JP2022537758A - キナゾリン系化合物の結晶体、塩およびその調製方法 - Google Patents
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Classifications
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- C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
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Abstract
本発明は、Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤としての化合物の結晶体、塩およびその調製方法に関し、さらに、固形腫瘍を治療するための医薬品の調製におけるその使用に関する。【選択図】図１
Description
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１９年０６月１９日に出願された、出願番号がＣＮ２０１９１０５３３２４０．０である特許出願の優先権を主張する。
本出願は、２０１９年０６月１９日に出願された、出願番号がＣＮ２０１９１０５３３２４０．０である特許出願の優先権を主張する。
本発明は、Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤としての化合物の結晶体、塩およびその調製方法に関し、さらに、固形腫瘍を治療するための医薬品の調製におけるその使用に関する。
ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ、ＥＧＦＲ）は、プロテインチロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、様々なヒト組織の細胞膜に広く分布しており、細胞の増殖、成長、転移およびアポトーシスを調節することができる。その構造は、細胞外のリガンド結合領域、膜貫通領域、および細胞内のチロシンキナーゼ領域の３つの部分からなる。受容体の構造に応じて、ＨＥＲは、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ－１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ－２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ－３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ－４）の４つのアイソフォームに分けることができる。研究によると、ＨＥＲは、乳癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌、悪性神経膠腫および前立腺癌などのさまざまな腫瘍細胞で過剰に発現され、または異常に活性化されることが明らかになった。さらに、研究によると、ＨＥＲの過剰発現または異常な活性化は、腫瘍の分化の程度、悪性度およびその予後と密接に関連していることが明らかになった（Ｂａｓｅｌｇａ．Ｊ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ２００２，７，２－８）。したがって、抗腫瘍薬の研究においてＨＥＲの阻害は注目されている。
現在、市販されている標的ＨＥＲ阻害剤としては、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）などが挙げられる。しかし、これらの市販の医薬品は、有効奏効率が低く、薬剤耐性が生じやすく、毒性および副作用があるため、優れた抗腫瘍効果を有し、薬剤耐性を克服することができ、且つ忍容性が良好な他の抗腫瘍薬の開発が期待されている。
Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼの不可逆的阻害剤は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４を同時に阻害する。研究によると、ＨＥＲファミリー受容体へのこの不可逆的な阻害は、医薬品の活性を高めるだけでなく、薬剤耐性の発生を減らすことができ、同時に、エルロチニブに耐性のあるＨ１９７５細胞株のような薬剤耐性のある腫瘍細胞株の一部に対しても優れた阻害効果を示すことが明らかになった。現在、市販されているＰａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼの不可逆的阻害剤は、アファチニブ（Ａｆａｔｉｎｉｂ）とネラチニブ（Ｎｅｒａｔｉｎｉｂ）のみである。さらに、例えは、ポジオチニブ（Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂ）、ダコミチニブ（Ｄａｃｏｍｉｔｉｎｉｂ）、カネルチニブ（Ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ）などの多くの阻害剤は臨床研究の段階にあり、市場の需要はまだ満たされていない。
したがって、癌の治療のためのＰａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼの不可逆的阻害剤をさらに開発することが必要である。
したがって、癌の治療のためのＰａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼの不可逆的阻害剤をさらに開発することが必要である。
Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂ（対照化合物１）は、ＷＯ２００８１５０１１８で開発された、以下の構造を持つｐａｎ－ＨＥＲ阻害剤である。
特許出願ＷＯ２０１５０４３５１５は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２に対して阻害効果を有し、以下の構造を持つ対照化合物２を開示している。
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、１７．４±０．２°、２０．８±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａを提供する。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ａは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、１４．６±０．２°、１５．２±０．２°、１７．４±０．２°、１９．０±０．２°、２０．８±０．２°、２２．１±０．２°、２４．１±０．２°、２９．５±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ａは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、１２．０±０．２°、１２．７±０．２°、１４．６±０．２°、１５．２±０．２°、１５．９±０．２°、１７．４±０．２°、１９．０±０．２°、２０．８±０．２°、２２．１±０．２°、２４．１±０．２°、２９．５±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ａは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３°、３．７°、６．９°、１１．２°、１２．０°、１２．７°、１４．６°、１５．２°、１５．９°、１６．９°、１７．４°、１７．９°、１８．５°、１９．０°、１９．４°、２０．１°、２０．４°、２０．８°、２２．１°、２２．４°、２３．５°、２４．１°、２４．４°、２５．４°、２５．８°、２６．６°、２７．１°、２８．３°、２９．０°、２９．５°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＡのＸＲＰＤパターンは、図１に示すとおりである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＡのＸＲＰＤパターンの解析データは、表１に示すとおりである。
本発明は、式（ＩＩ）で表される化合物を提供する。
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、８．０±０．２°、１１．４±０．２°、１８．７±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを提供する。
本発明の一部の実施形態において、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂは、Ｘ線粉末回折パターンが、１２．７±０．２°、１８．７±０．２°、２４．８±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｂは、Ｘ線粉末回折パターンが、８．０±０．２°、１１．４±０．２°、１２．７±０．２°、１５．０±０．２°、１６．１±０．２°、１８．７±０．２°、２０．０±０．２°、２０．７±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｂは、Ｘ線粉末回折パターンが、１１．４±０．２°、１２．７±０．２°、１６．１±０．２°、１８．７±０．２°、２０．０±０．２°、２２．４±０．２°、２３．１±０．２°、２４．８±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｂは、Ｘ線粉末回折パターンが、８．０±０．２°、１１．４±０．２°、１２．７±０．２°、１５．０±０．２°、１６．１±０．２°、１８．７±０．２°、２０．０±０．２°、２０．７±０．２°、２２．４±０．２°、２３．１±０．２°、２４．８±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｂは、Ｘ線粉末回折パターンが、６．８２５°、８．０４１°、１１．４１２°、１２．７２°、１３．４５４°、１５．００７°、１６．０６７°、１６．８１７°、１７．４０２°、１８．００９°、１８．６９１°、２０．０１２°、２０．７４８°、２１．２６５°、２２．０３°、２２．３８３°、２２．７７９°、２３．０７５°、２３．６４８°、２４．４７５°、２４．７７°、２５．５９３°、２５．９１４°、２６．２４８°、２７．０７６°、２７．５２７°、２８．５５７°、２８．９８７°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＢのＸＲＰＤパターンは、図２に示すとおりである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＢのＸＲＰＤパターンの解析データは、表２に示すとおりである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｂは、示差走査熱量測定曲線が２０７．４±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＢのＤＳＣパターンは、図３に示すとおりである。
本発明は、式（ＩＩＩ）で表される化合物を提供する。
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、７．６±０．２°、８．５±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃを提供する。
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、１３．８±０．２°、１７．７±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃを提供する。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｃは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、７．６±０．２°、８．５±０．２°、１１．３±０．２°、１３．８±０．２°、１５．２±０．２°、１７．７±０．２°、１８．３±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｃは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、７．６±０．２°、１１．３±０．２°、１３．８±０．２°、１５．２±０．２°、１７．７±０．２°、２３．７±０．２°、２４．９±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｃは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、７．６±０．２°、８．５±０．２°、１１．３±０．２°、１３．８±０．２°、１５．２±０．２°、１７．７±０．２°、１８．３±０．２°、２３．７±０．２°、２４．１±０．２°、２４．９±０．２°、２６．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｃは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、７．６±０．２°、８．５±０．２°、１１．３±０．２°、１３．８±０．２°、１５．２±０．２°、１７．７±０．２°、１８．３±０．２°、２２．６±０．２°、２３．７±０．２°、２４．９±０．２°、２６．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｃは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３１５°、３．６２１°、７．６５１°、８．５２８°、１０．８９８°、１１．３°、１３．０８１°、１３．４７２°、１３．７６７°、１５．２４７°、１５．９３°、１６．４７°、１７．１０３°、１７．７３３°、１８．３２２°、１８．７５９°、１９．１７３°、１９．３６９°、２０．１２３°、２０．５３２°、２１．１４６°、２１．９１４°、２２．６２９°、２２．８４１°、２３．７０９°、２４．１２７°、２４．９３８°、２５．５８１°、２６．２２１°、２６．５８８°、２７．００５°、２７．６５８°、２８．１０９°、２８．５０８°、２９°、２９．２８９°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＣのＸＲＰＤパターンは、図４に示すとおりである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＣのＸＲＰＤパターンの解析データは、表３に示すとおりである。
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、３．５±０．２°、９．５±０．２°、１０．５±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｄを提供する。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｄは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．５±０．２°、９．５±０．２°、１０．５±０．２°、１４．０±０．２°、１６．３±０．２°、１８．７±０．２°、１９．０±０．２°、２３．４±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｄは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．５±０．２°、９．５±０．２°、１０．５±０．２°、１４．０±０．２°、１６．３±０．２°、１８．７±０．２°、２３．４±０．２°、２５．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｄは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．５０２°、９．５０５°、１０．５０９°、１２．１６６°、１２．４４６°、１４．００８°、１５．３８５°、１５．６８４°、１６．２７５°、１７．４９５°、１８．６８１°、１９．０１６°、１９．４０４°、２０．３５６°、２０．９５４°、２１．８０２°、２２．４８９°、２３．０１９°、２３．４５７°、２４．２４５°、２４．９７７°、２５．５８３°、２６．２５３°、２６．６８８°、２７．３５９°、２８．４２５°、２８．７６２°、２９．８２１°、３１．５８１°、３２．４１１°、３２．９０７°、３３．１５５°、３４．５７９°、３６．３１５°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＤのＸＲＰＤパターンは、図５に示すとおりである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＤのＸＲＰＤパターンの解析データは、表４に示すとおりである。
