CN107344925B - 氘代二苯基氨基-三氟甲基嘧啶化合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及氘代二苯基氨基‑三氟甲基嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，具体涉及式(Ⅰ)所示化合物或其药学上可接受的盐、其制备方法、其药物组合物及其在治疗细胞增殖性疾病中的用途。

Description

氘代二苯基氨基-三氟甲基嘧啶化合物

技术领域

本发明属于医药领域，涉及氘代二苯基氨基-三氟甲基嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，具体涉及式(Ⅰ)所示化合物或其药学上可接受的盐、其制备方法、其药物组合物及其在治疗细胞增殖性疾病中的用途。

背景技术

肺癌是严重威胁人类健康的重大疾病，是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有类型肺癌的85％以上。EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，也被称作HER1、ErbB1。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1)，HER2/c-neu(ErbB-2)，HER3(ErbB-3)和HER4(ErbB-4)。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170KDa。

EGFR抑制剂易瑞沙(Gefinitib)和特罗凯(Erlotinib)等已在临床治疗非小细胞肺癌病人中获得巨大成功，但其耐药问题也日益突出，耐药的主要原因是EGFR-T790M突变，约占耐药病人总数的50％。目前虽有第二代EGFR非可逆抑制剂(Canertinib、Afatinib、Neratinib、Pelitinib等)进入临床试验，但这些分子对EGFR-T790M突变体的选择性差，造成药物临床耐受剂量较低，在其最大耐受剂量下，药物无法在体内达到其有效浓度而使得对多数耐药病人无效。多数临床试验也已被迫终止。此外，皮疹和腹泻是wt-EGFR抑制剂导致的最显著毒副作用。因此开发具有高特异性EGFR-T790M突变体抑制剂已成为解决目前耐药性问题的重要策略。

2014年5月20日，克洛维斯肿瘤公司(Clovis Oncology)宣布，美国FDA授予其试验药物Rociletinib(CO-1686,AVL-301)突破性治疗药物资格，其作为单一药物二线用于治疗T790M突变患者EGFR突变非小细胞肺癌(NSCLC)。

CO-1686可用于治疗EGFR突变型NSCLC，它能够选择性抑制T790M突变型EGFR的同时使野生型EGFR信号闲置。该药开发用于携带初始激活突变EGFR及T790M突变EGFR的NSCLC患者的治疗，所有不同剂量水平均能显示出良好反应和长久益处。

氘代修饰是改进药物代谢性质的一种非常有潜力的新药开发技术。在该方法中，设法通过将一个或多个氢原子用氘原子取代从而减慢CYP介导的药物代谢或减少不期望的代谢物的生成。氘是安全、稳定、不具有放射性的同位素，与氢相比，氘与碳可以形成更强的键。在某些情况下，由氘形成的增加的键强度可以积极影响药物的ADME性质，结果可能会明显地延长其药物代谢循环、减少有毒代谢物的产生和药物间的相互作用、提高安全性以及获得更佳的疗效。

即使氘原子掺入了已知的代谢位置，氘修饰对于药物的代谢性质的影响仍然是不可预测的。因此必须经过氘代分子的实际制备和测试，才能确定氘代药物与非氘代药物在代谢方面的差别。

虽然CO-1686能够有效地抵抗T790M抗性突变，并且同时几乎不抑制wt-EGFR并且无相关的剂量限制性毒性，但是发现具有治疗细胞增值性疾病(如非小细胞肺癌)且具有很好的口服生物利用度且有成药性的新型化合物还是具有挑战性的工作。

因此，本领域仍需要开发对适用作治疗剂的突变型EGFR激酶具有选择性抑制活性或更好的药效学/药代动力学的化合物。

发明内容

本发明的目的是提供一类新型的对突变型EGFR激酶具有选择性抑制活性和具有更好药效学/药代动力学性能的化合物及其用途。

本发明一方面提供一种式(Ⅰ)所示的氘代化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃、R₁₄、R₁₅、R₁₆、R₁₇、R₁₈、R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂、R₂₃、R₂₄、R₂₅和R₂₆各自独立地为氢或氘；

R₈为三氟甲基；

R₉为氢；

附加条件是R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃、R₁₄、R₁₅、R₁₆、R₁₇、R₁₈、R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂、R₂₃、R₂₄、R₂₅和R₂₆中至少一个是氘，并且排除如下所示的化合物：

