CN118103404A - 抗vegfr1抗体及其用途 - Google Patents

抗vegfr1抗体及其用途 Download PDF

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CN118103404A
CN118103404A CN202280069328.1A CN202280069328A CN118103404A CN 118103404 A CN118103404 A CN 118103404A CN 202280069328 A CN202280069328 A CN 202280069328A CN 118103404 A CN118103404 A CN 118103404A
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M·D·布雷耶
R·A·冈萨雷斯维拉洛博斯
J·李
T·J·鲁特科斯基
R·V·斯旺森
G·郑
S·郑
X·郑
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Janssen Biotech Inc
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
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Abstract

本文公开了结合血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞以及使用它们治疗慢性肾病的方法。

Description

抗VEGFR1抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月16日提交的美国临时申请63/233,343号和2022年3月22日提交的名称为“ANTI-VEGFR1 ANTIBODIES AND THEIR USES”的美国临时申请63/322,273号的优先权，这些临时申请中的每个临时申请的公开内容以引用的方式全文并入本文。
以电子方式提交的参考序列表
本申请包含已经以XML文件格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。创建于2022年7月22日的所述XML副本命名为JBI6512WOPCT1_SL.xml并且大小为181,681字节。
技术领域
提供了包含结合血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的抗原结合结构域或其片段的蛋白质、多核苷酸、载体、宿主细胞以及使用它们治疗慢性肾病的方法。
背景技术
慢性肾病(CKD)是世界范围内的公共健康难题，其随着人口老龄化和糖尿病/肥胖症的流行而持续增长。CKD增加了全因死亡和心血管死亡的风险以及需要透析或肾移植才能存活的晚期肾病的风险。CKD 4-5期患者发生肾衰竭的风险最高，5年死亡率为约40％。糖尿病(38％)和高血压(25％)是晚期和末期肾病的主要原因。糖尿病性肾病，最常见的CKD，约25％的2型糖尿病患者在诊断后10年内发病。尽管有肾素-血管紧张素-醛固酮***抑制剂(即血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体阻断剂)的标准护理，或最近引入了SGLT2抑制剂，但大多数“高危”患者或反应不佳者仍进展至末期肾病。仅在美国，每年就有超过100,000名患者进行透析。70％的进行透析的患者在5年内死亡。
在晚期CKD患者中，通过肾脏保护或功能恢复来预防或治疗晚期肾病的疗法的医学需求仍然非常高。
在肾脏中，由肾小球足细胞和肾小管上皮细胞产生的血管内皮生长因子A(VEGFA)对维持肾小球完整性、肾微脉管***和功能是必需的。在CKD患者中，对患者肾活检的mRNA微阵列分析显示VEGFA表达降低，并且在肾小球和肾小管间质中的VGFA表达水平与eGFR、蛋白尿或血管稀疏相关(Bortoloso,Del Prete等人2004,Martini,Nair等人2014,Pan,Jiang等人2018)。在健康肾脏中，局部产生的VEGFA，通过VEGFR2的信号传导促进内皮健康，从而保护肾小球滤过屏障。在CKD中，VEGFA缺乏连同其诱骗受体VEGFR1的隔离导致VEGFR2信号传导受到抑制。开发了抗VEGFR1阻断抗体以阻断VEGFA隔离，增加局部VEGFA可用性，并且能够实现内皮保护、肾小球滤过屏障的保存和肾功能恢复。
发明内容
本文提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段与VEGFR1的SEQ ID NO:173内的表位结合并阻止VEGFA与VEGFR1的结合。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段与具有氨基酸序列FPLDTL(SEQ ID NO:143)或EIGL(SEQ ID NO:144)的VEGFR1上的表位结合。在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段与具有氨基酸序列FPLDTL(SEQ ID NO:143)和EIGL(SEQ ID NO:144)的VEGFR1上的表位结合。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人、小鼠、大鼠和/或食蟹猴VEGFR1。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人VEGFR1。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人VEGFR1和来自至少一种选自由食蟹猴、小鼠和大鼠组成的组的物种的VEGFR1。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人VEGFR1和至少两种来自选自由食蟹猴、小鼠和大鼠组成的组的物种的VEGFR1。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人、食蟹猴、小鼠和大鼠VEGFR1。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段以通过使用表面等离子共振(SPR)所确定的6×10-8M或更小，特别是1×10-8M或更小，更特别是5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD与人VEGFR1、小鼠VEGFR1和食蟹猴VEGFR1结合。
在一些实施方案中，本申请的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区具有包含SEQ ID NO:31、33、34、36、38或39的氨基酸序列的VH的重链互补决定区(HCDR)，该轻链可变区具有包含SEQ ID NO:32、35、37或40的氨基酸序列的VL的轻链互补决定区(LCDR)。
在某些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR；
b.具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR。
c.具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL的LCDR；
d.具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR；
e.具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR；或
f.具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL的LCDR。
本文提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:7、175、9、10、11和12；
分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；
分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18；
分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24；
分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30；
分别为SEQ ID NO:71、176、73、74、75和76；
分别为SEQ ID NO:71、72、73、74、75和76；
分别为SEQ ID NO:77、78、79、80、81和82；
分别为SEQ ID NO:83、84、85、86、87和88；
分别为SEQ ID NO:89、90、91、92、93和94；
分别为SEQ ID NO:95、177、97、98、99和100；
分别为SEQ ID NO:95、96、97、98、99和100；
分别为SEQ ID NO:101、102、103、104、105和106；
分别为SEQ ID NO:107、108、109、110、111和112；
分别为SEQ ID NO:113、114、115、116、117和118；
分别为SEQ ID NO:119、178、121、122、氨基酸序列LNS和SEQ ID NO:124；
分别为SEQ ID NO:119、120、121、122、氨基酸序列LNS和SEQ ID NO:124；
分别为SEQ ID NO:125、126、127、128、氨基酸序列FNF和SEQ ID NO:130；
分别为SEQ ID NO:131、132、133、134、氨基酸序列YD和SEQ ID NO:136；或者
分别为SEQ ID NO:137、138、139、140、氨基酸序列FNS和SEQ ID NO:142；
其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
还公开了一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:31的VH和SEQ ID NO:32的VL；
SEQ ID NO:33的VH和SEQ ID NO:32的VL；
SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:35的VL；
SEQ ID NO:36的VH和SEQ ID NO:37的VL；
SEQ ID NO:38的VH和SEQ ID NO:37的VL；或者
SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:31的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:32的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:33的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:32的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:34的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:35的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:36的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:37的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:38的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:37的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
本公开还提供了一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60。
本公开还提供了一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:51或52的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。
本公开还提供了一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:53或52的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。
本公开还提供了一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:54或55的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。
本公开还提供了一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:56或57的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。
本公开还提供了一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:58或57的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。
本公开还提供了一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59或60的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的分离的抗体包含：
a.包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC；
b.包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC；
c.包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LC；
d.包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC；
e.包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC；或
f.包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:7、175、9、10、11和12的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:31的VH和SEQ ID NO:32的VL；和/或
SEQ ID NO:51的HC和SEQ ID NO:52的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:33的VH和SEQ ID NO:32的VL；和/或
SEQ ID NO:53的HC和SEQ ID NO:52的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:35的VL；和/或
SEQ ID NO:54的HC和SEQ ID NO:55的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:36的VH和SEQ ID NO:37的VL；和/或
SEQ ID NO:56的HC和SEQ ID NO:57的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:38的VH和SEQ ID NO:37的VL；和/或
SEQ ID NO:58的HC和SEQ ID NO:57的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
还公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL；和/或
SEQ ID NO:59的HC和SEQ ID NO:60的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，该分离的抗体或其抗原结合片段缀合至半衰期延长部分。任选地，该半衰期延长部分是免疫球蛋白(Ig)、该Ig的片段、Ig恒定区、该Ig恒定区的片段、Fc区、转铁蛋白、白蛋白、白蛋白结合结构域或聚乙二醇。任选地，该Ig恒定区的片段包含Fc区。任选地，结合VEGFR1的该抗体或抗原结合片段缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的C端。
任选地，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。任选地，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG1同种型。任选地，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG4同种型。任选地，Ig恒定区或Ig恒定区的片段包含导致蛋白质与Fcγ受体(FcγR)的结合减少的至少一个突变。任选地，导致蛋白质与FcγR的结合减少的该至少一个突变选自由以下项组成的组：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S，其中根据EU索引进行残基编号。任选地，导致蛋白质与FcγR的结合减少的突变是L234A_L235A_D265S。任选地，该Ig恒定区或该Ig恒定区的片段包含调节蛋白质的半衰期的至少一个突变。任选地，调节蛋白质的半衰期的该至少一个突变选自由以下项组成的组：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中根据EU索引进行残基编号。
本公开还提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含缀合至治疗剂或显像剂的分离的抗体或其抗原结合片段。
本公开还提供一种药物组合物，该药物组合物包含结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂。
本公开还提供一种多核苷酸，该多核苷酸编码结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段。
任选地，编码结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段的该多核苷酸包含SEQID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、61、62、63、74、65、66、67、68、69或70的多核苷酸序列。
任选地，编码结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段的该多核苷酸包含与SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70的多核苷酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的多核苷酸。
本公开还提供了一种包含本公开的多核苷酸的载体。
本公开还提供一种包含本公开的多核苷酸或载体的宿主细胞。
本公开还提供一种表达分离的抗体或其抗原结合片段和/或包含本公开的多核苷酸或载体的宿主细胞。
本公开还提供一种阻止有需要的受试者中VEGFA与VEGFR1结合的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本公开的任何分离的抗体或其抗原结合片段、本公开的任何免疫缀合物、本公开的任何药物组合物、本公开的任何分离的多核苷酸或载体或本公开的任何宿主细胞，从而阻止VEGFA与VEGFR1的结合。
本公开还提供一种治疗受试者的慢性肾病(CKD)并减缓其进展的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的任何分离的抗体或其抗原结合片段、本公开的任何免疫缀合物、或本公开的任何药物组合物、本公开的任何分离的多核苷酸或载体或本公开的任何宿主细胞，持续足以治疗CKD的时间。任选地，该受试者患有晚期4期或5期慢性肾病。任选地，该受试者患有早期慢性肾病。
本公开还提供一种试剂盒，该试剂盒包含本公开的任何分离的抗体或其抗原结合片段、本公开的任何免疫缀合物、本公开的任何药物组合物、本公开的任何分离的多核苷酸或载体或本公开的任何宿主细胞。
本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的CKD的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的任何分离的抗体或其抗原结合片段、本公开的任何免疫缀合物、本公开的任何药物组合物、本公开的任何分离的多核苷酸或载体或本公开的任何宿主细胞，持续足以减少受试者的蛋白尿的时间。
本公开还提供一种减少有需要的受试者的蛋白尿的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的任何分离的抗体或其抗原结合片段、本公开的任何免疫缀合物、本公开的任何药物组合物、本公开的任何分离的多核苷酸或载体或本公开的任何宿主细胞，持续足以减少受试者的蛋白尿的时间。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。
图1示出了来自不同物种的VEGFR1的配体结合区(结构域2-3)的氨基酸序列比对。与人序列相同的残基用点表示。明确示出了不相同的残基。图1分别以外观顺序公开了SEQID NO:179-184。
图2示出了描绘VEGFR1抗体(VGFB54、VGFB71、VGFB78和VGFB82)与人、食蟹猴和小鼠VEGFR1的物种交叉反应性但相对于VEGFR2或VEGFR3保留了对VEGFR1的特异性的代表性FACS结合数据。人VEGR1、食蟹猴VEGFR1、鼠VEGFR1、人VEGFR2和人VEGFR3在细胞表面上过表达。使用过表达所示VEGFR蛋白的细胞系绘制平均荧光强度。
图3示出了在VGFB78 VH的位置105处SHM亮氨酸(L)与谷氨酰胺(Q)相比的相对频率的评估。
图4A示出了针对VEGFR1(VGFW1)的四种抗VEGFR1抗体(VGFB54、VGFB71、VGFB78和VGFB82)的重链可变结构域的互补位图。图4A分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:31、34、36和39。
图4B示出了针对VEGFR1(VGFW1)的四种抗VEGFR1抗体轻链(VGFB54、VGFB71、VGFB78和VGFB82)的轻链可变结构域的互补位图。突出显示的残基代表基于IMTG描绘的HCDR和LCDR。与VEGFR1结合时自由能变化为-1.0kcal/mol或更低的残基以从中灰色到深灰色的渐变颜色显示，如刻度所示。与VEGFR1结合时不稳定的残基以浅灰色显示。交换太快或太慢而不能在结合时看到扰动的残基显示为灰色。没有颜色的残基表示未监测到HDX行为，因为没有肽覆盖残基或者残基是肽的前两个残基。图4B分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:32、35、37和40。
图5示出了在食蟹猴中单次IV/SC施用后总VGFB54和游离VGFB54随时间推移的血浆浓度(ng/mL)。
图6示出了在食蟹猴中单次IV/SC施用后总VGFB78和游离VGFB78随时间推移的血浆浓度(ng/mL)。
图7示出了在食蟹猴中单次IV/SC施用后总VGFB82和游离VGFB82随时间推移的血浆浓度(ng/mL)。
图8示出了在食蟹猴中单次IV/SC施用后总VGFB80和游离VGFB80随时间推移的血浆浓度(ng/mL)。
图9示出了在食蟹猴中单次IV/SC施用VGFB54后随时间推移的总PlGF血浆浓度(pg/mL)。
图10示出了在食蟹猴中单次IV/SC施用VGFB78后随时间推移的总PlGF血浆浓度(pg/mL)。
图11示出了在食蟹猴中单次IV/SC施用VGFB82后随时间推移的总PlGF血浆浓度(pg/mL)。
图12示出了在食蟹猴中单次IV/SC施用VGFB80后随时间推移的总PlGF血浆浓度(pg/mL)。
具体实施方式
定义
可通过结合形成本公开一部分的附图参考以下具体实施方式来更容易地理解所公开的分离的抗VEGFR1抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、细胞、组合物、试剂盒和方法。应当理解，所公开的抗体、抗原结合结构域、抗体片段、多核苷酸、载体、细胞、组合物、试剂盒和方法不限于本文具体描述和/或所示的那些，并且本文所用的术语仅用于以举例方式描述具体实施方案的目的，并且不旨在限制所要求保护的抗体、抗原结合结构域、抗体片段、多核苷酸、载体、细胞、组合物、试剂盒和方法。
除非另外特别说明，否则关于可能的机制或作用模式或改善原因的任何描述仅旨在出于示例性目的，并且所公开的抗体、抗原结合结构域、抗体片段、多核苷酸、载体、细胞、组合物、试剂盒和方法不受任何此类建议的机制或作用模式或改善原因的正确或错误的约束。
在本文中，说明书涉及抗体、其抗原结合片段和使用所述抗原结合结构域的方法。当本公开描述或要求保护与抗原结合结构域相关的特征或实施方案时，这样的特征或实施方案同样适用于使用所述抗原结合结构域的方法。同样，当本公开描述或要求保护与使用抗原结合结构域的方法相关的特征或实施方案时，这样的特征或实施方案同样适用于抗原结合结构域。
当本文列举或建立数值范围时，该范围包括其端值以及该范围内的所有单独整数和分数，并且也包括其中由那些端值以及内部整数和分数的所有各种可能组合形成的较窄范围中的每一者，以在相同程度上形成所述范围内的较大数值组的亚组，如同明确列举了那些较窄范围中的每一者一样。当在本文陈述数值范围大于规定值时，该范围然而是有限的，并且其上限由在如本文所述的本发明的上下文中可操作的值限定。当在本文陈述数值范围小于规定值时，该范围的下限然而由非零值限定。不旨在将本发明的范围限于当限定范围时所列举的特定值。所有范围均包括端值在内并且可组合。
当前面使用“约”将值表示为近似值时，应当理解，该具体值构成了另一个实施方案。提及具体数值至少包括该具体值，除非上下文另有明确规定。
应当理解，为了清楚起见，本发明的某些特征在单独实施方案的上下文中进行阐述，但也可以组合形式提供在单个实施方案中。也就是说，除非明显不相容或明确地被排除在外，否则每个单独实施方案被认为可与任何其他实施方案组合，并且这种组合被视为另一个实施方案。相反地，为简明起见，本发明的各种特征在单个实施方案的上下文中进行阐述，也可单独地或以任何子组合形式提供。最终，尽管实施方案可描述为一系列步骤的一部分或更普遍结构的一部分，但每个所述步骤也可被视为独立的实施方案，可与其他实施方案组合。
除非另外特别说明，否则关于可能的机制或作用模式或改善原因的任何描述仅旨在出于示例性目的，并且本发明所公开的方法不受任何此类建议的机制或作用模式或改善原因的正确或错误的约束。
与说明书的各方面相关的各种术语在说明书和权利要求书中通篇使用。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的普通含义。其他具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
过渡术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”旨在暗示它们在专利用语中的公认含义；即，(i)“包括”与“包含”、“含有”或“其特征在于”同义，并且是包括端值在内或末端开放的，并且不排除附加的、未列出的要素或方法步骤；(ii)“由……组成”排除权利要求书未指定的任何要素、步骤或成分；以及(iii)“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤“以及本质上不影响受权利要求书保护的公开的基本及新颖特征的材料或步骤”。还提供了以短语“包括”(或其等同形式)描述的实施方案，如以“由……组成”和“基本上由……组成”独立描述的那些实施方案。还提供了以短语“基本上由…组成”(或其等同形式)描述的实施方案，如以“由…组成”独立描述的那些实施方案。
如本说明书和所附权利要求书中所用，短语“及其片段”在附加到列表时包括相关列表的一个或多个成员的片段。列表可包括马库什群组，使得例如短语“由肽A、B和C以及它们的片段组成的组”指定或列举包括A、B、C、A的片段、B的片段和/或C的片段的马库什群组。
“分离的”是指已从产生分子(诸如合成多核苷酸或多肽)的***(诸如重组细胞)的其他组分中基本上分离和/或纯化出来的该分子的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的分子，并且涵盖分离至更高纯度(诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度)的分子。
“多核苷酸”是指包含磷酸糖类主链共价连接的核苷酸链或其它等同共价化学物的合成分子。cDNA是多核苷酸的典型示例。
“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
如本文所用，“Tagg”是指蛋白质通过二聚化或寡聚化开始聚集的温度。聚集温度检测聚集的开始，即蛋白质将示出聚集倾向的温度。Tagg可通过差示扫描量热法(DSC)、差示扫描荧光法(DSF)或通过圆二色性(CD)测定。这些技术可以检测蛋白质构象的微小变化，并因此检测聚集的起始点。Tagg值可以低于或高于Tm。在Tagg低于Tm的情况下，蛋白质首先二聚化和/或寡聚化，并且然后在高于Tagg的温度下稍后开始解折叠。在Tagg高于Tm的情况下，蛋白质首先开始解折叠，并且然后在高于Tm的温度下聚集。这两个事件都是常见的并且取决于氨基酸组成和蛋白质构象。
如本文所用，“Tm”或“中点温度”是热解折叠曲线的温度中点。它是指50％的氨基酸序列处于其天然构象而另外50％变性的温度。热解折叠曲线通常绘制为温度的函数。Tm用于测量蛋白质稳定性。通常，Tm越高表示蛋白质越稳定。Tm可以使用本领域技术人员熟知的方法容易地测定，诸如圆二色光谱法、差示扫描量热法、差示扫描荧光法(基于内在染料和外在染料两者)、UV光谱法、FT-IR和等温量热法(ITC)。
“互补决定区”(CDR)是结合抗原的抗体区。VH中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且VL中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。CDR可使用各种描绘来定义，诸如Kabat(Wu等人，(1970)J Exp Med 132:211-50；Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia等人，(1987)J Mol Biol 196:901-17)、IMGT(Lefranc等人，(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77)和AbM(Martin和Thornton，JBmol Biol 263:800-15,1996)。描述了各种描绘和可变区编号之间的对应关系(参见例如，Lefranc等人,(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77；Honegger和Pluckthun(2001),J MolBiol 309:657-70；International ImMunoGeneTics(IMGT)数据库；World Wide Web:imgt.org)。可用程序(诸如UCL Business PLC的abYsis)可用于描绘CDR。除非说明书中另有明确地说明，否则如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括由任何上述方法(Kabat、Chothia、IMGT或AbM)定义的CDR。编号***之间的对应关系，包括例如Kabat编号和IMGT唯一编号***，为本领域技术人员所熟知(参见例如Kabat，出处同上；Chothia，出处同上；Martin，出处同上；Lefranc等人，出处同上)。
表1.