本発明は、式（ＩＶ）で表される化合物を提供する。
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、１２．８±０．２°、１３．２±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｅを提供する。
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、１６．２±０．２°、２３．２±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｅを提供する。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｅは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、１２．８±０．２°、１３．２±０．２°、１４．９±０．２°、１６．２±０．２°、１８．７±０．２°、２３．２±０．２°、２４．８±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｅは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、８．１±０．２°、１３．２±０．２°、１４．９±０．２°、１６．２±０．２°、１８．７±０．２°、２３．２±０．２°、２４．８±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｅは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．３０５°、３．６０１°、８．０８８°、１１．２８°、１２．７６２°、１３．１７７°、１４．２０６°、１４．８７５°、１６．２５６°、１７．２６４°、１８．６６１°、１９．９９３°、２１．３９７°、２１．９３４°、２３．１９６°、２４．７５５°、２５．２０９°、２７．３８１°、２８．７６°、３０．８０２°、３２．９６°、３３．３２５°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＥのＸＲＰＤパターンは、図６に示すとおりである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＥのＸＲＰＤパターンの解析データは、表５に示すとおりである。
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、３．６±０．２°、７．５±０．２°、１６．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｆを提供する。
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、３．６±０．２°、１２．２±０．２°、１６．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｆを提供する。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｆは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．６±０．２°、７．５±０．２°、１２．２±０．２°、１５．１±０．２°、１６．６±０．２°、２３．６±０．２°、２４．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体Ｆは、Ｘ線粉末回折パターンが、３．６２°、６．９８１°、７．５０１°、１０．８９６°、１１．１８°、１２．１９８°、１３．７３４°、１４．７８９°、１５．１１１°、１６．６１１°、１８．１４６°、１９．５８６°、２０．１０４°、２０．３７５°、２０．９２４°、２１．０８４°、２１．５３７°、２２．１１１°、２２．６１４°、２３．６３８°、２４．６１４°、２５．０７７°の２θ角に特徴的回折ピークを有するものである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＦのＸＲＰＤパターンは、図７に示すとおりである。
本発明の一部の実施形態において、前記の結晶体ＦのＸＲＰＤパターンの解析データは、表６に示すとおりである。
本発明は、
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に溶解させること；
（２）加熱しながら攪拌し、冷却し、濾過し、乾燥させ、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａを得ること；
を含む、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａの製造方法を提供する。
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に溶解させること；
（２）加熱しながら攪拌し、冷却し、濾過し、乾燥させ、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａを得ること；
を含む、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａの製造方法を提供する。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ａの製造方法において、前記溶媒は、メタノール、エタノールおよび酢酸エチルから選択される。
本発明は、
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に溶解させること；
（２）マレイン酸を加え、攪拌し、濾過し、乾燥させ、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを得ること；
を含む、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂの製造方法を提供する。
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に溶解させること；
（２）マレイン酸を加え、攪拌し、濾過し、乾燥させ、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを得ること；
を含む、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂの製造方法を提供する。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｂの製造方法において、前記溶媒はテトラヒドロフランである。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｂの製造方法において、攪拌温度は３５℃～４５℃である。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｂの製造方法において、攪拌時間は２４時間～４８時間である。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｂの製造方法において、化合物と溶媒との重量－体積比は１ｇ：１０～５０ｍＬである。
本発明は、
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に溶解させること；
（２）加熱し、マレイン酸を加え、攪拌し、固体を析出させ、冷却し、濾過し、乾燥させ、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを得ること；
を含む、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂの別の製造方法を提供する。
（１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に溶解させること；
（２）加熱し、マレイン酸を加え、攪拌し、固体を析出させ、冷却し、濾過し、乾燥させ、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを得ること；
を含む、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂの別の製造方法を提供する。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｂの製造方法において、前記溶媒は、エタノール、酢酸エチルから選択される。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｂの製造方法において、攪拌温度は６５℃～７５℃である。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｂの製造方法において、攪拌時間は１６時間～２４時間である。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｂの製造方法において、化合物と溶媒との重量－体積比は１ｇ：６～１０ｍＬである。
本発明は、
（１）式（Ｉ）で表される化合物およびその塩酸塩を溶媒に加えて懸濁液を得ること；
（２）加熱し、攪拌し、遠心分離し、乾燥させ、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃを得ること；
を含む、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃの製造方法を提供する。
（１）式（Ｉ）で表される化合物およびその塩酸塩を溶媒に加えて懸濁液を得ること；
（２）加熱し、攪拌し、遠心分離し、乾燥させ、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃを得ること；
を含む、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃの製造方法を提供する。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｃの製造方法において、前記溶媒はアセトニトリルである。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｃの製造方法において、攪拌温度は３５℃～４５℃である。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｃの製造方法において、攪拌時間は２４時間～４８時間である。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｃの製造方法において、化合物と溶媒との重量－体積比は１ｇ：７～１０ｍＬである。
本発明は、
（１）式（Ｉ）で表される化合物およびその塩酸塩を溶媒に加えて懸濁液を得ること；
（２）加熱し、攪拌し、遠心分離し、乾燥させ、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｄを得ること；
を含む、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｄの製造方法を提供する。
（１）式（Ｉ）で表される化合物およびその塩酸塩を溶媒に加えて懸濁液を得ること；
（２）加熱し、攪拌し、遠心分離し、乾燥させ、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｄを得ること；
を含む、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｄの製造方法を提供する。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｄの製造方法において、前記溶媒は、酢酸エチル、アセトニトリル－水（１：１）およびメタノール－水（１：１）から選択される。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｄの製造方法において、攪拌温度は３５℃～４５℃である。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｄの製造方法において、攪拌時間は２４時間～４８時間である。
本発明の一部の実施形態では、上記の結晶体Ｄの製造方法において、化合物と溶媒との重量－体積比は１ｇ：７～１０ｍＬである。
また、本発明は、Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤に関連する疾患を治療するための医薬品の調製における前記の結晶体の使用を提供する。
さらに、本発明は、Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤に関連する疾患を治療するための医薬品の調製における上記の化合物または結晶体の使用を提供する。
本発明の一部の実施形態では、前記Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤に関する医薬品が腫瘍に用いられる医薬品であることを特徴とする上記の使用を提供する。
定義と説明
特に断らない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有する。特定の用語や語句は、特定の定義がなければ、不明瞭または不明確であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に商品名が記載されている場合、対応する商品またはその有効成分を指すものである。
特に断らない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有する。特定の用語や語句は、特定の定義がなければ、不明瞭または不明確であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に商品名が記載されている場合、対応する商品またはその有効成分を指すものである。
本発明の中間化合物は、以下に列挙される特定の実施形態、それらを他の化学合成方法と組み合わせることにより形成される実施形態、および当業者に周知の同等の代替方法を含む、当業者に周知の様々な合成方法によって調製することができる。好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。
本明細書に開示される特定の実施形態における化学反応は、本発明の化学変化および必要とされる試薬や材料に適する適切な溶媒中で行う。本発明の化合物を得るために、当業者が、既存の実施形態に基づいて合成工程または反応スキームを変更または選択する必要がある場合がある。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
本発明で使用されるすべての溶媒は市販されるものであり、さらに精製することなく使用される。
本発明で使用される溶媒は市販品である。本発明は以下の略語を使用する。ＤＣＭはジクロロメタンを表し；ＤＭＦはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを表し；ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表し；ＥtＯＨはエタノールを表し；ＭｅＯＨはメタノールを表し；ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表し；ＡＴＰはアデノシン三リン酸を表し；ＨＥＰＥＳは４－ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸を表し；ＭｇＣｌ２はを二塩化マグネシウムを表す。
本発明化合物の結晶体は、安定性が良く、ドラッガビリティが優れている。本発明化合物は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４に対して顕著な阻害活性を示し、また、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＯＥ２１およびＯＥ１９細胞の増殖に対しても顕著な阻害活性を示す。本発明化合物は、優れた薬物動態特性を有する。本発明化合物は、腫瘍増殖に対して顕著な阻害効果を有し、有効用量でマウスの体重に大きな影響を与えず、より良好な安全性を有する。
１．１． 粉末Ｘ線回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ，ＸＲＰＤ）
機器モデル：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ ａｄｖａｎｃｅ Ｘ線回折計
測定方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ分析に使用した。
詳細なＸＲＰＤパラメータは以下の通りである。
ライトチューブ：Ｃｕ、Ｃｕ：ｋα、（λ＝１．５４１７９Å）