在本发明的一些实施方案中，式(Ⅰ)所示化合物的实例如下：

本发明的另一方面提供了一种治疗EGFR介导的疾病的方法，所述方法包括给予治疗有效量的式(Ⅰ)化合物或者其药学上可接受的盐。

本发明的另一个方面提供了式(Ⅰ)化合物或者其药学上可接受的盐在制备治疗EGFR介导的疾病的药物中的用途。

在本发明的部分实施方式中，所述EGFR介导的疾病选自EGFR-T790M激活突变介导的疾病。

在本发明的部分实施方式中，所述EGFR介导的疾病是癌症；所述癌症选自卵巢癌、***、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、***癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠道间质瘤、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、间皮瘤；所述肺癌可以选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌。

本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的式(Ⅰ)化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的药物组合物可通过将本发明的化合物或其盐与适宜的药学上可接受的载体组合而制备，例如可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等。

给予本发明的化合物或其药物可接受的盐或其药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、***内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。

本发明的药物组合物可以采用本领域众所周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。

对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体混合来配制该药物组合物。这些载体能使本发明的化合物被配制成片剂、丸剂、锭剂、糖衣剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、浆剂、悬浮剂等，用于对患者的口服给药。

可以通过常规的混合、填充或压片方法来制备固体口服组合物。例如，可通过下述方法获得：将所述的活性化合物与固体赋形剂混合，任选地碾磨所得的混合物，如果需要则加入其它合适的辅剂，然后将该混合物加工成颗粒，得到了片剂或糖衣剂的核心。适合的辅料包括但不限于：粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、甜味剂或矫味剂等。如微晶纤维素、葡萄糖溶液、***胶浆、明胶溶液、蔗糖和淀粉糊；滑石、淀粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸；乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇或磷酸二钙；二氧化硅；交联羧甲基纤维素钠、预交化淀粉、淀粉羟乙酸钠、藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、甲基纤维素、琼脂、羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮等。可以根据通常药物实践中公知的方法任选地对糖衣剂的核心进行包衣，尤其使用肠溶包衣。

药物组合物还可适用于肠胃外给药，如合适的单位剂型的无菌溶液剂、混悬剂或冻干产品。

本发明所述的式(Ⅰ)化合物或其药学上可接受的盐可以通过任何适用的途径和方法给药，例如通过口服或肠胃外(例如，静脉内)给药。式(Ⅰ)化合物的治疗有效量为从约0.0001到20mg/Kg体重/天，例如从0.001到10mg/Kg体重/天。

式(Ⅰ)化合物的剂量频率由患者个体的需求决定，例如，每天1次或2次，或每天更多次。给药可以是间歇性的，例如，其中在若干天的期间内，患者接受式(Ⅰ)化合物的每日剂量，接着在若干天的期间，患者不接受式(Ⅰ)化合物的每日剂量。

