JP2022526334A - 新たなタウ種を標的化することによるタウオパチー障害の処置の方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、新たなタウ種、特に１１位のメチオニン残基から開始するタウ種に特異的に結合する抗体を使用したタウオパチー障害の処置の方法に関し、前記メチオニンはＮ－アルファアセチル化されている（ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ）。本発明はまた、この新たなタウ種に特異的に結合する抗体に関する。本発明者らは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕがタウ病理発生に関与する病理学的タウ種であることを発見した。本発明者らは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種の脳発現によって、Ｔｈｙ－Ｔａｕトランスジェニックマウスにおけるタウ病理発生が増強され、少なくともタウ病理を加速することにより病理学的過程に関与することを示すことにより、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種とタウ病理の間での因果関係を実証した。本発明者らはまた、タウ病理のＴｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックモデルにおけるこのタウ種の減少／中和によって、タウ病理及び関連する記憶障害に対する保護効果に導かれることを実証するために、特定のモノクローナル抗体（２Ｈ２Ｄ１１）に基づく受動免疫アプローチを使用した。さらに、本発明者らは、２Ｃ１２ハイブリドーマをサブクローン化し、Ｎ－アルファ－アセチル－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ（ＡｃＭｅｔｔ１１－Ｔａｕ）に対するさらなる抗体である２Ｃ１Ｃ８を選択した。本発明者らは、２Ｃ１Ｃ８抗体がまた、タウタンパク質のＮ－アルファ末端アセチル化メチオニン１１に対して特異性を呈したこと、及びＴｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックマウスの海馬において神経原線維変性を呈するニューロンを標識することを実証した。

Description

発明の分野：

本発明は、新たなタウ種、特に１１位のメチオニン残基から開始するタウ種（前記メチオニンはＮ－アルファアセチル化されている（ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ））に特異的に結合する抗体を使用した、タウオパチー障害の処置の方法に関する。本発明はさらに、特定のモノクローナル抗体２Ｈ２Ｄ１１及び誘導体に関する。これらの特異的抗体は、タウオパチー障害、例えばアルツハイマー病などの治療のために使用することができる。

発明の背景：

タウタンパク質は微小管関連タンパク質ファミリーに属し、本質的にニューロンにおいて見出され、そこでは、それらは主に微小管の安定性及び動態、ならびに軸索輸送の調節に関与する。ヒト成人の脳において、異なるＮ末端を伴い、及びそれらのＣ末端部分において４つの微小管結合ドメイン（４Ｒアイソフォーム）又は３つの微小管結合ドメイン（３Ｒアイソフォーム）のいずれかを含む６つのタウアイソフォームがある。タウタンパク質は、エクソン２、３、及び１０の選択的スプライシングにより、単一の遺伝子から由来する（Caillet-Boudin et al., 2015）。タウタンパク質は、タウオパチーとして言及される神経変性障害の大きなグループにおいてフィラメント中に凝集する。アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も一般的なタウオパチーであり、認知症の形態である。その神経病理学的特徴の１つは、異常な翻訳後修飾を持つ凝集したタウタンパク質で作られた神経原線維変性（ＮＦＤ）である。皮質脳領域におけるＮＦＤの進行は、ＡＤにおける認知障害と密接に相関しており（Braak and Braak, 1995；Duyckaerts et al, 1998；Delacourte et al., 1999）、それ故に、タウがＡＤ病理学の中心的なプレーヤーであり、価値ある治療標的であることを示している（Novak et al., 2018）。免疫療法は現在、ＡＤに遭遇することを考慮するための革新的で有望な治療アプローチである（Wisniewski et al., 2014）。タウオパチーの齧歯類モデルにおける受動免疫療法は、全身経路を介して注射されたモノクローナル抗体が血液脳関門を通過し、タウ標的タンパク質に結合することができることを示している（Pedersen et al., 2015；Ittner et al., 2015）。マウスモデルにおけるタウベースの免疫療法の有益な効果の基礎をなすメカニズムは依然として決定されていない。治療用抗体は、タウ播種を遮断し、それ故に、病的オリゴマー及び凝集タウ種の形成を回避する、又は細胞間タウの拡散を遮断する、又はエンドソーム／リソソーム経路を介してタウ分解を促進することができうる（Sigurdsson et al., 2016）。しかし、タウ免疫療法についての課題は、正常なタウタンパク質に影響することを伴わずに標的化されるタウ種の特定に依存し、したがって、有害な副作用を回避する。

最後に、タウ障害についての新規免疫療法を開発する継続的な必要性がある。

ＡＤ脳において見出されるタウ種の間で、切断形態は有毒なものである可能性が高いが、しかし、病理学的過程におけるそれらの役割は研究中である（Zilka et al., 2012）。本発明者らは最近、ヒトの脳から新たなＮ末端切断タウ種を特定している（Derisbourg et al., 2015）。これらの新たな種の間で、残基Ｍｅｔ１１（Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ）で開始するタウタンパク質が特に興味深く、なぜなら、Ｍｅｔ１１が、全てのタウタンパク質アイソフォームにより共有されるエクソン１によりコードされる領域中に位置付けられるためである。エクソン１機能についてはほとんど公知ではないが、その修飾はタウ機能に影響を及ぼし、タウの病理をもたらしうる（Hayashi et al., 2002；Poorkaj et al., 2002；Magnani et al., 2007；Derisbourg et al., 2015)）。タウのＮ末端の役割は、少なくとも特定のタウ構造の形成への関与に関連しうる。実際に、自然に折り畳まれていないタンパク質であるタウは、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの間の分子内相互作用の結果として「ペーパークリップ」立体構造を採用する可能性が高い（Carmel et al., 1996；Jeganathan et al., 2006；Jeganathan et al., 2008）。従って、タウの最外側のＮ末端の喪失は、Ｍｅｔ１１－Ｔａｕタンパク質において遭遇されるように、重大な機能的及び病理学的な結果となりうる。より興味深いことに、プロテオミクスデータの本発明者らのさらなる分析によって、Ｍｅｔ１１－Ｔａｕがまた、Ｎ－アルファ末端アセチル化形態（ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ）において検出されることが示されている。重要なことに、これらのタウ種は以前には記載されていない。本発明者らは最初、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種の特異的な検出を可能にするモノクローナル抗体を開発した。次に、抗体を使用し、神経原線維変性（ＮＦＤ）及び記憶欠損を進行的に発生するＴｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックマウスモデルを使用することで、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種とタウ病理の間の関連性を確立した（Schindowski et al., 2006；Van der Jeugd at al., 2013）。ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種は、Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２マウスの海馬脳切片でＮＦＤを呈するニューロンにおいて明確に検出された。興味深いことに、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕエピトープは、記憶欠損に先行する病理学的過程の初期段階で検出された。さらに、ヒト脳海馬切片の免疫組織化学分析によって、抗体がＡＤ脳における神経原線維タングルを標識するが、それは高齢者コントロールからの海馬においては反応性でないことが示された（ＷＯ２０１８／１７８０７８）。全体的には、本発明者らのデータは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕエピトープが、ＮＦＤを呈するニューロンにおいて明確に検出され、生理学的及び治療的価値のある新たな初期の病理学的タウ種を表すことを示す。

発明の概要：

本発明は、治療における使用のための抗タウ抗体であって、前記抗体は、以下のアミノ酸配列（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）を含むエピトープに結合する、抗タウ抗体を提供する。

特定の実施形態では、本発明の抗タウ抗体をタウオパチーの処置において使用する。

本発明はさらに、特定の抗ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ抗体及び誘導体に関する。

発明の詳細な説明：

本発明者らの以前のデータは、ＡｃＭｅｔ１１－ＴａｕがＡＤ関連タウ病理のバイオマーカーの痕跡となる特色であることを示した（ＷＯ２０１８／１７８０７８を参照のこと）。

本発明者らは現在、さらなる分析を実施しており、データは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕがタウの病理発生に関与する病理学的タウ種であることを示す。

第一に、本発明者らは、ＡＤ脳タンパク質の生化学的分画を行った。ＥＬＩＳＡ分析によって、病理学的な高リン酸化タウタンパク質のように、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種が不溶性画分（タウタンパク質凝集体を含む）中に存在することが示された（図１）。

第二に、海馬タウの病理を３から１０ヶ月までに、及び記憶欠損を６ヶ月から徐々に発生するＴＨＹ－Ｔａｕ２２マウス（Schindowski et al., 2006；Van der Jeugd at al., 2013）において、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種が、記憶欠損に先行する病理学的過程の早い段階で検出される（図２）。

第三に、本発明者らは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種の脳発現がＴｈｙ－Ｔａｕトランスジェニックマウスにおけるタウ病理の発生を増強し（図３及び４）、少なくともタウの病理を加速することにより、病理学的過程に関与することを示すことにより、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種及びタウ病理の間での因果関係を実証した。

第四に、本発明者らは、タウ病理のＴｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックモデルにおけるこれらのタウ種の減少／中和が、タウ病理（図７及び８）及び関連する記憶欠損（図１０）に対する保護効果を導くことを実証するために、以前に開発された特定のモノクローナル抗体（２Ｈ２Ｄ１１ ＩｇＧ２ａアイソタイプ）に基づく受動免疫アプローチを使用した。

全体的に、これらのデータは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕが生理病理学的な価値のある初期の病理学的種であり、それ故に、価値ある治療標的となりうることを示す。

治療における使用のための新たなタウ種に特異的に結合する抗体

本発明は、治療における使用のための抗タウ抗体に関し、それにおいて前記抗体は、以下のアミノ酸配列（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）を含むエピトープに結合する。

特定の実施形態では、本発明に従った使用のための抗タウ抗体は、１１位のメチオニン残基から開始するタウポリペプチドに特異的に結合するが、それにおいて１１位の前記メチオニンはＮ－アルファアセチル化されている（ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ）。

特定の実施形態では、本発明に従った使用のための抗タウ抗体は、以下を含む、又は以下からなる群より選択されるポリペプチドに特異的に結合する：
（ｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３５２（配列番号：１）からなるアミノ酸配列；
（ｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３８１（配列番号：２）からなるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３８３（配列番号：３）からなるアミノ酸配列
（ｉｖ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４１０（配列番号：４）からなるアミノ酸配列
（ｖ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４１２（配列番号：５）からなるアミノ酸配列；
（ｖｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４４１（配列番号：６）からなるアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－７７６（配列番号：７）からなるアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｖｉｉ）の配列の１１位のＮ－アルファアセチルメチオニン残基から開始する少なくとも９連続アミノ酸のフラグメント。

特定の実施形態では、本発明に従った使用のための抗タウ抗体は、以下を含む、又は以下からなる群より選択されるポリペプチドに特異的に結合する：
（ｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３５２（配列番号：１）からなるアミノ酸配列；
（ｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３８１（配列番号：２）からなるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３８３（配列番号：３）からなるアミノ酸配列
（ｉｖ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４１０（配列番号：４）からなるアミノ酸配列
（ｖ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４１２（配列番号：５）からなるアミノ酸配列；
（ｖｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４４１（配列番号：６）からなるアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－７７６（配列番号：７）からなるアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｖｉｉ）の配列の１１位のＮ－アルファアセチルメチオニン残基から開始する少なくとも１１連続アミノ酸のフラグメント。

本明細書中で使用する用語「タウ」は、哺乳動物、及び特に霊長目（及びツパイ科）からのタウタンパク質を意味する。ヒトタウは、主に軸索において見出されるニューロンの微小管関連タンパク質であり、チューブリンの重合を促し、微小管を安定化させるために機能する。６つのアイソフォーム（アイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、胎児タウ）がヒト脳において見出され、最も長いアイソフォームは４４１アミノ酸（アイソフォームＦ、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０６３６－８）を含む。タウ及びその特性はまた、Reynolds, C. H. et al., J. Neurochem. 69 (1997) 191-198により記載されている。タウは、その高リン酸化形態において、アルツハイマー病（ＡＤ）脳における神経原線維病変の構成要素であるペアードヘリカルフィラメント（ＰＨＦ）の主要な成分である。タウは、いくつかの異なるキナーゼ（ＧＳＫ３ｂｅｔａ、ｃｄｋ５、ＭＡＲＫ、及びＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーを含む）により、そのセリン残基又はスレオニン残基でリン酸化されうる。

ヒトタウタンパク質のタンパク質配列、及びそのアイソフォームは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおいて、以下のアクセス番号で見出されうる：
タウアイソフォーム胎児（３５２アミノ酸）Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０６３６－２
タウアイソフォームＢ（３８１ＡＡ）Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０６３６－４
タウアイソフォームＤ（３８３ＡＡ）Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０６３６－６
タウアイソフォームＣ（４１０ＡＡ）Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０６３６－５
タウアイソフォームＥ（４１２ＡＡ）Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０６３６－７
タウアイソフォームＦ（４４１ＡＡ）Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０６３６－８
タウアイソフォームＧ（７７６ＡＡ）Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１０６３６－９

切断は、タウの病理において病原学的な役割を有しうる追加の翻訳後修飾である。タウタンパク質の生化学的及び機能的特性に影響し、毒性機能の獲得を誘発しうるタウタンパク質の多数のカルボキシ切断形態も記載されている（Garcia-Sierra et al., 2001；Rissman et al., 2004；Zilka et al., 2006；Basurto-Islas et al., 2008；McMillan et al., 2011）。

一部の実施形態では、本発明の抗体により特異的に検出されるタウポリペプチドは、最大で７６６（及び少なくとも９）のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、

のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは５０未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは３０未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは２５未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは２０未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは１５未満のアミノ酸を含む。

本発明者らは、タウポリペプチドＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに対して向けられた特異的抗体を生成した。

モノクローナル抗体を、合成ペプチド（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）でマウスを免疫化することにより産生した。より正確には、本発明者らは、抗体が、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕポリペプチド（１１位のメチオニン残基から開始し、１１位の前記メチオニンがＮ－アルファアセチル化されているタウポリペプチド）に特異的に結合し、細胞株サンプルならびにＡＤ患者からの及びタウオパシーのＴＨＹ－Ｔａｕ２２マウスモデルからの脳サンプルを染色するそれらの能力についてスクリーニングされることを見出した（図１及び２）。本発明の抗体のスクリーニング工程は、これらの抗体が、Ｎ－アルファアセチル化形態のメチオニン１１タウ種に特異的であることを示した。なぜなら、それらは、非アセチル化形態のメチオニン１１タウ種にも非切断タウ種にも、Ｎ－アルファ－アセチル－Ｍｅｔ１－Ｔａｕポリペプチド（非アミノ切断タウ種）のいずれにも結合しなかったためである。

本発明は、タウポリペプチドＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ、特にペプチド（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）内に位置付けられるエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。そのような抗体は、それらがＮ－アルファ－アセチル－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ種に特異的に結合することで特徴付けられる。

特定の実施形態では、本発明の抗体は、非Ｎ－アルファ－アセチル化形態のメチオニン１１タウポリペプチド（即ち、配列番号９）及び／又はＮ－アルファ－アセチル－Ｍｅｔ１－Ｔａｕポリペプチド（即ち、配列番号１０）に結合しない。

本発明によれば、「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において等しく使用される。本明細書中で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。そのようなものとして、用語「抗体」は、完全な抗体分子だけでなく、しかし、また、抗体フラグメントならびに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）を包含する。天然抗体において、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに連結され、各々の重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に連結されている。軽鎖の２つの型、ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（又はアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各々の鎖は異なる配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、集合的にＣＨとして言及する）を含む。軽鎖の可変領域（ＶＬ）及び重鎖の可変領域（ＶＨ）の両方が、抗原への結合認識及び特異性を決定する。軽鎖の定常領域ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常領域ドメイン（ＣＨ）は、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などを付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位及び抗原決定基の間での構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で作られる。時折、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基は、全ドメイン構造及び、それ故に、結合部位に影響を与える。相補性決定領域又はＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に定めるアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、各々が、３つのＣＤＲを有する（それぞれＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ＶＬ－ＣＤＲ３及びＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３と命名される）。抗原結合部位は、従って、重鎖及び軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列を指す。

ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕポリペプチドに結合する抗体は、当技術分野において公知の従来の方法によりアッセイすることができる。本発明のポリペプチドの成熟形態は、好ましくは、本発明のポリペプチドのエピトープへの（特にＡｃ－Ｍｅｔ１１エピトープ：（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）への）抗体結合をアッセイするために使用する。あるいは、ｍＡｂ ２Ｈ２Ｄ１１の結合を保持する本発明のポリペプチドの任意の変異形態を使用することができる。多くの異なる競合結合アッセイフォーマットを、エピトープ結合を決定するために使用することができる。使用することができるイムノアッセイは、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、及び補体固定アッセイなどの技術を使用した競合アッセイシステムを含むが、それらに限定されない。そのようなアッセイはルーチンであり、当技術分野において周知である（例、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。例えば、BIACORE（登録商標）（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするためにルーチン的に使用される多様な表面プラズモン共鳴アッセイ形式の１つである。加えて、ルーチンの交差遮断アッセイ、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988において記載されているようなものなどを実施することができる。適切なＥＬＩＳＡアッセイの例を、また、以下の実施例において記載する。