ライトチューブ電圧：４０ｋＶ、ライトチューブ電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲（２θ角）：３または４～４０ｄｅｇ
スキャン速度：１０ｄｅｇ／ｍｉｎ
サンプルディスクの回転数：１５ｒｐｍ／０ｒｐｍ
機器モデル：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ ａｄｖａｎｃｅ Ｘ線回折計
測定方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ分析に使用した。
詳細なＸＲＰＤパラメータは以下の通りである。
ライトチューブ：Ｃｕ、Ｃｕ：ｋα、（λ＝１．５４１７９Å）
ライトチューブ電圧：４０ｋＶ、ライトチューブ電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲（２θ角）：３または４～４０ｄｅｇ
スキャン速度：１０ｄｅｇ／ｍｉｎ
サンプルディスクの回転数：１５ｒｐｍ／０ｒｐｍ
１．２． 示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ，ＤＳＣ）
機器モデル：ＴＡ Ｑ２０００示差走査熱量計
試験方法：サンプル（０．５～１ｍｇ）を採取し、ＤＳＣアルミニウムポットに入れ、２５ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件下、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で３０℃から３００℃までサンプルを加熱して試験を行った。
機器モデル：ＴＡ Ｑ２０００示差走査熱量計
試験方法：サンプル（０．５～１ｍｇ）を採取し、ＤＳＣアルミニウムポットに入れ、２５ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件下、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で３０℃から３００℃までサンプルを加熱して試験を行った。
１．３ 高速液体クロマトグラフィー方法
サンプル濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ
固体安定性試験におけるＨＰＬＣ法の条件を以下の表７に示す。
サンプル濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ
固体安定性試験におけるＨＰＬＣ法の条件を以下の表７に示す。
以下、本発明の内容をよりよく理解するために、特定の実施例によって本発明をさらに説明するが、これらの特定の実施形態は、本発明の内容を限定するものではない。
実施例１：式（Ｉ）で表される化合物の製造
合成経路：
工程１：
化合物１－１（９００．０ｍｇ，３．９３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（１．０９ｇ，７．８５ｍｍｏｌ）および化合物Ｑ－１（１．６０ｇ，７．０７ｍｍｏｌ）を加え、反応液を７５℃で１６時間攪拌した。反応液を２０℃に冷却し、水（３０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出し、有機相を合わせ、水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ×２）で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：石油エーテル＝１：３）により精製して、化合物１－２を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．４２（ｓ，１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１０－４．４０（ｍ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．７５－３．８０（ｍ，１Ｈ），１．９０－２．１０（ｍ，４Ｈ），１．５０－１．７０（ｍ，４Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝４５８．１［Ｍ＋Ｎａ］＋。
化合物１－１（９００．０ｍｇ，３．９３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（１．０９ｇ，７．８５ｍｍｏｌ）および化合物Ｑ－１（１．６０ｇ，７．０７ｍｍｏｌ）を加え、反応液を７５℃で１６時間攪拌した。反応液を２０℃に冷却し、水（３０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出し、有機相を合わせ、水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ×２）で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：石油エーテル＝１：３）により精製して、化合物１－２を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．４２（ｓ，１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１０－４．４０（ｍ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．７５－３．８０（ｍ，１Ｈ），１．９０－２．１０（ｍ，４Ｈ），１．５０－１．７０（ｍ，４Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝４５８．１［Ｍ＋Ｎａ］＋。
工程２：
化合物１－２（１．５０ｇ，３．４４ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍＬ）に溶解させ、湿ったパラジウム／炭素（１０％，５０．０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、２０℃で反応液を０．５時間攪拌した。反応液を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、乾燥させ、化合物１－３を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．０９（ｓ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．３６ （ｂｒｓ， ２Ｈ），４．１５－４．４０（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．６５－３．８０（ｍ，１Ｈ），１．９５－２．１５（ｍ，４Ｈ），１．９０－１．８５（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），１．３０－１．４５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ： ｍ／ｚ＝４０６．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物１－２（１．５０ｇ，３．４４ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍＬ）に溶解させ、湿ったパラジウム／炭素（１０％，５０．０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、２０℃で反応液を０．５時間攪拌した。反応液を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、乾燥させ、化合物１－３を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ７．０９（ｓ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．３６ （ｂｒｓ， ２Ｈ），４．１５－４．４０（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．６５－３．８０（ｍ，１Ｈ），１．９５－２．１５（ｍ，４Ｈ），１．９０－１．８５（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），１．３０－１．４５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ： ｍ／ｚ＝４０６．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程３：
化合物１－３（１．３０ｇ，３．２１ｍｍｏｌ）および酢酸アンモニウム（２．４７ｇ，３２．０６ｍｍｏｌ）をオルトギ酸トリメチル（３１．２９ｇ，２９４．８９ｍｍｏｌ）に加え、７０℃で反応液を１０時間攪拌した。２０℃まで冷却し、反応液を減圧下で濃縮した。残留物に水（１０ｍＬ）を添加してスラリー化し、濾過し、固体を乾燥させた後、化合物１－４を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８３（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），５．１７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１０－４．２０（ｍ，２Ｈ），３．９５－４．００（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），１．９０－２．００（ｍ，４Ｈ），１．７５－１．９０（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．６０（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０１．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物１－３（１．３０ｇ，３．２１ｍｍｏｌ）および酢酸アンモニウム（２．４７ｇ，３２．０６ｍｍｏｌ）をオルトギ酸トリメチル（３１．２９ｇ，２９４．８９ｍｍｏｌ）に加え、７０℃で反応液を１０時間攪拌した。２０℃まで冷却し、反応液を減圧下で濃縮した。残留物に水（１０ｍＬ）を添加してスラリー化し、濾過し、固体を乾燥させた後、化合物１－４を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８３（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），５．１７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１０－４．２０（ｍ，２Ｈ），３．９５－４．００（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），１．９０－２．００（ｍ，４Ｈ），１．７５－１．９０（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．６０（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０１．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程４：
化合物１－４（１．２０ｇ，３．００ｍｍｏｌ）を塩化水素のジオキサン溶液（４Ｎ，１０ｍＬ）に加え、０℃で反応液を０．４時間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮して、化合物１－５の塩酸塩を得た。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０１．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物１－４（１．２０ｇ，３．００ｍｍｏｌ）を塩化水素のジオキサン溶液（４Ｎ，１０ｍＬ）に加え、０℃で反応液を０．４時間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮して、化合物１－５の塩酸塩を得た。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０１．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程５：
０℃で、１－５の塩酸塩（１．１０ｇ，３．２７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．６ｍＬ，３２．６６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸無水物（１．３７ｇ，６．５３ｍｍｏｌ）を滴下し、２０℃で反応液を１時間攪拌した。減圧下で濃縮し、残留物に水（４０ｍＬ）を添加してスラリー化させ、濾過し、固体を乾燥させて、化合物１－６を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ １１．９０（ｓ，１Ｈ），７．８０－７．９０（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｍ，１Ｈ），７．００（ｍ，１Ｈ），５．２８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．６０－４．７０（ｍ，１Ｈ），４．４０－４．５０（ｍ，１Ｈ），４．００－４．１０（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），１．９０－２．２０（ｍ，６Ｈ），１．５５－１．７５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝３９７．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
０℃で、１－５の塩酸塩（１．１０ｇ，３．２７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．６ｍＬ，３２．６６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸無水物（１．３７ｇ，６．５３ｍｍｏｌ）を滴下し、２０℃で反応液を１時間攪拌した。減圧下で濃縮し、残留物に水（４０ｍＬ）を添加してスラリー化させ、濾過し、固体を乾燥させて、化合物１－６を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ １１．９０（ｓ，１Ｈ），７．８０－７．９０（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｍ，１Ｈ），７．００（ｍ，１Ｈ），５．２８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．６０－４．７０（ｍ，１Ｈ），４．４０－４．５０（ｍ，１Ｈ），４．００－４．１０（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），１．９０－２．２０（ｍ，６Ｈ），１．５５－１．７５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝３９７．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程６：