IMGT Kabat AbM Chothia
VH CDR1 27-38 31-35 26-35 26-32
VH CDR2 56-65 50-65 50-58 53-55
VH CDR3 105-117 95-102 95-102 96-101
VL CDR1 27-38 24-34 24-34 26-32
VL CDR2 56-65 50-56 50-56 50-52
VL CDR3 105-117 89-97 89-97 91-96
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原的结合的重链或轻链结构域。重链或轻链的可变结构域(分别为VH和VL)包含四个框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。
“受试者”包括任何人或非人动物。“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。术语“受试者”和“患者”在本文中可以互换使用。
术语“试剂盒”和“制造的制品”作为同义词使用。
本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
结合VEGFR1的抗体
本公开涉及分离的抗VEGFR1抗体及其抗原结合片段。术语“分离的抗体”、“其抗原结合片段”和“抗VEGFR1抗体”等可互换使用，并且是指结合VEGFR1并包含至少一个特异性结合VEGFR1的结合结构域的抗体。
本公开的抗体具有一种或多种功能特性，包括但不限于与VEGFR1的高亲和力结合、阻断VEGFA与VEGFR1的结合以及治疗慢性肾病(CKD)的能力。在一些实施方案中，本发明涉及特异性结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，包括单克隆抗体，包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体；抗原结合片段；多特异性抗体，诸如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体；二聚抗体、四聚抗体或多聚抗体；单链抗体；结构域抗体；以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。术语抗体包括全长抗体、全抗体、完整抗体、抗体片段、抗原结合片段和抗原结合结构域。
一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五大类(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可为五种主要种类或对应的亚类中的任一种。优选地，本发明的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明的抗体可含有κ或λ轻链恒定域。根据一些实施方案，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链和轻链恒定结构域之外，抗体还含有由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，其中每个可变区含有三个结构域(即互补决定区1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域另选地被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且重链可变区结构域另选地被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与VEGFR1特异性结合的分离的抗体基本上不含不与VEGFR1结合的抗体)。另外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。“分离的抗体”涵盖分离至更高纯度的抗体，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一组基本上均质的抗体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该组的各个抗体是相同的。本发明单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或通过重组DNA方法制备。例如，单克隆抗体可以由包括获自转基因非人动物诸如转基因小鼠或大鼠的B细胞的杂交瘤产生，转基因非人动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，“VEGFR1”或“VEGFR-1”是指称为血管内皮生长因子受体1的已知蛋白质。VEGFR1由FLT1基因编码。除非另有说明，否则本文所用的VEGFR1是指人VEGFR1。人VEGFR1的氨基酸序列可从Uniprot(登录号P17948)获得。全长人VEGFR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:170中。VEGFR1的序列由包含七个免疫球蛋白(Ig)样基序(结构域D1-结构域D7：D1残基32-123；D2残基151-214、D3残基230-327、D4残基335-421、D5残基428-553、D6残基556-654、D7残基661-747)的细胞外配体结合结构域(氨基酸残基27-758)、单个跨膜结构域和包含被激酶***物分开的激酶结构域(氨基酸残基827-1158)的细胞质结构域以及羧基端组成。人VEGFR1 D2结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO:171中。人VEGFR1 D3结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO:172中。人VEGFR1 D2-D3结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO:173中。VEGFR1作为膜受体和可溶性蛋白质产生。可溶性VEGFR1通过结合该因子并阻止其与其膜受体的相互作用而充当VEGFA活性的负调节因子。
SEQ ID NO:170，人VEGFR1(Uniprot登录号P17948)
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSKLKDPELSLKGTQHIMQAGQTLHLQCRGEAAHKWSLPEMVSKESERLSITKSACGRNGKQFCSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKAFITVKHRKQQVLETVAGKRSYRLSMKVKAFPSPEVVWLKDGLPATEKSARYLTRGYSLIIKDVTEEDAGNYTILLSIKQSNVFKNLTATLIVNVKPQIYEKAVSSFPDPALYPLGSRQILTCTAYGIPQPTIKWFWHPCNHNHSEARCDFCSNNEESFILDADSNMGNRIESITQRMAIIEGKNKMASTLVVADSRISGIYICIASNKVGTVGRNISFYITDVPNGFHVNLEKMPTEGEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSISKQKMAITKEHSITLNLTIMNVSLQDSGTYACRARNVYTGEEILQKKEITIRDQEAPYLLRNLSDHTVAISSSTTLDCHANGVPEPQITWFKNNHKIQQEPGIILGPGSSTLFIERVTEEDEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDKSNLELITLTCTCVAATLFWLLLTLFIRKMKRSSSEIKTDYLSIIMDPDEVPLDEQCERLPYDASKWEFARERLKLGKSLGRGAFGKVVQASAFGIKKSPTCRTVAVKMLKEGATASEYKALMTELKILTHIGHHLNVVNLLGACTKQGGPLMVIVEYCKYGNLSNYLKSKRDLFFLNKDAALHMEPKKEKMEPGLEQGKKPRLDSVTSSESFASSGFQEDKSLSDVEEEEDSDGFYKEPITMEDLISYSFQVARGMEFLSSRKCIHRDLAARNILLSENNVVKICDFGLARDIYKNPDYVRKGDTRLPLKWMAPESIFDKIYSTKSDVWSYGVLLWEIFSLGGSPYPGVQMDEDFCSRLREGMRMRAPEYSTPEIYQIMLDCWHRDPKERPRFAELVEKLGDLLQANVQQDGKDYIPINAILTGNSGFTYSTPAFSEDFFKESISAPKFNSGSSDDVRYVNAFKFMSLERIKTFEELLPNATSMFDDYQGDSSTLLASPMLKRFTWTDSKPKASLKIDLRVTSKSKESGLSDVSRPSFCHSSCGHVSEGKRRFTYDHAELERKIACCSPPPDYNSVVLYSTPPI
SEQ ID NO:171(Ig样D2结构域)
GRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGH
SEQ ID NO:172(Ig样D3结构域)
IDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVH
SEQ ID NO:173(Ig样D2-D3)
GRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVH
“特异性结合”或“结合”是指蛋白质类分子以比对其他抗原更大的亲和力与抗原或抗原内的表位结合。通常，蛋白质分子与抗原或抗原内的表位结合，平衡解离常数(KD)为约1×10-7M或更低，例如约5×10-8M或更低、约1×10-8M或更低、约1×10-9M或更低、约1×10-10M或更低、约1×10-11M或更低或约1×10-12M或更低，通常KD比它与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的KD低至少一百倍。术语“KD”是指自Kd与Ka的比(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)的解离常数。根据本公开，抗体的KD值可以使用本领域中的方法确定。例如，抗体的KD可通过使用表面等离振子共振(SPR)，诸如通过使用生物传感器***(例如***)，或者通过使用生物层干涉测量技术(诸如Octet RED96***)来确定。抗体的KD值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。
如本文所用，“与VEGFR1结合”或“与VEGFR1特异性结合”的抗体是指以1×10-7M或更小，优选1×10-8M或更小，更优选5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或者1×10-10M或更小的KD与VEGFR1(优选人VEGFR1)结合的抗体。
在一些实施方案中，“与VEGFR1结合”或“与VEGFR1特异性结合”的抗体或其抗原结合片段是指以1×10-7M或更小的KD与VEGFR1结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段以优选1×10-8M或更小，更优选5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或者1×10-10M或更小的KD与人VEGFR1特异性结合。
本公开的抗VEGFR1抗体包括全抗体、与VEGFR1特异性结合的抗体片段以及其与VEGFR1特异性结合的抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的抗VEGFR1抗体包括全抗体或全长抗体、Fv片段、单链scFv片段(scFv)、Fab、F(ab)2或单链抗体。在一些实施方案中，本公开的抗VEGFR1抗体是全抗体或全长抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗VEGFR1抗体是与VEGFR1特异性结合的抗体片段或抗原结合结构域。
术语“全长抗体”、“全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体类似的结构的抗体。“完整抗体”由通过二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)构成。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)并间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白可根据重链恒定结构域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。
如本文所用，术语“抗体片段”和“抗原结合片段”是指除完整抗体以外的分子。抗原结合片段可以是合成的、可酶促获得的或基因工程化的多肽，并且包括结合抗原的免疫球蛋白的部分，诸如VH、VL、VH和VL、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd和Fv片段、二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫化物稳定的双链抗体(ds双链抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双链抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)、鲨鱼可变IgNAR结构域、骆驼化VH结构域、VHH结构域、由模拟抗体的CDR的氨基酸残基组成的最小识别单位(诸如FR3-CDR3-FR4部分)、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3、结合抗原的替代支架、二价结构域抗体、包含抗原结合片段或与抗原结合但不包含全抗体结构的任何其他抗体片段的多特异性蛋白质。
“dAb”或“dAb片段”是指由VH结构域构成的抗体片段(Ward等人，Nature 341:544546(1989))。
“Fab”或“Fab片段”是指由VH结构域、CH1结构域、VL结构域和CL结构域构成的抗体片段。
“F(ab')2”或“F(ab')2片段”是指含有通过铰链区中的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
“Fd”或“Fd片段”是指由VH结构域和CH1结构域构成的抗体片段。
“Fv”或“Fv片段”是指由来自抗体的单臂的VH结构域和VL结构域构成的抗体片段。Fv片段缺乏Fab(CH1和CL)区的恒定区。Fv片段中的VH和VL通过非共价相互作用保持在一起。
抗原结合片段(诸如VH和VL)可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单抗体设计，其中VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合结构域，诸如单链Fv(scFv)或双链抗体。在重组表达***中，接头是肽接头并且可以包含任何天然存在的氨基酸。可以被包含到接头中的示例性氨基酸为Gly、Ser、Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His和The。该接头的长度应当足以使VH和VL以相对于彼此形成正确构象，从而使得它们保持期望的活性(诸如与VEGFR1结合)的方式连接。接头的长度可以为约5个至50个氨基酸。
“单链Fv”或“scFv”是包含含有轻链可变区(VL)的至少一个抗体片段和含有重链可变区(VH)的至少一个抗体片段的融合蛋白，其中VL和VH经由多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽。scFv可以具有任一顺序的VL可变区和VH可变区，例如，相对于多肽的N末端和C末端，该scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
二价或二价单链可变片段(di-scFv、bi-scFv)可以通过连接两个scFv来工程化。“(scFv)2”或“串联scFv”或“双scFv”片段是指包含两个轻链可变区(VL)和两个重链可变区(VH)的融合蛋白，其中两个VL区和两个VH区经由多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽。通过肽接头融合的两个VL区和两个VH区形成二价分子VLA-接头-VHA-接头-VLB-接头-VHB，以形成能够同时结合两个不同抗原或表位的两个结合位点。(ScFv)2可表达为单链多肽。
本文鉴定的结合VEGFR1的VH结构域和VL结构域中的任一个结构域都可以工程化为VH-接头-VL或VL-接头-VH取向的scFv格式。本文鉴定的VH结构域和VL结构域中的任一者也可用于生成sc(Fv)2结构，诸如VH-接头-VL-接头-VL-接头-VH、VH-接头-VL-接头-VH-接头-VL、VH-接头-VH-接头-VL-接头-VL、VL-接头-VH-接头-VH-接头-VL、VL-接头-VH-接头-VL-接头-VH或VL-接头-VL-接头-VH-接头-VH。
“双链抗体”是由两条链形成的二价二聚体，每条链含有VH结构域和VL结构域。链内的两个结构域被接头分开，该接头太短而不能促进链内二聚化，导致两条链以头尾排列的方式二聚化。接头可以是富含甘氨酸的五聚体接头(G4S)。
“VHH”是指仅由重链的抗原结合结构域构成的单结构域抗体或纳米抗体。VHH单结构域抗体缺乏常规Fab区的轻链和重链的CH1结构域。在一些实施方案中，本公开的抗VEGFR1抗体包括Fv片段、单链scFv片段(scFv)、(scFv)2、Fab、F(ab)2、双链抗体、VHH、dAb、Fd、Fv或其他单链抗体。
本公开的抗VEGFR1抗体包括与VEGFR1特异性结合的嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
“人抗体”是指被优化以在被施用于人受试者时具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的***获得，则该人抗体包含“源自”人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性***为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。因为用于获得人抗体和人免疫球蛋白基因座的***之间的差异，体细胞突变的引入或有意将取代引入框架或CDR中或两者，因此“人抗体”与在人中表达的免疫球蛋白相比通常包含氨基酸差异。
通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可以包含由人框架序列分析得出的共有框架序列(例如，如Knappik等人，(2000)J MolBiol 296:57-86所述)，或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如，如Shi等人，(2010)J Mol Biol 397:385-96和国际专利公布WO2009/085462号中所述)。“人抗体”的定义中不包括其中至少一个CDR源自非人物种的抗体。
基因组中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因动物(诸如小鼠、大鼠或鸡)可用于生成结合VEGFR1的抗原结合片段并且描述于例如美国专利6,150,584号、国际专利公布WO1999/45962号、国际专利公布WO2002/066630号、WO2002/43478号、WO2002/043478号和WO1990/04036号中。可破坏此类动物中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座***动物的基因组中。公司如Regeneron(World Wide Web:regeneron.com)、Harbour Antibodies(World Wide Web:harbourantibodies.com)、Open MonoclonalTechnology,Inc.(OMT)(World Wide Web:omtinc.net)、KyMab(World Wide Web:kymab.com)、Trianni(World Wide Web:trianni.com)和Ablexis(World Wide Web:ablexis.com)可以参与提供针对所选抗原的人抗体。
通过使非人动物免疫生成的结合VEGRF1的抗体或其抗原结合片段可以是人源化的。包括选择人受体框架的示例性人源化技术包括CDR接枝(美国专利5,225,539号)、SDR接枝(美国专利6,818,749号)、表面重塑(Padlan,(1991)Mol Immunol 28:489-499)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公布2010/0261620号)、人框架改型(美国专利8,748,356号)或超人源化(美国专利7,709,226号)。在这些方法中，亲本抗体的CDR或CDR残基的子集被转移到人框架上，该人框架可基于其与亲本框架的总体同源性，基于CDR长度的相似性或规范结构同一性，或它们的组合进行选择。
可通过如下过程进一步优化人源化抗原结合结构域以改善其对所需抗原的选择性或亲和力：通过采用诸如国际专利公布号WO1090/007861和WO1992/22653中所述的技术，并入改变的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，或者通过在任何CDR处引入变异例如来改善抗原结合结构域的亲和力。
在一些实施方案中，本公开提供一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:7、175、9、10、11和12；
b.分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；
c.分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18；
d.分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24；
e.分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30；
f.分别为SEQ ID NO:71、176、73、74、75和76；
g.分别为SEQ ID NO:71、72、73、74、75和76；
h.分别为SEQ ID NO:77、78、79、90、81和82；
i.分别为SEQ ID NO:83、84、85、86、87和88；
j.分别为SEQ ID NO:89、90、91、92、93和94；
k.分别为SEQ ID NO:95、177、97、98、99和100；
l.分别为SEQ ID NO:95、96、97、98、99和100；
m.分别为SEQ ID NO:101、102、103、104、105和106；
n.分别为SEQ ID NO:107、108、109、110、111和112；
o.分别为SEQ ID NO:113、114、115、116、117和118；
p.分别为SEQ ID NO:119、178、121、122、氨基酸序列LNS和SEQ ID NO:124；
q.分别为SEQ ID NO:119、120、121、122、氨基酸序列LNS和SEQ ID NO:124；
r.分别为SEQ ID NO:125、126、127、128、氨基酸序列FNF和SEQ ID NO:130；
s.分别为SEQ ID NO:131、132、133、134、氨基酸序列YD和SEQ ID NO:136；或者
t.分别为SEQ ID NO:137、138、139、140、氨基酸序列FNS和SEQ ID NO:142。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:7、175、9、10、11和12的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本公开提供一种结合VEGFR1的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
SEQ ID NO:31的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:32的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO:33的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:32的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ IDNO:34的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:35的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQID NO:36的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:37的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO:38的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:37的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO:39的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:40的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:40的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
a.SEQ ID NO:31的VH和SEQ ID NO:32的VL；
b.SEQ ID NO:33的VH和SEQ ID NO:32的VL；
c.SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:35的VL；
d.SEQ ID NO:36的VH和SEQ ID NO:37的VL；
e.SEQ ID NO:38的VH和SEQ ID NO:37的VL；
f.SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL；或者
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:31的VH和SEQ ID NO:32的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:33的VH和SEQ ID NO:32的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:35的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:36的VH和SEQ ID NO:37的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:38的VH和SEQ ID NO:37的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60。
在一些实施方案中，本公开提供包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开还提供包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开提供包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本公开还提供包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开提供包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开还提供包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开提供包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本公开还提供包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开提供包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本公开还提供包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的分离的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
a.包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC；
b.包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC；
c.包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LC；
d.包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC；
e.包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC；或
f.包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:7、175、9、10、11和12的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:31的VH和SEQ ID NO:32的VL；和/或
SEQ ID NO:51的HC和SEQ ID NO:52的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:33的VH和SEQ ID NO:32的VL；和/或
SEQ ID NO:53的HC和SEQ ID NO:52的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:35的VL；和/或
SEQ ID NO:54的HC和SEQ ID NO:55的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:36的VH和SEQ ID NO:37的VL；和/或
SEQ ID NO:56的HC和SEQ ID NO:57的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:38的VH和SEQ ID NO:37的VL；和/或
SEQ ID NO:58的HC和SEQ ID NO:57的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL；和/或
SEQ ID NO:59的HC和SEQ ID NO:60的LC；
并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
SEQ ID NO:31的VH、SEQ ID NO:32的VL、
SEQ ID NO:51的HC和SEQ ID NO:52的LC；
并且该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
SEQ ID NO:33的VH、SEQ ID NO:32的VL、
SEQ ID NO:53的HC和SEQ ID NO:52的LC；
并且该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
SEQ ID NO:34的VH、SEQ ID NO:35的VL、
SEQ ID NO:54的HC和SEQ ID NO:55的LC；
并且该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
SEQ ID NO:36的VH、SEQ ID NO:37的VL、
SEQ ID NO:56的HC和SEQ ID NO:57的LC；
并且该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
SEQ ID NO:38的VH、SEQ ID NO:37的VL、
SEQ ID NO:58的HC和SEQ ID NO:57的LC；
并且该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开通过一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含
SEQ ID NO:39的VH、SEQ ID NO:40的VL、
SEQ ID NO:59的HC和SEQ ID NO:60的LC；
并且该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，分离的抗体或其分离的抗原结合片段是全长抗体。在一些实施方案中，分离的抗体或其分离的抗原结合结构域是抗体片段或抗原结合片段。
具有保守取代的同源抗体及其抗原结合片段