本发明的式(Ⅰ)化合物或者其药学上可接受的盐也可用于制备治疗心血管疾病、炎症、感染、免疫性疾病、细胞增值性疾病、病毒性疾病、代谢性疾病或器官移植的药物中的用途。

本发明的式(Ⅰ)化合物或者其药学上可接受的盐亦可与其他治疗药物联用治疗上述疾病或者延缓所述疾病的进展或发病，所述的其他治疗药物包括但并不限于：5-氟尿嘧啶、FOLFOX、阿瓦斯丁(avastin,bevacizumab)、贝沙罗汀(bexarotene)、硼替佐米(bortezomib)、骨化三醇(calcitriol)、卡奈替尼(canertinib)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、碳铂(carboplatin)、塞来考昔(celecoxib)、西妥昔单抗(cetuximab)、顺铂(cisplatin)、达沙替尼(dasatinib)、地高辛(digoxin)、埃罗替尼(Erlotinib)、依托泊甙(etoposide)、依维莫司(everolimus)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)金雀异黄素(genistein)、伊马替尼(imatinib)、依立替康(irinotecan)、拉帕替尼(lapatinib)、来那度胺(lenalidomide)、来曲唑(letrozole)、亚叶酸(leucovorin)、马妥珠单抗(matuzumab)奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(doxetaxel)、帕尼单抗(panitumumab)、PEG化的粒细胞集落剌激因子(pegfilgrastin)、PEG化的α-干扰素(peglated alfa-interferon)、培美曲塞(pemetrexed)、沙柏(satraplatin)、西罗莫司(sirolimus)、舒尼替尼(sunitinib)、舒林酸(sulindac)、泰索帝(taxotere)、替莫唑胺(temozomolomide)、驮瑞塞尔(Torisel)、替西罗莫司(temsirolimus)、替吡法尼(tipifarnib)、曲妥单抗(trastuzumab)、丙戊酸(valproicacid)、长春氟宁(vinflunine)、索拉非尼(sorafenib)、克唑替尼(crizotinib)、埃克替尼(lcotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、托法替尼(tofacitinib)、PD-0332991(palbociclib)、安贝生坦(ambrisentan)、CD40和/或CD154特异性抗体、融合蛋白、NF-kB抑制剂、非甾体抗炎药、凝血因子FXa抑制剂(如利伐沙班等)、抗-TNF抗体、抗生素药物如剌孢霉素(calicheamicin)、放线菌素(actinomycin)、阿霉素(doxorubicin)等。

有关定义：

术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

作为药学上可接受的盐，例如，与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与酸性氨基酸形成的盐等。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸等有机酸；以及脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。

本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离碱形式的这些化合物与化学计量的适当酸反应来制备。

本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。本发明的某些化合物可以以多晶或无定形形式存在。

本发明中所标记合成的化合物的任何原子若没有特别指定，可代表该原子的任何一种稳定的同位素。除非特别说明，当结构中某一位置被定义为H即氢(H-1)时，该位置仅含天然存在的同位素量。同样，除非特别说明，当结构中某一位置被定义为D即氘(H-2)时，该位置含同位素量至少比天然存在的同位素量(0.015％)大3340倍(即至少会50.1％氘同位素)。

本发明中所标记合成的化合物的氘代率是指标记合成的同位素含量与天然存在的同位素量的比值。本发明中所标记合成的化合物的每个指定氘原子的氘代率可至少为3500倍(52.5％)、至少为4000倍(60％)、至少为4500倍(67.5％)、至少为5000倍(75％)、至少为5500倍(82.5％)、至少为6000倍(90％)、至少为6333.3倍(95％)、至少为6466.7倍(97％)、至少为6566.7倍(98.5％)、至少为6600倍(99％)、至少为6633.3倍(99.5％)。

本发明中的同位素体(isotopologues)是指在化学结构方面仅有同位素组成上不同的化合物。本发明中所标记合成的化合物具有相同的化学结构、仅在其分子的原子组成中同位素的变化。因此，本发明中所标记合成的在特定位置含氘化合物也同样会含非常少的该位置的氢同位素体，本发明中所标记合成的化合物中的某位置的氢同位素体的量取决许多因素，其中包括氘代试剂(D₂O、D₂、NaBD₄、LiAlD₄等)的氘同位素纯度以及引入氘同位素合成方法的有效性。然而，如前所述这种某位置的氢同位素体的量总数将少于49.9％。本发明中所标记合成的化合物中的某位置的氢同位素体的量总数将少于47.5％、40％、32.5％、25％、17.5％、10％、5％、3％、1％或0.5％。

本发明中，任何未指定为氘的各原子以其天然同位素丰度存在。

术语“药学上可接受的载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些载体。“药学上可接受的载体”是指与活性成份一同给药的、有利于活性成份给药的惰性物质，包括但不限于国家食品药品监督管理局许可的可接受的用于人或动物(例如家畜)的任何助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、崩解剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。所述载体的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇等。关于载体的其他信息，可以参考Remington:The Science and Practice ofPharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。

术语“赋形剂”通常是指配制有效的药物组合物所需要载体、稀释剂和/或介质。

针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。

术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。

在本发明中，式Ⅰ所示化合物具对突变型EGFR激酶具有优异的选择性抑制活性，同时展现出优异的药代动力学性质。所述药代动力学性质可以通过本领域已知的实验方法得到，例如但不仅限于体外肝脏微粒体实验、大鼠体内药代动力学实验等等。

