KR20230088393A - 재조합 아데노 연관 바이러스 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

재조합 아데노 연관 바이러스 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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조나단 챈
조지 할러
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Abstract

재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 재조합 배큘로바이러스 시스템 및 이러한 조성물을 생성하고 정제하기 위해 이를 사용하는 방법이 본원에 개시된다. 또한 이러한 조성물의 역가 및 효능을 시험하기 위한 분석법이 본원에 개시되어 있다.

Description

재조합 아데노 연관 바이러스 조성물 및 이의 제조 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 15일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/092,179의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
본원에 전자적으로 제출된 다음과 같은 텍스트 파일의 내용이 전체적으로 본원에 참조로 포함된다: 컴퓨터 판독 가능한 형식의 서열 목록 사본(파일명: PRVL_013_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록 일자: 2021년 10월 15일, 파일 크기 ~16,966바이트).
기술 분야
본 발명은 일반적으로 유전자 치료 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합 배큘로바이러스 시스템 및 재조합 아데노 연관 바이러스를 포함하는 조성물을 생산하기 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다.
배경
재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)는 유전자 치료를 위한 벡터로 널리 사용되어 왔다. 비인간 영장류 연구, 인간 임상 시험 및 의학적 치료를 위한 rAAV 수요가 증가하고 있다. 재조합 배큘로바이러스 시스템은 rAAV 생산에 사용되어 왔다. 유전자 치료 프로토콜에 사용하기에 적합한 개선된 순도를 갖는 rAAV를 높은 수율로 얻는 배큘로바이러스 기반 공정이 여전히 필요하다.
요약
본원은 세포 용해물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (i) 2개 이상의 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 세포 배양 배지를 포함하는 혼합물에 현탁된 곤충 세포를 함유하는 생물반응기를 얻는 단계; (ii) 곤충 세포를 배큘로바이러스 벡터의 제1 집단으로 약 1.0 내지 2.0의 감염 다중도(MOI)로 감염시키는 단계 (이 때 배큘로바이러스 벡터의 제1 집단은 관심 유전자 산물을 인코딩하는 발현 카세트를 포함함); (iii) 곤충 세포를 배큘로바이러스 벡터의 하나 이상의 추가 집단으로 약 1.0 내지 2.0의 MOI로 감염시키는 단계 (이 때 추가 집단은 각각 AAV Rep 단백질 및/또는 AAV Cap 단백질을 인코딩하는 발현 카세트를 포함함); (iv) 감염된 곤충 세포가 관심 유전자를 인코딩하는 rAAV 입자를 생산하는 조건 하에서 감염된 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 (v) 감염된 곤충 세포를 용해시켜 rAAV 입자를 포함하는 세포 용해물을 생산하는 단계. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 배양 배지 각각은 4셀 곤충 CD 배지, ESF-921, ESF-AF, ExpiSf CD 배지, Express Five SFM, baculoGROW, IS SF, 및 SF900 II SFM으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 약 10% v/v 내지 약 50% v/v의 SF900 II SFM 배지를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단계 (i)의 곤충 세포는 마스터 씨드 트레인의 4-6회 계대 후에 얻어진다. 일부 실시형태에서, 단계 (ii)의 감염 및 단계 (iii)의 감염은 동시에 발생한다.
일부 실시형태에서, 곤충 세포는 mL당 8E+06 생존 세포(vc/mL) 내지 약 20E+06 vc/mL의 세포 밀도로 생물반응기에 존재한다.
일부 실시형태에서, 단계 (iv)의 배양은 1일 내지 5일 동안 일어난다. 일부 실시형태에서, 단계 (v)의 용해는 감염된 곤충 세포를 세제와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 용해물을 생산하는 방법은 심층 여과에 의해 세포 용해물을 정화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물을 생산하는 방법은 용해물의 rAAV 입자를 접선 유동 여과 및/또는 정용여과에 의해 농축시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 관심 유전자 산물은 펩티드, 폴리펩티드, 억제성 핵산 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 관심 유전자 산물은 글루코세레브로시다제(GCase), 프로그래눌린(PGRN), 프로사포신(PSAP), C9orf72, 골수 세포 2(TREM2)에서 발현된 촉발 수용체, 아포지단백 E2(ApoE2) 또는 파킨을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 용해물은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 이들 중 어느 하나의 변이체인 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 용해물은 (a) 밀리리터당 약 1E+11 바이러스 게놈(vg/mL) 내지 약 1.0E+13 vg/mL; (b) 약 2E+11 vg/mL 내지 약 1.0E+13 vg/mL; 또는 (c) 약 5E+11 vg/mL 내지 약 1.0E+13 vg/mL을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 방법에 의해 생산된 세포 용해물을 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 동결 방지제를 추가로 포함한다.
본원은 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: (i) rAAV 입자를 포함하는 세포 용해물을 얻는 단계; (ii) 친화성 크로마토그래피 컬럼을 세포 용해물과 접촉시키는 단계(이 때, 친화성 컬럼은 rAAV 입자가 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하는 조건 하에서 rAAV 입자의 캡시드 단백질에 특이적인 결합제를 포함함); (iii) 결합된 rAAV 입자를 컬럼으로부터 용출하여 1차 용출액을 생산하는 단계; (iv) 1차 용출액에 대해 음이온-교환 크로마토그래피를 수행하여 2차 용출액을 생산하는 단계(이 때, 2차 용출액은 1차 용출액보다 더 적은 수의 빈 rAAV 입자를 포함함); (v) 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188을 포함하는 유동 완충액을 사용하여 접선 유동 여과를 수행하여 2차 용출액을 농축함으로써 rAAV 입자를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 단계. 일부 실시형태에서, 단계 (i)의 세포 용해물은 본원에 개시된 세포 용해물을 생산하기 위한 임의의 방법들에 의해 얻는다. 일부 실시형태에서, 결합제는 AAV9 캡시드 단백질에 특이적인 친화성 수지를 포함한다.
일부 실시형태에서, 음이온-교환 크로마토그래피는 1차 용출액을 평형화 완충액과 혼합하여 약 0.5 mS/cm 내지 5 mS/cm의 전도도를 갖는 혼합물을 생산하는 단계(선택적으로 이 때 혼합물은 2 mS/cm의 전도도를 가짐), 혼합물을 4차 아민-함유 수지에 결합시켜 혼합물 내의 rAAV 입자를 수지에 결합시키는 단계, 그리고 rAAV 입자를 수지로부터 용출시켜 2차 용출액을 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 2차 용출액은 약 1.0E+12 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL로 농축된다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 15% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함한다.
본원은 rAAV 입자를 포함하는 치료 조성물을제공하며, 이 때 rAAV 입자는 AAV 캡시드 단백질 및 관심 유전자 산물을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하고, 이 때 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 초과의 rAAV 입자를 포함하고, 치료 조성물은 약 15% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 관심 유전자 산물은 펩티드, 폴리펩티드, 억제성 핵산 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 관심 유전자 산물은 GCase, GRN, PSAP, TREM2, ApoE2 또는 파킨을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 이들 중 어느 하나의 변이체인 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL를 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료 조성물은 용기에 존재한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 무균이다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 미생물 성장을 촉진하지 않는다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 0.5 EU/mL 미만의 내독소 수준을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV의 약 1.0E+13 vg/mL 초과가 유전자 산물을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV의 TCID50 역가는 약 1,000 vg/IU 내지 약 6,000 vg/IU이다.
일부 실시형태에서, 유전자 산물은 GCase이다. 일부 실시형태에서, GCase 활성은 참조 표준에 비해 적어도 110%이며, 여기서 참조 표준은 GCAse를 인코딩하는 정제된 rAAV이다.
일부 실시형태에서, 감염 역가는 약 8.0E+9 IU/mL 내지 약 1.2E+10 IU/mL이다.
일부 실시형태에서, 삼투질농도는 약 300 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg이다. 일부 실시형태에서, pH는 약 7 내지 약 9이다.
일부 실시형태에서, 치료 조성물은 눈에 보이는 입자가 없다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 용기당 약 10 μm보다 큰 약 6000개 미만의 입자 및 용기당 약 25 μm보다 큰 약 600개 미만의 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 3% 이하의 응집체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 300μg/mL 내지 약 1000μg/mL의 총 단백질 수준을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV의 순도는 약 90% v/v 초과이다.
일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 5% v/v 보다 큰 임의의 단일 불순물을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 0.0007% 내지 약 0.0012%의 플루로닉(Pluronic)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 5.5 x 104 사본 미만의 RNA/mL의 랍도바이러스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 용기 내 치료 조성물의 추출 가능한 부피는 약 1.0mL 이상이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 rAAV 효능 분석을 위한 PCR 플레이트 맵의 다이어그램이다. “RS”는 “참조 표준”을 지칭한다. “TS”는 “테스트 샘플”을 지칭한다.
도 2는 GCase를 발현하는 여러 rAAV 샘플의 선 그래프 및 상대적 효능의 계산을 도시한다.
도 3은 PGRN을 발현하는 여러 rAAV 샘플의 선 그래프 및 상대적 효능의 계산을 도시한다.
상세한 설명
본 발명은 유전자 요법 프로토콜에서의 투여에 적합한 고수율 및 충분한 순도를 갖는 rAAV를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고수율 및 고순도로 rAAV를 포함하는 조성물을 생산하기 위해 재조합 배큘로바이러스 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다.
용어 “재조합 바이러스”는 예를 들어, 바이러스 입자에 이종 핵산 구조체를 추가하거나 삽입함으로써 유전적으로 변경되어 있는 바이러스를 지칭한다.
“이종”이라는 용어는 본원에서 “외인성”이라는 용어와 상호교환적으로 사용되며, 본래의 공급원이 아닌 일부 공급원으로부터 유래하는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 용어 “외인성 단백질” 또는 “외인성 유전자”는 AAV 게놈 또는 AAV 입자에 인공적으로 도입되어 있는 비-AAV 공급원으로부터의 얻은 단백질 또는 유전자를 지칭한다.
용어 “재조합 아데노 연관 바이러스” 또는 “rAAV”는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 rAAV 벡터를 포함하는 AAV 입자 또는 AAV 비리온을 지칭한다.
용어 “rAAV 벡터”는 AAV 5' 역위 말단 반복(ITR) 서열 및, AAV 바이러스 게놈, 예를 들어, 하나 이상의 프로모터 및/또는 인핸서 그리고, 선택적으로 폴리아데닐화 서열 및/또는 단백질 코딩 서열의 엑손들 사이에 삽입된 하나 이상의 인트론에 대해 이종인 전사 조절 요소들에 작동 가능하게 연결된 단백질 코딩 서열에 측접하는(flanking) AAV 3' ITR을 갖는,단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산을 지칭한다.
용어 “완전 rAAV 입자” 또는 “완전 rAAV 캡시드”는 AAV ITR이 양쪽에서 측접하고 있는 관심 외인성 유전자를 포함하는 핵산 분자를 캡슐화하는 AAV 구조 단백질 쉘을 포함하는 AAV 비리온을 지칭한다.
용어 “빈 rAAV 입자” 또는 “빈 rAAV 캡시드”는 AAV 구조 단백질 쉘을 포함하지만 AAV ITR이 양쪽에서 측접하는 관심 외인성 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체가 전체적으로 또는 부분적으로 결여된 AAV 비리온을 지칭한다. 빈 rAAV 입자는 관심 유전자를 숙주 세포로 전달하는 기능을 하지 않는다.
일부 실시형태에서, 용어 “용출액”은 물질을 용출하는데 사용되는 완충액을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 “용출액”은 문맥상 예를 들어, 분석 또는 추가 정제를 위해 용출된 물질, 예를 들어, 이전 정제 단계로부터 얻은 원하는 산물 또는 물질을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
“참조 표준”이라는 용어는 농도 및/또는 효능이 공지되어 있는 외인성 관심 단백질을 인코딩하는 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 지칭한다.
용어 “IU”는 감염 단위를 지칭한다.
용어 “TCID50”은 50% 세포 배양물 감염 용량을 지칭한다.
용어 “USP”는 미국 약전을 지칭한다.
재조합 아데노 연관 바이러스를 포함하는 치료 조성물
rAAV를 포함하는 치료 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양상들에서, 본원에 제공된 치료 조성물은 유전자 요법에 적합하다.
일부 양상에서, 본원은 rAAV 입자를 포함하는 치료 조성물을제공하며, 이 때 rAAV 입자는 AAV 캡시드 단백질 및 관심 유전자 산물을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하고, 이 때 치료 조성물은 1E+13 vg/mL 초과의 rAAV 입자를 포함하고, 치료 조성물은 15% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 관심 유전자 산물은 펩티드, 폴리펩티드, 억제성 핵산 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 관심 유전자 산물은 인간 GCase 또는 인간 프로그래눌린(PGRN 또는 GRN)이다. 일부 실시형태에서, 관심 유전자 산물은 인간 PSAP, 인간 C9orf72, 인간 TREM2, 인간 ApoE2 또는 인간 파킨이다.
일부 실시형태에서, 억제성 핵산은 억제 RNA이다. 일부 실시형태에서, 억제성 핵산은 이중 가닥 RNA(dsRNA), siRNA, 마이크로 RNA(miRNA), 인공 miRNA(amiRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 RNA 압타머이다. 인공 마이크로RNA(amiRNA)는 pre-mRNA의 천연 표적화 영역을 관심 표적화 영역으로 대체하기 위해 천연 miRNA를 변형함으로써 유도될 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 발현된 miRNA는 스캐폴드 또는 백본(예를 들어, pri-miRNA 스캐폴드)으로서 사용될 수 있으며 줄기 서열은 관심 유전자를 표적으로 하는 miRNA의 것으로 대체된다. 인공 전구체 마이크로RNA(pre-amiRNA)는 일반적으로 하나의 안정한 작은 RNA가 우선적으로 생성되도록 처리된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 scAAV 벡터 및 scAAV는 amiRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, amiRNA의 pri-miRNA 스캐폴드는 pri-MIR-21, pri-MIR-22, pri-MIR-26a, pri-MIR-30a, pri-MIR-33, pri-MIR-122, pri-MIR-375, pri-MIR-199, pri-MIR-99, pri-MIR-194, pri-MIR-155 및 pri-MIR-451로 구성된 군으로부터 선택된 pri-mRNA에서 유래한다. 일부 실시형태에서, amiRNA는 예를 들어 Fowler 외, (2016) Nucleic Acids Res. 44(5):e48에 기재된 eSIBR amiRNA 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시형태에서, amiRNA는 miR-7-2 스캐폴드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 억제성 RNA는 인간 α-시누클레인, 인간 아탁신 2(ATXN2), 인간 미세소관 관련 단백질 타우(MAPT) 또는 인간 아포지단백 E(ApoE)를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 GCase(예를 들어, 서열 번호 2)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 α-시누클레인을 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 α-시누클레인을 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 12를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 C9orf72(즉, 기능적 C9orf72)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 C9orf72를 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 ApoE2(즉, 기능적 ApoE2)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 ApoE2를 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 핵산 분자는 외인성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 TREM2(즉, 기능적 TREM2)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 TREM2를 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 적합한 rAAV 벡터의 예는 WO2019/070891, WO2019/070893, WO2019/070894, 및 WO2019/084068에 개시되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 치료 조성물의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 치킨 베타 액틴(CBA) 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서; 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE); 소 성장 호르몬 폴리A 신호 꼬리; 인공 인트론; 인공 엑손; 및 프로모터 영역의 다음 전사 조절 활성화 부위:TATA, RBS 및 YY1 중 하나 이상(Francois 외, (2005) J. Virol. 79(17):11082-11094). TATA, RBS 및 YY1 전사 조절 활성화 부위는 프로모터 영역의 5' 말단에 위치할 수 있다.
본원에 개시된 치료 조성물의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 제1 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 및 관심 유전자 산물 및 관련 조절 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 측접하는 제2 ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 ITR은 야생형 AAV2 ITR(서열 번호 5)이다. 일부 실시형태에서, 각각의 ITR은 야생형 AAV2 ITR로부터 유도된다.
본원에 개시된 치료 조성물의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는, 순차적으로, 제1 AAV ITR, CMV 인핸서, CBA 프로모터, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, WPRE, 소 성장 호르몬 폴리A 신호 꼬리, 및 제2 AAV ITR을 순차적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 최적화된 코돈이다(예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈). 일부 실시형태에서, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2를 포함한다.
본원에 개시된 치료 조성물의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는, 순차적으로, 제1 AAV ITR, CMV 인핸서, CBA 프로모터, 인간 PGRN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, WPRE, 소 성장 호르몬 폴리A 신호 꼬리, 및 제2 AAV ITR을 순차적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 PGRN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 최적화된 코돈이다(예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈). 일부 실시형태에서, 인간 PGRN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4를 포함한다.
본원에 개시된 치료 조성물의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 자기-상보적 재조합 아데노 연관 바이러스(scAAV) 벡터이다. scAAV 벡터는 예를 들어 McCarty 외, (2001) Gene Ther. 8(16):1248-54에 기재되어 있다.
본원에 개시된 치료 조성물의 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 본원에 개시된 조성물의 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질, 또는 이들 캡시드 단백질 중 어느 하나의 변이체를 포함한다.
rAAV 벡터의 게놈 역가(물리적 역가라고도 함), 예를 들어, 본원에 개시된 조성물 및 제형의 게놈 역가는 다수의 방식으로 결정될 수 있다. 바이러스 벡터에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR은 상대적 측정값을 제공할 수 있다. 정량적 PCR(qPCR)은 더 작은 샘플 및 절대 측정에 사용될 수 있다. 이중 디지털 PCR(ddPCR)은 유중수 액적(water-oil emulsion droplet) 기술을 기반으로 디지털 PCR을 수행하는 방법이다. 샘플을 수만 개의 액적들로 분획화하고, 각 개별 액적에서 템플릿 분자의 PCR 증폭이 발생합니다. 표준 곡선을 만들거나 증폭 효율이 높은 프라이머가 필요하지 않으므로, ddPCR은 일반적으로 기존 PCR 기반 기술만큼 많은 샘플을 사용하지 않는다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈 역가는 PCR을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈 역가는 qPCR을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈 역가는 ddPCR을 사용하여 결정된다. ddPCR을 사용하여 바이러스 게놈 역가를 결정하는 방법은, 예를 들어, Lock 외, (2014) Hum Gene Ther Methods 25(2):115-25에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈 역가는 실시예 11 또는 실시예 13에 제공된 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물의 물리적 역가는 약 2.0 x 1013 vg/mL, 약 3.0 x 1013 vg/mL, 약 4.0 x 1013 vg/mL, 또는 약 5.0 x 1013 이상이다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물의 물리적 역가는 약 2.0 x 1013 vg/mL 내지 약 5.0 x 1013 vg/mL이다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 1E+13 vg/mL 초과의 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL의 rAAV 입자를 포함한다.
rAAV 벡터의 감염 역가(기능적 역가라고도 지칭됨), 예를 들어, 본원에 개시된 조성물 및 제형의 감염 역가는 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자의 농도이다. 일부 실시형태에서, 감염 역가는 세포 형질도입 분석에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터의 감염 역가는 실시예 12 또는 실시예 14에 제공된 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물의 감염 역가는 약 8.0E+9 IU/mL 내지 약 1.2E+10 IU/mL이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물의 감염 역가는 약 8.0E+9 IU/mL, 약 8.15E+9 IU/mL, 약 8.5E+9 IU/mL, 약 9.0E+9 IU/mL, 약 9.5E+9 IU/mL, 약 9.99E+9 IU/mL, 약 1E+10 IU/mL, 약 1.12E+10 IU/mL 또는 약 1.2E+10 IU/mL이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물의 TCID50은 약 4,500 vg/IU 내지 약 10,000 vg/IU이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물의 TCID50은 약 1,000 vg/IU 내지 약 6,000 vg/IU이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물의 TCID50은 약 4,500 vg/IU, 약 5,000 vg/IU, 약 5,500 vg/IU, 약 6,000 vg/IU, 약 6,290 vg/IU, 약 6,500 vg/IU, 약 7,000 vg/IU, 약 7,500 vg/IU, 약 8,000 vg/IU, 약 8,500 vg/IU, 약 9,000 vg/IU, 약 9,500 vg/IU, 약 9,980 vg/IU 또는 약 10,000 vg/IU이다.
일부 실시형태에서, PCR 기반 방법은 외인성 유전자를 표적으로 하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 캡슐화된 rAAV 게놈을 검출하고 정량화한다. 일부 실시형태에서, PCR 기반 방법은 CBA 프로모터를 표적으로 하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 캡슐화된 rAAV 게놈을 검출하고 정량화한다. 일부 실시형태에서, PCR 기반 방법은 CMV 인핸서를 표적으로 하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 캡슐화된 rAAV 게놈을 검출하고 정량화한다. 일부 실시형태에서, PCR 기반 방법은 ITR 서열들을 표적으로 하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 캡슐화된 rAAV 게놈을 검출하고 정량화한다. 일부 실시형태에서, PCR 기반 방법은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(폴리A) 신호 꼬리를 표적으로 하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 캡슐화된 rAAV 게놈을 검출하고 정량화한다.