所述抗体或其抗原结合片段的衍生物、同源抗原结合结构域、功能等同物或变体也是本公开的目的。本公开的抗体还包括结合VEGFR1的所公开的抗体或其抗原结合片段的同源抗体、同源抗原结合结构域、功能等同物或变体，其包括具有与本公开的抗体的可变结构域或高变结构域的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽或具有保守取代的多肽。本公开的同源抗体和抗原结合结构域、功能等同物或变体与结合VEGFR1的所述抗体或其抗原结合片段的序列具有足够的同源性，并且在功能上类似于未修饰的抗VEGFR1抗体，以保留与VEGFR1的结合或保留未修饰抗体的至少一种活性。
术语“抗体衍生物”、“同源抗原结合结构域”、“功能等同物”或“变体”是指包含一个或多个氨基酸残基的一个或多个突变、取代、缺失和/或添加的抗体。这种添加、取代或缺失可以位于分子中的任何位置。在已经添加、取代或缺失几个氨基酸的情况下，可以考虑添加、取代或缺失的任何组合，条件是所得抗体仍然至少具有本发明的抗体的有利特性。
本公开的序列可包含与上述序列具有至少80％同一性或同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，与本公开的结合VEGFR1的抗原结合结构域的序列同一性可为约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在结合VEGFR1的抗原结合结构域中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸取代的结合VEGFR1的抗原结合结构域的变体在本公开的范围内，只要它们与亲本抗原结合结构域相比保留或具有改善的功能特性即可。结合VEGFR1的抗原结合结构域的功能等同物或变体包括一个或多个氨基酸残基的一个或多个缺失和/或添加。这种添加、取代或缺失可以位于分子中的任何位置。在已经添加、取代或缺失几个氨基酸的情况下，可以考虑添加、取代或缺失的任何组合，条件是所得抗体仍然至少具有本发明的抗体的有利特性。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:31的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和与SEQ IDNO:32的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:33的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和与SEQ IDNO:32的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:34的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和与SEQ IDNO:35的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:36的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和与SEQ IDNO:37的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:38的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和与SEQ IDNO:37的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和与SEQ IDNO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL。
本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少95％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少95％同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少95％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少99％同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少99％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少99％同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少99％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少95％同一性的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和与SEQ IDNO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和SEQ ID NO:40的VL，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少95％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少95％同一性的VL，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少95％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少99％同一性的VL，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少99％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少99％同一性的VL，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少99％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少95％同一性的VL，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列，并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列；并且其中该抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1。
在一些实施方案中，本申请的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链(HC)和轻链(LC)，该重链具有与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列，该轻链具有与SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:60的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列。
本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的LC。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的HC和SEQ ID NO:60的LC。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:59的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的LC。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC。
本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的HC和SEQ ID NO:60的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含SEQ ID NO:59的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本公开还提供一种分离的抗体，该分离的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的HC和SEQ ID NO:60的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含SEQ ID NO:59的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，其中该抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在两个或更多个核酸或多肽序列(例如，抗VEGFR1抗体和编码它们的多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，相同的或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比的两条或更多条序列或子序列，如使用以下序列比较算法中的一种序列比较算法或通过目视检查所测量的。相对于参考多肽的氨基酸序列同一性百分比(％)定义为给定序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。两个序列之间的百分比(％)同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用本领域技术范围内的各种算法，使用公众可获得的软件如BLAS、BLAST-2、ALIGN.Megalin(DNASTAR)或GCG软件包中可用的GAP程序来确定。
多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两种肽的不同之处仅在于保守取代。本公开的抗体还包括已经通过直接突变改善了其结合特性、功能或物理性质的那些抗体。在一些实施方案中，结合VEGFR1的变体抗原结合结构域在任何CDR区中包含一个或两个保守取代，同时保持结合VEGFR1的亲本抗原结合片段的所需功能特性。
“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸修饰的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可被丙氨酸取代，如先前针对丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，(1988)Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67；Sasaki等人，(1988)Adv Biophys 35:1-24)。对本发明的抗体的氨基酸取代可通过已知的方法进行，例如通过PCR诱变(美国专利4,683,195号)进行。可替代地，可例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp))来产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得变体的特征。
物种交叉反应性
在一些实施方案中，抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段与人、小鼠、大鼠和食蟹猴VEGFR1结合。在一些实施方案中，本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段是物种交叉反应性抗体，该抗体能够以类似的亲和力结合人、小鼠、大鼠和食蟹猴VEGFR1，从而为本文所公开的抗VEGFR1抗体提供显著的价值。
在一些实施方案中，抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段与人和小鼠VEGFR1结合。在一些实施方案中，抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段与人和大鼠VEGFR1结合。在一些实施方案中，抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段与人、小鼠和大鼠VEGFR1结合。在一些实施方案中，抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段与人、小鼠和食蟹猴VEGFR1结合。在一些实施方案中，抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段与人、大鼠和食蟹猴VEGFR1结合。在一些实施方案中，抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段与人VEGFR1结合。
定量抗体的物种交叉反应性的程度的一种方式是其对一个物种的抗原的亲和力与对另一物种的抗原的亲和力相比的倍数差异，例如对人VEGFR1与小鼠VEGFR1、与大鼠VEGFR1或与食蟹猴VEGFR1的亲和力的倍数差异。亲和力可以定量为KD，是指如本文别处所述，通过SPR确定的抗体-抗原反应的平衡解离常数。物种交叉反应性抗VEGFR1抗体在结合人和小鼠VEGFR1、人和大鼠VEGFR1或人和食蟹猴VEGFR1的亲和力方面可具有500倍或更小、250倍或更小、100倍或更小、50倍或更小、25倍或更小、10倍或更小或者5倍或更小的倍数差异。换句话说，结合人VEGFR1的KD可以在与小鼠、大鼠或食蟹猴VEGFR1结合的KD的500倍、250倍、100倍、50倍、25倍、10倍或5倍以内。在一些实施方案中，结合人VEGFR1的抗体可以以不弱于比对人的亲和力弱500倍的亲和力，例如以不弱于比对人VEGFR1的亲和力弱500倍、250倍、100倍、50倍、25倍、10倍或5倍的亲和力与小鼠、大鼠或食蟹猴结合。在一些实施方案中，结合人VEGFR1的抗体可以以不强于比对人的亲和力强500倍的亲和力，例如以不强于比对人VEGFR1的亲和力强500倍、250倍、100倍、50倍、25倍、10倍或5倍的亲和力与小鼠、大鼠或食蟹猴VEGFR1结合。如果结合两种不同物种的抗原的KD达到阈值，例如，如果结合人VEGFR1的KD和结合小鼠、大鼠或食蟹猴VEGFR1的KD为10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小，则抗体也可被认为是交叉反应性的。KD可以是10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小或1nM或更小。KD可以是0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、或0.1nM或更小、0.01nM或更小、0.001nM或更小。
结合人VEGFR1和小鼠、大鼠或食蟹猴VEGFR1的交叉反应性的另一种量度是抗体阻断配体与VEGR1结合的能力，诸如VEGFA结合或PlGF结合。物种交叉反应性抗VEGFR1抗体对阻断与人VEGFR1的VEGFA结合或PlGF结合的IC50可在阻断与小鼠、大鼠或食蟹猴的VEGFA结合或PlGF结合的IC50的25倍、20倍、15倍、10倍或5倍以内。作为另一种选择，物种交叉反应性抗体可以具有调节动物体内的循环或组织VEGFA或循环或组织PlGF水平的能力，例如结合人VEGFR1的抗体可以调节小鼠、大鼠和/或食蟹猴体内的循环或组织VEGFA或PlGF水平。
物种交叉反应性抗体使得能够进行跨几个物种的转化研究，并且可有助于在已建立的临床前疾病模型中证明功效和药效学特性，而无需在开发阶段使用替代抗体。早期报道的抗VEGFR1抗体是人或小鼠特异性的，并且显示出较差的物种交叉反应性。
产生具有物种交叉反应性并结合在人和其他物种之间保守的表位的单克隆抗体是具有挑战性的。本公开的物种交叉反应性抗VEGFR1抗体是通过独特的免疫方法产生的，该免疫方法包括(1)选择包含VEGFR1 D2和D3结构域的人和小鼠VEGFR1抗原，(2)选择鸡，一种***发育距离较远的免疫物种，(3)在人VEGFR1 D2-D3和小鼠VEGFR1 D2-D3之间交替进行的免疫加强，以及(4)仔细监测和选择显示出对人和小鼠VEGFR1两者具有反应性的血清滴度。
在一些实施方案中，本公开的抗VEGFR1抗体能够与人VEGFR1(Uniprot登录号P17948)的氨基酸残基130至331的序列内的表位结合。在一些实施方案中，本公开的抗VEGFR1抗体识别并与SEQ ID NO:173内的表位结合。在一些实施方案中，本公开的抗VEGFR1抗体识别并与SEQ ID NO:4内的表位结合。
在一些实施方案中，抗VEGFR1抗体与SEQ ID NO:143(FPLDTL)和SEQ ID NO:144(EIGL)中所示的VEGFR1上的表位结合。在一些实施方案中，抗VEGFR1抗体与SEQ ID NO:144中所示的VEGFR1上的表位结合。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段与人VEGFR1特异性结合并且还能够与来自至少一种选自由食蟹猴、小鼠和大鼠组成的组的非人物种的VEGFR1特异性结合。在某些实施方案中，本申请的分离的抗体或其抗原结合片段以通过使用表面等离子共振(SPR)确定的6×10-8M或更小，特别是1×10-8M或更小，更特别是5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD与人VEGFR1、小鼠VEGFR1和食蟹猴VEGFR1特异性结合。
“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分(诸如氨基酸或多糖侧链)的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。
“互补位”是指抗体的与抗原特异性结合的部分。互补位可以在性质上是线性的或可以是不连续的，其通过抗体的非邻接氨基酸之间的空间关系而不是氨基酸的线性系列形成。“轻链互补位”和“重链互补位”或“轻链互补位氨基酸残基”和“重链互补位氨基酸残基”分别指与抗原接触的抗体轻链和重链残基，或一般而言，“抗体互补位残基”是指与抗原接触的那些抗体氨基酸。
hVEGFR1内与抗体结合的残基的确定可以通过本领域普通技术人员已知的任何技术来确定。在一些实施方案中，通过H/D交换测定来确定hVEGFR1内与抗体结合的残基。在H/D交换测定法中，将重组表达的hVEGFR1在存在或不存在抗体情况下于氘化水中温育预定时间，从而导致氘在不受抗体保护的可交换氢原子处引入，之后使蛋白酶消化蛋白质并使用LC-MS分析肽片段。H/D交换测定法可使用已知的方案执行。在一些实施方案中，通过添加淬灭缓冲液(例如8M尿素，1M TCEP，pH 3.0)来淬灭H/D交换混合物，之后在室温处使其通过平衡的固定胃蛋白酶/FPXIII柱(例如600μL/min)。然后将肽片段上样到反相阱柱上(例如在600μL/min处)并且脱盐(例如在600μL处持续1min)，分离(例如在C18柱上)并通过质谱法分析(例如使用LTQTMOrbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo Fisher Scientific)，毛细管温度为275℃，分辨率150,000和质量范围(m/z)300-1,800)。
阻断VEGFA与VEGFR1结合的抗体
在一些实施方案中，本公开的抗VEGFR1抗体能够识别并与VEGFR1的D2-D3结构域中的表位结合，并阻止血管内皮生长因子A(VEGFA)的结合。
在肾脏中，由肾小球足细胞和肾小管上皮细胞产生的VEGFA对维持肾小球完整性、肾微脉管***和功能是必需的。在条件性或诱导型VEGFA基因敲除(KO)小鼠中观察到的严重表型中表明了VEGFA在肾脏发育、结构和功能中的关键作用。在慢性肾病(CKD)患者中，对患者肾活检的mRNA微阵列分析显示VEGFA表达降低，并且在肾小球和肾小管间质中的VGFA表达水平与eGFR、蛋白尿或血管稀疏相关(Bortoloso,Del Prete等人2004,Martini,Nair等人2014,Pan,Jiang等人2018)。VEGFA通过两种内皮限制性受体发挥作用：1)主要信号传导受体VEGFR2，和2)诱骗受体VEGFR1，其以10倍高的结合亲和力将VEGFA与VEGFR2隔离，但具有弱的或不可检测的酪氨酸激酶活性(TK)。本公开的抗VEGFR1旨在通过阻断其诱骗受体VEGFR1对VEGFA的隔离来恢复肾脏中受损的VEGFA水平和VEGFA活性。本公开的抗VEGFR1抗体将阻断VEGFA隔离并增加局部VEGFA可用性，这又将能够实现内皮保护、肾小球滤过屏障(GFB)的保存和肾功能恢复。
缀合和Fc工程化
除上述修饰之外，本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段以及它们的功能等同物可以缀合至其他抗体、蛋白质、抗原结合片段或替代支架。
本公开的抗VEGFR1抗体、其抗原结合片段和功能等同物可以缀合至半衰期延长部分。示例性的半衰期延长部分是白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白及其片段和类似物、免疫球蛋白(Ig)或其片段(诸如Fc区)。前述半衰期延长部分的氨基酸序列是已知的。可缀合至本公开的VEGFR1抗体、其抗原结合片段和功能等同物的附加半衰期延长部分包括聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20,000；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、碳水化合物(右旋糖酐、纤维素、低聚糖或多糖)，以便获得所需特性。这些部分可与本公开的抗体或抗原结合片段直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术生成。可替代地，熟知的化学偶联方法可以用于将这些部分附接到本公开的重组产生的抗体或抗原结合片段。
可以例如通过将半胱氨酸残基并入到结合VEGFR1的抗体或抗原结合片段的C端或将半胱氨酸工程化到背离VEGFR1结合位点的残基位置中并且使用熟知的方法将聚乙二醇基团附接到半胱氨酸来将聚乙二醇部分缀合至结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是白蛋白。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是白蛋白结合结构域。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是转铁蛋白。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是聚乙二醇。
在一些实施方案中，缀合还包括但不限于与可检测受体分子的缀合。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是Ig恒定区或Ig恒定区的片段。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是Ig。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是Ig的片段。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是Ig恒定区。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是Ig恒定区的片段。
在一些实施方案中，该半衰期延长部分是Fc区。
Ig恒定区或Ig恒定区的片段，诸如本公开的抗体或其抗原结合片段中存在的Fc区，可以是任何同种异型或同种型，即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE。
在一些实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG1同种型。
在一些实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG2同种型。
在一些实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG3同种型。
在一些实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG4同种型。
预期同种异型对Ig恒定区的特性诸如结合或Fc介导的效应子功能没有影响。包含Ig恒定区或其片段的治疗性蛋白质的免疫原性与增大的输注反应风险和减少的治疗应答持续时间相关(Baert等人，(2003)N Engl J Med348:602-08)。包含Ig恒定区或其片段的治疗性蛋白质在宿主中诱导免疫应答的程度可部分地由Ig恒定区的同种异型确定(Stickler等人，(2011)Genes and Immunity 12:213-21)。Ig恒定区同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置的氨基酸序列变异有关。
本公开的抗体或其抗原结合片段以及它们的功能等同物可缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段，以调节抗体或抗原结合片段效应子功能，诸如ADCC、ADCP和/或ADCP和/或药代动力学特性。这可以通过将突变引入Fc来实现，该突变调节突变的Fc与活化FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)、抑制性FcγRIIb和/或FcRn的结合。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段，在Ig恒定区或Ig恒定区的片段中包含至少一个突变。
在一些实施方案中，所述至少一个突变处于Fc区中。
在一些实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合VEGFR1的抗体或抗原结合片段在Fc区中包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个突变。
新生儿Fc受体(FcRn)在IgG的细胞运输和血清半衰期中起核心作用。在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段缀合至在Fc区中包含至少一个突变的Ig恒定区或Ig恒定区的片段，该至少一个突变调节抗体或抗原结合片段与FcRn的结合并调节抗体或抗原结合片段的半衰期。
在一些实施方案中，该Ig恒定区或Ig恒定区的片段包含调节分离的抗体或其抗原结合片段的半衰期的至少一个突变。
可突变以调节半衰期(例如与FcRn结合)的Fc位置包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可单独地或组合产生的示例性突变为突变T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R。可产生以增加半衰期的示例性单突变或组合突变为突变M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A。在一些实施方案中，调节本公开的抗体或其抗原结合片段以及它们的功能等同物的至少一个突变选自由以下项组成的组：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中根据EU索引进行残基编号。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段缀合至包含M252Y/S254T/T256E突变的Ig恒定区或Ig恒定区的片段。
在一些实施方案中，本公开的抗体或抗原结合片段以及它们的功能等同物缀合至在Fc区中包含至少一个突变的Ig恒定区或Ig恒定区的片段，该至少一个突变减少蛋白质与活化Fcγ受体(FcγR)的结合和/或降低Fc效应子功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)。
可突变以减少蛋白质与活化FcγR的结合并随后降低效应子功能的Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可单独地或组合产生的示例性突变为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的突变K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S。产生具有降低的ADCC的蛋白质的示例性组合图表为IgG1上的突变L234A/L235A、IgG1上的突变L234A/L235A/D265S、IgG2上的突变V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上的突变F234A/L235A、IgG4上的突变S228P/F234A/L235A、所有Ig同种型上的N297A、IgG2上的突变V234A/G237A、IgG1上的突变K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上的突变H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上的突变S267E/L328F、IgG1上的突变L234F/L235E/D265A、IgG1上的突变L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上的突变S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、以及IgG4上的突变S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc结构域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段缀合至IgG1重链恒定区或IgG1重链恒定区的片段。在一些实施方案中，IgG1重链恒定区包含导致抗体与FcγR的结合减少的至少一个突变。在一些实施方案中，导致抗体与FcγR的结合减少的至少一个突变选自由以下项组成的组：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S，其中根据EU索引进行残基编号。在一些实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。在一些实施方案中，FcγR是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII或者它们的任何组合。
在一些实施方案中，本公开的抗体或抗原结合片段以及它们的功能等同物缀合至在Fc区中包含至少一个突变的Ig恒定区或Ig恒定区的片段，该至少一个突变增强蛋白质与Fcγ受体(FcγR)的结合和/或增强Fc效应子功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或吞噬作用(ADCP)。
可突变以增加蛋白质与活化FcγR的结合和/或增强Fc效应子功能的Fc位置包括位置236、239、243、256，290，292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396或430(根据EU索引进行残基编号)。可单独地或组合进行的示例性突变为G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T和P396L。产生具有增加的ADCC或ADCP的蛋白质的示例性组合突变为S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/1332E。
可以突变以增强CDC的Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345和430。可单独地或组合产生的示例性突变为S267E、F1268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F和E430T。产生具有增加的CDC的蛋白质的示例性组合突变为K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T和S267E/H268F/S324T。
