CN113939284A - 对携带egfr或her2外显子20***的癌细胞具有抗肿瘤活性的化合物 - Google Patents

对携带egfr或her2外显子20***的癌细胞具有抗肿瘤活性的化合物 Download PDF

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Abstract

本公开提供了通过施用第三代酪氨酸激酶抑制剂如波齐替尼或阿法替尼来治疗被确定具有EGFR和/或HER2外显子20突变如***突变的患者的癌症的方法。

Description

对携带EGFR或HER2外显子20***的癌细胞具有抗肿瘤活性的 化合物
本申请要求2019年3月29日提交的美国临时专利申请第62/826,843号的权益，所述申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表的并入
随附的包含在命名为“UTFCP1383WO.txt”的文件中、3.59KB(在MicrosoftWindows中测量)并创建于2020年3月27日的序列表通过电子递交并通过引用并入本文。
背景
本发明是在美国国立卫生研究院授予的资助号CA190628的政府支持下完成的。政府对本发明享有特定权利。
1.领域
本发明大体上涉及分子生物学和医药领域。更特别的是，本发明涉及治疗具有EGFR和/或HER2外显子20突变，例如***突变的患者的方法。
2.相关技术的描述
大约10-15％的NSCLC携带激活性EGFR突变。对于肿瘤具有“典型”致敏突变(L858R和外显子19缺失)的这些患者中的大多数，例如吉非替尼和厄洛替尼的TKI提供了巨大的临床效益，大约70％的患者有客观反应(OR)，与单纯化疗相比提高了无进展生存期(PFS)和生活质量(Maemondo等人，2010)。然而，大约10-12％的EGFR突变NSCLC肿瘤在EGFR的外显子20内具有符合读框的(in-frame)***(Arcila等人，2012年)，并且通常对EGFR TKI耐药。此外，NSCLC中90％的HER2突变是外显子20突变(Mazieres等人，2013)。EGFR和HER2外显子20突变共占NSCLC患者的约4％。迄今为止的数据表明，HER2的现有TKI(阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、达克替尼(dacomitinib))对具有HER2突变肿瘤的患者的活性有限，许多研究报告的OR低于40％(Kosaka等人，2017)，尽管在用阿法替尼治疗的HER2小鼠模型中观察到一些临床前活性(Perera等人，2009)。
EGFR和HER2的外显子20包含两个主要区域，即c-螺旋(EGFR中的残基762-766，和HER2中的残基770-774)和c-螺旋之后的环(EGFR中的残基767-774，和HER2中的残基775-783)。EGFR外显子20***D770insNPG的晶体学揭示了稳定的脊状活性构象，在残基764后的***诱导对第一代TKI的耐药性。然而，对EGFR A763insFQEA的建模表明，残基764之前的***不会表现出这种效果，也不会诱发耐药性(Yasuda等人，2013)。此外，在EGFR外显子20驱动的NSCLC的患者来源的异种移植(PDX)模型中，如果***位于c-螺旋之后的环中(EGFRH773insNPH)，则发现第三代EGFR TKI，即奥希替尼(osimertinib)(AZD9291)和诺司替尼(rociletinib)(CO-1696)的活性最小(Yang等人，2016)。在最近一项对罕见EGFR和HER2外显子20突变的研究中，作者发现对基于共价喹唑啉的第二代抑制剂如达克替尼和阿法替尼有异质性反应；然而，靶向更常见的外显子20***突变所需的浓度高于临床可达到的浓度(Kosaka等人，2017)。因此，临床上非常需要鉴定新的疗法来克服在EGFR和HER2中携带外显子20突变，特别是***突变的NSCLC肿瘤的先天性耐药性。
发明内容
本公开的实施方案提供了治疗具有EGFR和/或HER2外显子20突变，例如外显子20***突变的患者的癌症的方法和组合物。在一个实施方案中，提供了一种治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的波齐替尼(poziotinib)，其中该受试者已被确定具有一个或多个EGFR外显子20突变，例如一个或多个EGFR外显子20***突变。在特定方面，受试者是人。
在一些方面，波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。在某些方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变被进一步确定为原发性(denovo)EGFR 20***突变。
在某些方面，一个或多个EGFR外显子20突变包括氨基酸763-778之间的一个或多个点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。在一些方面，受试者已被确定为具有2、3或4个EGFR外显子20突变。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变在一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773、V774和R776组成的组的残基处。
在某些方面，受试者已被确定在残基C797和/或T790处没有EGFR突变，如C797S和/或T790M。在一些方面，一个或多个外显子20突变选自由A763insFQEA、A763insLQEA、A767insASV、S768dupSVD、S768I、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insY H773Y、N771insSVDNR、N771insHH、N771dupN、P772insDNP、H773insAH、H773insH、V774M、V774insHV、R776H和R776C组成的组。在特定方面，外显子20突变是A763insFQEA、A767insASV、S768dupSVD、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH和/或N771dupNPH。
在一些方面，受试者对先前施用的酪氨酸激酶抑制剂有耐药性或表现出耐药性。在某些方面，酪氨酸激酶抑制剂是拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、依鲁替尼(ibrutinib)、纳扎替尼(nazartinib)或来那替尼。
在某些方面，波齐替尼被口服施用。在一些方面，波齐替尼以5-25mg，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg的剂量施用。在某些方面，波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。在一些方面，波齐替尼被每天施用。在某些方面，波齐替尼被连续施用。在一些方面，波齐替尼以28天的周期施用。
在某些方面，通过分析来自受试者的基因组样品，确定受试者具有EGFR外显子20突变，如***突变。在一些方面，基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。在特定方面，通过核酸测序(例如，对肿瘤组织或血浆中的循环游离DNA的DNA测序)或PCR分析来确定EGFR外显子20突变的存在。
在某些方面，所述方法还包括施用另外的抗癌疗法。在一些方面，抗癌疗法是化疗、放疗、基因疗法、手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。在某些方面，波齐替尼和/或抗癌疗法被静脉内、皮下、骨内、口服、经皮、以持续释放剂、以控制释放剂、以延迟释放剂、作为栓剂或舌下施用。在一些方面，施用波齐替尼和/或抗癌疗法包括局部(local)、区域性(regional)或全身施用。在特定方面，波齐替尼和/或抗癌疗法被施用两次或更多次，如每天、每隔一天或每周。
在一些方面，癌症是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠道癌、中枢或外周神经***组织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血***癌、胶质瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆管癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李-法美尼肿瘤(Li-Fraumeni tumor)、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺肿瘤、成骨肉瘤、多发性神经内分泌肿瘤I型和II型、乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、食道癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在特定方面，癌症是非小细胞肺癌。
在另一个实施方案中，提供了一种包含波齐替尼的药物组合物，用于被确定具有一个或多个EGFR外显子20突变，如一个或多个EGFR外显子20***突变的患者。在某些方面，一个或多个EGFR外显子20突变包括氨基酸763-778之间的点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。在某些方面，受试者已被确定为具有2、3或4个EGFR外显子20突变。
在一些方面，波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。在某些方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变被进一步确定为原发性EGFR 20***突变。
在一些方面，波齐替尼被口服施用。在一些方面，波齐替尼以5-25mg，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg的剂量施用。在一些方面，波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。在某些方面，波齐替尼被每天施用。在一些方面，波齐替尼被连续施用。在一些方面，波齐替尼以28天的周期施用。
在一些方面，受试者对先前施用的酪氨酸激酶抑制剂有耐药性或表现出耐药性。在某些方面，酪氨酸激酶抑制剂是拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、依鲁替尼、纳扎替尼或来那替尼。
在一些方面，一个或多个EGFR外显子20***突变在一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772和H773组成的组的残基处。在某些方面，受试者已被确定为在残基C797和/或T790处没有EGFR突变，如C797S和/或T790M。在特定方面，一个或多个外显子20突变选自由A763insFQEA、A763insLQEA、A767insASV、S768dupSVD、S768I、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insY H773Y、N771insSVDNR、N771insHH、N771dupN、P772insDNP、H773insAH、H773insH、V774M、V774insHV、R776H和R776C组成的组。在一些方面，患者正被抗癌疗法治疗。
在又一个实施方案中，提供了一种预测患有癌症的受试者对单独的波齐替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼的反应的方法，包括在从所述患者获得的基因组样品中检测EGFR外显子20突变(例如，EGFR外显子20***突变)，其中如果所述品对EGFR外显子20突变的存在呈阳性，则所述患者被预测为对单独的波齐替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼具有良好反应。在一些方面，基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。在某些方面，通过核酸测序或PCR分析确定EGFR外显子20突变的存在。在某些方面，EGFR外显子20突变包括氨基酸763-778之间的一个或多个点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。在一些方面，EGFR外显子20突变在残基A763、H773、A767、S768、V769、D770、N771和/或D773处。在一些方面，EGFR外显子20突变选自由A763insFQEA、A767insASV、S768dupSVD、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH和N771dupNPH组成的组。
在某些方面，对单独的波齐替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼抑制剂的良好反应包括减小肿瘤尺寸或负荷、阻断肿瘤生长、减少肿瘤相关疼痛、减少癌症相关病理学、减少癌症相关症状、癌症无进展、增加无病间隔期、距进展的时间增加、诱导缓解、减少转移或增加患者存活。在其他方面，对被预测具有良好反应的患者施用单独的波齐替尼或与另一种抗癌疗法组合的波齐替尼。
在一些方面，波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。在某些方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变被进一步确定为原发性EGFR 20***突变。
在一些方面，波齐替尼被口服施用。在一些方面，波齐替尼以5-25mg，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg的剂量施用。在一些方面，波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。在某些方面，波齐替尼被每天施用。在一些方面，波齐替尼被连续施用。在一些方面，波齐替尼以28天的周期施用。
在一些方面，受试者对先前施用的酪氨酸激酶抑制剂有耐药性或表现出耐药性。在某些方面，酪氨酸激酶抑制剂是拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、依鲁替尼、纳扎替尼或来那替尼。
另一个实施方案提供了一种治疗患者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的波齐替尼或阿法替尼，其中受试者已被确定具有一个或多个HER2外显子20突变，所述突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776C V777insC、G776delinsVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS、V773M、Y772dupYVMA、G776delinsLC、G778dupGSP、V777insCG、G776V/S、V777M、M774dupM、A775insSVMA、A775insVA和L786V组成的组。在一些方面，一个或多个HER2外显子20突变另外包括氨基酸770-785之间的一个或多个点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。在一些方面，一个或多个HER2外显子20突变位于残基Y772、A775、M774、G776、G778、V777、S779、P780和/或L786处。在一些方面，一个或多个HER2外显子20突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776CV777insV、G776C V777insC、G776del insVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS和V773M组成的组。在一些方面，HER2外显子20突变位于残基V773、A775、G776、S779、G778和/或P780处。在特定方面，受试者是人。
在一些方面，波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。在某些方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变被进一步确定为原发性EGFR 20***突变。
在一些方面，波齐替尼被口服施用。在一些方面，波齐替尼以5-25mg，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg的剂量施用。在一些方面，波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。在某些方面，波齐替尼被每天施用。在一些方面，波齐替尼被连续施用。在一些方面，波齐替尼以28天的周期施用。
在一些方面，受试者对先前施用的酪氨酸激酶抑制剂有耐药性或表现出耐药性。在某些方面，酪氨酸激酶抑制剂是拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、依鲁替尼、纳扎替尼或来那替尼。
在一些方面，所述方法还包括施用mTOR抑制剂。在某些方面，mTOR抑制剂是雷帕霉素(rapamycin)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)或MLN4924。在特定方面，mTOR抑制剂是依维莫司。
在某些方面，波齐替尼或阿法替尼和/或mTOR抑制剂被静脉内、皮下、骨内、口服、经皮、以持续释放剂、以控制释放剂、以延迟释放剂、作为栓剂或舌下施用。在一些方面，通过分析来自患者的基因组样品确定患者具有HER2外显子20突变。在某些方面，基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。在一些方面，通过核酸测序或PCR分析确定HER2外显子20突变的存在。
在额外方面，所述方法还包括施用另外的抗癌疗法。在一些方面，抗癌疗法是化疗、放疗、基因疗法、手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。
在一些方面，癌症是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠道癌、中枢或外周神经***组织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血***癌、胶质瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆管癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李-法美尼肿瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺肿瘤、成骨肉瘤、多发性神经内分泌肿瘤I型和II型、乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、食道癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方面，癌症是非小细胞肺癌。
在另一个实施方案中，提供了一种包含波齐替尼或阿法替尼的药物组合物，用于被确定具有一个或多个HER2外显子20突变的患者，所述突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776C V777insC、G776del insVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS、V773M、Y772dupYVMA、G776del insLC、G778dupGSP、V777insCG、G776V/S、V777M、M774dupM、A775insSVMA、A775insVA和L786V组成的组。在一些方面，一个或多个HER2外显子20突变还包括氨基酸770-785之间的一个或多个点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。在一些方面，一个或多个HER2外显子20突变位于残基Y772、A775、M774、G776、G778、V777、S779、P780和/或L786处。在一些方面，一个或多个HER2外显子20突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776C V777insC、G776del insVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS和V773M组成的组。在一些方面，HER2外显子20突变位于残基V773、A775、G776、S779、G778和/或P780处。在一些方面，患者正被抗癌疗法治疗。
在一些方面，波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。在某些方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变被进一步确定为原发性EGFR 20***突变
在一些方面，波齐替尼以5-25mg，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg的剂量包括在组合物中。在一些方面，波齐替尼的剂量为8mg、12mg或16mg。
在一些方面，受试者对先前施用的酪氨酸激酶抑制剂有耐药性或表现出耐药性。在某些方面，酪氨酸激酶抑制剂是拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、依鲁替尼、纳扎替尼或来那替尼。
在又一个实施方案中，提供了一种预测患有癌症的患者对单独的波齐替尼或阿法替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼或阿法替尼的反应的方法，包括在从所述患者获得的基因组样品中检测HER2外显子20突变(例如，HER2外显子20***突变)，所述突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776C V777insC、G776del insVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS、V773M、Y772dupYVMA、G776del insLC、G778dupGSP、V777insCG、G776V/S、V777M、M774dupM、A775insSVMA、A775insVA和L786V组成的组，其中如果所述样品对HER2外显子20突变的存在呈阳性，则所述患者被预测为对单独的波齐替尼或阿法替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼或阿法替尼具有良好反应。在一些方面，一个或多个突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776C V777insC、G776delinsVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS和V773M组成的组。在一些方面，HER2外显子20突变还包括氨基酸770-785之间的一个或多个点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。在某些方面，HER2外显子20突变位于残基V773、A775、G776、V777、G778、S779和/或P780处。在其他方面，HER2外显子20突变位于残基A775、G776、S779和/或P780处。