本明細書中で使用するように、用語「親和性」は、単一の抗原部位での抗体と抗原（特にＡｃ－Ｍｅｔ１１抗原：（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８））の間での相互作用の強さを指す。各々の抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域が、弱い非共有結合力を通じて、多数の部位で抗原と相互作用する；相互作用が多いほど、親和性が強くなる。親和性は、Ｋ_Ｄを測定することにより決定することができる。用語「Ｋ_Ｄ」は、本明細書中で使用するように、解離定数を指すことを意図し、それは、Ｋ_ｄとＫ_ａの比率（即ち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から得られ、モル濃度（M）として表される。抗体についてのＫ_Ｄ値は、当技術分野において十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫ_Ｄを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによる、又はバイオセンサーシステム、例えばBiacore（登録商標）システムなどを使用することによる。

これらの抗体はポリクローナル又はモノクローナルでありうる。抗体がモノクローナルである場合、それらは、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体、抗体フラグメント、及び単一ドメイン抗体に対応しうる。

用語「キメラ抗体」は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、ならびにヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインを含む抗体を指す。

本発明によれば、用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体からの可変領域フレームワーク及び定常領域を有する抗体を指すが、しかし、以前の非ヒト抗体のＣＤＲを保持する。

用語「抗体フラグメント」は、抗体のＣＤＲを含む可変ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。基本的な抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖを含む。抗体フラグメントの例については、総説、Holliger et al Nature Biotechnology 23, issue 9 1126 - 1136 (2005)も参照のこと。これは参照により本明細書中に含まれる。

用語「Ｆａｂ」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを意味し、それにおいては、プロテアーゼであるパパインを用いてＩｇＧを処理することにより得られるフラグメントの内、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分及びＬ鎖全体が、ジスルフィド結合を通じて一緒に結合されている。

用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを示し、それは、プロテアーゼであるペプシンを用いてＩｇＧを処理することにより得られるフラグメントの内、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されるＦａｂよりもわずかに大きい。

用語「Ｆａｂ’」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、それは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる。

単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、それは、通常は、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化された、ＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。二価及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合により自然に形成することができる、又は、ペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖを結合させることにより生成することができ、例えば二価ｓｃ（Ｆｖ）２などである。

用語「ダイアボディ」、「トリボディ」、又は「テトラボディ」は、多価抗原結合部位（２、３、又は４）を伴う小さな抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ－ＶＬ）。同じ鎖上で２つのドメイン間での対合を可能にするには短過ぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作るように強いられる。

本明細書中で使用するように、用語「単一ドメイン抗体」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、軽鎖を自然に欠いているラクダ哺乳動物において見出されうる型の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。そのような単一ドメイン抗体はまた、ＶＨＨ又は「ナノボディ（登録商標）」と呼ぶ。（単一）ドメイン抗体の一般的な記載については、上で引用した先行技術、ならびにＥＰ ０ ３６８ ６８４、Ward et al.（Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6）、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490；及びＷＯ ０６／０３０２２０、ＷＯ ０６／００３３８８も参照のこと。ＶＨＨはヒトＩｇＧ分子のものの約１０分の１の分子量を有し、わずか数ナノメートルの物理的な直径を有する。小さなサイズの１つの結果は、より大きな抗体タンパク質に機能的に不可視である抗原部位に結合する単一ドメイン抗体（又はＶＨＨ）の能力であり、即ち、単一ドメイン抗体（又はＶＨＨ）は、古典的な免疫学的技術を使用して、本来なら潜在性である抗原を検出するための試薬として、及び可能な治療用薬剤として有用である。このように、小さなサイズのさらに別の結果は、単一ドメイン抗体（又はＶＨＨ）が、標的タンパク質の溝又は狭い裂け目中の特定部位への結合の結果として活性／相互作用を阻害することができ、及び、それ故に、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量薬物の機能により密接に似た能力において役割を果たしうる。折り畳みの低分子量及びコンパクトさによって、ＶＨＨは極度に熱安定性であり、極度のｐＨに対して及びタンパク質分解消化に対して安定であり、ならびにＦｃフラグメントの非存在によって低い抗原特性が提供される。別の結果は、ＶＨＨが循環器系から組織中に容易に移動し、血液脳関門を通過するより高い可能性を有し、神経組織に影響する障害を処置することができることである。単一ドメイン抗体（又はＶＨＨ）は、血液脳関門を通過する薬物輸送をさらに促進することができる。２００４年８月１９日に公開された米国特許出願２００４０１６１７３８を参照のこと。ヒトへの低い抗原性と組み合わされたこれらの特色は、大きな治療的な潜在力を示す。単一ドメイン抗体のアミノ酸配列及び構造は、当技術分野において及び本明細書中で「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」として；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」としてそれぞれ言及される４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」から構成されると考えることができ、それらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」により中断され、それらは、当技術分野において「ＣＤＲ１」について「相補性決定領域」として；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」として、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」としてそれぞれ言及される。したがって、単一ドメイン抗体は、一般的な構造を伴うアミノ酸配列として定義することができる：ＦＲｌ－ＣＤＲｌ－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４、それにおいてＦＲ１からＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１から４を指し、及びそれにおいてＣＤＲ１からＣＤＲ３は相補性決定領域１から３を指す。本発明の文脈において、単一ドメイン抗体のアミノ酸残基は、International ImMunoGeneTics情報システムのアミノ酸ナンバリング（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）により与えられる、ＶＨ（可変重鎖）ドメインについての一般的なナンバリングに従ってナンバリングされる。

そのような抗体を得るための方法は当技術分野において周知である。例えば、本発明に従ったモノクローナル抗体は、（ｉ）から（ｖｉｉｉ）のいずれか１つを含む、又はからなる前記フラグメントを用いた非ヒト哺乳動物の免疫化を通じて得ることができる。ポリクローナル抗体から開始し、次に、標準的な方法を使用してモノクローナル抗体を得ることができる。

本発明のさらなる目的は、タウオパチーの処置における使用のための本発明の抗体に関する。

用語「タウオパチー」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、タウ凝集により特徴付けられる疾患を指す（Iqbal, K. et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1739 (2005) 198-210）。タウオパチーには、とりわけ、アルツハイマー病、ダウン症候群；Ｇｕａｍパーキンソニズム認知症複合体；拳闘家認知症及び他の慢性外傷性脳症；筋緊張性ジストロフィー；ニーマンピック病Ｃ型；ピック病；嗜銀性顆粒病；前頭側頭型認知症；大脳皮質基底核変性症；淡蒼球橋黒質変性症；進行性核上性麻痺；及びプリオン障害、例えばタングルを伴うゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病などを含む。

特定の実施形態では、タウオパチー障害はアルツハイマー病である。

本発明の特異的抗体

本発明者らは、モノクローナル抗体２Ｈ２Ｄ１１の軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、及び重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）をクローン化し、配列決定した。前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列の位置は、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って決定されている。ＩＭＧＴ固有ナンバリングは、抗原受容体、鎖の型、又は種を問わず、可変ドメインを比較するために定義されている（Lefranc M.-P., Immunology Today, 18, 509 (1997)；Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)；Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003).）。

一実施形態では、本発明は、以下を含む抗タウ抗体に関する：
（ａ）可変ドメインが以下を含む重鎖：
－ 配列番号１１として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ１、及び
－ 配列番号１２として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ２、及び
－ 配列番号１３として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ３；
（ｂ）可変ドメインが以下を含む軽鎖：
－ 配列番号１４として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ１、及び
－ 配列番号１５として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ２、及び
－ 配列番号１６として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ３。
（ｃ）抗体２Ｈ２Ｄ１１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び／又は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性を伴ってＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕポリペプチドに結合する。

一実施形態では、本発明の抗体は以下を含む：
（ａ）可変ドメインが以下を含む重鎖：
－ 配列番号１１として示される配列を有するＨ－ＣＤＲ１、及び
－ 配列番号１２として示される配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び
－ 配列番号１３として示される配列を有するＨ－ＣＤＲ３；
（ｂ）可変ドメインが以下を含む軽鎖：
－ 配列番号１４として示される配列を有するＬ－ＣＤＲ１、及び
－ 配列番号１５として示される配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び
－ 配列番号１６として示される配列を有するＬ－ＣＤＲ３。

一実施形態では、本発明の抗体は以下を含み：
－ 可変ドメインが配列番号１７として示される配列と少なくとも７０%の同一性を有する重鎖
－ 可変ドメインが配列番号１８として示される配列と少なくとも７０%の同一性を有する軽鎖
及び、抗体２Ｈ２Ｄ１１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び／又は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性を伴ってＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕポリペプチドに結合する。

一実施形態では、本発明の抗体は以下を含み：
－ 可変ドメインが配列番号１７として示される配列と少なくとも８０%の同一性を有する重鎖
－ 可変ドメインが配列番号１８として示される配列と少なくとも８０%の同一性を有する軽鎖
及び、抗体２Ｈ２Ｄ１１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び／又は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性を伴ってＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに結合する。

一実施形態では、本発明の抗体は以下を含み：
－ 可変ドメインが配列番号１７として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有する重鎖
－ 可変ドメインが配列番号１８として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有する軽鎖
及び、抗体２Ｈ２Ｄ１１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び／又は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性を伴ってＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕポリペプチドに結合する。

一実施形態では、本発明の抗体は以下を含む：
－ 可変ドメインが配列番号１７として示される配列を有する重鎖、及び
－ 可変ドメインが配列番号１８として示される配列を有する軽鎖。

一部の実施形態では、本発明に従った抗体（２Ｈ２Ｄ１１誘導体）は、配列番号１１として示される配列を有するＨ－ＣＤＲ１、配列番号１２として示される配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号１３として示される配列を有するＨ－ＣＤＲ３、配列番号１４として示される配列を有するＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５として示される配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１６として示される配列を有するＬ－ＣＤＲ３を含む。

特定の実施形態では、上に記載する抗体は同じ抗原に結合し、本発明の抗体、即ち、配列番号１１から１６のＣＤＲを伴う抗体と同じ、又は改善された特性（「２Ｈ２Ｄ１１類似体」の定義を参照のこと）を有する。

特定の実施形態では、本発明の抗体（例えば２Ｈ２Ｄ１１又は類似体もしくは誘導体、及びＡｃ－Ｍｅｔ１１エピトープ：（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）に結合する、治療における使用のための抗体など）は、実験を通してタウタンパク質の病理学的播種及び／又は凝集を阻害することができる。

本明細書中で使用するように、「２Ｈ２Ｄ１１類似体」又は「２Ｈ２Ｄ１１誘導体」は、タウタンパク質（特にＡｃ－Ｍｅｔ１１エピトープ：（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号：８））への同じ、又はより良好な結合、ならびに配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬを伴う抗体２Ｈ２Ｄ１１の生物学的活性の少なくとも１つを示す抗体を指す。

本発明の抗体は、例えば、実験を通してタウタンパク質の病理学的播種及び／又は凝集を阻害することが可能であることで特徴付けられうる（ＨＥＫ２９３レポーター細胞株における凝集播種アッセイを参照のこと）。簡単には、そのようなアッセイは、ＭＴＢＤ－Ｐ３０１Ｓ凝集の誘導時に一緒にＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）シグナルを生成するＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）又はＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）のいずれかに融合された、Ｐ３０１Ｓ変異を伴うタウＲＤ（ＭＴＢＤ）を構成的に発現するセンサー細胞株に基づく。ＭＴＢＤ－Ｐ３０１Ｓタンパク質の細胞内凝集は、タウシードの存在において誘導され、ＦＲＥＴシグナルを導く（Holmes et al. 2014）。

本発明の抗体の生物学的活性は、例えば、上に記載するように、タウタンパク質の病理学的播種及び／又は凝集のレベルを低下させることである。タウの病理学的播種及び／又は凝集レベルの評価によって、抗体の治療的特性、例えばタウオパチーにおいて観察される認知障害の矯正などを決定することが可能になる。

抗体２Ｈ２Ｄ１１の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＨ）ならびにドメイン（ＣＤＲ）についての配列を以下の表１中に示す：

２Ｈ２Ｄ１１及び変異体のＣＤＲ配列を太字で示す。

本明細書中で使用するように、用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において等しく使用する。本明細書中で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子（Ａｃ－Ｍｅｔ１１ Ｔａｕ種）を指す。そのようなものとして、用語「抗体」は、完全な抗体分子だけでなく、しかし、また、抗体フラグメントならびに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）を包含する。天然抗体において、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに連結され、各々の重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に連結されている。軽鎖の２つの型、ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（又はアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各々の鎖は異なる配列ドメインを含む。軽鎖は２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、集合的にＣＨとして言及する）を含む。軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖の両方の可変領域が、抗原への結合認識及び特異性を決定する。軽（ＣＬ）鎖及び重（ＣＨ）鎖の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などを付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間での構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で作られる。時折、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基は、抗体結合部位に関与し、全ドメイン構造及び、それ故に、結合部位に影響しうる。相補性決定領域又はＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に定めるアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、各々が、３つのＣＤＲを有する（それぞれＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３及びＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と命名される）。抗原結合部位は、従って、６つのＣＤＲ（重鎖及び軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む）を含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列を指す。本発明の文脈において、本発明の抗体のアミノ酸残基は、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従ってナンバリングされる。ＩＭＧＴ固有ナンバリングは、抗原受容体、鎖の型、又は種を問わず、可変ドメインを比較するために定義されている（Lefranc M.-P., “Unique database numbering system for immunogenetic analysis” Immunology Today, 18, 509 (1997)；Lefranc M.-P., “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist, 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, G., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains” Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)）。ＩＭＧＴ固有ナンバリングでは、保存されたアミノ酸は常に同じ位置を有する（例えば、システイン２３、トリプトファン４１、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４、フェニルアラニン又はトリプトファン１１８）。ＩＭＧＴ固有ナンバリングによって、フレームワーク領域（ＦＲ１－ＩＭＧＴ：１～２６位、ＦＲ２－ＩＭＧＴ：３９～５５、ＦＲ３－ＩＭＧＴ：６６～１０４、及びＦＲ４－ＩＭＧＴ：１１８～１２８）及び相補性決定領域：ＣＤＲ１－ＩＭＧＴ：２７～３８、ＣＤＲ２－ＩＭＧＴ：５６～６５、及びＣＤＲ３－ＩＭＧＴ：１０５～１１７の標準化された分界が提供される。ＣＤＲ３－ＩＭＧＴの長さが１３アミノ酸未満である場合、ギャップがループの上部から以下の順序１１１、１１２、１１０、１１３、１０９、１１４などで作られる。ＣＤＲ３－ＩＭＧＴの長さが１３アミノ酸を上回る場合、追加の位置が、ＣＤＲ３－ＩＭＧＴループの上部の位置１１１と１１２の間に、以下の順序１１２．１、１１１．１、１１２．２、１１１．２、１１２．３、１１１．３などで作られる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／ＩＭＧＴ－ＦＲＣＤＲｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）。

本明細書中で使用するように、用語「特異性」は、抗原、例えばＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕなどの上に提示されるエピトープに検出可能に結合する抗体の能力を指し、非アセチル化形態のＭｅｔ１１－Ｔａｕタンパク質又は構造（例えばＴＡＭ上で又は他の細胞型上で発現される他のタンパク質など）との比較的小さな検出可能な反応性を有する。特異性は、本明細書中の他で記載するように、例えば、Biacore機器を使用した結合アッセイ又は競合結合アッセイにより相対的に決定することができる。特異性は、例えば、他の無関係な分子への非特異的結合における親和性／結合力に対する特定の抗原への結合における親和性／結合力の約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１又はそれ以上の比率により示されうる（この場合では、特定の抗原はＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕである）。

用語「親和性」は、本明細書中で使用するように、エピトープへの抗体の結合の強さを意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄにより与えられ、式中、［Ａｂ－Ａｇ］は抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、及び［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和定数Ｋａは１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための好ましい方法を、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、及びMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)において見出すことができ、それらの参考文献は、参照により本明細書中に完全に組み入れられる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野において周知の１つの好ましい標準的な方法は、Biacore機器の使用である。

本発明の抗体は、当技術分野において公知の任意の方法により特異的結合についてアッセイされうる。多くの異なる競合結合アッセイフォーマットをエピトープ結合のために使用することができる。使用することができるイムノアッセイは、例えばウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降アッセイ、ゲル拡散沈降アッセイ、免疫ラジオメトリーアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、及び補体固定アッセイなどの技術を使用した競合アッセイシステムを含むが、これらに限定されない。そのようなアッセイはルーチン的であり、当技術分野において周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。例えば、BIACORE（登録商標）（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするためにルーチン的に使用される多様な表面プラズモン共鳴アッセイ形式の１つである。加えて、ルーチン的な交差遮断アッセイ、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988において記載されているようなものを実施することができる。

本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナルＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」、「ｍＡｂ」などは、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについて単一の結合特異性及び親和性を呈する。

本明細書中で使用するように、２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各々のギャップの長さを考慮に入れた、配列により共有される同一位置の数（即ち、%同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）の関数である。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下に記載するように、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム中に組み入れられているE. Myers and W. Miller（Comput. Appl. Biosci. 4: 1 1-17, 1988）のアルゴリズムを使用して決定することができる。また、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み入れられているNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol. 48:443- 453, 1970）のアルゴリズムを使用して決定することができる。パーセント同一性を決定するためのさらに別のプログラムは、ＣＬＵＳＴＡＬ（M. Larkin et al., Bioinformatics 23:2947-2948, 2007；D. Higgins and P. Sharp, Gene 73:237-244, 1988により最初に記載されている）であり、それは、スタンドアロンプログラムとして、又はＷｅｂサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／を参照のこと）を介して入手可能である。

２つのヌクレオチドアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、例えば、アルゴリズム、例えば核酸配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムなどを使用し、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用して決定してもよい。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、以下を含む：
（ａ）可変ドメインが以下を含む重鎖：
－ 抗体２Ｈ２Ｄ１１のＨ－ＣＤＲ１（配列番号１１）内に少なくとも５、４、３、２、１の保存的置換を有するＨ－ＣＤＲ１；
－ 抗体２Ｈ２Ｄ１１のＨ－ＣＤＲ２（配列番号１２）内に少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１の保存的置換を有するＨ－ＣＤＲ２；
－ 抗体２Ｈ２Ｄ１１のＨ－ＣＤＲ３（配列番号１３）内に少なくとも９、８、７、６、５、４、３、２、１の保存的置換を有するＨ－ＣＤＲ３；
（ｂ）可変ドメインが以下を含む軽鎖：
－ 抗体２Ｈ２Ｄ１１のＬ－ＣＤＲ１（配列番号１４）内に少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１の保存的置換を有するＬ－ＣＤＲ１；
－ 抗体２Ｈ２Ｄ１１のＬ－ＣＤＲ２（配列番号１５）内に少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１の保存的置換を有するＬ－ＣＤＲ２；
－ 抗体２Ｈ２Ｄ１１のＬ－ＣＤＲ３（配列番号１６）内に少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１の保存的置換を有するＬ－ＣＤＲ３。
（ｃ）抗体２Ｈ２Ｄ１１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び／又は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性を伴いＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに結合する。

本発明の抗体は、当技術分野において公知の任意の技術（例えば、限定しないが、任意の化学的、生物学的、遺伝的、又は酵素的技術などを、単独又は組み合わせのいずれかで）により産生される。典型的には、所望の配列のアミノ酸配列が公知であれば、当業者は、ポリペプチドの産生のための標準的技術により、前記抗体を容易に産生することができる。例えば、それらは、周知の固相方法を使用し、好ましくは、商業的に入手可能なペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティ）により作られたものなど）を使用し、製造業者の指示に従って合成することができる。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術により合成することができる。例えば、抗体は、発現ベクター中への抗体をコードするＤＮＡ配列の組み入れ及び所望の抗体を発現する適切な真核生物又は原核生物宿主中へのそのようなベクターの導入後にＤＮＡ発現産物として得ることができ、そこからそれらを、周知の技術を使用して後に単離することができる。

一実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、特にキメラマウス／ヒト抗体である。

本発明によれば、用語「キメラ抗体」は、非ヒト抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、ならびにヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインを含む抗体を指す。

一部の実施形態では、本発明のヒトキメラ抗体は、以前に記載されたようにＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードする核酸配列を得ること、それらを、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中に挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築すること、ならびに発現ベクターを動物細胞中に導入することによりコード配列を発現させることにより産生することができる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとして、それは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域でありうるが、しかし、ＩｇＧクラスのものが適切であり、ＩｇＧクラスに属するサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などの任意の１つも使用することができる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとして、それは、Ｉｇに属する任意の領域でありうるが、カッパクラス又はラムダクラスのものを使用することができる。従来の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術を含む、キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である（Morrison SL. et al. (1984)ならびに特許文献ＵＳ５，２０２，２３８；及びＵＳ５，２０４，２４４を参照のこと）。

別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。特に、前記ヒト化抗体において、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域、及び、場合により、存在する場合にはヒト定常ドメイン、及び非ヒトドナーＣＤＲ、例えばマウスＣＤＲなどを含む。

別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体を、ヒト化と同じ方法に基づいて、イヌ化又は霊長類化する。

本発明によれば、用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体からの可変領域フレームワーク及び定常領域を有する抗体を指すが、しかし、以前の非ヒト抗体のＣＤＲを保持する。

本発明のヒト化抗体を、以前に記載されたように、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得ること、それらを、（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域及び（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中に挿入することによりヒト化抗体発現ベクターを構築すること、ならびに発現ベクターを動物細胞中に導入することにより遺伝子を発現させることにより産生してもよい。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子及び抗体軽鎖をコードする遺伝子が、別々のベクター上に存在する型又は両方の遺伝子が同じベクター上に存在する型（タンデム型）のいずれかでありうる。ヒト化抗体発現ベクターの構築の簡単さ、動物細胞中への導入の簡単さ、ならびに動物細胞における抗体Ｈ及びＬ鎖の発現レベル間のバランスに関して、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターの例は、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などを含む。従来の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術に基づく、ヒト化抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Riechmann L. et al. 1988；Neuberger MS. et al. 1985を参照のこと）。抗体は、当技術分野において公知の種々の技術、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又はリサーフェイシング（ＥＰ ５９２，１０６；ＥＰ ５１９，５９６；Padlan EA (1991)；Studnicka GM et al. (1994)；Roguska MA. et al. (1994)）、及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を使用してヒト化することができる。そのような抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３及び国際特許出願ＷＯ ９６／０２５７６を参照のこと）。

本発明の抗体のフラグメント

一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、単一ドメイン抗体、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ユニボディ、ミニボディ、マキシボディ、小さなモジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）として抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位、及びＶＬ鎖又はＶＨ鎖、ならびに配列番号１７又は配列番号１８と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００%の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択される抗原結合フラグメントである。

抗体の用語「抗原結合フラグメント」は、本明細書中で使用するように、所与の抗原（例、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ）に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体のフラグメントにより実施することができる。抗体の用語「抗原結合フラグメント」内に包含される結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；Ｆａｂ’フラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域からなる一価フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価フラグメント；抗体の単一アームのＶＨドメインからなるＦｄフラグメント；ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え方法を使用し、ＶＬ及びＶＨ領域が対になり一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする人工ペプチドリンカーにより連結することができる（単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）として公知である；例えば、Bird et al., 1989 Science 242:423-426；及びHuston et al., 1988 proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照のこと）。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。二価及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合により自然に形成することができる、又はペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖを結合させることにより生成することができる（例えば二価ｓｃ（Ｆｖ）２など）。そのような単鎖抗体は、抗体の１つ以上の抗原結合部分あるいはフラグメントを含む。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、そのフラグメントは、有用性について、インタクトな抗体と同じ様式でスクリーニングされる。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を欠く別の型の抗体フラグメントである。ヒンジ領域の欠失は、従来のＩｇＧ４抗体の本質的に半分のサイズであり、ＩｇＧ４抗体の二価結合領域よりむしろ一価結合領域を有する分子をもたらす。抗原結合フラグメントは、単一ドメイン抗体、ＳＭＩＰ、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、及びテトラボディ中に組み入れることができる（例、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照のこと）。用語「ダイアボディ」「トリボディ」、又は「テトラボディ」は、多価抗原結合部位（２、３、又は４）を伴う小さな抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ－ＶＬ）。同じ鎖上で２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作るように強制される。抗原結合フラグメントは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む単鎖分子に組み入れることができる（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10); 1057-1062及び米国特許第５，６４１，８７０号）。

本発明のＦａｂは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕと特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるパパインを用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核生物発現系用の又は真核生物発現系用のベクター中に挿入すること、及び、そのベクターを、（適切に）原核生物又は真核生物中に導入し、Ｆａｂを発現させることにより産生することができる。

本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕと特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるペプシンを用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して、以下に記載するＦａｂ’を結合することにより産生することができる。

本発明のＦａｂ’は、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕと特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤であるジチオスレイトールを用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを、原核生物用の発現ベクター、又は真核生物用の発現ベクター中に挿入すること、及び、そのベクターを、（適切に）原核生物又は真核生物中に導入し、その発現を実施することにより産生することができる。

本発明のｓｃＦｖは、以前に記載されたように、ＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得ること、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、このＤＮＡを原核生物用の発現ベクター、又は真核生物用の発現ベクター中に挿入すること、次にこの発現ベクターを（適切に）原核生物又は真核生物中に導入し、ｓｃＦｖを発現させることにより産生することができる。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを生成するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を使用してもよく、それは、相補性決定領域（ＣＤＲ）をドナーｓｃＦｖフラグメントより選択すること、及び、それらを、公知の三次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワーク上に移植することを含む（例、Ｗ０９８／４５３２２；ＷＯ ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照のこと）。

ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、抗体の最も小さな機能的結合単位（分子量約１３ｋＤａ）であり、抗体の重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応する。ドメイン抗体及びそれらの産生の方法に関するさらなる詳細は、ＵＳ ６，２９１，１５８；６，５８２，９１５；６，５９３，０８１；６，１７２，１９７；及び６，６９６，２４５；ＵＳ ２００４／０１１０９４１；ＥＰ １４３３８４６、０３６８６８４、及び０６１６６４０；ＷＯ ２００５／０３５５７２、２００４／１０１７９０、２００４／０８１０２６、２００４／０５８８２１、２００４／００３０１９、及び２００３／００２６０９において見出され、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。

核酸分子、ベクター、宿主細胞

本発明のさらなる目的は、本発明に従った抗体をコードする核酸分子に関する。特に、核酸分子は、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする。

特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１９又は配列番号２０と少なくとも７０%の同一性を有する核酸配列を含む。

特に、核酸分子は、配列番号１９又は配列番号２０と少なくとも８０%の同一性を有する核酸配列を含む。

特に、核酸分子は、配列番号１９又は配列番号２０と少なくとも９０%の同一性を有する核酸配列を含む。

特に、核酸分子は、配列番号１９又は配列番号２０と少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有する核酸配列を含む。

可変ドメイン重鎖：核酸配列ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４：配列番号１９

可変ドメイン軽鎖：核酸配列ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４：配列番号２０

典型的には、前記核酸はＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、それは、任意の適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターなどにおいて含まれうる。本明細書中で使用するように、用語「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例、外来遺伝子）を宿主細胞中に導入することができ、宿主を形質転換し、導入配列の発現（例、転写及び翻訳）を促進する媒体を意味する。そのため、本発明のさらなる態様は、本発明の核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターは、調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み、被験者への投与時に前記抗体の発現を引き起こしうる、又はそれに向けうる。動物細胞用の発現ベクターにおいて使用されるプロモーター及びエンハンサーの例は、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）及びエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などを含む。適切なベクターの例は、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O’Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１ベータｄ２－４－（Miyaji H et al. 1990）などを含む。プラスミドの他の例は、複製起点を含む複製プラスミド、又は統合プラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどを含む。ウイルスベクターの他の例は、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、及びＡＡＶベクターを含む。そのような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術により、例えばパッケージング細胞をトランスフェクトすることにより、又はヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いた一過性トランスフェクションにより産生してもよい。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などを含む。そのような複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルが、例えば、ＷＯ ９５／１４７８５、ＷＯ ９６／２２３７８、ＵＳ ５，８８２，８７７、ＵＳ ６，０１３，５１６、ＵＳ ４，８６１，７１９、ＵＳ ５，２７８，０５６、及びＷＯ ９４／１９４７８において見出されうる。

本発明のさらなる態様は、本発明に従った核酸及び／又はベクターによりトランスフェクト、感染、又は形質転換された宿主細胞に関する。

用語「形質転換」は、宿主細胞への「外来」（即ち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の導入を意味し、宿主細胞が、導入された遺伝子又は配列を発現し、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子又は配列によりコードされるタンパク質又は酵素を産生するようにする。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取り、発現する宿主細胞は「形質転換」されている。

本発明の核酸を使用し、適切な発現系において本発明の抗体を産生してもよい。用語「発現系」は、適切な条件下での、例えば、ベクターにより運ばれ、宿主細胞中に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための宿主細胞及び適合するベクターを意味する。一般的な発現系は、大腸菌宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞及びベクターを含む。宿主細胞の他の例は、限定しないが、原核細胞（例えば細菌など）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）を含む。特定の例は、大腸菌、クルイベロマイセス又はサッカロマイセス酵母、哺乳動物細胞株（例、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）ならびに初代又は確立された哺乳動物細胞培養（例、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生される）を含む。例はまた、マウスＳＰ２／０－Ａｇｌ４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」として言及する）を欠損しているＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」として言及する）などを含む。

一部の実施形態では、本発明のための有用なベクターは、ウイルスベクターである。本発明の実践において有用な遺伝子送達ウイルスベクター（本発明の抗体の直接的なインビボ送達用）は、分子生物学の技術分野において周知の方法論を利用して構築することができる。典型的には、導入遺伝子を運ぶウイルスベクターは、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、適切な調節エレメント、及び細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の産生のために必要なエレメントから組み立てられる。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含むが、それらに限定されない。一部の実施形態では、本発明のベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。「ＡＡＶベクター」により、限定しないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、又はヒト、サル、もしくは他の種に感染することができる任意の他のＡＡＶの血清型を含む、アデノ随伴ウイルス血清型から由来するベクターを意味する。一部の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、哺乳動物の中枢神経系及び末梢神経系の細胞、特にニューロン、ニューロン前駆細胞、星状細胞、希突起膠細胞、及びグリア細胞において向性及び高い形質導入効率を有するＡＡＶ血清型から由来するベクターより選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、脳細胞、特にニューロンを十分に形質導入することが記載されているＡＡＶ４、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ１０である。

本発明はまた、本発明に従った抗体を発現する組換え宿主細胞を産生する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：（ｉ）インビトロ又はエクスビボで、上に記載するような組換え核酸又はベクターを、コンピテント宿主細胞中に導入すること、（ｉｉ）インビトロ又はエクスビボで、得られた組換え宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択すること。そのような組換え宿主細胞を、本発明の抗体の産生のために使用することができる。本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手段、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなどにより培養培地から適切に分離される。

機能的変異体及び競合抗体

本発明は、２Ｈ２Ｄ１１抗体のＶＬ領域、ＶＨ領域、あるいは１つ以上のＣＤＲの機能的変異体を含む抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体の文脈において使用されるＶＬ、ＶＨ、又はＣＤＲの機能的変異体は、抗体が、親抗体（即ち、６－２５抗体）の親和性／結合力及び／又は特異性／選択性の少なくとも実質的な割合（少なくとも約５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、９５%又はそれ以上）を保持することを依然として可能にし、ならびに、一部の場合では、本発明のそのようなモノクローナル抗体は、親Ａｂよりも高い親和性、選択性及び／又は特異性と関連付けられうる。そのような変異体は、ＣＤＲを変異させること（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌のミューテーター株の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャッフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）、及びsexualＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含む、多数の親和性成熟プロトコールにより得ることができる。Vaughanら（上記）は、親和性成熟のこれらの方法について考察している。そのような機能的変異体は、典型的には、親Ａｂに対して有意な配列同一性を保持する。ＣＤＲ変異体の配列は、大半の保存的置換を通じて、親抗体配列のＣＤＲの配列とは異なりうる；例えば、変異体における置換の少なくとも約３５%、約５０%又はそれ以上、約６０%又はそれ以上、約７０%又はそれ以上、約７５%又はそれ以上、約８０%又はそれ以上、約８５%又はそれ以上、約９０%又はそれ以上、（例、約６５～９５%、例えば約９２%、９３%、又は９４%など）は、保存的アミノ酸残基置換である。ＣＤＲ変異体の配列は、大半の保存的置換を通じて、親抗体配列のＣＤＲの配列とは異なりうる；例えば、変異体における置換の少なくとも１０、例えば少なくとも９、８、７、６、５、４、３、２、又は１などは、保存的アミノ酸残基置換である。本発明の文脈において、保存的置換は、以下のように反映されるアミノ酸のクラス内の置換によって定義されうる：
脂肪族残基Ｉ、Ｌ、Ｖ、及びＭ
シクロアルケニル関連残基Ｆ、Ｈ、Ｗ、及びＹ
疎水性残基Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹ
負荷電残基Ｄ及びＥ
極性残基Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴ
正荷電残基Ｈ、Ｋ、及びＲ
小さな残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、及びＶ
非常に小さな残基Ａ、Ｇ、及びＳ
ターン中に含まれる残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、及びフォーメーションＴ
柔軟な残基Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、及びＲ

より保存的な置換グルーピングは、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンを含む。疎水性／親水性特性及び残基の重量／サイズに関する保存も、６－２５抗体のＣＤＲと比較し、変異体ＣＤＲにおいて実質的に保持される。タンパク質上に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対的な疎水性特徴が、結果としてのタンパク質の二次構造に寄与し、それは次に、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義することが受け入れられている。各々のアミノ酸は、それらの疎水性及び荷電特徴に基づいて疎水性指標が割り当てられており、これらは以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）。類似残基の保持はまた、あるいは代替的にＢＬＡＳＴプログラム（例、標準設定ＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップ＝１１及び拡張ギャップ＝１を使用するＮＣＢＩを通じて利用可能なＢＬＡＳＴ ２．２．８）の使用により決定されるような類似性スコアにより測定されうる。適切な変異体は、典型的には、親ペプチドに対して少なくとも約７０%の同一性を示す。本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０%の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００%の同一性を有することを意味する。本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも９０%の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００%の同一性を有することを意味する。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ１と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ２と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ３と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ１と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ２と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ３と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ１と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ２と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ３と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖ならびにｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ１と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ２と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ３と少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖ならびにｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１７と少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有する重鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１８と少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有する軽鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１７と少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有する重鎖ならびに配列番号１８と少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有する軽鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１７と同一である重鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１８と同一である軽鎖を有する抗体である。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１７と同一である重鎖及び配列番号１８と同一である軽鎖を有する抗体である。