在一些实施方案中，本公开提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，本公开提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和与SEQ IDNO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如，IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VH和SEQ ID NO:40的VL，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的VL，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少95％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少95％同一性的VL，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少95％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少99％同一性的VL，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少99％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少99％同一性的VL，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的VH有至少99％同一性的VH和与SEQ ID NO:40的VL有至少95％同一性的VL，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列，并且其中抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列；并且其中抗体或其抗原结合片段结合VEGFR1，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的LC，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的HC和SEQ ID NO:60的LC，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如，IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:59的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的LC，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如，IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如，IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的HC和SEQ ID NO:60的LC，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:59的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的HC和SEQ ID NO:60的LC，其中抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:59的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少95％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少99％同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
在一些实施方案中，结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:59的HC有至少99％同一性的HC和与SEQ ID NO:60的LC有至少95％同一性的LC，其中抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL，并且其中抗体或抗原结合片段是IgG1(例如IgG1λ)，任选地其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S，诸如其中第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：L234A_L235A_D265S。
多核苷酸
还提供编码本公开的抗VEGFR1抗体或抗原结合片段的多核苷酸及其功能等同物。本公开提供编码本公开的任何抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:31的VH的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:33的VH的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:34的VH的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:36的VH的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:38的VH的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:39的VH的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:32的VL的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:35的VL的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:37的VL的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:40的VL的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:51的重链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:53的重链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:54的重链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:56的重链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:58的重链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:59的重链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:52的轻链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:55的轻链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:57的轻链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:60的轻链的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供编码SEQ ID NO:59和60的多肽序列的分离的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含与SEQID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70的多核苷酸序列有至少80％(诸如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的多核苷酸序列。
编码本公开的抗VEGFR1抗体或抗原结合片段的多核苷酸包括具有与本公开的多核苷酸的核酸序列基本上相同的核酸序列的多核苷酸。“基本上相同的”核酸序列在本文中定义为当两个序列比对时与另一核酸序列具有至少80％同一性的序列。如果由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性，则两个核酸序列基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下彼此杂交。
经修饰的核苷酸可以用于生成本公开的多核苷酸。示例性修饰的核苷酸是5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5″-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queuosine)、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
包含编码抗VEGFR1抗体的多核苷酸的载体
还提供包含编码本公开的抗VEGFR1抗体或抗原结合片段的DNA的载体。所公开的载体可用于例如产生任何上述公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段。可使用标准分子生物学方法将编码本公开的任何抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段的多核苷酸结合到载体中。
在一些实施方案中，本公开提供包含本发明的多核苷酸的表达载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其它适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。本公开的载体可以是用于在原核和真核***(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养物)中有效合成VEGFR1抗体多肽和表达本公开的VEGFR1抗体多肽的表达载体。
可使用的示例性载体为细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)、pEE6.4(Lonza)和pEE12.4(Lonza)。另外的载体包括pUC系列(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。可以使用噬菌体载体，诸如λGT10、λGT11、λEMBL4和λNM1149、λZapII(Stratagene)。示例性的植物表达载体包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3和pBIN19(Clontech)。示例性的动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体。
本公开的载体可以含有启动子和增强子序列。编码本公开的VEGFR1结合蛋白的多核苷酸可以可操作地连接到表达载体中确保VEGFR1结合蛋白的表达的控制序列。此类调节元件可包含转录启动子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。表达载体还可包含一个或多个非转录元件，诸如复制起点、连接到待表达的基因的合适启动子和增强子、其他5'或3'侧翼非转录序列、5'或3'非翻译序列(诸如必需的核糖体结合位点)、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受***点或转录终止序列。也可并入赋予在宿主中复制能力的复制起点。
本公开的载体也可含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列包含在融合介体中可能有利于增强一些蛋白质的表达。在一些实施方案中，载体***将包括一个或多个聚腺苷酸化位点(例如，SV40)，这些位点可在任何上述核酸序列的上游或下游。载体组分可连续地连接，或以提供用于表达基因产物的最佳间距的方式(即通过在ORF之间引入“间隔区”核苷酸)排列，或以另一种方式定位。调控元件诸如IRES基序也可被布置成提供用于表达的最佳间距。
本公开的载体可以是圆形的或线性的。可将它们制备成包含在原核或真核宿主细胞中起作用的复制***。复制***可源自例如ColE1、SV40、2μ质粒、λ、牛***状瘤病毒等。
可将重组表达载体设计用于瞬时表达、用于稳定表达或用于两者。而且，可将重组表达载体制备用于组成型表达或用于诱导型表达。
载体还可包含本领域熟知的选择标记。选择标记包括阳性和阴性选择标记。标记基因包括杀生物剂抗性(例如对抗生素、重金属等的抗性)、营养缺陷型宿主中提供原养型的互补作用等等。示例性标记基因包括抗生素抗性基因(例如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、青霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、组氨醇x抗性基因)、谷氨酰胺合酶基因、HSV-TK、用于更昔洛韦选择的HSV-TK衍生物或用于6-甲基嘌呤选择的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等人，7Gene Ther.1738-1743(2000))。编码选择标志物或克隆位点的核酸序列可在编码感兴趣的多肽或克隆位点的核酸序列的上游或下游。
宿主细胞
本公开还提供了包含本公开的任何载体的宿主细胞。“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的主体细胞，还指此类细胞的子代，并且也指特定主体细胞所产生的稳定细胞系。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此此类子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。原核宿主细胞的示例是大肠杆菌(Escherichia coli)、杆菌属(bacilli)(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)(诸如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)))以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)菌种。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括永生细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas,VA，CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury,Wiltshire,UK，ECACC号85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠科动物细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHO-K1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本公开提供了包含本公开的任何表达载体的重组宿主细胞。编码任何VEGFR1结合蛋白或其片段的核酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。
可基于目的VEGFR1抗体的高水平表达和来自宿主细胞蛋白的最小污染来选择细胞系。可用作表达宿主细胞的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，包括但不限于来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞如CHO-K1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或CHO DG44，以及幼仓鼠肾(BHK)细胞。通过在适用于表达抗体的条件下培养细胞并从宿主细胞或宿主细胞周围的培养基中纯化抗体，这些细胞系可用于产生本公开的任何抗VEGFR1抗体或抗体片段。
本公开还提供了产生本公开的抗VEGFR1结合蛋白的方法，该方法包括在表达抗VEGFR1结合蛋白的条件下培养本公开的宿主细胞，以及使用本领域熟知的方法回收由该宿主细胞产生的抗VEGFR1抗体结合蛋白。受试者蛋白可以基本上是纯净的，例如，至少约80％至85％纯净、至少约85％至90％纯净、至少约90％至95％纯净、或者至少约98％至99％纯净，或者更加纯净，例如，不含除受试者蛋白之外的污染物，诸如细胞碎片、大分子等。
在一些实施方案中，本公开提供了表达本公开的任何分离的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了包含本公开的载体的宿主细胞。
药物组合物
还提供了任何所公开的抗体用于制备用于治疗慢性肾病的药物的用途。
还提供了任何所公开的抗体用于制备用于治疗慢性肾病的药物组合物的用途。
还提供了包含本公开的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂的药物组合物。
就治疗性用途而言，可以药物组合物形式制备本公开的抗VEGFR1抗体和其抗原结合片段，这些药物组合物含有有效量的抗体作为药学上可接受的载剂中的活性成分。
“载剂”是指本发明的抗体与其一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的公知灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学可接受的辅助物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本发明的抗体的浓度可从按重量计小于约0.5％，通常到至少约1％到多达15％或20％改变，且可根据所选择的施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其他人蛋白(例如，人血清白蛋白)在内的合适的媒介物和制剂在例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”，第21版，Troy,D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins，Philadelphia，PA，2006年，第5部分，“Pharmaceutical Manufacturing”，第691-1092页(特别参见第958-989页)中有所描述。
药学上可接受的载剂可以包括缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。药学上可接受的载剂的示例是生理上相容的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，诸如盐、缓冲剂、抗氧化剂、糖类、水性或非水性载剂、防腐剂、润湿剂、表面活性剂或乳化剂，或者它们的组合。药物组合物中的药学上可接受的载剂的量可基于载剂活性和所需制剂特征(例如稳定性和/或最低氧化)来通过实验确定。
药物组合物可以包含缓冲剂，诸如乙酸、柠檬酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、碳酸、苹果酸、天冬氨酸、组氨酸、硼酸、Tris缓冲剂、HEPPSO、HEPES、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；抗细菌剂和抗真菌剂；以及防腐剂。
本公开的药物组合物可以被配制用于肠胃外施用或非肠胃外施用的多种方式。在一个实施方案中，所述组合物可以被配制用于输注或静脉内施用。本文所公开的药物组合物可以例如作为无菌液体制剂(例如等渗水溶液剂、乳剂、混悬剂、分散体或粘稠组合物)提供，其可以被缓冲至期望的pH。适用于口服施用的制剂可以包括液体溶液剂、胶囊剂、小药囊、片剂、锭剂和糖锭、散剂，以及在适当的液体和乳剂中的液体混悬剂。
如本文关于药物组合物所用的术语“药学上可接受的”，意味着由联邦或州政府的监管机构批准的或者在美国药典或其他公认的药典中列出的用于在动物和/或人类中使用的物质。
治疗方法和用途
还提供了任何所公开的抗体、其抗原结合片段或药物组合物用于治疗慢性肾病的用途。
疾病或病症(诸如慢性肾病)的“治疗(Treat/treating/treatment)”是指实现以下结果中的一者或多者：降低病症的严重程度和/或缩短病症的持续时间、延迟病症的进展、减缓病症的进展、抑制所治疗病症的特征性症状的恶化、限制或防止先前患有病症的受试者的该病症的复发，或者限制或防止先前有病症的症状的受试者的症状的复发。如本文所用，术语“延迟…的进展”和“减缓…的进展”应当包括：(a)延迟或减缓疾病、病状或病症的一种或多种症状或并发症的发展；(b)延迟或减缓疾病、病状或病症的一种或多种新型/附加症状或并发症的发展；和/或(c)延迟或减缓疾病、病状或病症进展成所述疾病、病状或病症的后续阶段或更严重形式。
“受试者”包括任何人或非人动物。“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于非人灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，受试者或患者是人。
本申请的分离的抗体或其抗原片段可阻止有需要的受试者中VEGFA与VEGFR1的结合。因此，本申请的另一个一般方面涉及阻止有需要的受试者中VEGFA与VEGFR1结合的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本申请的分离的抗体或其抗原片段、免疫缀合物、药物组合物、分离的多核苷酸、载体或宿主细胞，从而阻止VEGFA与VEGFR1的结合。受试者可能需要治疗与VEGFA与VEGFR1的结合相关的疾病、病症或医学病状。
在一些实施方案中，受试者需要治疗慢性肾病(CKD)，需要减少蛋白尿，患有晚期4期或5期慢性肾病，或者患有伴有蛋白尿、白蛋白尿或糖尿病的CKD。
在一些实施方案中，一种阻止有需要的受试者中VEGFA与VEGFR1结合的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本公开的任何分离的抗体或其抗原片段、本公开的任何免疫缀合物、本公开的任何药物组合物、本公开的任何分离的多核苷酸、本公开的任何载体或本公开的任何宿主细胞，从而阻止VEGFA与VEGFR1的结合。
还提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段来治疗医学病状的方法。在一些实施方案中，医学病状是慢性肾病。“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段内有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素而变化。
在一些实施方案中，医学病状是慢性肾病。在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的慢性肾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的所公开的药物组合物。
“慢性肾病”旨在包括任何病因的或由与慢性肾病相关的任何类型的病状引起并产生与慢性肾病相关的所有类型的症状的所有类型的慢性肾病(CKD)。CKD包括原发性肾小球疾病(包括但不限于肾病和局灶节段性肾小球硬化)、继发性肾小球疾病(包括但不限于狼疮性肾炎)、血栓性微血管病、肾小管间质疾病、缺血性肾病、糖尿病性肾病、多囊性肾病、高血压性肾病、局灶节段性肾小球硬化、肾病综合征和梗阻性尿路病(包括但不限于反流性肾病)。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的糖尿病性肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的任何抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段或本公开的任何所公开的药物组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的慢性肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中该慢性肾病是糖尿病性肾病。
在一些实施方案中，本公开提供了延迟受试者的慢性肾病的进展或减缓其进展的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中该慢性肾病是糖尿病性肾病。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的慢性肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体，其中该慢性肾病是局灶节段性肾小球硬化。
在一些实施方案中，本公开提供了延迟受试者的慢性肾病的进展或减缓其进展的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体，其中该慢性肾病是局灶节段性肾小球硬化。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的慢性肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中该慢性肾病是高血压性肾病。
在一些实施方案中，本公开提供了延迟受试者的慢性肾病的进展或减缓其进展的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中该慢性肾病是高血压性肾病。
在一些实施方案中，受试者患有慢性肾病(CKD)。慢性肾病被分为五个肾病阶段。肾病的阶段是根据肾脏能够从血液中过滤出废物和多余液体的速度来进行分类的。估计的肾小球滤过率(eGFR)数值基于血液中肌酸和废物的水平，并且已经用于对肾损伤的五个阶段进行分类，从第1阶段的极轻度损伤到第5阶段的肾衰竭。
在一些实施方案中，治疗有需要的受试者的慢性肾病(CKD)的方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的任何分离的抗体或其抗原片段、本公开的任何免疫缀合物、本公开的任何药物组合物、本公开的任何分离的多核苷酸、本公开的任何载体或本公开的任何宿主细胞，持续足以治疗CKD的时间。
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低肾小球滤过率(GFR)损失的VEGFR1。
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低肾小球滤过率(GFR)损失的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，受试者患有晚期3期、4期或5期慢性肾病，其中eGFR(估计的肾小球滤过率)低于60ml/min/1.73m2。在一些实施方案中，受试者含有晚期4期或5期慢性肾病，其中测量的eGFR等于或低于30ml/min/1.73m2。在一些实施方案中，受试者患有3期慢性肾病，其中测量的eGFR为30ml/min/1.73m2至和60ml/min/1.73m2。在一些实施方案中，受试者患有3b期慢性肾病，其中测量的eGFR为30ml/min/1.73m2至45ml/min/1.73m2。在一些实施方案中，受试者患有晚期4期或5期慢性肾病并且未进行透析。在一些实施方案中，受试者患有晚期4期或5期慢性肾病并且正在进行透析。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的慢性肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有4期或5期慢性肾病，测量的eGFR等于或低于30ml/min/1.73m2。
在一些实施方案中，本公开提供了延迟受试者的慢性肾病的进展或减缓其进展的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有4期或5期慢性肾病，测量的eGFR等于或低于30ml/min/1.73m2。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的慢性肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有3期慢性肾病，测量的eGFR为30ml/min/1.73m2至60ml/min/1.73m2。
在一些实施方案中，本公开提供了延迟受试者的慢性肾病的进展或减缓其进展的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有3期慢性肾病，测量的eGFR为30ml/min/1.73m2至60ml/min/1.73m2。
在一些实施方案中，受试者患有伴有蛋白尿的慢性肾病。在一些实施方案中，受试者患有伴有白蛋白尿的慢性肾病。在一些实施方案中，受试者患有伴有糖尿病的慢性肾病。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的慢性肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有伴有蛋白尿的慢性肾病。
在一些实施方案中，本公开提供了延迟受试者的慢性肾病的进展或减缓其进展的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有伴有蛋白尿的慢性肾病。
在一些实施方案中，本公开提供了减少有需要的受试者的蛋白尿的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的任何分离的抗体或其抗原片段、本公开的任何免疫缀合物、本公开的任何药物组合物、本公开的任何分离的多核苷酸、本公开的任何载体或本公开的任何宿主细胞，持续足以减少受试者的蛋白尿的时间。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的慢性肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有伴有白蛋白尿的慢性肾病。
在一些实施方案中，本公开提供了延迟受试者的慢性肾病的进展或减缓其进展的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有伴有白蛋白尿的慢性肾病。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者的慢性肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有伴有糖尿病的慢性肾病。
在一些实施方案中，本公开提供了延迟受试者的慢性肾病的进展或减缓其进展的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段，其中受试者患有伴有糖尿病的慢性肾病。
“蛋白尿”是指在尿液中存在增加量的蛋白质。蛋白尿可能反映血浆蛋白的异常损失，这是由于a)肾小球对大分子量蛋白质的通透性增加(白蛋白尿或肾小球性蛋白尿)，b)肾小管对正常滤过的低分子量蛋白质的重吸收不完全(肾小管性蛋白尿)，或c)低分子量蛋白质的血浆浓度增加(过量产生蛋白尿，诸如免疫球蛋白轻链)。蛋白尿也可能反映来源于肾脏(肾小管损伤引起的肾小管细胞成分)和下尿路的蛋白质的异常损失。
“白蛋白尿”是尿液中存在白蛋白的病状。健康个体的肾能过滤白蛋白。当肾无法正常地从尿液中过滤大分子(诸如白蛋白)时，白蛋白会分泌到尿液中，并且通常是肾损伤的病征。白蛋白尿是CKD患者中常见但不一致的病状。它是肾小球疾病(包括糖尿病性肾小球硬化)的最早标志物，其通常在eGFR降低之前出现。它是高血压性肾硬化的标志物，但可能直到eGFR降低后才出现。
“糖尿病性肾病”是糖尿病的微血管并发症之一，并且其特征在于白蛋白尿持续存在以及肾功能逐渐衰退。
在一些实施方案中，本公开提供了减少患有慢性肾病的患者的蛋白尿的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开提供了减少有需要的患者的蛋白尿的方法，该方法包括向所述患者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，蛋白尿由慢性肾病引起。在其他实施方案中，蛋白尿由糖尿病性肾病引起。
在一些实施方案中，本公开提供了减少患有慢性肾病的患者的白蛋白尿的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段。
还提供了检测样品中VEGFR1的方法，该方法包括获得样品，使样品与本公开的抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段接触以及检测样品中结合的VEGFR1。
在一些实施方案中，样品可源自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、滑液、循环细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。可使用已知的方法检测VEGFR1。示例性方法包括使用荧光或化学发光标记、或放射标记物直接标记抗体，或者使易于检测的部分(诸如生物素、酶或表位标签)连接到本发明的抗体上。示例性的标记和部分为钌、111In-DOTA、111In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料和染料。
本公开的抗体及其抗原结合片段可用于多种测定以检测样品中的VEGFR1。示例性的测定法为蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离子体共振、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。
试剂盒
本文描述了包含本公开的抗体或抗原结合片段或它们的功能等同物的试剂盒。
本公开提供了包含结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
试剂盒可用于治疗用途并用作诊断试剂盒。
试剂盒可用于检测样品中VEGFR1的存在。
在一些实施方案中，试剂盒包含本公开的抗VEGFR1抗体或抗原结合片段和用于检测VEGFR1结合蛋白的试剂。试剂盒可包含一个或多个其他元件，包括：使用说明；其他试剂，例如标记、治疗剂、或者可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其他方式偶联的药剂、或辐射防护组合物；用于准备施用抗体的装置或其他材料；药学上可接受的载剂；以及用于向受试者施用的装置或其他材料。