在一些方面，基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。在某些方面，通过核酸测序或PCR分析确定HER2外显子20突变的存在。在特定方面，抗癌疗法是mTOR抑制剂。在一些方面，对单独的波齐替尼或阿法替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼或阿法替尼抑制剂的良好反应包括减小肿瘤尺寸或负荷、阻断肿瘤生长、减少肿瘤相关疼痛、减少癌症相关病理学、减少癌症相关症状、癌症无进展、增加无病间隔期、距进展的时间增加、诱导缓解、减少转移或增加患者存活。在其他方面，被预测具有良好反应的患者施用单独的波齐替尼或阿法替尼或与另一种抗癌疗法组合的波齐替尼。
本文还提供了一种组合物，包括从人癌细胞中分离的核酸，以及能够扩增人EGFR或HER2编码序列的外显子20的至少第一部分的引物对。在一些方面，所述组合物还包括标记的探针分子，当人EGFR或HER编码序列中存在突变时，所述标记的探针分子可以特异性地与该序列的外显子20的第一部分杂交。在某些方面，所述组合物还包括热稳定的DNA聚合酶。在一些方面，所述组合物还包括dNTP。在一些方面，当存在选自由A763insFQEA、A763insLQEA、A767insASV、S768dupSVD、S768I、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insY H773Y、N771insSVDNR、N771insHH、N771dupN、P772insDNP、H773insAH、H773insH、V774M、V774insHV、R776H和R776C组成的组的突变时，标记的探针与人EGFR编码序列的外显子20的第一部分杂交。
在某些方面，当存在选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776CV777insV、G776C V777insC、G776del insVV、G776del insVC和P780insGSP组成的组的突变时，标记的探针与人HER2编码序列的外显子20的第一部分杂交。
在另一个实施方案中，提供了一种编码突变EGFR蛋白的分离核酸，其中所述突变蛋白与野生型人EGFR的不同之处在于一个或多个EGFR外显子20突变，所述突变包括在氨基酸763-778之间的点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。在一些方面，一个或多个EGFR外显子20突变在一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773、V774和R776组成的组的残基处。在某些方面，一个或多个外显子20突变选自由A763insFQEA、A763insLQEA、A767insASV、S768dupSVD、S768I、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insY H773Y、N771insSVDNR、N771insHH、N771dupN、P772insDNP、H773insAH、H773insH、V774M、V774insHV、R776H和R776C组成的组。在特定方面，核酸包含SEQ ID NO:8、9、10、11或12的序列。
在另一个实施方案中，提供了一种编码突变HER2蛋白的分离核酸，其中所述突变蛋白与野生型人HER2的不同之处在于一个或多个HER2外显子20突变，所述突变包括氨基酸770-785之间的点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。在一些方面，一个或多个HER2外显子20突变位于残基V773、A775、G776、V777、G778、S779和/或P780处。在某些方面，一个或多个HER2外显子20突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776CV777insC、G776del insVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS和V773M组成的组。在特定方面，核酸包含SEQ ID NO:14、15、16、17或18的序列。
本发明的其他目标、特征和优点将根据以下详细说明变得明显。然而，应了解虽然指示了本发明的优选实施方案，但是该详细说明和具体实施例仅以示例的方式被提供，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改将根据该详细说明而对于本领域技术人员变得明显。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步展示本发明的特定方面。通过参考这些附图中的一或多个以及本文呈现的具体实施方案的详细说明，可以更好地理解本发明。
图1A-1J：外显子20***突变诱导对共价和非共价TKI的原发耐药性。(图1A)具有典型突变和外显子20EGFR突变的患者的无进展生存期(PFS)显示对一线疗法的耐药性。具有外显子20***的患者的百分比存活率降低。(图1B)在稳定的Ba/F3模型中产生的EGFR和HER2外显子20***突变的示意图。表达EGFR(图1C-E)和(图1F-H)HER2外显子20***突变的Ba/F3细胞系用第一代、第二代和第三代TKI治疗72小时的细胞成活力的剂量反应曲线。(图1C-H)对于每种浓度(n＝3)绘制了6个细胞系的平均值±SEM。(图1I)EGFR D770insNPG和T790M的3-D建模。P环和α-c螺旋向结合口袋的移动导致空间位阻，从而将AZD9291推出结合口袋。(图1J)HER2 A775insYVMA和WT的3-D建模。P环和α-c螺旋向结合口袋的整体移动导致结合口袋尺寸的整体降低。
图2A-2G：波齐替尼有效抑制EGFR和HER2外显子20***突变。表达EGFR(图2A)和HER2(图2B)外显子20***突变的Ba/F3细胞系用波齐替尼治疗72小时的细胞成活力的剂量反应曲线。对于每种浓度(n＝3)绘制了每个单独的细胞系的平均值±SEM。(图2C)蛋白质印迹法证实在波齐替尼治疗2小时后，Ba/F3细胞系的p-EGFR和p-HER2受到抑制(n＝2)。(图2D)Ba/F3 EGFR外显子20***位置与氨基酸位置的相关性(n＝2)。使用GraphPad Prism确定皮尔森相关性(pearson correlation)和p值。(图2E)表达EGFR A767dupASV的患者来源细胞系CUTO14和(图2F)表达EGFR N771del insFH的YUL0019用波齐替尼或阿法替尼治疗72小时的细胞成活力的剂量反应曲线(n＝3)。(图2F)与阿法替尼、奥希替尼、诺司替尼或波齐替尼一起孵育72小时后，针对Ba/F3 EGFR T790M细胞系的IC50值归一化的EGFR突变型Ba/F3细胞的IC50值(n＝3)。(图2G)线条代表平均值±SEM。大于1的数值表明与T790M相比，抑制作用较弱，而小于1的数值表明与T790M相比，对外显子20***的抑制作用更强。
图3A-3H：波齐替尼降低EGFR和HER2外显子20***突变小鼠模型的肿瘤负荷。EGFRD770insNPG(图3A)或HER2 A775insYVMA(图3B)小鼠用溶媒(EGFR n＝5，和HER2 n＝4)、20mg/kg的阿法替尼(EGFR n＝4)或10mg/kg的波齐替尼(EGFR n＝5，和HER2 n＝6)每天治疗，持续4周。通过MRI测量的肿瘤体积变化的瀑布图显示，在EGFR和HER2 GEMM中，4周时波齐替尼的肿瘤抑制率分别为85％和60％。(图3A-3B)使用双侧学生t检验来计算p值。EGFR(图3C)和HER2(图3D)GEMM在4周波齐替尼治疗之前和之后的代表性MRI图像显示了稳健的肿瘤消退。用10mg/kg的波齐替尼(5天/周)治疗12周的EGFR D770insNPG(图3E)(n＝4)和HER2 A775insYVMA(图3F)(n＝6)的肿瘤体积图显示了小鼠继续对波齐替尼治疗有反应。(图3G)用阿法替尼或波齐替尼治疗的YUL-0019(EGFR N771delinsFH)细胞。用10mg/kg波齐替尼治疗的细胞具有最小的肿瘤体积，用5mg/kg波齐替尼治疗的细胞具有第二小的肿瘤体积。(图3H)EGFR H773insNPH PDX小鼠用溶媒对照(n＝6)、5mg/kg(n＝6)或10mg/kg(n＝3)的波齐替尼治疗。用波齐替尼治疗的小鼠的肿瘤体积减小。瀑布图表明，在所有波齐替尼治疗的小鼠中，肿瘤负荷减少了>85％，而在9只波齐替尼治疗的小鼠中，有8只的异种移植物完全减小成残留的小团(residual bolus)。单因素ANOVA分析与Tukey检验组合用以确定统计显著性，***，P<0.0001。
图4A-4C：EGFR和HER2外显子20***突变是激活突变。(图4A)具有EGFR外显子20***的个体患者的瀑布图显示对厄洛替尼、吉非替尼或阿法替尼的原发耐药性。患者突变列在每个代表线条下面。(图4B)表达EGFR外显子20***突变的稳定Ba/F3细胞系在不依赖于IL-3的条件下是有活力的，这与表达Ba/F3空载体的细胞或表达EGFR WT的Ba/F3细胞不同，表明EGFR外显子20***是激活突变。(图4C)11个表达不同HER2突变的稳定Ba/F3细胞系的不依赖于IL-3的生长显示，大多数HER2激活突变都在HER2的外显子20内。除L755P外，所有激活突变都是HER2外显子20***突变。图4B-4C)细胞成活力通过Cell Titer Glo分析法确定。对于每个细胞系(n＝3)绘制了平均值±SEM。
图5：表达EGFR外显子20***突变的单独Ba/F3细胞系用第一代、第二代和第三代TKI治疗72小时的细胞成活力的剂量反应曲线。对于每种浓度(n＝3)绘制了平均值±SEM。
图6：表达HER2外显子20***突变的单独Ba/F3细胞系用第一代、第二代和第三代TKI治疗72小时的细胞成活力的剂量反应曲线。对于每种浓度(n＝3)绘制了平均值±SEM。
图7A-7D：残基A763之后的EGFR和HER2外显子20***突变对第一代和第三代TKI有耐药性。具有EGFR外显子20***的Ba/F3细胞进行血清饥饿1小时，然后用所示剂量的(图7A)厄洛替尼或(图7C)奥希替尼治疗2小时(N＝2)。(图7B)厄洛替尼治疗和(图7D)奥希替尼治疗后的p-EGFR和p-HER2水平使用Photoshop进行定量。在Graphpad Prism中对数值作图，并且线条代表平均值±SEM。(N＝2)p<0.05(*)，p<0.01(**)或p<0.001(***)。
图8A-8E：EGFR和HER2外显子20***突变在体外对波齐替尼敏感。(图8A)波齐替尼对所示Ba/F3细胞系治疗2小时后p-EGFR和p-HER2的蛋白质印迹使用Photoshop进行定量。在Graphpad Prism对数值作图，并且线条代表平均值±SEM。(N＝2)(图8B)CUTO-14患者来源的细胞系在所示剂量的阿法替尼或波齐替尼(N＝3)治疗3小时后的蛋白质印迹。(图8C)使用所示剂量的阿法替尼或波齐替尼对CUTO-14细胞系治疗3小时后，从蛋白质印迹中定量p-EGFR。波齐替尼治疗导致p-EGFR降低。(图8D)IC50值与Ba/F3细胞系的相对表达的线性回归图表明，表达与对波齐替尼的敏感性之间没有相关性(n＝2)。(图8E)IC50值与HER2受体内突变位置的线性回归图表明，在HER2突变型Ba/F3细胞系(n＝2)中，位置与对波齐替尼的敏感性之间没有相关性。使用GraphPad prism计算皮尔森相关性和p值。p<0.05(*)，p<0.01(**)或p<0.001(***)。
图9：C797S和EMT是体外波齐替尼耐药的两种不同的机制。用波齐替尼治疗72小时的EGFR突变型Ba/F3细胞系的细胞成活力的剂量反应曲线。对于每种浓度(n＝3)绘制了平均值±SEM。
图10：用所示TKI治疗的MCF10A HER2 G776del insVC细胞系的细胞成活力的剂量反应曲线。
图11A-11D：(图11A-11B)用波齐替尼或指定的TKI治疗72小时的EGFR突变型Ba/F3细胞系的细胞成活力的剂量反应曲线。(图11C-11D)用波齐替尼或所示KI治疗72小时的包括耐药突变的EGFR突变型Ba/F3细胞系的细胞成活力的剂量反应曲线。
图12：用波齐替尼或所示TKI治疗72小时的HER2突变型Ba/F3细胞系的细胞成活力的剂量反应曲线。
图13A-13B：HER2突变发生在多种癌症类型中，突变热点遍布该受体发生。按癌症区分的HER2突变(A)和HER2外显子20突变(B)频率的加权平均值的条形图。线条代表加权平均值±SEM。点的尺寸代表每个数据库中的患者数量。将Guardant Health报道的通过cfDNA检测到的HER2突变频率针对如Odegaard等人2018年报道的临床敏感性标准化。
图14A-14H：HER2突变热点因癌症类型而异。在cBioportal和MD Anderson数据库中报道的(A)所有癌症(N＝2338)、(B)肺癌(N＝177)、(C)乳腺癌(N＝143)和(D)结肠直肠癌(N＝219)中HER2突变位置的频率的饼图。(E)cBioPortal和MD Anderson中报道的所有癌症中10种最常见HER2突变的棒棒糖图(N＝2338HER2突变)。线条的长度与突变频率有关。(E-H)cBioPortal和MD Anderson数据库中的NSCLC(F，N＝177)、乳腺癌(G，N＝143)和结肠直肠癌(H，N＝219)中10个最常见的HER2突变的棒棒糖图；线条的长度与报道的突变频率有关。
图15A-15C：酪氨酸激酶结构域中最常见的HER2变体是激活突变。表达HER2外显子19(A)、HER2外显子20(B)和HER2外显子21(C)突变的稳定Ba/F3细胞系在无IL-3条件下生长14天的细胞成活力。通过Cell Titer Glo分析法每3天测定一次细胞成活力。对每个细胞系的平均值±SEM作图(n＝3个生物学独立实验)。
图16A-16F：波齐替尼是针对Ba/F3细胞中的HER2突变测试的最有效的抑制剂。(A)在GraphPad中计算的在药物治疗72小时后稳定表达所示突变的Ba/F3细胞中药物的logIC50值的热图。通过Cell Titer Glo分析法测定细胞成活力(N≥3)。在用阿法替尼、来那替尼、他索替尼-TKI或波齐替尼进行药物治疗72小时后，所有表达HER2突变的Ba/F3细胞系(B)、HER2外显子19突变型细胞系(C)、HER2外显子20突变型细胞系(D)或HER2外显子21突变型细胞系(E)的平均IC50值。线条代表平均值±SEM(N≥3)。(C-E)使用邓恩多重比较检验的单因素ANOVA用于确定组之间的统计学显著性。(F)在使用所示抑制剂的情况下，表达L755S或L755P的Ba/F3细胞的平均IC50值。点代表平均值±SEM(N≥3)。通过配对t检验确定统计学显著性。
图17A-17D：HER2突变体的分子动力学模拟揭示Y772dupYVMA和L755P突变的药物敏感性降低的可能机制。(A)150ns加速分子动力学模拟期间HER2V777L和Y772dupYVMA外显子20突变体的α-C-螺旋位置。(B)HER2外显子20突变体呈α-C-螺旋“内”构象与α-C-螺旋“外”构象的分子动力学快照的群体百分比。(C)V777L和Y772dupYVMA突变体的分子动力学快照。P-环和激酶铰链构象有微小差异，但α-C-螺旋位置有显著偏移。(D)L755P和L755SHER2突变体的分子动力学快照。L755P突变体缺乏与V790的主链氢键，导致激酶铰链不稳定和P-环朝结合位点收缩。
图18A-18F：表达HER2突变的人细胞系对波齐替尼也最敏感。表达外显子20***突变，HER2 G776delinsVC(A)、HER2 Y772dupYVMA(B)、HER2G778dupGSP(C)的MCF10A细胞用所指示的定抑制剂处理72小时的剂量反应曲线。(D)MCF10A HER2选择性指数的柱状图。对于每种所指示药物，将突变细胞系的IC50值除以表达HER2 WT的细胞系的平均IC50值。点代表每种细胞系的平均值±SEM，条代表所有三种细胞系的平均值±最小值/最大值(每种细胞系N≥3)。(E)携带HER2外显子19突变L755S的CW-2大肠细胞用所指示抑制剂处理72小时的剂量反应曲线。(A-C,E)曲线代表平均值±SEM，N＝3。(F)第21天时CW-2肿瘤体积的柱状图。用溶媒对照(N＝5)、30mg/kg来那替尼(N＝5)、20mg/kg阿法替尼(N＝5)或5mg/kg波齐替尼(N＝5)治疗小鼠，5天/周，且随机取虚线表示的350mm3肿瘤。点代表单个肿瘤，条代表平均值±SEM。采用单因素ANOVA确定统计学意义。
图19A-19D：具有HER2突变的NSCLC患者对波齐替尼具有42％的确定反应率。(A)临床试验NCT03066206中前12个HER2外显子20患者的反应的瀑布图。示出了客观部分反应(从左起：第7、8、10、11和12条)，示出了未确定的反应(第9条)，示出了疾病稳定(第3-6条)，且示出了疾病进展(第1-2条)。(B)前12例HER2外显子20患者的无进展生存期的Kaplan-meier图显示，截至2018年12月，mPFS为5.6个月。(C)具有HER2 Y772dupYVMA突变的患者在波齐替尼治疗前1天和治疗后8周的CT扫描。(D)具有HER2 L755P突变性NSCLC的患者在波齐替尼治疗前1天和治疗后4周的PET扫描。患者以前经过铂基化疗联合曲妥珠单抗、纳武单抗和抗TDM1治疗并进展，但使用波齐替尼治疗后靶病变减少了12％。
图20A-20G：波齐替尼治疗诱导细胞表面的HER2蓄积，并且波齐替尼和T-DM1联合治疗增强了抗肿瘤活性。(A)在10nM波齐替尼处理24小时后，表达HER2 Y772dupYVMA、HER2G778dupGSP和HER2 G776delinsVC的MC10A细胞系上HER2受体表达的FACS分析。条代表平均值±SEM，通过学生t检验确定了DMSO和波齐替尼处理组之间的显著差异。(B)表达HER2Y772dupYVMA、HER2 G778dupGSP和HER2 G776delinsVC的MCF10A细胞系经波齐替尼、T-DM1或波齐替尼和指定剂量的T-DM1处理后的IC50值的柱状图。条代表平均值±SEM(n＝3个独立实验)，通过单因素ANOVA和事后邓恩多重比较确定了显著差异。(C)用所指示抑制剂治疗的HER2 Y772dupYVMA NSCLC PDX的肿瘤生长曲线。波齐替尼治疗每周施用5天，T-DM1在治疗开始时施用1次。(D)无进展生存期(PFS)的Kaplan-Meier曲线，其中PFS定义为自最佳反应的肿瘤倍增。采用Mantel-Cox对数秩检验确定组间的显著差异。在实施安乐死时，对小鼠进行检查。(E)用所指示抑制剂治疗的小鼠在第15天肿瘤体积百分比变化的点图。(F)第15天和第45天各组荷瘤小鼠数量的图表。(G)用所指示抑制剂治疗的HER2 Y772dupYVMA小鼠的肿瘤体积蜘蛛图。红色虚线指示随机化取的点(300mm3)。
图21A-21D：在Guardant、cBioPortal和MD Anderson数据库中，外显子20***突变多样性因癌症类型而异。所有癌症类型，N＝517(A)中HER2外显子20***突变频率的饼图。进一步按癌症类型：(B)肺癌，N＝362，(C)乳腺癌，N＝30，(D)其他癌症，N＝125分析了外显子20***突变的频率。
图22A-22B：常见的HER2突变是组成型磷酸化，且p-HER2表达与药物敏感性无关。(A)通过采用ELISA法确定的p-HER2与总HER2的比值确定相对p-HER2表达。条代表平均值±SEM，且n＝3。ND＝低于检测限。(B)针对Ba/F3HER2突变细胞系，绘制了相对HER2与波齐替尼IC50值的相关性。Pearson相关性和p值通过GraphPad Prism(n＝3)确定。
图23A-23B：分子建模显示HER2突变体的结合口袋尺寸不同。(A)HER2激酶结构域外显子19、20和21蛋白骨架分别呈蓝色、粉红色和橙色。模板X射线结构(PDB 3PP0)中的配体呈绿色棒状，并提供了突变残基/***位置的标记。(B)来自加速分子动力学模拟的HER2突变体的结合口袋体积的曲线。
图24：波齐替尼抑制HER2突变细胞系中的p-HER2。使用所指示药物和剂量治疗2小时后，表达G776delinsVC的MCF10A细胞的蛋白质印迹。
图25：波齐替尼抑制外显子19突变结肠直肠癌异种移植物的肿瘤生长。将携带HER2 L755S突变的CW-2细胞注射到6周龄雌性nu/nu裸鼠的侧腹。当肿瘤达到350mm3时，将小鼠随机分配到4个组：20mg/kg阿法替尼、5mg/kg波齐替尼、30mg/kg来那替尼或溶媒对照。每周测量三次肿瘤体积，小鼠在周一至周五(每周5天)接受药物。符号代表每个时间点的平均值±SEM。采用双因素ANOVA和Tukey多重比较检验确定统计显著性。星号指示溶媒与波齐替尼或来那替尼之间的显著差异。从首次检测到显著差异的第10天开始，在其下方列出了每次比较的p值。
图26：波齐替尼在EGFR S768dupSVD PDX模型中比高剂量奥希替尼更有效。6-8周龄的雌性NSG小鼠被植入携带EGFR S768dupSVD突变的患者NSCLC肿瘤片段，并且当肿瘤达到300mm3时，小鼠被随机分为4组：溶媒对照、波齐替尼2.5mg/kg、奥希替尼5mg/kg或奥希替尼25mg/kg。每周对小鼠施用药物5天，并每周测量肿瘤体积三次。符号代表每个时间点肿瘤体积的平均值±SEM。点图代表第21天平均肿瘤体积的百分比变化，其中每个点代表单只小鼠。
图27：在携带Y772dupYVMA的NSCLC的PDX模型中，波齐替尼具有比来那替尼更高的抗肿瘤活性。6-8周龄的雌性NSG小鼠被植入携带HER2Y772dupYVMA突变的患者NSCLC肿瘤片段，并且当肿瘤达到300mm3时，小鼠被随机分为3组：溶媒对照、波齐替尼2.5mg/kg或来那替尼30mg/kg。每周对小鼠施用药物5天，并每周测量肿瘤体积三次。符号代表每个时间点的平均值±SEM肿瘤体积。点图代表第21天的平均肿瘤体积的百分比变化，其中每个点代表单只小鼠。ANOVA用于确定治疗结束时所示线条的p值。
图28：在携带V777L的乳腺癌PDX中，单药波齐替尼比来那替尼更有效。6-8周龄的雌性NSG小鼠被植入携带HER2 V777L突变的患者乳腺癌肿瘤片段，并且当肿瘤达到300mm3时，小鼠被随机分为3组：溶媒对照、波齐替尼2.5mg/kg或来那替尼30mg/kg。每周对小鼠施用药物5天，并每周测量肿瘤体积三次。符号代表每个时间点肿瘤体积的平均值±SEM。点图代表第30天平均肿瘤体积的百分比变化，其中每个点代表单只小鼠。ANOVA分析用于确定治疗结束时所示线条的p值。