別の態様では、本発明は、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕへの結合について、本発明の抗体と競合する抗体を提供する。

本明細書中で使用するように、所定の抗原又はエピトープへの抗体の結合の文脈における用語「結合」は、典型的には、例えば、リガンドとして可溶形態の抗原を使用し、分析物として抗体を使用して、BIAcore 3000機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定された場合、約１０－７M又はそれ以下、例えば約１０－８M又はそれ以下など、例えば約１０－９M又はそれ以下、約１０－１０M又はそれ以下、あるいは約１０－１１M又はそれ以下のＫＤに対応する親和性を伴う結合である。BIACORE（登録商標）（GE Healthcare、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするためにルーチン的に使用される多様な表面プラズモン共鳴アッセイ形式の１つである。典型的には、抗体は、所定の抗原と同一ではない、又は密接に関連していない非特異的抗原（例、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するためのそのＫＤよりも少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば、少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性を伴って所定の抗原に結合する。したがって、抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が高い親和性を有する）場合、それが抗原に結合するＫＤは、典型的には、非特異的抗原についてのそのＫＤよりも少なくとも１０，０００倍低い。抗体は、そのような結合が検出不可能である（例えば、リガンドとして可溶形態の抗原を、及び分析物として抗体を使用した、BIAcore 3000機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用）、あるいは、その抗体及び異なる化学構造又はアミノ酸配列を有する抗原又はエピトープにより検出される結合よりも、１００倍、５００倍、１０００倍、又は１０００倍もしくはそれ以上少ない場合、抗原又はエピトープに本質的に結合しないと言われる。

抗体操作

本発明の操作抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に行われたものが含まれる。典型的には、そのようなフレームワークの修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「逆変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含みうる。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列配置に戻すために、体細胞変異を、例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介性変異誘発により生殖系列配列に「逆変異」させることができる。そのような「逆変異」抗体もまた、本発明により包含されることが意図される。別の型のフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、あるいはさらに１つ以上のＣＤＲ領域内で１つ以上の残基を変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチはまた、「脱免疫化」として言及され、Carrらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。

一部の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。グリコシル化は、例えば、抗原についての抗体の親和性を増加させるように変えることができる。そのような糖修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を変えることにより達成することができる。例えば、それによって１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の除去をもたらす、１つ以上のアミノ酸置換を行うことができ、それによりその部位でのグリコシル化を除去する。そのような非グリコシル化によって、抗原についての抗体の親和性が増加されうる。そのようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号においてさらに詳細に記載されている。

一部の実施形態では、一部の変異を、第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）内及びその近くの凝集「ホットスポット」中に局在化されるアミノ酸に行い、凝集に対する抗体の感受性を減少させる（Joseph M. Perchiacca et al., Proteins 2011; 79:2637-2647を参照のこと）。

本発明の抗体は、任意のアイソタイプでありうる。アイソタイプの選択は、典型的には、所望のエフェクター機能により導かれうる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４がそうしない、又はより低い様式である場合、ＡＤＣＣ又はＣＤＣとしてのそのようなエフェクター機能を媒介するアイソタイプである。軽鎖定常領域であるカッパ又はラムダのいずれかを使用してもよい。望ましい場合、本発明のモノクローナル抗体のクラスは、公知の方法によりスイッチさせてもよい。典型的なクラススイッチ技術を使用し、１つのＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換させてもよい。このように、本発明のモノクローナル抗体のエフェクター機能は、種々の治療的使用のために、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチングにより変化されうる。

一部の実施形態では、本発明の抗体は全長抗体である。一部の実施形態では、全長抗体はＩｇＧ２抗体である。一部の実施形態では、全長抗体はＩｇＧ４抗体である。

一部の実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変えられる、例えば、増加又は減少されるように修飾される。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを促進にするために、あるいは抗体の安定性を増加又は減少させるために変えられる。

一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を変えるために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより変えられる。例えば、１つ以上のアミノ酸は、抗体が、エフェクターリガンドについて変えられた親和性を有するが、しかし、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。親和性が変えられたエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体でありうる。このアプローチは、Winterらによる米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号においてさらに詳細に記載されている。

半減期

一実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、以下の変異の１つ以上を、Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７５号において記載されているように導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体をＣＨ１又はＣＬ領域内で変えて、Prestaらによる米国特許第５，８６９，０４６号及び第６，１２１，０２２号において記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取得されたサルベージ受容体結合エピトープを含めることができる。増加した半減期及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を伴う抗体は、胎児への母体のＩｇＧの移行に関与し（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. immunol. 24:249 (1994)）、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）において記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を伴うＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１，３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を伴うものを含む。

本発明により熟慮される本明細書中の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例、血清中）半減期を増加させるためにペグ化することができる。抗体をペグ化するために、抗体、又はそのフラグメントは、典型的には、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体又は抗体フラグメントに付加される条件下で、ＰＥＧ、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などと反応する。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応又はアルキル化反応により行うことができる。本明細書中で使用するように、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態のいずれか、例えばモノ（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシ－又はアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドなどを包含することを意図する。特定の実施形態では、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、NishimuraらによるＥＰ０１５４３１６及びIshikawaらによるＥＰ０４０１３８４を参照のこと。

本発明により熟慮される抗体の別の修飾は、結果として得られる分子の半減期を増加させるための、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン又はそのフラグメントなどへの、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域のコンジュゲート又はタンパク質融合体である。そのようなアプローチは、例えば、Ballanceら、ＥＰ０３２２０９４において記載されている。別の可能性は、結果として得られる分子の半減期を増加させるための、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなどへの結合が可能なタンパク質への、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の融合体である。そのようなアプローチは、例えば、Nygrenら、ＥＰ０４８６５２５において記載されている。

ポリシアル化は別の技術であり、それによって天然ポリマーポリシアル酸（ＰＳＡ）が使用され、活性寿命が延ばされ、治療用ペプチド及びタンパク質の安定性が改善される。ＰＳＡはシアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質及び治療用ペプチド薬物送達のために使用される場合、ポリシアル酸は結合時に保護微小環境を提供する。これによって循環中の治療用タンパク質の活性寿命が延びて、免疫系によりそれが認識されるのを防止する。ＰＳＡポリマーはヒトの身体において自然に見出される。それは、その壁を覆うために何百万年にわたり進化した特定の細菌により採用された。これらの自然にポリシアル化された細菌は、次に、分子模倣のおかげで、身体の防御システムを妨害することができた。ＰＳＡは、自然の究極のステルス技術であり、そのような細菌から簡単に大量に、所定の物理的特徴を伴って産生することができる。細菌のＰＳＡは、タンパク質と結合した場合でさえ、完全に非免疫原性である。なぜなら、それは、ヒトの身体におけるＰＳＡと化学的に同一であるためである。

別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルスターチ（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳは、ワキシーメイズスターチから由来する修飾天然ポリマーであり、身体の酵素により代謝されることができる。ＨＥＳ溶液は通常、欠乏している血液量に代わり、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のヘシル化（ｈｅｓｙｌａｔｉｏｎ）は、分子の安定性を増加させることにより、ならびに腎クリアランスを低下させることにより循環半減期の延長を可能にし、増加した生物学的活性をもたらす。異なるパラメーター、例えばＨＥＳの分子量などを変動させることにより、広い範囲のＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。

別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、１つ以上のアミノ酸変異をＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン界面領域に導入し、抗体が、天然のＦｃヒンジドメインブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比べて、損なわれたＳｐＡ結合を有するようにする。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳細に記載されている。

他の修飾

本発明の特定の実施形態では、抗体は、ｐＩ（等電点）を増加させ、それらの薬物様特性を改善するように操作されている。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理学的特性の重要な決定要因である。低いｐＩを有する抗体は、溶解性が低く、安定性が低く、凝集傾向があることが公知である。さらに、低いｐＩを伴う抗体の精製は困難であり、特に臨床使用のためのスケールアップの間に問題となりうる。本発明の抗体又はそのフラグメントのｐＩを増加させることによって、それらの溶解性が改善され、抗体がより高い濃度（＞１００mg/ml）で製剤化されることが可能になった。高い濃度（例、＞１００mg/ml）での抗体の製剤化によって、硝子体内注射を介して患者の眼中により高い用量の抗体を投与することができるという利点が提供され、それは次に、タウオパシーのような神経変性疾患を含む慢性疾患の処置についての重要な利点である、減少した投薬頻度を可能にする。より高いｐＩはまた、抗体のＩｇＧバージョンのＦｃＲｎ媒介性リサイクリングを増加させうるが、このように、薬物がより長い期間にわたり身体中で存続することを可能にし、より少ない注射を要求する。最後に、抗体の全体的な安定性は、より高いｐＩに起因して有意に改善され、より長い保存可能期間及びインビボでの生物活性がもたらされる。好ましくは、ｐＩは８．２を上回る、又はそれと等しい。

ワクチン組成物

本発明者らがタウの病理発生に関与する新たなタウ種ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕを発見したため、このように、革新的なワクチン接種アプローチへの道が開かれた。

したがって、本発明の別の対象は、以下のアミノ酸配列（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）のポリペプチド及び免疫アジュバント化合物を含むワクチン組成物である。

「ワクチン組成物」により、それは本明細書中では、個体において免疫応答を誘導することができ、例えば、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種に対して向けられた抗体の産生を誘導することができる物質を意図する。

ワクチンは、本明細書中では、ワクチンが送達された動物において防御応答を提供することが可能であり、重度疾患を起こすことが不可能である生物学的薬剤として定義される。ワクチンは、疾患を起こす病原体に対して抗体産生又は細胞性免疫を刺激する；ワクチンの投与は、このように、疾患からの免疫をもたらす。

好ましくは、前記免疫アジュバント化合物は、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、及びリン酸カルシウムからなる群において選択される。

特に、前記抗原性ポリペプチドは、以下の式（Ｉ）を有することができる：
ＮＨ２－ＰｅｐＮｔ－［（Ｉ）ｎ－ＰｅｐＸｎ］ｎ－ＰｅｐＣｔ－ＣＯＯＨ （Ｉ）、
式中：
‐「ＰｅｐＮｔ」は、０から１００アミノ酸残基まで変動するアミノ酸長を有し、式（Ｉ）のポリペプチドのＮ末端に位置付けられるポリペプチドからなり；
‐「［（Ｉ）ｎ－ＰｅｐＸｎ］」はポリペプチド単位からなり、それにおいて：
‐「（Ｉ）１」から－「（Ｉ）ｎ」は各々が、互いに非依存的に、以下のアミノ酸配列（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）のポリペプチドからなり、ｎは１から１２までの整数であり；及び
‐「ＰｅｐＸ１」から「ＰｅｐＸｎ」は各々が、互いに非依存的に、０から３０アミノ酸残基まで変動するアミノ酸長を有するスペーサーポリペプチドからなり、ｎは１から１２までの整数であり；及び
‐ｎは、前記ポリペプチド中の［（Ｉ）ｎ－ＰｅｐＸｎ］ポリペプチド単位の数であり、ｎは１から１２までの整数であり；及び
‐「ＰｅｐＣｔ」は、０から１００アミノ酸残基まで変動するアミノ酸長を有し、式（Ｉ）のポリペプチドのＣ末端に位置付けられるポリペプチドからなる。

特に、前記抗原性ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）又は上で定義したような以下の式（Ｉ）を有することができる。

特に、以下を含む又は以下からなる、前記抗原性ポリペプチド：
（ｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３５２（配列番号：１）からなるアミノ酸配列；
（ｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３８１（配列番号：２）からなるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３８３（配列番号：３）からなるアミノ酸配列
（ｉｖ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４１０（配列番号：４）からなるアミノ酸配列
（ｖ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４１２（配列番号：５）からなるアミノ酸配列；
（ｖｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４４１（配列番号：６）からなるアミノ酸配列；）；
（ｖｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－７７６（配列番号：７からなるアミノ酸配列
（ｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｖｉｉ）の配列の１１位のＮ－アルファアセチルメチオニン残基から開始する、少なくとも９連続アミノ酸のフラグメント
（ｉｘ）（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の配列と実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の配列と少なくとも８０%同一のアミノ酸配列。

参照ペプチドと「実質的に相同」なペプチドは、１つ以上の保存的置換により参照配列から由来しうる。２つのアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸残基が、生物学的に類似の残基により置換される場合、あるいはアミノ酸の８０%超が同一である、又は約９０%超、好ましくは約９５%超類似している（機能的に同一である）場合、「実質的に相同」である又は「実質的に類似」している。好ましくは、類似の、同一の、又は相同な配列を、例えば、GCG（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7、ウィスコンシン州マジソン）パイルアッププログラム、又は当技術分野において公知のプログラム（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）のいずれかを使用して、アラインメントにより同定する。同一性のパーセンテージは、Needleman-Wunschアラインメントアルゴリズムに基づいてペアワイズグローバルアラインメントを実施し、その全長に沿った２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見出すことにより算出され得、例えば、Needleを使用し、及びBLOSUM62マトリックスをギャップオープニングペナルティ１０及びギャップエクステンションペナルティ０．５で使用することができる。

本明細書中で使用する用語「保存的置換」は、ペプチドの全体的な立体構造及び機能を変えることなく、アミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを意味し、例えば、類似の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、形状、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換を含むが、それに限定されない。類似の特性を伴うアミノ酸は当技術分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンは親水性塩基性アミノ酸であり、互換的でありうる。同様に、イソロイシンは疎水性アミノ酸であり、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置換されうる。中性の親水性アミノ酸は、互いに置換することができ、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンを含む。

「置換された」又は「修飾された」により、本発明は、天然アミノ酸から変えられた又は修飾されたアミノ酸を含む。

そのようなものとして、本発明の文脈において、保存的置換は、類似の特性を有する別のアミノ酸についての１つのアミノ酸の置換として当技術分野において認識されることを理解すべきである。

本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも８０%の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、適切な配列アラインメントアルゴリズム及びデフォルトパラメーター、例えばＢＬＡＳＴ Ｐ（Karlin and Altschul, 1990）などを使用して決定される。

前記抗原性ペプチドは、アミノ酸残基を通じて、担体タンパク質又は合成ポリマーに共有結合的に連結することができる。

ペプチドの免疫原性を増強するために、式（Ｉ）のペプチドは、担体としての役割を果たすより大きな分子に共有結合的に連結（「結合」）することができる。

担体へのペプチドの付加は、いくつかの方法の１つによりうるが、グルタルアルデヒド（Reichlin, Methods Enzymol. 70: 159-165, 1980）又はＤＣＣ手順（例えば、Atassi et al., Biochem. Biophys. Acta 670: 300-302, 1981）を使用したペプチドＬｙｓを通じた、ＤＣＣを使用したペプチドＡｓｐ又はＧｌｕを通じた（Bauminger et al., Methods Enzymol 70: 151-159, 1980）、ビスジアゾ化ベンジジンを使用したペプチドＴｙｒを通じた（Walter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77: 5197-5200, 1980）、光化学的付加部位を通じた（Parker et al., Cold Spring Harbor Symposium - Modern Aoproaches to Vaccines, Ed. Chanock & Lerner, Cold Spring Harbor Press, New York, 1984）、又はペプチドＣｙｓを通じた（Liu et al., Biochem. 18: 690-697, 1979）連結を含む。

ペプチド担体コンジュゲートは、透析又はゲル濾過により過剰の遊離ペプチドから分離することができる。担体上でのペプチドの負荷レベルは、放射性トレーサーを使用し、特定の手順において負荷レベルを確立して、又はコンジュゲートの定量的アミノ酸分析により、無負荷の担体との比較において決定することができる。後者の技術を使用する場合、Ｎ末端又はＣ末端側でペプチド中に固有の非天然アミノ酸、例えばＮｌｅなどを組み入れることが便利であり、それはペプチド組み入れについての定量的マーカーとしての役割を果たし、コンジュゲートのアミノ酸分析により測定される。このＮｌｅはまた、上に記載するように、抗原部位と、付加を促進にするために組み入れられた任意のアミノ酸、例えばＣｙｓ、Ｌｙｓ、又はＴｙｒなどの間でのスペーサーとして機能することができる。

好ましくは、前記担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン、又はジフテリアトキソイドからなる群より選択される。

本発明に従ったワクチン組成物において、前記合成ポリマーは、リジン残基で構成されるコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構築物でありうる。

ポリマー中でリジン骨格を使用する放射状分岐システムが、J. P. Tam [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5409-5413 (1988)］により、担体の使用を伴わない抗原を開発するために使用されてきた。これらの抗原は、多様な疾患に対するワクチンを生成するように設計された。具体的には、マラリア疾患に対するワクチンを生成するための抗原は、ＰＣＴ特許出願シリアル番号ＷＯ９３／１０１５２、ＷＯ２００６／０２９８８７、ＷＯ２００７／００３３８４、ＷＯ２００９／０２１９３１及びＷＯ２００９／０８０７１５、ＷＯ２０１５０３８７０８において記載されている。