化合物１－６（５００．０ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を塩化ホスホリル（２４．１ｍＬ，２６０．２２ｍｍｏｌ）に溶解させ、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（９２．２ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で反応液を５時間攪拌した。減圧下で濃縮し、残留物に３，４－ジクロロ－２－フルオロアニリン（３４０．６ｍｇ，１．８９ｍｍｏｌ）のイソプロパノール（５ｍＬ）溶液を加え、９０℃で反応液を１時間攪拌した。反応液を２０℃に冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（１０ｍＬ×２）で抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：石油エーテル＝２：１）により精製して、化合物１－７を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．５０－８．６５（ｍ，２Ｈ），７．４０－７．５０（ｍ，１Ｈ），７．１５－７．２５（ｍ，２Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），４．７５－４．８５（ｍ，１Ｈ），４．５５－４．６５（ｍ，２Ｈ），４．０５－４．１０（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），２．１０－２．４０（ｍ，４Ｈ），１．９０－２．００（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．７５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝５５７．９［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物１－６（５００．０ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を塩化ホスホリル（２４．１ｍＬ，２６０．２２ｍｍｏｌ）に溶解させ、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（９２．２ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で反応液を５時間攪拌した。減圧下で濃縮し、残留物に３，４－ジクロロ－２－フルオロアニリン（３４０．６ｍｇ，１．８９ｍｍｏｌ）のイソプロパノール（５ｍＬ）溶液を加え、９０℃で反応液を１時間攪拌した。反応液を２０℃に冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（１０ｍＬ×２）で抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：石油エーテル＝２：１）により精製して、化合物１－７を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．５０－８．６５（ｍ，２Ｈ），７．４０－７．５０（ｍ，１Ｈ），７．１５－７．２５（ｍ，２Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），４．７５－４．８５（ｍ，１Ｈ），４．５５－４．６５（ｍ，２Ｈ），４．０５－４．１０（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），２．１０－２．４０（ｍ，４Ｈ），１．９０－２．００（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．７５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝５５７．９［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程７：
化合物１－７（３０５．０ｍｇ，５４７．２μｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（３７８．２ｍｇ，２．７４ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で反応液を１４時間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮し、残留物を分取用シリカゲルプレート（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）により精製して、化合物１－８を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ９．４５（ｓ，１Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｓ，１Ｈ），７．１４（ｓ，１Ｈ），５．１７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０５－４．１０（ｍ，２Ｈ），３．９８－４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ），２．１５－２．３０（ｍ，４Ｈ），１．９５－２．１０（ｍ，２Ｈ），１．７０－１．８０（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝４６２．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物１－７（３０５．０ｍｇ，５４７．２μｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（３７８．２ｍｇ，２．７４ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で反応液を１４時間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮し、残留物を分取用シリカゲルプレート（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）により精製して、化合物１－８を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ９．４５（ｓ，１Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｓ，１Ｈ），７．１４（ｓ，１Ｈ），５．１７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０５－４．１０（ｍ，２Ｈ），３．９８－４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ），２．１５－２．３０（ｍ，４Ｈ），１．９５－２．１０（ｍ，２Ｈ），１．７０－１．８０（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝４６２．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程８：
０℃で、化合物１－８（２２０．０ｍｇ，４７５．８μｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（６ｍＬ）と水（６ｍＬ）との混合溶媒に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（１１９．９ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）を加え、塩化アクリロイル（３８．８ｍｇ，４２８．３μｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。０℃で反応液をさらに０．５時間攪拌し、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）でクエンチし、減圧下で濃縮し、残留物を分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）により精製して、式（Ｉ）で表される化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ９．３５（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｓ，１Ｈ），７．０６（ｓ，１Ｈ），６．７２（ｄｄ，Ｊ１＝１６．８Ｈｚ，Ｊ２ ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），６．１８（ｄｄ，Ｊ１＝１６．８Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｄｄ，Ｊ１＝１０．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．３５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５０－４．６０（ｍ，２Ｈ），４．０５－４．１５（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），１．８５－２．２０（ｍ，６Ｈ），１．６０－１．７０（ｍ，１Ｈ），１．５０－１．６０（ｍ，１Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝５３８．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
０℃で、化合物１－８（２２０．０ｍｇ，４７５．８μｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（６ｍＬ）と水（６ｍＬ）との混合溶媒に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（１１９．９ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）を加え、塩化アクリロイル（３８．８ｍｇ，４２８．３μｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。０℃で反応液をさらに０．５時間攪拌し、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）でクエンチし、減圧下で濃縮し、残留物を分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）により精製して、式（Ｉ）で表される化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ９．３５（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｓ，１Ｈ），７．０６（ｓ，１Ｈ），６．７２（ｄｄ，Ｊ１＝１６．８Ｈｚ，Ｊ２ ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），６．１８（ｄｄ，Ｊ１＝１６．８Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｄｄ，Ｊ１＝１０．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．３５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５０－４．６０（ｍ，２Ｈ），４．０５－４．１５（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），１．８５－２．２０（ｍ，６Ｈ），１．６０－１．７０（ｍ，１Ｈ），１．５０－１．６０（ｍ，１Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝５３８．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
実施例２：
式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａの製造
式（Ｉ）で表される化合物（５０ｇ）をメタノールと酢酸エチルとの混合溶液（ｖ：ｖ＝５０ｍＬ：２５０ｍＬ）に加え、得られた懸濁液を８０℃～９０℃で加熱しながら攪拌し、ゆっくりと冷却し、濾過し、固体を減圧下で乾燥させて、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａを得た。
式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａの製造
式（Ｉ）で表される化合物（５０ｇ）をメタノールと酢酸エチルとの混合溶液（ｖ：ｖ＝５０ｍＬ：２５０ｍＬ）に加え、得られた懸濁液を８０℃～９０℃で加熱しながら攪拌し、ゆっくりと冷却し、濾過し、固体を減圧下で乾燥させて、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａを得た。
式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂの製造
式（Ｉ）で表される化合物（４０．９ｇ）をエタノール中（３２０ｍＬ）に溶解させ、混合物を７０℃まで加熱し、攪拌しながらマレイン酸（９．４ｇ）のエタノール溶液（８０ｍＬ）を加えた。反応液が透明になった後、固体が析出した。７０℃で混合物を０．５時間攪拌し、酢酸エチル（４００ｍＬ）を添加し、７０℃で混合物をさらに１６時間攪拌した。室温に冷却し、濾過し、フィルターケーキを集め、減圧下で乾燥させて、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを得た。
式（Ｉ）で表される化合物（４０．９ｇ）をエタノール中（３２０ｍＬ）に溶解させ、混合物を７０℃まで加熱し、攪拌しながらマレイン酸（９．４ｇ）のエタノール溶液（８０ｍＬ）を加えた。反応液が透明になった後、固体が析出した。７０℃で混合物を０．５時間攪拌し、酢酸エチル（４００ｍＬ）を添加し、７０℃で混合物をさらに１６時間攪拌した。室温に冷却し、濾過し、フィルターケーキを集め、減圧下で乾燥させて、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを得た。
約５００ｍｇの式（Ｉ）で表される化合物を秤量し、４０ｍＬのガラス瓶に加え、２５ｍＬのテトラヒドロフランを添加して、溶解させ、マグネットバーを追加した後、上記のサンプルをマグネチックスターラー（４０℃，８９０ｒｐｍ）に置いて反応させた。その後、マレイン酸と溶媒との混合物（マレイン酸：アセトン＝２００ｍｇ：１５００μＬ）をゆっくりと加え、マグネチックスターラー（４０℃，８９０ｒｐｍ）に置いて、さらに反応させた。懸濁状態のサンプル（４０℃、８９０ｒｐｍの条件下、マグネチックスターラーで２４時間撹拌した後）を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた固体サンプルを３０℃の真空乾燥オーブンで乾燥させ、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを得た。
適量の式（Ｉ）で表される化合物、約５０ｍｇのマレイン酸塩を秤量し、２．０ｍＬのガラスバイアルに加え、適量の溶媒（下記の表８を参照）を加えて、懸濁液を得た。マグネットバーを追加した後、上記のサンプルをマグネチックスターラーに置いて反応させた。４０℃の条件下で２日振盪させた後、遠心分離し、得られた固体サンプルを３５℃の真空乾燥オーブンで一晩乾燥させ、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを得た。
表８ 式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂの製造
式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃおよび結晶体Ｄの製造
適量の式（Ｉ）で表される化合物、約２０－３０ｍｇの塩酸塩を秤量し、２．０ｍＬのガラスバイアルに加え、適量の溶媒（下記の表９を参照）を加えて、懸濁液を得た。マグネットバーを追加した後、上記のサンプルをマグネチックスターラーに置いて反応させた。４０℃の条件下で２日振盪させた後、遠心分離し、得られた固体サンプルを３５℃の真空乾燥オーブンで一晩乾燥させ、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃまたは結晶体Ｄを得た。
適量の式（Ｉ）で表される化合物、約２０－３０ｍｇの塩酸塩を秤量し、２．０ｍＬのガラスバイアルに加え、適量の溶媒（下記の表９を参照）を加えて、懸濁液を得た。マグネットバーを追加した後、上記のサンプルをマグネチックスターラーに置いて反応させた。４０℃の条件下で２日振盪させた後、遠心分離し、得られた固体サンプルを３５℃の真空乾燥オーブンで一晩乾燥させ、式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃまたは結晶体Ｄを得た。
表９ 式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃおよび結晶体Ｄの製造
式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｅの製造
２５ｍｇの式（Ｉ）で表される化合物、約２０－３０ｍｇの硫酸塩を秤量し、２．０ｍＬのガラスバイアルに加え、２００μＬメタノールを添加して懸濁液を得た。マグネットバーを追加した後、上記のサンプルをマグネチックスターラーに置いて反応させた。４０℃の条件下で２日振盪させた後、遠心分離し、得られた固体サンプルを３５℃の真空乾燥オーブンで一晩乾燥させ、式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｅを得た。
２５ｍｇの式（Ｉ）で表される化合物、約２０－３０ｍｇの硫酸塩を秤量し、２．０ｍＬのガラスバイアルに加え、２００μＬメタノールを添加して懸濁液を得た。マグネットバーを追加した後、上記のサンプルをマグネチックスターラーに置いて反応させた。４０℃の条件下で２日振盪させた後、遠心分離し、得られた固体サンプルを３５℃の真空乾燥オーブンで一晩乾燥させ、式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｅを得た。
式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｆの製造