图29：波齐替尼在多个EGFR和HER2外显子20突变体体内模型中具有抗肿瘤活性。对于PDX模型，6-8周龄的雌性NSG小鼠被植入携带各种EGFR或HER2外显子20突变的所示肿瘤片段，并且当肿瘤达到300mm3时，小鼠被随机分为2组：溶媒对照或波齐替尼5mg/kg。每周对小鼠施用药物5天，并每周测量肿瘤体积三次。线条代表4周时平均肿瘤体积的百分比变化，其中每个点代表单只小鼠。对于GEMM，用多西环素饮食诱发肿瘤，并通过MRI测量肿瘤构象后，每天用溶媒或波齐替尼10mg/kg治疗小鼠，持续4周。线条代表4周时平均肿瘤体积的百分比变化，其中每个点代表单只小鼠，并通过MRI测量肿瘤体积。
对示例性实施方式的描述
尽管表皮生长因子受体(EGFR)突变性非小细胞肺癌(NSCLC)的大多数激活突变对可用的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)敏感，但EGFR和HER2的外显子20发生改变的一个亚组是固有地耐药的。目前的研究利用计算机模拟(in silico)、体外和体内测试来对这些外显子20突变引起的结构改变建模，并鉴定有效的抑制剂。3-D建模显示了限制药物结合口袋的尺寸的明显改变，强加了大型刚性抑制剂的结合。发现，波齐替尼由于其尺寸小和柔性，能够绕过这些空间变化，并且是一种有效的和相对选择性的EGFR或HER2外显子20突变蛋白抑制剂。波齐替尼在突变外显子20EGFR或HER2 NSCLC患者来源的异种移植物(PDX)模型和基因工程化小鼠模型中也有较强的活性。因此，这些数据表明，波齐替尼是一种有效的、临床上有活性的EGFR/HER2外显子20突变抑制剂，并阐明了可以绕过这些***引起的空间变化的激酶抑制剂的分子特征。
因此，本公开的某些实施方案提供了治疗具有EGFR和/或HER2外显子20突变，例如外显子20***的癌症患者的方法。特别地，本方法包括对被鉴定为具有EGFR和/或HER外显子20***突变的患者施用波齐替尼(也称为HM781-36B)或阿法替尼。波齐替尼的大小和柔性克服了空间位阻，从而在低纳摩尔浓度下抑制EGFR和HER2外显子20突变体。因此，波齐替尼或阿法替尼以及结构类似的抑制剂是有效的EGFR或HER2抑制剂，可用于靶向对不可逆的第2代和第3代TKI具有耐药性的EFGR和HER2外显子20***。
I.定义
如本说明书所用，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可表示一个/种或更多个/种。如权利要求中所用，当与词“包括”一起使用时，词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可表示一个/种或一个/种以上。
权利要求中使用术语“或”来意指“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，但是本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个/另一种(another)”可以意指至少第二个/第二种或更多个/更多种。
术语“约”是指规定值±5％。
“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括(1)抑制经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者中的该疾病(例如，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)，(2)改善经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者的该疾病(例如，逆转病理学和/或症状学)，和/或(3)实现经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者的该疾病的任何可测量减少。例如，治疗可包括施用有效量的波齐替尼。
“预防性治疗”包括：(1)降低或减轻可能处于疾病的风险和/或易患疾病但尚未经历或表现出该疾病的任何或所有病理学或症状学的受试者或患者中发生该疾病的风险，和/或(2)减缓可能处于疾病的风险和/或易患疾病但尚未出现或表现出该疾病的任何或所有病理学或症状学的受试者或患者中该疾病的病理学或症状学的发作。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物生物体，例如人类、猴、牛、绵羊、山羊、犬、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或受试者为灵长类动物。人类患者的非限制性实例为成人、青少年、婴儿和胎儿。
如在本说明书和/或权利要求中使用的术语，术语“有效”是指足以实现期望的、预期的或想要的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的情况下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药物有效量”是指当对受试者或患者施用化合物以治疗或预防疾病时，足以实现对疾病的此类治疗或预防的化合物的量。
如本文所用，术语“IC50”指的是所获得的最大反应的抑制剂量的50％。这种定量测量指示，需要多少特定药物或其他物质(抑制剂)才能将给定的生物、生化或化学过程(或过程的成分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半。
例如，通过促进杀伤癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应，促进对癌细胞或肿瘤的免疫反应、预防或抑制癌症进展或增加具有癌症的受试者的寿命，“抗癌”药能够对受试者的癌细胞/肿瘤产生不利影响。
术语“***”或“***突变”是指向DNA序列中加入一个或更多个核苷酸碱基对。例如，EGFR的外显子20的***突变可能发生在氨基酸767至774之间，为约2-21个碱基对。在另一个实例中，例如，HER2外显子20***突变包括氨基酸770-785之间3-18个核苷酸的一种或更多种***。示例性的EGFR和HER外显子20***突变被描绘于本公开的图1中。
“杂交(Hybridize)”或“杂交(hybridization)”是指核酸之间的结合。杂交条件可根据待结合核酸的序列同源性而变化。因此，如果受试核酸之间的序列同源性高，则使用严格条件。如果序列同源性较低，则使用温和条件。当杂交条件严格时，杂交特异性增加，并且这种杂交特异性的增加导致非特异性杂交产物的产量降低。然而，在温和的杂交条件下，杂交特异性降低，并且这种杂交特异性的降低导致非特异性杂交产物的产量增加。
“探针(probe)”或“探针(probes)”是指长度为至少八(8)个核苷酸并且由于探针中至少一条序列与靶区域中序列的互补性而与靶序列形成杂交体结构的多核苷酸。多核苷酸可包括DNA和/或RNA。在某些实施方案中，探针被可检测地标记。探针的尺寸可以有很大差异。通常，探针的长度为例如至少8-15个核苷酸。其他探针的长度为例如至少20、30或40个核苷酸。还有一些探针稍微更长一些，例如长度为至少50、60、70、80或90个核苷酸。探针也可以具有落入前述范围内的任何具体长度。优选地，探针不含有与用于在聚合酶链式反应期间引发靶序列的序列互补的序列。
“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链聚合物，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。
“修饰的核糖核苷酸”或脱氧核糖核苷酸是指，可用于代替核酸中天然存在的碱基的分子，包括但不限于修饰的嘌呤和嘧啶，稀有碱基，可转换(convertible)核苷，嘌呤和嘧啶的结构类似物，标记的、衍生的和修饰的核苷和核苷酸，共轭核苷和核苷酸，序列修饰物，末端修饰物，间隔子修饰物，以及具有主链修饰的核苷酸，所述主链修饰包括但不限于核糖修饰的核苷酸、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯、亚磷酰胺(phosphonamidite)、甲基膦酸酯、甲基亚磷酰胺(methyl phosphoramidite)、甲基亚膦酰胺(methyl phosphonamidite)、5'-β-氰乙基亚磷酰胺(5’-β-cyanoethylphosphoramidite)、亚甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、肽核酸、非手性和中性核苷酸间键(internucleotidic linkage)。
“变体”是指分别相对于野生型或受试者群体中最普遍的形式，因一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或***而不同的多核苷酸或多肽。交换、缺失或***的核苷酸或氨基酸的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多，例如25、30、35、40、45或50个。
“引物”或“引物序列”是指与靶核酸序列(例如，要扩增的DNA模板)杂交以引发核酸合成反应的寡核苷酸。引物可以是DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或嵌合序列。引物可以含有天然、合成或修饰的核苷酸。引物长度的上限和下限都是凭经验确定的。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下与靶核酸杂交后形成稳定双链体所需的最小长度。在这种杂交条件下，非常短的引物(长度通常少于3-4个核苷酸)不会与靶核酸形成热力学稳定的双链体。上限通常由在靶核酸中预定核酸序列以外的区域中形成双链体的可能性来确定。通常，合适的引物长度在约10至约40个核苷酸长的范围内。在某些实施方案中，例如，引物的长度可以为10-40、15-30或10-20个核苷酸长。当置于适当条件下时，引物能够在多核苷酸序列上作为合成起始点。
“检测(detection)”、“可检测的(detectable)”及其语法等效物是指确定靶核酸序列的存在和/或数量和/或身份的方式。在一些实施方案中，检测发生在扩增靶核酸序列时。在其他实施方案中，靶核酸的测序可以表征为“检测”该靶核酸。连接于探针的标记可以包括可通过例如化学或物理方式检测的本领域已知的多种不同标记中的任一种。可以连接于探针的标记可以包括例如荧光材料和发光材料。
“扩增(amplifying)”、“扩增(amplification)”及其语法等同体是指以依赖模板的方式复制靶核酸序列的至少一部分的任何方法，包括但不限于，用于以线性或指数方式扩增核酸序列的大量技术。用于进行扩增步骤的示例性手段包括，连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、连接后Q-复制酶扩增、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化(hyperbranched)链置换扩增、多重置换扩增(MDA)、核酸链基扩增(NASBA)、两步多重扩增(two-step multiplexed amplification)、滚环扩增(RCA)、重组酶-聚合酶扩增(RPA)(TwistDx,Cambridg,UK)和自持序列复制(3SR)，包括其多重化形式或组合，例如但不限于OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(也称为组合链式反应-CCR)等。此类技术的描述尤其可见于Sambrook et al.Molecular Cloning,3rd Edition(分子克隆，第三版)。
“EGFR”或“表皮生长因子受体”或“EGFR”是指酪氨酸激酶细胞表面受体，且由以GenBank登录号NM_005228.3、NM_201282.1、NM_201283.1和NM_201284.1呈现的四种可选择转录本之一编码。EGFR的变体包括外显子20中的***。
“HER2”或“ERBB2”是EGFR/ErbB家族的成员，以GenBank登录号NM_004448.2呈现。HER2的变体包括外显子20中的***。
本文通常使用的“药学上可接受的”是指，在合理医学判断范围内、适合用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触，但没有过度毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相称的其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型。
“药学上可接受的盐”是指，如上所定义的药学上可接受的并且具有所需的药理学活性的本发明化合物的盐。此类盐的非限制性实例包括与无机酸或与有机酸形成的酸加成盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸；有机酸例如1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4,4'-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、乙酸、脂肪族一元和二元羧酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟萘甲酸、乳酸、十二烷基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、四丁基乙酸和三甲基乙酸。药学上可接受的盐还包括，当存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时可以形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱的非限制性实例包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇和N-甲基葡糖胺。应当认识到，构成本发明任何盐的一部分的具体阴离子或阳离子不是关键的，只要盐作为一个整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其他实例及其制备和使用方法提供于Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,and Use(药用盐手册：性质和使用)(P.H.Stahl&C.G.Wermuth eds.,Verlag Helvetica Chimica Acta,2002)。
II.EGFR和HER2外显子20突变
本公开的某些实施方案涉及确定受试者是否具有一个或多个EGFR和/或HER2外显子20突变，例如***突变，特别是如图1所示的一个或多个***突变。受试者可能具有2、3、4个或更多个EGFR外显子20突变和/或HER2外显子20突变。突变检测方法在本领域是已知的，包括PCR分析和核酸测序，以及FISH和CGH。在特定方面，外显子20突变通过DNA测序检测，例如对来自肿瘤的DNA或来自血浆的循环游离DNA进行测序。
EGFR外显子20突变可以包括氨基酸763-778之间的一个或多个点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。一个或多个EGFR外显子20突变可以位于一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773、V774和R776组成的组的残基处。
EGFR外显子20***可以包括H773_V774insH、A767_v769ASV、N771_P772insH、D770_N771insG、H779_V774insH、N771delinsHH、S768_D770dupDVD、A767_V769dupASV、A767_V769dupASV、P772_H773dup、N771_H773dupNPH、S768_D770dupSVD、N771delinsGY、S768_D770delinsSVD、D770_D770delinsGY、A767_V769dupASV、H773dup、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insYH773Y、N771insSVDNR、N771insHH、P772insDNP、H773insAH、H773insH和/或V774insHV。在特定方面，外显子20突变是A763insFQEA、A767insASV、S768dupSVD、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH和/或N771dupNPH。
在一些方面，受试者可能在EGFR残基C797处具有或发生突变，这可能导致对TKI如波齐替尼的耐药性。因此，在某些方面，受试者被确定为在EGFR C797和/或T790处没有突变，如C797S和/或T790M。在一些方面，具有T790突变如T790M的受试者可施用奥希替尼，而具有C797突变如C797S的受试者可施用化疗和/或放疗。
HER2外显子20突变可以包括氨基酸770-785之间的一个或多个点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。一个或多个HER2外显子20突变可以位于残基Y772、A775、M774、G776、G778、V777、S779、P780和/或L786处。一个或多个HER2外显子20突变可以是A775insVG776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776C V777insC、G776del insVV、G776delinsVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS、V773M、Y772dupYVMA、G776del insLC、G778dupGSP、V777insCG、G776V/S、V777M、M774dupM、A775insSVMA、A775insVA和/或L786V。
患者样品可以是包括来自受试者肺癌的核酸的任何身体组织或体液。在某些实施方案中，样品将是包含循环肿瘤细胞或细胞游离DNA的血液样品。在其他实施方案中，样品可以是组织，例如肺组织。肺组织可以来自肿瘤组织，并且可以是新鲜冷冻的或***固定石蜡包埋的(FFPE)。在某些实施方案中，获得肺肿瘤FFPE样品。
适用于本文所述方法的样品含有遗传材料，例如基因组DNA(gDNA)。基因组DNA通常从生物样品中提取，例如血液或口腔内壁的黏膜刮屑(scraping)，但也可以从其他生物样品中提取，包括尿液、肿瘤或咳吐物(expectorant)。样品本身通常包括有核细胞(例如血液细胞或口腔细胞)或从受试者取出的组织，包括正常组织或肿瘤组织。用于获得、处理和分析样品的方法和试剂是本领域已知的。在一些实施方案中，在例如抽血的医疗保健提供者的帮助下获得样品。在一些实施方案中，在没有医疗保健提供者的帮助下获得样品，例如，在非侵入性获得样品的情况下，例如使用口腔拭子或刷子获得的、包含口腔细胞的样品，或漱口水样品。
在某些情况下，可以处理生物样品以进行DNA分离。例如，可以将细胞样品或组织样品中的DNA与样品的其他组分分离。可以使用本领域已知的标准技术从生物样品中收获细胞。例如，可以通过离心细胞样品并重悬浮沉淀的细胞来收获细胞。可以将细胞重悬浮于缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在离心细胞悬浮液以获得细胞团块后,可以裂解细胞以提取DNA，例如gDNA。参见，例如Ausubel et al.(2003)。可以浓缩和/或纯化样品以分离DNA。从受试者获得的所有样品，包括那些经过任何类型的进一步处理的样品，都视为是从受试者获得的。可使用常规方法从生物样品中提取基因组DNA，包括例如苯酚提取。或者可以使用诸如
Figure BDA0003373351350000251
组织试剂盒(Qiagen,Chatsworth,Calif.)和
Figure BDA0003373351350000252
基因组DNA纯化试剂盒(Promega)等试剂盒提取基因组DNA。样品来源的非限制性例子包括尿液、血液和组织。
可以使用本领域已知的方法确定本文所述EGFR或HER2外显子20突变例如外显子20***突变是否存在。例如，凝胶电泳、毛细管电泳、尺寸排阻层析、测序和/或阵列可用于检测***突变的存在或不存在。在需要时，可以使用本领域已知的方法，例如PCR，来完成核酸的扩增。在一个实例中，从受试者获得样品(例如，包含基因组DNA的样品)。然后检查样品中的DNA，以确定本文所述***突变的身份。可以通过本文所述的任何方法，例如通过测序，或通过将基因组DNA、RNA或cDNA中的基因与核酸探针例如DNA探针(其包括cDNA和寡核苷酸探针)或RNA探针杂交，检测***突变。可以将核酸探针设计为与具体变体特异性杂交或优先杂交。
一组探针通常是指一组用于检测本公开的可操作治疗建议中使用的靶遗传变异(例如，EGFR和/或HER2外显子20突变)的引物，通常是引物对，和/或可检测地标记的探针。在扩增反应中使用引物对来界定跨越每个上述基因的靶遗传变异的扩增子。由一组匹配的探针检测该组扩增子。在示例性实施方案中，本发明的方法可以使用用于检测一组靶遗传变异诸如EGFR和/或HER2外显子20突变的TaqManTM(Roche Molecular Systems,Pleasanton,Calif.)测定。在一个实施方案中，该组探针是用于生成扩增子的一组引物，该扩增子通过诸如下一代测序反应等核酸测序反应检测。在这些实施方案中，例如，可以采用AmpliSEQTM(Life Technologies/Ion Torrent,Carlsbad,Calif.)或TruSEQTM(Illumina,San Diego,Calif.)技术。
对核酸标志物的分析可以使用本领域已知的技术来进行，包括但不限于序列分析和电泳分析。序列分析的非限制性实例包括Maxam-Gilbert测序、Sanger测序、毛细管阵列DNA测序、热循环测序(Sears et al.,1992)、固相测序(Zimmerman et al.,1992)、质谱测序例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS；Fu et al.,1998)和杂交测序(Chee et al.,1996；Drmanac et al.,1993；Drmanac et al.,1998)。电泳分析的非限制性实例包括平板凝胶电泳，例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和变性梯度凝胶电泳。此外，可以使用来自公司例如Life Technologies/Ion Torrent PGM或Proton、Illumina HiSEQ或MiSEQ以及Roche/454下一代测序***的市售试剂盒和仪器进行下一代测序方法。