在一些实施方案中，试剂盒包含在容器中的结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段以及试剂盒的使用说明。
在一些实施方案中，本公开包含试剂盒，该试剂盒包含本公开的任何分离的抗体或抗原结合片段、本公开的任何免疫缀合物、本公开的任何药物组合物、本公开的任何分离的多核苷酸、本公开的任何载体、本公开的任何宿主细胞。
在一些实施方案中，试剂盒中结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段是标记的。
在一些实施方案中，试剂盒包含结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:31的VH和SEQ ID NO:32的VL；
SEQ ID NO:33的VH和SEQ ID NO:32的VL；
SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:35的VL；
SEQ ID NO:36的VH和SEQ ID NO:37的VL；
SEQ ID NO:38的VH和SEQ ID NO:37的VL；或者
SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，试剂盒包含结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施方案中，试剂盒包含结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:51、52、53、54、55、56、57、59或60的氨基酸序列。
在一些实施方案中，试剂盒包含结合VEGFR1的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:51和SEQ IDNO:52；(b)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:52；(c)SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55；(d)SEQ IDNO:56和SEQ ID NO:57；(e)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:57；以及SEQ ID NO:59和SEQ IDNO:60。
实施方案
实施方案的以下列表旨在补充而不是替换或取代先前的描述。
实施方案1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与SEQ ID NO:173或SEQ IDNO:4的氨基酸序列内的表位结合，并且其中所述抗体或其抗原结合片段阻止VEGFA与VEGFR1的结合。
实施方案2.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与SEQ ID NO:173的氨基酸序列内的表位结合，并且其中所述抗体或其抗原结合片段阻止VEGFA与VEGFR1的结合。
实施方案3.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与SEQ ID NO:4的氨基酸序列内的表位结合，并且其中所述抗体或其抗原结合片段阻止VEGFA与VEGFR1的结合。
实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与具有氨基酸序列FPLDTL(SEQ ID NO:143)或EIGL(SEQ IDNO:144)的VEGFR1上的表位结合，或与具有氨基酸序列FPLDTL(SEQ ID NO:143)和EIGL(SEQID NO:144)的表位结合。
实施方案5.根据实施方案4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与具有氨基酸序列FPLDTL(SEQ ID NO:143)的VEGFR1上的表位结合。
实施方案6.根据实施方案4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与具有氨基酸序列EIGL(SEQ ID NO:144)的VEGFR1上的表位结合。
实施方案7.根据实施方案4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人、小鼠、大鼠和/或食蟹猴VEGFR1结合。
实施方案8.根据实施方案7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人VEGFR1。
实施方案9.根据实施方案8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人VEGFR1和来自至少一种选自由食蟹猴、小鼠和大鼠组成的组的物种的VEGFR1结合。
实施方案10.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人和小鼠VEGFR1结合。
实施方案11.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人和大鼠VEGFR1结合。
实施方案12.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人、小鼠和大鼠VEGFR1结合。
实施方案13.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人和食蟹猴VEGFR1结合。
实施方案14.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人、小鼠、大鼠和食蟹猴VEGFR1结合。
实施方案15.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过使用表面等离子共振(SPR)所确定的6×10-8M或更小，特别是1×10-8M或更小，更特别是5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD与人VEGFR1、小鼠VEGFR1、大鼠VEGFR1和食蟹猴VEGFR1结合。
实施方案16.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过使用表面等离子共振(SPR)所确定的6×10-8M或更小，特别是1×10-8M或更小，更特别是5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD与人VEGFR1、小鼠VEGFR1和食蟹猴VEGFR1结合。
实施方案17.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过使用表面等离子共振(SPR)所确定的6×10-8M或更小，特别是1×10-8M或更小，更特别是5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD与人VEGFR1和小鼠VEGFR1结合。
实施方案18.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过使用表面等离子共振(SPR)所确定的6×10-8M或更小，特别是1×10-8M或更小，更特别是5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD与人VEGFR1和大鼠VEGFR1结合。
实施方案19.根据实施方案9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过使用表面等离子共振(SPR)所确定的6×10-8M或更小，特别是1×10-8M或更小，更特别是5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD与人VEGFR1和食蟹猴VEGFR1结合。
实施方案20.根据实施方案1至19中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:31、33、34、36、38或39的VH的重链互补决定区(HCDR)和SEQ ID NO:32、35、37或40的VL的轻链互补决定区(LCDR)。
实施方案21.根据实施方案20所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR；
b.具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR；
c.具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL的LCDR；
d.具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR；
e.具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR；或
f.具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL的LCDR。
实施方案22.根据实施方案21所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含具有HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和具有LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含以下氨基酸序列：
a.分别为SEQ ID NO:7、175、9、10、11和12；
b.分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；
c.分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18；
d.分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24；
e.分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30；
f.分别为SEQ ID NO:71、176、73、74、75和76；
g.分别为SEQ ID NO:71、72、73、74、75和76；
h.分别为SEQ ID NO:77、78、79、80、81和82；
i.分别为SEQ ID NO:83、84、85、86、87和88；
j.分别为SEQ ID NO:89、90、91、92、93和94；
k.分别为SEQ ID NO:95、177、97、98、99和100
l.分别为SEQ ID NO:95、96、97、98、99和100；
m.分别为SEQ ID NO:101、102、103、104、105和106；
n.分别为SEQ ID NO:107、108、109、110、111和112；
o.分别为SEQ ID NO:113、114、115、116、117和118；
p.分别为SEQ ID NO:119、178、121、122、氨基酸序列LNS和SEQ ID NO:124；
q.分别为SEQ ID NO:119、120、121、122、氨基酸序列LNS和SEQ ID NO:124；
r.分别为SEQ ID NO:125、126、127、128、氨基酸序列FNF和SEQ ID NO:130；
s.分别为SEQ ID NO:131、132、133、134、氨基酸序列YD和SEQ ID NO:136；或者
t.分别为SEQ ID NO:137、138、139、140、氨基酸序列FNS和SEQ ID NO:142。
实施方案23.根据实施方案22所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:7、175、9、10、11和12的氨基酸序列。
实施方案24.根据实施方案22所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18的氨基酸序列。
实施方案25.根据实施方案22所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的氨基酸序列。
实施方案26.根据实施方案22所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的氨基酸序列。
实施方案27.根据实施方案22所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24的氨基酸序列。
实施方案28.根据实施方案1至27中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域具有与SEQ ID NO:31、33、34、36、38或39的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:32、35、37或40的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列。
实施方案29.根据实施方案28所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，所述VH和VL包含以下氨基酸序列：
a.分别为SEQ ID NO:31和32；
b.分别为SEQ ID NO:33和32；
c.分别为SEQ ID NO:34和35；
d.分别为SEQ ID NO:36和37；
e.分别为SEQ ID NO:38和37；或者
f.分别为SEQ ID NO:39和40。
实施方案30.根据实施方案29所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:40的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
实施方案31.根据实施方案30所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL。
实施方案32.根据实施方案29所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
实施方案33.根据实施方案32所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
实施方案34.根据实施方案29所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:37的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
实施方案35.根据实施方案34所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL。
实施方案36.根据实施方案29所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
实施方案37.根据实施方案36所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
实施方案38.根据实施方案29所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:37的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
实施方案39.根据实施方案38所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL。
实施方案40.根据实施方案29所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:35的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
实施方案41.根据实施方案40所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
实施方案42.根据实施方案1至41中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链(HC)和轻链(LC)，所述重链具有与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:60的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列。
实施方案43.根据实施方案42所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:51、52、53、54、55、56、57、59和60。
实施方案44.根据实施方案43所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含
a.包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；
b.包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；
c.包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；
d.包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；
e.包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；或
f.包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC。
实施方案45.根据实施方案44所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:51的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC。
实施方案46.根据实施方案44所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:53的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC。
实施方案47.根据实施方案44所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:54的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LC。
实施方案48.根据实施方案44所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:56的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC。
实施方案49.根据实施方案44所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:58的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC。
实施方案50.根据实施方案44所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:59的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC。
实施方案51.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH的HCDR和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR；
b.包含分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC。
实施方案52.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH的HCDR和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL的LCDR；
b.包含分别具有SEQ ID NO:13、14和15的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL；和/或d.具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC；以及具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LC。
实施方案53.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH的HCDR的重链可变区(VH)和具有包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR的轻链可变区(VL)；
b.包含分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC。
实施方案54.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH的HCDR的重链可变区(VH)和具有包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL的LCDR的轻链可变区(VL)；
b.包含分别具有SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:28、29和30的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC。
实施方案55.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH的HCDR的重链可变区(VH)和具有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR的轻链可变区(VL)；
b.包含分别具有SEQ ID NO:7、175和9的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC。
实施方案56.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH的HCDR的重链可变区(VH)和具有包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR的轻链可变区(VL)；
b.包含分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC。
实施方案57.根据实施方案1至56中任一项所述的分离的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab’)2、Fd、dAb、VHH或单链抗体。
实施方案58.根据实施方案1至57中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
实施方案59.根据实施方案58所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型。
实施方案60.根据实施方案59所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含Ig恒定区或所述Ig恒定区的片段。
实施方案61.根据实施方案60所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段包含导致所述抗体或其抗原结合片段与Fcγ受体(FcγR)的结合减少的至少一个突变。
实施方案62.根据实施方案61所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中导致所述抗体或其抗原结合片段与FcγR的结合减少的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S，其中根据EU索引进行残基编号。
实施方案63.根据实施方案62所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述Ig恒定区或所述恒定区的所述片段包含L234A_L235A_D265S的突变。
实施方案64.根据实施方案62所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述FcγR是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII，或它们的任何组合。
实施方案65.根据实施方案64所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段还包含调节所述抗体或其抗原结合片段的半衰期的至少一个突变。
实施方案66.根据实施方案65所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中调节所述抗体或其抗原结合片段的所述半衰期的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中根据EU索引进行残基编号。
实施方案67.一种免疫缀合物，包含缀合至治疗剂或显像剂的根据实施方案1至66中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
实施方案68.一种药物组合物，包含根据实施方案1至66中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载剂。
实施方案69.一种分离的多核苷酸，编码根据实施方案1至66中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
实施方案70.根据实施方案69所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70的多核苷酸序列有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。
实施方案71.一种载体，包含根据实施方案69或70所述的多核苷酸。
实施方案72.一种宿主细胞，表达根据实施方案1至70中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，诸如包含根据实施方案71所述的载体的宿主细胞。
实施方案73.一种阻止有需要的受试者中VEGFA与VEGFR1结合的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案1至66中任一项所述的分离的抗体或其抗原片段、根据实施方案67所述的免疫缀合物、根据实施方案68所述的药物组合物、根据实施方案69或70所述的分离的多核苷酸、根据实施方案71所述的载体或根据实施方案72所述的宿主细胞，从而阻止VEGFA与所述VEGFR1的结合。
实施方案74.根据实施方案73所述的方法，其中所述受试者需要治疗慢性肾病(CKD)，需要减少蛋白尿，患有晚期4期或5期慢性肾病，或者患有伴有蛋白尿、白蛋白尿或糖尿病的CKD。
实施方案75.一种治疗有需要的受试者的慢性肾病(CKD)的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1至66中任一项所述的分离的抗体或其抗原片段、根据实施方案67所述的免疫缀合物、根据实施方案68所述的药物组合物、根据实施方案69或70所述的分离的多核苷酸、根据实施方案71所述的载体或根据实施方案72所述的宿主细胞，持续足以治疗所述CKD的时间。
实施方案76.根据实施方案75所述的方法，其中所述受试者患有晚期4期或5期慢性肾病。
实施方案77.根据实施方案75所述的方法，其中所述受试者患有3期慢性肾病。
实施方案78.根据实施方案75所述的方法，其中所述受试者患有伴有蛋白尿、白蛋白尿或糖尿病的CKD。
实施方案79.一种减少有需要的受试者的蛋白尿的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1至66中任一项所述的分离的抗体或其抗原片段、根据实施方案67所述的免疫缀合物、根据实施方案68所述的药物组合物、根据实施方案69或70所述的分离的多核苷酸、根据实施方案71所述的载体或根据实施方案72所述的宿主细胞，持续足以减少所述受试者的蛋白尿的时间。
实施方案80.一种减少有需要的受试者的白蛋白尿的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1至66中任一项所述的分离的抗体或其抗原片段、根据实施方案67所述的免疫缀合物、根据实施方案68所述的药物组合物、根据实施方案69或70所述的分离的多核苷酸、根据实施方案71所述的载体或根据实施方案72所述的宿主细胞，持续足以减少所述受试者的蛋白尿的时间。
实施方案81.一种试剂盒，包含根据实施方案1至66中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段、根据实施方案67所述的免疫缀合物、根据实施方案68所述的药物组合物、根据实施方案69或70所述的分离的多核苷酸、根据实施方案71所述的载体或根据实施方案72所述的宿主细胞。
实施例
实施例1.抗原生成
血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)是受体酪氨酸激酶(RTK)的V型亚家族的成员，其由七个细胞外免疫球蛋白(Ig)样结构域、单个跨膜结构域和细胞质激酶结构域组成。先前的结构研究表明，配体与VEGFR1的结合由Ig结构域2和3(D2和D3)介导，这两个结构域分别为结合界面贡献了和/>(Markovic-Mueller,S.等人,Structure,25(2),341–352,2017)。这通过结合分析得到证实，其中通过SPR测定重组人VEGFR1(D1-D3)和人VEGFR1(D2-D3)对人VEGF165(R&D Systems)的亲和力分别为<45pM和<30pM。单独的hVEGFR1的结构域2表现出22nM的显著较低的亲和力(亲和力降低约1,000倍)，这与先前发表的生化数据一致，表明单独的VEGFR1的D2(Flt-1(2)-IgG)对VEGF165表现出显著降低的亲和力(Davis-Smyth,T.等人,EMBO Journal,15(18),4919–4927,1996)。
因此，为了鉴定能够阻断配体与VEGFR1结合的抗体，在抗体发现期间使用仅包含D2-D3或D1-D3的VEGFR1细胞外结构域(ECD)的截短形式作为主要免疫原。人VEGFR1的第二免疫球蛋白样结构域和第三免疫球蛋白(Ig)样结构域的Fc嵌合体(hVEGFR1 D2–D3-Fc-6xHis)通过经由HRV3C蛋白酶识别序列‘LEVLFQGP’(SEQ ID NO:174)将氨基酸残基130-331(UniProt登录号P17948)与人免疫球蛋白重链恒定γ1(UniProt登录号P01857)的残基100-330融合而产生。将6X His-标签添加到构建体的C端以用于灵活的纯化选择(构建体VGFW8；SEQ ID NO:1)。另外，鼠VEGFR1的第一免疫球蛋白样结构域至第三免疫球蛋白(Ig)样结构域的Fc嵌合体(mVEGFR1 D1–D3-Fc-6xHis)通过经由HRV3C蛋白酶识别序列‘LEVLFQGP’(SEQID NO:174)将残基23-332(UniProt登记号P35969)连接至人免疫球蛋白重链恒定γ1(UniProt登记号P01857)的残基100-330而产生。
类似的构建体(mFlt(1-3-IgG))先前被描述为VEGF和/或PlGF活性的有效抑制剂(Ferrara,N.等人,Nature Medicine,4(3),336–340 1998)。为了纯化策略的灵活性，还将6X His-标签添加到构建体的C端(构建体VGFW9；SEQ ID NO:2)。设计了另外的构建体，其中来自人、小鼠或食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))的VEGFR1细胞外结构域(ECD)的部分或整体在C端附加有Avi-标签和6x His-标签序列。这些包括：人VEGFR1的Ig样结构域2(Uniprot登录号P17948的残基130-225；构建体VGFW2；SEQ ID NO:3)、人VEGFR1的Ig样结构域2和3(Uniprot登录号P17948的残基130-331；构建体VGFW3；SEQ ID NO:4)、鼠VEGFR1的Ig样结构域1至3(Uniprot登录号P35969的残基23-332；构建体VGFW4；SEQ ID NO:5)和猴VEGFR1的整个细胞外结构域(登录号XP_005585612.1的残基27-758；构建体VGFW5；SEQ IDNO:6)。
使用聚乙烯亚胺将VEGFR1 ECD表达构建体瞬时转染到HEK 293-6E细胞中。将细胞在20L分批进料的Wave袋(Culti袋)[Sartorius，RM 20L光学目录号DFO020L]中在37℃和5％CO2处温育六天，然后当培养物的活力下降到<80％时收获。通过离心移除细胞，并使用固定化金属亲和色谱法(IMAC)，使用Ni Sepharose 6Fast Flow树脂(GEHealthcare)，然后使用在pH 7.2的Dubelcco磷酸盐缓冲液(1x DPBS)中平衡的Superdex200柱(GE Healthcare)进行制备型尺寸排阻色谱法(SEC)，从培养基中纯化具有His标签的可溶性VEGFR1蛋白质。可替代地，对于VGFW8和VGFW9，通过应用于MabSelectSuRe蛋白A色谱树脂(GE Healthcare)并从其洗脱来从用过的上清液中捕获重组蛋白。生成的抗原的氨基酸序列显示在表2中。
表2.