コアマトリックスは、好ましくは、自然において分岐している樹枝状ポリマーであり、好ましくは、その分岐の各々が同一である。コアマトリックスは、末端官能基を有する分子分岐が共有結合的に結合されている少なくとも２つの官能基を有するコア分子に基づいている。コアマトリックスを形成するための使用について例示的であるのは、リジンである。中央のリジン残基は２つのリジン残基に結合しており、各々がそのカルボキシル基を通じて、中央のリジン残基のアミノ基の１つに結合している。これによって、４つのアミノ基を伴う分子が提供され、それは、式（Ｉ）の４つのペプチドを含む構造についてのコアマトリックスでありうる。上記の構造の製造は、当技術分野において公知である。例えば、Tam et al., J. Immun. 148, 914-920 (1992)及びWang et al., Science, 254, 285-288 (1991)を参照のこと。

加えて、前記ペプチドと前記担体タンパク質又は合成ポリマーの間にスペーサーを加えることができる。ペプチドリンカー配列を用いて、各々のポリペプチドがその二次及び三次構造に折り畳まれるのを確実にするのに十分な距離だけ、第１及び第２のポリペプチド成分を分離することができる。そのようなペプチドリンカー配列を、当技術分野において周知の標準的な技術を使用して融合タンパク質中に組み入れる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の要因に基づいて選んでもよい：（１）柔軟な伸長された立体構造を採用するそれらの能力；（２）第１及び第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用しうる二次構造を採用するそれらの不能；及び（３）ポリペプチドの機能的エピトープと反応しうる疎水性又は荷電残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基、及びＳｅｒ残基を含む。他の中性に近いアミノ酸、例えばＴｈｒ及びＡｌａなどもリンカー配列中で使用してもよい。リンカーとして有用に用いられうるアミノ酸配列は、Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985；Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986；米国特許第４，９３５，２３３号及び米国特許第４，７５１，１８０号において開示されているものを含む。リンカー配列は一般的に、１から約５０アミノ酸の長さでありうる。リンカー配列は、第１及び第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、立体障害を防止するために使用することができる非必須のＮ末端アミノ酸領域を有する場合には要求されない。

本発明はまた、アミノ酸配列（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）を含むペプチドを含むワクチン組成物に関する。

前記ペプチドは、アミノ酸残基を通じて担体タンパク質に又は合成ポリマーに共有結合的に連結されている。

好ましくは、前記担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン、又はジフテリアトキソイドからなる群より選択される。

合成ポリマーは、リジン残基で構成されるコアマトリックスを含む多分岐ペプチド構造でありうる。前記ポリペプチドと前記担体タンパク質又は合成ポリマーの間にスペーサーを導入することができる。

好ましくは、直前に引用したワクチン組成物において、前記ポリペプチドと前記担体タンパク質又は合成ポリマーの間にスペーサーがある。

治療的使用

実験のセクションにおいて記載されているように、本発明の抗体は、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕポリペプチドを標的化し、それはタウ病理発生において関連する。本発明者らは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種が、Ｔｈｙ－Ｔａｕトランスジェニックマウスにおけるタウ病理発生を増強し（図３及び４）、少なくともタウ病理を加速することにより、病理学的過程において関連することを示した。

本発明の抗体、フラグメント、又は免疫複合体は、タウオパチーを処置するために有用でありうる。本発明の抗体は、単独で、又は任意の適切な薬剤との組み合わせにおいて使用してもよい。

本明細書中に記載する処置方法の実施形態の各々において、本発明の抗体又は本発明の抗体－薬物複合体は、処置が求められる疾患又は障害の管理に関連付けられる従来の方法論と一致する様式において送達される。本明細書中の開示によれば、有効量の抗体又は抗体－薬物複合体が、疾患又は障害を防止又は処置するのに十分な時間にわたり及び条件下で、そのような処置を必要とする患者に投与される。

本明細書中で使用するように、用語「処置」又は「処置する」は、疾患に罹るリスクがある又は疾患に罹った疑いのある被験者ならびに病気である又は疾患もしくは医学的状態に苦しんでいるとして診断された被験者の処置を含む、予防的又は防止的処置ならびに治癒的又は疾患修飾処置の両方を指し、臨床的再発の抑制を含む。処置は、障害又は再発性障害の１つ以上の症状を防止する、治癒させる、その発症を遅延させる、その重症度を低下させる、又は寛解させるために、あるいは、そのような処置の非存在において予想される生存を超えて被験者の生存を延長させるために、医学的障害を有する、又は最終的に障害を獲得しうる被験者に投与してもよい。「治療レジメン」により、病気の処置のパターン、例えば、治療の間に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含みうる。語句「導入レジメン」又は「導入期間」は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの部分）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間の間に被験者に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは、（部分的又は全体的に）「負荷レジメン」を用いてもよく、それは、医師が維持レジメンの間に用いうるよりも大きな用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメンの間に薬物を投与しうるよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含みうる。語句「維持レジメン」又は「維持期間」は、病気の処置の間での被験者の維持のために、例えば、被験者を長期間（月又は年）にわたり寛解に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの部分）を指す。維持レジメンは、継続的治療（例、定期的な間隔で、例えば、毎週、毎月、毎年などに薬物を投与する）又は断続的治療（例、中断された処置、断続的な処置、再発時の処置、又は特定の所定の基準［例、疾患の顕在化など］の達成時の処置）を用いうる。

本明細書中で使用するように、用語「治療有効量」又は「有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量及び期間にわたる有効な量を指す。本発明の抗体の治療的有効量は、要因、例えば個人の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個人において所望の応答を誘発する本発明の抗体の能力などに従って変動しうる。治療的有効量はまた、抗体又は抗体部分の任意の毒性又は有害効果よりも治療的に有益な効果が勝るものである。本発明の抗体のための効率的な投与量及び投与レジメンは、処置される疾患又は状態に依存し、当業者により決定されうる。当業者である医師は、要求される医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方することができうる。例えば、医師は、所望の治療効果を達成するために要求されるレベルよりも低いレベルで、医薬組成物中で用いられる本発明の抗体の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができうる。一般的に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の投与レジメンに従って治療効果を生じさせるのに有効な最も低い用量である化合物の量である。そのような有効用量は、一般的に、上に記載する要因に依存する。例えば、治療的使用のための治療有効量は、疾患の進行を安定化させるその能力により測定されうる。典型的には、タウオパチーを阻害する化合物の能力は、例えば、ヒトタウオパチーにおける効力を予測する動物モデルシステムにおいて評価されうる。あるいは、組成物のこの特性は、神経保護を誘導する化合物の能力を、当業者に公知のインビトロアッセイにより検証することにより評価されうる。治療的化合物の治療有効量は、神経原線維変性を減少させうる、又は、他では、被験者における認知機能低下症状を寛解させうる。当業者は、被験者のサイズ、被験者の症状の重症度、及び選択された特定の組成物又は投与の経路などの要因に基づいてそのような量を決定することができるであろう。本発明の抗体の治療有効量についての例示的な、非限定的な範囲は、約０．１～１００mg/kg、例えば約０．１～５０mg/kgなど、例えば、約０．１～２０mg/kg、例えば約０．１～１０mg/kgなど、例えば、約０．５、例えば約０．３、約１、約３mg/kg、約５mg/kg、又は約８mg/kgなどである。本発明の抗体の治療有効量についての例示的な、非限定的な範囲は、０．０２～１００mg/kg、例えば約０．０２～３０mg/kgなど、例えば約０．０５～１０mg/kg又は０．１～３mg/kgなど、例えば、約０．５～２mg/kgである。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下でありうるが、例えば、標的の部位の近位に投与されうる。処置及び使用の上の方法における投与計画を調整し、最適な所望の応答（例、治療的応答）を提供する。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、あるいは用量を、治療的状況の緊急事態により示されるように、比例的に減少又は増加させてもよい。一部の実施形態では、処置の効力は、治療の間に、例えば、事前定義された時間点でモニターされる。一部の実施形態では、効力は、疾患領域の可視化により、又は本明細書中でさらに記載する他の診断方法により、例えば、本発明の標識抗体、本発明の抗体から由来するフラグメント又はミニ抗体を使用し、１つ以上のＰＥＴ－ＣＴスキャンを実施することによりモニターされうる。所望の場合、医薬組成物の効果的な１日用量は、１日を通して適した間隔で、場合により、単位剤形において別々に投与される２、３、４、５、６、又はそれ以上のサブ用量として投与されうる。一部の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、任意の望ましくない副作用を最小限にするために、長期間、例えば２４時間超にわたるゆっくりした連続注入により投与される。本発明の抗体の有効用量はまた、毎週、隔週、又は３週間の投薬期間を使用して投与されうる。投薬期間は、例えば、８週間、１２週間、又は臨床的進行が確立されるまでに制限されうる。非限定的な例として、本発明に従った処置は、本発明の抗体の１日投与量として、約０．１～１００mg/kg、例えば、０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００mg/kg/日などの量において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日の少なくとも１つで、又は、あるいは、処置の開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０週の少なくとも１つで、又は、それらの任意の組み合わせで、単一又は分割用量を２４、１２、８、６、４、もしくは２時間毎に、又はそれらの任意の組み合わせで使用して提供されうる。

したがって、本発明の１つの目的は、治療有効量の本発明の抗体を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者においてタウオパチーを処置する方法に関する。

別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書中の任意の態様又は実施形態において定義される本発明の抗体に関する。

別の態様では、本発明は、タウオパチーの処置のための本発明の抗体の使用に関する。

用語「タウオパチー」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、タウ凝集により特徴付けられる疾患を指す（Iqbal, K. et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1739 (2005) 198-210）。タウオパチーは、とりわけ、アルツハイマー病、ダウン症候群；Ｇｕａｍパーキンソニズム認知症複合体；拳闘家認知症及び他の慢性外傷性脳症；筋緊張性ジストロフィー；ニーマンピック病Ｃ型；ピック病；嗜銀性顆粒病；前頭側頭型認知症；大脳皮質基底核変性症；淡蒼球橋黒質変性症；進行性核上性麻痺；及びプリオン障害、例えばタングルを伴うゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病を含む。

特定の実施形態では、タウオパチー障害はアルツハイマー病である。

医薬組成物

本発明の一態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物に関する。

典型的には、本発明の抗体は、医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物の形態で被験者に投与される。これらの組成物中で使用されうる医薬的に許容可能な担体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなど、緩衝物質、例えばリン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂肪を含むが、それらに限定されない。患者への投与における使用のために、組成物は、患者への投与用に製剤化される。本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧により、局所的に、直腸的に、経鼻的に、頬側に、経膣的に、又は埋め込みリザーバーを介して投与されうる。本明細書中で使用するのは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。本発明の組成物の無菌注射用形態は、水性又は油性懸濁剤でありうる。これらの懸濁剤は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用し、当技術分野において公知の技術に従って製剤化されうる。無菌注射用調整物はまた、例えば、１，３－ブタネジオール中の溶液として、非毒性、非経口の許容可能な希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁剤でありうる。用いてもよい許容可能なビヒクル及び溶媒のなかには、水、リンガー溶液、及び等張性の塩化ナトリウム溶液がある。また、無菌の固定油は従来、溶媒又は懸濁媒質として用いられる。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激の固定油を用いてもよい。脂肪酸、例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体などは、注入剤の調製において有用であり、天然の医薬的に許容可能な油、例えばオリーブ油又はヒマシ油（特にそれらのポリオキシエチル化型）なども同様である。これらの油剤又は懸濁剤はまた、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースなど、あるいは乳剤及び懸濁剤を含む医薬的に許容可能な剤形の製剤化において一般に使用される類似の分散剤を含みうる。他の一般に使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓ、及び他の乳化剤など、あるいは医薬的に許容可能な固体、液体、又は他の剤形の製造において一般に使用されるバイオアベイラビリティの賦活薬も、製剤化の目的のために使用してもよい。本発明の組成物は、限定はしないが、カプセル、錠剤、水性懸濁液、又は溶液を含む、任意の経口で許容可能な剤形において経口投与されうる。経口使用のための錠剤の場合では、一般に使用される担体は、ラクトース及びコーンスターチを含む。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムなども典型的に加えられる。カプセル形態での経口投与については、有用な希釈剤は、例えば、ラクトースを含む。水性懸濁剤が経口使用のために要求される場合、活性成分を乳化剤及び懸濁剤と組み合わせる。所望の場合、特定の甘味剤、香味剤、又は着色剤も加えてもよい。あるいは、本発明の組成物は、直腸投与用の坐剤の形態で投与されうる。これらは、薬剤を、室温では固体であるが、しかし、直腸温で液体であり、従って、直腸において溶けて薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合させることにより調製することができる。そのような材料は、カカオバター、蜜ろう、及びポリエチレングリコールを含む。本発明の組成物はまた、特に処置の標的に、眼、皮膚、又は下部腸管の疾患を含む、局所適用により容易に接近可能な部位又は器官が含まれる場合、局所投与されうる。適切な局所製剤は、これらの部位又は器官の各々について容易に調製される。局所適用のために、組成物を、１つ以上の担体中に懸濁又は溶解させた活性成分を含む適切な軟膏剤中に製剤化してもよい。本発明の化合物の局所投与用の担体は、鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、及び水を含むが、それらに限定されない。あるいは、組成物を、１つ以上の医薬的に許容可能な担体中に懸濁又は溶解させた活性成分を含む適切なローション又はクリーム中に製剤化することができる。適切な担体は、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水を含むが、それらに限定されない。下部腸管のための局所塗布は、直腸坐剤製剤（上記を参照のこと）中で、又は適切な浣腸製剤中でもたらすことができる。パッチも使用してもよい。本発明の組成物はまた、鼻エアロゾル又は吸入により投与してもよい。そのような組成物は、医薬製剤の技術分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコール又は他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製されうる。例えば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１０mg/mLの濃度において１００mg（１０mL）又は５００mg（５０mL）の使い捨てバイアルのいずれかで供給することができる。この産物は、９．０mg/mL塩化ナトリウム、７．３５mg/mLクエン酸ナトリウム二水和物、０．７mg/mLポリソルベート８０、及び注射用無菌水中でＩＶ投与用に製剤化される。ｐＨは６．５に調整される。本発明の医薬組成物中の抗体についての例示的な、適切な投与量範囲は、約１mg/m2から５００mg/m2の間でありうる。しかし、これらのスケジュールは例示的であり、最適なスケジュール及びレジメンを、臨床治験において決定されなければならない医薬組成物中の特定の抗体の親和性及び忍容性を考慮して適合させることができることが理解されるであろう。注射用（例、筋肉内、静脈内）の本発明の医薬組成物は、無菌緩衝水（例、筋肉内については１ml）及び約１ngから約１００mg、例えば、約５０ngから約３０mg、又はより好ましくは約５mgから約２５mgの間の本発明の抗タウ抗体を含むように調製することができうる。

特定の実施形態では、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が、宿主細胞中への抗体の導入のために熟慮される。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者に公知である。

ナノカプセルは、一般的に、安定な再現性のある方法で、化合物を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、そのような超微粒子（およそ０．１μmのサイズ）は、一般的に、インビボで分解されることができるポリマーを使用して設計される。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、本発明における使用のために熟慮され、そのような粒子は簡単に作られうる。

リポソームは、水性媒質中に分散されたリン脂質から形成され、自然に多層同心二重層小胞（また、多層小胞（ＭＬＶ）と呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５nm～４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００～５００Åの範囲中の直径を伴い、コア中に水性溶液を含む、小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。