일부 경우에, rAAV-함유 조성물의 제조 공정 동안, 불순물을 포함하는 조성물이 생성될 수 있다. 적은 양의 불순물을 포함하는 약학 조성물은 미성숙하거나 약화된 면역 체계를 갖는 대상체(예를 들어, 유아)가 치료적 이점 없이 불필요하게 항원 물질(예를 들어, 빈 캡시드, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA)에 노출되는 것을 방지하기 때문에 유리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 약학 조성물은 잠재적인 주입 반응 또는 더 광범위한 면역 반응을 감소시킬 수 있고 치료 효능을 향상시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 물질을 함유하지 않는 빈 rAAV 입자(“빈 캡시드”라고도 지칭됨)가 AAV 생산 공정 동안 생성될 수 있다. rAAV 벡터 물질을 포함하는 완전 바이러스 입자와 비교할 때, 빈 입자들은 다른 밀도를 가지므로, 당업계에 알려진 방법으로 두 종을 분리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 빈 캡시드는 크로마토그래피(예를 들어, 모놀리스 크로마토그래피, 또는 보다 구체적으로 대류 상호작용 매질 모노리스 크로마토그래피)에 의해 분리된다.
일부 실시형태에서, 완전 rAAV 입자에 대한 빈 rAAV 입자의 비율은 표준 실험실 기술에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 비율은 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 이러한 비율은 광학적 흡광도 측정에 의해 측정된다. 일부 실시예에서, 이러한 비율은 UV 흡광도 측정에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 약 15% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 10% 미만, 약 8% 미만의 빈 rAAV 입자, 7% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만, 또는 약 1% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 1% 내지 약 10%의 빈 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 2% 내지 약 8%의 빈 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 약 6% 이하의 빈 rAAV 입자, 약 5%의 빈 rAAV 입자, 약 4%의 빈 rAAV 입자, 약 3%의 빈 rAAV 입자, 약 2%의 빈 rAAV 입자, 또는 약 1%의 빈 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 빈 rAAV 입자의 수는 검출 한계 미만이다. 일부 실시형태에서, 빈 rAAV 입자의 백분율은, 예를 들어, 분석 초원심분리(AUC)를 사용한 총 rAAV 입자의 백분율로 결정된다. 일부 실시형태에서, 빈 rAAV 입자의 이러한 낮은 백분율은, 예를 들어 더 높은 백분율의 빈 rAAV 입자를 갖는 조성물을 투여하는 것과 비교하여, 대상체에게 투여한 후 치료의 효능을 개선하고/하거나 이상 반응(예를 들어, 염증 반응, 간 손상)을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 rAAV 조성물의 제조 방법은, 다른 방법, 예를 들어 본원에 기재된 생산 및/또는 정제 방법을 사용하지 않는 방법에서 생산된 빈 rAAV 입자들의 수준과 비교하여, 빈 rAAV 입자를 이러한 낮은 백분율로 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 적어도 80%의 완전 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 적어도 85%의 완전 rAAV 입자, 적어도 90%의 완전 rAAV 입자, 또는 적어도 95%의 완전 rAAV 입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 조성물의 생산 공정 동안, rAAV 입자를 생성하기 위해 사용된 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)로부터의 잔류 단백질은 완전히 분리되지 않을 수 있다. 잔류 숙주 세포 단백질은 유전자 치료 대상체에서 면역 반응을 유도할 가능성이 있다. 잔류 숙주 세포 단백질의 양은 바이러스 캡시드 단백질과 잔류 숙주 세포 단백질을 구별할 수 있는 표준 실험실 기술로 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 잔류 숙주 세포 단백질의 양은 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 잔류 숙주 세포 단백질의 양이 부모 세포-특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 측정될 수 있는 측정이 행해질 수 있다. 일부 실시형태에서, 잔류 숙주 세포 단백질의 양은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 잔류 숙주 세포 단백질의 양은 상업적 ELISA 키트에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 치료 조성물 중 잔류 숙주 세포 단백질은 약 45 ng/1E+13 vg, 42 ng/1E+13 vg, 40 ng/1E+13 vg, 35 ng/1E+13 vg, 30 ng/1E+13 vg, 약 29 ng/1E+13 vg, 약 28 ng/1E+13 vg, 약 27 ng/1E+13 vg, 약 26 ng/1E+13 vg, 또는 약 25ng / 1E+13 vg 이하이다.
일부 경우에, rAAV 조성물의 생산 공정 동안, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)로부터의 잔류 숙주 세포 DNA 또는 rAAV 벡터를 생성하기 위해 사용된 잔류 배큘로바이러스 DNA 또는 바크미드 DNA가 완전히 제거되지 않을 수 있다. 정화 공정(예를 들어, 정화, 접선 유동 여과 등)은 대부분의 다량의 잔류 숙주 세포 DNA 또는 배큘로바이러스 DNA를 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, 잔류 숙주 세포 또는 배큘로바이러스 DNA의 양의 측정은 PCR(중합 효소 연쇄 반응)에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 잔류 숙주 세포 또는 배큘로바이러스 DNA의 양의 측정은 숙주 세포 또는 배큘로바이러스 서열에 특이적인 프라이머를 사용한 qPCR에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 잔류 숙주 세포 또는 배큘로바이러스 DNA의 양의 측정은 ddPCR에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 또는 바크미드 DNA의 양은 바크미드의 항생제 내성 유전자 영역에 특이적인 프라이머를 사용한 qPCR 분석을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 잔류 숙주 세포 DNA의 양은 시판 qPCR 분석 키트에 의해 결정된다. 잔류 숙주 세포 또는 배큘로바이러스 또는 바크미드 DNA의 양을 감소시키는 것은 치료 결과를 개선할 수 있고, 이러한 조성물은 본원에 개시된 치료에 사용하기 위해 정제 및/또는 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 약학 조성물 중 잔류 숙주 세포 DNA의 양은 1E+14 vg/ml 당 약 1E+03 pg/ml 이하이다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 1E+14 vg/mL당 약 1.3ng 이하의 잔류 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 제약 조성물 중 잔류 숙주 세포 DNA의 양은 정량 한계 미만이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 바이러스 입자를 포함하는 본원에 개시된 치료 조성물은 기준 표준의 ±20% 사이, ±15% 사이, ±10% 사이, 또는 ±5% 사이의 효능을 유지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료 조성물은 바이러스 벡터를 포함하며, 이 때 바이러스 벡터의 상대 역가는 참조 표준에 비해 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 99.5%, 적어도 99.9%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130% 또는 적어도 140%이다. 일부 실시형태에서, 효능은 적합한 시험관 내 세포 분석 또는 생체 내 동물 모델을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 인간 GCase를 인코딩하는 rAAV의 효능 또는 기능성%는 하기 기재된 바와 같이 형광원성 기질 레조루핀-β-D-글루코피라노사이드를 사용하는 세포 기반 분석에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 프로그래눌린을 인코딩하는 rAAV의 효능 또는 기능적%는 하기 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하는 세포 기반 분석에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제, 습윤제 등과 같은 생리학적 조건에 근접하도록 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화 나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트 등을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 방부제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 방부제를 포함하지 않는다.
본원에 개시된 rAAV 조성물은 약학으로 유용한 조성물을 제조하기 위해 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 포유동물 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 조성물은 대조(cisterna magna) 내부로의 주사용으로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 조성물은 근육내, 피내, 점막, 피하, 척수강내 또는 국소 투여용으로 제형화될 수 있다.
본원은 다음을 포함하는 약학 제형을 추가로 제공한다: (a) 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자; (b) 트리스 완충액; (c) 염화 마그네슘; (d) 염화 나트륨; 및 (e) 폴록사머. 본원에 개시된 치료 조성물의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는, 순차적으로, 제1 AAV ITR, CMV 인핸서, CBA 프로모터, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, WPRE, 소 성장 호르몬 폴리A 신호 꼬리, 및 제2 AAV ITR을 순차적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자는 PR001로 지칭된다.
추가로 rAAV 입자, 약 20mM 트리스 pH 8.0, 약 1mM 염화 마그네슘, 약 200mM 염화 나트륨 및 약 0.001% 폴록사머 188을 포함하는 약학 제형이 본원에 제공되며, 여기서 rAAV는 인간 글루코세레브로시다아제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하고, 이 때 인간 글루코세레브로시다아제 단백질은 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고; 그리고 인간 글루코세레브로시다제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에는 2개의 AAV ITR 서열이 측접된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 입자이다.
본원은 다음을 포함하는 약학 제형을 추가로 제공한다: (a) 인간 프로그래눌린(PGRN) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자; (b) 트리스 완충액; (c) 염화 마그네슘; (d) 염화 나트륨; 및 (e) 폴록사머. 본원에 개시된 치료 조성물의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는, 순차적으로, 제1 AAV ITR, CMV 인핸서, CBA 프로모터, 인간 PGRN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, WPRE, 소 성장 호르몬 폴리A 신호 꼬리, 및 제2 AAV ITR을 순차적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 PGRN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 PGRN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자는 PR006으로 지칭된다.
추가로 rAAV 입자, 약 20mM 트리스 pH 8.0, 약 1mM 염화 마그네슘, 약 200mM 염화 나트륨 및 약 0.001% 폴록사머 188을 포함하는 약학 제형이 본원에 제공되며, 여기서 rAAV는 인간 프로그래눌린 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하고, 이 때 인간 프로그래눌린 단백질은 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고; 그리고 인간 글루코세레브로시다제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에는 2개의 AAV ITR 서열이 측접된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 입자이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 제제는 약 10 mM 내지 약 30 mM의 트리스 pH 8.0을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 제제는 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mM의 염화 마그네슘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 제제는 약 100 mM 내지 약 300 mM의 염화 나트륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 제제는 약 0.001% 내지 약 0.005%의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 제제는 약 1E+13 vg/mL 내지 약 5E+13 vg/mL를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 총 호기성 미생물 수(TAMC) ≤1 CFU/10 mL 및 총 조합 효모 및 곰팡이 수(TYMC) ≤1 CFU/10 mL를 갖는다. TAMC 및 TYMC 양은 멤브레인 여과 USP <61> 방법으로 측정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 0.5 EU/mL 미만, 약 0.4 EU/mL 미만, 약 0.3 EU/mL 미만, 약 0.2 EU/mL 미만, 또는 약 0.1 EU/mL 미만의 내독소 수준을 포함한다. 내독소 수준은 동역학적 발색 방법으로 측정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 마이코플라즈마 및 스피로플라즈마의 존재에 대해 음성이다. 마이코플라즈마 및 스피로플라즈마의 존재는 마이코플라즈마 생장정지(Mycoplasmastasis)가 있는 마이코플라즈마 테스트(USP <63>)에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 외래성 인자는 본원에 개시된 조성물에서 검출되지 않는다. 바이러스 오염 물질의 존재는 MRC-5, Vero 및 Hela 세포의 세 가지 세포주에 직접 접종하여 시험관 내에서 결정될 수 있다. 바이러스 오염물질의 존재는 성체 마우스, 기니피그, 젖먹이 마우스 및 부화란에 접종하여 생체 내에서 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 복제 적격 AAV는 본원에 개시된 조성물에서 검출되지 않는다. 복제 가능 AAV의 존재는 연속 감염 및 qPCR에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 > 약 2% 이상의 단일 불순물 없이 순도 > 약 90%를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 90%, 약 95%, 또는 약 99% 초과의 순도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 5% v/v, 약 4% v/v, 약 3% v/v, 또는 약 2% v/v보다 큰 임의의 단일 불순물을 포함하지 않는다. 순도는 SDS-PAGE SYPRO® Ruby에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 중 잔류 트리톤 X-100의 존재는 HPLC-RI 또는 UV 흡광도에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 1.7 ng/1x1013 vg 미만, 1.67 ng/1x1013 vg 미만, 1.6 ng/1x1013 vg 미만, 또는 1.5 ng/1x1013 vg 미만의 잔류 벤조나제를 포함한다. 잔류 벤조나제의 수준은 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 중 잔류 배큘로바이러스의 존재는 BacPAK™ 분석에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 내의 잔류 SF9 숙주 세포 DNA의 존재는 qPCR에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 중 잔류 SF9 숙주 세포 단백질의 존재는 ELISA에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 노다바이러스에 대해 음성이다. 노다바이러스의 존재는 qPCR에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 마이코박테리아 DNA는 본원에 개시된 조성물에서 전혀 검출되지 않았다. 마이코박테리아 DNA의 존재는 qPCR에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 막 여과 USP<71>에 의해 무균성에 대해 테스트된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 이 테스트에서 성장을 나타내지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 USP<71>에 의해 정균작용/정진균작용에 대해 테스트된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 이 테스트에서 성장의 억제를 나타내지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 AAV9-특이적 ELISA에 의해 AAV9 캡시드의 존재에 대해 테스트된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 바이러스 입자 단백질에 대한 웨스턴 블롯에 의해 AAV 캡시드 단백질의 존재에 대해 테스트된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 차세대 시퀀싱에 의해 DNA 동일성에 대해 테스트된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 300 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 388 mOsm/kg 내지 약 426 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 삼투압은 어는점 내림법으로 측정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 7 내지 약 9의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 8.0 +/- 0.5의 pH를 갖는다. pH는 pH 측정기로 측정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 투명 내지 약간 불투명하고, 무색 내지 희미한 백색 용액이며 육안 검사에 의해 결정되는 눈에 보이는 입자가 없다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 ≥ 10μm의 약 6000개의 입자/용기 및 ≥ 25μm의 ≤ 약 600개의 입자/용기를 포함한다. 눈에 보이지 않는 미립자 물질은 USP<787> 방법으로 측정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 동적 광 산란(DLS)에 의해 응집체에 대해 테스트된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 300μg/mL 내지 약 1000μg/mL의 총 단백질 수준을 포함한다. 총 단백질 수준은 Micro BCA™ 단백질 분석 키트로 측정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 용기에 존재한다. 일부 실시형태에서, 용기 마개는 염료 침투 시험에 의해 테스트된다. 일부 실시형태에서, 용기 내 조성물의 추출 가능한 부피는 적어도 약 1.0mL이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 0.0007% 내지 약 0.0012%의 플루로닉을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 5.5 x 104 미만의 사본의 RNA/mL의 랍도바이러스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 다음 중 하나 이상을 가진다: TAMC ≤1 CFU/10 mL; TYMC ≤1 CFU/10mL; 내독소 수준 ≤ 5 EU/mL를 포함하고; 마이코플라즈마 및 스피로플라즈마의 존재에 대해 음성이고; 외래성 바이러스 인자에 의한 오염의 증거가 없고; 물리적 역가가 ≥ 3.0 x 1013 vg/mL이고, 검출 가능한 복제 적격 AAV를 나타내지 않으며; >2% 이상의 단일 불순물 없이 >90%의 순도를 가지고; <1.67 ng / 1x1013 vg의 잔류 벤조나제를 가지고; ≤15%의 빈 캡시드를 가지며; <42 ng / 1x1013 vg의 잔류 Sf9 숙주 세포 단백질을 가지고; 노다바이러스에 대해 음성이고; 마이코박테리아 DNA가 검출되지 않았다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 다음 중 하나 이상을 가진다: 무균 시험에서 성장을 나타내지 않으며; 내독소 수준 ≤ 5 EU/mL를 포함하고; AAV9 캡시드 단백질에 대해 양성이고; 예상되는 DNA 서열을 포함하고; ≥3.0 x 1013 vg/mL를 포함하고; >2% 이상의 단일 불순물 없이 >90%의 순도를 가지며; 약 388 mOsm/kg 내지 약 426 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖고; pH 8.0 +/- 0.5를 가지며; 투명 내지 약간 불투명하고; 무색 내지 희미한 흰색 용액이며; 육안 검사로 결정하여 눈에 보이는 입자가 없고; ≥ 10μm의 6000개 입자/용기 및 ≥ 25μm의 ≤600개 입자/용기를 포함하고; 용기에 ≥ 1.0mL의 추출 가능한 부피를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 rAAV-함유 조성물 및 제제는 이상 리소좀 기능과 관련된 질환을 치료함에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 rAAV-함유 조성물 및 제제는 신경퇴행성 장애 또는 질환을 치료함에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV를 포함하는 본원에 개시된 조성물 또는 제형은 고셔병 또는 파킨슨병(예를 들어, GBA1 돌연변이를 갖는 파킨슨병)을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 프로그래눌린 단백질을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV를 포함하는 본원에 개시된 조성물 또는 제형은 GRN 돌연변이를 갖는 전측두엽 치매(FTD-GRN)를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 α-시누클레인을 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 글루코세레브로시다제 단백질을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV를 포함하는 본원에 개시된 조성물 또는 제형은 시누클레인병증 또는 파킨슨증을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 α-시누클레인을 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV를 포함하는 본원에 개시된 조성물 또는 제형은 시누클레인병증 또는 파킨슨증을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
재조합 배큘로바이러스
본 발명의 방법은 곤충 세포를 재조합 배큘로바이러스(rBV) 집단으로 공동 감염시켜 관심 유전자(외인성 유전자로도 지칭됨)를 인코딩하는 rAAV를 생산하는 것을 포함한다. 적어도 2개의 rBV 집단이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 재조합 배큘로바이러스를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System(Invitrogen, Carlsbad, CA) 참조).
일부 양상들에서, rBV 게놈은 오토그라파 캘리포르니카 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV), 봄빅스 모리 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, BmNPV), 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera, HearNPV) 또는 스포돕테라 엑시구아 MNPV(Spodoptera exigua MNPV)에서 파생된다. 일부 실시형태에서, rBV 게놈은 AcMNPV 클론 C6으로부터 유래된다.
rBV 벡터의 제1 집단은 외인성 관심 유전자(GOI) 및 관련 조절 서열들을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rBV 게놈을 포함할 수 있다. 이 rBV는 “rBV GOI”로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, rBV 게놈은 다음을 포함하는 발현 카세트를 포함한다: (1) 외인성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, (2) 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 (3) 외인성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드. 발현 카세트에는 두 개의 AAV ITR이 측접한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 ITR은 AAV2 ITR(예를 들어, 야생형 AAV2 ITR(서열 번호 5))이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 ITR은 야생형 AAV2 ITR로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, GOI는 인간 GCase, 인간 PGRN, 인간 PSAP, 인간 C9orf72, 인간 TREM2, 인간 ApoE2 또는 인간 파킨을 인코딩하는 유전자이다. 일부 실시형태에서, 억제성 RNA는 인간 α-시누클레인, 인간 ATXN2, 인간 MAPT 또는 인간 ApoE를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, rBV 게놈은 인간 GCase(예를 들어, 서열 번호 2)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 α-시누클레인을 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 12)를 포함한다. 일부 실시형태에서, rBV 게놈은 인간 C9orf72(즉, 기능적 C9orf72)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 C9orf72를 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rBV 게놈은 인간 ApoE2(즉, 기능적 ApoE2)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 ApoE2를 표적으로 하는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. rBV 게놈에 포함시키기에 적합한 폴리뉴클레오티드 서열들의 예는 WO2019/070891, WO2019/070893, WO2019/070894, 및 WO2019/084068에 개시되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 양상들에서, 본원에 개시된 방법에 사용된 rBV 게놈은 GCase를 인코딩하는 인간 GBA1 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, GCase-인코딩 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되었다(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다). 일부 실시형태에서, GCase-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 아미노산 서열(예를 들어, NCBI 참조 서열 NP_000148.2)을 포함하는 단백질을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, GCase-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2의 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, 본원에 개시된 방법에 사용된 rBV 게놈은 인간 GBA1 유전자를 포함하고 소 성장 호르몬 폴리A 신호 꼬리(bGH), WPRE, 닭 베타 액틴 프로모터(CBAp), 거대세포바이러스 인핸서(CMVe), 인공 인트론 또는 인공 엑손, 또는 이러한 서열들의 조합을 추가로 포함한다.
일부 양상들에서, 본원에 개시된 방법에 사용된 rBV 게놈은 PGRN을 인코딩하는 인간 PGRN 유전자(GRN 유전자로도 알려짐)를 포함한다. 일부 실시형태에서, PGRN-인코딩 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되었다(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다). 일부 실시형태에서, PGRN-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3의 아미노산 서열(예를 들어, NCBI 참조 서열 NP_002078.1)을 포함하는 단백질을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, PGRN-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 4의 서열을 포함한다.
추가로 관심 외인성 유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 배큘로바이러스가 본원에 제공되며, 이 때 외인성 관심 유전자는 인간 글루코세레브로시다제 단백질을 인코딩하고; 이 때 인간 글루코세레브로시다제 단백질은 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 또한 관심 외인성 유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 배큘로바이러스가 본원에 제공되며, 이 때 외인성 관심 유전자는 인간 프로그래눌린 단백질을 인코딩하고; 이 때 인간 프로그래눌린 단백질은 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 본원에 개시된 재조합 배큘로바이러스에 의해 감염된 곤충 세포가 본원에 추가로 제공된다.
rBV 벡터의 하나 이상의 추가 집단은 각각 AAV Rep 단백질 및/또는 AAV Cap 단백질을 인코딩하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. AAV Rep 발현 카세트는 AAV 복제효소를 발현한다. AAV Cap 발현 카세트는 캡시드 단백질이라고도 지칭되는 AAV 바이러스 구조 단백질(VP1, VP2, VP3)을 발현한다. 일부 실시형태에서, AAV Cap 발현 카세트는 AAV9 구조 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, AAV Cap 발현 카세트는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV10 또는 AAV11 구조 단백질, 또는 이들 구조 단백질 중 어느 하나의 변이체를 발현한다.