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实施例2.scFv-Fc形式的VEGFR1抗体生成和初步表征
免疫策略
强烈倾向于鉴定配体阻断的抗VEGFR1抗体，这些抗体在包括食蟹猴和啮齿动物在内的各种物种(除人类外)中表现出广泛的交叉反应性，从而能够在糖尿病性肾病(DKD)的公认啮齿动物模型中进行非临床安全性和药理学/功效研究。在发现活动开始时产生物种交叉反应性抗体的能力消除了开发替代抗体的需要，考虑到生物学的复杂性，这些替代抗体可能无法模拟感兴趣的抗体的行为。
获得具有广泛的物种交叉反应性(包括啮齿动物)的抗体可代表严格的设计要求。实际上，先前报道的抗VEGFR1抗体要么是严格的小鼠特异性的，要么是严格的人特异性的，并且显示出较差的物种交叉反应性至没有物种交叉反应性。尽管VGFB80是有效的人VEGFR1结合剂，但在本文中用作参考的VGFB80不表现出与啮齿动物来源的VEGFR1的结合。众所周知，广泛交叉反应性抗体的生成往往受到对表位的免疫耐受性的阻碍，这些表位在通常用于抗体发现的哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠和兔)中是保守的。VEGFR1的配体结合结构域在典型抗体发现物种(即小鼠和大鼠)中的保守性由图1和表3中所示的氨基酸序列同一性来证明。在人和小鼠/大鼠之间观察到VEGFR1结构域2和3的序列同一性分别为约80％和67％。
表3.人和食蟹猴、小鼠、大鼠、兔或鸡之间的结构域2或结构域2和3的VEGFR1序列同一性的概述。使用Geneious2021.1.1通过比对和分析计算同一性百分比。
可替代地，对***发育较远的物种(诸如鸡)进行免疫有时可以克服对“泛哺乳动物”表位的免疫耐受性(Ching,K.H.等人,MAbs,10(1),71–80,2018)。与小鼠和大鼠相比，转基因Omnichicken在***发育上与人的距离更远，对保守的人蛋白质表现出强大的免疫应答。然而，单独使用Omnichicken并不能保证高亲和力物种交叉反应性抗体。
本文所述的高亲和力和物种交叉反应性抗VEGFR1抗体是使用独特的抗体生成策略生成的，该策略包括(1)选择和设计独特的抗原(VEGFR1的配体结合亚结构域)，(2)选择用于免疫的***发育上较远的物种(鸡)，(3)独特的免疫程序和(4)精细的血清滴度筛选过程，其鉴定具有广泛物种反应性的抗VEGFR1抗体。具有人源化免疫球蛋白基因的转基因鸡(n＝12)(OmniChicken；Ligand Pharmaceuticals；Emeryville,CA and Schusser,B.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110,20170-20175,2013)用hVEGFR1 D2–D3-Fc-6xHis(VGFW8)或用VGFW8和mVEGFR1 D1–D3-Fc-6xHis(VGFW9)的交替加强进行免疫。使用VGFW2(hVEGFR1_D2-Avi-His)、VGFW3(hVEGFR1_D2-3 Avi His)、VGFW4(mVEGFR1_D1-3_Avi-6xHis)和VGFW5(食蟹猴VEGFR1_ECD_Avi-6xHis)纯化的重组蛋白，通过ELISA监测鸟类的血清滴度。从具有针对人和小鼠VEGFR1重组蛋白的最佳滴度的鸟类中收获脾脏。从脾脏中分离淋巴细胞，并询问其与包被有VGFW4以及VGFW3和/或VGFW2的两种珠子的阳性结合。对淋巴细胞进行单细胞逆转录酶PCR以回收v基因序列。在哺乳动物表达载体中将VH和VL序列组装为scFv-Fc(人IgG1)分子。哺乳动物表达构建体用于通过瞬时转染以小规模(96孔格式)产生抗体。通过使用纯化抗原的ELISA，对来自小规模表达的上清液中是否存在对VEGFR1具有特异性的重组抗体进行筛选。将再次确认的阳性克隆扩增到6孔板(2mL)中，并使用上清液的系列稀释液重复ELISA和FACS分析，以确认与人、食蟹猴和小鼠VEGFR1的结合—两者都是细胞外结构域的可溶性纯化重组蛋白和经工程化以过表达人、食蟹猴或小鼠VEGFR1的HEK细胞上的全长细胞表面结合受体。另外，在分别经工程化以过表达hVEGFR2和hVEGFR3的HEK和K562细胞上对扩增的克隆进行反筛选(图2)。
对通过ELISA和FACS显示与人、食蟹猴和小鼠VEGFR1特异性结合的克隆亚群进行测序，并重组为人单克隆IgG1(L234A/L235A/D265S)分子(2H:2L)，以消除任何Fc受体效应子功能，同时保留FcRn亲和力。在最初询问的约800个淋巴细胞中，产生了43个符合上述标准的独特分子(5.6％)。剩余的克隆通常要么缺乏与鼠VEGFR1的交叉反应性，要么不显示与VEGFR1的特异性结合(即，也结合细胞上的人VEGFR2或人VEGFR3)。相比之下，更常规的啮齿动物免疫活动是平行进行的(n＝42只免疫动物)，并且在细胞上筛选的约2,200个MSD初级命中中，仅有4个克隆显示出Hu/Cy/Mo VEGFR1广泛的物种交叉反应性(0.18％命中率)，并且这些分子最终被证明在阻断配体结合方面不太有效或具有不期望的序列倾向。
对重组为人单克隆IgG1(L234A/L235A/D265S)分子的43个独特的Omnichicken衍生的克隆以小规模(2mL)进行表达和纯化，并进行广泛的附加表征，包括(1)通过SPR对人、食蟹猴和小鼠VEGFR1的亲和力测定，(2)配体阻断效力(生物化学和基于细胞的)，(3)热稳定性，(4)表面疏水性，(5)非特异性结合，(6)在应力/强制降解研究后缺乏修饰。43个分子中的28个(约65％)被鉴定为代表10-11个序列家族的强效配体阻断剂。在db/db小鼠的单剂量PK-TE-PD研究中评估了八种抗VEGFR1 mAb。在食蟹猴单剂量PK-TE研究中评估了VGFB54、VGFB71、VGFB78和VGFB82，并对其进行了广泛的内在特性和结构表征。
VGFB883和VGFB400的设计
观察到VGFB54在重链CDR2中含有‘NG’脱酰胺序列，并且通过肽谱观察到当在pH8.5(40℃)处维持一周时，其经历显著的脱酰胺(14.7％修饰)。为了解决这种风险，生成了一个小的变体文库，其中N54或G55被每一个可能的替代氨基酸(除Cys或Trp之外)取代。然后在生化配体阻断测定和细胞结合测定中评估变体文库与靶标的保留结合。几乎所有变体都表现出与VEGFR1的保留或略有改善的结合。选择VGFB54的N54Q变体(VGFB883)用于进一步开发，因为它是化学上最保守的氨基酸取代之一，解决了翻译后修饰的风险，并表现出与靶标结合的保留(表4)。
表4. VGFB883的配体阻断和细胞结合
抗体 配体阻断,IC50(M) 细胞结合,IC50(M)
VGFB54 8.94095E-11 1.97903E-10
VGFB883 4.40442E-11 6.54912E-11
从转基因动物获得的抗体序列在框架区和CDR区中可含有体细胞超突变。体细胞超突变可能会导致人框架区中出现异常或低频残基，并影响生物治疗药物的稳定性和免疫原性。亲本抗VEGFR1抗体VGFB78重链可变区在框架区内的位置110(105Chothia描绘)处含有体细胞超突变。与通常在该位置处发现的最常见的谷氨酰胺(Q)残基(频率76％)相比，在位置110(105Chothia)处的亮氨酸残基通常是低频率残基(频率低于1％)(图3)。因此，在VGFB78的重链中工程化了L11Q突变，导致VGFB400，这代表了在该位置的种系同一性的逆转。选择这种取代以反映该位置处最常见的同一性。
ExpiCHO小规模转染和纯化
将从免疫活动中鉴定的抗体克隆并以2ml规模表达为IgG1-AAS(L234A/L235A/D265S)并纯化。将ExpiCHOTM细胞(ThermoFisher Scientific)在37℃、7％CO2处在ExpiCHOTM表达培养基中培养。当密度达到具有98％-99％活力的4×106个至6×106个活细胞/mL的对数生长期时，对细胞进行继代培养。在转染当天，测定活细胞密度和活力百分比。按照制造商的转染方案(用于24和96深孔板和小型生物反应管的ThermoFisher ExpiCHO表达***方案)，以6×106个活细胞/mL的密度转染细胞。在转染后第7天，通过在纯化前以850×g离心15分钟来收获培养上清液。使用MabSelect Sure树脂(GE Healthcare)从澄清的上清液中纯化抗体，并透析到PBS中。通过使用DropSense仪器(Trinean NV/SA)测量滤液在280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。
抗VEGFR1抗体的序列
表5示出了所选抗VEGFR1选择抗体的Kabat HCDR1、HCDR2和HCDR3。表6示出了所选抗VEGFR1抗体的Kabat LCDR1、LCDR2和LCDR3。表7示出了所选抗VEGFR1抗体的ChothiaHCDR1、HCDR2和HCDR3。表8示出了所选抗VEGFR1抗体的Chothia LCDR1、LCDR2和LCDR3。表9示出了所选抗VEGFR1抗体的ABM HCDR1、HCDR2和HCDR3。表10示出了所选抗VEGFR1抗体的ABM LCDR1、LCDR2和LCDR3。表11示出了所选抗VEGFR1抗体的IMTG HCDR1、HCDR2和HCDR3。表12示出了所选抗VEGFR1抗体的IMTG LCDR1、LCDR2和LCDR3。表13示出了所选抗VEGFR1抗体的VH和VL氨基酸序列。表14示出了所选抗VEGFR1抗体的VH核酸序列。表15示出了所选抗VEGFR1抗体的VL核酸序列。
表16示出了所选抗VEGFR1抗体的HC氨基酸序列。表17示出了所选抗VEGFR1抗体的LC氨基酸序列。表18示出了所选抗VEGFR1抗体的HC核苷酸序列。表19示出了所选抗VEGFR1抗体的LC核苷酸序列。表20汇总了指定给所选抗VEGFR1抗体的SEQ ID NO:。
表5.使用Kabat描绘的所选抗VEGFR1抗体的HCDR
表6.使用Kabat描绘的所选抗VEGFR1抗体的LCDR
表7.使用Chothia描绘的所选抗VEGFR1抗体的HCDR
表8.使用Chothia描绘的所选抗VEGFR1抗体的LCDR
表9.使用ABM描绘的所选抗VEGFR1抗体的HCDR
表10.使用ABM描绘的所选抗VEGFR1抗体的LCDR
表11.使用IMTG描绘的所选抗VEGFR1抗体的HCDR
表12.使用IMTG描绘的所选抗VEGFR1抗体的LCDR
NA＝不适用
表13.所选抗VEGF1抗体的VH和VL氨基酸序列
/>
表14.所选抗VEGFR1抗体的VH核酸序列
/>
/>
表15.所选抗VEGFR1抗体的VL核酸序列
/>
表16.所选抗VEGFR1抗体的HC氨基酸序列
/>
/>
表17.所选抗VEGFR1抗体的LC氨基酸序列
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表18.所选抗VEGFR1抗体的HC核苷酸序列。
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/>
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表19.所选抗VEGFR1抗体的LC核苷酸序列。
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表20.抗VEGFR1抗体SEQ ID NO的概述
实施例3.抗VEGFR1抗体的生物物理学表征和体外活性分布
确认与过表达VEGFR1的细胞的结合
将亲本CHO-K1细胞、稳定表达人VEGFR1的CHO-K1细胞、Ba/F3亲本细胞和稳定表达鼠VEGFR1的Ba/F3细胞在4℃处分别用无染色、CSFE、CTV或CTV+CSFE染色10分钟。随后用含有热灭活的FBS的培养基洗涤细胞，通过离心收集，合并，重悬于染色缓冲液中，并进行铺板(95μL/孔；每孔每种细胞类型200,000个)。添加抗体样品(5μL/孔)至最终浓度为10nM，并避光在4℃处温育60min。将细胞用150μL/孔染色缓冲液洗涤两次。添加AlexaFluor647缀合的抗人IgG1二抗(100μL/孔)并避光在4℃处温育30分钟。将细胞用150μL染色缓冲液洗涤两次，最终重悬于30μL运行缓冲液中，并在iQue流式细胞仪上读取。该单一浓度测定用于快速确认与细胞上的人和小鼠VEGFR1的结合。进行类似的测定以确认候选抗体在10nM的单一浓度处与稳定过表达食蟹猴VEGFR1的HEK293细胞的结合。为了证明对VEGFR1的特异性，还进行了类似的反筛选测定，以确认抗VEGFR1抗体在单一高浓度(10nM)处缺乏与稳定表达人VEGFR2的HEK293细胞或稳定表达人VEGFR3的K562细胞的结合(表21)。
表21.与细胞上的VEGFR1/2/3的结合：交叉反应性和特异性。
CyVEGFR1的阳性阈值是S/B>3
ND＝未测定的山羊抗人VEGFR2＝R&D Systems目录号AF357
山羊抗人VEGFR2＝R&D Systems目录号AF349
还生成了抗VEGFR1抗体与细胞上的VEGFR1的结合的全剂量-反应曲线。将亲本CHO-K1细胞和稳定表达人VEGFR1的CHO-K1细胞(CHO-K1\hVEGFR1)分别在aMEM+10％FBS和含有10μg/mL嘌呤霉素的aMEM+10％FBS中培养。如上所述，将CHOK1\hVEGFR1用CSFE染色，并且亲本CHO-K1细胞保持未染色。将细胞洗涤，合并(约0.5×106个细胞/mL)，并以每孔约40,000个细胞(75μL/孔)铺板。然后将连续稀释的抗体样品添加到细胞中，并在37℃处温育1小时。将细胞用染色缓冲液洗涤两次，然后在4℃处用AF647缀合的二抗染色30min。将铺板的细胞洗涤两次，然后添加含有Sytox Blue(1:1000)的读取缓冲液，并在iQue流式细胞仪上读取。拟合数据以获得EC50值(表22)。
表22.抗VEGFR1抗体与表达人VEGFR1的细胞的结合。
配体阻断：生物化学和基于细胞的
抗VEGFR1抗体阻止VEGFA或胎盘生长因子(PlGF)配体与VEGFR1结合的能力在生化电化学发光(ECL)测定和基于细胞的测定形式中测定。
简而言之，将MSD MA6000 384板用0.5μg/ml蛋白A/G(Thermo FisherScientific)或抗His mAb(R&D)在TBS中在冷室中包被16小时。将板用1×TBS洗涤两次，并在室温处用35μl/孔的阻断剂A封闭1小时。将重组人或小鼠VEGFR1-Fc蛋白(R&D Systems)或His标记的食蟹猴VEGFR1以0.5μg/ml添加到板中，并在室温处温育1小时。使用70μl/孔1×MSD Tris洗涤缓冲液洗去未结合的VEGFR1蛋白。将半对数系列稀释液中的未标记的VEGFR1配体或抗VEGFR1抗体与结合的VEGFR1在室温处一起预温育30分钟，然后添加稀释的生物素标记的人VEGFA165(0.2nM)、小鼠VEGFA164(0.2nM)或PLGF(2nM)用于结合。值得注意的是，食蟹猴和人VEGFA和PlGF的氨基酸序列是相同的，生物素标记的人VEGF-A和PlGF用作食蟹猴VEGFR1竞争测定的配体。通过添加1μg/ml磺基标记的链霉亲和素来检测结合的配体。在35μl/孔的2×MSD读取缓冲液T的存在下，在MSD成像仪，SECTOR S 600(Meso Scale CDiagnostics，序列号1201180626620)上产生并检测信号。ECL读数用于计算结合％、IC50和最大抑制％。
·结合％＝(((样品-平均值(背景))÷(平均值(总结合)-平均值(背景)))×100
о总结合＝仅生物素配体
о背景＝无阻断剂且无生物素配体
·使用非线性回归对数(抑制剂)与反应-可变斜率(四个参数)拟合曲线。
о公式：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))
о从Prism 8软件中提取IC50。
·最大抑制％＝100-平均值(最高浓度下的结合％)
表23和表24中总结了VEGFR1 mAb在取代VEGFA/PlGF与人、食蟹猴、小鼠VEGFR1结合方面的体外功效(最大抑制％)和效力(IC50)。抗VEGFR1抗体在与人和食蟹猴VEGFR1结合时显示出有效的配体阻断活性，最大抑制率为约100％。IC50值在亚纳摩尔范围内，与其配体相当。虽然VGFB80对小鼠VEGFR1没有结合或没有配体竞争，但其他VEGFR1mAb在该测定中对小鼠VEGFR1显示出高阻断功效和效力。
表23.VEGFA与人、食蟹猴和小鼠VEGFR1的结合竞争
表24.PlGF与人、食蟹猴和小鼠VEGFR1的结合竞争
如下确定细胞上的配体阻断：将Cell Trace Violet CSFE(ThermoFisherScientific)染色的细胞以15,000个细胞/孔(30μL/孔；亲本CHO或经工程化以过表达人VEGFR1的CHO细胞)在FACS染色缓冲液中铺板。将等体积的连续稀释的测试抗体应用于细胞，并在4℃处温育一小时。将细胞用200μL/孔的染色缓冲液洗涤两次，然后添加100μL/孔的生物素化VEGF A配体(500pM)。将细胞在4℃处再温育一小时，然后添加50μL/孔的AF647-缀合的链霉亲和素(3nM)。将板在4℃处避光温育30分钟，用200μL/孔的染色缓冲液洗涤两次，通过离心收集，重悬于含有Sytox Blue活/死染色剂的运行缓冲液中，然后在Intellicyt iQue Plus流式细胞仪上读取。拟合数据以获得IC50值。计算每种浓度的每种测试抗体的配体阻断百分比并确定IC50值(表25)。
表25.VEGF A配体对过表达人VEGFR1(CHOK1)或过表达食蟹猴VEGFR1(HEK)的细胞 的阻断。
热稳定性确定
使用来自Nanotemper Technologies的自动化Prometheus仪器，通过NanoDSF方法确定每种抗体的热稳定性。通过将浓度为0.25mg/mL的样品从384孔样品板加载到24孔毛细管中来进行测量。对每个样品进行重复运行。Prometheus NanoDSF用户界面(熔融扫描选项卡)用于设置运行的实验参数。典型IgG样品的热扫描范围为20℃至95℃，速率为1.0℃/分钟。包括NIST mAb(和/或CNTO3930、CNTO5825)作为对照，并重复运行。分子在330nm和350nm处的固有荧光用于监测温度斜坡期间的展开并被记录为荧光强度随时间的变化。T开始是展开开始时的温度。
表26.通过NanoDSF测量的抗VEGFR1抗体的热稳定性
抗体 T开始(℃) Tagg(℃) Tm1(℃) Tm2(℃)
VGFB54 63.99 72.27 71.75 -
VGFB71 62.74 71.81 67.85 -
VGFB78 62.57 68.48 67.86 -
VGFB82 61.20 73.15 71.32 77.32
还通过差示扫描量热法(DSC)确定了所选候选物的热稳定性。使用MicroCal VP-毛细管DSC仪器。将样品透析到1X DPBS或其他合适的缓冲液中过夜。通过以60℃/小时的速率将样品和参比细胞的温度从25℃升高至95℃来进行热扫描。使用“非双态”参数拟合热谱图。所有样品的Tm1可代表Fab展开，范围为68℃至73℃。Tm2和Tm3与变体IgG1 Fc展开有关。
表27.通过DSC测量的抗VEGFR1抗体的热稳定性
动力学排除测定确定亲和力
动力学排除测定(KEA；KinExA)用于分析抗VEGFR1抗体与人、小鼠和食蟹猴VEGFR1的结合。KEA是基于荧光的溶液法，并且在文献(Darling and Brault,2004)中有详细描述。为了测量相互作用的亲和力，制备具有固定浓度的一种相互作用物(A)和不同浓度的另一种相互作用物(B)的一系列溶液并使其达到平衡。在平衡后，通过使平衡的混合物流过填充有用反应物B修饰的珠粒的柱来测定游离A的浓度。游离A与珠粒结合，然后用荧光标记的多克隆抗体进行检测。将样品以快速流速加载到柱中以实现混合物与珠粒之间的短接触时间，以确保平衡不被破坏(移位)，即，并且B不从AB复合物中解离(动力学排除)。
简而言之，固定浓度(300pM、60pM、12pM、2.4pM或0.5pM)的Ab用于制备抗原的系列稀释液(2nM至0.52pM，或800pM至5.37fM)。将复合物滴定在室温处温育以达到结合平衡至少2天。温育后，将样品在KinExA3200或KinExA4000仪器上运行以评估反应中的游离抗体。在这些研究期间，一些数据被拒绝，因为实验失败或不符合验收标准。对于小鼠VEGFR1，60pM和300pM浓度由于高滴定剂相关的NSB而被拒绝。使用KinExA Pro软件的n-曲线分析特征确定解离平衡常数(KD)。该程序使用全局拟合数据对1:1结合模型的非线性最小二乘回归分析。(CI＝置信区间)。
表28.抗VEGFR1抗体对人、小鼠和食蟹猴VEGFR1的结合亲和力
a小鼠VEGFR1特异性抗体。不结合人、食蟹猴或大鼠VEGFR1
VEGFR对5种mAb的HDX表位作图
通过HDX-MS对VEGFR1针对五种mAb(VGFB54、VGFB71、VGFB78、VGFB80和VGFB82)的表位进行作图。VGFB80是在本文所述的抗体生成工作中未发现的参比分子。在与mAb结合时使自由能降低超过2kcal/mol的片段是HDX-MS定义的“强”表位。在与mAb结合时使自由能降低1kcal/mol至2kcal/mol的片段被认为是“弱”表位。VEGFR1针对所有测试的mAb的表位非常相似。VEGFR1针对VGFB54的强表位是片段172-177(FPLDTL，SEQ ID NO:143)和201-204(EIGL，SEQ ID NO:144)。VEGFR1针对VGFB71的强表位是片段172-177(FPLDTL，SEQ ID NO:143)、200(K)和201-204(EIGL，SEQ ID NO:144)。VEGFR1针对VGFB78的强表位是片段172-177(FPLDTL，SEQ ID NO:143)、200(K)和201-204(EIGL，SEQ ID NO:144)。VEGFR1针对VGFB82的强表位是片段201-204(EIGL，SEQ ID NO:144)。在用0.4mM FC-14、8M尿素、1MTCEP，pH 3.0淬灭后，在用胃蛋白酶/FPXIII混合床柱消化时，VGFW1的序列覆盖率为88％(＝285/326)。在五个潜在的糖基化位点中，N196被非糖肽覆盖，而其他四个位点未被覆盖。