５０．２８４ｍｇの式（Ｉ）で表される化合物、約５０ｍｇの硫酸塩を秤量し、２．０ｍＬのガラスバイアルに加え、２００μＬエタノールを添加して懸濁液を得た。マグネットバーを追加した後、上記のサンプルをマグネチックスターラーに置いて反応させた。４０℃の条件下で２日振盪させた後、遠心分離し、得られた固体サンプルを３５℃の真空乾燥オーブンで一晩乾燥させ、式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｆを得た。
５０．２８４ｍｇの式（Ｉ）で表される化合物、約５０ｍｇの硫酸塩を秤量し、２．０ｍＬのガラスバイアルに加え、２００μＬエタノールを添加して懸濁液を得た。マグネットバーを追加した後、上記のサンプルをマグネチックスターラーに置いて反応させた。４０℃の条件下で２日振盪させた後、遠心分離し、得られた固体サンプルを３５℃の真空乾燥オーブンで一晩乾燥させ、式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｆを得た。
実施例３：
式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ｂの固体安定性試験
影響因子および加速試験条件に従って、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ｂ約５ｍｇを正確に秤量し、乾燥した清潔なガラス瓶に入れて、薄層に広げた。上記の操作を２回繰り返し、正式な試験サンプルをした。影響因子試験条件（６０℃，９２．５％ＲＨ）および加速条件（４０℃／７５％ ＲＨおよび６０℃／７５％ ＲＨ）下に置いた。なお、サンプルは完全に露出され、小さな穴が開けられたアルミホイル紙で覆われた。さらに、少量のサンプルを４０ｍＬのガラスサンプル瓶に入れ、同じ条件下で結晶状態を測定した。なお、光照（１．２×１０６Ｌｕｘ・ｈｒ／近紫外２００ｗ・ｈｒ／ｍ２）条件下に置かれたサンプルは、室温で完全に露出された。試験の結果を表１０に示す。
式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ｂの固体安定性試験
影響因子および加速試験条件に従って、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ｂ約５ｍｇを正確に秤量し、乾燥した清潔なガラス瓶に入れて、薄層に広げた。上記の操作を２回繰り返し、正式な試験サンプルをした。影響因子試験条件（６０℃，９２．５％ＲＨ）および加速条件（４０℃／７５％ ＲＨおよび６０℃／７５％ ＲＨ）下に置いた。なお、サンプルは完全に露出され、小さな穴が開けられたアルミホイル紙で覆われた。さらに、少量のサンプルを４０ｍＬのガラスサンプル瓶に入れ、同じ条件下で結晶状態を測定した。なお、光照（１．２×１０６Ｌｕｘ・ｈｒ／近紫外２００ｗ・ｈｒ／ｍ２）条件下に置かれたサンプルは、室温で完全に露出された。試験の結果を表１０に示す。
結論：式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ｂは、良好な安定性を有する。
生化学的アッセイ：インビトロ評価
実験例１ 酵素活性の評価
このアッセイの目的は、ＨＥＲ１（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）に対する化合物のインビトロ阻害活性を検出することである。このアッセイで使用された酵素は、ヒトＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４であった。Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｐｈａｒｍａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅは、活性の検出方法を提供した。ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４に対する試験化合物の阻害活性の結果を表１１に示す。
実験例１ 酵素活性の評価
このアッセイの目的は、ＨＥＲ１（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）に対する化合物のインビトロ阻害活性を検出することである。このアッセイで使用された酵素は、ヒトＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４であった。Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｐｈａｒｍａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅは、活性の検出方法を提供した。ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４に対する試験化合物の阻害活性の結果を表１１に示す。
実験手順および方法（９６ウェルプレート）：
５倍で希釈された試験化合物の緩衝液（５μＬ）、ポリペプチド基質ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）（４：１）（２．５μＬ）、ＥｒｂＢ（４－２０ｎｇ，２．５μＬ）、ＭｎＣｌ２（５０ｍｍ，１．２５μＬ）、ｄＨ２Ｏ（３．７５μＬ）、［γ－３３Ｐ］ＡＴＰ（１０μＬ）を加え、３０℃で１０分間インキュベートした。３％リン酸を加えて反応を停止させ、１０μＬのサンプルをを採取し、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ Ａに移した。７５ｍＭリン酸でフィルターディスクを３回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、フィルターディスクを密封されたビニール袋に移し、シンチレーション混合物（４ｍＬ）を加え、シンチレーションカウンターにより、放出された光子の強度を測定し、酵素サンプルのＣＰＭ（回／分）を内部対照サンプルのＣＰＭと比較した。なお、光子強度のレベルは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映した。
５倍で希釈された試験化合物の緩衝液（５μＬ）、ポリペプチド基質ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）（４：１）（２．５μＬ）、ＥｒｂＢ（４－２０ｎｇ，２．５μＬ）、ＭｎＣｌ２（５０ｍｍ，１．２５μＬ）、ｄＨ２Ｏ（３．７５μＬ）、［γ－３３Ｐ］ＡＴＰ（１０μＬ）を加え、３０℃で１０分間インキュベートした。３％リン酸を加えて反応を停止させ、１０μＬのサンプルをを採取し、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ Ａに移した。７５ｍＭリン酸でフィルターディスクを３回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、フィルターディスクを密封されたビニール袋に移し、シンチレーション混合物（４ｍＬ）を加え、シンチレーションカウンターにより、放出された光子の強度を測定し、酵素サンプルのＣＰＭ（回／分）を内部対照サンプルのＣＰＭと比較した。なお、光子強度のレベルは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映した。
結論：式（Ｉ）で表される化合物は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４に対して明らかな阻害活性を有する。
実験例２ 細胞増殖に対する阻害活性の評価
実験の目的：細胞増殖に対する試験化合物の阻害活性を検出する。
実験の目的：細胞増殖に対する試験化合物の阻害活性を検出する。
実験の原理：Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬中のルシフェラーゼは、ルシフェリン、酸素およびＡＴＰを反応基質として利用し、酸化されたルシフェリンを生成し、光としてエネルギーを放出する。ルシフェラーゼの反応にはＡＴＰが必要であるため、反応によって発生する光の総量は、細胞の生存率を反映するＡＴＰの総量に比例する。
実験の材料：
細胞株：ＮＣＩ－Ｎ８７細胞株（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－５８２２）、ＢＴ－４７４細胞株（ＡＴＣＣ－ＨＴＢ－２０）、ＯＥ２１（ＥＣＡＣＣ－９６０６２２０１）
細胞培養培地：（ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃２２４００－１０５； １０％血清Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１００９０１４８； Ｌ－グルタミン１×、Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０－０８１；ペニシリン－ストレプトマイシンＨｙｃｌｏｎｅ＃ ＳＶ３００１０）
Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）、発光法細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）
３８４ウェル細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８１０９０）
化合物プレート（ＬＡＢＣＹＴＥ ＃ ＬＰ－０２００）
ＣＯ２インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７１）
Ｖｉ－ｃｅｌｌセルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）
ピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ピペッティングチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
ピペッティングガン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
多機能マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ）
ＥＣＨＯ Ｌｉｑｕｉｄ－ｈａｎｄｌｉｎｇ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｌａｂｃｙｔｅ－ＥＣＨＯ５５５）
細胞株：ＮＣＩ－Ｎ８７細胞株（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－５８２２）、ＢＴ－４７４細胞株（ＡＴＣＣ－ＨＴＢ－２０）、ＯＥ２１（ＥＣＡＣＣ－９６０６２２０１）
細胞培養培地：（ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃２２４００－１０５； １０％血清Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１００９０１４８； Ｌ－グルタミン１×、Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０－０８１；ペニシリン－ストレプトマイシンＨｙｃｌｏｎｅ＃ ＳＶ３００１０）
Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）、発光法細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）
３８４ウェル細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８１０９０）
化合物プレート（ＬＡＢＣＹＴＥ ＃ ＬＰ－０２００）
ＣＯ２インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７１）
Ｖｉ－ｃｅｌｌセルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）
ピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ピペッティングチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
ピペッティングガン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
多機能マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ）
ＥＣＨＯ Ｌｉｑｕｉｄ－ｈａｎｄｌｉｎｇ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｌａｂｃｙｔｅ－ＥＣＨＯ５５５）
実験手順および方法：
２．１ １日目：
細胞プレートの播種概略図に従って、３８４または９６ウェルプレートに、ウェルあたり１０００細胞およびウェルあたり２５μＬの密度で細胞を播種し、周縁のウェルに細胞を播種せず、２５μＬのＰＢＳを補充した。
２．１ １日目：
細胞プレートの播種概略図に従って、３８４または９６ウェルプレートに、ウェルあたり１０００細胞およびウェルあたり２５μＬの密度で細胞を播種し、周縁のウェルに細胞を播種せず、２５μＬのＰＢＳを補充した。
２．２ ０日目：
（１）で表される化合物のストック液は１０ｍＭであり、初期濃度が４ｍＭになるようにＤＭＳＯで化合物を希釈した。化合物のストック液プレートに、ウェルあたり９μＬの化合物を添加した。
（２）ＥＣＨＯ液体処理ワークステーションにより化合物を希釈し、細胞プレートの各ウェルに１２５ｎＬの化合物を加えた。なお、２列目および２３列目の細胞ウェルに、ウェルあたり１２５ｎＬのＤＭＳＯを加え、１列目および２４列目のＰＢＳウェルに、ウェルあたり１２５ｎＬのＤＭＳＯを加えた。
（３）細胞プレートに、ウェルあたり２５μＬの培養基を追加し、細胞プレートの最終容量はウェルあたり５０μＬにした。化合物の濃度は１μＭであり、３倍段階希釈して１０個の濃度を得た。左右の２つのウェルについて同様の操作を行い、同様に実験を行った。ＤＭＳＯの最終濃度は０．２５％であった。
（１）で表される化合物のストック液は１０ｍＭであり、初期濃度が４ｍＭになるようにＤＭＳＯで化合物を希釈した。化合物のストック液プレートに、ウェルあたり９μＬの化合物を添加した。
（２）ＥＣＨＯ液体処理ワークステーションにより化合物を希釈し、細胞プレートの各ウェルに１２５ｎＬの化合物を加えた。なお、２列目および２３列目の細胞ウェルに、ウェルあたり１２５ｎＬのＤＭＳＯを加え、１列目および２４列目のＰＢＳウェルに、ウェルあたり１２５ｎＬのＤＭＳＯを加えた。
（３）細胞プレートに、ウェルあたり２５μＬの培養基を追加し、細胞プレートの最終容量はウェルあたり５０μＬにした。化合物の濃度は１μＭであり、３倍段階希釈して１０個の濃度を得た。左右の２つのウェルについて同様の操作を行い、同様に実験を行った。ＤＭＳＯの最終濃度は０．２５％であった。
２．３ 化合物を添加した後、１０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、次いで細胞プレートをを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて３日間インキュベートした。
２．４ ３日目：
細胞プレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分間平衡化した。各ウェルに２５μＬのＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏｏ試薬を加え、１分間振とうして十分に混合し、１０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した。１０分後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎでプレートを読み取り、蛍光読み取り時間を０．２秒に設定した。
細胞プレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分間平衡化した。各ウェルに２５μＬのＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏｏ試薬を加え、１分間振とうして十分に混合し、１０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した。１０分後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎでプレートを読み取り、蛍光読み取り時間を０．２秒に設定した。
実験の結果：実験の結果を表１２に示す。
ＯＥ１９細胞のＣＴＧ実験
飽和度が８０％～９０％に達したＯＥ１９細胞をトリプシンで消化し、遠心分離し、再懸濁してカウントした。細胞の濃度を９０ｍｌ／ウェルに調整し、ウェルあたり８０００個になるようにＯＥ１９細胞を９６ウェル細胞培養プレートに加えた。３７℃、５％ＣＯ２を含む細胞インキュベーターで、一晩培養した。
飽和度が８０％～９０％に達したＯＥ１９細胞をトリプシンで消化し、遠心分離し、再懸濁してカウントした。細胞の濃度を９０ｍｌ／ウェルに調整し、ウェルあたり８０００個になるようにＯＥ１９細胞を９６ウェル細胞培養プレートに加えた。３７℃、５％ＣＯ２を含む細胞インキュベーターで、一晩培養した。
試験化合物のストック液をＤＭＳＯで３倍段階希釈して１０個の濃度を得た。実験を開始した前に、段階希釈した試験化合物を、無菌条件下で細胞培養培地を用いてさらに１０×化合物溶液（最高濃度１００μＭ、１％ＤＭＳＯを含む）に希釈した。調製した１０×化合物溶液を、ウェルあたり１０μＬで細胞培養プレートに加えた。このようにして、標準対照としてのＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（スタウロスポリン）およびすべての試験化合物は、いずれも最終濃度が１０μＭを開始濃度とし、３倍段階希釈して合計共１０個の測定濃度とした。
細胞培養の７２時間後、９６ウェル細胞培養プレートを取り出した。５０ｍｌ／ウェルでＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を添加し、均一に混合し、遠心分離し、室温、暗所で１０分間インキュベートした。細胞プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎで読み取った。
生データから以下の式により阻害率を算出した。
阻害百分率％＝（ＺＰＥ－サンプル検出値）／（ＺＰＥ－ＨＰＥ）×１００％
３日目（実験の１日目は化合物を添加した日であり、３日目は読み取りが行われた日である）の１０ｍＭのｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅを含むウェルをＨＰＥ（１００％阻害対照）ウェルとして使用し、３日目の０．１％のＤＭＳＯを含むウェルをＺＰＥ（０％阻害対照）ウェルとして使用した。試験化合物の各濃度を２回ずつ測定した。
処理されたデータについて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６分析ソフトウェアを利用して非線形回帰分析を実施し、用量反応曲線を作成し、ＯＥ１９細胞に対するアッセイ化合物の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。実験の結果を表１２に示す。
阻害百分率％＝（ＺＰＥ－サンプル検出値）／（ＺＰＥ－ＨＰＥ）×１００％
３日目（実験の１日目は化合物を添加した日であり、３日目は読み取りが行われた日である）の１０ｍＭのｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅを含むウェルをＨＰＥ（１００％阻害対照）ウェルとして使用し、３日目の０．１％のＤＭＳＯを含むウェルをＺＰＥ（０％阻害対照）ウェルとして使用した。試験化合物の各濃度を２回ずつ測定した。
処理されたデータについて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６分析ソフトウェアを利用して非線形回帰分析を実施し、用量反応曲線を作成し、ＯＥ１９細胞に対するアッセイ化合物の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。実験の結果を表１２に示す。
結論：式（Ｉ）で表される化合物は、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＯＥ２１およびＯＥ１９細胞の増殖に対して明らかな阻害活性を有する。
実験例３
ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍を用いたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるインビボ薬力学研究
実験目的：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍に対する本明細書に開示される試験化合物のインビボ有効性を評価する。
実験動物：雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、６～８週齢、体重１８～２２グラム、仕入先：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇ Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。
ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍を用いたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるインビボ薬力学研究
実験目的：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍に対する本明細書に開示される試験化合物のインビボ有効性を評価する。
実験動物：雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、６～８週齢、体重１８～２２グラム、仕入先：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇ Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。
実験方法および手順：
３．１ 細胞の培養
ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞は、インビトロ、単層で培養された。培養は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。トリプシン－ＥＤＴＡによる通常の消化処理によって、週に２回継代を行った。細胞の飽和度が８０％～９０％に達したとき、細胞を回収し、カウントし、接種した。
３．１ 細胞の培養
ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞は、インビトロ、単層で培養された。培養は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。トリプシン－ＥＤＴＡによる通常の消化処理によって、週に２回継代を行った。細胞の飽和度が８０％～９０％に達したとき、細胞を回収し、カウントし、接種した。
３．２ 腫瘍細胞の接種（腫瘍接種）
０．２ｍＬ（１０×１０６）ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（ＰＢＳ＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ，１：１）を、各ヌードマウスの右背部に皮下接種した。腫瘍の平均体積が１５８ｍｍ３に達した時、群を分けて投与を開始した。
０．２ｍＬ（１０×１０６）ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（ＰＢＳ＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ，１：１）を、各ヌードマウスの右背部に皮下接種した。腫瘍の平均体積が１５８ｍｍ３に達した時、群を分けて投与を開始した。
３．３ 試験化合物の調製：
試験化合物を０．０４ｍｇ／ｍＬおよび０．０８ｍｇ／ｍＬの透明溶液に調製した。なお、溶媒は、１０％のＮＭＰ（Ｎ－メチルピロリドン）＋１０％のステアリン酸エチレングリコール＋８０％の水であった。
試験化合物を０．０４ｍｇ／ｍＬおよび０．０８ｍｇ／ｍＬの透明溶液に調製した。なお、溶媒は、１０％のＮＭＰ（Ｎ－メチルピロリドン）＋１０％のステアリン酸エチレングリコール＋８０％の水であった。
３．４ 腫瘍の測定および実験の指標
実験の指標は、腫瘍の増殖が阻害されるか、遅延されるか、または治癒されるかを調査するものであった。ノギスを使用して週に２回腫瘍の直径を測定した。腫瘍の体積の計算式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２。なお、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
実験の指標は、腫瘍の増殖が阻害されるか、遅延されるか、または治癒されるかを調査するものであった。ノギスを使用して週に２回腫瘍の直径を測定した。腫瘍の体積の計算式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２。なお、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
化合物の抗腫瘍効果は、ＴＧＩ（％）または腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価された。ＴＧＩ（％）は、腫瘍増殖阻害率を反映する。ＴＧＩ（％）は次のように計算された：ＴＧＩ（％）＝［１－（ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積－この処理群の投与開始時の平均腫瘍体積）／（溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積－この溶媒対照群の治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％。
腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）の計算式は以下のとおりである。Ｔ／Ｃ（％）＝ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積／溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積×１００％。
腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）の計算式は以下のとおりである。Ｔ／Ｃ（％）＝ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積／溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積×１００％。
３．５ 統計分析
統計分析は、各群の各時点での腫瘍体積の平均値および標準誤差（ＳＥＭ）（具体的なデータは表１３に示す）を含む。治療群は、試験の終了時、すなわち投与後２８日目に最良の治療効果を示した。したがって、このデータに基づいて統計分析を実行し、群の間の差異を評価した。２つの群の間の比較では、Ｔ検定によって分析を行い、３つ以上の群の間の比較では、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって分析を行った。検定の結果、Ｆ値に有意差が見られ、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌ法で検定した。なお、ＳＰＳＳ １７．０を使用してすべてのデータ分析を行った。ｐ＜０．０５は有意差があると見なされた。
統計分析は、各群の各時点での腫瘍体積の平均値および標準誤差（ＳＥＭ）（具体的なデータは表１３に示す）を含む。治療群は、試験の終了時、すなわち投与後２８日目に最良の治療効果を示した。したがって、このデータに基づいて統計分析を実行し、群の間の差異を評価した。２つの群の間の比較では、Ｔ検定によって分析を行い、３つ以上の群の間の比較では、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって分析を行った。検定の結果、Ｆ値に有意差が見られ、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌ法で検定した。なお、ＳＰＳＳ １７．０を使用してすべてのデータ分析を行った。ｐ＜０．０５は有意差があると見なされた。
３．６ 実験の結果
３．６．１ 死亡率、罹患率および体重の変化
実験動物の体重を、医薬品の毒性を間接的に測定するための参照指標として使用した。このモデルでは、治療群のマウスの体重は減少傾向にあり、他の罹患率や死亡率はなかった。
３．６．１ 死亡率、罹患率および体重の変化
実験動物の体重を、医薬品の毒性を間接的に測定するための参照指標として使用した。このモデルでは、治療群のマウスの体重は減少傾向にあり、他の罹患率や死亡率はなかった。
３．６．２ 抗腫瘍効果の評価指標
３．７ 実験の結論および考察
本実験において、ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）で表される化合物のインビボ有効性を評価した。溶媒対照群と比較して、治療群の式（Ｉ）で表される化合物が０．８ｍｇ／ｋｇである場合は、参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂが０．８ｍｇ／ｋｇである場合と同等の薬効を示し、両方とも明らかな腫瘍阻害効果を示した。低用量群では、式（Ｉ）で表される化合物は、参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂと同等またはそれ以上の薬効を示した。
本実験において、ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）で表される化合物のインビボ有効性を評価した。溶媒対照群と比較して、治療群の式（Ｉ）で表される化合物が０．８ｍｇ／ｋｇである場合は、参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂが０．８ｍｇ／ｋｇである場合と同等の薬効を示し、両方とも明らかな腫瘍阻害効果を示した。低用量群では、式（Ｉ）で表される化合物は、参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂと同等またはそれ以上の薬効を示した。
実験例４
ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍を用いたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるインビボ薬力学研究
実験目的：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍に対する本明細書に開示される試験化合物のインビボ有効性を評価する。
実験動物：雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、６～８週齢、体重１８～２２グラム、仕入先：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ Ｂｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ。
ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍を用いたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるインビボ薬力学研究
実験目的：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍に対する本明細書に開示される試験化合物のインビボ有効性を評価する。
実験動物：雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、６～８週齢、体重１８～２２グラム、仕入先：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ Ｂｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ。
実験方法および手順：
４．１ 細胞の培養
ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞は、インビトロ、単層で培養された。培養は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。トリプシン－ＥＤＴＡによる通常の消化処理によって、週に２回継代を行った。細胞の飽和度が８０％～９０％に達したとき、細胞を回収し、カウントし、接種した。
４．１ 細胞の培養
ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞は、インビトロ、単層で培養された。培養は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。トリプシン－ＥＤＴＡによる通常の消化処理によって、週に２回継代を行った。細胞の飽和度が８０％～９０％に達したとき、細胞を回収し、カウントし、接種した。
４．２ 腫瘍細胞の接種（腫瘍接種）