재조합 아데노 연관 바이러스를 포함하는 조성물의 생산 방법
일부 양상들에서, rAAV를 포함하는 조성물을 생산하기 위해 본원에 개시된 방법은 업스트림 공정 및 다운스트림 공정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 업스트림 공정은 곤충 세포 확장, rBV 종자 스톡 생성, 곤충 세포를 2개의 rBV로 공동 감염, 감염된 세포 용해, 용해물의 정화 및 접선 유동 여과(TFF1) 농축 및 정용여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다운스트림 공정은 AAV 친화성 정제, 크로마토그래피, 접선 유동 여과(TFF2) 및 멸균 여과를 포함한다.
본원은 세포 용해물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (i) 2개 이상의 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 세포 배양 배지를 포함하는 혼합물에 현탁된 곤충 세포를 함유하는 생물반응기를 얻는 단계; (ii) 곤충 세포를 배큘로바이러스 벡터의 제1 집단으로 약 1.0 내지 2.0의 감염 다중도(MOI)로 감염시키는 단계 (이 때 배큘로바이러스 벡터의 제1 집단은 관심 유전자 산물을 인코딩하는 발현 카세트를 포함함); (iii) 곤충 세포를 배큘로바이러스 벡터의 하나 이상의 추가 집단으로 약 1.0 내지 2.0의 MOI로 감염시키는 단계 (이 때 추가 집단은 각각 AAV Rep 단백질 및/또는 AAV Cap 단백질을 인코딩하는 발현 카세트를 포함함); (iv) 감염된 곤충 세포가 관심 유전자를 인코딩하는 rAAV 입자를 생산하는 조건 하에서 감염된 곤충 세포를 배양하는 단계; 및 (v) 감염된 곤충 세포를 용해시켜 rAAV 입자를 포함하는 세포 용해물을 생산하는 단계.
일부 실시형태들에서, 2개 이상의 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 배양 배지는 4셀 곤충 CD 배지, ESF-921, ESF-AF, ExpiSf CD 배지, Express Five SFM, baculoGROW, IS SF, 및 SF900 II SFM으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 약 10% v/v 내지 약 50% v/v의 SF900 II SFM 배지를 포함한다.
일부 실시형태에서, 곤충 세포는 마스터 씨드 트레인의 4-6회 계대 후에 얻어진다. 일부 실시형태에서, 단계 (ii)의 감염 및 단계 (iii)의 감염은 동시에 발생한다.
일부 실시형태에서, 곤충 세포는 mL당 8E+06 생존 세포(vc/mL) 내지 약 20E+06 vc/mL의 세포 밀도로 생물반응기에 존재한다.
일부 실시형태에서, 단계 (iv)의 배양은 1일 내지 5일 동안 일어난다.
일부 실시형태에서, 단계 (v)의 용해는 감염된 곤충 세포를 세제와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 용해물을 생산하는 방법은 심층 여과에 의해 세포 용해물을 정화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 용해물을 생산하는 방법은 용해물에서 rAAV 입자를 접선 유동 여과 및/또는 정용여과에 의해 농축시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 용해물은 (a) 밀리리터당 약 1E+11 바이러스 게놈(vg/mL) 내지 약 1.0E+13 vg/mL; (b) 약 2E+11 vg/mL 내지 약 1.0E+13 vg/mL; 또는 (c) 약 5E+11 vg/mL 내지 약 1.0E+13 vg/mL을 포함한다.
추가로 본원은 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: (i) rAAV 입자를 포함하는 세포 용해물을 얻는 단계; (ii) 친화성 크로마토그래피 컬럼을 세포 용해물과 접촉시키는 단계(이 때, 친화성 컬럼은 rAAV 입자가 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하는 조건 하에서 rAAV 입자의 캡시드 단백질에 특이적인 결합제를 포함함); (iii) 결합된 rAAV 입자를 컬럼으로부터 용출하여 1차 용출액을 생산하는 단계; (iv) 1차 용출액에 대해 음이온-교환 크로마토그래피를 수행하여 2차 용출액을 생산하는 단계(이 때, 2차 용출액은 1차 용출액보다 더 적은 수의 빈 rAAV 입자를 포함함); (v) 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188을 포함하는 유동 완충액을 사용하여 접선 유동 여과를 수행하여 2차 용출액을 농축함으로써 rAAV 입자를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 단계.
일부 실시형태에서, 결합제는 AAV9 캡시드 단백질에 특이적인 친화성 수지를 포함한다.
일부 실시형태에서, 음이온-교환 크로마토그래피는 1차 용출액을 평형화 완충액과 혼합하여 약 0.5 mS/cm 내지 5 mS/cm의 전도도를 갖는 혼합물을 생산하는 단계(선택적으로 이 때 혼합물은 2 mS/cm의 전도도를 가짐), 혼합물을 4차 아민-함유 수지에 결합시켜 혼합물 내의 rAAV 입자를 수지에 결합시키는 단계, 그리고 rAAV 입자를 수지로부터 용출시켜 2차 용출액을 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 2차 용출액은 약 1.0E+12 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL로 농축된다. 일부 실시형태에서, 2차 용출액은 약 1.0E+13 vg/mL 내지 약 5E+13 vg/mL로 농축된다.
일부 실시형태에서, 재조합 아데노 연관 바이러스를 포함하는 조성물은 실시예 2에 기재된 방법에 의해 생산된다(하기 참조).
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 조성물(예를 들어, 벌크 원제 의약품)은 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상의 완전 rAAV 입자를 포함한다. 일부 양상들에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 조성물은 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함한다. 빈 AAV 입자 및 완전 AAV 입자에 대한 분석 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Grimm 외, (1999) Gene Therapy6:1322-1330; Sommer 외, (2003) Mol. Ther. 7:122-128를 참조하라.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, AAV Cap 발현 카세트는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 구조 단백질, 또는 이러한 구조 단백질의 변이체를 발현한다. AAV9는 US 7,198,951 및 Gao el al. (2004) J. Virol. 78:6381-6388에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 관심 외인성 유전자는 인간 GBA1 또는 인간 PGRN이다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 관심 유전자는 인간 글루코세레브로시다제 단백질 또는 인간 프로그래눌린 단백질을 인코딩한다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 인간 글루코세레브로시다제 단백질은 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 인간 프로그래눌린 단백질은 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 외인성 관심 유전자는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 인코딩한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 관심 외인성 유전자는 인간 PSAP, 인간 C9orf72, 인간 TREM2, 인간 ApoE2 또는 인간 파킨이다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 관심 외인성 유전자는 억제성 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 억제성 RNA는 인간 α-시누클레인, 인간 ATXN2, 인간 MAPT 또는 인간 ApoE를 표적으로 한다. 본원에 개시된 방법들에 사용시키기에 적합한 폴리뉴클레오티드 서열들의 예는 WO2019/070891, WO2019/070893, WO2019/070894, 및 WO2019/084068에 개시되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 임의의 방법에 의해 생산된 조성물이 본원에 추가로 제공된다.
재조합 아데노 연관 바이러스를 포함하는 조성물에 대한 공정 및 방출 테스트
본원에 기재된 방법에 의해 생산된 rAAV 조성물, 뿐만 아니라 이러한 방법의 중간 단계 동안 생산된 물질은 안전성, 동일성, 역가, 순도, 불순물, 물리화학적 특성, 생물학적 특성 및 추출가능 부피(용기의 부피) 중 하나 이상에 대해 테스트될 수 있다.
안전성을 평가하는 테스트에는: 무균(미국 약전(USP) <71>), 정균작용/정진균작용(USP <71>), 엔도톡신, 마이코플라스마(USP <63>), 체외 외래성 바이러스, 바이러스 오염 물질에 대한 생체 내 분석, rcAAV 및 용기 마개가 포함될 수 있다.
동일성을 평가하는 테스트에는: 특정 AAV 혈청형 캡시드 단백질에 대한 ELISA, rAAV 분석을 위한 웨스턴 블롯 분석 및 외인성 관심 유전자(트랜스진) 서열에 대한 DNA 단리가 포함될 수 있다.
역가를 평가하는 테스트에는: 물리적 역가(qPCR), 감염 역가, TCID50 및 물리적 역가:감염 역가 비율이 포함될 수 있다.
순도 및 불순물을 평가하는 테스트에는: rAAV 분석을 위한 SDS PAGE/은 염색 분석, 트리톤 X-100, ELISA에 의한 벤조나제, qPCR에 의한 배큘로바이러스 오염, TEM(완전/빈의 비율), Sf9 숙주 세포 DNA, Sf9 숙주 세포 단백질 (ELISA) 및 랍도바이러스 검출이 포함될 수 있다.
물리화학적 특성 및 생물학적 특성을 평가하는 테스트에는: 생체활성 이식유전자 발현(역가), cGMP 샘플의 삼투질농도, 품질 관리 샘플의 pH, 외관, 눈에 보이지 않는 미립자 물질(USP<787>), 동적 광 산란 및 총 단백질(마이크로 BCA)이 포함될 수 있다.
qPCR을 사용하여 GCase를 인코딩하는 rAAV(예를 들어, AAV9)의 역가를 측정하는 분석법이 본원에서 제공된다(실시예 11 참조). 오염 물질(예를 들어, 캡슐화되지 않은 DNA)은 분석 중에 제거된다. 초기 단계에서, DNase는 캡슐화되지 않은 DNA를 제거하는 데 사용된다. 그런 다음, qPCR을 수행하기 전에 프로테이나제를 추가하여 AAV 캡시드를 방출시킨다. 분석은 AAV9-GBA1 특이적 프라이머 및 프로브(정방향 프라이머, GAC TGT GGG ATC CGT TCG AA(서열 번호 6); 역방향 프라이머, GAT TGA CAC CCG GCT CAG A(서열 번호 7); TaqMan 프로브, 6FAM-CCA TGG AAT TCA GCA GCC CCA GC(서열 번호 8)-TAMRA)를 사용하여 벡터에서 관심 영역을 증폭시킨 다음 qPCR을 사용하여 정량화한다.
또한 GCase를 인코딩하는 rAAV(예를 들어, AAV9)에 대한 시험관 내 효능을 측정하는 분석법이 본원에 제공된다(실시예 12 참조). 분석은 96-웰 형식으로 수행된다. HEK293 세포를 웰당 20,000개 세포로 플레이팅하고 다음날 테스트 항목 및 참조 표준 모두에 대해 상이한 농도의 AAV9-GBA1을 형질도입한다. 일부 실시형태들에서, 참조 표준은 효능이 기존에 결정되어 있는 GCase를 인코딩하는 정제된 rAAV이다. 세포는 형질도입 후 72시간에 용해된다. GCase 활성은 형광원성 기질 레조루핀-β-D-글루코피라노사이드를 사용하여 이러한 용해물에서 평가된다. GCase 존재 시, 이 기질은 촉매화되어 형광 산물인 레조루핀을 형성한다. 산물 형성 속도를 계산하기 위해 반응이 진행됨에 따라 레조루핀 생산을 직접 모니터링한다. 과량의 레조루핀-β-D-글루코피라노사이드 기질(5.3mM)의 존재 및 분석 조건 하에서, 산물 형성 속도는 GCase 단백질의 양에 선형으로 비례한다. 각각의 GCase 활성 분석을 위해, 정제된 재조합 GCase(rGBA, 0 내지 333 ng/ml, R&D 카탈로그 번호 7410-GHB-020, >95% 순도)의 표준 곡선을 테스트 샘플과 병행하여 실행시킨다. 이 곡선의 선형 회귀에 대한 분석 허용 기준 R2 ≥ 0.96은 측정된 효소 속도가 GCase 단백질 수준과 상관되도록 설정된다. 참조 표준에 대한 상대 효능 보고값은 평행선 분석을 사용하여 계산된다.
또한 qPCR 또는 ddPCR을 사용하여 PGRN을 인코딩하는 rAAV(예를 들어, AAV9)의 역가를 측정하는 분석이 본원에 제공된다(실시예 13 참조). 오염 물질(예를 들어, 캡슐화되지 않은 DNA)은 분석 중에 제거된다. 초기 단계에서, DNase는 캡슐화되지 않은 DNA를 제거하는 데 사용된다. 그런 다음 프로테이나제를 추가하여 AAV 캡시드를 방출시킨 후 qPCR 또는 dd PCR을 수행한다. 분석은 AAV9-GRN 특이적 프라이머 및 프로브(정방향 프라이머, 5'-GTCTTCCACGACTGTGGGAT-3'(서열 번호: 9); 역방향 프라이머, 5'-GTCAGGGCCACCCAGCTC-3'(서열 번호: 10); TaqMan 프로브, 5'-FAM-CCGGTTGAGCCACCATGTGGACCC (서열 번호 11)-TAMRA-3') 를 사용하여 벡터 내 관심 영역을 증폭시킨 다음, qPCR 또는 ddPCR을 사용하여 정량화한다.
PGRN을 인코딩하는 rAAV(예를 들어 AAV9)에 대한 시험관 내 효능을 측정하는 분석이 추가로 본원에 제공된다. 분석은 96-웰 형식으로 수행된다. HEK293 세포를 웰당 20,000개 세포로 플레이팅하고 다음날 테스트 항목 및 참조 표준 모두에 대해 상이한 약물 농도의 AAV9-GRN을 형질도입한다. 형질도입 후 72시간에, PGRN 수준을 ELISA(AdipoGen Life Sciences 카탈로그 번호 AG-45A-0018YEK-KI01)로 측정한다. 참조 표준에 대한 상대 효능 보고값은 평행선 분석을 사용하여 계산된다.
모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 그 전문이 참조 문헌으로 인용된다.
하기 실시예는 본원에 기재되고 청구범위에 기재된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 제조되고 평가되고 의도되는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된다. 순전히 예시적인 것으로 발명자가 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
곤충 세포를 해동하고 1차 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 세포 배양 배지(예를 들어, 4셀 곤충 CD 배지, ESF-921, ESF AF, ExpiSf CD 배지, Express Five SFM, baculoGROW, IS SF 및 SF900 II SFM)에, 3.0E+05개 초과의 눈에 보이는 세포/ml(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 만든다. 씨드 배양물의 세포는 4-6계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩된다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 1차 곤충 세포 배지와 약 4.0E+05 내지 6.0E+05 세포/ml의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 5.5E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 90% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮기고, 약 5.0E+05 내지 1.5E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 1차 곤충 세포 배지와 혼합한다. N-1 배양물은 또한 0.1%-0.3%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 포함한다. N-1 배양 용기의 총 부피를 1차 곤충 배양 배지를 더 추가하여 50L가 되게 한다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 72시간 동안 배양되어 5.5E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하였으며, 생존 세포는 90% 이상이었다.
rBV 감염을 준비함에 있어서, N-1 배양물을 2차 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 세포 배양 배지(예를 들어, 4셀 곤충 CD 배지, ESF-921, ESF AF, ExpiSf CD 배지, Express Five SFM, baculoGROW, IS SF 및 SF900 II SFM)와 혼합하고, 소포제와 0.1%-0.3%(v/v) 폴록사머-188 용액으로 보충한다. 1차 곤충 세포 배지를 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물의 1차 곤충 세포 배지의 비율은 약 30%에서 70% 사이이다. 시작 세포 밀도는 약 1.00E+06과 2.00E+06 vc/mL 사이이다. 1.00E+07에서 2.00E+07 vc/mL 사이의 세포 밀도에 도달하도록 세포를 96시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 1 감염 단위(IFU)/세포 내지 2 IFU/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L이다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 중 1차 곤충 세포 배지의 백분율이 10% 내지 50%(v/v)가 되도록 2차 곤충 세포 배지를 사용하여 배양물의 총 부피를 조정한다. 감염 후 15시간 내지 25시간 사이에, 배양물에 약 3% 내지 8%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(Production Boost Additive, PBA)가 보충된다. 감염 후 약 72 내지 120시간 후에 세포를 수확한다.
수확을 위해, 곤충 세포를 약 0.2% 내지 0.8%(w/v)의 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시킨다. 세포는 약 30분 내지 약 90분 동안 용해 완충액에서 배양된다. 세포 용해물은 약 45분 내지 75분 동안 약 1.5 내지 2.5 mM MgCl2의 존재 하에 약 42 IU/mL 내지 60 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리된다. 반응은 약 100mM 내지 300mM의 NaCl에 의해 퀀칭된다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함한다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거친다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 12-20L/분의 세척(flushing) 유속에서 1.1m2 표면적(POD DOHC), 및 최대 압력 8-14psi를 사용하는 심층 여과로 수행된다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 8-15L/분의 세척 유속에서 0.11m2 표면적(POD A1HC), 및 8-14psi의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화된다. 이어서, 1차 곤충 배양 배지를 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적하여, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 75% 내지 95%를 산출시킨다. 세포 용해물은 TFF에 의해 농축된다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.1% 플루로닉을 포함하며 pH는 약 7.5 내지 8.5이다. DF 완충액 세척 단계는 3-8의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 60% 내지 약 80%이다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시킨다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 80% 내지 98%이다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물을 해동시켜 바이오버든에 대해 테스트한다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시킨다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시킨다. 여과는 최대 압력 14.00psi에서 유속 750mL/분으로 수행된다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척된다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행된다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용된다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 2.00E+13 내지 9.00E+13 vg/mL의 로딩 용량을 갖는다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 1.00E+13 내지 약 1.00E+14 vg/mL이다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.06-0.12M 인산으로 산을 제거한다. 그런 다음 컬럼을 80-120mM 트리스 및 1.8-2.2M NaCl을 사용하여 재생시킨다. 재생 후, 컬럼을 약 0.8-1.5mM 시트르산, 12-22mM 인산염, 300-400mM NaCl, 0.2%-0.8% 수크로스, 0.06% 내지 0.2% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 평형화 시킨 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고 컬럼을 로딩 후 다시 평형화시킨다. 고 염(high salt) 세척은 약 0.8-1.5mM 시트르산, 12-22mM 인산염, 800-1500mM NaCl, 0.2%-0.8% 수크로스, 0.06% 내지 0.2% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 pH 2.2 내지 2.8에서 10-18mM 시트르산, 300-400mM NaCl, 0.2%-0.8% 수크로스, 0.06% 내지 0.2% F-68을 함유한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 30 mAU 이상의 용출 피크에서 시작된다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생된다. 4-9M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 45 내지 70cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 컬럼을 45-70cm/h의 선형 유속으로 1mM 시트르산, 18mM 인산염, 20% 에탄올을 함유하는 주입 및 보관 완충액으로 세척한다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 120 내지 180cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩된다. 이어서 용출된 분획을 pH 8.2 내지 9.5에서 0.25-0.6M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시킨다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 6.8-8이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과하고, 12-22mM 비스-트리스 프로판, pH 9.0-9.5의 0.001% 내지 0.01% F-68 및 0.5 내지 3mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시킨다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/ml이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비한다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 0.8-1.5M NaOH 및 1.5-2.2M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 16-24mM 비스-트리스 프로판, 0.8-1.5M NaCl, 0.001% 내지 0.01% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 12-22mM 비스-트리스 프로판, 0.001% 내지 0.01% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형을 이루면 샘플은 약 9.0 내지 9.5의 로딩 pH, 및 0.5 내지 3 mS/cm의 로딩 전도도로 컬럼에 로딩된다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척된다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출된다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 A280에서 약 3mAU 이상의 용출 피크에서 시작하여 약 20mAU 미만의 용출 피크에서 끝난다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 5.8 내지 6.8 pH의 0.2-1M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화된다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 1.2L/분 내지 2.5L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩된다.
중화 후, 샘플은 약 1.0E+17 내지 2.0E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 유동 여과 및 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관된다. BDS 스톡은 약 2.5E+13 내지 4.5E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하며, 1E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과된다.
실시예 2
곤충 세포를 해동시키고 SF900 II SFM에 3.0E+05 이상의 생존 세포/ml(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 설정하였다. 씨드 배양물의 세포는 5계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩되었다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 SF900 II SFM과 약 5.0E+05 세포/ml의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 5.5E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 90% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮겨 SF-900 II SFM과 약 1.0E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 혼합하였다. N-1 배양물은 또한 0.1%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 함유하였다. SF900 II SFM을 더 추가하여 N-1 배양 용기의 총 부피를 50L가 되게 하였다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 5.5E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하도록 72시간 동안 배양되었으며, 생존 세포는 90% 초과였다.
rBV 감염을 위한 준비에 있어서, N-1 배양액을 ESF AF 배지와 혼합하고 소포제와 0.1%(v/v) 폴록사머-188 용액을 보충했다. SF900 II SFM 배지를 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물 내 SF900 II SFM의 비율은 약 60%(v/v)였다. 시작 세포 밀도는 약 1.50E+06였다. 세포를 96시간 동안 배양하여 1.50E+07의 세포 밀도에 도달하였다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 1.5 감염 단위(IFU)/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L였다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 내 SF900 II SFM의 백분율이 40%(v/v)가 되도록 ESF AF 배지를 사용하여 배양물의 총 부피를 조정하였다. 감염 약 20시간 후, 배양물을 약 5%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(PBA)로 보충하였다. 감염 후 약 72시간 후에 세포를 수확하였다.
수확 시, 곤충 세포를 0.5%(w/v) 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시켰다. 세포를 용해 완충액에서 약 60분 동안 배양하였다. 세포 용해물을 약 2 mM MgCl2의 존재 하에 약 60분 동안 약 50 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리하였다. 반응을 약 240mM의 NaCl로 퀀칭하였다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함하였다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거쳤다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 18L/분의 세척(flushing) 유속에서 6 x 1.1 m2 표면적(POD DOHC), 및 14psi 미만의 최대 압력을 사용하는 심층 여과로 수행되었다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 11L/분의 세척 유속에서 3 x 1.1 m2 표면적(POD A1HC), 및 14psi 미만의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화되었다. 이어서, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 80%를 산출하는 SF900 II SFM을 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적했다. 세포 용해물은 TFF에 의해 농축되었다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.001% 플루로닉을 포함하며 pH는 8.0이다. DF 완충액 세척 단계는 6의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 90%였다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시켰다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 약 95%였다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시켰다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시켰다. 여과는 최대 압력 14.00psi에서 유속 750mL/분으로 수행되었다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척되었다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행되었다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용되었다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 3.0 내지 9.0E+13 vg/mL의 로딩 용량을 가졌다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 4.2E+17 vg 였다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.1M 인산으로 산을 제거하였다. 그런 다음 컬럼을 100mM 트리스 및 2M NaCl을 사용하여 재생시켰다. 재생 후, 컬럼을 약 1mM 시트르산, 18mM 인산염, 350mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시켰다. 평형화 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고, 로딩 후 다시 친화성 정제 평형 완충액으로 컬럼을 평형화시켰다. 고 염 세척은 약 1mM 시트르산, 18mM 인산염, 1000mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행되었다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시켰다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 14mM 시트르산, 350mM NaCl, 0.5% 수크로스, pH 2.5의 0.1% F-68을 포함한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 50 mAU 이상의 용출 피크에서 시작되었다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생되었다. 6M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 60 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척하였다. 그런 다음 컬럼을 60cm/h의 선형 유속으로 1mM 시트르산, 18mM 인산염, 20% 에탄올을 포함하는 주입 및 보관 완충용 물을 사용하여 세척했다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 150 cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩되었다. 이어서 용출된 분획을 pH 9에서 0.4 M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시켰다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 6.8-8이었다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과시켰고, 20 mM 비스-트리스 프로판, pH 9.2의 0.001% F-68 및 2.1 mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시켰다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/mL이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비하였다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 1 M NaOH 및 2 M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 20 mM 비스-트리스 프로판, 1 M NaCl, 0.001% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 20 mM 비스-트리스 프로판, 0.001% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형화되면, 샘플을 pH가 약 9.3이고 로딩 전도도가 2mS/cm 미만인 CIMQ 완충액과 함께 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척되었다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출되었다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 약 15 mAU의 용출 피크에서 시작되었다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 6.5 pH의 0.5 M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화되었다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 2 L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩되었다.
중화 후, 샘플은 약 1.3E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 TFF 및 한외여과/정용여과에 의해 농축되었다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하였으며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관되었다. BDS 스톡은 약 4.0E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하였으며, 3.0E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과되었다.
실시예 3
곤충 세포를 해동시키고 4셀 곤충 CD 배지에 3.0E+05 이상의 생존 세포/mL(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 설정하였다. 씨드 배양물의 세포는 3계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩된다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 4셀 곤충 CD 배지와 약 3.0E+05 세포/mL의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 5.5E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 85% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮겨 4셀 곤충 CD 배지와 약 1.0E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 혼합하였다. N-1 배양물은 또한 9%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 함유하였다. N-1 배양 용기의 총 부피를 4셀 곤충 CD 배지를 더 추가하여 최대 50L가 되게 한다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 72시간 동안 배양되어 5.5E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하였으며, 생존 세포는 85% 이상이었다.
rBV 감염을 위한 준비에 있어서, N-1 배양액을 ExpiSf CD 배지와 혼합하고 소포제와 9%(v/v) 폴록사머-188 용액을 보충했다. 4셀 곤충 CD 배지를 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물 내 4셀 곤충 CD 배지의 비율은 약 45%(v/v)이다. 시작 세포 밀도는 약 1.20E+06이다. 1.20E+07의 세포 밀도에 도달하도록 세포를 96시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 1 감염 단위(IFU)/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L이다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 중 4셀 곤충 CD 배지의 백분율이 40%(v/v)가 되도록 ExpiSf CD 배지를 사용하여 배양물의 총 부피를 조정한다. 감염 약 25시간 후, 배양물을 약 5%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(PBA)로 보충한다. 감염 후 약 96 시간 후에 세포를 수확한다.
수확 시, 곤충 세포를 0.5%(w/v) 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시킨다. 세포는 약 60분 동안 용해 완충액에서 배양된다. 세포 용해물은 약 60분 동안 약 2.5 mM MgCl2의 존재 하에 약 30 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리된다. 반응은 약 300mM의 NaCl에 의해 퀀칭된다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함한다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거친다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 12L/분의 세척(flushing) 유속에서 1.1 m2 표면적(POD DOHC), 및 12psi 미만의 최대 압력을 사용하여 심층 여과로 수행된다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 9L/분의 세척 유속에서 0.11m2 표면적(POD A1HC), 및 12psi 미만의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화된다. 이어서, 4셀 곤충 CD 배지를 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적하여, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 85%를 산출시킨다. 세포 용해물은 TFF에 의해 농축된다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.001% 플루로닉을 포함하며 pH는 8.5이다. DF 완충액 세척 단계는 5의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 80%이다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시킨다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 약 90%이다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시킨다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시킨다. 여과는 최대 압력 12.00psi에서 유속 780mL/분으로 수행된다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척된다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행된다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용된다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 3.0E+13 vg/mL의 로딩 용량을 갖는다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 1.20E+17이다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.1M 인산으로 산을 제거한다. 그런 다음 컬럼을 85mM 트리스 및 2M NaCl을 사용하여 재생시킨다. 재생 후, 컬럼을 약 1.2 mM 시트르산, 15 mM 인산염, 300 mM NaCl, 0.2% 수크로스, 0.08% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 평형화 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고, 로딩 후 다시 친화성 정제 평형 완충액으로 컬럼을 평형화시킨다. 고 염 세척은 약 1.2mM 시트르산, 15mM 인산염, 800mM NaCl, 0.2% 수크로스, 0.08% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 10 mM 시트르산, 300mM NaCl, 0.2% 수크로스, pH 2.2의 0.08% F-68을 포함한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 30 mAU 이상의 용출 피크에서 시작된다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생된다. 4M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 60 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 컬럼을 60cm/h의 선형 유속으로 1.2 mM 시트르산, 15 mM 인산염, 20% 에탄올을 포함하는 주입 및 보관 완충용 물을 사용하여 세척한다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 120 cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩된다. 이어서 용출된 분획을 pH 8.8에서 0.25M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시킨다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 7.5이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과시키고, 12 mM 비스-트리스 프로판, pH 9.0의 0.001% F-68 및 2.5 mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시킨다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/mL이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비한다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 0.8 M NaOH 및 2 M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 16 mM 비스-트리스 프로판, 0.8 M NaCl, 0.0008% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 20 mM 비스-트리스 프로판, 0.001% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형을 이루면 샘플은 약 9.0의 로딩 pH, 및 2.3 mS/cm의 로딩 전도도로 컬럼에 로딩된다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척된다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출된다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 A280에서 약 6 mAU 이상의 용출 피크에서 시작하여 약 20mAU 미만의 용출 피크에서 끝난다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 6.0 pH의 0.4 M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화된다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 1.5L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩된다.
중화 후, 샘플은 약 1.42E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 유동 여과 및 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관된다. BDS 스톡은 약 3.0E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하며, 1.0E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과된다.
실시예 4
곤충 세포를 해동시키고 ESF AF 배지에 3.0E+05 이상의 생존 세포/mL(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 설정하였다. 씨드 배양물의 세포는 4계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩된다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 ESF AF 배지와 약 4.0E+05 세포/mL의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 6.2E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 93% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮겨 ESF AF 배지와 약 1.0E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 혼합하였다. N-1 배양물은 또한 10%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 함유하였다. N-1 배양 용기의 총 부피를 ESF AF 배지를 더 추가하여 최대 50L가 되게 한다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 72시간 동안 배양되어 6E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하였으며, 생존 세포는 90% 이상이었다.
rBV 감염을 위한 준비에 있어서, N-1 배양액을 ExpiSf CD 배지와 혼합하고 소포제와 10%(v/v) 폴록사머-188 용액을 보충했다. ESF AF 배지를 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물 내 ESF AF 배지의 비율은 약 50%(v/v)이다. 시작 세포 밀도는 약 1.80E+06이다. 1.80E+07의 세포 밀도에 도달하도록 세포를 96시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 1.8 감염 단위(IFU)/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L이다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 중 ESF AF 배지의 백분율이 40%(v/v)가 되도록 ExpiSf CD 배지를 사용하여 배양물의 총 부피를 조정한다. 감염 약 25시간 후, 배양물을 약 7%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(PBA)로 보충한다. 감염 후 약 84 시간 후에 세포를 수확한다.
수확 시, 곤충 세포를 0.5%(w/v) 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시킨다. 세포는 약 45분 동안 용해 완충액에서 배양된다. 세포 용해물은 약 60분 동안 약 2.2 mM MgCl2의 존재 하에 약 30 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리된다. 반응은 약 300mM의 NaCl에 의해 퀀칭된다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함한다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거친다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 14L/분의 세척(flushing) 유속에서 1.1 m2 표면적(POD DOHC), 및 약 10psi의 최대 압력을 사용하는 심층 여과로 수행된다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 10L/분의 세척 유속 0.11m2 표면적(POD A1HC), 및 약 10psi의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화된다. 이어서, ESF AF 배지를 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적하여, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 85%를 산출시킨다. 세포 용해물은 TFF에 의해 농축된다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.001% 플루로닉을 포함하며 pH는 8.0이다. DF 완충액 세척 단계는 5의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 80%이다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시킨다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 약 95%이다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시킨다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시킨다. 여과는 약 10.00psi에서 유속 780mL/분으로 수행된다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척된다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행된다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용된다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 3.2E+13 vg/mL의 로딩 용량을 갖는다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 1.50E+17이다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.08M 인산으로 산을 제거한다. 그런 다음 컬럼을 85mM 트리스 및 1.8M NaCl을 사용하여 재생시킨다. 재생 후, 컬럼을 약 1.2 mM 시트르산, 18 mM 인산염, 380 mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.08% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 평형화 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고, 로딩 후 다시 친화성 정제 평형 완충액으로 컬럼을 평형화시킨다. 고 염 세척은 약 1.2mM 시트르산, 18mM 인산염, 800mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.08% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 15 mM 시트르산, 380mM NaCl, 0.5% 수크로스, pH 2.5의 0.08% F-68을 포함한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 60 mAU 이상의 용출 피크에서 시작된다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생된다. 6M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 45 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 컬럼을 60cm/h의 선형 유속으로 1.2 mM 시트르산, 18 mM 인산염, 20% 에탄올을 포함하는 주입 및 보관 완충용 물을 사용하여 세척한다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 150 cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩된다. 이어서 용출된 분획을 pH 8.8에서 0.4M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시킨다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 7.2이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과시키고, 18 mM 비스-트리스 프로판, pH 9.0의 0.001% F-68 및 1.8 mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시킨다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/mL이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비한다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 0.8 M NaOH 및 2 M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 18 mM 비스-트리스 프로판, 1 M NaCl, 0.001% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 18 mM 비스-트리스 프로판, 0.001% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형을 이루면 샘플은 약 9.0의 로딩 pH, 및 2.1 mS/cm의 로딩 전도도로 컬럼에 로딩된다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척된다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출된다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 A280에서 약 4 mAU 이상의 용출 피크에서 시작하여 약 15mAU 미만의 용출 피크에서 끝난다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 6.0 pH의 0.6 M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화된다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 2L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩된다.
중화 후, 샘플은 약 1.42E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 유동 여과 및 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관되었다. BDS 스톡은 약 3.0E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하며, 1.0E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과된다.
실시예 5
곤충 세포를 해동시키고 Express Five SFM에 3.0E+05 이상의 생존 세포/mL(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 설정하였다. 씨드 배양물의 세포는 5계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩된다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 Express Five SFM과 약 5.0E+05 세포/mL의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 6E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 90% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮겨 Express Five SFM과 약 1.2E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 혼합하였다. N-1 배양물은 또한 12%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 함유하였다. N-1 배양 용기의 총 부피를 Express Five SFM을 더 추가하여 최대 50L가 되게 한다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 72시간 동안 배양되어 6E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하였으며, 생존 세포는 90% 이상이었다.
rBV 감염을 위한 준비에 있어서, N-1 배양액을 IS SF 배지와 혼합하고 소포제와 12%(v/v) 폴록사머-188 용액을 보충했다. Express Five SFM을 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물 내 Express Five SFM의 비율은 약 50%(v/v)이다. 시작 세포 밀도는 약 1.50E+06이다. 1.80E+07의 세포 밀도에 도달하도록 세포를 96시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 1.5 감염 단위(IFU)/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L이다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 중 Express Five SFM의 백분율이 40%(v/v)가 되도록 IS SF 배지를 사용하여 배양물의 총 부피를 조정한다. 감염 약 48시간 후, 배양물을 약 5%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(PBA)로 보충한다. 감염 후 약 72 시간 후에 세포를 수확한다.
수확 시, 곤충 세포를 0.8%(w/v) 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시킨다. 세포는 약 60분 동안 용해 완충액에서 배양된다. 세포 용해물은 약 60분 동안 약 2.2 mM MgCl2의 존재 하에 약 45 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리된다. 반응은 약 300mM의 NaCl에 의해 퀀칭된다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함한다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거친다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 13L/분의 세척(flushing) 유속에서 1.1 m2 표면적(POD DOHC), 및 약 14psi의 최대 압력을 사용하여 심층 여과로 수행된다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 11L/분의 세척 유속에서 0.11 m2 표면적(POD A1HC), 및 약 14psi의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화된다. 이어서, Express Five SFM을 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적하여, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 85%를 산출시킨다. 세포 용해물은 TFF에 의해 농축된다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.001% 플루로닉을 포함하며 pH는 8.5이다. DF 완충액 세척 단계는 4의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 90%이다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시킨다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 약 95%이다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시킨다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시킨다. 여과는 약 14.00psi에서 유속 700mL/분으로 수행된다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척된다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행된다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용된다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 3.4E+13 vg/mL의 로딩 용량을 갖는다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 1.50E+17이다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.08M 인산으로 산을 제거한다. 그런 다음 컬럼을 120mM 트리스 및 2.2M NaCl을 사용하여 재생시킨다. 재생 후, 컬럼을 약 1.2 mM 시트르산, 15 mM 인산염, 300 mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 평형화 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고, 로딩 후 다시 친화성 정제 평형 완충액으로 컬럼을 평형화시킨다. 고 염 세척은 약 1.2mM 시트르산, 15mM 인산염, 800mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 18 mM 시트르산, 300mM NaCl, 0.5% 수크로스, pH 2.6의 0.1% F-68을 포함한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 60 mAU 이상의 용출 피크에서 시작된다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생된다. 5M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 55 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 1.2 mM 시트르산, 15 mM 인산염, 20% 에탄올을 포함하는 주입 및 보관 완충용 물을 사용하여 55cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 175 cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩된다. 이어서 용출된 분획을 pH 8.5에서 0.6M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시킨다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 7이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과시키고, 20 mM 비스-트리스 프로판, pH 9.3의 0.0012% F-68 및 2.5 mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시킨다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/mL이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비한다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 1 M NaOH 및 1.5 M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 20 mM 비스-트리스 프로판, 0.8 M NaCl, 0.001% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 20 mM 비스-트리스 프로판, 0.001% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형을 이루면 샘플은 약 9.3의 로딩 pH, 및 1.8 mS/cm의 로딩 전도도로 컬럼에 로딩된다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척된다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출된다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 A280에서 약 5 mAU 이상의 용출 피크에서 시작하여 약 20mAU 미만의 용출 피크에서 끝난다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 6.5 pH의 1 M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화된다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 1.5L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩된다.
중화 후, 샘플은 약 1.37E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 TFF 및 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관된다. BDS 스톡은 약 1E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하며, 1.0E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과된다.
실시예 6
곤충 세포를 해동시키고 Express Five SFM에 3.0E+05 이상의 생존 세포/mL(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 설정하였다. 씨드 배양물의 세포는 6계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩된다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 Express Five SFM과 약 4.0E+05 세포/mL의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 5.5E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 90% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮겨 Express Five SFM과 약 1.5E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 혼합하였다. N-1 배양물은 또한 10%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 함유하였다. N-1 배양 용기의 총 부피를 Express Five SFM을 더 추가하여 최대 50L가 되게 한다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 72시간 동안 배양되어 6E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하였으며, 생존 세포는 90% 이상이었다.
rBV 감염을 위한 준비에 있어서, N-1 배양액을 SF900 II SFM과 혼합하고 소포제와 10%(v/v) 폴록사머-188 용액을 보충했다. Express Five SFM을 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물 내 Express Five SFM의 비율은 약 50%(v/v)였다. 시작 세포 밀도는 약 2E+06이다. 2E+07의 세포 밀도에 도달하도록 세포를 96시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 1 감염 단위(IFU)/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L이다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 중 Express Five SFM의 백분율이 40%(v/v)가 되도록 SF900 II SFM을 사용하여 배양물의 총 부피를 조정한다. 감염 약 36시간 후, 배양물을 약 8%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(PBA)로 보충한다. 감염 후 약 72 시간 후에 세포를 수확한다.
수확 시, 곤충 세포를 0.5%(w/v) 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시킨다. 세포는 약 75분 동안 용해 완충액에서 배양된다. 세포 용해물은 약 60분 동안 약 2 mM MgCl2의 존재 하에 약 60 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리된다. 반응은 약 200mM의 NaCl에 의해 퀀칭된다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함한다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거친다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 12L/분의 세척(flushing) 유속에서 1.1 m2 표면적(POD DOHC), 및 약 11psi의 최대 압력을 사용하는 심층 여과로 수행된다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 11L/분의 세척 유속에서 0.11m2 표면적(POD A1HC), 및 약 11psi의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화된다. 이어서, Express Five SFM을 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적하여, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 80%를 산출시킨다. 세포 용해물은 TFF에 의해 농축된다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.001% 플루로닉을 포함하며 pH는 8.0이다. DF 완충액 세척 단계는 6의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 90%이다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시킨다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 약 95%이다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시킨다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시킨다. 여과는 약 11.00psi에서 유속 720mL/분으로 수행된다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척된다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행된다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용된다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 4E+13 vg/mL의 로딩 용량을 갖는다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 1.50E+17이다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.12M 인산으로 산을 제거한다. 그런 다음 컬럼을 100mM 트리스 및 1.8M NaCl을 사용하여 재생시킨다. 재생 후, 컬럼을 약 1 mM 시트르산, 20 mM 인산염, 400 mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 평형화 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고, 로딩 후 다시 친화성 정제 평형 완충액으로 컬럼을 평형화시킨다. 고 염 세척은 약 1 mM 시트르산, 20 mM 인산염, 800mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 14 mM 시트르산, 400mM NaCl, 0.5% 수크로스, pH 2.5의 0.1% F-68을 포함한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 40 mAU 이상의 용출 피크에서 시작된다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생된다. 5M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 70 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 1 mM 시트르산, 20 mM 인산염, 20% 에탄올을 포함하는 주입 및 보관 완충용 물을 사용하여 70 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 150 cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩된다. 이어서 용출된 분획을 pH 9.0에서 0.3M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시킨다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 7.5이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과시키고, 12 mM 비스-트리스 프로판, pH 8.8의 0.0012% F-68 및 2 mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시킨다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/mL이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비한다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 1.2 M NaOH 및 1.8 M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 12 mM 비스-트리스 프로판, 1.5 M NaCl, 0.001% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 12 mM 비스-트리스 프로판, 0.0012% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형을 이루면 샘플은 약 8.8의 로딩 pH, 및 2.5 mS/cm의 로딩 전도도로 컬럼에 로딩된다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척된다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출된다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 A280에서 약 5 mAU 이상의 용출 피크에서 시작하여 약 18 mAU 미만의 용출 피크에서 끝난다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 5.8 pH의 0.8 M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화된다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 1.5L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩된다.
중화 후, 샘플은 약 1.4E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 유동 여과 및 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관된다. BDS 스톡은 약 1E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하며, 1.0E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과된다.