其他核酸分析方法可以包括直接手动测序(Church and Gilbert,1988；Sangeret al.,1977；美国专利第5,288,644号)；自动荧光测序；单链构象多态性分析(SSCP)(Schafer et al.,1995)；钳夹变性凝胶电泳(CDGE)；二维凝胶电泳(2DGE或TDGE)；构象敏感凝胶电泳(CSGE)；变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Sheffield et al.,1989)；变性高效液相色谱(DHPLC,Underhill et al.，1997)；红外基质辅助激光解吸/电离(IR-MALDI)质谱(WO99/57318)；迁移率变化分析(Orita et al.,1989)；限制酶分析(Flavell et al.,1978；Geever et al.,1981)；实时定量PCR(Raca et al.,2004)；异源双链分析；化学错配切割(CMC)(Cotton et al.,1985)；RNA酶保护测定(Myers et al.,1985)；使用识别核苷酸错配的多肽，例如大肠杆菌(E.coli)的mutS蛋白；等位基因特异性PCR，以及这些方法的组合。参见，例如，美国专利公开第2004/0014095号，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实例中，鉴定样品中EGFR和/或HER2突变的方法包括，使来自所述样品的核酸与能够与编码突变EGFR和/或HER2蛋白或其包含突变的片段的核酸特异性杂交的核酸探针接触，和检测所述杂交。在具体实施方案中，所述探针用例如放射性同位素(3H、32P或33P)、荧光剂(若丹明或荧光素)或显色剂可检测地标记。在具体实施方案中，探针是反义寡聚体，例如PNA、吗啉代-氨基磷酸酯、LNA或2'-烷氧基烷氧基。探针可以为约8个核苷酸至约100个核苷酸，或约10至约75个、或约15至约50个、或约20至约30个核苷酸。在另一方面，将本公开的所述探针提供在试剂盒中，用于鉴定样品中的EGFR和/或HER2突变，所述试剂盒包括与EGFR和/或HER2基因中的突变位点特异性杂交或邻近该位点杂交的寡核苷酸。该试剂盒还可以包括基于使用该试剂盒的杂交测试结果，使用波齐替尼或阿法替尼治疗患有含有EGFR和/或HER2***突变的肿瘤的患者的说明书。
另一方面，检测样品中外显子20突变的方法包括，从所述样品扩增对应于所述EGFR基因或HER2基因的外显子20或其疑似含有突变的片段的核酸，并将扩增的核酸的电泳迁移率与相应野生型EGFR或HER2基因或其片段的电泳迁移率进行比较。迁移率的差异指示扩增的核酸序列中存在突变。可以在聚丙烯酰胺凝胶上测定电泳迁移率。
或者，可以使用酶促突变检测(EMD)(Del Tito et al.,1998)分析核酸以检测突变。EMD使用噬菌体解离酶T4内切核酸酶VII，该酶沿着双链DNA进行扫描，直到它检测并切割由点突变、***和缺失导致的碱基对错配引起的结构扭曲。例如通过凝胶电泳检测通过解离酶切割形成的两个短片段，指示存在突变。EMD方法的优点是，使用单一方案来鉴别直接从PCR反应测定的点突变、缺失和***，消除了对样品纯化的需要，从而缩短杂交时间并提高信噪比。可以分析含有高达20倍过量的正常DNA和尺寸高达4kb的片段的混合样品。然而，EMD扫描不能鉴定突变阳性样品中发生的具体碱基变化，如有必要，需要另外的测序程序来鉴定该突变。如美国专利第5,869,245号所证明的，可以使用类似于解离酶T4内切核酸酶VII的CEL I酶。
III.治疗方法
本文还提供了用于治疗或延缓个体中癌症进展的方法，其包括向确定具有EGFR和/或HER2外显子20突变(例如外显子20***)的受试者施用有效量的波齐替尼、阿法替尼或结构类似的抑制剂。受试者可能具有一个以上的EGFR和/或HER外显子20突变。
考虑待被治疗的癌症的实例包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、***癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、***、胃肠癌、淋巴瘤、肺肿瘤前病变、结肠癌、黑色素瘤和膀胱癌。在特定方面，癌症是非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人类(例如，患本文所述病症或处于患本文所述病症的风险的患者)。在一个实施方案中，受试者需要增强免疫反应。在某些实施方案中，受试者是免疫功能受损的，或处于免疫功能受损的风险。例如，受试者正在接受或已经接受化疗治疗和/或放疗。或者，或组合地，受试者由于感染而导致免疫功能受损或处于免疫功能受损的风险。
某些实施方案涉及确定对具有EGFR或HER2外显子20突变例如外显子20***的受试者施用波齐替尼(也称为HM781-36B、HM781-36和1-[4-[4-[(3,4-二氯-2-氟苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基]-氧基哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮。波齐替尼是一种基于喹唑啉的泛HER抑制剂，其不可逆地阻断通过HER家族的酪氨酸激酶受体(包括HER1、HER2和HER4)的信号传递。波齐替尼或结构类似的化合物(例如，美国专利号8,188,102和美国专利公开号20130071452；通过引用并入本文)可以用于本方法中。
波齐替尼，如波齐替尼盐酸盐，可以例如以片剂形式口服施用。波齐替尼可以以4mg-25mg的剂量，例如以5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、21mg、22mg、23mg或24mg的剂量施用。可以每天、每隔一天、每3天或每周一次施用。可以按连续时间表，如28天为一个周期给药。
在一些方面，可对具有T790突变(例如T790M)的受试者施用奥希替尼，并且可对具有C797突变(例如C797S)的受试者施用如本文所述化疗和/或放疗。可以单独或联合波齐替尼施用奥希替尼、化疗和/或放疗。可以以25mg至100mg，例如约40mg或80mg的剂量施用奥希替尼。可以每天、每隔一天、每2天、每3天或每周一次给药。奥希替尼可以例如以片剂形式口服施用。
可以以10mg-50mg，例如10mg、20mg、30mg、40mg或50mg的剂量施用阿法替尼。可以施用阿法替尼。
B.药物组合物
本文还提供了用于确定具有EGFR或HER2外显子20突变(例如外显子20***)的受试者的药物组合物和制剂，其包括波齐替尼或阿法替尼和药学上可接受的载体。
可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition(雷明顿药物学，第22版),2012)混合来制备冻干制剂或水溶液形式的本文所述药物组合物和制剂。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如可溶性人PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20
Figure BDA0003373351350000291
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。一方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
C.联合疗法
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法组合的波齐替尼或阿法替尼。另外的疗法可以是放疗、手术(例如，***肿瘤切除术和***切除术)、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述疗法的组合。另外的疗法可以为辅助疗法或新辅助疗法的形式。
在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减少治疗副作用的发生和/或严重程度的药剂，例如止吐剂等)。在一些实施例中，另外的疗法是放疗。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放疗与手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐射。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR途径、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂的疗法。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。
相对于另外的癌症疗法，例如免疫检查点疗法，可以在各种组合之前、期间、之后或以各种组合施用波齐替尼或阿法替尼。施用间隔可以从同时到几分钟到几天到几周。在将波齐替尼或阿法替尼与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每次递送之间没有很长的时间段，使得这两种化合物仍能够对患者产生有利的联合效果。在这种情况下，预期可以在彼此相隔约12-24或72小时内，更具体而言，彼此相隔约6-12小时内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，如果各自施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7、或8)，可能需要显著延长治疗时间。
可以采用各种组合。对于下文的实例而言，波齐替尼或阿法替尼为“A”，抗癌疗法为“B”：
Figure BDA0003373351350000301
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，将本实施方案的任何化合物或疗法施用至患者应当遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于联合疗法的毒性的步骤。
1.化疗
根据本发明的实施方案，可以使用各种各样的化学治疗剂。术语“化疗”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据其在细胞内的活性模式来分类，例如，它们是否以及在哪个阶段影响细胞周期。或者，药剂可基于其直接交联DNA、嵌入DNA或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝***畸变的能力来表征。
化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美托替呢(meturedopa)和瑞多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利司他丁(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱；肉球菌素(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔抗生素类(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯并-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链霉黑素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺素，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如弗林酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶、阿莫斯汀(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；亚丝醌；艾氟米辛(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登素类，例如美登木素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫达醇(mopidanmol)；二胺硝呢(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯毒素(尤其是T-2毒素、犹孢菌素A(verracurin A)、漆斑菌素A和蛇形菌素(anguidine))；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；伽胞嘧啶；***糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛、吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位化合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇类，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂、甲基苄肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维苯(navelbine)、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)和任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放疗
导致DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利第5,760,395号和第4,870,287号)和紫外线照射。很可能所有这些因素都会对DNA、对DNA前体、对DNA复制和修复以及对染色体的组装和维持产生广泛的损伤。X射线的剂量范围从每天50-200伦琴的长时间(3-4周)剂量到2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并取决于同位素的半衰期、发射辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
3.免疫疗法
本领域技术人员应当理解，另外的免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于免疫效应细胞以及靶向和破坏癌细胞的分子的使用。利妥昔单抗
Figure BDA0003373351350000331
就是这样实例。免疫效应物可以是，例如，对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以作为治疗的效应物，或者它可以招募其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并用作靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
抗体-药物缀合物已成为开发癌症治疗剂的突破性方法。癌症是世界上导致死亡的主要原因之一。抗体药物缀合物(ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物相结合，从而产生将有效载荷(药物)递送至具有富集水平的抗原的肿瘤细胞的“武装的”MAb。药物的靶向递送也最大限度地减少了其在正常组织中的暴露，从而降低了毒性并提高了治疗指数。FDA批准的两种ADC药物，即2011年批准的
Figure BDA0003373351350000332
(维布妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年批准的
Figure BDA0003373351350000333
(曲妥珠单抗美坦新偶联物(trastuzumab emtansine)或T-DM1)验证了该方法。目前有30多种ADC候选药物处于癌症治疗临床试验的各个阶段(Lealet al.,2014)。随着抗体工程和接头-有效载荷(linker-payload)优化越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合这种方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的生成。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中的表达上调/高水平和稳健的内化。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带适合靶向，即不存在于大多数其他细胞上的某标志物。存在许多肿瘤标志物，并且在本实施方案的背景中，这些标志物中的任何一种都可能适合被靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的另一方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趋化因子,例如MIP-1、MCP-1、IL-8，以及生长因子,例如FLT3配体。
免疫疗法的实例包括免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利第5,801,005号和第5,739,169号；Hui and Hashimoto,1998；Christodoulides et al.,1998)、细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ，IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski et al.,1998；Davidson et al.,1998；Hellstrand et al.,1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin et al.,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利第5,830,880号和第5,846,945号)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012；Hanibuchi et al.,1998；美国专利第5,824,311号)。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。
在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么调高信号(例如，共刺激分子)要么降低信号。免疫检查点阻断可以靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、程序性死亡因子1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活抑制物Ig V结构域(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物例如小分子、配体或受体的重组形式，或者特别地是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer,12(4):252-64,2012；两者均通过引用并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用嵌合、人源化或人源形式的抗体。如技术人员应当知道的，本公开中提及的某些抗体可使用替代名称和/或等效名称。在本发明的上下文中，这类替代和/或等效名称是可互换的。例如，众所周知，帕博利珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等效名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)为人所知。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号8,735,553、8,354,509和8,008,449中，上述专利均通过引用并入本文。用于本文提供的方法中的其他PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，例如美国专利公开号US20140294898、US2014022021和US20110008369中描述的，上述专利公开均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附素(例如，包含PDL1或PDL2的融合到恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)的细胞外部分或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003373351350000351
是描述于WO2006/121168中的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck3475、帕博利珠单抗、
Figure BDA0003373351350000352
和SCH-900475，是描述于WO2009/114335中的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是描述于WO2009/101611中的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文提供的方法中靶向的另一免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，且当与抗原呈递细胞表面的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA4是在辅助性T细胞表面表达并向T细胞传递抑制信号的免疫球蛋白超家族成员。CTLA4类似于T细胞共刺激蛋白CD28，且这两种分子都与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28则传递刺激信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，且可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28激活T细胞会导致CTLA-4即B7分子的抑制性受体的表达增加。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
可以使用本领域公知的方法生成适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，本文公开的方法可以使用以下公开的抗CTLA-4抗体：美国专利第8,119,129号；国际专利公开号WO 01/14424、WO 98/42752和WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；以前称为替西木单抗(ticilimumab))；美国专利第6,207,156号；Hurwitz et al.,1998；Camacho et al.,2004；以及Mokyr et al.,1998。每一前述出版物的教导均在此通过引用并入。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请号WO2001014424和WO2000037504以及美国专利第8,017,114号中；其全部通过引用并入本文。
示例性抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0003373351350000361