図１．ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕは、ＡＤ脳の不溶性凝集タウ画分中に見いだされる病理学的タウ種である。Ａ）ＡＤ脳のサルコシル不溶性画分（不溶性）中に存在する凝集タウタンパク質を標識するＡＴ１００抗体を使用した、ヒト頭頂葉皮質画分の代表的なウエスタンブロット分析。Ｂ）同様に過剰リン酸化されたタウ（ｐＳｅｒ３９６）であるＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種が、凝集タウタンパク質を含むＡＤ脳の不溶性画分中で検出されることを示すサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｒａａｋ Ｖ－ＶＩステージを伴うＡＤ患者４名からの頭頂葉のプールからの画分を使用した分析）。 図１．ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕは、ＡＤ脳の不溶性凝集タウ画分中に見いだされる病理学的タウ種である。Ａ）ＡＤ脳のサルコシル不溶性画分（不溶性）中に存在する凝集タウタンパク質を標識するＡＴ１００抗体を使用した、ヒト頭頂葉皮質画分の代表的なウエスタンブロット分析。Ｂ）同様に過剰リン酸化されたタウ（ｐＳｅｒ３９６）であるＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種が、凝集タウタンパク質を含むＡＤ脳の不溶性画分中で検出されることを示すサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｒａａｋ Ｖ－ＶＩステージを伴うＡＤ患者４名からの頭頂葉のプールからの画分を使用した分析）。 図２．ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕは、タウ病理の早期イベントである（Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックマウスの海馬において２ヶ月という早期に検出）。Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２の海馬ならびに２、３、及び６ヶ月齢のそれらの同腹仔ＷＴマウスにおける２Ｈ２Ｄ１１抗体ベースのＥＬＩＳＡ（＊＊＊ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析、それに続くＬＳＤフィッシャー検定）。 図３．インビボ試験前のニューロンの初代培養におけるレンチウイルスベクターバッチの検証。全長タウ（ＬＶ－Ｔａｕ－ＦＬ）、及びＭｅｔ１１－Ｔａｕ（ＬＶＭｅｔ１１－Ｔａｕ）をコードするレンチウイルスベクターからの同じレベルのＴａｕ発現を示すウエスタンブロット分析；Ｍｅｔ１１－Ｔａｕは、ニューロンの初代培養中でＮ－α－アセチル化形態として検出される（２Ｈ２Ｄ１１抗体イムノブロッティング）。ＤＩＶ：インビトロでの日数。 図４．ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ／Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ種は、ＮＦＴを持つニューロン：ＡＴ１００陽性免疫染色の数における増加により示されるように、Ｔｈｙ－Ｔａｕ３０トランスジェニックマウスにおけるタウ病理の発生を増強する。Ａ）Ｔｈｙ－Ｔａｕ３０トランスジェニックマウス（ｎ＝５／群）に、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖａｌ）ベクター（ＬＶ）を用いて、海馬のＣＡ１領域中に、示された座標でのブレグマに関して（ＡＰ：前側‐後側；ＭＬ：内側‐外側；ＤＶ：背腹側）注射した。これらの群は、ヒトタウ発現に関連する効果（ＬＶ ＦＬ－Ｔａｕ対ＰＢＳ）とＭｅｔ１１－Ｔａｕ 種の適切な効果の間を、即ち、タウの最も外側のＮ末端欠失の結果及び／又はＭｅｔ１１Ｎ－α－アセチル化（ＬＶＭｅｔ１１－Ｔａｕ対ＬＶＦＬ－Ｔａｕ）の結果を識別するために計画されている。マウスを１ヶ月齢に注射し、２ヶ月後に屠殺（ｓｃａｒｉｆｉｅｄ）した。Ｂ）海馬のＣＡ１領域中で過剰リン酸化タウ種（矢印）を持つニューロンを標識するＡＴ８抗体を使用した、注射後２ヶ月の脳冠状切片の免疫組織化学的分析。Ｃ）ＡＴ１００抗体を用いて標識された神経原線維変性を持つニューロンの平均数の定量化。各々の動物について、海馬を含む４～６の冠状切片を分析した（ｎ＝５マウス／群）。＊ｐ＜０．０５一元配置分散分析、それに続く事後フィッシャー。 図４．ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ／Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ種は、ＮＦＴを持つニューロン：ＡＴ１００陽性免疫染色の数における増加により示されるように、Ｔｈｙ－Ｔａｕ３０トランスジェニックマウスにおけるタウ病理の発生を増強する。Ａ）Ｔｈｙ－Ｔａｕ３０トランスジェニックマウス（ｎ＝５／群）に、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖａｌ）ベクター（ＬＶ）を用いて、海馬のＣＡ１領域中に、示された座標でのブレグマに関して（ＡＰ：前側‐後側；ＭＬ：内側‐外側；ＤＶ：背腹側）注射した。これらの群は、ヒトタウ発現に関連する効果（ＬＶ ＦＬ－Ｔａｕ対ＰＢＳ）とＭｅｔ１１－Ｔａｕ 種の適切な効果の間を、即ち、タウの最も外側のＮ末端欠失の結果及び／又はＭｅｔ１１Ｎ－α－アセチル化（ＬＶＭｅｔ１１－Ｔａｕ対ＬＶＦＬ－Ｔａｕ）の結果を識別するために計画されている。マウスを１ヶ月齢に注射し、２ヶ月後に屠殺（ｓｃａｒｉｆｉｅｄ）した。Ｂ）海馬のＣＡ１領域中で過剰リン酸化タウ種（矢印）を持つニューロンを標識するＡＴ８抗体を使用した、注射後２ヶ月の脳冠状切片の免疫組織化学的分析。Ｃ）ＡＴ１００抗体を用いて標識された神経原線維変性を持つニューロンの平均数の定量化。各々の動物について、海馬を含む４～６の冠状切片を分析した（ｎ＝５マウス／群）。＊ｐ＜０．０５一元配置分散分析、それに続く事後フィッシャー。 図４．ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ／Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ種は、ＮＦＴを持つニューロン：ＡＴ１００陽性免疫染色の数における増加により示されるように、Ｔｈｙ－Ｔａｕ３０トランスジェニックマウスにおけるタウ病理の発生を増強する。Ａ）Ｔｈｙ－Ｔａｕ３０トランスジェニックマウス（ｎ＝５／群）に、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖａｌ）ベクター（ＬＶ）を用いて、海馬のＣＡ１領域中に、示された座標でのブレグマに関して（ＡＰ：前側‐後側；ＭＬ：内側‐外側；ＤＶ：背腹側）注射した。これらの群は、ヒトタウ発現に関連する効果（ＬＶ ＦＬ－Ｔａｕ対ＰＢＳ）とＭｅｔ１１－Ｔａｕ 種の適切な効果の間を、即ち、タウの最も外側のＮ末端欠失の結果及び／又はＭｅｔ１１Ｎ－α－アセチル化（ＬＶＭｅｔ１１－Ｔａｕ対ＬＶＦＬ－Ｔａｕ）の結果を識別するために計画されている。マウスを１ヶ月齢に注射し、２ヶ月後に屠殺（ｓｃａｒｉｆｉｅｄ）した。Ｂ）海馬のＣＡ１領域中で過剰リン酸化タウ種（矢印）を持つニューロンを標識するＡＴ８抗体を使用した、注射後２ヶ月の脳冠状切片の免疫組織化学的分析。Ｃ）ＡＴ１００抗体を用いて標識された神経原線維変性を持つニューロンの平均数の定量化。各々の動物について、海馬を含む４～６の冠状切片を分析した（ｎ＝５マウス／群）。＊ｐ＜０．０５一元配置分散分析、それに続く事後フィッシャー。 図５．Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２マウスにおけるＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに対する受動免疫療法の実験計画：試験１．ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに対して向けられたモノクローナル抗体（２Ｈ２Ｄ１１抗体；ＩｇＧ２ａアイソタイプ）、及び非特異的抗体（ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（Ｂ６９ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－９４３７（商標））から精製）の反復腹腔内注射（ＩＰ）が、ヘテロ接合性Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２雄及びその同腹仔ＷＴマウス（ｎ＝２－３マウス／群、１０mg抗体/kg）において実施された。同じ実験手順において、２つのマウス群にＰＢＳを注射した。マウスは３ヶ月齢で最初のＩＰを、次に７ヶ月齢まで１０日毎に受けた。マウスは屠殺の１週間前（８ヶ月齢）に最後の注射を受けた。動物を頸椎脱臼により屠殺し、脳を除去した。右半球を４%パラホルムアルデヒド中で７日間にわたり後固定し、次に２０%スクロース中で２４時間にわたりインキュベートし、タウ病理の免疫組織化学的分析のための使用まで－８０℃で凍結保存した。左半球を使用し、タウ病理の生化学的分析のために、４℃で冠状アクリルスライサー（Delta Microscopies）を使用して海馬を解剖し、－８０℃で保存した。血液サンプル（尾静脈で採取）を、抗体安定性（力価）のＥＬＩＳＡ分析のために、各々のＩＰ注射の前に回収した。 図６．ＡｃＭｅｔ１１－ＴａｕペプチドベースのＥＬＩＳＡは、２Ｈ２Ｄ１１抗体が、反復ＩＰ注射にわたりマウスの血液中で安定であり、機能的であることを示す。免疫化プロトコル（図５）にわたる各々の注射の前に回収されたマウス血液サンプル（Ｓ０からＳ７）を、特定のＡｃＭｅｔ１１－ペプチド又はネガティブコントロールＴａｕ－ペプチドのいずれかでコーティングした後、間接的ＥＬＩＳＡ（１：６００に希釈）により分析した。抗体力価が、標準として使用された精製２Ｈ２Ｄ１１抗体により決定された。 図７Ａ．２Ｈ２Ｄ１１抗体ベースの免疫療法は、ＭＣ１免疫染色（タウオリゴマー）を低下させる。タウオリゴマー種を標識するＭＣ１抗体を使用した海馬冠状切片の代表的な免疫組織化学的分析。ヒストグラムは、ＭＣ１染色の定量化をＣＡ１面積の%として示した。各々の動物について、海馬を含む４～６の冠状切片を分析した（ｎ＝３マウス／群）；＊＊ｐ＝０，００３３対応のないスチューデントのｔ検定。 図７Ｂ．２Ｈ２Ｄ１１抗体ベースの免疫療法によって、ＡＴ１００陽性ニューロン（神経原線維タングルを伴うニューロン）の数が減少する。タウ凝集種を標識するＡＴ１００抗体を使用した海馬冠状切片の代表的な免疫組織化学的分析。ヒストグラムは、海馬において神経原線維変性を持つニューロン（ＡＴ１００陽性ニューロン）の平均数の定量化を示し、mm2当たりで平均化した。各々の動物について、海馬を含む４～６の冠状切片を分析した（ｎ＝３マウス／群）；＊ｐ＝０，０１４対応のないスチューデントのｔ検定。 図８．２Ｈ２Ｄ１１抗体ベースの免疫療法は、不溶性のタウ凝集体を減少させる。マウス海馬からのサルコシル可溶性（Ｓ）及び不溶性（Ｐ）画分のウエスタンブロット分析：Ａ）サルコシル不溶性画分（不溶性）中に存在する凝集タウタンパク質を標識するＡＴ１００抗体を使用；Ｂ）ＨＴ７抗体（汎タウ抗体）を使用；Ｃ）ＨＴ７についてのウエスタンブロットのデンシトメトリー定量化及び不溶性タウタンパク質の%の概略図。 図８．２Ｈ２Ｄ１１抗体ベースの免疫療法は、不溶性のタウ凝集体を減少させる。マウス海馬からのサルコシル可溶性（Ｓ）及び不溶性（Ｐ）画分のウエスタンブロット分析：Ａ）サルコシル不溶性画分（不溶性）中に存在する凝集タウタンパク質を標識するＡＴ１００抗体を使用；Ｂ）ＨＴ７抗体（汎タウ抗体）を使用；Ｃ）ＨＴ７についてのウエスタンブロットのデンシトメトリー定量化及び不溶性タウタンパク質の%の概略図。 図８．２Ｈ２Ｄ１１抗体ベースの免疫療法は、不溶性のタウ凝集体を減少させる。マウス海馬からのサルコシル可溶性（Ｓ）及び不溶性（Ｐ）画分のウエスタンブロット分析：Ａ）サルコシル不溶性画分（不溶性）中に存在する凝集タウタンパク質を標識するＡＴ１００抗体を使用；Ｂ）ＨＴ７抗体（汎タウ抗体）を使用；Ｃ）ＨＴ７についてのウエスタンブロットのデンシトメトリー定量化及び不溶性タウタンパク質の%の概略図。 図９．Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２マウスにおけるＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに対する受動免疫療法の実験計画：試験２．ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに対して向けられたモノクローナル抗体（２Ｈ２Ｄ１１抗体；ＩｇＧ２ａアイソタイプ）、及び非特異的抗体（ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（Ｂ６９ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－９４３７（商標））から精製）を用いた反復腹腔内注射（ＩＰ）を、ヘテロ接合性Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２雄（ｎ＝１５マウス／群；１０mg抗体/kg）において実施した。同じ実験手順において、同腹子ＷＴマウス群にＰＢＳ（ｎ＝９）又はＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（ｎ＝６）のいずれかを用いて注射し、行動評価におけるベースラインを得た。雌で作られた実験群も含まれた。 マウスは、３ヶ月齢で最初のＩＰを、次に７ヶ月齢での行動評価まで２週間毎に受けた。マウスは屠殺の１週間前（８ヶ月齢）に最後の注射を受けた。動物は頸椎脱臼により屠殺され、脳が除去された。右半球を４%パラホルムアルデヒド中で７日間にわたり後固定し、次に２０%スクロース中で２４時間にわたりインキュベートし、使用まで－８０℃で凍結保存した。左半球を使用し、生化学的分析のために、４℃で冠状アクリルスライサー（Delta Microscopies）を使用して海馬及び皮質を解剖し、－８０℃で保存した。 血液サンプル（尾静脈で収集）を、ＥＬＩＳＡ分析のために、最初の注射の前、ならびに免疫化プロトコルの中間及び終了時に回収した。 図１０．ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに対する受動免疫療法によって、Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２マウスの空間記憶（Ｙ迷路）が改善される。ＷＴコントロール動物は、他の既知アームよりも新規アームに対して選好性を示した（＊＊ｐ＜０．０１ Ｎ対Ｏ；一元配置分散分析、それに続くＬＳＤフィッシャー検定）。予想通り、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールを用いて処置されたＴＨＹ－Ｔａｕ２２は、新規アーム対他のアームについての選好性により特徴付けられる適切な空間記憶を呈することなく（ｐ＝０．２１、Ｎ対Ｏ）、そして新規アームにおいて費やされた時間のパーセンテージは、ＷＴ動物と比較して有意に減少した（＃ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、それに続くＬＳＤフィッシャー検定）。逆に、２Ｈ２Ｄ１１抗体を用いて処置されたＴＨＹ－Ｔａｕ２２は、他のアームよりも新規アームについて有意な選好性（＊＊ｐ＜０．０１ Ｎ対Ｏ；一元配置分散分析、それに続くＬＳＤフィッシャー検定）を、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体を用いて処置されたＴＨＹ－Ｔａｕ２２動物と比較して有意に増強された新規アームにおいて費やされた時間のパーセンテージ（°ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、それに続くＬＳＤフィッシャー検定）と一緒に示し、回復された空間記憶能力が裏付けられた。 図１１：２Ｃ１２Ｃ８ハイブリドーマ上清によって、間接的ＥＬＩＳＡによるＮ－アルファ末端アセチル化Ｍｅｔ１１－Ｔａｕペプチドの特異的検出が可能になる。ヒストグラムは、２Ｃ１２Ｃ８ハイブリドーマ培養物からの上清の段階希釈により得られた代表的なＥＬＩＳＡ ＯＤ値を示した。ポジティブコントロールとして、本発明者らは、本発明者らが間接的ＥＬＩＳＡにおいて使用してきた３つのペプチドを同様に認識する精製ｈＴａｕＥ１抗体（全タウ、１２－２１）、及びＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕペプチドに向かって特異性を示す精製２Ｈ２Ｄ１１抗体を使用した。３つのペプチドは以前に記載されている（ＷＯ ２０１８／１７８０７８）：ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕペプチド：Ｎ－アルファ－アセチル－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕペプチド；Ｍｅｔ１１－Ｔａｕペプチド：非アルファアセチル化切断Ｍｅｔ１１ Ｔａｕ；ＦＬ－Ｔａｕペプチド：メチオニン１から開始し、非ノンフリーＭｅｔ１１ Ｔａｕを含むタウペプチド。 図１２：２つの異なる抗体：２Ｃ１２Ｃ８及び２Ｈ２Ｄ１１に基づくサンドイッチＥＬＩＳＡによるＮ末端アセチル化Ｍｅｔ１１－Ｔａｕキャリブレータの検出。上部パネル。Ｎ－アルファ－アセチル－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ種の検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの概略図；捕捉抗体は精製２Ｃ１２Ｃ８又は２Ｈ２Ｄ１１で作製された；検出抗体はＴａｕＥ１抗体（全タウ、２３－４０）で作製された。下部パネル。各々の抗体（２Ｃ１２Ｃ８及び２Ｈ２Ｄ１１）について、標準曲線は、Ｎ－アルファ－アセチル化－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕキャリブレーターペプチドの段階希釈を使用することにより作製された。 図１３：２つの異なるモノクローナル抗体：２Ｃ１２Ｃ８及び２Ｈ２Ｄ１１を使用した、細胞溶解物中のＮ末端アセチル化Ｍｅｔ１１－Ｔａｕタンパク質のウエスタンブロット分析による特異的検出。４８時間のテトラサイクリン処理後の、全長タウ（Ｔａｕ－４１２）又はＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ（Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ）のいずれかを過剰発現するＳＨ－ＳＹ５Ｙ誘導性細胞株からの１０μgのタンパク質抽出物の代表的なウエスタンブロット分析。分析は最初に、２Ｈ２Ｄ１１抗体又は２Ｃ１２Ｃ８抗体のいずれかを使用して実施した。膜を次に、両方の細胞株におけるタウタンパク質の発現を示すために、Ｔａｕ Ｃ－ｔｅｒ抗体を用いてリプローブした。 図１４：アルツハイマー病患者（Ａ）及びＴｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックマウス（Ｂ）からの脳サンプル（海馬）における２Ｃ１２Ｃ８抗体によるＮ末端アセチル化Ｍｅｔ１１－Ｔａｕタンパク質の特異的検出。Ａ．年齢を一致させたコントロール（ｎ＝６）及びＡＤ症例（ｎ＝７、Ｂｒａａｋ ＩＶ－ＶＩから）の海馬からのタンパク質抽出物を、２Ｃ１２Ｃ８抗体ベースのサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて使用した。データは、２Ｃ１２Ｃ８抗体がＡＤサンプル中で特異的に反応することを示した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；対応のないｔ検定で比較）。Ｂ．Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２ならびに３及び７ヶ月齢のそれらの同腹仔ＷＴマウスの海馬における２Ｃ１２Ｃ８抗体ベースのサンドイッチＥＬＩＳＡ（＊＊＊＊ｐ＝０．００１６；対応のないｔ検定で比較）。 図１４：アルツハイマー病患者（Ａ）及びＴｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックマウス（Ｂ）からの脳サンプル（海馬）における２Ｃ１２Ｃ８抗体によるＮ末端アセチル化Ｍｅｔ１１－Ｔａｕタンパク質の特異的検出。Ａ．年齢を一致させたコントロール（ｎ＝６）及びＡＤ症例（ｎ＝７、Ｂｒａａｋ ＩＶ－ＶＩから）の海馬からのタンパク質抽出物を、２Ｃ１２Ｃ８抗体ベースのサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて使用した。データは、２Ｃ１２Ｃ８抗体がＡＤサンプル中で特異的に反応することを示した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；対応のないｔ検定で比較）。Ｂ．Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２ならびに３及び７ヶ月齢のそれらの同腹仔ＷＴマウスの海馬における２Ｃ１２Ｃ８抗体ベースのサンドイッチＥＬＩＳＡ（＊＊＊＊ｐ＝０．００１６；対応のないｔ検定で比較）。 図１５：２Ｃ１２Ｃ８抗体は、Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックマウスの海馬において神経原線維変性を呈するニューロンを標識する。２Ｃ１２Ｃ８抗体を使用した、マウス脳矢状切片の代表的な免疫組織化学分析。パネルＡ：８ヶ月齢のＷｔ同腹仔マウスからの切片；パネルＢ－Ｃ：それぞれ３、８、及び１３ヶ月齢のＴｈｙ－Ｔａｕ２２マウスからの切片。矢印は、２Ｃ１２Ｃ８抗体により呈される、神経原線維変化の特色を伴う典型的なニューロンの一部を示した。