실시예 7
곤충 세포를 해동시키고 ESF-921에 3.0E+05 이상의 생존 세포/mL(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 설정하였다. 씨드 배양물의 세포는 4계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩된다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 ESF-921과 약 3.0E+05 세포/mL의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 5.5E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 80% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮겨 ESF-921과 약 1.5E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 혼합하였다. N-1 배양물은 또한 10%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 함유하였다. ESF-921을 더 추가하여 N-1 배양 용기의 총 부피를 50L가 되게 한다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 72시간 동안 배양되어 6.5E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하였으며, 생존 세포는 80% 이상이었다.
rBV 감염을 위한 준비에 있어서, N-1 배양액을 baculoGROW와 혼합하고 소포제와 10%(v/v) 폴록사머-188 용액을 보충했다. ESF-921을 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물 내 ESF-921의 비율은 약 40%(v/v)이다. 시작 세포 밀도는 약 2E+06이다. 1.5E+07의 세포 밀도에 도달하도록 세포를 96시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 2 감염 단위(IFU)/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L이다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 중 ESF-921의 백분율이 40%(v/v)가 되도록 baculoGROW를 사용하여 배양물의 총 부피를 조정한다. 감염 약 24시간 후, 배양물을 약 5%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(PBA)로 보충한다. 감염 후 약 96 시간 후에 세포를 수확한다.
수확 시, 곤충 세포를 0.5%(w/v) 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시킨다. 세포는 약 75분 동안 용해 완충액에서 배양된다. 세포 용해물은 약 60분 동안 약 2 mM MgCl2의 존재 하에 약 60 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리된다. 반응은 약 200mM의 NaCl에 의해 퀀칭된다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함한다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거친다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 12L/분의 세척(flushing) 유속에서 1.1 m2 표면적(POD DOHC), 및 약 14psi의 최대 압력을 사용하는 심층 여과로 수행된다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 12L/분의 세척 유속에서 0.11m2 표면적(POD A1HC), 및 약 14psi의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화된다. 이어서, ESF-921을 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적하여, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 80%를 산출시킨다. 세포 용해물은 TFF에 의해 농축된다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.001% 플루로닉을 포함하며 pH는 8.0이다. DF 완충액 세척 단계는 8의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 80%이다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시킨다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 약 90%이다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시킨다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시켰다. 여과는 약 14.00psi에서 유속 750mL/분으로 수행된다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척된다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행된다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용된다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 3E+13 vg/mL의 로딩 용량을 갖는다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 1.60E+17이다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.12M 인산으로 산을 제거한다. 그런 다음 컬럼을 120mM 트리스 및 1.8M NaCl을 사용하여 재생시킨다. 재생 후, 컬럼을 약 1.2 mM 시트르산, 16 mM 인산염, 350 mM NaCl, 0.4% 수크로스, 0.1% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 평형화 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고, 로딩 후 다시 친화성 정제 평형 완충액으로 컬럼을 평형화시킨다. 고 염 세척은 약 1.2 mM 시트르산, 16 mM 인산염, 1000mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 18 mM 시트르산, 350mM NaCl, 0.4% 수크로스, pH 2.2의 0.1% F-68을 포함한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 50 mAU 이상의 용출 피크에서 시작된다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생된다. 6M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 50 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 1.2 mM 시트르산, 16 mM 인산염, 20% 에탄올을 포함하는 주입 및 보관 완충용 물을 사용하여 50 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 130 cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩된다. 이어서 용출된 분획을 pH 9.5에서 0.3M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시킨다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 7.5이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과시키고, 18 mM 비스-트리스 프로판, pH 9.2의 0.0012% F-68 및 3 mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시킨다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/mL이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비한다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 1 M NaOH 및 1.8 M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 18 mM 비스-트리스 프로판, 1 M NaCl, 0.001% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 18 mM 비스-트리스 프로판, 0.001% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형을 이루면 샘플은 약 9.2의 로딩 pH, 및 3 mS/cm의 로딩 전도도로 컬럼에 로딩된다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척된다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출된다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 A280에서 약 5 mAU 이상의 용출 피크에서 시작하여 약 18 mAU 미만의 용출 피크에서 끝난다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 5.8 pH의 0.8 M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화된다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 1.5L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩된다.
중화 후, 샘플은 약 1.4E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 유동 여과 및 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관된다. BDS 스톡은 약 1E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하며, 1.0E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과된다.
실시예 8
곤충 세포를 해동시키고 baculoGROW에 3.0E+05 이상의 생존 세포/mL(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 설정하였다. 씨드 배양물의 세포는 6계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩된다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 baculoGROW와 약 3.0E+05 세포/mL의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 5.5E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 90% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮겨 baculoGROW와 약 1.5E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 혼합하였다. N-1 배양물은 또한 5%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 함유하였다. N-1 배양 용기의 총 부피를 baculoGROW를 더 추가하여 최대 50L가 되게 한다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 72시간 동안 배양되어 6.5E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하였으며, 생존 세포는 90% 이상이었다.
rBV 감염을 위한 준비에 있어서, N-1 배양액을 ESF AF와 혼합하고 소포제와 5%(v/v) 폴록사머-188 용액을 보충했다. baculoGROW를 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물 내 baculoGROW의 비율은 약 30%(v/v)이다. 시작 세포 밀도는 약 2E+06이다. 1.5E+07의 세포 밀도에 도달하도록 세포를 96시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 1.8 감염 단위(IFU)/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L이다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 중 baculoGROW의 백분율이 40%(v/v)가 되도록 ESF AF를 사용하여 배양물의 총 부피를 조정한다. 감염 약 36시간 후, 배양물을 약 8%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(PBA)로 보충한다. 감염 후 약 120 시간 후에 세포를 수확한다.
수확 시, 곤충 세포를 0.8%(w/v) 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시킨다. 세포는 약 60분 동안 용해 완충액에서 배양된다. 세포 용해물은 약 60분 동안 약 2.5 mM MgCl2의 존재 하에 약 60 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리된다. 반응은 약 280mM의 NaCl에 의해 퀀칭된다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함한다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거친다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 15L/분의 세척 유속에서 1.1 m2 표면적(POD DOHC), 및 약 12psi 미만의 최대 압력을 사용하는 심층 여과로 수행된다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 15L/분의 세척 유속에서 0.11m2 표면적(POD A1HC), 및 약 12psi 미만의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화된다. 이어서, baculoGROW를 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적하여, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 85%를 산출시킨다. 세포 용해물은 TFF에 의해 농축된다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.001% 플루로닉을 포함하며 pH는 8.0이다. DF 완충액 세척 단계는 3의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 75%이다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시킨다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 약 80%이다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시킨다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시킨다. 여과는 약 12.00 미만의 psi에서 유속 780mL/분으로 수행된다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척된다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행된다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용된다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 2.5E+13 vg/mL의 로딩 용량을 갖는다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 1E+17이다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.12M 인산으로 산을 제거한다. 그런 다음 컬럼을 100mM 트리스 및 1.8M NaCl을 사용하여 재생시킨다. 재생 후, 컬럼을 약 1 mM 시트르산, 22 mM 인산염, 320 mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 평형화 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고, 로딩 후 다시 친화성 정제 평형 완충액으로 컬럼을 평형화시킨다. 고 염 세척은 약 1 mM 시트르산, 22 mM 인산염, 1000mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 15 mM 시트르산, 320mM NaCl, 0.5% 수크로스, pH 2.5의 0.1% F-68을 포함한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 50 mAU 이상의 용출 피크에서 시작된다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생된다. 6M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 60 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 1 mM 시트르산, 22 mM 인산염, 20% 에탄올을 포함하는 주입 및 보관 완충용 물을 사용하여 70 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 150 cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩된다. 이어서 용출된 분획을 pH 8.5에서 0.5M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시킨다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 7.5이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과시키고, 22 mM 비스-트리스 프로판, pH 9.2의 0.001% F-68 및 3 mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시킨다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/mL이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비한다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 1 M NaOH 및 1.8 M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 22 mM 비스-트리스 프로판, 1.8 M NaCl, 0.001% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 22 mM 비스-트리스 프로판, 0.0012% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형을 이루면 샘플은 약 9.2의 로딩 pH, 및 2 mS/cm의 로딩 전도도로 컬럼에 로딩된다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척된다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출된다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 A280에서 약 5 mAU 이상의 용출 피크에서 시작하여 약 15 mAU 미만의 용출 피크에서 끝난다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 6 pH의 0.5 M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화된다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 1.5L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩된다.
중화 후, 샘플은 약 1.4E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 유동 여과 및 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관된다. BDS 스톡은 약 1E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하며, 1.0E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과된다.
실시예 9
곤충 세포를 해동시키고 ExpiSf CD 배지에 3.0E+05 이상의 생존 세포/mL(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 설정하였다. 씨드 배양물의 세포는 5계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩된다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 ExpiSf CD 배지와 약 6.0E+05 세포/mL의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 6E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 90% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮겨 ExpiSf CD 배지와 약 1.5E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 혼합하였다. N-1 배양물은 또한 10%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 함유하였다. N-1 배양 용기의 총 부피를 ExpiSf CD 배지를 더 추가하여 최대 50L가 되게 한다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 72시간 동안 배양되어 6E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하였으며, 생존 세포는 85% 이상이었다.
재조합 배큘로바이러스(rBV) 감염을 위한 준비에 있어서, N-1 배양액을 SF900 II SFM과 혼합하고 소포제와 10%(v/v) 폴록사머-188 용액을 보충했다. ExpiSf CD 배지를 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물 내 ExpiSf CD 배지의 비율은 약 40%(v/v)이다. 시작 세포 밀도는 약 2E+06이다. 1.5E+07의 세포 밀도에 도달하도록 세포를 96시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 1.6 감염 단위(IFU)/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L이다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 중 ExpiSf CD 배지의 백분율이 40%(v/v)가 되도록 SF900 II SFM을 사용하여 배양물의 총 부피를 조정하였다. 감염 약 20시간 후, 배양물을 약 8%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(PBA)로 보충한다. 감염 후 약 60 시간 후에 세포를 수확한다.
수확 시, 곤충 세포를 0.4%(w/v) 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시킨다. 세포는 약 75분 동안 용해 완충액에서 배양된다. 세포 용해물은 약 60분 동안 약 2.5 mM MgCl2의 존재 하에 약 50 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리된다. 반응은 약 150mM의 NaCl에 의해 퀀칭된다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함한다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거친다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 15L/분의 세척(flushing) 유속에서 1.1 m2 표면적(POD DOHC), 및 약 13psi의 최대 압력을 사용하는 심층 여과로 수행된다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 12L/분의 세척 유속에서 0.11m2 표면적(POD A1HC), 및 약 13psi의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화된다. 이어서, ExpiSf CD 배지를 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적하여, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 95%를 산출시킨다. 세포 용해물은 접선 유동 여과(TFF)에 의해 농축된다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.001% 플루로닉을 포함하며 pH는 8.0이다. DF 완충액 세척 단계는 6의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 75%이다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시킨다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 약 95%이다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시킨다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시킨다. 여과는 약 13.00psi에서 유속 720mL/분으로 수행된다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척된다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행된다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용된다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 3.4E+13 vg/mL의 로딩 용량을 갖는다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 1E+17이다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.12M 인산으로 산을 제거한다. 그런 다음 컬럼을 90mM 트리스 및 1.8M NaCl을 사용하여 재생시킨다. 재생 후, 컬럼을 약 1.5 mM 시트르산, 22 mM 인산염, 360 mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.2% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 평형화 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고, 로딩 후 다시 친화성 정제 평형 완충액으로 컬럼을 평형화시킨다. 고 염 세척은 약 1.5 mM 시트르산, 22 mM 인산염, 1500mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 18 mM 시트르산, 360mM NaCl, 0.5% 수크로스, pH 2.5의 0.2% F-68을 포함한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 30 mAU 이상의 용출 피크에서 시작된다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생된다. 6M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 80 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 1.5 mM 시트르산, 22 mM 인산염, 20% 에탄올을 포함하는 주입 및 보관 완충용 물을 사용하여 80 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 120 cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩된다. 이어서 용출된 분획을 pH 8.5에서 0.5M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시킨다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 6.8이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과시키고, 20 mM 비스-트리스 프로판, pH 8.8의 0.001% F-68 및 2.5 mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시킨다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/mL이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비한다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 1 M NaOH 및 1.8 M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 20 mM 비스-트리스 프로판, 1.8 M NaCl, 0.001% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 20 mM 비스-트리스 프로판, 0.0012% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형을 이루면 샘플은 약 8.8의 로딩 pH, 및 2.5 mS/cm의 로딩 전도도로 컬럼에 로딩된다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척된다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출된다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 A280에서 약 5 mAU 이상의 용출 피크에서 시작하여 약 15 mAU 미만의 용출 피크에서 끝난다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 6 pH의 1 M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화된다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 1.5L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩된다.
중화 후, 샘플은 약 1.39E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 유동 여과 및 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관된다. BDS 스톡은 약 3.0E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하며, 1.0E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과된다.
실시예 10
곤충 세포를 해동시키고 SF900 II SFM에 3.0E+05 이상의 생존 세포/ml(계대 1, P1)로 씨딩하여 씨드 배양물을 만든다. 씨드 배양물의 세포는 5계대 동안 배양된 다음, rAAV 생산의 주요 생물 반응에 씨딩된다.
주요 생물 반응이 일어나는 동안, 상기 씨드 배양액 2 L를 SF900 II SFM과 약 4.8E+05 세포/mL의 밀도로 혼합하여 N-2 배양 용기로 총 부피 10 L까지 이동시켰다. 세포들은 N-2 배양 용기에서 96시간 동안 배양되어 4.8E+06 vc/mL 초과의 배양 밀도에 도달하였으며 생존 세포는 90% 초과였다. 이어서, N-2 배양액의 세포 10L를 N-1 배양 용기로 옮겨 SF-900 II SFM과 약 2E+06 vc/mL의 시작 세포 밀도로 혼합한다. N-1 배양물은 또한 8%(v/v)의 폴록사머-188 용액을 함유하였다. N-1 배양 용기의 총 부피를 SF900 II SFM을 더 추가하여 최대 50L가 되게 한다. 필요에 따라 소포제를 배양액에 첨가할 수 있다. 세포는 72시간 동안 배양되어 6E+06 vc/ml 이상의 최종 밀도에 도달하였으며, 생존 세포는 90% 이상이었다.
rBV 감염을 위한 준비에 있어서, N-1 배양액을 IS SF와 혼합하고 소포제와 8%(v/v) 폴록사머-188 용액을 보충했다. SF900 II SFM을 원하는 총 부피에 도달하도록 혼합물에 첨가한다. 이 단계에서 혼합물 내 SF900 II SFM의 비율은 약 45%(v/v)였다. 시작 세포 밀도는 약 2E+06이다. 1.5E+07의 세포 밀도에 도달하도록 세포를 96시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 Rep/AAV9 Cap을 인코딩하는 rBV 및 표적 유전자(예를 들어, GBA, PGRN, PSAP, TREM2 또는 APOE)를 인코딩하는 rBV로 각 rBV에 대해 약 1.5 감염 단위(IFU)/세포의 감염 다중도로 감염시킨다. 배양물에 첨가된 각 rBV의 부피는 바이러스 역가에 따라 약 5 내지 26L이다. 일단 rBV가 배양물에 첨가되면, 혼합물 중 SF900 II SFM의 백분율이 40%(v/v)가 되도록 IS SF를 사용하여 배양물의 총 부피를 조정한다. 감염 약 18시간 후, 배양물을 약 8%(v/v)의 생산 촉진 첨가제(PBA)로 보충한다. 감염 후 약 72 시간 후에 세포를 수확한다.
수확 시, 곤충 세포를 0.5%(w/v) 트리톤이 포함된 트리스 완충액에서 용해시킨다. 세포는 약 75분 동안 용해 완충액에서 배양된다. 세포 용해물은 약 60분 동안 약 2.5 mM MgCl2의 존재 하에 약 50 IU/mL 농도의 벤조나제로 처리된다. 반응은 약 280mM의 NaCl에 의해 퀀칭된다. 세포 용해물은 감염된 곤충 세포에 의해 패키징된 rAAV를 포함한다.
생성된 세포 용해물은 정화 단계를 거친다. 1차 정화는 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), D0HC 매질 시리즈, 약 20L/분의 세척(flushing) 유속에서 1.1 m2 표면적(POD DOHC), 및 약 11psi의 최대 압력을 사용하는 심층 여과로 수행된다. 세포 용해물은 Millistak+® HC Pod 심층 필터(Depth Filter), A1HC 배지 시리즈, 약 20L/분의 세척 유속에서 0.11m2 표면적(POD A1HC), 및 약 11psi의 압력을 사용하는 심층 여과로 추가로 정화된다. 이어서, SF900 II SFM을 사용하여 용해물을 컨디셔닝하고 추적하여, 정화 단계 전에 세포 용해물의 약 95%를 산출시킨다. 세포 용해물은 TFF에 의해 농축된다. TFF 동안, 세포 용해물은 물 세척, 정용여과 완충액(DF 완충액) 컨디셔닝, DF 완충액 세척 및 DF 완충액 추적을 거친다. DF 완충액은 20mM 트리스, 500mM NaCl 및 0.001% 플루로닉을 포함하며 pH는 8.0이다. DF 완충액 세척 단계는 6의 농축 계수에서 수행된다. 농축 후 수율은 TFF 전 용해물의 약 90%이다.
농축된 세포 용해물을 Opticap XL10 필터를 사용하여 정용여과로 멸균 여과시킨다. 여과 후 세포 용해물 수율은 멸균 여과 전 세포 용해물의 약 95%이다. 세포 용해물은 -80°C에서 동결 및 보관할 수 있다.
rAAV에 대한 크로마토그래피 정제 전에 세포 용해물을 해동시키고 Sartopore 2 멤브레인을 사용하여 여과시킨다. 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 사전 세척 및 평형화시킨다. 여과는 약 13.00psi에서 유속 750mL/분으로 수행된다. 여과 후, 필터는 친화성 정제 평형 완충액으로 다시 세척된다. rAAV를 정제하기 위해 친화성 정제에 이어 음이온 교환 정제가 수행된다.
캡시드 특이적 친화성 정제 컬럼이 rAAV의 친화성 정제에 사용된다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지는 약 4E+13 vg/mL의 로딩 용량을 갖는다. 캡시드 특이적 친화성 정제 수지의 총 결합 용량은 약 2E+17이다. 컬럼에 주사용수(WFI)를 주입하고 0.06M 인산으로 산을 제거한다. 그런 다음 컬럼을 100mM 트리스 및 1.8M NaCl을 사용하여 재생시킨다. 재생 후, 컬럼을 약 1.2 mM 시트르산, 20 mM 인산염, 360 mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.2% F-68을 함유하는 친화성 정제 평형 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 평형화 후 세포 용해물을 컬럼에 로딩하고, 로딩 후 다시 친화성 정제 평형 완충액으로 컬럼을 평형화시킨다. 고 염 세척은 약 1.2 mM 시트르산, 20 mM 인산염, 1200mM NaCl, 0.5% 수크로스, 0.2% F-68을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 고 염 세척 후, 컬럼을 용출 전에 친화성 정제 평형 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 정제 크로마토그래피 용출 완충액은 20 mM 시트르산, 360mM NaCl, 0.5% 수크로스, pH 2.2의 0.2% F-68을 포함한다. 용출된 rAAV의 수집은 A280에서 약 50 mAU 이상의 용출 피크에서 시작된다. 용출 후, 컬럼은 산 제거되고 재생된다. 4M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 약 75 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 그런 다음 1.2 mM 시트르산, 20 mM 인산염, 20% 에탄올을 포함하는 주입 및 보관 완충용 물을 사용하여 75 cm/h의 선형 유속으로 컬럼을 세척한다. 상기 설명한 완충액과 샘플은 달리 지정하지 않는 한 약 120 cm/h의 선형 유속으로 컬럼에 로딩된다. 이어서 용출된 분획을 pH 9.0에서 0.4M 인산염을 함유하는 인산염 완충액을 사용하여 중화시킨다. 중화 후 용출된 분획의 목표 pH는 7.5이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 준비하기 위해, 친화성 크로마토그래피 후 중화된 용출 분획의 샘플을 Kleenpak 필터를 사용하여 여과시키고, 18 mM 비스-트리스 프로판, pH 9의 0.0015% F-68 및 2 mS/cm의 전도도를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액을 사용하여 희석 및 평형화시킨다. 컬럼의 로딩 밀도는 약 1.0+E13 내지 4.0+E13 vg/mL이었다. 용출 분획을 희석하기 전에, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 다음 단계들에 의해 준비한다: (i) 주사용수로 세척, (ii) 1 M NaOH 및 1.2 M NaCl을 갖는 완충액으로 소독, (iii) 다시 주사용 물로 세척, (iv) 18 mM 비스-트리스 프로판, 1.2 M NaCl, 0.0015% F-68을 함유하는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 세척, 및 (v) 18 mM 비스-트리스 프로판, 0.0015% F-68을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 평형을 유지. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 평형을 이루면 샘플은 약 9의 로딩 pH, 및 2.3 mS/cm의 로딩 전도도로 컬럼에 로딩되었다. 로딩 후, 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로 다시 세척된다. 샘플은 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충액으로, 다음으로 음이온 교환 크로마토그래피 용출 완충액으로 용출된다. rAAV를 포함하는 분획의 수집은 A280에서 약 5 mAU 이상의 용출 피크에서 시작하여 약 15 mAU 미만의 용출 피크에서 끝난다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 분획은 약 6.2 pH의 0.6 M 트리스/HCL을 포함하는 CIM QA 중화 완충액을 사용하여 중화된다. 달리 명시되지 않는 한 음이온 교환 크로마토그래피 동안 완충액 및 샘플은 1.5L/분의 체적 유속으로 컬럼에 로딩된다.