本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。

本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。涉及对水和/或氧气敏感的实验的所有操作都在预干燥玻璃仪器中于氮气氛下进行。除非另有说明，所有原料均为商业原料，并且在使用前未作进一步纯化。本发明所用柱层析采用的是青岛海洋化工所生产的硅胶(200-300目)。薄层色谱采用默克公司(E.Merck)预涂色谱板(硅胶60PF254，0.25毫米)。核磁共振光谱分析使用的仪器为瓦里安VNMRS-400共振光谱仪，化学位移以四甲基硅烷(TMS＝δ0.00)为内标，核磁共振氢谱数据的记录格式为：质子数，峰型(s，单峰；d，双重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰)，耦合常数(以赫兹Hz为单位)。

本发明采用下述缩略词：DCM代表二氯甲烷；DIPEA代表二异丙基乙基胺；PE代表石油醚；EA代表乙酸乙酯；DMSO代表二甲亚砜；DMA代表N,N-二甲基乙酰胺；TFA代表三氟乙酸。

化合物经手工或者

软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。

具体实施方式

下面的实施例可以更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1 式Ⅰ-1化合物的制备

步骤1：式2化合物(d3-间苯二胺)的制备

在35mL微波反应管中称量间苯二胺(700mg，6.47mmol)，重水(8.8mL，485mmol)，溶清后加Ru₃(CO)₁₂催化剂(11mg，16.2umol)，微波150℃反应1hr，抽滤除催化剂，旋蒸干溶剂后再重复操作，二次氘代得710mg标题化合物；

MS(ESI,[M+H]+)：112.0944；

1H‐NMR(300M，D2O)：7.05(s，1H)。

步骤2：式4化合物(1‐(4‐(4‐(4‐(2,4,6‐d‐3‐氨基苯基氨基)‐5‐(三氟甲基)嘧啶‐2‐基氨基)‐3‐甲氧基苯基)哌嗪‐1‐基)乙酮)的制备

在35mL微波反应管中称量式3化合物(710mg，1.65mmol)，d3-间苯二胺(184mg，1.65mmol)，EtOH 20mL，微波100℃反应90min，HPLC监控原料点消失，反应液制砂，DCM-MeOH洗脱(50:1到20：1)得标题化合物(500mg，0.99mmol)；

MS(ESI,[M+H]+)：505.2498；

1H-NMR(500M，DMSO-d6)：8.23(s，1H)，8.10(s，1H)，8.08(s，1H)，7.55(s，1H)，6.94(s，1H)，4.94(s，2H)，3.78(s，3H)，3.58-3.57(d，4H)，3.29(s，2H)，3.12-3.06(d，4H)，2.05(s，3H)。

步骤3：式Ⅰ-1化合物的制备

反应瓶中称量式4化合物(470mg，0.93mmol)，新蒸THF 10mL溶清，加三乙胺(141mg，1.40mmol)，N₂保护下滴加丙烯酰氯(169mg，1.86mmol)，3hr后点板原料消失，旋蒸反应液，残余物加水EA萃取，干燥旋蒸干得320mg，反应液制砂，DCM-MeOH洗脱得标题化合物(210mg，0.38mmol)；

MS(ESI,[M+H]+)：559.2978；

1H-NMR(500M，DMSO-d6)：10.1(s，1H)，8.63(s，1H)，8.28(s，1H)，8.07(s，1H)，7.49～7.55(t，J＝9.69Hz，2H)，7.24～7.29(t，J＝8.01Hz，1H)，7.15～7.17(be，1H)，6.40～6.49(dd，1H)，6.28～6.29(d，J＝1.98Hz，1H)，5.74～5.78(dd，1H)，3.77(s，3H)，3.57(s，4H)，3.07-3.01(d，4H)，2.04(s，3H)。

实施例2 式Ⅰ-2化合物的制备

步骤1：式7化合物(2-甲氧基-3,5,6-d-4-哌嗪苯胺)的制备

将式6化合物(2.5g，10.03mmol)加入三氟乙酸酐(2.5g，11.90mmol)的重水溶液中。密封管油浴加热120℃反应过夜，TLC检测反应完毕后，0℃下向反应液中加入碳酸钾固体调碱。用二氯甲烷萃取反应液，有机相合并用饱和食盐水洗，减压旋蒸后得标题化合物2.35g；