)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO 01/14424)。在其他实施方案中，该抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，该抗体包含伊匹单抗VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域以及伊匹单抗VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体竞争结合CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其他分子包括：CTLA-4配体和受体(例如美国专利号5,844,905、5,885,796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752中描述的，其全部通过引用并入本文)和免疫黏附素(例如美国专利号8,329,867中描述的，其通过引用并入本文)。
4.手术
大约60％的癌症患者会接受某些类型的手术，这包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌性组织被物理去除、切除和/或破坏并且可以与其他疗法结合使用，例如本发明实施方式的疗法、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指物理切除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科和通过显微镜控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。
在切除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或其他抗癌疗法的局部区域应用来完成。此类治疗可重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有不同的剂量。
5.其他剂
预期其他剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗的疗效。这些另外的剂包括影响细胞表面受体和细胞间隙连接(GAP junction)的上调的剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的剂或其他生物剂。通过提高细胞间隙连接的数量来增加细胞间信号传导会增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗的抗过度增殖功效。考虑了细胞黏附抑制剂来提高本发明实施方案的功效。细胞黏附抑制剂的实例是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还预期，增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他剂，例如抗体c225，可以与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗功效。
IV.试剂盒
用于检测EGFR和/或HER2外显子20突变(例如本文公开的那些突变)的试剂盒也在本公开的范围内。这种试剂盒的实例可以包括一组外显子20突变特异性引物。该试剂盒还可以包括使用引物检测本文所述具体EGFR和/或HER2外显子20突变的存在或不存在的说明书。该试剂盒还可以包括用于诊断目的的说明书，其指出在来自癌症患者的样品中对本文所述EGFR和/或HER2外显子20突变的阳性鉴定表明对酪氨酸激酶抑制剂波齐替尼或阿法替尼或结构相似的抑制剂的敏感性。该试剂盒还可以包括这样的说明书，该说明书指出在来自癌症患者的样品中对本文所述EGFR和/或HER2外显子20突变的阳性鉴定表明患者应该用波齐替尼或阿法替尼或结构相似的抑制剂治疗。
V.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术遵循发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以视为构成其实施的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，且这些改变仍然获得类似或相似的结果。
实施例1-具有EGFR或HER外显子20***的癌细胞的药物的鉴定
在临床数据库中研究了携带EGFR外显子20***的肿瘤的患者对TKI的临床反应；并且在280例具有EGFR突变性NSCLC的患者中，129例患者被鉴定出具有典型的EGFR突变(外显子19缺失、L858R和L861Q)，9例患者被鉴定出具有EGFR外显子20***，用单一药物厄洛替尼、吉非替尼或阿法替尼治疗这些患者。具有典型EGFR突变的NSCLC患者的PFS中位数为14个月，而具有EGFR外显子20***的患者的PFS中位数仅为2个月(P<0.0001，对数秩检验；图1A)。在9例EGFR外显子20***患者中，仅在1例接受阿法替尼的携带S768del-insIL突变的患者中观察到OR(图4A)。这一临床数据表明，在EGFR外显子20***驱动的NSCLC中，可用的EGFR TKI的活性有限，并验证了这些特定肿瘤需要替代治疗策略。
作为药物筛选的起始步骤，在Ba/F3细胞中表达了7个EGFR突变和11个HER2突变。EGFR和HER2外显子20突变的位置总结在图1B中。为了评估EGFR和HER2的哪些外显子20突变是激活性的，筛选Ba/F3细胞系的不依赖于IL-3的存活率。发现测试的所有EGFR外显子20***都是激活突变(图4B)，6个HER2外显子20突变和位于外显子19中的L755P是激活突变(图4C)。接下来，测试外显子20***对已进行临床评估的EGFR和HER2 TKI的敏感性，所述TKI包括可逆(第一代)、不可逆(第二代)和不可逆突变特异性TKI(第三代)，然后将敏感性与典型致敏突变EGFR L858R比较。除EGFR A763insFQEA外，EGFR外显子20***(n＝6)对第一代(图1C，IC50＝3.3->10μM)、第二代(图1d，IC50＝40-135nM)和第三代(图1e，IC50＝103-850nM)EGFR TKI具有耐药性(图5，表1)。此外，HER2外显子20突变体(n＝6)对第一代(图1F，IC50＝1.2-13μM)和第三代(图1H，IC50＝114-505nM)TKI具有耐药性。第二代TKI对Ba/F3 HER2外显子20突变细胞系的确有一定的活性(图1G，IC50＝10-12nM，图6，表1)。与药物筛选一致，除了EGFR A763insFQEA在较低剂量下显示部分抑制外，蛋白质印迹法显示厄洛替尼和奥希替尼对EGFR外显子20***突变的p-EGFR2没有明显抑制，仅在500nM时对HER2外显子20***突变的p-HER2有明显抑制(图7A-D)。
表1：EGFR/HER2 TKI针对EGFR和HER2外显子20***的IC50值。
Figure BDA0003373351350000391
为了研究为什么外显子20***对第一代和第三代EGFR TKI有耐药性，用EGFRT790M和EGFR WT对已解析的EGFR D770insNPG的晶体结构进行3-D建模，以观察药物结合口袋内的变化。建模显示，EGFR外显子20***与T790M突变相似，与看门残基(gatekeeperresidue)T790对齐，这导致与ATP的亲和力增加以及与第一代抑制剂的结合减少，从而使这些突变对非共价抑制剂耐药。此外，HER2外显子20***诱导组成性活性构象，从而阻止非共价HER2抑制剂拉帕替尼(其与处于非活性构象的HER2)的结合。此外，EGFR和HER2外显子20***对药物结合口袋有显著的影响。在EGFR(图1I)和HER2(图1J)的计算机建模中，外显子20***揭示了由于这些***在α-c螺旋的C末端(图1J)，α-c螺旋显著地移位到药物结合口袋(箭头)中，迫使α-c螺旋脊状放置在向内的激活的位置上。此外，3-D建模显示P环显著位移到两个受体的药物结合口袋中(图1I，1J)。这些位移共同导致EGFR和HER2外显子20突变蛋白的药物结合口袋从两个方向受到空间位阻。与上述体外测试一致，3-D建模支持阿法替尼比奥希替尼更有效地抑制外显子20***的观察结果。奥希替尼有一个大的直接连接到刚性嘧啶核心的末端1-甲基吲哚基团。这个大的非柔性基团降低了奥希替尼到达C797残基的能力，无法像阿法替尼对EGFR外显子20***一样有效(图1I)。或者，阿法替尼有一个较小的通过仲胺基团间接连接到喹唑啉核心的1-氯-2-氟苯环末端基团，使阿法替尼能够在尺寸上适合空间受阻的结合口袋。此外，空间位阻阻止了奥希替尼与HER2 A775insYVMA的结合。总之，体外数据和计算机建模表明，小的柔性的喹唑啉衍生物可能能够靶向EGFR/HER2外显子20***。
接下来试图鉴定针对外显子20***具有增强的活性的TKI。波齐替尼和阿法替尼一样，也含有一个小的末端基团和一个柔性的喹唑啉核心。然而，与阿法替尼相比，波齐替尼具有的将迈克尔受体基团连接至喹唑啉核心的取代基更小，并且末端苯环的卤化相比阿法替尼增加。这个富含电子的部分还与EGFR的碱性残基如K745相互作用以进一步稳定其结合。因此，在Ba/F3***中测试了波齐替尼。在体外，波齐替尼能有效抑制EGFR外显子20突变性Ba/F3细胞系(图2A)和HER2外显子20突变性Ba/F3细胞系(图2B)的生长。在EGFR外显子20突变性Ba/F3细胞系中，波齐替尼的平均IC50值为1.0nM，使波齐替尼在体外的效力为奥希替尼的约100倍，为阿法替尼的约40倍。此外，波齐替尼在HER2外显子20突变性Ba/F3细胞系中的平均IC50值为1.9nM，使波齐替尼在体外的效力为奥希替尼的200倍，为阿法替尼的6倍。这些结果通过蛋白质印迹法验证，其中波齐替尼在低至5nM的浓度抑制EGFR和HER2的磷酸化(图2C、8A)。此外，为了验证波齐替尼敏感性不是由于EGFR或HER2突变体的表达水平导致的，通过ELISA确定了每个突变体的表达，然后针对IC50值作图(图8D)。虽然没有发现IC50与表达之间的相关性(R＝-0.056，p＝0.856)，但是发现了波齐替尼敏感性与EGFR突变的位置之间的相关性(R＝0.687，p＝0.044)(图2D)，表明***距离α-c螺旋越远，IC50越高。有趣的是，对HER2外显子20突变没有发现这种相关性，在HER2外显子20突变在***的尺寸方面上变化更大，而不是位置(图8E)。这种相关性表明，突变的精确位置对药物结合口袋有不同的影响，促成了所看到的药物反应的异质性。此外，波齐替尼有效抑制患者来源细胞系CUTO14(EGFR A767dupASV)和YUL0019(EGFR N771del insFH)的生长，其平均IC50值分别为1.84nM和0.30nM，对CUT014的效力是阿法替尼的15倍，对YUL0019的效力是阿法替尼的100倍以上(图2E，2F)。对CUT014细胞系的蛋白质印迹发现，10nM波齐替尼治疗对p-EGFR有明显的抑制，但阿法替尼在1000nM之前对p-EGFR无明显抑制(图8B，8C)。
为了测定与T790M突变体相比，波齐替尼抑制外显子20突变体的特异性，比较了阿法替尼、奥希替尼、诺司替尼和波齐替尼对外显子20突变体的IC50值与阿法替尼、奥希替尼、诺司替尼和波齐替尼对EGFR T790M突变性Ba/F3细胞系的IC50值。IC50值被显示为针对单一EGFR T790M突变归一化，其中小于1的值表示与T790M相比对外显子20***具有特异性(图2G)。与EGFR T790M突变体相比，EGFR外显子20***对波齐替尼的敏感性是前者的65倍。此外，EGFR外显子20***突变对阿法替尼的耐药性是EGFR T790M突变体的1.4倍，对奥希替尼的耐药性是EGFR T790M突变体的5.6倍，对诺司替尼的耐药性是EGFR T790M突变体的24倍(图2G)。
为了研究为什么与T790M突变相比，波齐替尼(而不是第三代TKI如奥希替尼)选择性地和有效地抑制外显子20突变，进行了3-D建模以确定药物结合口袋的变化如何影响药物结合。虽然奥希替尼尺寸适合EGFR T790M突变受体的药物结合口袋(图2H)，但在外显子20突变体中，结合口袋内的较大变化(图2I)在空间上阻碍了第三代抑制剂的结合。然而，波齐替尼更小，且具有更大的柔性，允许尺寸适合于空间受阻的外显子20结合口袋(图2I)。此外，EGFR D770insNPG与波齐替尼和阿法替尼的3-D建模表明，位移到药物结合口袋中的P环使波齐替尼比阿法替尼更紧密地结合到药物结合口袋中。对结构建模的计算表明，波齐替尼的结合自由能(LondonΔG)低于阿法替尼，说明波齐替尼的结合亲和力更强。对WT HER2与奥希替尼的3-D建模表明WT HER2的结合口袋大于HER2 A775insYVMA的结合口袋。因此，波齐替尼紧密结合到HER2A775insYVMA的空间受阻的药物结合口袋中，克服了外显子20***引起的结构变化。
采用EGFR和HER2外显子20***驱动的NSCLC的GEM模型在体内测试波齐替尼的功效。在先前描述的EGFR D770insNPG(Cho等人，2013)和HER2A775insYVMA(Perera等人，2009)小鼠中诱导了肺肿瘤，并每日对动物口服波齐替尼(10mg/kg)或溶媒对照，持续4周。经MRI测定，波齐替尼减少了EGFR外显子20GEMM中85％的肿瘤负荷(图3A，3C)并减少了HER2外显子20GEMM中60％的肿瘤负荷(图3B，3D)，这是比先前在相同的GEM模型中对阿法替尼观察到的37％更高的抑制水平。对于EGFR和HER2 GEMM显示了使用波齐替尼之前和之后肿瘤的代表性MRI图像(图3C，3D)。在EGFR和HER2 GEM模型中，用10mg/kg波齐替尼治疗的小鼠表现出持久的消退，在12周时没有进展迹象(图3E，3F)。此外，在EGFR外显子20***PDX模型LU0387(H773insNPH)中，波齐替尼治疗(5或10mg/kg)在第14天使肿瘤完全减少(>85％抑制)(图3G)。
为了确定波齐替尼是否像其他不可逆抑制剂一样在C797处共价结合，利用在～30％的患者中观察到具有奥希替尼耐药的C797S突变产生Ba/F3细胞系(Thress等人，2015)。发现C797S突变诱导了对波齐替尼的耐药性，IC50值>10μM。这些实验表明，与其他第三代TKI一样，波齐替尼可能具有类似的获得性耐药机制。
为了验证上述发现，使用具有HER2 G776del insVC的乳腺癌细胞系MCF10A进行实验。用不同剂量的不同抑制剂处理细胞，且发现乳腺癌细胞系对波齐替尼敏感，如在测试的其他细胞系中所见(图10)。因此，波齐替尼可用于治疗其他具有外显子20突变的癌症。
因此，发现外显子20突变体对第一代、第二代和第三代TKI表现出原发耐药性。利用EGFR D770insNPG和HER2 A775insYVMA的三维建模，发现波齐替尼具有能够克服药物结合口袋内由外显子20***引起的变化的结构特征。此外，使用体外和体内模型证实了预测到的波齐替尼的活性，证明了波齐替尼在具有这些突变的细胞中的有效抗肿瘤活性。
发现在EGFR外显子20突变体中，波齐替尼的效力为阿法替尼的约40倍，和达克替尼的约65倍。此外，在体外HER2外显子20突变体中，波齐替尼的效力是阿法替尼和达克替尼的6倍。综上所述，这些数据表明，尽管波齐替尼与阿法替尼和达克替尼具有类似的喹唑啉骨架，但该激酶抑制剂的额外特征导致对于EGFR外显子20突变的活性和相对特异性与更常见的T790M突变相比增加。
3-D建模表明，波齐替尼较小的尺寸、增加的卤化和柔性给予该抑制剂在外显子20突变型EGFR/HER2的空间受阻的药物结合口袋中的竞争优势。观察到突变和α-c螺旋的距离与药物敏感性之间的负相关性。这种关系表明突变的精确位置影响TKI的药物结合口袋和/或结合亲和力。此外，该数据表明***的尺寸也影响药物敏感性。此外，与具有更大的EGFR外显子20***的细胞系相比，仅有一个氨基酸的净增的患者来源细胞系YUL0019(N771delinsFH)对基于喹唑啉的泛HER抑制剂更敏感。
实施例2–材料和方法
患者群体与统计分析：鉴别了在前瞻性地收集的MD Anderson Lung Cancer MoonShot GEMINI数据库中登记的EGFR突变型NSCLC患者。使用对用于常规临床护理的50、134或409个基因的小组中之一的基于PCR的下一代测序来确定EGFR突变状态。使用Kaplan Meier方法计算PFS。PFS定义为从EGFR TKI开始至放射学进展或死亡的时间。获取治疗期间以间隔6-8周的再分期扫描，并根据实体瘤反应评估标准(RECIST)1.1版进行回顾性评估，以确定EGFR外显子20***NSCLC患者的反应率。
细胞系产生与IL-3剥夺：Ba/F3细胞系在完全RPMI-1640(R8758；Sigma LifeScience)培养基中在无菌条件下培养，所述培养基补充有L-谷氨酰胺、10％热灭活FBS(Gibco)、1％青霉素/链霉素(Sigma Life Science)和10ng/ml小鼠IL-3(R&D systems)。通过逆转录病毒转导Ba/F3细胞系12小时来产生稳定的细胞系。通过使用Lipofectamine2000(Invitrogen)将表2中归纳的基于pBabe-Puro的载体(Addgene和Bioinnovatise)转染到Phoenix 293T两性包装细胞系(Orbigen)中来产生逆转录病毒。转导后72小时，向培养基中加入2μg/ml嘌呤霉素(Invitrogen)。选择5天后，将细胞用FITC-HER2(Biolegend)或PE-EGFR(Biolegend)染色，并通过FACS分选。使细胞系在无IL-3的情况下培养15天，并且每3天用Cell Titer Glo分析(Progema)测定细胞成活力。将得到的稳定细胞系维持在不含IL-3的如上所述的完全RPMI-1640培养基中。从ATCC获得HCC827和HCC4006肺癌细胞系，并在无菌条件下维持在10％RPMI培养基中。使用PowerPlex 1.2试剂盒(Promega)通过短串联重复序列进行DNA指纹比对来确定细胞系的身份。将指纹比对结果与细胞系原始来源所保持的参考指纹进行比较。所有细胞系均不含支原体。为了产生厄洛替尼耐药细胞系，将HCC827和HCC4006(均为EGFR突变型)细胞用递增浓度的厄洛替尼培养，直到出现耐药变体。
表2：用于产生稳定细胞系的载体。
Figure BDA0003373351350000441
Figure BDA0003373351350000451
细胞成活力分析和IC50估算：使用Cell Titer Glo分析(Promega)确定细胞成活力。从悬浮培养基中收集细胞，以300xg离心5分钟，重新悬浮在新鲜的RPMI培养基中，并使用Countess自动细胞计数器和台盼蓝(Invitrogen)计数。将每孔1500个细胞接种在384孔板(Greiner Bio-One)中，一式三份。细胞用七种不同浓度的抑制剂，连续的三倍稀释的TKI或单独的溶媒处理，终体积为每孔40μL。72小时后，每孔加入11μL Cell Titer Glo。平板振荡10分钟，并用FLUOstar OPTIMA多模式酶标仪(BMG LABTECH)确定生物发光。将生物发光值针对DMSO处理的细胞归一化，并将归一化的值在GraphPad Prism中绘图，使用非线性回归拟合具有可变斜率的归一化数据。通过GraphPad Prism计算50％抑制的IC50值。每个实验重复3次，除非另有说明。
酪氨酸激酶抑制剂：拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、AZD9291、CO-1686、EGF816、依鲁替尼和HM781-36B购自Selleck Chemical。厄洛替尼和吉非替尼是从美国德克萨斯大学MDAnderson癌症中心的机构药房获得的。BI-694由Boehringer-Ingelheim提供。将所有抑制剂均溶于浓度为10mM的DMSO中并储存于-80℃。
3-D建模：检索到EGFR D770insNPG蛋白的结构(Protein Data Bank条目代码：4LRM)，并使用它为模板构建EGFR D770insNPG的3-D分子结构模型。使用以前在Shen等人中发表的模型构建HER2 A775insYVMA。使用MODELLER9v6构建同源模型，并用MolecularOperating Environment软件包(Chemical Computing Group,Montreal,Canada)进一步进行能量最小化。TKI与外显子20突变型EGFR和HER2的分子对接使用GOLD软件进行，使用默认参数，除非另有说明。对接过程中不允许提前终止。限制条件(restraint)被用来对受体和抑制剂之间的共价键形成建模。使用GOLD软件解决结合口袋内残基的柔性。用PYMOL观察显示EGFR/HER2和抑制剂之间的相互作用的图。
Ba/F3突变体的蛋白质印迹法：对于蛋白质印迹，将细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤，并在蛋白裂解缓冲液(ThermoFisher)中用蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche)裂解。将蛋白质(30-40μg)加样到购自BioRad的凝胶中。使用BioRad半干式转移，然后用针对pEGFR(#2234)、EGFR(#4267)、pHER2(#2247)、HER2(#4290)的抗体(1:1000；Cell Signaling)进行检测。使用针对β-肌动蛋白的抗体(Sigma-Aldrich，#A2228)或针对粘着斑蛋白(vinculin)的抗体(Sigma-Aldrich，#V4505)作为上样对照来检测印迹，并使用SuperSignal West PicoChemiluminescent Substrate(ThermoFisher)和BioRad的ChemiDoc Touch ImagingSystem或射线照相胶片暴露印迹。显示了一式两份运行的两个独立的蛋白分离和印迹分析的代表性图像。蛋白质印迹的定量在Photoshop中完成，并计算为(背景平均强度-样品平均强度)(像素数)＝条带强度。首先将样品针对上样对照(β-肌动蛋白或黏着斑蛋白)归一化，然后再针对DMSO归一化，并在GraphPad Prism中作图。在GraphPad Prism中计算来自DMSO的显著性。
Ba/F3突变体的ELISA和相关性：从亲本Ba/F3细胞系中收获蛋白质，并且发现每一个Ba/F3外显子20突变体都是如上所述的激活突变。按照制造说明所述的，对总EGFR(Cellsignaling，#7250)和总HER2(Cell Signaling，#7310)进行ELISA。将通过ELISA确定的相对表达与针对如上所述计算的IC50值作图。通过GraphPad Prism确定皮尔森相关性和p值。
患者来源细胞系研究：CUTO14细胞是在知情同意后使用先前描述的培养方法(Davies等人，2013)从肺腺癌患者的胸腔积液中产生的。用指定剂量的阿法替尼或波齐替尼处理细胞系72小时，并通过MTS分析法(Promega)测定细胞成活力。按先前所述得计算IC50(n＝3)。如先前所述(Hong等人，2007)完成了对患者来源细胞系的蛋白质印迹(n＝3)。用指定剂量的阿法替尼或波齐替尼处理细胞2小时。除总EGFR(BD TransductionLaboratories)和GAPDH(Calbiochem)外，所有抗体均购自Cell Signaling Technology。
采用IRB批准的方案，从晚期肺腺癌患者的恶性心包液中建立YUL0019细胞系。将该细胞系在补充有10％热灭活胎牛血清(Atlanta Biologicals)和1％青霉素/链霉素(Corning)的RPMI+L-谷氨酰胺(Corning)中培养。为了确认EGFR突变的存在，根据制造商的说明书，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen#74104)从细胞沉淀物中提取RNA。用SuperscriptIII第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen#18080-051)合成cDNA，并将其作为模板以扩增EGFR。PCR产物通过Sanger测序法使用以下引物进行测序：EGFR-2080F：CTTACACCCAGTGGAGAAGC(SEQ ID NO:5)和EGFR-2507R ACCAAGCGACGGTCCTCCAA(SEQ ID NO:6)。人工审查正向和反向序列追踪。在患者来源细胞系中检测到的变体是EGFR的外显子20中的复杂***(N771delinsFH)，导致771位的氨基酸天冬酰胺被苯丙氨酸和组氨酸这两个氨基酸取代。细胞成活力和IC50评估如上所述进行。
患者来源异种移植物(PDX)研究：LU0387 PDX实验由Crown Biosciences完成。简言之，将表达EGFR H773insNPH的肿瘤的肿瘤片段接种于5-6周龄雌性nu/nu裸鼠。当肿瘤达到100-200mm3时，将小鼠随机分为3组：5mg/kg波齐替尼，10mg/kg波齐替尼，或溶媒对照(20％PEG-400，3％Tween-80于dH2O中)。每周两次测量肿瘤体积和体重。接受5mg/kg波齐替尼的小鼠接受药物4-5天，然后停止给药4天，然后再给药4天。然后，在没有给药的情况下另外观察小鼠2天。接受10mg/kg波齐替尼的小鼠接受药物3-4天，然后在没有给药的情况下观察10天。因与肿瘤负荷无关的事件而被人为安乐死的小鼠被从最终分析排除。
基因工程化小鼠模型(GEMM)研究：如先前所述(Perera等人，2009；Cho等人，2013)产生EGFR D770insNPG GEMM和HER2 A775insYVMA GEMM。根据实验动物福利办公室定义的良好动物规范(Good Animal Practices)，并经Dana-Farber癌症研究所机构动物护理和使用委员会(波士顿，MA)批准，对小鼠进行处置。从6周龄开始给小鼠连续喂食多西环素膳食。如前所述(Perera等人，2009；Cho等人，2013)，通过MRI测定肿瘤体积。在通过MRI测定到明显肿瘤形成后，将初始肿瘤体积相等的小鼠非盲随机分为溶媒组和每日10mg/kg波齐替尼组。因与肿瘤负荷无关的事件而被人为安乐死的小鼠被从最终分析排除。
实施例3-针对具有HER2外显子21突变的癌细胞的药物的鉴定
HER2突变最常见于膀胱癌、胃癌和胆管癌：为了了解HER2突变在不同癌症类型中的多样性，查询了几个数据库，包括来自cBioPortal、MD Anderson癌症中心和基础医学公司(Foundation Medicine)的群组(cohort)以及来自Guardant Health的cfDNA群组。在所有数据库中，分析了25种不同癌症类型的所有非同义HER2突变(表4)。计算了HER2突变的加权平均频率。与在AACR GENIE数据库中观察到的情况相似(Meric-Bernstam等人，2018年)，HER2突变最常见于膀胱癌(8.3％)、胆管癌(5.3％)和胃癌(4.5％)(图13A)；且HER2外显子20突变最常见于小肠癌(1.8％)、肺癌(1.5％)和乳腺癌(0.9％)(图13B)。
HER2突变最常见于HER2的酪氨酸激酶结构域，且突变热点因恶性肿瘤而异：接下来，分析了cBioPortal和MD Anderson报告的HER2受体不同区域内的突变频率。在所有癌症类型中，HER2突变最常见于酪氨酸激酶结构域(46％)，包括外显子20(20％)、外显子19(11％)和外显子21(9％)的突变(图14A)。此外，胞外结构域突变占HER2突变的37％。在所有查询的癌症中，最常见的HER2突变为p.S310F/Y(11.0％)、p.Y772_A775dupYVMA(5.7％)、p.L755P/S(4.6％)、p.V842I(4.4％)和p.V777L/M(4.0％)(图14E)。在肺癌中，大多数HER2突变发生在外显子20内(48％)，其中Y772_A775dupYVMA占所有HER2突变的34％(图14B、14F)。在乳腺癌中，大多数HER2突变发生在外显子19内(37％)，其中L755突变最常见，占HER2突变的22％(图14C)。然而，与一种变异体占优势的肺癌不同，在乳腺癌中，外显子19突变的突变多样性较大(图14G)。在结肠直肠癌中，HER2突变最常见于外显子21(23％)和胞外结构域(23％)，其中外显子21中的V842I变体最常见(19％)(图14D、14H)。
Y772dupYVMA是所有癌症类型中最常见的HR2外显子20***突变：HER2外显子20突变是HER2酪氨酸激酶结构域内最常见的突变(占所有HER2突变的16％和酪氨酸激酶结构域突变的43％)，而且HER2外显子20***突变仍然是临床挑战。为了了解外显子20***的多样性和患病率，在cBioportal、MD Anderson和Guardant Health数据库中按癌症类型分析了HER2外显子20***序列的发生率。Y772dupYVMA***是最常见的HER2外显子20***，其占所有HER2外显子20***的70％，且p.G778dupGSP(14％)和p.G776del insVC(9％)***是第二和第三常见的(图21A)。NSCLC中的外显子20***突变(N＝362)显示外显子20***突变的最大多样性(图21B)，乳腺癌中的外显子20***突变(N＝30)显示***序列的极小多样性，仅报告了三种不同的变体(图21C)。在其他癌症类型中观察到了其他罕见的***突变，但在所分析的每种癌症类型中，Y772和G778处的复制出现频率最高(图21D)。
经常检测到的HER2改变是激活突变：为了评估常见HER2突变的功能影响，使得Ba/F3细胞稳定表达外显子19、20和21的16个最常检测到的HER2突变。发现16个测试的HER2突变均可诱导Ba/F3细胞的IL-3非依赖性存活(图15A-15C)。此外，这16个HER2突变的表达导致磷酸化HER2的表达(图22A)，指示这些突变导致受体活化。
波齐替尼是经测试的最有效的TKI，并在体外抑制最常见的HER2突变：尽管最近的报道强调了基于共价喹唑啉胺的TKI(即阿法替尼、达克替尼、波齐替尼、来那替尼)在HER2突变疾病的临床前模型中的有效性，但阿法替尼、达克替尼和来那替尼的临床研究具有较低的ORR以及患者结局的癌症特异性和变异体特异性差异。为了***评估最常检测到的HER2变体的药物敏感性，针对11种共价和非共价EGFR和HER2 TKI筛选了HER2突变的Ba/F3细胞的组。HER2突变体对非共价抑制剂，拉帕替尼和沙帕替尼(sapatinib)表现出稳健的耐药性(图16A)。共价TKI，奥希替尼、依鲁替尼和纳扎替尼在抑制表达外显子20突变的细胞的细胞成活力方面无效；然而，这些TKI对表达D769变体的细胞确实显示出活性(图16A)。相比之下，共价、基于喹唑啉胺的TKI，阿法替尼、来那替尼、达克替尼、他索替尼-TKI和波齐替尼对所有三个外显子的HER2突变体均具有抑制活性(图16A)。在测试的所有HER2突变变体和TKI中，波齐替尼具有最低的平均IC50，且在降低细胞成活力方面明显比阿法替尼、来那替尼或他索替尼-TKI更有效(图16B)。此外，尽管波齐替尼对HER2外显子19和20突变的疗效显著高于阿法替尼、来那替尼或他索替尼-TKI，但对外显子21突变体的平均IC50无显著差异(图16C-16E)，表明突变位置影响药物结合。此外，在外显子19内，L755S和L755P变体对所有检测的TKI的药物敏感性具有显著差异(图16F)，表明该位点的特定氨基酸变化影响药物结合亲和力。
HER2突变位置和氨基酸变化影响药物结合亲和力：为了进一步了解突变位置和氨基酸变化如何能够影响药物结合亲和力和抑制效力，使用分子动力学模拟检查了这些突变如何影响HER2激酶结构域的结构和动力学。L755S、L755P、Y772dupYVMA和V777L HER2突变体的分子模型(图23A)是使用公众可得的X射线结构(PDB 3PP0)为模板构建的，并进行了加速分子动力学以增加蛋白质构象取样。在这些HER2突变体中，所取样的蛋白质构象范围，特别关于P-环和α-C-螺旋位置，其各不相同。甚至在外显子20突变之间也明显存在差异，尤其是在α-C-螺旋区，其中α-C-螺旋构象在“内”(具有较小结合口袋的活性构象)和“外”(具有较大结合口袋的非活性构象)之间的持续时间的变化。V777L突变体大量采样了“外”构象，而Y772dupYVMA突变体同时采样了“内”和“外”构象(图17A)。总的来说，构象状态的这些差异导致Y772dupYVMA突变体以“内”构象存在的频率是V777L突变体的10倍(图17B)，并且，平均而言，与V777L相比，Y772dupYVMA的结合口袋尺寸更小(图17C和23B)。此外，与V777L相比，Y772drupYVMA的较小结合口袋可能是导致来那替尼抗Y772dupYVMA效力较弱的原因，因为来那替尼含有朝α-C-螺旋定向的吡啶环。
对HER2突变体结合口袋体积的进一步分析(图22B)表明，相同残基的突变对蛋白质构象的影响可能截然不同。特别是，L755P突变的脯氨酸残基缺少氢键供体，该供体会分别破坏L755和V790之间β3和β5链之间的主链氢键。这两条β-链之间缺乏稳定性导致β-折叠不稳定和激酶铰链区的结构重排(图17D)。特别是L755P的L800残基突出到活性位点中，大大减小了口袋尺寸。β3链构象的变化也导致P-环向内塌陷，进一步减少了口袋体积，并使该突变体对大多数TKI不太敏感。此外，铰链活动度的变化也可能在激酶激活中发挥作用。L755P突变体确认中的这些明显变化与L755S突变体的表现形成对比，L755S突变体的构象和口袋体积轮廓与野生型HER2更相似(图23B)。
HER2突变性人癌细胞系显示对波齐替尼的敏感性增强：检测HER2抑制剂的临床研究显示了药物敏感性的癌症类型特异性差异(Hyman等人，2018年)。为了确定共价、基于喹唑啉胺的TKI在HER2突变疾病模型中是否具有活性，在人癌细胞系中测试了EGFR/HER2 TKI的组。用HER2外显子20突变转染瘤前MCF10A乳腺上皮细胞，并评估其对12种EGFR/HER2 TKI的体外敏感性。表达G776del insVC、Y772dupYVMA或G778dupGSP HER2突变的MCF10A细胞对波齐替尼最敏感，IC50值分别为12nM、8.3nM和4.5nM(图18A-18C)。相比之下，他索替尼-TKI和来那替尼分别产生了21nM和150nM的平均IC50值(图18A-18C)，表明波齐替尼的药效分别是他索替尼-TKI和来那替尼的2.6倍和19倍(p<0.001)。此外，使用波齐替尼和来那替尼的MCF10A HER2G776delinsVC细胞的蛋白印迹显示，10nM的波齐替尼(而非来那替尼)完全抑制p-HER2(图24A)。由于野生型(WT)HER2不会转化Ba/F3细胞以独立于IL-3生长，因此使用MCF10A细胞来确定TKI对突变型HER2与WT HER2相比的选择性。为此，计算了每种抑制剂的选择性指数(SI，突变体IC50值/WT IC50值)，并发现波齐替尼是在MCF10A细胞系中测试的最具突变选择性的TKI(SI＝0.028)，其次是吡咯替尼(SI＝0.063)和他索替尼-TKI(SI＝0.111)(图18D)。与使用Ba/F3细胞获得的数据一致(图15C)，在HER2外显子19突变结肠直肠癌(CW-2)模型中，波齐替尼、他索替尼-TKI和来那替尼之间的敏感性差异不太明显，但具有显著性(p＝0.02和p＝0.0004)，平均IC50值分别为3.19nM、4.24nM和68.8nM(图18E)。此外，在CW-2结肠直肠细胞的异种移植小鼠模型中，在第21天，与溶媒治疗组相比，波齐替尼(5mg/kg)治疗的动物显示肿瘤体积缩小58％(p＝0.011)。相比之下，与溶媒对照(p＝0.023)相比，接受来那替尼(30mg/kg)治疗的动物显示肿瘤体积增大(28％)，而且与溶媒对照相比，阿法替尼(20mg/kg)治疗未显著影响肿瘤生长(图18F、25)。
波齐替尼在HER2突变NSCLC患者中具有抗肿瘤活性：基于这些临床前数据和先前已发表的关于外显子20突变的工作(Robichaux等人，2018年)，一项研究者发起的、对EGFR和HER2外显子20突变性NSCLC(NCT03066206)进行的波齐替尼II期临床试验已启动。患者每天一次口服16mg波齐替尼治疗，直至进展、死亡或停药。根据RECIST v1.1，每八周评估客观反应。在前12例携带HER2外显子20***突变的可评估患者中，6/12(50％)患者有部分反应(PR)的最佳反应。2个月后，5/12的重复扫描证实了这一反应(证实的客观反应率，42％)(图19A)。在这12例患者中，2例患者在首次反应评估时具有疾病进展(PD)，导致83％的疾病控制率(DCR)。截至2018年12月，12例患者中10例有进展，前且前12例患者的中位PFS为5.6个月(图19B)。到目前为止，纳入研究的所有患者都携带两个最常见的HER2外显子20***(Y772dupYVMA和G778dupGSP)之一(图19A)。具有Y772dupYVMA突变的一位NSCLC患者在治疗前和治疗后(8周)的代表性图像显示右肺稳健的肿瘤缩小(图19C)。包括既往治疗线数的患者特征可见于表3。此外，一名接受大量预治疗的携带HER2外显子19点突变(L755P)的NSCLC患者接受了同情用药方案(C-IND18-0014)治疗。该患者每日接受16mg波齐替尼治疗，四周时肿瘤缩小(图19D，白色框)。根据RECIST v1.1，患者疾病稳定(SD)(-靶病变减少12％)。该患者在疾病控制的情况下继续接受波齐替尼超过7个月，直至成像显示疾病进展，并停用波齐替尼。该患者在波齐替尼治疗结束时临床状况良好，并继续接受进一步的全身治疗。
波齐替尼与T-DM1联合治疗增强抗肿瘤活性：先前在HER2阳性乳腺癌模型中进行的HER2 TKI拉帕替尼研究和在EGFR突变性NSCLC模型中进行的EGFR抑制剂研究已表明，TKI治疗导致细胞表面受体累积增加，增加的细胞表面HER2/EGFR增加了对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的敏感性。为确定波齐替尼治疗是否增加细胞表面的总HER2受体表达，在低剂量波齐替尼治疗24小时后，通过FACS分析了细胞表面HER2表达。发现，平均而言，波齐替尼治疗使细胞表面HER2表达增加2倍(图20A，p<0.0001)。接下来，检测了波齐替尼和T-DM1的组合是否会降低体外细胞成活力，并发现，虽然单独的T-DM1不会抑制MCF10A HER2突变细胞系的细胞成活力，但T-DM1和波齐替尼的组合导致IC50值显著低于单独的每种剂，呈剂量依赖性(图20B)。为了体内验证这些结果，在HER2突变NSCLC PDX模型(HER2 Y772dupYVMA)中测试了低剂量波齐替尼与单剂量T-DM1的组合(图20C)。为了评估对治疗的反应，确定了无进展生存期(PFS)，定义为从最佳反应到肿瘤倍增的时间。接受溶媒对照的小鼠的中位PFS(mPFS)为3天，而接受低剂量波齐替尼或T-DM1的小鼠的mPFS分别为15天和27天。然而，接受单剂量T-DM1联合低剂量波齐替尼治疗的(14/20)小鼠在第45天仍保持无肿瘤(图20D)。此外，在最佳反应时(第15天)，与单独接受T-DM1的2/9小鼠或接受低剂量波齐替尼的0/12小鼠相比，低剂量波齐替尼(2.5mg/kg)和单剂量T-DM1(10mg/kg)的组合导致20/20小鼠(100％)肿瘤完全消退(图20C-20F)。到第30天，在接受单独的T-DM1的所有小鼠中肿瘤生长重新开始；然而，在接受联合治疗的14/20小鼠中，无肿瘤复发的迹象(图20F、20G)。
进一步研究证实了波齐替尼与其他TKI相比的功效。发现波齐替尼对EGFRS768dupSVD PDX模型比高剂量的奥希替尼更有效(图26)。还表明，在携带Y772dupYVMA的NSCLC的PDX模型中，波齐替尼比来那替尼具有更大的抗肿瘤活性(图27)。在携带V777L的乳腺癌PDX模型中，单一药物波齐替尼比来那替尼更有效(图28)。波齐替尼在不同EGFR和HER2外显子20突变体的体内模型中的抗肿瘤活性的功效总结显示在图29中。
表3：表达所示EGFR外显子20突变的Ba/F3细胞的平均IC50值的表。为了确定IC50值，产生Ba/F3细胞。将细胞以每孔2,000个细胞铺在384孔板中，一式三份。24小时后，用150nM至0.01nM范围内的七种不同剂量的波齐替尼处理细胞。测定百分比成活力，并针对DMSO处理的对照组归一化。在GraphPad Prism中用非线性回归建模计算每个生物复本的IC50值。平均值和SEM代表三个独立的实验。
平均值 SEM
EGFR WT 6.753 0.882
EGFR A763insLQEA 0.082 0.0002
EGFR A763insFQEA 0.354 0.097
EGFR A767insASV 0.275 0.009
EGFR A767insTLA 1.006 0.064
EGFR S768I 0.481 0.042
EGFR S768I/V769L 0.214 0.059
EGFR S768I V774M 0.601 0.016
EGFR S768dupSVD 1.198 0.166
EGFR S768dupSVD V7689M 0.401 0.004
EGFR V769L 0.392 0.095
EGFR V769insASV 2.028 0.355
EGFR V769insGSV 1.225 0.197
EGFR V769insGVV 1.248 0.208
EGFR V769insMASVD 1.124 0.184
EGFR D770del insGY 0.839 0.183
EGFR D770insG 1.491 0.183
EGFR D770insY H773Y 1.115 0.171
EGFR D770insNPG 1.238 0.257
EGFR D770insSVD 2.385 0.359
EGFR N771dupN 0.204 0.006
EGFR N771dupN G724S 1.103 0.470
EGFR N771insHH 1.533 0.201
EGFR N771insSVDNR 0.836 0.042
EGFR P772insDNP 2.890 0.554
EGFR H773insAH 1.999 0.428
EGFR H773insNPH 3.507 0.641
EGFR H773insH 18.132 2.066
EGFR V774insHV 2.385 0.463
EGFR V774M 0.095 0.006
EGFR R776H 0.084 0.0003
EGFR R776C 0.155 0.011
在此，报告了发生在各种肿瘤类型中的HER2突变，但是具体的突变热点因恶性肿瘤而异。此外，对HER2 TKI的敏感性在突变位置上是异质性的，HER2外显子20***和L755P突变对大多数HER2 TKI具有耐药性，可能是由于药物结合口袋体积缩小所致。此外，将波齐替尼鉴定为强效泛HER2突变选择性抑制剂，在携带HER2外显子20***和L755P突变的NSCLC患者中具有临床疗效。最后，认可了波齐替尼治疗诱导HER2在细胞表面的累积，并且波齐替尼和T-DM1的组合增强了体外和体内抗肿瘤活性。
泛癌分析显示，HER2突变热点因癌症类型而异，并且在体外对HER2 TKI具有不同的敏感性，这可能会影响临床疗效。在SUMMIT试验中，来那替尼对乳腺癌患者的疗效最好，大多数反应者呈L755S、V777L或L869R突变阳性。在体外Ba/F3药物筛查中，这些突变与低IC50值相关。相比之下，结肠直肠癌患者对来那替尼无反应。与该临床观察结果一致的是，发现V842I突变是结肠直肠癌病例中最常见的HER2突变，并且在药物筛查测定中，该特异性突变对来那替尼不敏感。这些数据表明，恶性肿瘤之间的不同TKI敏感性可部分由癌症特异性突变热点解释，这直接影响药物敏感性。然而，仍然存在关于HER2突变的分布为何因肿瘤类型而异以及给定突变是否在不同肿瘤类型中产生相似的药物反应的关键问题。SUMMIT试验的数据显示，虽然特定的外显子20***与乳腺癌患者的来那替尼敏感性相关，但这些相同的突变与所有其他癌症类型中的耐药性相关，证明了这些肿瘤类型特异性敏感性差异可能存在值得进一步研究的潜在机制。
外显子20***突变和外显子19L755P突变对大多数HER2 TKI耐药。体外药物筛查显示，外显子20***突变和L755P突变对检测的每种TKI均具有最高IC50值。分子动力学模拟显示，这些突变诱导的构象变化影响药物结合口袋的整体尺寸和移动性。总之，这些体外和计算机模拟结果与临床观察结果一致，即具有HER2外显子20***突变的患者既往地对TKI反应不佳。在外显子20***频繁发生的肺癌中，携带HER2外显子20***突变的患者对来那替尼、达克替尼和阿法替尼分别具有0％、11.5％和18.2％-18.8％的反应率。此外，虽然L755S突变已显示对来那替尼有反应，但L755P突变对TKI和抗体-药物偶联物两者均有很强的耐药性。
实施例4–材料与方法
HER2突变的患病率和变异频率分析：为了确定MD Anderson癌症中心、cBioPortal、基础医学公司或Guardant Health数据库中报告的每个HER2突变的频率，单独查询了每个数据库，然后根据每个数据库中的患者总数对频率进行加权，并以加权平均值进行报告。为了确定cBioPortal中不同癌症类型的HER2突变频率，选择并导出了所有非重叠研究。对于重叠研究，仅使用最大的数据集。为了确定MD Anderson癌症中心的HER2突变频率，查询了个体化癌症治疗研究所(Institute for Personalized Cancer Therapy)的数据库所有独立于癌症类型的HER2突变。为了确定来自基础医学公司的HER2外显子20突变的频率，对具有HER2缺失、框偏移、***和点突变的患者的去标识数据进行了制表，并排除了少于5个突变的癌症类型。最后，为了确定Guardant Health的HER2外显子20突变的频率，查询了Guardant360临床数据库中2015年10月至2018年5月期间(70和73个基因的组)测试的具有ERBB2外显子20突变的样品。
Figure BDA0003373351350000561
是经CLIA证明、CAP/NYSDOH认证的全面cfDNA NGS测试，其报告出SNV、***缺失(indel)、融合，且SNV多达73种基因。然后对Guardant Health报告的频率进行归一化针对Odegaard等2018年报告的临床敏感性校正。具体而言，将频率除以临床敏感性百分比(85.9％)。
Ba/F3细胞系产生和IL-3剥夺：如前所述建立Ba/F3细胞系。简言之，通过逆转录转导Ba/F3细胞系12小时产生稳定的Ba/F3细胞系。通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将表1(Addgene和Bioinnovatise)中汇总的基于pBabe-Puro的载体转染到Phoenix 293T-ampho细胞(Orbigen)中产生逆转录病毒。转导后3天，向RPMI培养基中加入2μg/ml的嘌呤霉素(Invitrogen)。选择5天后，用FACS分选的FITC-HER2(Biolegend)对细胞染色。然后使细胞系在缺乏IL-3的情况下生长两周，并每三天使用Cell Titer Glo测定(Progema)评估细胞成活力。将所得稳定细胞系维持在无IL-3的含10％FBS的RPMI-1640培养基中。
细胞成活力测定和IC50估算：如前所述，使用Cell Titer Glo测定(Promega)确定细胞成活力(Robichaux等人，2018年)。简而言之，将每孔2000-3000个细胞铺于384孔板(Greiner Bio-One)中，一式三份。用7种不同浓度的酪氨酸激酶抑制剂或单独的溶媒处理细胞，终体积40μL/孔。3天后，向每个孔中加入11μL Cell Titer Glo。摇晃平板15分钟，使用FLUOstar OPTIMA多模式酶标仪(BMG LABTECH)确定生物发光。将生物发光值针对DMSO处理的细胞归一化，并使用非线性回归拟合具有可变斜率的归一化数据，在GraphPad Prism中对归一化值作图。通过GraphPad Prism计算50％抑制时的IC50值。
针对磷酸化和总HER2的ELISA以及与IC50值的相关性：如上所述，从亲代Ba/F3细胞系和表达HER2突变的每个Ba/F3细胞系中收获蛋白。加入5μg/ml蛋白至每个ELISA板中，并按照磷酸化HER2(Cell Signaling，#7968)和总HER2(Cell Signaling，#7310)的制造说明书所述进行ELISA。通过ELISA测定的p-HER2与总HER2的比值确定相对p-HER2表达。将相对p-HER2比值相对于如上所述计算的波齐替尼IC50值作图。Pearson相关性和p值通过GraphPad Prism确定。
酪氨酸激酶抑制剂和T-DM1：所有抑制剂均购自Selleck Chemical，但EGF816和吡咯替尼除外，它们购自MedChem Express。将所有抑制剂以10mM的浓度溶于DMSO中，并储存在-80℃。在丢弃之前，将抑制剂限制在两个冻融循环。T-DM1购自MD Anderson癌症中心机构药房并重构。
分子动力学模拟：使用MOE计算机程序(Chemical Computing Group)通过在PDB3PP0 X射线结构中引入计算机模拟突变构建HER2突变体的蛋白质结构模型。使用NAMD模拟软件包进行经典和加速分子动力学模拟。补充信息部分提供了更多详细信息。
人细胞系：MCF10A细胞购自ATCC，并在补充了1％青霉素/链霉素、5％马血清(sigma)、20ng/ml EGF、0.5mg/ml氢化可的松和10μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养基中培养。通过逆转录转导建立稳定的细胞系，并使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将表1(Addgene和Bioinnovatise)中汇总的基于pBabe-Puro的载体转染到Phoenix 293T-ampho细胞(Orbigen)中，从而产生逆转录病毒。转导后2天，向RPMI培养基中加入0.5μg/ml的嘌呤霉素(Invitrogen)。选择14天后，在如上所述的细胞成活力测定中检测细胞。CW-2细胞由MTA的Riken细胞系数据库提供，并在含10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI中保存。
体内异种移植物研究：通过将50％基质胶中的1x106细胞注射到6周龄雌性nu/nu裸鼠中建立CW-2细胞系异种移植物。当肿瘤达到350mm3时，将小鼠随机分配到4个组：20mg/kg阿法替尼、5mg/kg波齐替尼、30mg/kg来那替尼或溶媒对照(0.5％甲基纤维素，2％吐温80的dH2O溶液)。每周测量肿瘤体积三次。小鼠在周一至周五(每周5天)接受药物，但在周三开始给药，在给药的前3天后允许停药2天。
Y772dupYVMAPDX小鼠购自Jax Labs(模型#TM01446)。将来自表达HER2Y772dupYVMA的肿瘤的片段接种到5至6周龄的雌性NSG小鼠中(Jax Labs#005557)。每周测量小鼠3次，当肿瘤体积达到200mm3-300 mm3时，将小鼠随机分配到4个治疗组：溶媒对照(0.5％甲基纤维素，0.05％吐温80的dH2O溶液)、2.5mg/kg波齐替尼、10mg/kg T-DM1，或2.5mg/kg波齐替尼和10mg/kg T-DM1的组合。每周测量三次肿瘤体积和体重。2.5mg/kg波齐替尼治疗的小鼠每周一至周五(每周5天)接受口服给药。在随机分配日，10mg/kg T-DM1治疗的小鼠接受一个静脉(IV)剂量的T-DM1。波齐替尼和T-DM1联合治疗的小鼠接受一个IV剂量的T-DM1，并在T-DM1给药3天后开始每周5日的2.5mg/kg波齐替尼。如果小鼠体重下降超过10％或体重下降至20g以下，则使小鼠接受休药期。无进展生存期定义为连续两次测量自最佳反应的肿瘤倍增。完全消退定义为肿瘤负荷减少大于95％，对于肿瘤完全消退的小鼠，肿瘤倍增定义为连续两次以上测量大于75mm3。实验的完成符合良好动物实践(GoodAnimal Practices)，并获得MD Anderson癌症中心机构动物护理和使用委员会(Houston，TX)的批准。
表3：用于产生稳定细胞系的载体
Figure BDA0003373351350000581
Figure BDA0003373351350000591
表4：各个数据库中按癌症类型分类的患者总数。
Figure BDA0003373351350000592
Figure BDA0003373351350000601
表5：患者特征和既往治疗的线数。
Figure BDA0003373351350000602
FACS：将过表达HER2突变的MCF10A细胞铺于6孔平板中过夜，然后用10nM波齐替尼处理。24小时后，用PBS洗涤两次细胞，并进行胰酶消化。然后将细胞重悬在含0.5％FBS的PBS中，然后用Biolegend的抗HER2-FITC抗体(#324404)在冰上染色45分钟。用含0.5％FBS的PBS洗涤细胞两次，用流式细胞术分析。IgG和未染色对照用于门控。
蛋白质印迹：对于蛋白质印迹，在PBS中洗涤细胞，然后在RIPPA裂解缓冲液(ThermoFisher)和用蛋白酶抑制剂混合片剂(Roche)裂解。将蛋白质(30μg-40μg)上样到购自BioRad的凝胶中。使用BioRad半干转印槽，然后使用抗pHER2、HER2、pPI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2(1:1000；Cell Signaling)的抗体进行检测。用抗粘着斑蛋白或β-肌动蛋白的抗体(Sigma-Aldrich)作为上样对照，检测印迹，并使用ECL蛋白质印迹底物(Promega)曝光。
HER2表达水平及其与Ba/F3突变体IC50的相关性：从Ba/F细胞系中收获蛋白质，并按照所述制造说明书对总HER2(Cell Signaling，#7310)进行ELISA。将ELISA确定的相对表达针对如上所述计算的IC50值作图。Pearson相关性和p值通过GraphPad Prism确定。
临床试验和CIND标识符：患者提供了书面知情同意书，同意在同情用药方案(MDAnderson癌症中心CIND-18-0014)或临床试验NCT03066206中使用波齐替尼治疗。方案经MDAnderson癌症中心机构审查委员会和美国食品药品监督管理局批准。
***
根据本公开，本文公开和要求保护的所有方法可以在没有过度实验的情况下进行和执行。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员来说明显的是，可以在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，对本文所述方法和所述方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，显然，某些化学和生理学相关的剂可以替代本文所述的剂，同时会获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员明显的类似替代和修改都视为落入所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。
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以下参考文献在其提供了示例性程序或补充本文所述内容的其他细节的程度上被通过引用专门并入本文。
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序列表
<110> 得克萨斯大学体系董事会
<120> 对携带EGFR或HER2外显子20***的癌细胞具有抗肿瘤活性的化合物
<130> UTFC.P1383WO
<150> US 62/826,843
<151> 2019-03-29
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EGFR突变
<400> 1
Phe Gln Glu Ala
1
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR突变
<400> 2
tccaggaagc ct 12
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2突变
<400> 3
Tyr Val Met Ala
1
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2突变
<400> 4
tatgtcatgg ct 12
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
cttacaccca gtggagaagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
accaagcgac ggtcctccaa 20
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
gaagcctacg tgatggccag cgtggacaac ccccacgtgt gccgc 45
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR外显子20 A763insFQEA
<400> 8
gaagcctcca ggaagcctta cgtgatggcc agcagcgtgg acgtggacaa cccccacgtg 60
tgccgc 66
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR外显子20 S768dupSVD
<400> 9
gaagcctacg tgatggccag cgtggacaac ccccacgtgt gccgc 45
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR外显子20 V769insASV
<400> 10
gaagcctacg tgatggccag cgtgccagcg tgggacaacc cccacgtgtg ccgc 54
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR外显子20 D770insSVD
<400> 11
gaagcctacg tgatggccag cgtggacgcg tggacaaacc cccacgtgtg ccgc 54
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR外显子20 H773insNPH
<400> 12
gaagcctacg tgatggccag cgtggacaac ccccacaacc cccacgtgtg ccgc 54
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
gaagcatacg tgatggctgg tgtgggctcc ccatatgtct cccgcctt 48
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2外显子20 G776V
<400> 14
gaagcatacg tgatggctgt tgtgggctcc ccatatgtct cccgcctt 48
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2外显子20 G776V V777insV
<400> 15
gaagcatacg tgatggcttg tgtgttgggc tccccatatg tctcccgcct t 51
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2外显子20 G776del insVV
<400> 16
gaagcatacg tgatggctgt tgttgtgggc tccccatatg tctcccgcct t 51
<210> 17
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2外显子20 G776del ins V
<400> 17
cgaagcatac gtgatggctg gtgtgtctgg ctccccatat gtctcccgcc tt 52
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2外显子P780insGSP
<400> 18
gaagcatacg tgatggctgg tgtgggctcc ccatggctcc cctatgtctc ccgcctt 57

Claims (123)

1.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的波齐替尼，其中所述受试者已被确定为具有一个或多个EGFR外显子20突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。
4.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变被进一步确定为EGFR 20***突变。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变被进一步确定为原发EGFR 20***突变。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变包括氨基酸763-778之间的点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者已被确定为具有2、3或4个EGFR外显子20突变。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变不是T790M和/或C797S。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已施用过酪氨酸激酶抑制剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者对先前施用的酪氨酸激酶抑制剂耐药。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、依鲁替尼、纳扎替尼或来那替尼。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变在一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773和V774组成的组的残基处。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变在一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773、V774和R776组成的组的残基处。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述受试者已被确定在残基C797处不具有EGFR突变。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述一个或多个外显子20突变选自由A763insFQEA、A767insASV、S768dupSVD、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insY H773Y、N771insSVDNR、N771insHH、P772insDNP、H773insAH、H773insH和V774insHV组成的组。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述一个或多个外显子20突变选自由A763insFQEA、A763insLQEA、A767insASV、S768dupSVD、S768I、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insYH773Y、N771insSVDNR、N771insHH、N771dupN、P772insDNP、H773insAH、H773insH、V774M、V774insHV、R776H和R776C组成的组。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述外显子20突变是D770insNPG。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中通过分析来自所述患者的基因组样品确定所述受试者具有EGFR外显子20突变。
19.根据权利要求19所述的方法，其中所述基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中通过核酸测序或PCR分析确定EGFR外显子20突变的存在。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼被口服施用。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以5-25mg的剂量施用。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼被每天施用。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼被连续施用。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以28天的周期施用。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，还包括施用另外的抗癌疗法。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述另外的抗癌疗法是化疗、放疗、基因疗法、手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述波齐替尼和/或抗癌疗法被静脉内、皮下、骨内、口服、经皮、以持续释放剂、以控制释放剂、以延迟释放剂、作为栓剂或舌下施用。
30.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中施用所述波齐替尼和/或抗癌疗法包括局部、区域性或全身施用。
31.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼和/或抗癌疗法被施用两次或更多次。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述癌症是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠道癌、中枢神经***组织癌或外周神经***组织癌、内分泌癌或神经内分泌癌或造血***癌、胶质瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆管癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李-法美尼肿瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺肿瘤、成骨肉瘤、多发性神经内分泌肿瘤I型和II型、乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、食道癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述患者是人。
35.一种包含波齐替尼的药物组合物，用于被确定具有一个或多个EGFR外显子20突变的受试者。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述组合物被进一步确定为口服组合物。
37.根据权利要求35或36所述的组合物，其中所述组合物包含5-25mg波齐替尼。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含8mg、12mg或16mg波齐替尼。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的组合物，其中所述波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成片剂。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变被进一步确定为EGFR 20***突变。
42.根据权利要求35至41中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变被进一步确定为原发性EGFR 20***突变。
43.根据权利要求35至42中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变包括氨基酸763-778之间的点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。
44.根据权利要求35至43中任一项所述的组合物，其中所述受试者已被确定为具有2、3或4个EGFR外显子20突变。
45.根据权利要求35至44中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变不是T790M和/或C797S。
46.根据权利要求35至45中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR外显子20***突变在一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773和V774组成的组的残基处。