중화 후, 샘플은 약 1.8E+17 vg/m2 바이러스 입자의 로딩 밀도로 접선 TFF 및 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 여과에 사용된 완충액에는 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188이 포함되어 있다.
필터링된 샘플은 정제된 rAAV 입자를 포함하며 -80°C에서 BDS 보관소에 보관된다. BDS 스톡은 약 1.5E+13 vg/mL의 rAAV 입자를 포함하며, 1.0E+13 vg/mL 초과의 DP 농도로 희석될 수 있다. 샘플은 포장 전에 멸균 여과된다.
실시예 11: 글루코세레브로시다제를 인코딩하는 rAAV의 물리적 역가를 측정하기 위한 정량적 PCR 분석.
본 분석의 목적은 GCase를 인코딩하는 AAV(예를 들어, AAV9) 캡슐화 벡터의 물리적 역가를 알려진 표준과 비교하여 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 정량화하는 것이다. 이 테스트 방법은 정제된 AAV 바이러스 샘플 또는 공정 생산 분획에서 물리적 벡터 게놈 역가를 정량화하는 데 사용할 수 있다.
실험실 테스트 방법
표 1: 재료
Figure pct00001
표 2: 기기
Figure pct00002
GCase를 인코딩하는 선형화된 플라스미드는 DraIII로 선형화되었다. 바이러스 참조 표준은 GCase를 인코딩하는 다른 rAAV 벡터였다.
표 3: 프라이머
Figure pct00003
참고: 모든 프라이머는 공급업체에서 100μM으로 제공되고 HPLC 수준 순도 이상인 것으로 가정한다.
방법의 배경/이론: 표적 서열을 캡슐화하는 AAV의 사본의 양을 결정하기 위해, 실시간 qPCR을 사용하는 PCR을 사용하여 원하는 서열을 증폭시켰다. 이 방법에서는 형광 리포터 분자(예를 들어, 염료 표지된 프로브)를 사용하여 증폭 반응의 진행을 모니터링했다. 각 증폭 주기에서, 형광 강도의 증가는 앰플리콘 농도의 증가에 비례하며, qPCR 기기 시스템은 각 PCR 주기 동안 각 샘플에 대한 데이터를 수집한다. 그런 다음 모든 샘플에 대한 형광 vs. 주기 수에 관해 생성된 플롯들을 공통 시작점에서 이들의 배경 형광으로 설정했다. 증폭 플롯이 미리 결정된 배경 임계값 형광 수준을 교차하는 주기 수를 “Ct” 또는 임계값 주기라고 한다. 알려지지 않은 물질의 Ct 값을 다양한 농도로 희석된 알려진 표준 물질과 비교하여 알려지지 않은 샘플의 시작 농도를 결정함으로써, 주어진 샘플에서 원하는 양의 복제물(존재하는 경우)을 산출했다.
절차
10% 폴리소르베이트-80, PCR 희석 완충액, 10X 프로테이나제 K 완충액 및 표준 희석액을 준비했다. 선형화된 플라스미드는 필요한 경우 2e9 사본/μL로 희석되었다. 2x107 사본/μL 내지 20 사본/μL 범위의 표준 곡선을 준비하기 위해 제1 표준을 사용하여 표준 희석액에서 10배 연속 희석을 수행했다. 표준 세트(2x107 내지 20 사본/μL)를 8-웰 0.2mL PCR 튜브 스트립의 7개 웰에 분할하여, 각 스트립이 일회용 표준 곡선으로서 사용되게 하였다. 프라이머 스톡은 동결건조된 프라이머로부터 준비되었다.
블랭크(Blanks) 및 DNAse 대조군을 준비했다. 참조 표준 및 샘플을 준비했다. 모든 샘플 및 참조 표준은 삼중으로 실행되었다. 모든 샘플 유형에 대한 샘플 희석은 표 4에 기초한 초기 농도를 기준으로 선택되었다. 공정 중 샘플들은 아래의 이론적 샘플 농도에 대해 제안된 최고 희석배수로 실행될 수 있다.
표 4: 샘플 및 참조 표준 희석 절차
Figure pct00004
DNAse 마스터 믹스와 프로테이나제 K 마스터 믹스를 제조했다. 샘플을 DNase로 처리하고 프로테이나제 K 용액과 혼합했다.
qPCR 마스터 반응 믹스는 다음 표 5에 자세히 설명된 바와 같이 제조되었다:
표 5: qPCR 마스터 반응 믹스 제조
Figure pct00005
최대 램프 속도로 다음과 같은 설정을 사용하여 qPCR을 실행했다:
표 6: qPCR 조건
Figure pct00006
최종 사본수는 다음과 같이 결정되었다:
a. 분석 플레이트에 있는 모든 샘플의 형광을 기반으로 한 표적 앰플리콘의 증폭이 기록되었고 Ct 값은 QuantStudio™ 소프트웨어에 의해 자동으로 결정된다.
b. 각 표준의 Ct vs. 반응당 사본수를 로그 스케일로 플롯하여 표준 곡선을 준비하였다(최종 그래프는 세미 로그 스케일이며 y축은 선형이고 x축은 log10 스케일임). 이것은 직선에 피팅되었다.
c. 각 반응 웰의 벡터 사본수는 (b)에서 결정된 표준 곡선으로 Ct 값을 보간하여 결정되었으며 기기에서 출력한 데이터에 포함되었다.
d. 마지막으로, 상기 (c)에서 결정된 수에 샘플을 준비하는 데 사용된 희석 배수를 곱하여 최종 사본수를 산출했다. 샘플에 2개 이상의 희석액이 사용된 경우, 표준 곡선의 모든 유효 값들은 계산 후 평균되었다.
Ct 값이 qPCR에 대한 표준 곡선의 선형 범위 위에 있는 경우, 이론적으로 반응이 선형 범위 내에 있도록 허용하는 희석 배수를 사용하여 샘플을 다시 제조할 수 있다.
분석 시스템 적합성은 다음과 같은 경우 허용되는 것으로 간주될 것이다:
Figure pct00007
테스트 방법 적격성평가 프로토콜
목적: 본 적격성평가 계획의 목적은 PR001 캡슐화 AAV 산물의 물리적 역가에 대한 테스트 방법을 정의하는 것이다. 이 프로토콜은 이 방법이 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하며 연구 및 공정 개발 목적(비 GXP)을 위한 정제된 AAV 샘플 분석에 적합함을 보여준다. 테스트 방법은 상기 제공되어 있다.
표 7: 적격성평가 재료
Figure pct00008
정확도 및 특이성 대조군들은 DIW를 DNAse로 대체하여 상기 설명한 바와 같이 제조하였다.
표 8: 방법 적격성평가 허용 기준
Figure pct00009
플레이트 레이아웃/실행 설정
표 9: qPCR 레이아웃(실행 1)
Figure pct00010
표 10: qPCR 레이아웃(실행 2 및 3)
Figure pct00011
데이터 처리 및 보고: QuantStudio™ 7은 원시 데이터를 수집하여 상기 테스트 방법에 설명된 바와 같이 사본/반응을 자동으로 계산한다. 이 데이터는 추가 분석 매개변수(예를 들어, 정확도 및 정밀도)를 계산하기 위해 스프레드시트로 출력될 것이다. 재료, 시약, 사용된 장비 및 테스트 조건과 같은 실험들의 세부 사항을 포함한 모든 결과 데이터는 두 번째 분석자가 검토할 것이다.
모든 유효한 분석 실행의 결과와 참조 표준 바이러스 및 연구 바이러스의 모든 유효한 농도에 기반하여, 상기 적격성평가로부터 얻은 모든 실행에 대한 전체 평균 역가는 추가 분석 실행들에서 사용하기 위한 이러한 샘플들에 대한 공칭 역가 값을 설정하는 데 사용된다.
실시예 12: rAAV 인코딩 GCase에 대한 시험관 내 효소 효능 분석.
본 분석의 목적은 세포 기반 분석을 사용하여 GCase를 인코딩하는 AAV(예를 들어, AAV9) 캡슐화 벡터의 시험관 내 상대 효능을 측정하는 것이다.
실험실 테스트 방법
이 방법의 목적은 세포 기반 기능 분석을 사용하여 시험관 내에서 GCase를 인코딩하는 AAV 캡슐화 벡터의 용량 반응을 측정하는 것이다. 이 테스트 방법은 연구 목적을 위해, 예를 들어, 다른 AAV 유전자 치료 제품 로트의 반응을 비교하기 위해 사용될 수 있다.
표 11: 정의
Figure pct00012
표 12: 재료 및 장비
Figure pct00013
방법의 배경/이론: PR001은 GBA1을 발현하는 예시적인 rAAV이다. 형질도입 분석은 HEK293T 세포에 PR001을 도입하여 GCase 효소를 발현시킨다. GCase 촉매 작용에 의해 형광 산물 레조루핀을 생성하는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노사이드를 사용하여 세포 용해물에서 형질도입으로부터 유도된 효소 활성을 분석하였다. 2개 이상의 rAAV 사이의 상대적 효능은 평행선 분석을 사용하여 상이한 양의 PR001에서 형질도입으로 인해 생성된 효소 활성으로부터 계산되었다.
표 13: 시약/희석제/배지
Figure pct00014
절차: HEK293T 세포를 96-웰 플레이트에 20,000개 세포/웰로 플레이팅하고 37℃및 5% CO2에서 밤새 부착시켰다. AAV의 연속 희석액들을 표 14에 나타낸 바와 같이 그 부형제에서 제조하였다.
표 14
Figure pct00015
10 μL의 AAV 희석액 또는 비히클을 도 1의 플레이트 맵에 따라 웰들로 옮겼다. 생성된 총 vg가 달성되었다(표 15).
표 15
Figure pct00016
세포를 2 내지 2.5시간 동안 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 μL의 회복 배지를 세포/형질도입 배지에 추가하여 총 부피 150 μL가 되게 하였다. 바이러스 유래 GCase 발현을 허용하기 위해 세포를 37°C 및 5% CO2에서 72 + 6시간 동안 인큐베이션하였다.
세포 용해물을 수확하였다. GCase 활성은 10μL의 1.25mM 레조루핀-β-D 글루코피라노사이드 실험 용액을 투명한 편평 바닥이 있는 검은색 플레이트에 추가한 다음 40μL의 세포 용해물을 추가하여 측정했다. 플레이트는 37°C에서 Varioskan 플레이트 리더에서 즉시 판독되었다.
분석: 상대 효능을 계산하기 위한 데이터의 병렬 분석을 다음과 같이 수행했다:
1. 각 vg/웰 포인트에 대한 CV%를 계산하라, 이는 ≤ 30%여야 한다. 필요한 경우 이를 달성하기 위해 vg/웰 포인트당 최대 하나의 반복실험을 폐기할 수 있다.
2. 바이러스 양과 GCase 활성(RFU/시간)의 로그 변환을 수행한다.
3. 로그(RFU/hr) 대 로그(바이러스)로 반응을 플롯한다.
4. 각 샘플에 대해 선형 회귀를 수행한다.
5. 공통 기울기 “A”(Y= AX + b)를 사용하여 새로운 선형 회귀를 수행한다.
6. 5단계에서 얻은 매개변수를 사용하여 다음 공식을 사용하여 상대 효능을 계산한다:
상대 효능(%) = 10 ^ ((b - b 참조)/A) x 100
7. 참조 표준에 상대적인 결과를 소수점 없이 백분율로 보고한다(예를 들어, 결과가 100.50이면 101%가 될 것임).
표 16: 분석 시스템 적합성 및 샘플 기준
Figure pct00017
테스트 방법 적격성평가 프로토콜
목적: 이 검증 계획의 목적은 세포 기반 분석을 사용하여 시험관 내에서 PR001의 상대적 역가를 측정하기 위한 테스트 방법을 정의하는 것이다. 이 프로토콜은 이 방법이 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하며 연구 및 공정 개발 목적(비 GXP)을 위한 AAV 샘플 분석에 적합함을 보여준다.
표 17: 적격성평가 재료
Figure pct00018
검증 계획: 밸리데이션(validation)은 국제 의약품 규제 조화 위원회(ICH) Q2(R1), USP<1032> 및 USP<1033>에 설명된 절차인 분석 테스트 방법의 밸리데이션에 따라 수행될 것이다. 밸리데이션 테스트는 50%, 100% 및 200% 상대 효능 수준에서의 AAV9-GBA DP 및 특이성 테스트로 구성될 것이다. 방법의 선형성, 정확도 및 정밀도(반복성 및 중간 정밀도)를 평가하기 위해 각 수준은 두 명의 분석자가 테스트한다. 각 분석의 상대적 효능은 독립적이며 단일 분석 결정으로 간주된다. 각 플레이트에는 하나의 참조 표준과 최대 2개의 테스트 샘플이 포함될 것이다. 하나의 플레이트에서 시스템 적합성이 실패하면, 해당 플레이트가 반복될 것이다. 하나의 샘플에 대한 시스템 적합성이 실패하면, 실패한 샘플만 반복될 것이다. 모든 샘플은 상기 방법에 정의된 분석 허용 기준과 이 프로토콜에 정의된 밸리데이션 기준을 충족해야 한다. 특이성 결정은 또한 GBA1을 보유하지 않는 관련 없는 AAV 제품을 사용하여 수행될 것이다. 검출 및 정량 한계는 USP<1032>에 설명된 상대적 효능을 보고하는 방법과 관련이 없기 때문에 포함되지 않았다. 표 18에는 상기 법의 성능을 평가하는 데 사용되는 밸리데이션 절차와 허용 기준이 요약되어 있다.
표 18: 밸리데이션 절차 및 적격성평가 허용 기준의 요약
Figure pct00019
Figure pct00020
선형성: AAV9-GBA 테스트 샘플은 참조 표준의 50%, 100% 및 200%로 희석되고 두 명의 분석자가 7가지 분석으로 테스트할 것이다. 평균(측정된) 상대 효능을 예상 상대 효능에 대해 플롯하고 선형 회귀를 사용하여 분석할 것이다. 생성된 선형성 식 및 결정 계수(R2)가 보고될 것이다. 시스템 적합성에 실패한 분석 플레이트는 분석에 사용되지 않는다.
정확도: 정확도를 평가하기 위해 선형성 데이터가 평가될 것이다. 평균 회복%는 각 수준에서 다음 식을 사용하여 계산될 것이다:
Figure pct00021
각 수준의 회복 값% 가 보고될 것이다.
반복성: 선형성 데이터는 반복성을 평가하기 위해 평가될 것이다. 백분율 상대 표준 편차(RSD%)는 각 분석에 대해 각 수준에서 계산되어(즉, 동일한 분석자 및 동일한 주차) 보고될 것이다.
중간 정밀도: 선형성 데이터는 반복성을 평가하기 위해 평가될 것이다. 각 수준에서 전체 RSD%가 계산되고 보고될 것이다.
범위: 선형성, 정확도 및 정밀도 실험에 대한 기준을 충족하는 테스트된 최저 및 최고 효능이 상기 방법 범위를 결정하는 데 사용될 것이며 보고될 것이다.
특이성: 대체 분자(특이성 샘플)는 한 명의 분석자가 하나의 분석에서 테스트할 것이다. 특이성 샘플은 AAV9-GBA 테스트 샘플에서와 같이 분석에 희석될 것이다. 특이성 샘플은 대체 분자(AM): PR006이다.
데이터 처리 및 보고: 원시 데이터는 SkanIt RE 5.0 소프트웨어에 의해 수집될 것이며 평행선 분석은 위의 테스트 방법에 표시된 대로 수행될 것이다. 이 데이터는 추가 분석 매개변수(예를 들어, 정확도 및 정밀도)를 계산하기 위해 스프레드시트로 출력될 것이다. 재료, 시약, 사용된 장비 및 테스트 조건과 같은 실험들의 세부 사항을 포함한 모든 결과 데이터가 기록될 것이며 두 번째 분석자가 검토할 것이다.
모든 유효한 분석 실행의 결과와 참조 표준 바이러스 및 연구 바이러스의 모든 유효한 농도에 기반하여, 상기 적격성평가로부터 얻은 모든 실행에 대한 전체 평균 상대 효능은 추가 분석 실행들에서 사용하기 위한 이러한 샘플들에 대한 공칭 RP 값을 설정하는 데 사용될 것이다.
여러 PR001 샘플의 효능 분석 데이터의 예가 도 2에 도시되어 있다.
실시예 13: 프로그래눌린을 인코딩하는 rAAV의 역가를 측정하기 위한 정량적 PCR 분석.
본 분석의 목적은 PGRN을 인코딩하는 AAV(예를 들어, AAV9) 캡슐화 벡터의 물리적 역가를 알려진 표준과 비교하여 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 또는 표준 없이 ddPCR에 의해 정량화하는 것이다. 이 테스트 방법은 정제된 AAV 바이러스 샘플 또는 공정 생산 분획에서 물리적 벡터 게놈 역가를 정량화하는 데 사용할 수 있다.
실험실 테스트 방법
표 19: 재료
Figure pct00022
표 20: 기기
Figure pct00023
선형화된 플라스미드 PR006A를 PmlI로 선형화하였다. 바이러스 참조 표준은 PR006의 다른 로트였다.
표 21: 프라이머
Figure pct00024
참고: 모든 프라이머는 공급업체에서 100μM으로 제공되고 HPLC 수준 순도 이상인 것으로 가정한다.
방법의 배경/이론: 표적 서열을 캡슐화하는 AAV의 사본의 양을 결정하기 위해, 하나 또는 두 가지 방법론을 사용하는 PCR을 사용하여 원하는 서열을 증폭시킨다. 첫 번째 방법은 실시간 qPCR을 사용하며, 이 방법에서 형광 리포터 분자(예를 들어, 염료 표지된 프로브)를 사용하여 증폭 반응의 진행을 모니터링한다. 각 증폭 주기에서, 형광 강도의 증가는 앰플리콘 농도의 증가에 비례하며, qPCR 기기 시스템은 각 PCR 주기 동안 각 샘플에 대한 데이터를 수집한다. 그런 다음 모든 샘플에 대한 형광 vs. 주기 수에 관해 생성된 플롯들을 공통 시작점에서 이들의 배경 형광으로 설정한다. 증폭 플롯이 미리 결정된 배경 임계값 형광 수준을 교차하는 주기 수를 “Ct” 또는 임계값 주기라고 한다. 알려지지 않은 물질의 Ct 값을 다양한 농도로 희석된 알려진 표준 물질과 비교하여 알려지지 않은 샘플의 시작 농도를 결정함으로써, 주어진 샘플에서 원하는 양의 복제물(존재하는 경우)을 산출한다. 두 번째 방법은 샘플을 개별 액적들로 이산화하는 ddPCR을 사용한다. 그런 다음 액적들이 PCR에 의해 증폭되고, 액적은 액적 리더에서 양성(형광 포함) 또는 음성(형광 없음)으로 계수된다. 그런 다음 절대 사본수는 푸아송 통계를 사용하여 총 액적에 대한 양성의 비율로부터 직접 결정되므로 표준이 필요하지 않다.
절차:
10% 폴리소르베이트-80, PCR 희석 완충액, 10X 프로테이나제 K 완충액 및 표준 희석액을 준비했다. 선형화된 플라스미드는 필요한 경우 2e9 사본/μL로 희석되었다. 2x107 사본/μL 내지 20 사본/μL 범위의 표준 곡선을 준비하기 위해 제1 표준을 사용하여 표준 희석액에서 10배 연속 희석을 수행했다. 표준 세트(2x107 내지 20 사본/μL)를 8-웰 0.2mL PCR 튜브 스트립의 7개 웰에 분할하여, 각 스트립이 일회용 표준 곡선으로서 사용되게 하였다. 프라이머 스톡은 동결건조된 프라이머로부터 준비되었다.
블랭크(Blanks) 및 DNAse 대조군을 준비했다. 참조 표준 및 샘플을 준비했다. 모든 샘플 및 참조 표준은 삼중으로 실행되었다. 모든 샘플 유형에 대한 샘플 희석은 표 22에 기초한 초기 농도를 기준으로 선택되었다.
표 22: 샘플 및 참조 표준 희석 절차
Figure pct00025
qPCR 마스터 믹스는 다음 표 23에 자세히 설명된 바와 같이 제조되었다:
표 23: qPCR 마스터 반응 믹스 제조
Figure pct00026
ddPCR의 경우, 표 23과 유사하게 제조된 다음 반응 혼합물을 사용했다:
표 24: ddPCR 마스터 반응 믹스 제조
Figure pct00027
qPCR 또는 ddPCR은 다음과 같이 실행되었다. qPCR의 경우, 15μL 마스터 반응 믹스를 샘플을 포함할 분석 플레이트의 모든 웰에 추가했다. ddPCR의 경우, 19.5μL 마스터 반응 믹스를 샘플을 포함할 분석 플레이트의 모든 웰에 추가했다. qPCR의 경우, 이전에 분취된 표준을 웰 당 5μl로 플레이트에 추가했다. ddPCR의 경우, 표준 곡선이 사용되지 않으므로 이 단계를 건너뛸 수 있다. 5μL 희석 샘플, qPCR용 대조군 또는 참조 표준, ddPCR용 2.5μL 희석 샘플을 각 플레이트에 추가했다. 각 분석에 템플릿이 없는 대조군도 포함되어야 하며, 대조군에서는 샘플이 물로 대체된다.