HRMS(ESI,[M+H]+)m/z：211.1638。

步骤2：式9化合物(1‐(4‐(2,5,6‐d‐3‐甲氧基‐4‐氨基苯基)哌嗪‐1‐基)乙酮)的制备

向式7化合物(1.03g，4.7mmol)的二氯甲烷溶液中加入式8化合物(0.52g，2.3mmol)。氮气保护下室温搅拌过夜，TLC检测反应完毕后向反应中加入饱和碳酸钾溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取反应液，有机相合并用饱和食盐水洗，柱层析得标题化合物0.53g；

HRMS(ESI,[M+H]+)m/z：253.1770。

步骤3：式Ⅰ-2化合物的制备。

将式10化合物(374mg，1.1mmol)和三氟乙酸(130mg，1.1mmol)加入式9化合物(330mg，1.3mmol)的1,4‐二氧六环溶液中，氮气保护下油浴加热至50℃反应过夜，HPLC监测反应完毕，向反应液中加入甲醇钠的重水溶液调碱，用DCM萃取反应液，有机相合并用饱和食盐水洗，柱层析分离得到标题化合物269mg；

HRMS(ESI,[M+H]+)m/z：558.2140；

1H‐NMR(300M，DMSO‐d6)：10.164(s,1H),8.663(br,1H),8.291(s,1H),8.089(s,1H),7.753(br,1H),7.538‐7.554(d,1H),7.257‐7.289(t,1H),7.166(br,1H),6.919(s,1H),6.420‐6.474(q,1H),6.246‐6.250(dd,1H),5.754‐5.777(dd,1H),3.779(s,3H),3.548‐3.583(br,4H),3.007‐3.070(br,4H),2.053(s,3H)。

实验例1：表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)及致癌驱动基因ALK抑制活性。

配制方法：以上样品均用DMSO配成10mM的原液。使用时用培养液配成所需浓度。

细胞株：NCI-H292细胞均购自中国科学院上海生命科学院细胞库；NCI-H3122来自美国NCI。用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基培养。

试剂及仪器：RPMI-1640购自Gibco BRL公司；胎牛血清购自Gibco公司；多功能酶标仪购自BioTek公司；SRB购自Sigma公司。

试验方法(SRB法)：应用磺酰罗丹明B蛋白染色法(Sulforhodamine B,SRB)检测药物对肿瘤细胞增殖生长的抑制作用。主要步骤如下：接种对数生长期细胞于96孔培养板，加入不同浓度的药物，每个浓度设3个复孔，同时设相应浓度的溶媒对照。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养72小时。细胞用SRB室温中染色，最后加入Tris溶液溶解，酶标仪(BioTek)510nm波长下测定OD值，以下列公式计算细胞生长抑制率：

抑制率＝(OD值_对照孔－OD值_给药孔)/OD值_对照孔×100％。

根据各浓度抑制率，根据非线性回归方法计算半数抑制浓度IC₅₀。

实验例2：对体外培养人肺腺癌H1975(T790M)细胞增殖的影响。

细胞株：H1975细胞购自中国科学院上海生命科学院细胞库，用含10％胎牛血清(FBS)的PRIM 1640培养基培养。

试剂及仪器：PRIM 1640购自Gibco BRL公司；胎牛血清购自Hyclone公司；多功能酶标仪购自BioTek公司；SRB购自Sigma公司。

试验方法(SRB法)：应用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)蛋白染色法检测药物对肿瘤细胞增殖生长的抑制作用。主要步骤如下：

接种对数生长期细胞于96孔培养板，加入不同浓度(1-10000nM)的药物，每个浓度设3个复孔，同时设相应浓度的溶媒对照。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养72小时。细胞用SRB室温中染色，最后加入Tris溶液溶解，酶标仪(BioTek)510nm波长下测定OD值，以下列公式计算细胞生长抑制率：

抑制率＝(OD值_对照孔－OD值_给药孔)/OD值_对照孔×100％。

根据各浓度抑制率，根据非线性回归方法计算半数抑制浓度IC₅₀。

Claims (2)

1.下述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症的药物中的用途，所述癌症选自卵巢癌、***、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、***癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝细胞癌、胃肠道间质瘤、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、间皮瘤，

2.下述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症的药物中的用途，所述癌症选自肺癌，所述肺癌选自小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌，