 비오티닐하고 디곡시겐 표지하였다. 각 변이체에 대해 비오티닐화 및 디곡시제닌 표지된 항체 4 ㎍ mL-1을 함유하는 저장 용액을 준비하고 300 U/ mL RF(Abcam)와 1:1 비로 혼합하였다. 실온에서 20시간 동안 인큐베이션한 후, 100 μL의 각 항체-RF 혼합물을 Streptawell™ 플레이트(Sigma-Aldrich)에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20이 포함된 PBS pH 7.4로 3회 세척하고 HRP-콘쥬게이션된 항-디곡시제닌 2차 항체(Abcam)의 1:2000 희석액 100 μL를 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션 후, 웰을 세척하고 실온에서 15분 동안 100 μL의 TMB 기질(Abcam)로 처리하였다. 100 L의 정지 용액(Abcam)으로 반응을 중단하고 SpectraMax® 플레이트 판독기에서 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항체-RF 혼합물을 포함하지 않는 웰은 블랭크 차감을 제공하고 실험을 3회 반복하였다. P-값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다.
실시예 2: 조절 배지에서 포화 점 돌연변이의 Octet 스크리닝
FcRn은 대부분의 Fc 수용체에 공통적인 MHC 클래스 I-유사 α-도메인 및 β2-마이크로글로불린(β2-m) 서브유닛(도 1의 A)의 이종이량체이다. FcRn은 다른 FcγR과 구별되는 항체 Fc 중쇄 상의 영역을 인식한다(예를 들어, 문헌[Oganesyan et al., J Biol Chem. (2014) 289:7812-24]; 및 문헌[Shields et al., J Biol Chem. (2001) 276:6591-604] 참조).
WT 항체보다 더 느린 FcRn 오프 속도를 갖는 변이체를 확인하기 위해, 고처리량 방식으로 조절 배지에서 항체 변이체를 스크리닝하도록 생물층 간섭계(BLI: biolayer interferometry) 기반 분석을 설계하였다(도 2a). 이 분석은 WT 항체와 비교하여 pH 6.0에서 FcRn에 대한 친화도를 향상시키거나(AAA, LS 및 YTE) 감소시키는(H435A, H310A/H435Q)하는 여러 벤치마크 변이체를 사용하여 개발하였다. NiNTA 바이오센서는 his-태그된 항원을 포획하고, 이어서 조절 배지를 모방하는 pH 7.4에서 각 항체 변이체를 포획하였다(도 2a). 인간 IgG1로부터 대략 25배 더 느린 오프 속도를 갖고 인간 FcRn(hFcRn)보다 Octet 연구에 더 적합한 pH 6.0에서 래트 FcRn(rFcRn)에 대한 결합 동역학을 각각의 변이체에 대해 측정하였다(도 2b). H435A(도 2b, 단일 점이 산재된 긴 대시) 및 H310A/H435Q(도 2b, 2개의 점이 산재된 긴 대시) 변이체는 FcRn 결합 동역학을 거의 또는 전혀 나타내지 않는다(또한, 예를 들어 문헌[Shields et al., supra; Medesan et al., J Immunol. (1997) 158:2211-7]; 및 문헌[Raghavan et al., Biochemistry (1995) 34(45):14649-57] 참조). AAA(도 2b, 짧은 대시), LS(도 2b, 단일 점이 산재된 짧은 대시) 및 YTE(도 2b, 긴 대시) 변이체는 모두 WT(도 2b, 실선)에 비해 FcRn 오프 속도에서 2~7.3배 감소된 더 느린 해리 동역학을 나타낸다. 이것은 Octet 스크리닝이 교란된 rFcRn 해리 역학을 갖는 변이체를 구별하는 데 적합하다는 것을 입증하였다.
IgG1 항체인 mAb1은 감소된 FcRn 오프 속도를 갖는 돌연변이체를 스크리닝하기 위해 포화 돌연변이유발 라이브러리를 생성하는 모델 시스템으로 사용하였다. mAb1의 Fc 영역에서 11개 위치를 FcRn 계면에 대한 근접성 또는 직접적인 기여에 기초하여 선택하였다(도 1의 A 및 도 1의 B)(예를 들어, Oganesyan 등의 상기 문헌, 및 Shields 등의 상기 문헌 참조). 이러한 위치에서 모든 점 돌연변이는 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여 구축하였고 발현을 위해 Expi293 세포에서 형질감염시켰다. 상기 기술된 바와 같이 포화 라이브러리 돌연변이체에 대해 조절 배지 스크리닝을 수행하였다. 변이체의 하위세트에 대한 정규화된 FcRn 결합 Octet 센서그램을 야생형(도 2c, 두꺼운 긴 대시) 및 모크 음성 대조군(도 2c, 점선)과 함께 도 2c(긴 대시)1에 나타낸다. 모크는 관찰 가능한 FcRn 결합의 결여를 보였다. 동역학 프로파일에서 신호 변화가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았기 때문에 몇몇 돌연변이체는 rFcRn의 결합을 분명히 방해하였다(도 2c, 점선(모크) 아래에 위치한 긴 대시). 개선된 FcRn 오프 속도를 갖는 변이체에 대한 컷오프는 WT 항체의 평균보다 낮은 3개의 표준 편차로 정의되었다. 도 2c에 도시된 돌연변이의 하위세트에서, 2개(도 2c, 실선)는 야생형 항체(도 2c, 두꺼운 긴 대시)와 비교하여 유의하게 감소된 오프 속도를 가졌으나 나머지 변이체는 rFcRn 오프 속도가 유사하였거나(도 2c, 단일 점이 산재된 짧은 대시) 또는 더 빨랐다(도 2c, 점선(모크)).
모든 단일 점 돌연변이에 대한 rFcRn 오프 속도는 위치와 돌연변이별로 도 2d 및 도 14에 도시한다. 데이터는 야생형에 비해 rFcRn 오프 속도의 배수 변화에 따라 4가지 범주 중 하나로 분류되고, 야생형 종은 흑색 사각형으로 표시된다.
도 14에서, 포화 라이브러리의 11개 위치에서 가능한 모든 치환에 대한 rFcRn 오프 속도의 배수 변화를 WT 항체의 평균에 정규화하고 색상으로 코딩하였다. 모든 돌연변이는 결합이 거의 또는 전혀 없음(짙은 회색), 더 빠른 rFcRn 오프 속도(회색), WT-유사 rFcRn 오프 속도(가로선) 및 느린 rFcRn 오프 속도(그리드)의 네 가지 범주 중 하나로 분류하였다. 다중 변이체는 WT 항체보다 느린 rFcRn 오프 속도를 보였다(그리드).
도 14에서 짙은 회색으로 착색된 돌연변이체는 모크(도 2c, 점선)와 유사한 방식으로 rFcRn에 대한 결합을 거의 또는 전혀 나타내지 않았고, M252, I253 및 S254 루프에 국한되었다. I253에서의 유일한 돌연변이는 메티오닌과 발린이었고, 둘 다 rFcRn 오프 속도를 상당히 증가시켰고, 이는 FcRn 상호작용에 대한 I253의 중요성을 더욱 뒷받침한다. 또 다른 120개의 변이체(도 21 및 도 14, 밝은 회색 직사각형)는 약 50%가 각각의 CH2 및 CH3 도메인에 위치하여 rFcRn과의 상호작용을 불안정화시켰다. 25개의 돌연변이체는 WT-유사 오프 속도(도 2d 및 도 14, 백색 직사각형)를 갖고 11개 위치 중 8개는 적어도 하나의 WT-유사 돌연변이를 보유한다(도 14, 백색 직사각형). 다음 돌연변이는 야생형과 비교하여 상당히 감소된 rFcRn 오프 속도를 가졌다(도 2d 및 도 14, 흑색 직사각형): M252Y, T256D/E, K288D/N, T307A/E/F/M/Q/W, E380C, N434F/P/Y 및 Y436H/N/W. M252Y, N434F 및 N434Y 돌연변이는 WT 항체보다 2배 이상 느린 오프 속도를 가졌다(도 2d). 이들 돌연변이는 추가 시험관 내 FcRn 동역학 특성화를 위해 단백질 A 크로마토그래피로 발현 및 정제되었다.