최대 램프 속도로 다음과 같은 설정을 사용하여 qPCR을 실행했다:
표 25: qPCR 조건
Figure pct00028
최종 사본수는 다음과 같이 결정되었다:
a. 분석 플레이트에 있는 모든 샘플의 형광을 기반으로 한 표적 앰플리콘의 증폭이 기록되었고 Ct 값은 QuantStudio™ 소프트웨어에 의해 자동으로 결정된다.
b. 각 표준의 Ct vs. 반응당 사본수를 로그 스케일로 플롯하여 표준 곡선을 준비하였다(최종 그래프는 세미 로그 스케일이며 y축은 선형이고 x축은 log10 스케일임). 이것은 직선에 피팅되었다.
c. 각 반응 웰의 벡터 사본수는 (b)에서 결정된 표준 곡선으로 Ct 값을 보간하여 결정되었으며 기기에서 출력한 데이터에 포함된다.
d. 마지막으로, 상기 (c)에서 결정된 수에 샘플을 준비하는 데 사용된 희석 배수를 곱하여 최종 사본수를 산출했다. 샘플에 2개 이상의 희석액이 사용된 경우, 표준 곡선의 모든 유효 값들은 계산 후 평균된다.
ddPCR은 다음과 같이 실행되었다:
표 26: ddPCR 조건
Figure pct00029
최종 사본수는 푸아송 통계를 사용하여 총 액적 카운트에 대한 양성 액적들의 수를 기반으로 QuantSoft 소프트웨어에 의해 자동으로 결정되었다. 샘플에 2개 이상의 희석액이 사용된 경우, 표준 곡선의 모든 유효 값들은 계산 후 평균될 것이다. 이러한 카운트들이 데이터 출력에 포함될 것이다. qPCR의 경우 Ct 값이 표준 곡선의 선형 범위 위에 있거나, 또는 ddPCR에서 “No call”로 결정되는 경우, 샘플은 이론적으로 반응이 상기 선형 범위 내에 속하게 하는 희석을 사용하여 다시 준비될 것이다.
분석 시스템 적합성은 다음과 같은 경우 허용되는 것으로 간주될 것이다:
Figure pct00030
샘플 적합성은 다음과 같은 경우 허용되는 것으로 간주될 것이다:
Figure pct00031
테스트 방법 적격성평가 프로토콜
목적: 본 적격성평가 계획의 목적은 PR006 캡슐화 AAV 산물의 물리적 역가에 대한 테스트 방법을 정의하는 것이다. 이 프로토콜은 이 방법이 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하며 연구 및 공정 개발 목적(비 GXP)을 위한 정제된 AAV 샘플 분석에 적합함을 보여준다. 테스트 방법은 상기 제공되어 있다.
표 27: 적격성평가 재료
Figure pct00032
정확도 및 특이성 대조군들은 DIW를 DNAse로 대체하여 상기 설명한 바와 같이 제조하였다.
표 28: 방법 적격성평가 허용 기준
Figure pct00033
플레이트 레이아웃/실행 설정
표 29: qPCR 레이아웃(실행 1)
Figure pct00034
표 30: qPCR 레이아웃(실행 2 및 3)
Figure pct00035
데이터 처리 및 보고
QuantStudio™ 7은 원시 데이터를 수집하여 상기 테스트 방법에 설명된 바와 같이 사본/반응을 자동으로 계산한다. 이 데이터는 추가 분석 매개변수(예를 들어, 정확도 및 정밀도)를 계산하기 위해 엑셀 시트로 출력될 것이다. 재료, 시약, 사용된 장비 및 테스트 조건과 같은 실험들의 세부 사항을 포함한 모든 결과 데이터가 기록될 것이며 두 번째 분석자가 검토할 것이다.
모든 유효한 분석 실행의 결과와 참조 표준 바이러스 및 연구 바이러스의 모든 유효한 농도에 기반하여, 상기 적격성평가로부터 얻은 모든 실행에 대한 전체 평균 역가가 사용될 것이다.
실시예 14: rAAV 인코딩 프로그래눌린에 대한 시험관 내 효소 효능 분석.
본 분석은 PGRN을 인코딩하는 rAAV(예를 들어 AAV9)에 대한 시험관 내 효능을 측정한다. 분석은 96-웰 형식으로 수행되었다. HEK293 세포를 웰당 20,000개 세포로 플레이팅하고 다음날 테스트 항목 및 참조 표준 모두에 대해 상이한 약물 농도의 AAV9-GRN을 형질도입하였다. 형질도입 후 72시간에, PGRN 수준을 ELISA(AdipoGen Life Sciences 카탈로그 번호 AG-45A-0018YEK-KI01)로 측정하였다. 참조 표준에 대한 상대 효능 보고값은 평행선 분석을 사용하여 계산되었다. 여러 PR006(AAV9 캡시드를 포함하고 PGRN을 인코딩하는 rAAV) 샘플로부터 얻은 효능 분석 데이터의 예는 도 3에 제시되어 있다. 또는 6개의 MOI 그룹을 사용하여 기울기 비율의 가변성을 줄일 수 있다. 샘플들의 프로그래눌린 수준 범위를 포괄하도록 희석 배수를 변경하여 반복 횟수를 최소화할 수도 있다.
실시예 15: rAAV 조성물의 단백질 순도 및 바이러스 캡시드 단백질 비율을 측정하기 위한 분석
목적: 이 방법의 목적은 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 rAAV 샘플의 단백질 순도와 바이러스 단백질 비율을 추정하는 것이다.
범위 및 배경: 이 테스트 방법은 정제된 rAAV 바이러스 샘플의 반정량적 방식에서 또는 공정 생산 분획들에서 순도 또는 밴드 비율을 추정하는 데 사용할 수 있다.
SDS-PAGE는 상대 분자량을 기준으로 환원 및 변성 조건하에서 단백질 혼합물의 성분을 분해하여 샘플의 균질성을 평가한다. SYPRO® Ruby 단백질 겔 염료는 PAGE로 분리된 단백질을 탐지하는 초민감성 발광 염료이다. 본 분석의 목적은 AAV 캡시드 단백질(VP 1, 2 및 3) 및 기타 불순물 밴드들의 상대적 양을 결정하는 것이다. 이 방법을 사용하여 모든 불순물 밴드와 관련하여 VP 밴드의 비율 및/또는 이러한 밴드의 순도 퍼센트를 계산할 수 있다. 샘플에 있는 모든 단백질의 분자량은 분자량 사다리 표준과 관련하여 결정될 수 있다.
절차: 고정 완충액, 세척 완충액, MES 실행 완충액 및 샘플 완충액 믹스가 준비된다. rAAV 샘플 연속 희석액들을 준비한다. 샘플들은 삼중으로 실행할 수 있다. 샘플 및 분자량 사다리 표준이 겔에 로딩되고 겔이 실행된다. 그런 다음 겔을 SYPRO® Ruby 염료로 염색한다. 그런 다음 염색된 겔의 이미지를 분석하여(ChemiDoc™ MP Imaging System, BioRad) 샘플의 VP 밴드 비율과 순도를 계산한다. VP1, VP2 및 VP3의 예상 분자량은 다음과 같다: VP1 = 87kDa, VP2 = 72kDa, VP3 = 62kDa.
분석 시스템 적합성은 다음과 같은 경우 허용되는 것으로 간주될 것이다:
Figure pct00036
두 로트의 PR006(AAV9-PGRN) 물질은 시험관 내 효능에서 차이를 나타냈다. 이 차이를 조사하기 위해, 불순물 수준과 VP 캡시드 단백질 비율이 이들 로트에서 유의미한 차이가 있는지 결정하기 위해 상기 설명한 SDS-PAGE를 수행한다. 이러한 로트에서 완전 대 부분 입자의 비율을 조사하기 위해 분석 초원심분리도 수행된다.
본 연구의 범위는 제품 효능에 영향을 미칠 수 있는 제품 속성인, 제품 순도 및 완전 대비(versus) 빈 캡시드 입자 측면에서, 두 개의 rAAV 로트를 비교하는 것이다. 이것은 두 가지 방법으로 평가될 것이다: 첫 번째는 바이러스 단백질 비율 및 바이러스 단백질에 대한 불순물의 양을 SDS-PAGE에 의해 분석하는 것이다. 두 번째는 완전 입자와 부분 입자를 분리하고 완전 대 부분 입자의 비율을 정량화하기 위해 분석 초원심분리(AUC)를 활용한다. SDS-PAGE는 ≤-60°C에서 보관된 테스트 물질과의 상대적 비교를 가능하게 하기 위해 동일한 겔에서 두 로트 모두에 대해 수행될 것이다.
샘플 배치: 테스트 전에, G14C0519의 단일 바이알을 분취하고 문서화할 것이다. 아래에 설명된 대로 SV-AUC에서 단일 실행에 사용하기 위해 하나의 100μL 분취량을 < -60º에서 보관할 것이다. 상기 설명한 바와 같이 SDS-PAGE로 분석할 때까지 별도의 50μL 분취량을 < -60º에서 보관할 것이다.
테스트 절차: 이들 샘플의 SDS-PAGE는 상기 설명한 바와 같이 분석될 것이다. 각 로트의 CoA에 보고된 총 vg를 기준으로 샘플을 로딩하는 것 외에도, 각 로트의 CoA에 보고된 마이크로 BCA에 의한 단백질 농도를 사용하여 총 단백질을 기준으로 당량을 로딩하여 샘플을 테스트 할 것이다.
분석 초원심분리가 수행될 것이다. 요약하면, 샘플을 먼저 샘플 완충액으로 230nm에서 0.5의 OD로 희석하고 단일 복제로 실행한다. 샘플은 다음 매개변수를 사용하여 실행된다:
표 33
Figure pct00037
생성된 SEDFIT c(s) 프로파일로부터 그리고 피크가 재현 가능한지 또는 모델 피팅으로 인해 가능한 모델링 아티팩트('거짓' 피크)인지를 평가하기 위해, 재현 가능한 임계값 기준이 구현된다. 재현 가능한 임계값은 캡시드 종 <0.5% 및/또는 <0.002 OD에 대한 흡광도의 백분율로 정의되며, 이 기준 미만의 종들은 표 결과에 포함되지 않는다. 분석에 대한 자세한 내용은 생물학적 분석 보고서에 포함될 것이다. 본 분석에 의해 결정된 완전 대 부분 입자의 비율 결과(c(s) 분포로 피팅된 총 퍼센트을 기준으로 함)가 보고될 것이다.
데이터 분석 및 데이터 보고: 모든 데이터는 보고되고 문서화된다. SDS-PAGE 결과를 위해, VP1 캡시드 단백질의 조성%를 배치(batch)들 간에 비교한다. 문헌(Bosma 외, (2018) Gene Therapy 25:415-424 및 이 문헌 내 참고문헌 참조)에 따르면, VP 단백질의 이러한 비율은 제품 효능을 제어하는 데 중요한 요소이다. AUC 방법의 경우, 빈 캡시드 및 부분적으로 포장된 캡시드에 비해 완전 입자 %가 높을수록 효능 증가와 관련이 있다.
실시형태
첨부된 청구범위에도 불구하고, 본 발명은 다음과 같이 번호가 매겨진 실시형태들을 제시한다:
1. 세포 용해물의 제조 방법으로서, 이 방법은:
(i) 2개 이상의 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 세포 배양 배지를 포함하는 혼합물에 현탁된 곤충 세포를 함유하는 생물반응기를 얻는 단계;
(ii) 곤충 세포를 배큘로바이러스 벡터의 제1 집단으로 약 1.0 내지 2.0의 감염 다중도(MOI)로 감염시키는 단계(이 때 배큘로바이러스 벡터의 제1 집단은 관심 유전자 산물을 인코딩하는 발현 카세트를 포함함);
(iii) 곤충 세포를 배큘로바이러스 벡터의 하나 이상의 추가 집단으로 약 1.0 내지 2.0의 MOI로 감염시키고, 이 때 추가 집단은 각각 AAV Rep 단백질 및/또는 AAV Cap 단백질을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하고;
(iv) 감염된 곤충 세포가 관심 유전자를 인코딩하는 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV) 입자를 생산하는 조건 하에서 감염된 곤충 세포를 배양하는 단계; 및
(v) 감염된 곤충 세포를 용해시켜 rAAV 입자를 포함하는 세포 용해물을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 실시형태 1에서, 2개 이상의 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 배양 배지 각각은 4셀 곤충 CD 배지, ESF-921, ESF-AF, ExpiSf CD 배지, Express Five SFM, baculoGROW, IS SF, 및 SF900 II SFM으로부터 선택되는, 방법.
3. 실시형태 1 또는 2에서, 혼합물은 약 10% v/v 내지 약 50% v/v의 SF900 II SFM 배지를 포함하는, 방법.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, (i)의 곤충 세포는 마스터 씨드 트레인의 4-6회 계대 후에 얻어지는, 방법.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, (ii)의 감염 및 (iii)의 감염이 동시에 발생하는, 방법.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 곤충 세포가 mL당 8E+06 생존 세포(vc/mL) 내지 약 20E+06 vc/mL의 세포 밀도로 생물반응기에 존재하는, 방법.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, (iv)의 배양이 1일 내지 5일 동안 일어나는, 방법.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, (v)의 용해는 감염된 곤충 세포를 세제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 심층 여과에 의해 세포 용해물을 정화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 용해물의 rAAV 입자를 접선 유동 여과 및/또는 정용여과에 의해 농축시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 관심 유전자 산물은 펩티드, 폴리펩티드, 억제성 핵산 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
12. 실시형태 11에 있어서, 관심 유전자 산물은 글루코세레브로시다제(GCase), 프로그래눌린(PGRN), 프로사포신(PSAP), C9orf72, 골수 세포 2(TREM2)에서 발현된 촉발 수용체, 아포지단백 E2(ApoE2) 또는 파킨을 포함하는, 방법.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 이들 중 어느 하나의 변이체인 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 세포 용해물은
(a) 밀리리터 당 약 1E+11 바이러스 게놈(vg/mL) 내지 약 1.0E+13 vg/mL;
(b) 밀리리터 당 약 2E+11 바이러스 게놈(vg/mL) 내지 약 1.0E+13 vg/mL; 또는
(c) 밀리리터 당 약 5E+11 바이러스 게놈(vg/mL) 내지 약 1.0E+13 vg/mL를 포함하는, 방법.
15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 세포 용해물을 포함하는 약학 조성물.
16. 실시형태 15에 있어서, 동결 방지제를 추가로 포함하는, 조성물.
17. 치료 조성물의 생산 방법으로서, 이 방법은:
(i) rAAV 입자를 포함하는 세포 용해물을 얻는 단계;
(ii) 친화성 크로마토그래피 컬럼을 세포 용해물과 접촉시키는 단계(이 때, 친화성 컬럼은 rAAV 입자가 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하는 조건 하에서 rAAV 입자의 캡시드 단백질에 특이적인 결합제를 포함함);
(iii) 결합된 rAAV 입자를 컬럼으로부터 용출하여 1차 용출액을 생산하는 단계;
(iv) 1차 용출액에 대해 음이온-교환 크로마토그래피를 수행하여 2차 용출액을 생산하는 단계(이 때 2차 용출액은 1차 용출액보다 더 적은 수의 빈 rAAV 입자를 포함함);
(v) 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188을 포함하는 유동 완충액을 사용하여 접선 유동 여과를 수행하여 2차 용출액을 농축함으로써, rAAV 입자를 포함하는 치료 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 치료 조성물의 생산 방법.
18. 실시형태 17에 있어서, (i)의 세포 용해물은 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되는, 방법.
19. 실시형태 17 또는 18에 있어서, 결합제는 AAV9 캡시드 단백질에 특이적인 친화성 수지를 포함하는, 방법.
20. 실시형태 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 음이온-교환 크로마토그래피는 1차 용출액을 평형화 완충액과 혼합하여 약 0.5 mS/cm 내지 5 mS/cm의 전도도를 갖는 혼합물을 생산하는 단계(선택적으로 이 때 혼합물은 2 mS/cm의 전도도를 가짐), 혼합물을 4차 아민-함유 수지에 결합시켜 혼합물 내의 rAAV 입자를 수지에 결합시키는 단계, 그리고 rAAV 입자를 수지로부터 용출시켜 2차 용출액을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
21. 실시형태 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 2차 용출액은 약 1.0E+12 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL로 농축되는, 방법.
22. 실시형태 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL를 포함하는, 방법.
23. 실시형태 17 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 약 15% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함하는, 방법.
24. rAAV 입자를 포함하는 치료 조성물로서, 이 때 rAAV 입자는 AAV 캡시드 단백질 및 관심 유전자 산물을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하고, 이 때 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 초과의 rAAV 입자를 포함하고, 치료 조성물은 약 15% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함하는, 치료 조성물.
25. 실시형태 24에 있어서, 관심 유전자 산물은 펩티드, 폴리펩티드, 억제성 핵산 또는 이들의 조합을 포함하는, 치료 조성물.
26. 실시형태 25에 있어서, 관심 유전자 산물은 GCase, GRN, PSAP, TREM2, ApoE2 또는 파킨을 포함하는, 치료 조성물.
27. 실시형태 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 이들 중 어느 하나의 변이체인 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 치료 조성물.
28. 실시형태 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL를 포함하는, 치료 조성물.
29. 실시형태 24 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 용기에 존재하는, 치료 조성물.
30. 실시형태 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 무균인, 치료 조성물.
31. 실시형태 30에 있어서, 치료 조성물은 미생물 성장을 촉진시키지 않는, 치료 조성물.
32. 실시형태 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 약 0.5 EU/mL 미만의 내독소 수준을 포함하는, 치료 조성물.
33. 실시형태 24 내지 32 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는, 치료 조성물.
34. 실시형태 24 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 약 1.0E+13 vg/mL 초과의 rAAV가 유전자 산물을 포함하는, 치료 조성물.
35. 실시형태 24 내지 34 중 어느 하나에 있어서, rAAV의 TCID50 역가는 약 1,000 vg/IU 내지 약 6,000 vg/IU인, 치료 조성물.
36. 실시형태 24 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 유전자 산물은 GCase인, 치료 조성물.
37. 실시형태 36에 있어서, GCase 활성은 참조 표준에 비해 적어도 110%이며, 이 때 참조 표준은 GCAse를 인코딩하는 정제된 rAAV인, 치료 조성물.
38. 실시형태 24 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 감염 역가는 약 8.0E+9 IU/mL 내지 약 1.2E+10 IU/mL인, 치료 조성물.
39. 실시형태 24 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 삼투질농도는 약 300 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg인, 치료 조성물.
40. 실시형태 24 내지 39 중 어느 하나에 있어서, pH는 약 7 내지 약 9인, 치료 조성물.
41. 실시형태 24 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물에 눈에 보이는 입자가 없는, 치료 조성물.
42. 실시형태 24 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 용기 당 약 10 μm보다 큰 약 6000개 미만의 입자, 및 용기 당 약 25 μm보다 큰 약 600개 미만의 입자를 포함하는, 치료 조성물.
43. 실시형태 24 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 약 3% 이하의 응집체를 포함하는, 치료 조성물.
44. 실시형태 24 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 약 300μg/mL 내지 약 1000μg/mL의 총 단백질 수준을 포함하는, 치료 조성물.
45. 실시형태 24 내지 44 중 어느 하나에 있어서, rAAV의 순도는 약 90% v/v 초과인, 치료 조성물.
46. 실시형태 45에 있어서, 치료 조성물은 약 5% v/v 초과의 임의의 단일 불순물을 포함하지 않는, 치료 조성물.
47. 실시형태 24 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 약 0.0007% 내지 약 0.0012%의 플루로닉을 포함하는, 치료 조성물.
48. 실시형태 24 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 약 5.5 x 104 사본 미만의 RNA/mL의 랍도바이러스를 포함하는, 치료 조성물.
49. 실시형태 24 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 용기 내 치료 조성물의 추출 가능한 부피는 약 1.0mL 이상인, 치료 조성물.