実施例１：

材料及び方法

２Ｈ２Ｄ１１抗体の生成。２Ｈ２Ｄ１１抗体は、１１位のメチオニンから２１位のグリシンまでのタウ配列に対応するＮ－アルファ末端アセチルタウペプチド（Ａｃ－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕペプチド：｛Ｎα－アセチル｝ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ：配列番号８）を用いた免疫化により生成した。この配列は、全てのタウアイソフォームにより共有されるエクソン１によりコード化されている。システイン残基が、ＫＬＨコンジュゲーションのためにＡｃ－Ｍｅｔ１１－ＴａｕペプチドのＣ末端に加えられている。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、１４、４５、及び６３日目に３回の追加免疫を用いて皮下免疫化させた。最も高い力価を呈するマウスの脾臓からのリンパ球を次に、（Pandey, 2010）において記載されている方法に従って、ＮＳ１骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ上清を、以下の異なるペプチドに対する間接的ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした：

Ａｃ－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕペプチド：｛Ｎα－アセチル｝ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ；（配列番号８）抗原として使用されるタウフラグメントと同じ配列。

Ｍｅｔ１１－Ｔａｕペプチド：ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ；（配列番号９）

Ａｃ－Ｍｅｔ１－Ｔａｕペプチド：｛Ｎα－アセチル｝ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号１０）；ペプチドは、Ｎ－アルファ末端アセチル化を保有するタウのメチオニン１で開始する。

ハイブリドーマ上清の間接的ＥＬＩＳＡスクリーニングによって、フリーの非Ｎ－アルファ末端アセチル化メチオニン１１との、又は非切断メチオニン１１との、又はそれがメチオニン１１と同じアミノ酸状況にない場合はＮ－アルファ－アセチル－メチオニンとのわずかな交差反応性を伴う、又は任意の交差反応性を伴わないＡｃ－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ種を特異的に検出する一組のクローンの選択が可能になった。アイソタイプ及び軽鎖の型を、選択したハイブリドーマについて決定している（表２、下）。

ハイブリドーマ２Ｈ２をさらにサブクローン化し、本発明者らは、２Ｈ２Ｄ１１抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。タウタンパク質のＮ－アルファ末端アセチル化メチオニン１１に向けられた２Ｈ２Ｄ１１抗体の特異性を、間接的ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、及び免疫組織化学により再現性よく検証した。２Ｈ２Ｄ１１のＶＨ及びＶＬ配列を提供する。

ヒト組織サンプル

ヒト脳の剖検サンプル（頭頂皮質）は、Lille NeuroBankコレクション（Centre de Ressources Biologiques du CHU de Lille）からであった。インフォームドコンセントを全ての被験者から得た。Lille NeuroBankは、２００８年８月１４日にLille University Hospital（CHU-Lille）により、参照ＤＣ－２０００－６４２の下でFrench Research Ministryに宣言され、インフォームドコンセント、倫理審査委員会の承認、及びデータ保護を含む、生物学的資源に関するフランス法により定められた基準を満たしている。Lille NeuroBankの倫理審査委員会により試験は承認された。タウ病理の段階を、Braak et al., (2011)に従って神経病理学的特徴に基づいて分類した。

マウス

Ｃ５７Ｂｌ６／ＪバックグラウンドのＴｈｙ－Ｔａｕトランスジェニックマウス系統（Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２及びＴｈｙ－Ｔａｕ３０）は、加齢とともに神経原線維変性及び記憶障害を発生し、Ｔｈｙ１．２ニューロンプロモーターの制御下での、２つの凝集促進性変異（Ｇ２７２Ｖ＆Ｐ３０１Ｓ）を持つヒトＴａｕアイソフォーム（１Ｎ４Ｒ）の過剰発現により生成された（Schindowski et al. 2006）。追加の記載が、Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２モデルについてVan der Jeugd et al. 2013及びLaurent et al. 2017；ならびにＴｈｙ－Ｔａｕ３０モデルについてLeroy et al. 2007において提供されている。

トランスジェニックマウス及び同腹仔コントロール（ＷＴ）を、病原体のない施設において収容し、ケージ当たり５匹（Techniplastケージ１２８４Ｌ）で、食料及び水を自由摂取させ、１２時間明／１２時間暗サイクルで維持した。動物を、実験動物の飼育及び使用についての欧州基準に準拠して維持し、全ての実験プロトコルが倫理的承認を得ている：脊椎動物での実験についての合意（ｎ°２０１５１０１３２０４４１６７１／２０１６－２０２０、ＣＥＥＡ７５、フランス、リールから）。遺伝子改変生物操作についての合意（ＯＧＭ ２０１５－２０２０、Ｎ°１２８５、le Haut Conseil des Biotechnologies）。

レンチウイルスベクター

全長タウ（Ｔａｕ－４１２）及びＭｅｔ１１－Ｔａｕ（４Ｒアイソフォームの状況における）についてのｃＤＮＡを運ぶニューロン指向性（Deglon et al., 2000）を伴うレンチウイルスベクター（ＬＶ）を生成及び産生し、それらの力価を、以前に記載されたように決定した（Caillierez et al., 2013）。

初代ニューロン培養

一次皮質ニューロンを１５から１７日齢のマウス胚から得て、以下のように調製した。簡単には、皮質を注意深く解剖し、研磨したパスツールピペットでの粉砕により培養培地中で機械的に解離させた。一度解離し、カウントしたら、細胞を６ウェルプレート中にプレーティングした（ウェル当たり８０００００個細胞）。解離、プレーティング、及び培養のために、２%Ｂ２７、５００μmグルタミン、及び１%抗生物質－抗真菌剤（Gibco、フランス）を添加したNeurobasal培地を使用した。細胞を３７℃の５%ＣＯ２加湿インキュベーター中で維持した。

レンチウイルスベクターベースの感染をＤＩＶ１１で実施した；４００ｎｇのＬＶをウェル当たりに加えた。３日後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、ＷＢ分析のために溶解緩衝液中に回収した。

定位注射

１ヶ月齢のヘテロ接合性Ｔｈｙ－Ｔａｕ３０トランスジェニックマウスを、ケタミン（１００mg/kg）及びキシラジン（２０mg/kg）の混合物の腹腔内注射で麻酔した。動物を定位固定装置（David Kopf Instrument）上に置き、両側注射を、ブレグマに関して以下の座標で、海馬のＣＡ１領域中に実施した：前後－２，５mm、内側－外側－１mm（右側）及び＋１（左側）及び背腹－１．８mm。等量のレンチウイルスベクター（４４５ｎｇのｐ２４）又はＰＢＳ（２．５μl）を、固定針を伴う１０μｌガラスシリンジ（Hamilton；Dutscher、フランス、ブリュマト）を使用し、０．２５μl/分の速度で注射した。注射後２ヶ月に、マウスをペントバルビタールナトリウム（５０mg/kg、腹腔内）を用いて深麻酔し、次に、最初に冷ＮａＣｌ（０．９%）を用いて、及び次に０．１mol/Lリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ ７．４）中の４%パラホルムアルデヒド（０．１mol/L）を用いて２０分間、経心的に灌流した。脳を４%パラホルムアルデヒド中で１日間後固定し、次に２０%スクロース中で２４時間にわたりインキュベートし、イソペンタン中で、－４０℃で１分間凍結し、次に使用まで－８０℃に保った。

受動免疫療法（図５及び図９）

ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに対して向けられたモノクローナル抗体（２Ｈ２Ｄ１１抗体；ＩｇＧ２ａアイソタイプ）の、ならびに非特異的抗体（ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（Ｂ６９ハイブリドーマ（ATCC（登録商標）HB-9437（商標））から精製））を用いた反復腹腔内注射（ＩＰ）をヘテロ接合性Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２（１０mg抗体/kg）において実施した。同じ実験手順において、同腹仔ＷＴマウス群にＰＢＳ又はＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールのいずれかを注射した。マウスはそれらの最初のＩＰを、３ヶ月齢で、及び次に１０日毎に（試験１について）、又は２週間毎に（試験２について）；７ヶ月齢での行動評価（試験２）まで受けた。マウスは屠殺の１週間前（８ヶ月齢）に最後の注射を受けた。

血液サンプルを尾静脈で収集し、血漿を遠心分離により回収し、ＥＬＩＳＡアッセイにおける使用まで－２０℃に保った。

免疫組織化学（ＩＨＣ）

連続浮遊脳冠状切片（４０μm）を、４℃でＰＢＳ－アジド（０．２%）中に保たれたクリオスタット（Leica Microsystems GmbH、ドイツ）を使用して得た。目的の切片をＰＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ（０．２%）で洗浄し、０．３%Ｈ２Ｏ２で３０分間にわたり処理し、非特異的結合をＭＯＭ（マウスＩｇＧブロッキング試薬）又はヤギ血清（ＰＢＳで１／１００；Vector Laboratories）で１時間にわたりブロッキングした。切片を次に、ＰＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ０．２%中の一次抗体（以下の表１）と４℃で一晩インキュベートした。３回の洗浄（１０分）後、標識を、ビオチン化抗マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧ（２５ ＰＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ ０．２%中の１／４００；Vector Laboratories）を１時間にわたり使用し、続いてＡＢＣキット（ＰＢＳ中の１／４００；Vector Laboratories）を使用することで増幅し、標識を、０．０７５%Ｈ２Ｏ２を含む５０mmol/l Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６中の０．５mg/ml ＤＡＢ（Vector Laboratories）を使用して完了した。脳切片をSuperFrostスライド上に乗せて、段階的な一連のアルコール及びトルエンを通じて脱水し、次にZeiss 30 AXIOSCANZ1スライドスキャナー及びZenソフトウェアを使用した顕微鏡分析のために、Vectamount（Vector Laboratories）を用いてマウントした。定量化を、ImageJソフトウェアを使用して海馬における同じ目的領域中で実施した。

生化学的画分（可溶性／不溶性タウ）

サルコシル可溶性／不溶性タンパク質調製物について、マウス海馬を、１０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．３２Mスクロース、８００mM ＮａＣｌ、１mM ＥＧＴＡ（Complete、Roche）を含み、プロテアーゼ阻害剤を伴う溶解緩衝液中での超音波処理によりホモジナイズし、１２０００ｇで１０分間にわたり４℃で遠心分離した。上清を１%サルコシル（Ｎ－ラウロイルサルコシニネートナトリウム、Fluka）中で、室温で１時間の穏やかな撹拌下でインキュベートし；次に、１０００００gで１時間にわたり４℃で遠心分離した。サルコシル可溶性タウ種を含む上清を回収し、不溶性タウ種を含むペレットを、還元剤（Invitrogen）を添加したＬＤＳ２Ｘ中で直接的にホモジナイズした。

ウエスタンブロットについて、可溶性画分中のタンパク質量を、ＢＣＡアッセイ（Pierce）を使用して評価し、その後に、還元剤（Invitrogen）を添加したＬＤＳ２Ｘで１μg/μlに標準化した。サルコシル可溶性及びサルコシル不溶性のサンプルを、１：６の比率でNuPageNovexゲル上にロードした。

タンパク質抽出

細胞を、ＰＢＳを使用して洗浄し、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液：１５０mM ＮａＣｌ、１%ＮＰ４０、０．５%デオキシコール酸ナトリウム、０．１%ＳＤＳ、５０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０（プロテアーゼ阻害剤（Complete、Roche）で完成）中で回収した。４℃で１時間の超音波処理及びホモジナイズ後、上清を、１２０００gで１０分間にわたる４℃での遠心分離により回収し、タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイキット（Pierce）を使用して決定した。

ウエスタンブロッティング

全タンパク質について、抽出物を、還元剤（Invitrogen）を添加したＬＤＳ２Ｘで１μg/μlに標準化し、１００℃で１０分間にわたり変性させた。タンパク質を次に、プレキャスト４～１２% Bis-Tris NuPage Novexゲル（Invitrogen）を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。タンパク質を０．４５μmニトロセルロースメンブレン（AmershamTM Hybond ECL）に移し、一次抗体により、ＴＮＴ緩衝液（１４０mM ＮａＣｌ、０．５% Ｔｗｅｅｎ２０、１５mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．４）中の５%乾燥脱脂乳又はＴＮＴ緩衝液中の５%ウシ血清アルブミン（Sigma）で飽和させた。メンブレンを次に、一次抗体（表３、下）と４℃で一晩インキュベートし、ＴＮＴ緩衝液で１０分間にわたり３回洗浄し、二次抗体（Vector）とインキュベートし、再度洗浄した。免疫標識は、ＬＡＳ－４０００取得システム（Fujifilm）上で化学発光キット（ECLTM、Amersham Bioscience）を使用して可視化した。

間接的ＥＬＩＳＡ

Nunc 96ウェルマイクロタイタープレート（Maxisorp F8；Nunc, Inc.）を、５０mM ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中の１００ng/ウェルのＡｃ－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕペプチド（｛Ｎα－アセチル｝ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ）又はＴａｕ １－ペプチド（ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ）を用いて４℃で一晩コーティングした。０．０５%Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）での３回の洗浄後、プレートを、０．１%カゼイン溶液（ＰＢＳ）を用いて３７℃で１時間ブロッキングし、マウス血漿（０．２%ＢＳＡを含むＰＢＳ中での１：６００希釈）との室温で２時間にわたるインキュベーションが続いた。ＰＢＳ－Ｔでの３回の洗浄後、免疫検出を、ＰＢＳ－ＢＳＡ ０．２%中での１：４０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（Ａ３６７３；Sigma）を使用して、３７℃で１時間にわたり実施した。ＰＢＳ－Ｔでの５回の洗浄後、検出を、テトラメチルベンジジン基質（Ｔ３４０５、Sigma）を使用して室温で３０分間にわたり実施した；アッセイをＨ２ＳＯ４で停止させ、吸光度を、分光光度計（Multiskan Ascent、Thermo Labsystems）を用いて４５０nmで読み取った。

サンドイッチＥＬＩＳＡ

Nunc 96ウェルプレート（ＶＷＲ）を、炭酸緩衝液（ＮａＨＣＯ３ ０．１M、Ｎａ２ＣＯ３ ０．１M、ｐＨ ９．６）中１μg/mlの濃度の２Ｈ２Ｄ１１抗体（Ａｃ－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ種の検出用）１００μｌを用いて４℃で一晩コーティングした。プレートをその後、０．１%カゼインを含むＷＡＳＨ１Ｘ緩衝液（INNOTEST hTau Agキット、FUJIREBIO）を用いて３７℃で１時間にわたりブロッキングし、ＷＡＳＨ１Ｘ緩衝液を用いて３回洗浄した。タンパク質サンプルを１μg/μlで標準化し、ＳＡＭＰＬ ＤＩＬ緩衝液（INNOTEST hTau Agキット、FUJIREBIO）中に希釈した。タンパク質サンプル及びビオチン化抗体（ＨＴ７／ＢＴ２、INNOTEST hTau Agキット、FUJIREBIO）を加え、プレートを室温で一晩インキュベートした。ウェルを４回洗浄し、次にペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと室温で３０分間にわたりインキュベートし、４回洗浄した。検出を、テトラメチルベンジジン基質を使用し、室温で３０分間にわたり実施した；アッセイをＨ２ＳＯ４で停止させ、吸光度を、分光光度計（Multiskan Ascent、Thermo Labsystems）を用いて４５０nmで読み取った。全タウタンパク質又はＳｅｒ３９６でリン酸化されたタウの検出のために、ＥＬＩＳＡ実験を、製造元の指示に従って、それぞれINNOTEST hTauキット（FUJIREBIO）及びHuman Tau[pS396]ELISAキット（Invitrogen）を使用することにより実施した。