실시예 3: pH 6.0에서의 Biacore ™ FcRn 결합 동역학
AAA, LS 및 YTE 변이체를 pH 6.0에서 인간 및 래트 FcRn 모두에 대한 Biacore™를 사용한 FcRn 결합 동역학 측정에서 양성 대조군으로 사용하였다. FcRn에 대한 농도 의존적 결합은 야생형, 벤치마크(도 3) 및 리드(도 4a 및 4b)를 포함한 모든 변이체에 대해 관찰하였으며, 인간 및 래트 FcRn을 1회 주사한 경우의 결합 프로파일은 각각 도 5a 및 도 5b에 나타냈다. 야생형 항체는 각각 2380 ± 470 nM 및 207 ± 43 nM 친화도의 인간 및 래트 FcRn에 대한 결합 친화도를 가졌다(표 1).
[표 1]
Figure pct00004
Figure pct00005
표 1에 표시된 모든 데이터는 각 열의 상단에 표시된 실험 기술을 사용하여 얻었다.
정제된 단백질을 사용한 Octet에 의한 rFcRn 오프 속도는 조절 배지에서 스크리닝으로부터 얻은 동역학 상수와 비교하여 측정하였다. 용출 pH는 FcRn 친화성 크로마토그래피에 의해 3회(n = 3) 반복하여 측정하였고 DSF는 열 안정성을 3회(n = 3) 반복하여 조사하였다. 인간 및 래트 FcRn에 대한 FcRn 결합 동역학은 Biacore™에서 일련의 항체 농도를 2회 반복하여(n = 2) 얻고 독립적으로 피팅하였다. pH 7.4에서 인간 및 래트 FcRn을 갖는 각 변이체의 정상 상태 결합 반응(RU)은 Biacore™를 사용하여 삼중으로(n=3) 1000 nM 항체로 측정하였다. 각 측정 단위는 다음과 같다: Octet pH 6.0 rFcRn 오프 속도(x10-3 s-1); 용출 pH(단위 없음); DSF Tm(℃); BiacoreTM pH 6.0 hFcRn 온 속도(x104 M-1 s-1), 오프 속도(x10-1 s-1) 및 KD,app(x109 M); BiacoreTM pH 6.0 rFcRn 온 속도(x104 M-1 s-1), 오프 속도(x10-3 s-1) 및 KD,app (x109 M); 및 BiacoreTM pH 7.4 정상 상태 결합 반응(RU).
도 5b에서, AAA(점선), LS(2개의 점으로 산재된 대시) 및 YTE(단일 점이 산재된 대시) 변이체는 WT와 비교하여 1.6 내지 10.4배 향상된 결합 친화도를 가졌다. 가장 긴밀한 FcRn 친화도를 갖는 벤치마크 변이체의 정체는 LS가 hFcRn에 대한 가장 긴밀한 친화성을 갖는 반면 rFcRn이 YTE에 대한 더 긴밀한 친화도를 갖기 때문에 종 특이적이었다(표 2A).
[표 2A]
Figure pct00006
Figure pct00007
인간 및 래트 FcRn 모두에 대한 대부분의 리드 변이체(도 5a 및 5b, 다양한 음영의 실선)는 WT 또는 벤치마크 변이체보다 상당히 느린 온 속도를 보였다(>2배)(표 1). N434F 및 N434Y 돌연변이는 두 종의 FcRn에 대해 향상된 온 속도를 나타내는 유일한 변이체였다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, hFcRn과의 더 느린 결합 동역학의 결과로서, rFcRn과 달리, 리드 변이체의 겉보기 결합 친화도는 일반적으로 WT보다 약하였다(도 5c 및 5d, 표 1). rFcRn에 대한 친화도는 YTE보다 약하였다(도 5d, 왼쪽 하단을 향한 대각선, 표 2A).
어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 이러한 결과는 단일 돌연변이가 LS 및 YTE 변이체를 능가하는 친화도를 향상시키기에 충분하지 않음을 나타냈다. (hFcRn에 대한 변이체의 약한 결합 친화도로 인해) FcRn 오프 속도의 순위를 매겨 인간 및 래트 FcRn 모두에 대해 감소된 오프 속도를 갖는 하위세트를 밝혔다: M252Y, N434F/P/Y, T256D/E 및 T307A/E/F/Q/W(표 2A). 벤치마크 변이체를 능가하도록 Fc 영역의 FcRn 결합 능력을 추가로 개선하기 위해 조합된 이들 변이체는 추가의 관심 대상이다.
리드 변이체에 대한 시험관 내 특성화 파라미터는 표 2B에 나타낸다.
[표 2B]
Figure pct00008
표 2B에서 모든 데이터는 각 열의 상단에 있는 실험 기술을 사용하여 얻었다. FcRn 친화성 크로마토그래피, DSF 및 FcγRIIIa 결합을 3회(n = 3) 반복하여 수행하였다. 인간 및 래트 FcRn에 대한 FcRn 결합 동역학은 사중으로 얻고 독립적으로 피팅하였다. 단위: DSF Tm(℃); FcγRIIIa 결합(WT에 대한 배수 변화), Biacore™ pH 6.0 hFcRn 온 속도(x104 M-1 s-1), 오프 속도(x10-1 s-1) 및 KD,app(x109 M); Biacore™ pH 6.0 rFcRn KD,app(x109 M); Biacore™ pH 7.4 hFcRn 및 rFcRn 정상 상태 RU(RU).
실시예 4: 조합 변이체는 FcRn 결합 오프 속도를 추가로 감소시킨다
다중 리드 돌연변이는 T307 및 N434와 같이 단일 위치(도 14, 흑색 직사각형)에 위치하였으며, 여기서 각각 6개 및 3개의 돌연변이가 더 느린 FcRn 해리 동역학을 나타내는 것으로 확인되었다. 이들 위치에서 hFcRn에 대한 가장 느린 FcRn 오프 속도를 갖는 돌연변이만을 조합 변이체의 생성에 사용하였다. 이 경우, T307Q, T307W, N434F 및 N434Y를 M252Y, T256D 및 T256E와 혼합하여 혼합 프라이머 PCR 및 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여 이중, 삼중 및 사중 변이체를 얻었다. 전체적으로, 조합 라이브러리는 7개의 리드 단일, 18개의 이중, 20개의 삼중, 8개의 사중 변이체 및 WT 항체를 포함하여 54개의 변이체로 이루어졌다. 이러한 변이체의 명명법은 다음과 같다. 야생형 배경에는 M252, T256, T307 및 N434가 포함되며 MTTN으로 다시 표시된다. 이와 같이, 삼중 변이체인 YTQY는 M252Y, T307Q 및 N434Y 돌연변이를 포함하는 반편, 위치 256에서 WT 트레오닌을 유지한다.
단일 돌연변이와 마찬가지로, Biacore™를 사용한 pH 6.0에서의 FcRn 결합 동역학을 사용하여 개선된 친화도를 갖는 조합 변이체를 결정하였다. 각각의 단일(2개의 점이 산재된 긴 대시), 이중(단일 점이 산재된 긴 대시), 삼중(긴 대시) 및 사중(짧은 대시)의 대표적인 FcRn 결합 동역학 자취는 WT(점선) 및 FcRn의 각각의 종에 대해 가장 긴밀한 친화성을 갖는 벤치마크 변이체(hFcRn: LS(2개의 점이 산재된 긴 대시); rFcRn: YTE(실선))와 비교하여 도 6a 및 6b에 도시되어 있다. hFcRn 온 및 오프 속도(도 6c)는 2개의 단일, 15개의 이중, 18개의 삼중 및 8개의 사중 변이체가 LS 변이체(도 6c, 점선)보다 향상된 결합 친화도를 가짐을 나타냈다. 유사하게, 하나의 삼중 변이체를 제외한 모든 조합은 YTE보다 rFcRn에 대해 더 긴밀한 친화도를 가졌다(도 6d, 왼쪽 하단을 향한 대각선). hFcRn의 경우, 추가적인 FcRn 향상 돌연변이가 결합 친화력을 더욱 증가시켰다(도 6c). hFcRn에 대한 가장 긴밀한 친화도를 갖는 5개의 조합은 모두 사중 변이체(도 6c, 체크무늬)였으며 결합 친화도가 야생형보다 대략 500배 더 크다. 가장 높은 친화도를 갖는 변이체가 이중 변이체(도 6d, 수평선)였기 때문에 rFcRn에서는 유사한 현상이 발생하지 않았다(도 6d). 3중(도 6d, 수직선) 및 사중(도 6d, 체크무늬) 변이체는 일반적으로 오프 속도에서 약간의 감소(2배 미만)만을 나타내었지만, 감소된 결합 속도도 나타냈다(도 6d). 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 이러한 결과는 rFcRn에서는 도달했지만 hFcRn에서는 도달하지 않은 FcRn 겉보기 결합 친화도(대략 0.5nM)와 관련하여 하한이 존재할 수 있음을 시사한다(도 6b). 전체적으로, 40개 이상의 조합 변이체가 벤치마크 변이체보다 더 긴밀한 친화도를 가졌으며 생체 내 연구에 유리한 특성을 가진 조합을 선택하려면 추가 특성화가 필요하다.
실시예 5: 조합 변이체는 생리학적 pH에서 상당한 결합을 유지한다
pH 6.0에서 상당히 개선된 FcRn 친화성의 결과로, pH 7.4에서 FcRn 친화성 크로마토그래피 및 Biacore™ 정상 상태 측정을 사용하여 pH 의존성에 대한 영향을 조사하였다. FcRn 친화성 크로마토그래피는 선형 pH 구배를 사용하여 돌연변이에 의한 pH 의존성의 섭동을 직접 측정한다. 약한 FcRn 결합을 갖는 변이체인 H435A 및 H310A/H435Q는 pH에 관계없이 컬럼에 결합하지 않았다(도 8a). WT는 생리학적 pH(pH 7.37 ± 0.05) 근처에서 용출된 반면 AAA, LS 및 YTE는 더 높은 pH가 필요하였다(표 2B).
모든 조합 변이체 및 7개의 리드 단일 변이체는 WT보다 친화성 컬럼에서 용출하기 위해 더 높은 pH를 필요로 하였다(도 8a 및 8c). N434F/Y 변이체는 LS(표 2B)보다 높은 pH에서 용출되었으며, 이는 과학적 이론에 얽매이지 않고 이러한 변이체 단독 및 조합 모두가 pH 의존성을 방해하였음을 나타낸다. 대표적인 크로마토그램은 돌연변이의 수에 따라 더 높은 용출 pH로의 명확한 이동을 보여주었다(도 9a 및 도 9b). 용출 pH와 hFcRn 오프 속도(도 9c) 사이의 강한 상관관계(R2 = 0.94)는 pH 6.0에서 더 느린 FcRn 오프 속도가 FcRn 변이체에 대한 증가된 용출 pH에 직접적으로 기여했음을 나타낸다.
FcRn 결합 동역학 실험은 생리학적 조건하에서 잔존 결합 활성을 측정하기 위해 Biacore™를 사용하여 pH 7.4에서 수행하였다. 정상 상태 RU는 잔류 FcRn 결합 친화도의 척도로 사용하였는데, 이는 일부 변이체가 이 pH에서 신뢰할 수 없는 동역학을 나타내고 결합이 거의 또는 전혀 없었기 때문이다. 단일(2개의 점으로 산재된 긴 대시), 이중(단일 점이 산재된 긴 대시), 삼중(긴 대시) 및 사중(짧은 대시) 변이체의 대표적인 동역학 자취를 LS(도 7a, 실선) 및 YTE(도 7b, 실선)와 비교하여 도 4에 나타냈다. 이들 2개의 변이체는 각각 pH 7.4에서 인간 및 래트 FcRn에 대한 가장 큰 잔존 결합을 나타냈다. 리드 단일 변이체의 대부분은 WT(4.3 ± 1.0 RU)에 비해 FcRn 결합이 약간 증가했지만 N434F/Y 돌연변이를 제외하고 AAA(13.1 ± 1.7 RU), LS(18.5 ± 2.6 RU) 및 YTE(13.1 ± 1.6 RU)보다 적었다(표 2A 및 2B). 조합 변이체는 또한 N434F/Y보다 훨씬 더 큰 정도로 pH 7.4에서 FcRn의 두 종에 대한 상당한 잔존 결합을 보유하였다(도 7a 및 7b). 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 생체 내 연구를 위한 이상적인 후보는 낮은 pH에서 증가된 FcRn 결합을 갖는 변이체(예컨대, AAA, LS 및 YTE 변이체)이지만, WT와 유사한 방식으로 상승된 pH에서 낮은 수준의 결합을 유지한다. 도 7c 및 7d에 도시된 플롯에서, 이들 조합은 인간 및 래트 FcRn 각각에 대한 각각의 pH에서 LS 및 YTE 변이체의 친화도로 지정된 좌측 하단 사분면을 차지할 것이다.
실시예 6: FcRn 친화성 크로마토그래피
조합 변이체는 pH 6.0에서의 겉보기 결합 친화도와 pH 7.4에서의 정상 상태 RU 사이에 중간 정도의 양의 상관관계(hFcRn: R2 = 0.69, rFcRn: R2 = 0.71)를 나타냈다(도 7c 및 7d). 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 이들 결과는 pH 6.0에서 상당히 더 높은 친화도가 전형적으로 pH 7.4에서 더 큰 잔류 FcRn 결합으로 해석된다는 것을 나타낸다. 이러한 변이체는 혈류에서 FcRn에 결합된 상태로 유지될 수 있고 높은 FcRn 친화성 Abdeg 돌연변이와 유사하게 짧은 혈청 반감기를 갖고/거나 제거를 촉진할 수 있다(YTEKF; 예를 들어, Swiercz et al., J Nucl Med. (2014) 55:1204-7; and Vaccaro et al., Nat Biotechnol. (2005) 23:1283-8] 참조). IgG-FcRn 상호작용은 pH 의존적이며 낮은 pH(<pH 6.5)에서만 발생하기 때문에 포화 돌연변이는 소수성 또는 전하-유도 기여를 통해 상호작용을 강화할 수 있으며, 이는 중요한 히스티딘 잔기의 탈양성자화(도 1의 B에 표시된 바와 같이) 및 생리학적 pH에서 이러한 상호작용의 약화를 방해할 수 있다. 그 결과, FcRn-결합 상호작용은 결과적으로 환경 pH에 덜 민감해진다.
FcRn 친화성 크로마토그래피는 FcRn 상호작용 pH 의존성의 섭동을 직접 측정하기 위해 선형 pH 구배를 사용한다(예를 들어, Schlothauer et al., 상기 참조). AAA, LS, YTE, H435A 및 H310A/H435Q 변이체를 사용한 FcRn 친화성 크로마토그래피는 pH 5.5에서도 통과액 내 용출물에서도 H435A(도 8a, 밝은 회색 실선) 및 H310A/H435Q(도 8a, AQ, 짙은 회색 실선)에 결합하지 않는 것으로 나타났다. 야생형 항체는 생리학적 pH(pH 7.37 ± 0.05) 부근에서 용출된 반면, Octet(도 2b~도 2d) 및 Biacore™(도 3)에 의해 야생형보다 더 느린 오프 속도 및 더 긴밀한 FcRn 결합 친화도를 갖는 AAA, LS 및 YTE는 컬럼에서 분리하기 위해 상당히 높은 pH가 필요하였다(AAA: 7.94 ± 0.06; LS: 8.29 ± 0.03; YTE: 8.14 ± 0.03). 용출 프로파일은 조합 라이브러리의 모든 변이체가 야생형보다 친화성 컬럼에서 용출하기 위해 더 높은 pH를 요구함을 보여주었다. 단일(2개의 점이 산재된 긴 대시), 이중(단일 점이 산재된 긴 대시), 삼중(긴 대시) 및 사중(짧은 대시) 변이체에 대한 평균 용출 pH에서의 대표적인 크로마토그램을 도 9a에 도시한다. 7개의 리드 단일 변이체(M252Y, T256D, T256E, T307Q, T307W, N434F 및 N434Y)는 WT와 비교하여 컬럼에서 분리하기 위해 더 높은 pH가 필요하였지만(도 10a, 표 3), hFcRn에 대한 야생형 유사 동역학을 가진 변이체(K288D/N, Y436H/H/W) 모두는 야생형과 유사한 pH에서 용출되었다.