47.根据权利要求35至46中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个EGFR外显子20***突变在一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773、V774和R776组成的组的残基处。
48.根据权利要求35至47中任一项所述的组合物，其中所述受试者已被确定在残基C797处不具有EGFR突变。
49.根据权利要求35至48中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个外显子20突变选自由A763insFQEA、A767insASV、S768dupSVD、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771delinsGY、N771delinsFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770delins GY、D770insG、D770insY H773Y、N771insSVDNR、N771insHH、P772insDNP、H773insAH、H773insH和V774insHV组成的组。
50.根据权利要求35至49中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个外显子20突变选自由A763insFQEA、A763insLQEA、A767insASV、S768dupSVD、S768I、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771delinsFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insYH773Y、N771insSVDNR、N771insHH、N771dupN、P772insDNP、H773insAH、H773insH、V774M、V774insHV、R776H和R776C组成的组。
51.根据权利要求35至50中任一项所述的组合物，其中所述受试者正在接受抗癌疗法治疗。
52.一种预测患有癌症的受试者对单独的波齐替尼或与另一种抗癌疗法组合的波齐替尼的反应的方法，包括在从所述患者获得的基因组样品中检测EGFR外显子20突变，其中如果所述样品对所述EGFR外显子20突变的存在呈阳性，则所述患者被预测为对单独的波齐替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼具有良好反应。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述EGFR外显子20突变被进一步确定为外显子20***突变。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中通过核酸测序或PCR分析确定EGFR外显子20突变的存在。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述EGFR外显子20突变包括氨基酸763-778之间的点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。
57.根据权利要求52至56中任一项所述的方法，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变不是T790M和/或C797S。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的方法，其中所述EGFR外显子20突变在残基A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773和/或V774处。
59.根据权利要求52至58中任一项所述的方法，其中所述EGFR外显子20突变在残基A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773、V774和/或R776处。
60.根据权利要求52至59中任一项所述的方法，其中所述外显子20突变选自由A763insFQEA、A767insASV、S768dupSVD、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insY H773Y、N771insSVDNR、N771insHH、P772insDNP、H773insAH、H773insH和V774insHV组成的组。
61.根据权利要求52至60中任一项所述的方法，其中所述外显子20突变选自由A763insFQEA、A763insLQEA、A767insASV、S768dupSVD、S768I、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insYH773Y、N771insSVDNR、N771insHH、N771dupN、P772insDNP、H773insAH、H773insH、V774M、V774insHV、R776H和R776C组成的组。
62.根据权利要求52至61中任一项所述的方法，其中对单独的波齐替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼的良好反应包括减小肿瘤尺寸或负荷、阻断肿瘤生长、减少肿瘤相关疼痛、减少癌症相关病理学、减少癌症相关症状、癌症无进展、增加无病间隔期、距进展的时间增加、诱导缓解、减少转移或增加患者存活。
63.根据权利要求52至62中任一项所述的方法，还包括对被预测具有良好反应的所述患者施用单独的波齐替尼或与另一种抗癌疗法组合的波齐替尼。
64.根据权利要求52至63中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼被口服施用。
65.根据权利要求52至64中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以5-25mg的剂量施用。
66.根据权利要求62至65中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。
67.根据权利要求62至66中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。
68.根据权利要求62至67中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。
69.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的波齐替尼或阿法替尼，其中所述受试者已被确定具有一个或多个HER2外显子20突变，所述突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776CV777insV、G776C V777insC、G776delinsVV、G776delinsVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS、V773M、Y772dupYVMA、G776del insLC、G778dupGSP、V777insCG、G776V/S、V777M、M774dupM、A775insSVMA、A775insVA和L786V组成的组。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述一个或多个HER2外显子20突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776CV777insC、G776del insVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS和V773M组成的组。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述波齐替尼被口服施用。
72.根据权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以5-25mg的剂量施用。
73.根据权利要求69至72中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼以8mg、12mg或16mg的剂量施用。
74.根据权利要求69至73中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。
75.根据权利要求69至74中任一项所述的方法，其中所述波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。
76.根据权利要求69至75中任一项所述的方法，其中所述一个或多个HER2外显子20突变还包括氨基酸770-785之间的一个或多个点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。
77.根据权利要求69至76中任一项所述的方法，其中所述一个或多个HER2外显子20突变在残基Y772、A775、M774、G776、G778、V777、S779、P780和/或L786处。
78.根据权利要求69至76中任一项所述的方法，其中所述一个或多个HER2外显子20突变在残基V773、A775、G776、V777、G778、S779和/或P780处。
79.根据权利要求69至78中任一项所述的方法，其中所述HER外显子20突变被进一步确定为HER2外显子20***突变。
80.根据权利要求69至79中任一项所述的方法，其中所述HER外显子20***突变是A775insYVMA。
81.根据权利要求69至80中任一项所述的方法，还包括施用mTOR抑制剂。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、地磷莫司或MLN4924。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是依维莫司。
84.根据权利要求81所述的方法，其中所述波齐替尼或阿法替尼和/或所述mTOR抑制剂被静脉内、皮下、骨内、口服、经皮、以持续释放剂、以控制释放剂、以延迟释放剂、作为栓剂或舌下施用。
85.根据权利要求69至84中任一项所述的方法，其中通过分析来自所述患者的基因组样品确定所述受试者具有HER2外显子20突变。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。
87.根据权利要求69至86中任一项所述的方法，其中通过核酸测序或PCR分析确定HER2外显子20突变的存在。
88.根据权利要求69至87中任一项所述的方法，还包括施用另外的抗癌疗法。
89.根据权利要求69至88中任一项所述的方法，其中所述另外的抗癌疗法是化疗、放疗、基因疗法、手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。
90.根据权利要求69至89中任一项所述的方法，其中所述癌症是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠道癌、中枢神经***组织癌或外周神经***组织癌、内分泌癌或神经内分泌癌或造血***癌、胶质瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆管癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李-法美尼肿瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺肿瘤、成骨肉瘤、多发性神经内分泌肿瘤I型和II型、乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、食道癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
91.根据权利要求69至90中任一项所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
92.根据权利要求69至91中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
93.一种包含波齐替尼或阿法替尼的药物组合物，用于被确定具有一个或多个HER2外显子20突变的受试者，所述突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776CV777insV、G776C V777insC、G776del insVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS、V773M、Y772dupYVMA、G776del insLC、G778dupGSP、V777insCG、G776V/S、V777M、M774dupM、A775insSVMA、A775insVA和L786V组成的组。
94.根据权利要求93所述的组合物，其中所述一个或多个HER2外显子20突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776C V777insC、G776delinsVV、G776delinsVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS和V773M组成的组。
95.根据权利要求93或94所述的组合物，其中所述HER2外显子20突变被进一步确定为HER2外显子20***突变。
96.根据权利要求93至95中任一项所述的组合物，其中所述HER2外显子20突变还包括氨基酸770-785之间的一个或多个点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。
97.根据权利要求93至96中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个HER2外显子20突变在残基Y772、A775、M774、G776、G778、V777、S779、P780和/或L786处。
98.根据权利要求93至96中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个HER2外显子20突变在残基V773、A775、G776、V777、G778、S779和/或P780处。
99.根据权利要求93至98中任一项所述的药物组合物，其中所述患者正在接受抗癌疗法治疗。
100.一种预测患有癌症的受试者对单独的波齐替尼或阿法替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼或阿法替尼的反应的方法，包括在从所述受试者获得的基因组样品中检测HER2外显子20突变，所述突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776C V777insC、G776del insVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS、V773M、Y772dupYVMA、G776del insLC、G778dupGSP、V777insCG、G776V/S、V777M、M774dupM、A775insSVMA、A775insVA和L786V组成的组，其中如果所述样品对所述HER2外显子20突变的存在呈阳性，则所述患者被预测为对单独的波齐替尼或阿法替尼或与抗癌疗法组合的波齐替尼或阿法替尼具有良好应。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述HER2外显子20突变被进一步确定为HER2外显子20***突变。
102.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。
103.根据权利要求100至102中任一项所述的方法，其中通过核酸测序或PCR分析确定HER2外显子20突变的存在。
104.根据权利要求100至103中任一项所述的方法，其中所述抗癌疗法是mTOR抑制剂。
105.根据权利要求100至104中任一项所述的方法，其中对单独的波齐替尼或阿法替尼抑制剂或与抗癌疗法联合使用的波齐替尼或阿法替尼抑制剂的良好反应包括减小肿瘤尺寸或负荷、阻断肿瘤生长、减少肿瘤相关疼痛、减少癌症相关病理学、减少癌症相关症状、癌症无进展、增加无病间隔期、距进展的时间增加、诱导缓解、减少转移或增加患者存活。
106.根据权利要求100至105中任一项所述的方法，还包括对被预测具有良好反应的所述受试者施用单独的波齐替尼或阿法替尼或与另一种抗癌疗法组合的波齐替尼或阿法替尼。
107.一种组合物，包括：
(a)从人癌细胞中分离的核酸；和
(b)能够扩增人EGFR或HER2编码序列的外显子20的至少第一部分的引物对。
108.根据权利要求107所述的组合物，还包括标记的探针分子，当人EGFR或HER编码序列中存在突变时，所述标记的探针分子能够特异性地与所述序列的外显子20的第一部分杂交。
109.根据权利要求107或108所述的组合物，还包括热稳定的DNA聚合酶。
110.根据权利要求107至109中任一项所述的组合物，还包括dNTPS。
111.根据权利要求108至110中任一项所述的组合物，其中当存在选自由A763insFQEA、A767insASV、S768dupSVD、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771delinsGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769insMASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insYH773Y、N771insSVDNR、N771insHH、P772insDNP、H773insAH、H773insH和V774insHV组成的组的突变时，所述标记的探针与所述人EGFR编码序列的外显子20的第一部分杂交。
112.根据权利要求108至111中任一项所述的组合物，其中当存在选自由A763insFQEA、A763insLQEA、A767insASV、S768dupSVD、S768I、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insY H773Y、N771insSVDNR、N771insHH、N771dupN、P772insDNP、H773insAH、H773insH、V774M、V774insHV、R776H和R776C组成的组的突变时，所述标记的探针与所述人EGFR编码序列的外显子20的第一部分杂交。
113.根据权利要求108至111中任一项所述的组合物，其中当存在选自由A775insVG776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776CV777insC、G776del insVV、G776delinsVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS、V773M、Y772dupYVMA、G776del insLC、G778dupGSP、V777insCG、G776V/S、V777M、M774dupM、A775insSVMA、A775insVA和L786V组成的组的突变时，所述标记的探针与所述人HER2编码序列的外显子20的第一部分杂交。
114.一种编码突变EGFR蛋白的分离的核酸，其中所述突变蛋白与人野生型EGFR的不同之处在于一个或多个EGFR外显子20突变，所述突变包括在氨基酸763-778之间的点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。
115.根据权利要求114所述的分离核酸，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变在一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773和V774组成的组的残基处。
116.根据权利要求114或115所述的分离的核酸，其中所述一个或多个EGFR外显子20突变在一个或多个选自由A763、A767、S768、V769、D770、N771、P772、H773、V774和R776组成的组的残基处。
117.根据权利要求114至116中任一项所述的分离的核酸，其中所述一个或多个外显子20突变选自由A763insFQEA、A767insASV、S768dupSVD、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insYH773Y、N771insSVDNR、N771insHH、P772insDNP、H773insAH、H773insH和V774insHV组成的组。
118.根据权利要求114至117中任一项所述的分离的核酸，其中所述一个或多个外显子20突变选自由A763insFQEA、A763insLQEA、A767insASV、S768dupSVD、S768I、V769insASV、D770insSVD、D770insNPG、H773insNPH、N771del insGY、N771del insFH、N771dupNPH、A767insTLA、V769insGVV、V769L、V769insGSV、V769ins MASVD、D770del ins GY、D770insG、D770insY H773Y、N771insSVDNR、N771insHH、N771dupN、P772insDNP、H773insAH、H773insH、V774M、V774insHV、R776H和R776C组成的组。
119.根据权利要求114至118中任一项所述的分的离核酸，其中所述核酸包含SEQ IDNO:8、9、10、11或12的序列。
120.一种编码突变HER2蛋白的分离的核酸，其中所述突变蛋白与人野生型HER2的不同之处在于一个或多个HER2外显子20突变，所述突变包括在氨基酸770-785之间的点突变、***和/或缺失3-18个核苷酸。
121.根据权利要求120所述的分离核酸，其中所述一个或多个HER2外显子20突变在残基Y772、A775、M774、G776、G778、V777、S779、P780和/或L786处。
122.根据权利要求120或121所述的分离的核酸，其中所述一个或多个HER2外显子20突变选自由A775insV G776C、A775insYVMA、G776V、G776C V777insV、G776C V777insC、G776del insVV、G776del insVC、P780insGSP、V777L、G778insLPS、V773M、Y772dupYVMA、G776del insLC、G778dupGSP、V777insCG、G776V/S、V777M、M774dupM、A775insSVMA、A775insVA和L786V组成的组。
123.根据权利要求120至122中任一项所述的分离核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO:14、15、16、17或18的序列。
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