表29.在与抗VEGFR1 mAb结合时的自由能变化(ΔΔG)(kcal/mol)。
起始残基 141 147 172 178 200 201 211 218
末端残基 147 153 177 199 200 204 215 228
VGFB71 -0.3 -1.2 -4.2 0 -2.8 -2.8 -0.1 -0.3
VGFB78 -0.3 -0.6 -2.7 -1.1 -2.9 -3.6 0.1 -0.2
VGFB54 -0.2 -0.4 -2.6 -0.3 -1.4 -3.6 -0.1 -0.7
VGFB82 -0.6 -0.1 -0.6 -1 -0.5 -3.3 -0.1 -0.3
针对VEGFR1的4种mAb的HDX互补位作图
通过HDX-MS对针对VEGFR1的四种mAb的互补位进行作图(图4A和图4B)。在与mAb结合时使自由能降低超过1kcal/mol的片段是HDX-MS限定的表位。VGFB54针对VEGFR1的互补位是重链片段32-35(YGMN，HCDR1，SEQ ID NO:145)、38-46(RQAPGKGLD，SEQ ID NO:146)、49-54(SSINRN，HCDR2，SEQ ID NO:147)、55-59(GDIST，HCDR2，SEQ ID NO:148)、69-77(FTISRDNSK，SEQ ID NO:149)和97-104(CTKNHDYH，HCDR3，SEQ ID NO:150)以及轻链片段1-32(QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSRSNIGNN，LCDR1，SEQ ID NO:151)和51-74(LNSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASL，LCDR2，SEQ ID NO:152)。VGFB71针对VEGFR1的互补位是重链片段30-34(RDYNM，HCDR1，SEQ ID NO:153)、39-47(QAPGKGEW，SEQ ID NO:154)和49-68(SIITNDGSSTAYSDSVKGRF，HCDR2，SEQ ID NO:155)以及轻链片段1-34(QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGSSNIGSNYV，LCDR1，SEQ ID NO:156)、50-51(YF，LCDR2)、54-74(QRPSGVPDRFSGSKSGTSASL，SEQ ID NO:158)和94-98(DRVNV，LCDR3，SEQ ID NO:159)。VGFB78针对VEGFR1的互补位是轻链片段50-73(YYD-QRPSGVPDRFSGSKSGTSASL，LCDR2，SEQID NO:160)。VGFB82针对VEGFR1的互补位是重链片段7-18(SGGGLVQPGGSL，SEQ ID NO:161)、23-28(EASGFD，HCDR1，SEQ ID NO:162)、31-33(TYA，HCDR1)、38-46(RQAPGKGLE，SEQID NO:163)、51-68(INSEGTITSHAPAVKGRFT，HCDR2，SEQ ID NO:164)和96-116(CSSTTGTTHGMDVWG，HCDR3，SEQ ID NO:165)以及轻链片段1-34(QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIQNNYV，LCDR1，SEQ ID NO:166)、50-51(YF，LCDR2)、52-74(NSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASL，LCDR2，SEQ ID NO:167)和95-100(SLNGWV，LCDR3，SEQ ID NO:168)。
酪氨酸激酶激活测定
测试抗VEGFR1抗体以确认它们不能激活VEGFR1信号传导。由于VEGFR1固有的弱信号传导活性，采用了先前描述的基于细胞的生物测定(T.等人EMBO Journal,20(17),4762–4773,2001)。生成稳定表达嵌合受体的Ba/F3细胞，其中人VEGFR1的细胞外结构域(残基1-758；Uniprot登录号P17948)与小鼠***受体的跨膜和细胞内结构域(EpoR；(残基250-507；Uniprot登录号P14753))融合，并在存在或不存在抗VEGFR1抗体或hVEGFR1作为阳性对照的情况下，测定这些细胞的IL-3非依赖性增殖。简而言之，将约20,000个细胞/孔接种于缺乏鼠IL-3的培养基(RPMI+10％FBS+0.5μg/ml嘌呤霉素)中。将鼠IL-3添加到对照孔中，达到10ng/mL的最终浓度。其他孔接受抗VEGFR1抗体(最终浓度10nM或50nM)、hVEGFA165(5nM；R&D Systems)或基础培养基(不含mIL-3)。将细胞在37℃、5％CO2处温育72小时。通过添加50μL/孔CellTiter Glo(Promega)，在室温处温育10分钟来测量增殖。最后，使用超灵敏发光方案在Envision 2105读板器上读取板。将BaF3\hVEGFR1-mEpoR细胞的增殖与mIL-3依赖性条件进行比较。与被证明在不存在mIL-3的情况下拯救细胞的活力的hVEGFA(5nM)不同，所测试的抗VEGFR1抗体在任何测试浓度下都不能促进IL-3非依赖性生长(表30)。该结果与抗VEGFR1抗体不能刺激酪氨酸激酶激活或进一步的下游信号传导一致。
表30.抗VEGFR1抗体激活酪氨酸激酶
特异性细胞表面组
与广泛物种交叉反应性抗体相关的一个风险是增加的脱靶倾向。进行细胞微阵列技术(Retrogenix Ltd.)以确认抗VEGFR1抗体对VEGFR1的特异性以及不存在任何“脱靶”倾向。
这种人细胞微阵列方法先前已描述于文献中(Freeth,J.等人,SLAS Discovery,25(2),223–230,2020)。在排列有固定的HEK293细胞的载玻片上进行初步筛选，其中HEK293细胞的每个点表达来自细胞表面组的独特蛋白、细胞表面束缚的人分泌蛋白或异二聚体人细胞表面受体。在该初步筛选中，总共出现了5,528种独特的基因产物(4,103种人质膜蛋白(+一些未束缚的分泌蛋白)+1,425种细胞表面束缚的人分泌蛋白)。简而言之，用测试抗体溶液(2μg/mL)覆盖含有固定的转染HEK293细胞的载玻片，温育并洗涤。使用AlexaFluor647缀合的抗人IgG Fc检测抗体和ImageQuant上的荧光定量来评估结合。如所预期的，所有测试的抗VEGFR1分子表现出与人VEGFR1的同工型(FLT1同工型1、2和3)的结合(表31-34)。VGFB54、VGFB80和VGFB82没有显示出与通过该筛选捕获的任何其他表面组蛋白的结合。两种抗VEGFR1抗体(VGFB71和VGFB78)表现出与无关细胞表面蛋白(表32)Nectin1、FGFR2(成纤维细胞生长因子受体2)、ISLR(含有富含亮氨酸的重复蛋白的免疫球蛋白超家族)和CRELD2(蛋白质二硫键异构酶CRELD2)的意外结合。位于ER中，与CRELD2的脱靶结合不太受关注。另一方面，Nectin-1、FGFR2和ISLR显示出广泛的组织表达谱。与这些蛋白质的交叉反应性是不期望的，因为与这些靶标的结合可能对分子的药代动力学和生物分布特征具有显著影响。随后通过流式细胞术在瞬时表达在初步筛选中鉴定的这些“脱靶”蛋白的活HEK293细胞上确认了这种脱靶结合。这些数据用于进一步选择不具有已知脱靶倾向的抗VEGFR1抗体。
表31.Retrogenix特异性数据。高于极弱强度的VEGFR1特异性膜命中(期望的命 中)的概述。
表32.Retrogenix特异性数据。高于极弱强度的非VEGFR1特异性膜命中(不期望的 命中)的概述。
表33.Retrogenix特异性数据。高于极弱强度的常见Fcγ受体特异性膜命中(预期 命中)的概述。
表34.Retrogenix特异性数据。高于极弱强度的常见Fcγ受体特异性膜命中(预期 命中)的概述。
实施例4.食蟹猴中抗VEGFR1抗体的全身药代动力学和靶标结合生物标志物谱
除了抗VEGFR1抗体的生物物理学和体外活性谱之外，还对食蟹猴的全身药代动力学(PK)和靶标结合(TE)生物标志物谱进行了表征。
将未经实验的雄性食蟹猴(食蟹猕猴，年龄2至7岁，Envigo RMS)按体重随机分为每组2只动物的组。在第1天以0.3mg/kg、2mg/kg和10mg/kg静脉(IV)给药VGFB54、VGFB78、VGFB82和VGFB80约2分钟，随后在第15天皮下(SC)给药。在给药前和如下时间点，即IV给药后1小时、6小时、24小时、48小时、96小时和168小时，以及SC给药后1小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时和336小时，经由股静脉将每只动物的血液样品(总共0.5mL-2mL)收集到含有K2 EDTA的试管中。在离心以获得血浆(采集后1小时内)之前，将血液样品保持在2℃-8℃。将血浆样品采集成PK和TE等分试样，并在-70℃处储存，直至样品分析。
抗VEGFR1抗体的免疫测定生物分析
食蟹猴血浆中抗VEGFR1 mAb的“总”和“游离”mAb浓度使用免疫测定方法测定，该方法采用典型的夹心形式与电化学发光检测。简而言之，将MSD金链霉亲和素板(MesoScale Discovery)用封闭缓冲液预润湿并拍干。将含有最终工作浓度的捕获和检测试剂的主混合溶液(35μL/孔)与稀释的标准品、质控品(QC)和样品(15μL/孔)一起添加到板中，并温育60分钟。在洗涤后，将1×MSD-T读取缓冲液添加到所有孔中。立即在MSD Sector S600成像仪上读取该板。“总”和“游离”VEGFR1 mAb的可定量范围分别定义为0.010μg/mL–2560μg/mL和0.020μg/mL–5120ug/mL，血浆样品的所需最小稀释度为10倍。为了测量“总”mAb，使用生物素化和钌标记的抗人Fc mAb(R10Z8E9)作为捕获/检测试剂。为了测量“游离”mAb，使用生物素化的重组食蟹猴VEGFR1[D1-D3]-Avi6xHis和钌标记的抗人Fc mAb(R10Z8E9)作为捕获/检测试剂。
将包含原始ECL计数的MSD输出文件扫描到Cyberlab Content Manager(Agilent)中，并导入到Watson LIMS(Thermo Scientific)回归软件中用于分析。Watson研究回归在测定鉴定期间被预先定义，并使用1/Y2加权因子的5参数逻辑(自动估计)拟合。
血浆药物浓度-时间曲线示于图5-图8中。所有四种分子在所有时间点的总浓度和游离浓度都相似。使用非房室分析估计的血浆PK参数示于表35中。一个给药间隔的终末半衰期(T1/2)、最大血浆药物浓度(Cmax)和药物血清浓度-时间曲线下面积(AUC)以大于剂量比例的方式随剂量增加。非线性PK曲线和在较低剂量下较短的半衰期表明靶标介导的药物处置(TMDD)。VGFB54、VGFB82和VGFB80在10mg/kg IV时的平均半衰期分别为约4.9天、5.7天、4.5天(基于总PK的非房室分析)。然而，由于显著的TMDD、采样时间短以及终期可能未被完全表征，应谨慎解释T1/2和清除率(CL)。还使用基于最小生理学的PK模型表征了VGFB82、VGFB54和VGFB80的猴PK谱。VGFB54、VGFB82和VGFB80的SC生物利用率分别为约83.7％、95.4％和87.7％。
表35.VEGFR1 mAb VGFB82、VGFB54、VGFB78和VGFB80在第0天单次IV给药和随后在 第14天以0.2mg/kg、3mg/kg或10mg/kg施用于食蟹猴后的平均药代动力学参数。
Cmax，最大(峰值)浓度；AUClast，截至最后一个采样点的浓度-时间曲线下面积；AUCinf，外推至无穷大的浓度-时间曲线下面积；CL，总清除率；T1/2 -，半衰期；NA，不可用
响应于施用VEGFR1 mAb的血浆PlGF
除VEGFA外，VEGFR1还与胎盘生长因子(PlGF)结合。与结合VEGFR1和VEGFR2两者的VEGFA不同，PlGF是VEGFR1的选择性配体。由于PlGF和VEGFA以相当的结合亲和力共享VEGFR1(D2-D3)上的重叠结合结构域，阻断VEGFA结合的抗VEGFR1抗体将竞争性地阻断PlGF与VEGFR1的结合，导致PlGF水平的增加。
使用逐步电化学发光测定(人PlGF V plex试剂盒，MSD K151MED-4)测定食蟹猴中包括未结合和与VEGFR1结合的总血浆PlGF水平。将包被捕获抗体的板封闭并温育1小时。将PlGF校准品(人PlGF，R&D Systems)、质控品(QC)和血浆样品用含有抗VEGFR1抗体(167μg/mL)的缓冲液以1:10稀释，该抗体与可溶性VEGFR1结合，从而减轻由VEGFR1与PlGF结合引起的信号抑制。在室温处温育至少15min后，在封闭后将混合物添加到洗涤过的MSD板中，并在4℃处温育过夜。洗涤后，添加与SulfoTag缀合的检测抗体并在室温处温育2小时。洗涤MSD板，并向所有孔中添加1×MSD-T读取缓冲液。立即在MSD Sector S600成像仪上读取该板。
将包含原始ECL计数的MSD输出文件导入到Watson LIMS(Thermo Scientific)回归软件中用于分析。Watson研究回归在测定鉴定期间被预先定义，并使用1/Y2加权因子的4参数逻辑拟合。
在IV或SC施用VEGFR1 mAb后，全身PlGF水平以剂量和PK相关的方式增加(图9-图12)。PlGF水平的增加在VGFB82和VGFB54之间是可比较的，其趋向高于VGFB80和VGFB78。
实施例5.db/db小鼠中小鼠重组抗VEGFR1导联的靶标结合生物标志物谱
为了降低人抗VEGFR1 mAb在小鼠中的免疫原性，使得能够在小鼠中进行长期给药和功效研究，生成了人抗VEGFR1抗体的小鼠重组形式，其中将人抗VEGFR1 mAb的可变区(VH/VL)移植到小鼠恒定区上，该小鼠恒定区由用于重链的沉默鼠IgG1_D265A(CH1、CH2、CH3)和用于轻链的鼠λ的恒定区组成。对照是不结合VEGFR1的相同同种型的对照抗体。
为了测量小鼠PlGF，使用小鼠PlGF-2Quantikine ELISA试剂盒(R&D SystemCatalog MP200)。根据剂量水平和时间点，用校准品稀释剂RD 5-17以1:4至1:15稀释测试血浆样品，以使读数保持在测定的线性检测范围内(测定范围为23.4pg/mL-1500pg/mL，灵敏度为1.84pg/mL)。在设定为450nm的SpectraMax读板器(Molecular Devices ModelParadigm)上读取板，并使用Pro 7.1计算小鼠血浆样品中PLGF-2的浓度。
在第0天、7天和14天以1mg/kg或10mg/kg每周重复皮下施用于db/db雌性小鼠(TheJackson laboratory，库存编号000642)中后，小鼠重组VGFB54、VGFB78和VGFB82在相同剂量水平下引发了不同水平的PlGF应答(表36和37)。在3个导联中，重组VGFB78诱导血浆PlGF最强的增加。重组VGFB82也导致PLGF的增加。然而，与VGFB78相比，VGFB82在小鼠中以显著更低的水平诱导PlGF应答(在10mg/kg时比VGFB78低约4倍)。重组VGFB54在小鼠中具有最小的TE生物标志物增加。
表36.在第0天、7天和14天将小鼠重组VGFB54和VGFB78三次SC施用于db/db小鼠(N ＝3/时间点)中后随时间变化的PlGF血浆浓度(pg/mL，平均值±SD)
表37.在第0天、7天和14天将小鼠重组VGFB82三次SC施用于db/db小鼠(N＝3/时间 点)中后随时间变化的PlGF血浆浓度(pg/mL，平均值±SD)
实施例6.在高血压单肾切除的db/db小鼠中VGFB82和VGFB78对蛋白尿减少的影响
本文命名为ReninAAV uNx db/db模型的重度进行性糖尿病性肾病小鼠模型用于评价抗VEGFR1先导mAb的功效(Harlan SM等人J Am Soc Nephrol 2018；29:477-91；HarlanSM等人Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2015；309:R467-74)。在该模型中，通过递送表达肾素的腺相关病毒诱导的持续性高血压进一步加速了单肾切除的db/db小鼠的疾病进展和肾损伤。ReninAAV uNx db/db小鼠显示严重的肾功能障碍，其特征在于尿白蛋白与肌酸酐比值(UACR)显著升高、肾小球滤过率(GFR)降低和血清肌酐增加。组织病理学特征显示了与晚期人糖尿病性肾病类似的特征，包括肾小球系膜扩张、肾小球硬化、肾小管变性以及肾小管间质炎症和纤维化。
雌性db/db小鼠在7-8周龄时进行单肾切除(来自Jackson Laboratory的Surg3041)，并在12-13周时感染表达肾素的腺相关病毒(1×1010个基因组拷贝)。六周后，基于它们的UACR、收缩压和体重，在IRINI软件上分别使用0.8、0.1、0.1的体重来将小鼠随机分组，每组9-15只动物。将血糖>300mg/dL和UACR>5000mg/g用作进入随机分组的入选标准。小鼠接受媒介物赖诺普利(Lisinopril)(10mg/kg在饮用水中)、同种型对照、低剂量或高剂量的小鼠重组VGFB82或VGFB78，以特定的给药频率皮下注射，持续4周-6周。通过在治疗前和给药后每两周将小鼠单独置于代谢笼(MMC100，Hatteras Instruments)中2小时来收集尿液样品。使用Sekisui Diagnostics微量白蛋白测定试剂盒(目录号252-20)、酶促肌酐测定试剂盒(目录号265-30)和Vet Axcel化学分析仪(Alfa Wassermann)测量尿白蛋白和肌酐的浓度。采集血浆样品用于PlGF测量。
数据呈现为平均值+/-SE。GraphPad Prism(Ver 8.0GraphPad)和双向重复测量ANOVA或/和线性混合效应模型用于治疗比较。
将3mg/kg和30mg/kg的小鼠重组VGFB82(VGFB877)每周SC(QW)给药，持续4周，随后分别每周三次(TW)30mg/kg给药且每周90mg/kg给药，再持续2周。表38显示了给药后第2周、第4周和第6周的UACR和相对于基线的变化百分比。表39显示了给药后第4周和第6周的血浆PlGF水平。媒介物治疗组在整个治疗期间显示连续且持续的UACR增加。赖诺普利，一种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEi，标准治疗)，在第4周与媒介物对照组相比，使UACR从其基线显著降低至-26％。与媒介物组比较时，用3mg/kg QW的VGFB877治疗4周的小鼠没有显示可辨别的UACR变化。在第4周，与媒介物治疗的小鼠相比，30mg/kg/QW的高剂量VGFB877部分地停止了UACR进展(VGFB877相对于基线的变化％为+15％，而媒介物为+83％)。在第6周，当剂量和给药频率从3mg/kg QW增加到30mg/kg TW时，UACR相对于基线的变化％从+63％降低到+28％。在第6周，当剂量从30mg/kg QW调整至90mg/kg QW时，UACR相对于基线的变化％从+15％降低到+6％。与改善的UACR降低一致，当VGFB82的剂量水平或频率增加时，血浆PlGF水平升高。
表38.ReninAAV uNx db/db小鼠中重组VGFB82(VGFB877)对UACR和相对于基线的 变化％的影响
表39.在ReninAAV uNx db/db小鼠中给药VGFB877后第4周和第6周的血浆PlGF水 平(pg/mL，平均值±SEM)
对于小鼠重组VGFB78(VGFB876)的功效研究，ReninAAV uNx db/db小鼠以3mg/kg和10mg/kg TW SC给药4周。表40-41显示了给药后第2周和第4周的UACR和相对于基线的百分比变化。表39显示了给药后第4周的血浆PlGF水平。与媒介物和同种型治疗的小鼠中UACR的逐渐增加相反，与对照组相比，VGFB876在第4周显著降低了UACR。3mg/kg的低剂量使UACR从基线降低了约-9％，并且10mg/kg的高剂量使UACR从基线降低了约-20％，这与ACEi相当。与显著的PD作用(UACR降低)一致，VGFB876诱导了血浆PlGF水平的强烈的、剂量相关的增加，与其对小鼠VEGFR1的高结合效力一致。
表40.ReninAAV uNx db/db小鼠中重组VGFB78(VGFB876)对UACR和相对于基线的 变化％的影响
表41.在ReninAAV uNx db/db小鼠中给药VGFB876后第4周的血浆PlGF水平(pg/ mL，平均值±SEM)
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Claims (69)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO:173或SEQ ID NO:4的氨基酸序列内的表位结合，并且其中所述抗体或其抗原结合片段阻止VEGFA与VEGFR1的结合。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与具有氨基酸序列FPLDTL(SEQ ID NO:143)或EIGL(SEQ ID NO:144)的VEGFR1上的表位结合，或与具有氨基酸序列FPLDTL(SEQ ID NO:143)和EIGL(SEQ ID NO:144)的表位结合。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人、小鼠、大鼠和/或食蟹猴VEGFR1结合。
4.根据权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人VEGFR1。
5.根据权利要求4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人VEGFR1和来自至少一种选自由食蟹猴、小鼠和大鼠组成的组的物种的VEGFR1结合。
6.根据权利要求5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人VEGFR1和来自至少两种选自由食蟹猴、小鼠和大鼠组成的组的物种的VEGFR1结合。
7.根据权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与人VEGFR1和来自食蟹猴、小鼠和大鼠的VEGFR1结合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以通过使用表面等离子共振(SPR)所确定的6×10-8M或更小，特别是1×10-8M或更小，更特别是5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD与人VEGFR1、小鼠VEGFR1和食蟹猴VEGFR1结合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:31、33、34、36、38或39的VH的重链互补决定区(HCDR)和SEQ ID NO:32、35、37或40的VL的轻链互补决定区(LCDR)。
10.根据权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR；
b.具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR；
c.具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL的LCDR；
d.具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR；
e.具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR；或
f.具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH的HCDR和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL的LCDR。
11.根据权利要求10所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含具有HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和具有LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含以下氨基酸序列：
a.分别为SEQ ID NO:7、175、9、10、11和12；
b.分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；
c.分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18；
d.分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24；
e.分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30；
f.分别为SEQ ID NO:71、176、73、74、75和76；
g.分别为SEQ ID NO:71、72、73、74、75和76；
h.分别为SEQ ID NO:77、78、79、80、81和82；
i.分别为SEQ ID NO:83、84、85、86、87和88；
j.分别为SEQ ID NO:89、90、91、92、93和94；
k.分别为SEQ ID NO:95、177、97、98、99和100
l.分别为SEQ ID NO:95、96、97、98、99和100；
m.分别为SEQ ID NO:101、102、103、104、105和106；
n.分别为SEQ ID NO:107、108、109、110、111和112；
o.分别为SEQ ID NO:113、114、115、116、117和118；
p.分别为SEQ ID NO:119、178、121、122、氨基酸序列LNS和SEQ ID NO:124；
q.分别为SEQ ID NO:119、120、121、122、氨基酸序列LNS和SEQ ID NO:124；
r.分别为SEQ ID NO:125、126、127、128、氨基酸序列FNF和SEQ ID NO:130；
s.分别为SEQ ID NO:131、132、133、134、氨基酸序列YD和SEQID NO:136；或者
t.分别为SEQ ID NO:137、138、139、140、氨基酸序列FNS和SEQ ID NO:142。
12.根据权利要求10所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含分别为SEQ ID NO:7、175、9、10、11和12的氨基酸序列。
13.根据权利要求11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18的氨基酸序列。
14.根据权利要求11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含分别为SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30的氨基酸序列。
15.根据权利要求11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的氨基酸序列。
16.根据权利要求11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域具有与SEQ ID NO:31、
33、34、36、38或39的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:32、35、37或40的氨基酸序列有至少80％
(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，所述VH和所述VL包含以下氨基酸序列：
a.分别为SEQ ID NO:31和32；
b.分别为SEQ ID NO:33和32；
c.分别为SEQ ID NO:34和35；
d.分别为SEQ ID NO:36和37；
e.分别为SEQ ID NO:38和37；或者
f.分别为SEQ ID NO:39和40。
19.根据权利要求18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:40的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
20.根据权利要求19所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH
和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL。
21.根据权利要求18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
22.根据权利要求21所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH
和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
23.根据权利要求18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:37的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
24.根据权利要求23所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH
和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL。
25.根据权利要求18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:32的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
26.根据权利要求25所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH
和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
27.根据权利要求18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:37的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
28.根据权利要求27所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH
和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL。
29.根据权利要求18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:35的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
30.根据权利要求29所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH
和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链(HC)和轻链(LC)，所述重链具有与SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ
ID NO:57或SEQ ID NO:60的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)同一性的氨基酸序列。
32.根据权利要求31所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：
SEQ ID NO:51、52、53、54、55、56、57、59和60。
33.根据权利要求32所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含
a.包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；
b.包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；
c.包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；
d.包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；
e.包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC；或
f.包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列的LC。
34.根据权利要求33所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:51的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC。
35.根据权利要求33所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:53的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC。
36.根据权利要求33所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:54的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LC。
37.根据权利要求33所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:56的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC。
38.根据权利要求33所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:58的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC。
39.根据权利要求33所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含含有SEQID NO:59的氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC。
40.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH的HCDR和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR；
b.包含分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC。
41.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH的HCDR和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL的LCDR；
b.包含分别具有SEQ ID NO:13、14和15的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC；以及具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LC。
42.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH的HCDR的重链可变区(VH)和具有包含SEQID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR的轻链可变区(VL)；
b.包含分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC。
43.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH的HCDR的重链可变区(VH)和具有包含SEQID NO:40的氨基酸序列的VL的LCDR的轻链可变区(VL)；
b.包含分别具有SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:28、29和30的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC。
44.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH的HCDR的重链可变区(VH)和具有包含SEQID NO:32的氨基酸序列的VL的LCDR的轻链可变区(VL)；
b.包含分别具有SEQ ID NO:7、175和9的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LC。
45.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a.具有包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH的HCDR的重链可变区(VH)和具有包含SEQID NO:37的氨基酸序列的VL的LCDR的轻链可变区(VL)；
b.包含分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和包含分别具有SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL；
c.具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL；和/或
d.具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的分离的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab’)2、Fd、dAb、VHH或单链抗体。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
48.根据权利要求47所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型。
49.根据权利要求48所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含Ig恒定区或所述Ig恒定区的片段。
50.根据权利要求49所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段包含导致所述抗体或其抗原结合片段与Fcγ受体(FcγR)的结合减少的至少一个突变。
51.根据权利要求50所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中导致所述抗体或其抗原结合片段与FcγR的结合减少的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S，其中根据EU索引进行残基编号。
52.根据权利要求51所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述Ig恒定区或所述恒定区的所述片段包含L234A_L235A_D265S的突变。
53.根据权利要求52所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述FcγR是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII，或它们的任何组合。
54.根据权利要求53所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段还包含调节所述抗体或其抗原结合片段的半衰期的至少一个突变。
55.根据权利要求54所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中调节所述抗体或其抗原结合片段的所述半衰期的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中根据EU索引进行残基编号。
56.一种免疫缀合物，包含缀合至治疗剂或显像剂的根据权利要求1至55中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
57.一种药物组合物，包含根据权利要求1至55中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求56所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载剂。
58.一种分离的多核苷酸，编码根据权利要求1至55中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
59.根据权利要求58所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70的多核苷酸序列有至少80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。
60.一种载体，包含根据权利要求58或59所述的多核苷酸。
61.一种宿主细胞，表达根据权利要求1至55中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，诸如包含根据权利要求60所述的载体的宿主细胞。
62.一种阻止有需要的受试者中VEGFA与VEGFR1结合的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至55中任一项所述的分离的抗体或其抗原片段、根据权利要求56所述的免疫缀合物、根据权利要求57所述的药物组合物、根据权利要求58或59所述的分离的多核苷酸、根据权利要求60所述的载体或根据权利要求61所述的宿主细胞，从而阻止VEGFA与所述VEGFR1的结合。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述受试者需要治疗慢性肾病(CKD)，需要减少蛋白尿，患有晚期4期或5期慢性肾病，或者患有伴有蛋白尿、白蛋白尿或糖尿病的CKD。
64.一种治疗有需要的受试者的慢性肾病(CKD)的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至55中任一项所述的分离的抗体或其抗原片段、根据权利要求56所述的免疫缀合物、根据权利要求57所述的药物组合物、根据权利要求58或59所述的分离的多核苷酸、根据权利要求60所述的载体或根据权利要求61所述的宿主细胞，持续足以治疗所述CKD的时间。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述受试者患有晚期4期或5期慢性肾病。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述受试者患有3期慢性肾病。
67.根据权利要求64所述的方法，其中所述受试者患有伴有蛋白尿、白蛋白尿或糖尿病的CKD。
68.一种减少有需要的受试者的蛋白尿的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至55中任一项所述的分离的抗体或其抗原片段、根据权利要求56所述的免疫缀合物、根据权利要求57所述的药物组合物、根据权利要求58或59所述的分离的多核苷酸、根据权利要求60所述的载体或根据权利要求59所述的宿主细胞，持续足以减少所述受试者的蛋白尿的时间。
69.一种试剂盒，包含根据权利要求1至55中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求56所述的免疫缀合物、根据权利要求57所述的药物组合物、根据权利要求58或59所述的分离的多核苷酸、根据权利要求60所述的载体或根据权利要求61所述的宿主细胞。
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