[표 3]
Figure pct00009
모든 데이터는 각 열의 상단에 있는 실험 기술을 사용하여 얻었다. 용출 pH는 FcRn 친화성 크로마토그래피에 의해 3회(n = 3) 반복하여 측정하였고 DSF는 열 안정성을 3회(n = 3) 반복하여 조사하였다. 인간 및 래트 FcRn에 대한 FcRn 결합 동역학은 일련의 항체 농도(n = 4)로 Biacore™에서 얻었고 독립적으로 피팅하였다. 각 측정의 단위는 다음과 같다: 용출 pH(단위 없음); DSF Tm(℃); BiacoreTM pH 6.0 hFcRn 온 속도(x104 M-1 s-1), 오프 속도(x10-1 s-1) 및 KD,app (x109 M); BiacoreTM pH 6.0 rFcRn 온 속도(x104 M-1 s-1), 오프 속도(x10-3 s-1) 및 KD,app (x109 M).
N434F/Y 변이체는 둘 다 LS 변이체(N434F: 8.30 ± 0.05; N434Y: 8.46 ± 0.02)보다 더 높은 pH에서 용출되었고 pH 7.4에서 상당한 FcRn 결합을 보여주었다(표 4). 이러한 결과는 이러한 변이체 단독으로 pH 의존성을 방해할 수 있음을 나타낸다. 일반적으로 평균 용출 pH는 FcRn 결합 강화 돌연변이의 수가 증가함에 따라 증가하였다(도 9b). 강한 상관관계(R2 = 0.94)가 hFcRn 오프 속도(도 9c)와 비교하여 용출 pH와 함께 나타났으며; 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 상호작용의 pH 의존성의 방해가 pH 6.0에서 조합 라이브러리에 대해 관찰된 더 느린 FcRn 오프 속도에 직접적으로 기여함을 나타낸다.
실시예 7: 열 안정성
열역학적 안정성이 낮은 항체를 포함한 대부분의 단백질은 접힘 오류 및 응집 경향이 증가하고 새로운 치료제로서의 활성, 효능 및 잠재력을 제한하거나 방해한다. 각 변이체의 열 안정성은 DSF를 사용하여 결정하였으며 보고된 용융 온도(Tm)는 Sypro™ Orange 형광 강도 프로파일에서 첫 번째 전이의 중간점으로 정의하였다.
Tm이 69.0 ± 0.2℃인 WT와 비교하여, LS 변이체는 WT와 유사하고(68.5 ± 0.3℃) AAA 및 YTE는 대략 8℃(AAA: 61.3 ± 0.6℃, YTE: 61.2 ± 0.3℃)만큼 열적으로 불안정하다(도 8b, 9b 및 10b 및 표 2B, 3 및 4). Tm이 69.0 ± 0.2℃인 WT 및 LS와 비교하여 AAA 및 YTE 변이체는 DSF에 의해 대략 8℃만큼 열 안정성이 낮았다.
[표 4]
Figure pct00010
Figure pct00011
야생형 백본에 도입된 돌연변이는 밑줄표시되어 있다. 모든 데이터는 각 열의 상단에 표시된 실험 기술을 사용하여 얻었다. 용출 pH 및 Tm을 3회(n = 3) 반복하여 결정하였다. pH 6.0에서 인간 및 래트 FcRn에 대한 FcRn 결합 동역학은 Biacore™(n = 4)에서 얻었고 독립적으로 피팅하였다. pH 7.4에서 정상 상태 FcRn 결합 반응은 단일 항체 농도에서 Biacore™를 사용하여 3회 반복하여 측정하였다. FcγRIIIa 결합 친화도는 Biacore™를 사용하여 2회 반복하여 일련의 항체 농도로부터 결정하였다. 각 측정의 단위는 다음과 같다. 용출 pH(단위 없음); DSF Tm(℃); Biacore™ pH 6.0 hFcRn 온 속도(x105 M-1 s-1), 오프 속도(x10-2 s-1) 및 KD,app(x109 M); BiacoreTM pH 6.0 rFcRn 온 속도(x105 M-1 s-1), 오프 속도(x10-3 s-1) 및 KD,app (x109 M); BiacoreTM pH 7.4 정상 상태 결합 반응(RU) 및 FcγRIIIa KD,app(x109 M).
18개의 리드 포화 변이체 중 12개(변이체 E380C, M252Y, T256D, T256E, K288N, K288D, N434P, T307A, T307W, Y436H, Y436N, Y436W)는 T307 돌연변이체(야생형에 비해 Tm이 감소하였으며, T307 돌연변이체 중 몇몇(T307E/F/M/Q)은 약간의 안정화를 보였다(표 4). 조합에 사용된 7개의 단일 변이체(도 10B 및 표 4) 중 어느 것도 YTE에 비해 상당히 불안정화되지 않았다. 조합에 사용된 개의 단일 변이체중 어느 것(도 10b 및 표 4)도 YTE(도 8b 및 표 5)에 비해 유의하게 불안정화되지 않았다. 이중(도 9d, 수평선), 삼중(도 9d, 수직선) 및 사중(도 9d, 체크무늬) 돌연변이를 Fc 도메인에 추가하면 단일 돌연변이에 비해 전반적인 열 안정성이 추가로 감소하였다(도 9d, 백색 원). 다중 변이체는 AAA 또는 YTE(61.2 ± 0.3℃)보다 낮은 Tm을 나타냈으며 이러한 이들 변종 중 >60%는 T307W를 포함한다. 사중 변이체(도 9d, 체크 무늬)는 T307W(도 9d)를 포함하는 조합보다 약 6℃ 더 높은 안정성을 갖는 T307Q를 포함하는 조합으로 용융 온도의 뚜렷한 이중 모드 분포를 보였다(도 9d).
실시예 8: Fc 변이체는 FcγRIIIa와의 결합 상호작용을 변경한다
FcRn과의 상호작용 외에도, Fc 영역 힌지 및 CH2 도메인은 FcγRIIIa를 비롯한 다른 Fc 수용체와의 상호작용을 담당한다. 조합 포화 라이브러리의 구축에 사용된 7개의 단일 변이체 중 5개가 CH2 도메인 내에 위치하기 때문에, 이들 수용체와 상호작용하는 능력은 상호작용 인터페이스에서 멀리 떨어진 위치에도 불구하고 야생형에 비해 손상될 수 있다. Biacore™를 사용하여 pH 7.4에서 FcRn 결합과 유사한 방식으로 FcγRIIIa 결합을 측정하여 YTE(도 11a, 짙은 회색) 변이체가 야생형(도 11a, 흑색)에 비해 결합 반응이 약 50% 감소한 것으로 나타났다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, YTE에 대한 감소된 FcγRIIIa 결합은 M252Y 돌연변이(도 11b, 가장 낮은 백색 원)의 결과인데, 이는 이 변이체 단독으로 이 수용체에 대한 친화도가 상당히 감소했기 때문이다. 다른 단일 돌연변이는 이러한 감소된 친화도를 공유하지 않았으며(도 11b, 백색 원), N434F/Y 변이체 단독은 결합을 16~40% 향상시켰다. 이러한 효과는 해당 조합의 전부는 아니지만 대부분으로 전달되었다. 예를 들어, M252Y 함유 조합은 FcγRIIIa 결합에서 17 내지 72% 감소를 보였다(표 5).
[표 5]
Figure pct00012
Figure pct00013
한 변이체, MDQF(도 11b, 삼중 변이체 범주에서 가장 높음)는 FcγRIIIa 결합에서 극적인 140% 증가를 보였다. 따라서, 조합 포화 라이브러리는 특정 이펙터 기능을 가진 치료 항체를 맞춤화하는 데 활용할 수 있는 광범위한 Fc 수용체 기능을 가진 변이체를 제공하였다.
도 11c는 WT 및 YTE 변이체와 비교한 7개의 리드 단일 변이체의 FcγRIIIa 결합 반응의 상자 플롯을 보여준다.
실시예 9: 7개의 리드 조합은 FcRn 상호작용의 pH 의존성의 균형을 이룬다
어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 생체 내 추가 연구를 위한 후보 변이체는 도 7c 및 도 7d에 도시된 플롯의 좌측 하단 사분면을 차지하였다. 7개의 변이체는 hFcRn에 대한 이러한 기준을 충족시키고 5개의 이중 및 2개의 삼중 조합(MDQN, MDWN, YDTN, YETN, YTWN, YDQN 및 YEQN)을 포함하였으며 N434 위치에서 돌연변이를 포함하지 않았다(표 3). 이들 조합 각각은 AAA(pH 7.94 ± 0.06)와 LS(pH 8.29 ± 0.03) 사이에서 FcRn 친화성 컬럼에서 용출되었으며 YDQN은 최고 pH 8.51 ± 0.14에서 용출되었으며(도 12a, 표 5), 이는 pH 의존성에서의 약간의 섭동 및 pH 7.4에서의 더 큰 잔존 결합(표 2A)을 나타낸다. 변이체 중 하나(MDQN)는 야생형과 유사한 열 안정성을 보유하고, 6개는 YTE 변이체와 비교하여 Tm이 유사하거나 감소하였다(도 12b, 표 4). FcγRIIIa 결합 분석에서, 5개의 조합 변이체는 YTE와 유사한 감소를 나타냈다(표 4). 단일 돌연변이 대한 추가 조사는 M252Y가 FcγRIIIa 결합에 유의하게 영향을 미침을 밝혀냈으며, 어떠한 이론에도 얽매이지 않고 이 효과를 이 돌연변이와의 조합으로 해석된다. 나머지 6개의 단일 돌연변이는 WT 유사이거나 이 수용체에 대한 결합이 약간 개선되었다. FcRn 결합 특성, 열 안정성 및 FcγRIIIa 결합을 기반으로 하는 추가 연구를 위해 3개의 조합 변이체를 선택하였다. DQ(T256D/T307Q), DW(T256D/T307W) 및 YD(M252Y/T256D)는 각각 LS 변이체로서 최적의 FcRn 결합 특성(표 2B)을 제공하였다(도 12e). 각 변이체는 다양한 기능을 제공하는 다양한 범위의 열 안정성 및 FcγRIIIa 결합 특성(도 12f 및 12g, 표 2B)을 제공한다. 도 12h는 균질한 가교 RF의 플롯이다.
각각 LS(도 13a, 두꺼운 긴 대시) 및 YTE 변이체(도 13b, 두꺼운 긴 대시)와 비교하여 pH 6.0에서 인간 및 래트 FcRn 둘 모두에 대한 겉보기 결합 친화도의 향상은 온 및 오프 속도 사이에서 절충이 있었다(도 13a 및 13b, 표 4). 일반적으로 오프 속도가 더 빠른 조합은 온 속도 더 빠르며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 이 관찰 결과는 인간과 래트 FcRn 사이에서 유지되었다(표 4). 또한, 이들 변이체 모두는 pH 7.4에서 hFcRn에 대해 LS 변이체(도 13c, 두꺼운 긴 대시)보다 정상 상태 반이이 더 낮았다. 이러한 결과는 5개의 M252Y 함유 변이체, YDTN, YETN, YTWN, YDQN 및 YEQN이 YTE와 비교하여 pH 7.4에서 FcRn 결합이 상승했기 때문에(표 5) rFcRn과 일치하지 않았다. MDQN 및 MDWN 변이체는 인간 및 래트 FcRn 사이에 교차 반응성인 유일한 조합이었다. 또한, 이들 2개의 변이체는 M252Y 함유 변이체와 유사한 정도로 FcγRIIIa와의 상호작용을 교란시키지 않았다(도 12c 및 12d 및 표 5; MDQN: 600 ± 4 nM; MDWN: 512 ± 30 nM; WT: 467 ± 99nM). 따라서, 주요 FcRn 상호작용 위치에서의 포화 및 조합 돌연변이 유발은 상호작용의 pH 의존성의 균형을 유지하고, Fc 수용체와의 기능성을 유지하고, 생체 내에서 FcRn 기능성을 향상시킬 수 있고, 치료 항체의 혈청 반감기를 연장할 수 있는 리드 변이체의 식별로 이어졌다.
실시예 10: 리드 조합 변이체의 류마티스 인자 결합 특성
이러한 돌연변이가 항체 표면 전하 및 면역원성을 변경할 수 있기 때문에, 리드 변이체의 등전점 및 RF 결합을 조사하였다. 산성이 더 큰 항체는 항체 약물동태학을 연장하는 것으로 생각되었다. WT 및 LS 대조군과 비교하여, 3개의 리드 모두 T256D 치환의 결과로 pI에서 대략 0.2 pH 단위를 감소시켰다. FcRn 강화 돌연변이는 중복되는 상호 작용 인터페이스로 인해 류마티스 인자(RF)와 같은 숙주 항체에 대한 결합을 동시에 변경할 수 있다. 균질 가교 ELISA를 리드 변이체에 대한 RF 결합의 변화를 측정하도록 조정하였다. 흥미롭게도, LS 및 YTE는 WT와 비교하여 RF 결합에서 완전히 반대되는 이동을 보였다(도 12h). LS는 RF 결합을 유의하게 증가시킨 반면, YTE는 유의한 감소를 나타냈다(p <0.001). YD(p<0.001) 및 DW(p<0.01)도 RF 결합을 상당히 감소시켰지만, DQ는 WT와 유사한 반응을 생성하였다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 이러한 결과는 DQ, DW 및 YD가 LS에 비해 면역원성 이점을 제공할 수 있음을 나타낸다. YD, DW 및 DQ 변이체는 벤치마크 YTE 및 LS 변이체에 비해 개선된 FcRn 결합 특성과 함께 활용할 수 있는 다양한 주요 항체 특성을 나타낸다.
실시예 11: 리드 조합 변이체는 다른 항체로 이동될 수 있다
도 15a에 도시된 바와 같이, CM5 센서 칩을 사용하여 새로운 결합 분석을 개발하였다. 결합 분석에는 CM5 센서 칩에 스트렙타비딘을 고정화하여 비오티닐화 FcRn을 약 30 RU로 포획하는 단계를 포함하며, 이는 필요에 따라 보충하된다. 항체 결합 동역학은 pH 6.0 및 7.4, 및 재생을 위해 pH 8.5에서 측정하였다. 도 15b 및 15c는 새로운 결합 분석을 사용한 FcRn의 직접 고정화 및 비오티닐화 FcRn의 스트렙타비딘 포획 각각을 보여준다.
pH 6.0에서 MAb2의 FcRn 결합: 마우스 FcRn의 경우, 리드 mAb2 변이체는 LS 변이체(대시) 및 야생형(흑색)보다 느린 오프 속도를 나타낸다(도 16a). 인간 FcRn의 경우, 리드 변이체는 모두 더 빠른 온 속도를 갖지만 LS(대시)와 유사한 오프 속도를 갖는다(도 16b).
pH 7.4에서의 MAb2의 FcRn 결합: 모든 리드 변이체는 LS(점선)와 비교하여 pH 7.4에서 감소된 인간 FcRn 결합을 나타냈다(도 17a). mAb1mAb1`배경에서와 같이, DW(MDWN) 및 DQ(MDQN) 변이체도 pH 7.4에서 마우스(래트) FcRn에 대한 더 낮은 잔존 결합을 나타냈다(도 17b).
리드 변이체는 LS와 비교하여 pH 6.0에서 더 높은 결합 친화도 및 pH 7.4에서 더 낮은 잔존 결합을 유지하였다(도 18). 중요하게는, 변이체는 FcRn 결합에 거의 영향을 미치지 않으면서 서로 다른 IgG1 배경 간에 이동할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 도 19에 나타난 바와 같이, LS는 배경에 관계없이 유사한 용출 pH를 가졌다. mAb2 배경에서 WT, DQ 및 DW는 아마도 mAb2 배경에서 pH 6.0에서 더 긴밀한 결합의 결과로 mAb1 배경에서보다 더 높은 용출 pH를 나타냈다.
MAb2 배경 변이체는 모두 도 20에 도시된 바와 같이 약간 증가된 열 안정성을 나타냈다.
도 21에 나타난 바와 같이, MAb1 배경과 유사하게, YD(YDTN)는 FcγRIIIa 결합 반응(좌측) 및 친화도(우측)의 감소를 나타냈다. DQ(밝은 회색) 및 DW(짙은 회색)는 MAb2 배경에서 WT(흑색)와 유사한 FcγRIIIa 결합 특성을 보여주었다. LS에 대한 FcγRIIIa 결합에 대한 효과는 MAb1과 mAb2 간에 일치한다.
따라서, mAb2 배경의 리드 변이체는 MAb1 배경의 동일한 리드 변이체와 비교하여 FcRn 결합, pH 의존성, 열 안정성 또는 FcγRIIIa 결합에 유의한 영향을 미치지 않는다.
한 실시양태에서, DQ(T256D/T307Q), DW(T256D/T307W) 및 YD(M252Y/T256D) 변이체를 추가의 IgG1 항체 및 재조합 Fc 단편에 혼입시켰다: mAb2는 mAb1과 상이한 항원을 인식하고, mAb3은 Fc 단편이다. 각각의 경우에, pH 의존적 FcRn 결합 동역학(도 22)은 용출 pH, 열 안정성 및 FcγRIIIa 결합 친화도 이외에 매우 유사하였다(표 2b 및 표 6). 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 이러한 결과는 DQ, DW 및 YD 변이체가 Fc 도메인으로 이루어진 단백질에 개선된 FcRn 결합 특성을 부여했음을 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00014
실시예 12: 리드 변이체는 생체 내 혈장 항체 제거 반감기를 연장하였다
시노몰구스 원숭이 및 hFcRn 트랜스제닉 마우스(균주 Tg32)를 사용하여 항체 순환 반감기에 대한 영향에 대한 DQ, DW 및 YD 변이체의 약물동태학(PK)을 WT 및 LS 대조군과 비교하여 조사하였다(예를 들어, 문헌[Avery et al. Mabs(2016) 8: 1064-78] 참조). 시노몰구스 FcRn을 사용한 FcRn 결합 연구는 hFcRn에 대한 유사한 결합 친화성을 나타냈다(도 23a~도 23b; 표 6). 각 동물에 WT, LS, DQ, DW 또는 YD 변이체를 정맥내 주사하고, 항체 농도를 질량 분석법을 통해 정량화하여 원숭이(도 24a) 및 hFcRn 트랜스제닉 마우스(도 24b)에서 제거율 및 혈청 반감기를 결정하였다. 제거율 및 혈청 반감기는 시간의 함수로서 항체 농도의 비구획 모델로부터 얻었다. 세 가지 리드 변이체와 LS 모두 원숭이와 마우스 모두에서 WT와 비교하여 유의하게 감소된 제거율을 보였다(p<0.001). WT 항체의 혈장 반감기는 원숭이와 마우스에 대해 각각 9.9 ± 0.5 및 11.7일이었다. 또한, 확인된 LS 벤치마크 및 변이체는 두 종 모두에서 야생형과 비교하여 제거 반감기의 상당한 증가를 나타냈다(원숭이 및 마우스에서 각각 2.5배 및 1.7배 증가)(표 7). DQ, DW 및 YD는 LS 벤치마크와 유사한 반감기 연장을 보였다(표 7). 포화 돌연변이 유발을 통해 본원에서 확인된 DQ, DW 및 YD 돌연변이는 마우스 및 비인간 영장류 동물 모델 모두에서 WT 대응물보다 유의하게 연장된 혈장 반감기를 입증하였다.
[표 7]
Figure pct00015
표 7에서 제거율 및 혈장 반감기는 mAb2를 사용하여 결정하였다. 각 제거율과 반감기는 시노몰구스 원숭이에 대한 n = 3의 평균이었고 n=6 hFcRn 트랜스제닉 마우스 풀에서 단일 평가였다. WT 대비 배수 및 LS 대비 배수는 각각 WT 및 LS와 비교하여 혈청 반감기의 상대적 개선을 보여준다. * ADA 형성으로 인해 n = 2, ** 부분적 피하 투여 경로로 인해 n = 2
실시예 13: pH 6.0 및 pH 7.4에서 향상된 FcRn 결합을 갖는 조합 변이체
실시예 2에 기술된 바와 같은 Octet 스크리닝(BLI 기반 스크리닝)에 기초하여, 다양한 단일, 이중, 삼중 및 사중 변이체를 생성하였고, pH 6.0 및 pH 7.4에서 FcRn에 대한 이들의 결합을 평가하였다(표 8; 치환된 잔기는 밑줄 표시됨).
[표 8]
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
표 8에는 다양한 단일, 이중, 삼중 및 사중 돌연변이체 뿐만 아니라 벤치마크 변이체(AAA, LS, YTE)에 대한 pH 6.0에서 FcRn에 대한 결합 친화도 및 pH 7.4에서 FcRn에 대한 정상 상태 결합을 표시한다.
이들 값은 도 25에 도시되어 있다. 도 25는 pH 6.0에서의 결합 친화도 및 pH 7.4에서의 RU의 비교를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 벤치마크 변이체 LS는 테스트된 벤치마크 변이체(AAA, LS, YTE)의 pH 6.0에서 가장 긴밀한 결합 친화도 및 pH 7.4에서 가장 큰 잔존 결합을 갖는다.
도 25에 도시된 여러 조합 변형이 pH 6.0 및 pH 7.4에서 향상된 FcRn 결합 친화성을 나타내었음을 확정되었다. 어떤 조합 변이체가 pH 6.0 및 pH 7.4 둘 모두에서 MST-HN 변이체(본원에서 "YTEKF 벤치마크"로 지칭됨, 이는 Met252, Ser254, Thr256, His433 및 Asn434에서 Tyr252, Thr254, Glu256, Lys433 및 Phe434로의 돌연변이를 포함함)보다 더 긴밀한 결합을 보였는지를 조사하기 위해서, 다음 방법론을 수행하였다. 비오틴 CAPture 방법에 의해 비오틴화된 인간 및 시노몰구스 FcRn의 포획을 수행하였다(개략도에 대해 도 26 참조). pH 6.0의 경우 1000 nM의 농도 시리즈(5개 지점)를 2회 반복하여 수행하였다. pH 7.4 및 8.0의 경우, 2회 반복하여 수행한 1000 nM로부터의 농도 시리즈에 더하여, 단일 농도(1000 nM) 주입을 3회 반복하여 수행하였다. pH 7.4 및 8.0 실험은 이 pH에서의 결합을 관찰하기 위해 pH 6.0에 비해 10배 증가된 FcRn 포획 수준에서 수행하였다. pH 9.0의 경우 단일 농도(1000 nM) 주입을 3회 반복하여 수행하였다. pH 9.0 실험은 이 pH에서의 결합을 관찰하기 위해 pH 6.0에 비해 100배 증가된 FcRn 포획 수준에서 수행하였다. pH 6.0의 경우 1000 nM의 농도 시리즈(5개 지점)를 2회 반복하여 수행하였다. pH 7.4의 경우, 단일 농도(1000 nM) 주입을 3회 반복하여 수행하였다(이 pH에서 결합을 관찰하기 위해 각 FcRn의 포획 수준을 10배 증가시킴). 결합: 180초; 해리: 300초. 도 27a~도 27g에 나타낸 야생형, YTEKF 벤치마크 및 10개 FcRn 길항제 조합 변이체의 pH 6.0(인간: 도 27a, 시노: 도 27b), pH 7.4(인간: 도 27c, 시노: 도 27d) 및 pH 8.0(인간: 도 27e, 시노)에서의 인간 및 시노 FcRn 결합 동역학 센서그램: 조사된 모든 변이체는 pH 6.0에서 WT와 비교하여 인간 및 시노 FcRn 둘 다에 대해 2배 더 강력한 친화도 및 더 높은 pH에서 관찰 가능한 동역학을 보여주었다. 조사된 변이체는 FcRn에 대한 향상된 친화성에 기인한 6개의 사중(YDQF, YDQY, YDWF, YDWY, YEQY 및 YEWY), 3개의 삼중(MDWY, YDTY, YTWY) 및 1개의 이중(YY) 조합이다(표 8). 2개의 추가 사중 변이체, YEQF 및 YEWF(도 27g)는 인간 및 래트 FcRn에 대한 더 약한 친화성의 결과로 선택하지 않았다.
도 28a~도 28h 및 29a~도 29h는 YTEKF 벤치마크(점선) 및 WT(대시)와 비교하여 10개의 FcRn 길항제 변이체(흑색 실선)의 인간 및 시노 FcRn 결합 동역학을 보여준다. 도 28a 및 29a에 도시된 바와 같이, 변이체 10개 중 8개는 YTEKF 벤치마크보다 더 느린 오프 속도를 나타내었고 pH 6.0에서 인간 및 시노 FcRn에 대해 유사한 온 속도를 가졌다(표 9 및 10). 모든 변이체는 pH 7.4 및 pH 8.0에서 인간(도 28b 및 28d) 및 시노(도 29c 및 29d) FcRn 둘 모두에 대한 유의한 FcRn 결합을 나타낸다(표 9 및 10). 5개의 사중 변이체, YDQF, YDQY, YDWY, YEQY 및 YEWY는 YTEKF 벤치마크보다 더 높은 결합 신호를 보여주었으며, 이는 이 pH에서 향상된 친화도를 나타낸다. 인간 및 시노 FcRn에 대해 각각 pH 7.4(도 28c 및 29c) 및 pH 8.0(도 28e 및 29e)에서의 센서그램의 정규화는 이들 5개의 변이체가 YTEKF 벤치마크보다 느린 오프 속도로 이들 pH에서 유의한 FcRn 결합을 나타낸다는 것을 보여주었다. 도 28f 및 29f에서, pH 9.0은 인간 및 시노 FcRn 결합을 WT 및 YTEKF 변이체와 유사한 수준으로 감소시켰다. 도 28g 및 29g는 YTEKF 벤치마크(오픈 사각형) 및 WT(흑색, pH 6.0만)와 비교하여 인간(도 28g) 및 시노(도 29g) FcRn 결합에 대한 3가지 pH(pH 6.0, 흑색; pH 7.4, 짙은 회색; pH 8.0, 회색)에서의 동종친화성 플롯을 나타낸다. YTEKF 벤치마크 및 리드 조합 변이체는 pH 6.0에서 WT보다 인간 및 시노 FcRn 결합 친화도가 2~3배 더 높다. FcRn 결합 친화성은 pH가 증가함에 따라 감소했고 벤치마크 및 조합 변이체는 조사된 모든 pH에서 유사한 친화성을 나타냈다. 3개의 변이체, YDQY, YDWY 및 YEWY는 모든 pH에서 인간 및 시노 FcRn에 대해 더 큰 결합을 나타냈다(표 9 및 10). pH의 함수로서 인간(도 28h) 및 시노(도 29h) FcRn에 대한 FcRn 결합 친화도를 비교하면 모든 조사된 조합 변이체에 대해 pH 단위당 FcRn 친화도가 10배 감소하는 것으로 나타났다.
도 33 및 도 34에서, 선택된 조합 변이체, YTEKF 벤치마크 및 WT의 pH 6.0, 7.4, 8.0 및 9.0에서 인간(도 33) 및 시노(도 34) FcRn에 대한 온 속도, 오프 속도, 결합 친화도 및 정상 상태 결합을 표시한다. 모든 변이체가 이 pH에서 측정 가능한 결합 동역학(온 속도, 오프 속도 및 결합 친화도)을 나타내므로 pH 6.0에서는 정상 상태 결합 수준을 보고하지 않는다. pH 9.0에서 모든 변이체의 유의하게 감소된 FcRn 결합 친화도로 인해, 이 pH에서 잔존 결합의 척도로서 정상 상태 결합 수준만이 표시된다. 삽입된 돌연변이는 WT 서열(MTTN: M252/T256/T307/N434)에서 볼드체로 표시되고 밑줄 표시된다. 예를 들어, MDWY는 T256D/T307W/N434Y 돌연변이와 위치 252에 WT 잔기를 포함하였다.
FcRn 길항제 변이체, YETK 벤치마크 및 WT의 기타 특성화 파라미터, 예를 들어 FcγRIIIa에 대한 결합, 열 안정성 및 용출 pH를 결정하고 표 9에 나타냈다. 삽입된 돌연변이는 WT 서열(MTTN: M252/T256/T307/N434)에서 볼드체로 표시되고 밑줄 표시된다. 예를 들어, M DWY 는 T256D/T307W/N434Y 돌연변이와 위치 252에 WT 잔기를 포함하였다.
[표 9]
Figure pct00019
표 9에 나타낸 바와 같이, 모든 FcRn 길항제는 WT와 비교하여 FcRn 컬럼으로부터 상당히 더 높은 pH에서 용출될 때 열적으로 불안정화되었다. FcγRIIIa 결합은 WT와 비교하여 유사하거나 감소된 정상 상태 결합으로 매우 가변적이었다. 삽입된 돌연변이는 WT 서열(MTTN: M252/T256/T307/N434)에서 굵게 표시되어 있고 밑줄 표시되어 있다. 예를 들어, MDWY는 T256D/T307W/N434Y 돌연변이와 위치 252에 WT 잔기를 포함하였다.
실시예 14: FcRn 길항제는 IgG 분해를 향상시킨다
IgG 고갈을 결정하기 위해서 인간 IgG와 함께 FcRn 길항제를 동시 투여한다. 인간 FcRn 동형접합성 트랜스제닉 마우스(Tg32; 예를 들어, Jackson Laboratory stock #014565, M01 유전자형)를 사용하여 실험을 수행하며, 이로써 인간 동역학을 예측하기 위한 스케일링이 허용된다.
혈청 IgG 수준에 대한 FcRn 길항제(예를 들어, 도 33 및 34에 제시된 사중 변이체 어느 하나; 예를 들어, YDQY, YEWY, YEQY, YDQF, 및 YDWY)의 효과를 Tg32 마우스에서 결정한다. Tg32 마우스에 정맥내 볼루스 주사에 의해 5 mg/kg의 비표적화 인간 IgG1을 투여한다. 6시간 후, 마우스에 FcRn 길항제를 포함하는 인간 IgG1(예를 들어, 도 33 및 34에 제시된 바와 같음; 예를 들어, YDQY, YEWY, YEQY, YDQF, 및 YDWY), 또는 FcRn 길항체(예를 들어, 도 33 및 34에 기재된 바와 같음; 예를 들어, YDQY, YEWY, YEQY, YDQF, 및 YDWY)를 포함하는 표적화 항체, 또는 비히클 대조군를 투여한다. 표 10에 제시된 투약 일정에 따라 동물에게 투여하였다.
[표 10]
Figure pct00020
혈액 샘플은 표 11에 제시된 채혈 일정에 따라 채취한다. FcRn 길항제 IgG1(FcRn-A; 인간 IgG1 및 사중 변이체를 포함하는 표적화 항체), 비표적화 인간 IgG1(hIgG), 내인성 마우스 IgG(murIgG) 및 마우스 혈청 알부민(murAlb)의 각각의 수준은 정량적 LC-MS/MS 및 ELISA 방법론에 의해 결정한다.
[표 11]
Figure pct00021
실시예 15: FcRn 길항제는 IgG 분해를 향상시킨다
이 실시예는 예시적인 FcRn 길항제가 공동-투여된 IgG의 제거를 향상시켰음을 보여주는 연구를 기술한다. 이 연구에서, mAb1 YDQY(hIgG1 변이체)를 야생형 mAb1과 함께 hFcRn 동형 접합 트랜스제닉 마우스(Tg32; Jackson Laboratory stock #014565, M01 유전자형)에 투여하였으며, 이로써 동역학의 인간에 대한 스케일링 예측이 가능하다. 연구의 일환으로, YDQY hIgG1 및 WT hIgG1 모두에 대한 PK 측정값을 얻었다. 알부민의 측정은 FcRn 억제가 알부민 결합 부위를 방해하지 않는다는 것을 추가로 확인시켜 줄 것이다.
보다 구체적으로, Tg32 마우스에 5 mg/kg의 WT hIgG1("추적자 IgG")을 정맥내 볼루스 주사하였다. 6시간 후, YTEKF hIgG1(ABDEG™) 또는 YDQY hIgG1을 표 12에 제시된 투약 일정에 따라 마우스에 투여하였다. 모든 용량은 10 mL/kg의 투약 부피로 투여하였다.
[표 12]
Figure pct00022
데이터는 YDQY hIgG1의 3회 20 mg/kg 용량(6, 24 및 48h)이 추적자 WT hIgG1 농도(군 6; 도 30a 및 30b; 표 13)를 유의하게 감소시켰고 YTEKF hIgG1보다 유의하게 개선된 결과를 산출했음을 보여준다. 1회 용량의 YDQY hIgG1 또는 YTEKF hIgG1은 추적자 WT IgG의 강력한 감소를 야기하는 것으로 보이지 않았다(도 30c; 표 13).
[표 13]
Figure pct00023
YDQY hIgG1(약 2.6 mL/h/kg)의 제거는 Tg32 마우스에서 일반적인 IgG(대략 0.1~1.0 mL/h/kg) 또는 YTEKF hIgG(대략 1.1 mL/h/kg)보다 빨랐지만(도 31a 및 도 31b) 연구 기간 내내 노출을 유지하였다. 결과는 이 FcRn 길항제가 WT IgG의 FcRn 매개 재순환을 감소시키고 WT IgG 제거를 촉진하기에 충분한 시간 동안 숙주에 남아 있을 수 있음을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Genzyme Corporation <120> Methods of Treating Antibody-Mediated Disorders with FcRn Antagonists <130> 022548.WO062 <150> 62/878,541 <151> 2019-07-25 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 2 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 3 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 65 70 75 80 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 85 90 95 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 100 105 110 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 115 120 125 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 130 135 140 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 165 170 175 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 180 185 190 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 195 200 205 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 4 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthenic polypeptide, poly-histidine tag" <400> 5 His His His His His His His His 1 5

Claims (35)

  1. IgG-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IgG-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 4개의 아미노산 잔기:
    아미노산 위치 252의 티로신(Y),
    아미노산 위치 256의 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E),
    아미노산 위치 307의 트립토판(W) 또는 글루타민(Q), 및
    아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)
    (Eu 넘버링에 따름)의 조합을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, FcRn 길항제의 치료적 유효량은 대상체에서 혈청 IgG의 제거를 증가시키는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은
    a) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y);
    b) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y);
    c) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y);
    d) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F);
    e) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y); 및
    f) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F)
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기들의 조합을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은
    M252Y/T256D/T307Q/N434Y,
    M252Y/T256E/T307W/N434Y,
    M252Y/T256E/T307Q/N434Y,
    M252Y/T256D/T307Q/N434F,
    M252Y/T256D/T307W/N434Y, 및
    M252Y/T256D/T307W/N434F
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 사중 아미노산 치환을 포함하는, 방법.
  4. IgG-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IgG-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)(Eu 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, FcRn 길항제의 치료적 유효량은 대상체에서 혈청 IgG의 제거를 증가시키는, 방법.
  5. IgG-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IgG-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)(Eu 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, FcRn 길항제의 치료적 유효량은 대상체에서 혈청 IgG의 제거를 증가시키는, 방법.
  6. IgG-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IgG-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 글루탐산(E), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)(Eu 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, FcRn 길항제의 치료적 유효량은 대상체에서 혈청 IgG의 제거를 증가시키는, 방법.
  7. IgG-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IgG-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 글루타민(Q), 및 아미노산 위치 434의 페닐알라닌(F)(Eu 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, FcRn 길항제의 치료적 유효량은 대상체에서 혈청 IgG의 제거를 증가시키는, 방법.
  8. IgG-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IgG-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)(Eu 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, FcRn 길항제의 치료적 유효량은 대상체에서 혈청 IgG의 제거를 증가시키는, 방법.
  9. IgG-매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IgG-매개 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 아미노산 잔기들:
    a) 아미노산 위치 252의 티로신(Y) 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y),
    b) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y),
    c) 아미노산 위치 252의 티로신(Y), 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y), 또는
    d) 아미노산 위치 256의 아스파르트산(D), 아미노산 위치 307의 트립토판(W), 및 아미노산 위치 434의 티로신(Y)
    (Eu 넘버링에 따름)의 조합을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, FcRn 길항제의 치료적 유효량은 대상체에서 혈청 IgG의 제거를 증가시키는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은
    M252Y/N434Y,
    M252Y/T307W/N434Y,
    M252Y/T256D/N434Y, 및
    T256D/307W/N434Y
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환들의 조합을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, IgG-매개 장애는 자가면역 질환인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 자가면역 질환은 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 중증 근무력증, 전신 경화증(SSc)/경피증, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 당뇨병, 다발성 경화증, 심상성 천포창, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 알러지, 특발성 폐 섬유증(IPF), 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP) 및 화농성 한선염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 진단 영상의 증강을 필요로 하는 대상체에서 진단 영상을 증강시키는 방법으로서,
    M252Y/T256D/T307Q/N434Y,
    M252Y/T256E/T307W/N434Y,
    M252Y/T256E/T307Q/N434Y,
    M252Y/T256D/T307Q/N434F,
    M252Y/T256D/T307W/N434Y,
    M252Y/T256D/T307W/N434F,
    M252Y/N434Y,
    M252Y/T307W/N434Y,
    M252Y/T256D/N434Y, 및
    T256D/307W/N434Y
    (Eu 넘버링에 따름)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환들의 조합을 포함하는 변형된 인간 IgG Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 방사성표지된 IgG 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, FcRn 길항제를 방사성표지된 항체 후에 투여함으로써 방사성표지된 항체에 대한 콘트라스트를 증강시키는, 방법.
  16. 진단 영상 동안 방사성표지된 항체에 대한 비-표적 조직의 노출의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 노출을 감소시키는 방법으로서,
    M252Y/T256D/T307Q/N434Y,
    M252Y/T256E/T307W/N434Y,
    M252Y/T256E/T307Q/N434Y,
    M252Y/T256D/T307Q/N434F,
    M252Y/T256D/T307W/N434Y,
    M252Y/T256D/T307W/N434F,
    M252Y/N434Y,
    M252Y/T307W/N434Y,
    M252Y/T256D/N434Y, 및
    T256D/307W/N434Y
    (Eu 넘버링에 따름)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환들의 조합을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 길항제의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은 변형된 인간 IgG Fc 도메인인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 산성 pH 및 비-산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성을 가지며, 선택적으로, 산성 pH는 약 6.0이고, 선택적으로, 비-산성 pH는 약 7.4인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은 변형된 인간 IgG Fc 도메인이고, 아미노산 치환 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F를 포함하는 동일 하위유형의 인간 IgG Fc 도메인과 비교하여 산성 pH 및/또는 비-산성 pH에서 향상된 FcRn 결합 친화성을 가지며, 선택적으로, 산성 pH는 약 6.0이고, 선택적으로, 비-산성 pH는 약 7.4인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 감소된 FcγRIIIa 결합 친화성을 갖는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, FcRn 길항제는 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 1, 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열, 또는 이의 FcRn-결합 부분을 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, FcRn 길항제는 FcRn이 아닌 하나 이상의 표적에 결합하는 결합 폴리펩티드인, 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, FcRn 길항제는 항체이거나 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, FcRn 길항제는 단클론 항체인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체인, 방법.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, FcRn 길항제는 Fc 융합 단백질인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, Fc 융합 단백질은 면역어드헤신인, 방법.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, FcRn 길항제는 Fc 단편인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에서 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 FcRn 길항제의 용도.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에서 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 사용하기 위한 FcRn 길항제.
  32. 단리된 폴리펩티드로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 아미노산 치환들의 조합을 포함하는 변형된 Fc 도메인으로 이루어진, 단리된 폴리펩티드.
  33. 제32항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은 변형된 인간 IgG Fc 도메인인, 단리된 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 변형된 Fc 도메인은 기재된 치환을 갖는 서열 번호 1, 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열, 또는 이의 FcRn-결합 부분을 포함하는, 단리된 폴리펩티드.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
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