표 34: 서열 표
Figure pct00038
_
Figure pct00039
Figure pct00040
SEQUENCE LISTING <110> Prevail Therapeutics, Inc. Dai, Yong Zhou, Jingmin Daniels, Garrett Chan, Jonathan Haller, Jorge Nelson, Stuart <120> RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING SAME <130> PRVL-013/01WO 334806-2132 <150> US 63/092,179 <151> 2020-10-15 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 536 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Phe Ser Ser Pro Ser Arg Glu Glu Cys Pro Lys Pro Leu Ser 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln 20 25 30 Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe 35 40 45 Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser 50 55 60 Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu 65 70 75 80 Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln 85 90 95 Ala Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln 100 105 110 Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val 145 150 155 160 Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp 165 170 175 Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp 180 185 190 Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln 195 200 205 Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu 210 215 220 Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro 225 230 235 240 Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu 245 250 255 Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu 260 265 270 Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu 275 280 285 Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly 290 295 300 Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu 305 310 315 320 Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr 325 330 335 Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr 340 345 350 Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg 355 360 365 Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser 370 375 380 Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met 385 390 395 400 Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly 405 410 415 Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp 420 425 430 Val Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp 435 440 445 Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys 450 455 460 Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys 465 470 475 480 Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val 485 490 495 Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys 500 505 510 Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile 515 520 525 His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln 530 535 <210> 2 <211> 1608 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized Glucocerebrosidase <400> 2 atggaattca gcagccccag cagagaggaa tgccccaagc ctctgagccg ggtgtcaatc 60 atggccggat ctctgacagg actgctgctg cttcaggccg tgtcttgggc ttctggcgct 120 agaccttgca tccccaagag cttcggctac agcagcgtcg tgtgcgtgtg caatgccacc 180 tactgcgaca gcttcgaccc tcctaccttt cctgctctgg gcaccttcag cagatacgag 240 agcaccagat ccggcagacg gatggaactg agcatgggac ccatccaggc caatcacaca 300 ggcactggcc tgctgctgac actgcagcct gagcagaaat tccagaaagt gaaaggcttc 360 ggcggagcca tgacagatgc cgccgctctg aatatcctgg ctctgtctcc accagctcag 420 aacctgctgc tcaagagcta cttcagcgag gaaggcatcg gctacaacat catcagagtg 480 cccatggcca gctgcgactt cagcatcagg acctacacct acgccgacac acccgacgat 540 ttccagctgc acaacttcag cctgcctgaa gaggacacca agctgaagat ccctctgatc 600 cacagagccc tgcagctggc acaaagaccc gtgtcactgc tggcctctcc atggacatct 660 cccacctggc tgaaaacaaa tggcgccgtg aatggcaagg gcagcctgaa aggccaacct 720 ggcgacatct accaccagac ctgggccaga tacttcgtga agttcctgga cgcctatgcc 780 gagcacaagc tgcagttttg ggccgtgaca gccgagaacg aaccttctgc tggactgctg 840 agcggctacc cctttcagtg cctgggcttt acacccgagc accagcggga ctttatcgcc 900 cgtgatctgg gacccacact ggccaatagc acccaccata atgtgcggct gctgatgctg 960 gacgaccaga gactgcttct gccccactgg gctaaagtgg tgctgacaga tcctgaggcc 1020 gccaaatacg tgcacggaat cgccgtgcac tggtatctgg actttctggc ccctgccaag 1080 gccacactgg gagagacaca cagactgttc cccaacacca tgctgttcgc cagcgaagcc 1140 tgtgtgggca gcaagttttg ggaacagagc gtgcggctcg gcagctggga tagaggcatg 1200 cagtacagcc acagcatcat caccaacctg ctgtaccacg tcgtcggctg gaccgactgg 1260 aatctggccc tgaatcctga aggcggccct aactgggtcc gaaacttcgt ggacagcccc 1320 atcatcgtgg acatcaccaa ggacaccttc tacaagcagc ccatgttcta ccacctggga 1380 cacttcagca agttcatccc cgagggctct cagcgcgttg gactggtggc ttcccagaag 1440 aacgatctgg acgccgtggc tctgatgcac cctgatggat ctgctgtggt ggtggtcctg 1500 aaccgcagca gcaaagatgt gcccctgacc atcaaggatc ccgccgtggg attcctggaa 1560 acaatcagcc ctggctactc catccacacc tacctgtggc gtagacag 1608 <210> 3 <211> 593 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Trp Thr Leu Val Ser Trp Val Ala Leu Thr Ala Gly Leu Val Ala 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Pro Asp Gly Gln Phe Cys Pro Val Ala Cys Cys Leu 20 25 30 Asp Pro Gly Gly Ala Ser Tyr Ser Cys Cys Arg Pro Leu Leu Asp Lys 35 40 45 Trp Pro Thr Thr Leu Ser Arg His Leu Gly Gly Pro Cys Gln Val Asp 50 55 60 Ala His Cys Ser Ala Gly His Ser Cys Ile Phe Thr Val Ser Gly Thr 65 70 75 80 Ser Ser Cys Cys Pro Phe Pro Glu Ala Val Ala Cys Gly Asp Gly His 85 90 95 His Cys Cys Pro Arg Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Arg Ser Cys 100 105 110 Phe Gln Arg Ser Gly Asn Asn Ser Val Gly Ala Ile Gln Cys Pro Asp 115 120 125 Ser Gln Phe Glu Cys Pro Asp Phe Ser Thr Cys Cys Val Met Val Asp 130 135 140 Gly Ser Trp Gly Cys Cys Pro Met Pro Gln Ala Ser Cys Cys Glu Asp 145 150 155 160 Arg Val His Cys Cys Pro His Gly Ala Phe Cys Asp Leu Val His Thr 165 170 175 Arg Cys Ile Thr Pro Thr Gly Thr His Pro Leu Ala Lys Lys Leu Pro 180 185 190 Ala Gln Arg Thr Asn Arg Ala Val Ala Leu Ser Ser Ser Val Met Cys 195 200 205 Pro Asp Ala Arg Ser Arg Cys Pro Asp Gly Ser Thr Cys Cys Glu Leu 210 215 220 Pro Ser Gly Lys Tyr Gly Cys Cys Pro Met Pro Asn Ala Thr Cys Cys 225 230 235 240 Ser Asp His Leu His Cys Cys Pro Gln Asp Thr Val Cys Asp Leu Ile 245 250 255 Gln Ser Lys Cys Leu Ser Lys Glu Asn Ala Thr Thr Asp Leu Leu Thr 260 265 270 Lys Leu Pro Ala His Thr Val Gly Asp Val Lys Cys Asp Met Glu Val 275 280 285 Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Ser Gly Ala Trp 290 295 300 Gly Cys Cys Pro Phe Thr Gln Ala Val Cys Cys Glu Asp His Ile His 305 310 315 320 Cys Cys Pro Ala Gly Phe Thr Cys Asp Thr Gln Lys Gly Thr Cys Glu 325 330 335 Gln Gly Pro His Gln Val Pro Trp Met Glu Lys Ala Pro Ala His Leu 340 345 350 Ser Leu Pro Asp Pro Gln Ala Leu Lys Arg Asp Val Pro Cys Asp Asn 355 360 365 Val Ser Ser Cys Pro Ser Ser Asp Thr Cys Cys Gln Leu Thr Ser Gly 370 375 380 Glu Trp Gly Cys Cys Pro Ile Pro Glu Ala Val Cys Cys Ser Asp His 385 390 395 400 Gln His Cys Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Cys Val Ala Glu Gly Gln Cys 405 410 415 Gln Arg Gly Ser Glu Ile Val Ala Gly Leu Glu Lys Met Pro Ala Arg 420 425 430 Arg Ala Ser Leu Ser His Pro Arg Asp Ile Gly Cys Asp Gln His Thr 435 440 445 Ser Cys Pro Val Gly Gln Thr Cys Cys Pro Ser Leu Gly Gly Ser Trp 450 455 460 Ala Cys Cys Gln Leu Pro His Ala Val Cys Cys Glu Asp Arg Gln His 465 470 475 480 Cys Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Cys Asn Val Lys Ala Arg Ser Cys Glu 485 490 495 Lys Glu Val Val Ser Ala Gln Pro Ala Thr Phe Leu Ala Arg Ser Pro 500 505 510 His Val Gly Val Lys Asp Val Glu Cys Gly Glu Gly His Phe Cys His 515 520 525 Asp Asn Gln Thr Cys Cys Arg Asp Asn Arg Gln Gly Trp Ala Cys Cys 530 535 540 Pro Tyr Arg Gln Gly Val Cys Cys Ala Asp Arg Arg His Cys Cys Pro 545 550 555 560 Ala Gly Phe Arg Cys Ala Ala Arg Gly Thr Lys Cys Leu Arg Arg Glu 565 570 575 Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu 580 585 590 Leu <210> 4 <211> 1779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized Progranulin <400> 4 atgtggaccc tggtgagctg ggtggccctg accgccggcc tggtggccgg cacccgctgc 60 cccgacggcc agttctgccc cgtggcctgc tgcctggacc ccggcggcgc cagctacagc 120 tgctgccgcc ccctgctgga caagtggccc accaccctga gccgccacct gggcggcccc 180 tgccaggtgg acgcccactg cagcgccggc cacagctgca tcttcaccgt gagcggcacc 240 agcagctgct gccccttccc cgaggccgtg gcctgcggcg acggccacca ctgctgcccc 300 cgcggcttcc actgcagcgc cgacggccgc agctgcttcc agcgcagcgg caacaacagc 360 gtgggcgcca tccagtgccc cgacagccag ttcgagtgcc ccgacttcag cacctgctgc 420 gtgatggtgg acggcagctg gggctgctgc cccatgcccc aggccagctg ctgcgaggac 480 cgcgtgcact gctgccccca cggcgccttc tgcgacctgg tgcacacccg ctgcatcacc 540 cccaccggca cccaccccct ggccaagaag ctgcccgccc agcgcaccaa ccgcgccgtg 600 gccctgagca gcagcgtgat gtgccccgac gcccgcagcc gctgccccga cggcagcacc 660 tgctgcgagc tgcccagcgg caagtacggc tgctgcccca tgcccaacgc cacctgctgc 720 agcgaccacc tgcactgctg cccccaggac accgtgtgcg acctgatcca gagcaagtgc 780 ctgagcaagg agaacgccac caccgacctg ctgaccaagc tgcccgccca caccgtgggc 840 gacgtgaagt gcgacatgga ggtgagctgc cccgacggct acacctgctg ccgcctgcag 900 agcggcgcct ggggctgctg ccccttcacc caggccgtgt gctgcgagga ccacatccac 960 tgctgccccg ccggcttcac ctgcgacacc cagaagggca cctgcgagca gggcccccac 1020 caggtgccct ggatggagaa ggcccccgcc cacctgagcc tgcccgaccc ccaggccctg 1080 aagcgcgacg tgccctgcga caacgtgagc agctgcccca gcagcgacac ctgctgccag 1140 ctgaccagcg gcgagtgggg ctgctgcccc atccccgagg ccgtgtgctg cagcgaccac 1200 cagcactgct gcccccaggg ctacacctgc gtggccgagg gccagtgcca gcgcggcagc 1260 gagatcgtgg ccggcctgga gaagatgccc gcccgccgcg ccagcctgag ccacccccgc 1320 gacatcggct gcgaccagca caccagctgc cccgtgggcc agacctgctg ccccagcctg 1380 ggcggcagct gggcctgctg ccagctgccc cacgccgtgt gctgcgagga ccgccagcac 1440 tgctgccccg ccggctacac ctgcaacgtg aaggcccgca gctgcgagaa ggaggtggtg 1500 agcgcccagc ccgccacctt cctggcccgc agcccccacg tgggcgtgaa ggacgtggag 1560 tgcggcgagg gccacttctg ccacgacaac cagacctgct gccgcgacaa ccgccagggc 1620 tgggcctgct gcccctaccg ccagggcgtg tgctgcgccg accgccgcca ctgctgcccc 1680 gccggcttcc gctgcgccgc ccgcggcacc aagtgcctgc gccgcgaggc cccccgctgg 1740 gacgcccccc tgcgcgaccc cgccctgcgc cagctgctg 1779 <210> 5 <211> 145 <212> DNA <213> Dependoparvovirus Adeno-associated virus 2 <400> 5 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV9-GBA1 specific primer <400> 6 gactgtggga tccgttcgaa 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV9-GBA1 specific primer <400> 7 gattgacacc cggctcaga 19 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV9-GBA1 specific probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 6-FAM fluorescent dye attached <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> TAMRA fluorescent dye attached <400> 8 ccatggaatt cagcagcccc agc 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV9-GRN specific primer <400> 9 gtcttccacg actgtgggat 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV9-GRN specific primer <400> 10 gtcagggcca cccagctc 18 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV9-GRN specific probe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 6-FAM fluorescent dye attached <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> TAMRA fluorescent dye attached <400> 11 ccggttgagc caccatgtgg accc 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inhibitory nucleic acid targeting alpha-synuclein <400> 12 tggaagactt cgagatacac tgt 23

Claims (49)

  1. 세포 용해물의 제조 방법으로서,
    (i) 2개 이상의 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 세포 배양 배지를 포함하는 혼합물에 현탁된 곤충 세포를 함유하는 생물반응기를 얻는 단계;
    (ii) 곤충 세포를 배큘로바이러스 벡터의 제1 집단으로 약 1.0 내지 2.0의 감염 다중도(MOI)로 감염시키는 단계(이 때 배큘로바이러스 벡터의 제1 집단은 관심 유전자 산물을 인코딩하는 발현 카세트를 포함함);
    (iii) 곤충 세포를 배큘로바이러스 벡터의 하나 이상의 추가 집단으로 약 1.0 내지 2.0의 MOI로 감염시키고, 이 때 추가 집단은 각각 AAV Rep 단백질 및/또는 AAV Cap 단백질을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하고;
    (iv) 감염된 곤충 세포가 관심 유전자를 인코딩하는 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV) 입자를 생산하는 조건 하에서 감염된 곤충 세포를 배양하는 단계; 및
    (v) 감염된 곤충 세포를 용해시켜 rAAV 입자를 포함하는 세포 용해물을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에서, 2개 이상의 무혈청 및/또는 무단백질 곤충 배양 배지 각각은 4셀 곤충 CD 배지, ESF-921, ESF-AF, ExpiSf CD 배지, Express Five SFM, baculoGROW, IS SF, 및 SF900 II SFM으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에서, 혼합물은 약 10% v/v 내지 약 50% v/v의 SF900 II SFM 배지를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 곤충 세포는 마스터 씨드 트레인의 4-6회 계대 후에 얻어지는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)의 감염 및 (iii)의 감염이 동시에 발생하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 mL당 8E+06 생존 세포(vc/mL) 내지 약 20E+06 vc/mL의 세포 밀도로 생물반응기에 존재하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (iv)의 배양이 1일 내지 5일 동안 일어나는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (v)의 용해는 감염된 곤충 세포를 세제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 여과에 의해 세포 용해물을 정화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물의 rAAV 입자를 접선 유동 여과 및/또는 정용여과에 의해 농축시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 유전자 산물은 펩티드, 폴리펩티드, 억제성 핵산 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 관심 유전자 산물은 글루코세레브로시다제(GCase), 프로그래눌린(PGRN), 프로사포신(PSAP), C9orf72, 골수 세포 2(TREM2)에서 발현된 촉발 수용체, 아포지단백 E2(ApoE2) 또는 파킨을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 이들 중 어느 하나의 변이체인 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 용해물은
    (a) 밀리리터 당 약 1E+11 바이러스 게놈(vg/mL) 내지 약 1.0E+13 vg/mL;
    (b) 약 2E+11 vg/mL 내지 약 1.0E+13 vg/mL; 또는
    (c) 약 5E+11 vg/mL 내지 약 1.0E+13 vg/mL를 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포 용해물을 포함하는 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 동결 방지제를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  17. 치료 조성물의 생산 방법으로서, 이 방법은:
    (i) rAAV 입자를 포함하는 세포 용해물을 얻는 단계;
    (ii) 친화성 크로마토그래피 컬럼을 세포 용해물과 접촉시키는 단계(이 때, 친화성 컬럼은 rAAV 입자가 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하는 조건 하에서 rAAV 입자의 캡시드 단백질에 특이적인 결합제를 포함함);
    (iii) 결합된 rAAV 입자를 컬럼으로부터 용출하여 1차 용출액을 생산하는 단계;
    (iv) 1차 용출액에 대해 음이온-교환 크로마토그래피를 수행하여 2차 용출액을 생산하는 단계(이 때 2차 용출액은 1차 용출액보다 더 적은 수의 빈 rAAV 입자를 포함함);
    (v) 트리스, MgCl2, NaCl 및 폴록사머 188을 포함하는 유동 완충액을 사용하여 접선 유동 여과를 수행하여 2차 용출액을 농축함으로써, rAAV 입자를 포함하는 치료 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 치료 조성물의 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서, (i)의 세포 용해물은 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되는, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 결합제는 AAV9 캡시드 단백질에 특이적인 친화성 수지를 포함하는, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온-교환 크로마토그래피는 1차 용출액을 평형화 완충액과 혼합하여 약 0.5 mS/cm 내지 5 mS/cm의 전도도를 갖는 혼합물을 생산하는 단계(선택적으로 이 때 혼합물은 2 mS/cm의 전도도를 가짐), 혼합물을 4차 아민-함유 수지에 결합시켜 혼합물 내의 rAAV 입자를 수지에 결합시키는 단계, 그리고 rAAV 입자를 수지로부터 용출시켜 2차 용출액을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 용출액은 약 1.0E+12 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL로 농축되는, 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL를 포함하는, 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조성물은 약 15% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함하는, 방법.
  24. rAAV 입자를 포함하는 치료 조성물로서, 이 때 rAAV 입자는 AAV 캡시드 단백질 및 관심 유전자 산물을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하고, 이 때 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 초과의 rAAV 입자를 포함하고, 치료 조성물은 약 15% 미만의 빈 rAAV 입자를 포함하는, 치료 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 관심 유전자 산물은 펩티드, 폴리펩티드, 억제성 핵산 또는 이들의 조합을 포함하는, 치료 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 관심 유전자 산물은 GCase, GRN, PSAP, TREM2, ApoE2 또는 파킨을 포함하는, 치료 조성물.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 이들 중 어느 하나의 변이체인 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 치료 조성물.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조성물은 약 1E+13 vg/mL 내지 약 1E+14 vg/mL를 포함하는, 치료 조성물.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조성물은 용기에 존재하는, 치료 조성물.
  30. 실시형태 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 치료 조성물은 무균인, 치료 조성물.
  31. 실시형태 30에 있어서, 치료 조성물은 미생물 성장을 촉진시키지 않는, 치료 조성물.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.5 EU/mL 미만의 내독소 수준을 포함하는, 치료 조성물.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는, 치료 조성물.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1.0E+13 vg/mL 초과의 rAAV가 유전자 산물을 포함하는, 치료 조성물.
  35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV의 TCID50 역가는 약 1,000 vg/IU 내지 약 6,000 vg/IU인, 치료 조성물.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 산물은 GCase인, 치료 조성물.
  37. 제36항에 있어서, GCase 활성은 참조 표준에 비해 적어도 110%이며, 이 때 참조 표준은 GCAse를 인코딩하는 정제된 rAAV인, 치료 조성물.
  38. 제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 감염 역가는 약 8.0E+9 IU/mL 내지 약 1.2E+10 IU/mL인, 치료 조성물.
  39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투질농도는 약 300 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg인, 치료 조성물.
  40. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, pH는 약 7 내지 약 9인, 치료 조성물.
  41. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조성물에는 눈에 보이는 입자가 없는, 치료 조성물.
  42. 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조성물은 용기 당 약 10 μm보다 큰 약 6000개 미만의 입자, 및 용기 당 약 25 μm보다 큰 약 600개 미만의 입자를 포함하는, 치료 조성물.
  43. 제24항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3% 이하의 응집체를 포함하는, 치료 조성물.
  44. 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조성물은 약 300μg/mL 내지 약 1000μg/mL의 총 단백질 수준을 포함하는, 치료 조성물.
  45. 제24항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV의 순도는 약 90% v/v 초과인, 치료 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 치료 조성물은 약 5% v/v 초과의 임의의 단일 불순물을 포함하지 않는, 치료 조성물.
  47. 제24항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조성물은 약 0.0007% 내지 약 0.0012%의 플루로닉(Pluronic)을 포함하는, 치료 조성물.
  48. 제24항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조성물은 약 5.5 x 104 사본 미만의 RNA/mL의 랍도바이러스를 포함하는, 치료 조성물.
  49. 제24항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 내 치료 조성물의 추출 가능한 부피는 약 1.0mL 이상인, 치료 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2024076940A1 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Eli Lilly And Company Gene therapy for trem2-associated diseases and disorders
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US20240209415A1 (en) * 2022-12-06 2024-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Droplet digital pcr assay for determining viral vector genomic titer

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2664505T3 (es) 2001-12-17 2018-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Secuencias de serotipo 9 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen, y usos de las mismas
WO2007084773A2 (en) * 2006-01-20 2007-07-26 University Of North Carolina At Chapel Hill Enhanced production of infectious parvovirus vectors in insect cells
IN2012DN06629A (ko) * 2010-01-28 2015-10-23 Philadelphia Children Hospital
CN106916793B (zh) * 2015-12-24 2019-01-15 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种重组腺相关病毒的制备方法及重组杆状病毒
US20200316221A1 (en) * 2016-10-13 2020-10-08 University Of Massachusetts Aav capsid designs
CN111542549A (zh) * 2017-10-03 2020-08-14 普利维尔治疗公司 用于溶酶体障碍的基因疗法
CA3078501A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
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