０．２ｍＬ（１０×１０６）ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（ＰＢＳ＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ，１：１）を、各ヌードマウスの右背部に皮下接種した。腫瘍の平均体積が１５６ｍｍ３に達した時、群を分けて投与を開始した。
０．２ｍＬ（１０×１０６）ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（ＰＢＳ＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ，１：１）を、各ヌードマウスの右背部に皮下接種した。腫瘍の平均体積が１５６ｍｍ３に達した時、群を分けて投与を開始した。
４．３ 試験化合物の調製：
試験化合物を０．０５ｍｇ／ｍＬの透明溶液に調製した。なお、溶媒は、１０％のＮＭＰ（Ｎ－メチルピロリドン）＋１０％のステアリン酸エチレングリコール＋８０％の水であった。
試験化合物を０．０５ｍｇ／ｍＬの透明溶液に調製した。なお、溶媒は、１０％のＮＭＰ（Ｎ－メチルピロリドン）＋１０％のステアリン酸エチレングリコール＋８０％の水であった。
４．４ 腫瘍の測定および実験の指標
実験の指標は、腫瘍の増殖が阻害されるか、遅延されるか、または治癒されるかを調査するものであった。ノギスを使用して週に２回腫瘍の直径を測定した。腫瘍の体積の計算式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２。なお、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
実験の指標は、腫瘍の増殖が阻害されるか、遅延されるか、または治癒されるかを調査するものであった。ノギスを使用して週に２回腫瘍の直径を測定した。腫瘍の体積の計算式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２。なお、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
化合物の抗腫瘍効果は、ＴＧＩ（％）または腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価された。ＴＧＩ（％）は、腫瘍増殖阻害率を反映する。ＴＧＩ（％）は次のように計算された：ＴＧＩ（％）＝［１－（ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積－この処理群の投与開始時の平均腫瘍体積）／（溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積－この溶媒対照群の治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％。
腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）の計算式は以下のとおりである。Ｔ／Ｃ（％）＝ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積／溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積×１００％。
腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）の計算式は以下のとおりである。Ｔ／Ｃ（％）＝ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積／溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積×１００％。
４．５ 統計分析
統計分析は、各群の各時点での腫瘍体積の平均値および標準誤差（ＳＥＭ）（具体的なデータは表１４に示す）を含む。治療群は、試験の終了時、すなわち投与後２８日目に最良の治療効果を示した。したがって、このデータに基づいて統計分析を実行し、群の間の差異を評価した。２つの群の間の比較では、Ｔ検定によって分析を行い、３つ以上の群の間の比較では、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって分析を行った。検定の結果、Ｆ値に有意差が見られ、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌ法で検定した。なお、ＳＰＳＳ １７．０を使用してすべてのデータ分析を行った。ｐ＜０．０５は有意差があると見なされた。
統計分析は、各群の各時点での腫瘍体積の平均値および標準誤差（ＳＥＭ）（具体的なデータは表１４に示す）を含む。治療群は、試験の終了時、すなわち投与後２８日目に最良の治療効果を示した。したがって、このデータに基づいて統計分析を実行し、群の間の差異を評価した。２つの群の間の比較では、Ｔ検定によって分析を行い、３つ以上の群の間の比較では、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって分析を行った。検定の結果、Ｆ値に有意差が見られ、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌ法で検定した。なお、ＳＰＳＳ １７．０を使用してすべてのデータ分析を行った。ｐ＜０．０５は有意差があると見なされた。
４．６ 実験の結果
４．６．１ 死亡率、罹患率および体重の変化
実験動物の体重を、医薬品の毒性を間接的に測定するための参照指標として使用した。このモデルでは、治療群のマウスの体重は減少傾向にあり、他の罹患率や死亡率はなかった。
４．６．１ 死亡率、罹患率および体重の変化
実験動物の体重を、医薬品の毒性を間接的に測定するための参照指標として使用した。このモデルでは、治療群のマウスの体重は減少傾向にあり、他の罹患率や死亡率はなかった。
４．６．２ 抗腫瘍効果の評価指標
４．７ 実験の結論および考察
本実験において、ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）で表される化合物および対照化合物２のインビボ有効性を評価した。溶媒対照群と比較して、治療群の式（Ｉ）で表される化合物が０．５ｍｇ／ｋｇである場合は、明らかな腫瘍阻害効果を示し、腫瘍阻害率は、Ｔ／Ｃ＝１０．６９％、ＴＧＩ＝１１９．４１％、ｐ＝０．００７であり；一方、同じ用量で、対照化合物２の薬効は明らかではなく、Ｔ／Ｃ＝８９．３５％、ＴＧＩ＝１８．８３％であった。式（Ｉ）で表される化合物の薬効は、対照化合物２の薬効よりも優れた。
本実験において、ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞の皮下異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）で表される化合物および対照化合物２のインビボ有効性を評価した。溶媒対照群と比較して、治療群の式（Ｉ）で表される化合物が０．５ｍｇ／ｋｇである場合は、明らかな腫瘍阻害効果を示し、腫瘍阻害率は、Ｔ／Ｃ＝１０．６９％、ＴＧＩ＝１１９．４１％、ｐ＝０．００７であり；一方、同じ用量で、対照化合物２の薬効は明らかではなく、Ｔ／Ｃ＝８９．３５％、ＴＧＩ＝１８．８３％であった。式（Ｉ）で表される化合物の薬効は、対照化合物２の薬効よりも優れた。
実験例５
ヒト食道癌ＯＥ２細胞の皮下異種移植腫瘍を用いたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるインビボ薬力学研究
実験目的：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるヒト食道癌ＯＥ２細胞の皮下異種移植腫瘍に対する試験化合物のインビボ有効性を評価する。
実験動物：雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、６～８週齢、体重１７～２３グラム、仕入先：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ Ｂｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ。
ヒト食道癌ＯＥ２細胞の皮下異種移植腫瘍を用いたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるインビボ薬力学研究
実験目的：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおけるヒト食道癌ＯＥ２細胞の皮下異種移植腫瘍に対する試験化合物のインビボ有効性を評価する。
実験動物：雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、６～８週齢、体重１７～２３グラム、仕入先：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ Ｂｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ。
実験方法および手順：
５．１ 細胞の培養
ヒト食道癌ＯＥ２細胞は、インビトロ、単層で培養された。培養は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。トリプシン－ＥＤＴＡによる通常の消化処理によって、週に２回継代を行った。細胞の飽和度が８０％～９０％に達したとき、細胞を回収し、カウントし、接種した。
５．１ 細胞の培養
ヒト食道癌ＯＥ２細胞は、インビトロ、単層で培養された。培養は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。トリプシン－ＥＤＴＡによる通常の消化処理によって、週に２回継代を行った。細胞の飽和度が８０％～９０％に達したとき、細胞を回収し、カウントし、接種した。
５．２ 腫瘍細胞の接種（腫瘍接種）
０．１ｍＬ（２０．１）のＯＥ２細胞（ＰＢＳ）を、各ヌードマウスの右背部に皮下接種した。腫瘍の平均体積が１１２ｍｍ３に達した時、群を分けて投与を開始した。
０．１ｍＬ（２０．１）のＯＥ２細胞（ＰＢＳ）を、各ヌードマウスの右背部に皮下接種した。腫瘍の平均体積が１１２ｍｍ３に達した時、群を分けて投与を開始した。
５．３ 試験化合物の調製：
試験化合物を０．１５ｍｇ／ｍＬ～０．３ｍｇ／ｍＬの透明溶液または懸濁液に調製した。なお、溶媒は、１０％のＮＭＰ＋１０％のステアリン酸エチレングリコール＋８０％の水であった。
試験化合物を０．１５ｍｇ／ｍＬ～０．３ｍｇ／ｍＬの透明溶液または懸濁液に調製した。なお、溶媒は、１０％のＮＭＰ＋１０％のステアリン酸エチレングリコール＋８０％の水であった。
５．４ 腫瘍の測定および実験の指標
実験の指標は、腫瘍の増殖が阻害されるか、遅延されるか、または治癒されるかを調査するものであった。ノギスを使用して週に２回腫瘍の直径を測定した。腫瘍の体積の計算式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２。なお、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
実験の指標は、腫瘍の増殖が阻害されるか、遅延されるか、または治癒されるかを調査するものであった。ノギスを使用して週に２回腫瘍の直径を測定した。腫瘍の体積の計算式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２。なお、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
化合物の抗腫瘍効果は、ＴＧＩ（％）または相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価された。ＴＧＩ（％）は、腫瘍増殖阻害率を反映する。ＴＧＩ（％）は次のように計算された：ＴＧＩ（％）＝［（１－（ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積－この処理群の投与開始時の平均腫瘍体積））／（溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積－この溶媒対照群の治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）の計算式は以下のとおりである。Ｔ／Ｃ（％）＝ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積／溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積×１００％。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）の計算式は以下のとおりである。Ｔ／Ｃ（％）＝ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積／溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積×１００％。
５．５ 統計分析
統計分析は、各群の各時点での腫瘍体積の平均値および標準誤差（ＳＥＭ）を含む。３つ以上の群の間の比較では、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって分析を行った。また、Ｆ値に有意差があった場合、ＡＮＯＶＡ分析後に多重比較を行った。なお、ＳＰＳＳ １７．０を使用してすべてのデータ分析を行った。ｐ＜０．０５は有意差があると見なされた。
統計分析は、各群の各時点での腫瘍体積の平均値および標準誤差（ＳＥＭ）を含む。３つ以上の群の間の比較では、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって分析を行った。また、Ｆ値に有意差があった場合、ＡＮＯＶＡ分析後に多重比較を行った。なお、ＳＰＳＳ １７．０を使用してすべてのデータ分析を行った。ｐ＜０．０５は有意差があると見なされた。
５．６ 実験の結果
５．６．１ 死亡率、罹患率および体重の変化
このモデルにおいて、Poziotinibが２／１．５ｍｇ／ｋｇである投与群の動物および式（Ｉ）で表される化合物が２／１．５ｍｇ／ｋｇである投与群の動物は、いずれも異なる程度の体重減少および皮屑を示した。Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂが２／１．５ｍｇ／ｋｇである場合、群を分けて投与した後６日目と７日目から、順次に１匹と３匹のマウスが１５％以上の体重減少を示したため、それらへの投与を中止し、しかも、群全体のマウスの尿は濃い黄色を呈して、毒性を示唆していた。投与した３日目から、Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂを２ｍｇ／ｋｇの用量から１．５ｍｇ／ｋｇに減らし、式（Ｉ）で表される化合物の用量を２ｍｇ／ｋｇから１．５ｍｇ／ｋｇに減らした。用量調整後、各群の動物の体重は明らかに回復した。
５．６．１ 死亡率、罹患率および体重の変化
このモデルにおいて、Poziotinibが２／１．５ｍｇ／ｋｇである投与群の動物および式（Ｉ）で表される化合物が２／１．５ｍｇ／ｋｇである投与群の動物は、いずれも異なる程度の体重減少および皮屑を示した。Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂが２／１．５ｍｇ／ｋｇである場合、群を分けて投与した後６日目と７日目から、順次に１匹と３匹のマウスが１５％以上の体重減少を示したため、それらへの投与を中止し、しかも、群全体のマウスの尿は濃い黄色を呈して、毒性を示唆していた。投与した３日目から、Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂを２ｍｇ／ｋｇの用量から１．５ｍｇ／ｋｇに減らし、式（Ｉ）で表される化合物の用量を２ｍｇ／ｋｇから１．５ｍｇ／ｋｇに減らした。用量調整後、各群の動物の体重は明らかに回復した。
５．６．２ 抗腫瘍効果の評価指標
５．７ 実験の結論および考察
本実験において、ＯＥ２１異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）で表される化合物および参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂのインビボ有効性を評価した。投与２１日後、溶媒対照群の担癌マウスの腫瘍体積は９４８ｍｍ３に達した。試験物質Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂが２／１．５ｍｇ／ｋｇである群および式（Ｉ）で表される化合物が２／１．５ｍｇ／ｋｇである群は、溶媒対照群と比較して明らかな腫瘍阻害効果を示した。Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂが２／１．５ｍｇ／ｋｇである群の腫瘍抑制率はＴ／Ｃ＝６．０５％、ＴＧＩ＝１０６．６５％、ｐ＝０．００８であり、式（Ｉ）で表される化合物が２／１．５ｍｇ／ｋｇである群の腫瘍阻害率はＴ／Ｃ＝５．８２％、ＴＧＩ＝１０６．６５％、ｐ＝０．００８であった。０．５ｍｐｋの低用量での式（Ｉ）で表される化合物の有効性は、１．５ｍｐｋの高用量での参照化合物Ｐｏｚｉｏｔｎｉｂおよび式（Ｉ）で表される化合物の有効性に相当した。
本実験において、ＯＥ２１異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）で表される化合物および参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂのインビボ有効性を評価した。投与２１日後、溶媒対照群の担癌マウスの腫瘍体積は９４８ｍｍ３に達した。試験物質Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂが２／１．５ｍｇ／ｋｇである群および式（Ｉ）で表される化合物が２／１．５ｍｇ／ｋｇである群は、溶媒対照群と比較して明らかな腫瘍阻害効果を示した。Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂが２／１．５ｍｇ／ｋｇである群の腫瘍抑制率はＴ／Ｃ＝６．０５％、ＴＧＩ＝１０６．６５％、ｐ＝０．００８であり、式（Ｉ）で表される化合物が２／１．５ｍｇ／ｋｇである群の腫瘍阻害率はＴ／Ｃ＝５．８２％、ＴＧＩ＝１０６．６５％、ｐ＝０．００８であった。０．５ｍｐｋの低用量での式（Ｉ）で表される化合物の有効性は、１．５ｍｐｋの高用量での参照化合物Ｐｏｚｉｏｔｎｉｂおよび式（Ｉ）で表される化合物の有効性に相当した。
式（Ｉ）で表される化合物は、顕著な腫瘍阻害効果を有し、その薬効は、参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｎｉｂと同等であった。しかしながら、参照化合物の高用量群では、マウスの体重は大幅に減少し、特に３匹のマウスが１５％以上の体重減少を示したため、それらへの投与を中止し、しかも、群全体のマウスの尿は濃い黄色を呈して、毒性を示唆していた。一方、式（Ｉ）で表される化合物は、マウスの体重にほとんど影響を与えず、投与を中止せず、濃い黄色の尿などの毒性を示唆することなく、その忍容性が参照化合物よりも優れた。参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｎｉｂと比較して、式（Ｉ）で表される化合物は、有効用量がより低く、忍容性がより良く、より優れた安全ウィンドウ（ｓａｆｅｔｙ ｗｉｎｄｏｗ）を有する。
実験例６
マウスの薬物動態を研究する実験
実験目的：本実験は、単回静脈内注射および胃内投与後の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける本明細書に開示される実施例化合物および参照化合物のインビボ血漿薬物動態を調査することを目的とした。
実験動物：雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、７～９週齢、体重１７～２３グラム、仕入先：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ Ｂｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ。
マウスの薬物動態を研究する実験
実験目的：本実験は、単回静脈内注射および胃内投与後の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける本明細書に開示される実施例化合物および参照化合物のインビボ血漿薬物動態を調査することを目的とした。
実験動物：雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、７～９週齢、体重１７～２３グラム、仕入先：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ Ｂｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ。
サンプルの採取：各時点で、穿刺によって実験動物の伏在静脈から０．０３ｍＬの血液サンプルを採取し、実際の採血時間を記録した。すべての血液サンプルを１．５ｍＬの仕様の市販のＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝固チューブに加えた（仕入先：Ｊｉａｎｇｓｕ ＫＡＮＧＪＩＡＮ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）。血液サンプルを採取してから３０分以内に、血液サンプルを３０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上澄みの血漿を回収し、ドライアイスに素早く入れ、－８０℃の冷蔵庫に保存し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
データの分析： ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）薬物動態ソフトウェアの非コンパートメントモデルを利用して血漿中濃度を処理し、線形対数台形法によって薬物動態パラメーターであるＣｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｔ１／２、およびＡＵＣ０－ｌａｓｔを算出した。
結論：マウスにおける薬物動態研究の結果は、式（Ｉ）で表される化合物が参照化合物よりも長い半減期を有し、参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｎｉｂおよび対照化合物２よりも明らかに良好な経口血漿曝露を有することを示した。
実験例７
ＣＹＰ酵素への阻害活性の評価
ヒト肝ミクロソームにおけるＣＹＰ酵素活性のアッセイにおいて、本発明化合物および参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂの結果は、以下の表に示す（表１７）。
ＣＹＰ酵素への阻害活性の評価
ヒト肝ミクロソームにおけるＣＹＰ酵素活性のアッセイにおいて、本発明化合物および参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂの結果は、以下の表に示す（表１７）。
ヒト肝臓ミクロソームにおけるＣＹＰに対する本発明化合物の阻害活性の結果は、式（Ｉ）で表される化合物およびＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂがＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４に対して阻害活性を有さなかったことを示した。ＣＹＰ２Ｃ１９に対する式（Ｉ）で表される化合物の阻害活性は、参照化合物であるＰｏｚｉｏｔｉｎｉｂと同等であった。ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｄ６に対する式（Ｉ）で表される化合物の活性は改善され、それぞれ参照化合物よりも２倍および６倍優れた。総合的に比較すると、式（Ｉ）で表される化合物は、ＣＹＰに対する活性が改善され、参照化合物よりも優れているため、薬物間相互作用のリスクはより低くなる。
また、本発明は、Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼに関連する疾患を治療するための医薬品の調製における前記の結晶体の使用を提供する。
さらに、本発明は、Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼに関連する疾患を治療するための医薬品の調製における上記の化合物または結晶体の使用を提供する。
本発明の一部の実施形態では、前記Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼに関連する疾患を治療するための医薬品が腫瘍に用いられる医薬品であることを特徴とする上記の使用を提供する。
本発明で使用される溶媒は市販品である。本発明は以下の略語を使用する。ＤＣＭはジクロロメタンを表し；ＤＭＦはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを表し；ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表し；ＥtＯＨはエタノールを表し；ＭｅＯＨはメタノールを表し；ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表し；ＡＴＰはアデノシン三リン酸を表し；ＨＥＰＥＳは２－（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）エタンスルホン酸を表し；ＭｇＣｌ２はを二塩化マグネシウムを表す。
Claims (34)
- Ｘ線粉末回折パターンは、３．３±０．２°、１７．４±０．２°、２０．８±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
- Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、１４．６±０．２°、１５．２±０．２°、１７．４±０．２°、１９．０±０．２°、２０．８±０．２°、２２．１±０．２°、２４．１±０．２°、２９．５±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項１に記載の結晶体Ａ。 - Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、１２．０±０．２°、１２．７±０．２°、１４．６±０．２°、１５．２±０．２°、１５．９±０．２°、１７．４±０．２°、１９．０±０．２°、２０．８±０．２°、２２．１±０．２°、２４．１±０．２°、２９．５±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項２に記載の結晶体Ａ。 - Ｘ線粉末回折パターンが、３．３°、３．７°、６．９°、１１．２°、１２．０°、１２．７°、１４．６°、１５．２°、１５．９°、１６．９°、１７．４°、１７．９°、１８．５°、１９．０°、１９．４°、２０．１°、２０．４°、２０．８°、２２．１°、２２．４°、２３．５°、２４．１°、２４．４°、２５．４°、２５．８°、２６．６°、２７．１°、２８．３°、２９．０°、２９．５°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項３に記載の結晶体Ａ。 - ＸＲＰＤパターンが図１に示すとおりである、
請求項４に記載の結晶体Ａ。 -
- Ｘ線粉末回折パターンは、８．０±０．２°、１１．４±０．２°、１８．７±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂ。 - Ｘ線粉末回折パターンが、８．０±０．２°、１１．４±０．２°、１２．７±０．２°、１５．０±０．２°、１６．１±０．２°、１８．７±０．２°、２０．０±０．２°、２０．７±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項７に記載の結晶体Ｂ。 - Ｘ線粉末回折パターンが、８．０±０．２°、１１．４±０．２°、１２．７±０．２°、１５．０±０．２°、１６．１±０．２°、１８．７±０．２°、２０．０±０．２°、２０．７±０．２°、２２．４±０．２°、２３．１±０．２°、２４．８±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項８に記載の結晶体Ｂ。 - ＸＲＰＤパターンが図２に示すとおりである、
請求項９に記載の結晶体Ｂ。 - 示差走査熱量測定曲線が、２０７．４℃±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する、
請求項７～１０のいずれか一項に記載の結晶体Ｂ。 - ＤＳＣパターンが図３に示すとおりである、
請求項１１に記載の結晶体Ｂ。 -
- Ｘ線粉末回折パターンは、３．３±０．２°、７．６±０．２°、８．５±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｃ。 - Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、７．６±０．２°、８．５±０．２°、１１．３±０．２°、１３．８±０．２°、１５．２±０．２°、１７．７±０．２°、１８．３±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項１４に記載の結晶体Ｃ。 - Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、７．６±０．２°、８．５±０．２°、１１．３±０．２°、１３．８±０．２°、１５．２±０．２°、１７．７±０．２°、１８．３±０．２°、２２．６±０．２°、２３．７±０．２°、２４．９±０．２°、２６．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項１５に記載の結晶体Ｃ。 - ＸＲＰＤパターンが図４に示すとおりである、
請求項１６に記載の結晶体Ｃ。 - Ｘ線粉末回折パターンは、３．５±０．２°、９．５±０．２°、１０．５±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
式（ＩＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｄ。 - Ｘ線粉末回折パターンが、３．５±０．２°、９．５±０．２°、１０．５±０．２°、１４．０±０．２°、１６．３±０．２°、１８．７±０．２°、２３．４±０．２°、２５．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項１８に記載の結晶体Ｄ。 - ＸＲＰＤパターンが図５に示すとおりである、
請求項１９に記載の結晶体Ｄ。 -
- Ｘ線粉末回折パターンは、３．３±０．２°、１２．８±０．２°、１３．２±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｅ。 - Ｘ線粉末回折パターンが、３．３±０．２°、８．１±０．２°、１３．２±０．２°、１４．９±０．２°、１６．２±０．２°、１８．７±０．２°、２３．２±０．２°、２４．８±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項２２に記載の結晶体Ｅ。 - ＸＲＰＤパターンが図６に示すとおりである、
請求項２３に記載の結晶体Ｅ。 - Ｘ線粉末回折パターンは、３．６±０．２°、７．５±０．２°、１６．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
式（ＩＶ）で表される化合物の結晶体Ｆ。 - Ｘ線粉末回折パターンが、３．６±０．２°、７．５±０．２°、１２．２±０．２°、１５．１±０．２°、１６．６±０．２°、２３．６±０．２°、２４．６±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項２５に記載の結晶体Ｆ。 - ＸＲＰＤパターンが図７に示すとおりである、
請求項２６に記載の結晶体Ｆ。 - （１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に溶解させること；
（２）加熱しながら攪拌し、冷却し、濾過し、乾燥させ、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａを得ること；
を含む、式（Ｉ）で表される化合物の結晶体Ａの製造方法。 - （１）式（Ｉ）で表される化合物を溶媒に溶解させること；
（２）加熱し、マレイン酸を加え、攪拌し、固体を析出させ、冷却し、濾過し、乾燥させ、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂを得ること；
を含む、式（ＩＩ）で表される化合物の結晶体Ｂの製造方法。 - 前記溶媒がテトラヒドロフランである、
請求項２８に記載の製造方法。 - 前記溶媒がエタノール、酢酸エチルから選択される、
請求項２９に記載の製造方法。 - 化合物と溶媒との重量－体積比が１ｇ：７～５０ｍＬである、
請求項２８または２９に記載の製造方法。 - Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤に関連する疾患を治療するための医薬品の調製における、請求項６、１３または２１のいずれか一項に記載の化合物、或いは請求項１～５、７～１２、１４～２０または２２～２７のいずれか一項に記載の結晶体、或いは請求項２８～３２のいずれか一項に記載の製造方法により得られた結晶体の使用。
- 前記Ｐａｎ－ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤に関する医薬品が、腫瘍に用いられる医薬品である、
請求項３３に記載の使用。
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