Ｙ迷路試験

短期空間記憶を、以前に記載されたように（Laurent et al., 2016）、自発的新規性ベース空間選好Ｙ迷路テストにおいて評価した。Ｙ迷路の各々のアームは、長さ２２cm、幅６．４cmで、高さ１５cmの不透明な壁を伴った。異なる迷路外の手がかりを周囲の壁に置いた。おがくずを実験の間に迷路に置き、各々の段階の間に混合した。アームの割り当ては、各々の群内で釣り合いが取れていた。曝露段階の間に、マウスを「開始」アームの端に置き、５分間にわたり（マウスが最初に開始アームを離れた時から開始）、「開始」アーム及び「他の」アームを探索することを可能にした。迷路の第３のアーム（「新規」アーム）へのアクセスは、不透明なドアによってブロックされた。マウスを次に、迷路から除き、２分間にわたりそのホームケージに戻した。テスト段階において、マウスを再び迷路の「開始」アームに置き、「新規」アームのドアを除き、マウスを、５分間にわたり（マウスが最初に開始アームを離れた時から開始）迷路を探索することを可能にした。迷路の各々のアームにおいてマウスが費やした時間の量を、EthovisionXT（Noldus Information Technology）を使用し、曝露段階及びテスト段階の両方の間に記録した。

統計

画像の取得及び定量化ならびに行動評価が、実験条件に対して盲検化された治験責任医師により実施された。結果を平均±ｓ．ｅ．ｍとして表現する。平均値の間の差を、スチューデントのｔ検定又は一元配置分散分析を使用して決定し、GraphpadPrismソフトウェアを使用した事後フィッシャーのＬＳＤ検定が続いた。Ｐ値＜０．０５を有意と考えた。

結果

本発明者らの最も初期のデータは、ＡｃＭｅｔ１１－ＴａｕがＡＤ関連のタウ病理の痕跡となる特色であることを示している（ＷＯ２０１８／１７８０７８）。

本発明者らはさらなる分析を実施し、データは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕがタウの病理発生に関与する病理学的タウ種であることを示す。第１に、本発明者らは、ＡＤ脳タンパク質の生化学的分画を行っている。本発明者らのＥＬＩＳＡ分析は、病理学的に過剰リン酸化されたタウタンパク質と同様に、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種が不溶性画分中に存在することを示した（図１）。

第２に、海馬のタウ病理を３～１０ヶ月から、及び記憶障害を６ヶ月から徐々に発生するＴＨＹ－Ｔａｕ２２マウス（Schindowski et al., 2006；Van der Jeugd at al., 2013）において、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種が、記憶障害に先行する病理学的過程の早期段階で検出される。実際に、海馬の脳切片の免疫組織化学的分析（示さず）及び海馬タンパク質抽出物を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ（図２）は、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕが２ヶ月齢のＴｈｙ－Ｔａｕ２２マウスにおいて検出されることを示すが、記憶障害は６ヶ月齢から検出される。

第３に、本発明者らは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種の脳発現がＴｈｙ－Ｔａｕ３０トランスジェニックマウスにおけるタウ病理発生を増強するか否かを分析することにより、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種とタウ病理との因果関係を評価した。本発明者らは、Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ又は全長タウタンパク質（ＦＬ－Ｔａｕ）のいずれかのニューロン発現（Caillierez et al., 2013）を可能にするレンチウイルスベクター（ＬＶ）の定位海馬注射を実施した。注目すべきことに、本発明者らは、定位注射の前に、ＬＶバッチが初代神経細胞において同じレベルのＦＬ－Ｔａｕ及びＭｅｔ１１－Ｔａｕの発現を可能にすること、及びＭｅｔ１１－ＴａｕがＮ－α－アセチル化形態として発現されることを確実にした（図３）。マウスの脳切片の本発明者らのＩＨＣ分析を、ＬＶの定位注射の２ヶ月後に実施し、タウタンパク質が海馬内の神経細胞において安定的に発現されること、及びＭｅｔ１１－Ｔａｕが、特にシナプス可塑性及び記憶に関連する領域、即ち、ＣＡ１、ＣＡ３、歯状回（ＤＧ）、及び苔状線維においてＮ－α－アセチル化型として検出されることを示した（図示せず）。重要なことに、ＡＴ８及びＡＴ１００抗体を使用した免疫染色は、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕを発現するマウスが、ＦＬ－Ｔａｕを発現するマウスと比較し、神経原線維タングルを持つニューロンの増加数を呈することを示したが（図４）、それ故に、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種が、少なくともタウ病理を加速することにより、病理学的過程に関与することを示唆する。

全体として、本発明者らのデータは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕが生理病理学的価値のある初期の病理学的種であり、それ故に貴重な治療標的でありうることを示す。次に、本発明者らは、タウ病理のＴｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックモデルにおけるこのタウ種の減少／中和が、タウ病理及び関連付けられる記憶障害に対する保護効果に導くか否かを評価した。この目的を達成するために、本発明者らは、本発明者らがＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種に対して開発した特定のモノクローナル抗体（２Ｈ２Ｄ１１）に基づく受動免疫アプローチを使用した。

本発明者らは、最初に、限定数のマウス（ｎ＝３／群）を用いたパイロット試験を実施し、２Ｈ２Ｄ１１ベースの免疫療法の実験設定を評価した。

このモデルにおいてタウ病理及び記憶障害が存在するが、しかし、最大ではない場合、Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２及びそれらの同腹仔ＷＴマウスは、３ヶ月齢（Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２マウスにおける初期の病理学的段階）から７ヶ月齢まで、１０日毎に注射された（腹腔内（ＩＰ）注射）。反復ＩＰ注射は、ＰＢＳ又はＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕに対する１０mg/kgのモノクローナル抗体（２Ｈ２Ｄ１１抗体；ＩｇＧ２ａアイソタイプ）のいずれかを用いて、ならびに非特異的抗体（ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体）を用いて実施した（図５）。本発明者らの分析によって、免疫療法に関連する明白な毒性は示されず、２Ｈ２Ｄ１１抗体が少なくとも２０日間にわたり血液中で安定かつ機能的であることが見出された（図６）。重要なことに、本発明者らは、タウの病理分析から面白いデータを得た。実際に、特定の立体構造的及び病理学的タウエピトープに対する抗体、それぞれＭＣ１（図７Ａ）及びＡＴ１００（図７Ｂ）を使用したＩＨＣ染色によって、２Ｈ２Ｄ１１抗体が注射されたＴｈｙ－Ｔａｕ２２マウスの海馬中でのタウ病理における有意な減少が明らかに示された。同様に、海馬タンパク質からの不溶性画分の分析によって、２Ｈ２Ｄ１１ベースの免疫療法が病理学的タウ不溶性種における減少を誘導することが示された（図８）。

その後、本発明者らは、多数のマウスを用いた広範な受動免疫療法試験を実施してきた（図９）。４ヶ月間の処置後、免疫療法の影響を短期空間記憶で評価した。ＷＴマウスと比較し、及びＴｈｙ－Ｔａｕ２２系統について予想されるように（Laurent et al., 2016）、ＩｇＧ２ａコントロールを用いて注射されたＴｈｙ－Ｔａｕ２２マウスが、新規アームについての選好の欠如により実証されるように、空間記憶の障害を示すことがデータによって示された（図１０）。対照的に、２Ｈ２Ｄ１１抗体を用いて処置されたＴｈｙ－Ｔａｕ２２マウスは、ＷＴマウスと同様に、他のアームよりも新規アームにおいて有意により多くの時間を費やし、空間記憶に対する抗ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ免疫療法の有益な効果が明らかになった。

結論

本発明者らは、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種が、ＡＤ及びタウオパチーに関連するタウ病理の分野において、特に免疫療法の標的として、良好な治療標的であるという概念実証を確立した。本発明者らの以前のデータによって、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕが病理学的状況において排他的に検出されることが明確に示されている（ＷＯ ２０１８／１７８０７８）。本明細書では、本発明者らは、ＡｃＭｅｔ１１－１１がタウ病理発生において推進的な役割を有していることを示した。重要なことに、本発明者らがＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種に対して開発した固有の抗体を使用した受動免疫療法は、タウ病理を減少させることにより、及びタウ病理のトランスジェニックモデルにおける記憶障害を改善することにより有益な影響を示した。

実施例２：

Ｎ－α－アセチル－Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ（ＡｃＭｅｔｔ１１－Ｔａｕ）に対するさらなる抗体を得るために、本発明者らは２Ｃ１２ハイブリドーマ（実施例１の表２において記載）をサブクローン化し、そして本発明者らは２Ｃ１２Ｃ８クローンを選択した。アイソタイプストリップは、２Ｃ１２Ｃ８ハイブリドーマがカッパ鎖を伴うＩｇＧ１抗体を産生することを示したが、本発明者らは、２Ｈ２Ｄ１１がＩｇＧ２ａ抗体であることを以前に立証している（実施例１の表２において参照）。図１１において示すように、間接的ＥＬＩＳＡを使用し、２Ｃ１２Ｃ８ハイブリドーマからの培養上清の異なる希釈を分析した。データによって、２Ｈ２Ｄ１１抗体（陽性コントロールとして使用）と同様に、２Ｃ１２Ｃ８ハイブリドーマからの上清が、タウタンパク質のＮ－アルファ末端アセチル化メチオニン１１に対して特異性を呈することが示された。実際に、２Ｃ１２Ｃ８は、それがメチオニン１１（ＦＬ－Ｔａｕペプチド）と同じアミノ酸の状況にない場合、フリーの非Ｎ－アルファ－末端アセチル化メチオニン１１（Ｍｅｔ１１－Ｔａｕペプチド）と、又は非切断メチオニン１１（Ｔａｕ１ペプチド）と、又はＮ－アルファ－アセチル－メチオニンと反応性を呈さない。全タウタンパク質に対する７Ｃ１２／Ｅ７抗体（ｈＴａｕＥ１抗体）に関して、それは、３つの異なるペプチドに対して類似の免疫反応性を呈する。

２Ｃ１２Ｃ８抗体の精製後（ＷＯ ２０１８／１７８０７８において記載されているプロトコルに従う）、このモノクローナル抗体を、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕキャリブレータの段階希釈を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡによりさらに特徴付けた。本発明者らのデータ（図１２）によって、２Ｈ２Ｄ１１抗体と同様に、２Ｃ１２Ｃ８抗体もサンドイッチＥＬＩＳＡによりＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕを検出することができることが示された。

２Ｃ１２Ｃ８抗体の特異性を、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ（Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ）又は全長Ｔａｕ（Ｔａｕ－４１２）（ＷＯ ２０１８／１７８０７８において記載）のいずれかを過剰発現する細胞株からのタンパク質抽出物を使用したウエスタンブロッティング（図１３）により検証した。全長タウ及び切断タウの発現は、それぞれＴａｕ－４１２及びＭｅｔ１１－Ｔａｕ細胞においてタウのＣ末端部分に対する抗体により呈される。しかし、２Ｈ２Ｄ１１抗体又は２Ｃ１２Ｃ８抗体のいずれかを使用した分析にあっては、Ｍｅｔ１１－Ｔａｕ細胞からの抽出物とだけに免疫標識が呈された。

２Ｃ１２Ｃ８の特徴付け後、本発明者らは、２Ｈ２Ｄ１１抗体（図２及びＷＯ ２０１８／１７８０７８）と同様に、２Ｃ１２Ｃ８抗体もＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種とタウ病理の間の関連を示すことができるか否かを分析した。高齢者コントロール（ｎ＝６）及びＡＤ患者（ｎ＝７；ＢｒａａｋＩＶ－ＶＩから；ＷＯ ２０１８／１７８０７８において記載）の海馬からのタンパク質抽出物を、２Ｃ１２Ｃ８ベースのサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した（図１４Ａ）。２Ｈ２Ｄ１１抗体（ＷＯ ２０１８／１７８０７８）を使用することにより以前に記載されたように、２Ｃ１２Ｃ８抗体はＡＤ海馬サンプルと特異的に反応した（ｐ＜０．０００１；対応のないｔ検定で比較）。同様に、２Ｃ１２Ｃ８抗体によって、サンドイッチＥＬＩＳＡによるＴｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックマウスにおけるＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕの特異的検出が可能になった（図１４Ｂ）。Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２トランスジェニックマウスにおける免疫反応性は、加齢とともに有意な増加を呈した（７ヶ月対３ヶ月；ｐ＝０．００１６；対応のないｔ検定で比較；ｎ＝４／群）。さらに、これらのマウスからの海馬切片の免疫組織化学分析によって、２Ｈ２Ｄ１１抗体（ＷＯ ２０１８／１７８０７８）と同様に、２Ｃ１２Ｃ８はＷｔマウスと免疫反応性を呈さなかったが（図１５、パネルＡ）、Ｔｈｙ－Ｔａｕ２２マウスにおいて、２Ｃ１２Ｃ８抗体は、ニューロンにおける典型的な病理学的封入体により呈されるように、タウ病理を標識する（図１５、パネルＢＤ）。２Ｈ２Ｄ１１抗体（ＷＯ ２０１８／１７８０７８）を用いて以前に示されたように、２Ｃ１２Ｃ８抗体の免疫標識が、病理学的過程の間の初期に検出される（図１５、パネルＢ）。

最後に、ＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕ種に対して、２Ｈ２Ｄ１１抗体として開発された特定のモノクローナル抗体（２Ｃ１２Ｃ８）に基づく受動免疫アプローチも、タウ病理のトランスジェニックモデルにおいて研究中である。

参考文献：

本願を通して、種々の参考文献が、本発明が関係する技術分野の状態を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により、本明細書により組み入れられる。

Claims (15)

1. アミノ酸配列（Ｎ－α－アセチル）ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧ（配列番号８）を含むエピトープに結合する、治療における使用のための抗タウ抗体。
2. １１位のメチオニン残基から開始するタウポリペプチドに特異的に結合する、ここで前記１１位のメチオニンはＮ－アルファアセチル化されている（Ａｃ１１Ｍｅｔ－Ｔａｕ）、請求項１に記載の使用のための抗タウ抗体。
3. タウポリペプチドに特異的に結合する、ここで前記ポリペプチドは以下からなる群より選択される、請求項２に記載の使用のための抗タウ抗体：
   （ｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３５２（配列番号：１）からなるアミノ酸配列；
   （ｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３８１（配列番号：２）からなるアミノ酸配列；
   （ｉｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－３８３（配列番号：３）からなるアミノ酸配列
   （ｉｖ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４１０（配列番号：４）からなるアミノ酸配列
   （ｖ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４１２（配列番号：５）からなるアミノ酸配列；
   （ｖｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－４４１（配列番号：６）からなるアミノ酸配列；
   （ｖｉｉ）タウＮ－アルファアセチル－Ｍｅｔ１１－７７６（配列番号：７）からなるアミノ酸配列；
   （ｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｖｉｉ）の配列の１１位のＮ－アルファアセチルメチオニン残基から開始する、少なくとも９連続アミノ酸のフラグメント。
4. 非Ｎ－アルファ－アセチル化形態のメチオニン１１タウポリペプチド（配列番号９）及び／又はＮ－アルファ－アセチル－Ｍｅｔ１－Ｔａｕポリペプチド（配列番号１０）に結合しない、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための抗タウ抗体。
5. タウオパチーの処置における使用のための、請求項１から４に記載の使用のための抗体。
6. タウオパチーがアルツハイマー病である、請求項５に記載の使用のための抗体。
7. （ａ）可変ドメインが以下を含む重鎖：
   － 配列番号１１として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ１、及び
   － 配列番号１２として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ２、及び
   － 配列番号１３として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＨ－ＣＤＲ３；
   （ｂ）可変ドメインが以下を含む軽鎖：
   － 配列番号１４として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ１、及び
   － 配列番号１５として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ２、及び
   － 配列番号１６として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%の同一性を有するＬ－ＣＤＲ３
   を含み、
   （ｃ）抗体２Ｈ２Ｄ１１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び／又は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性を伴ってＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕポリペプチドに結合する、抗タウ抗体。
8. （ａ）可変ドメインが以下を含む重鎖：
   － 配列番号１１として示される配列を有するＨ－ＣＤＲ１、及び
   － 配列番号１２として示される配列を有するＨ－ＣＤＲ２、及び
   － 配列番号１３として示される配列を有するＨ－ＣＤＲ３；
   （ｂ）可変ドメインが以下を含む軽鎖：
   － 配列番号１４として示される配列を有するＬ－ＣＤＲ１、及び
   － 配列番号１５として示される配列を有するＬ－ＣＤＲ２、及び
   － 配列番号１６として示される配列を有するＬ－ＣＤＲ３
   を含む、請求項７に記載の抗体。
9. － 可変ドメインが配列番号１７として示される配列と少なくとも７０%又は８０%又は９０%の同一性を有する重鎖
   － 可変ドメインが配列番号１８として示される配列と少なくとも７０%又は８０%又は９０%の同一性を有する軽鎖
   を含み、
   抗体２Ｈ２Ｄ１１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び／又は可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性を伴ってＡｃＭｅｔ１１－Ｔａｕポリペプチドに結合する、請求項８に記載の抗体。
10. － 可変ドメインが配列番号１７として示される配列を有する重鎖
    － 可変ドメインが配列番号１８として示される配列を有する軽鎖
    を含む、請求項９に記載の抗体。
11. タウタンパク質の病理学的播種及び／又は凝集を阻害することができる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
12. 医薬としての使用のための請求項７から１１に記載の抗体。
13. タウオパチーの処置における使用のための、請求項１２に記載の使用のための抗体。
14. タウオパチーがアルツハイマー病である、請求項１３に記載の使用のための抗体。
15. タウオパチー障害の処置の方法であって、前記方法は、それを必要とする被験者に、請求項１から１１に記載の治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法。

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