JP2022514082A - アポトーシスに耐性のある細胞株を使用してポリペプチドを生成する方法 - Google Patents

Abstract

ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含む細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株）、ならびに該細胞株を含む細胞培養物が本明細書で提供される。該細胞株および／または細胞培養物は、例えば、組換えポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）またはウイルスベクターを生成するための方法において用途を見出すことができる。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１８年１２月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／７８４，０５１号に対する優先権利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

本開示は、組換えポリペプチドまたはウイルスベクターを生成する方法、ならびに例えば、前記方法において用途を見出し得る細胞株および細胞培養物に関する。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）および他の組換えタンパク質は、免疫学、腫瘍学、神経科学などを含む多くの疾患適応症のための成功した治療薬として確立されている（例えば、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（２０１７）ｍＡｂｓ．９：１６７－１８１；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｕｒｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３：８５－９９を参照されたい）。バイオテクノロジー産業において３００を超えるｍＡｂが開発中であり、ｍＡｂ市場は２０２０年までに７０ ｍＡｂ製品に拡大すると予測されている（Ｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ｍＡｂｓ．７：９－１４）。業界が拡大し、標的がより複雑になるにつれて、多数のｍＡｂ変異体をスクリーニングし、所望の特徴を有する臨床候補を同定するために、より大きな抗体発見キャンペーンが必要とされる。

カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いた哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションは、抗体発見スクリーニング研究を含む、大分子開発のための組換えタンパク質を迅速に生成する一般的な方法となっている（Ｂａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９：６７７－６８４；Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．９２：６７－７６；Ｓｔｕｉｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８１：３９－４７；Ｌｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５２９：２２７－２４０；Ｒａｊｅｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３１：５４１－５４９）。ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）宿主細胞 およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞は、高度にトランスフェクト可能であり、それらのトランスフェクションプロセスはスケーラブルであるので、一過性トランスフェクションにしばしば使用される。

ＨＥＫ２９３の生成物の品質は、ＣＨＯ細胞由来のものと比較して異なり得るが（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０１：１８８９－１８９８）、ＨＥＫ２９３のトランスフェクションはＣＨＯと比較して半分の時間でより高い力価を生成することができ（Ｄｅｌａｆｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２７：１０３－１１１；Ｃｈｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｓｃａｌａｂｌｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．：Ｐoｒｔｎｅｒ ｅｄｉｔｏｒ．Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．ｐ．３５－５５）、ハイスループットの自動化された小規模トランスフェクションに非常に適している（Ｖｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５－１０；Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８０：１０－１６；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７５：２０９－２１５；Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．７：１１７－１１９；Ｒａｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ５５：４４－５１；Ｎｅｔｔｅｌｓｈｉｐ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７２：５５－６５）。ＣＨＯの大規模バイオリアクター培養およびトランスフェクションについて記載した多数の報告があるが、ＨＥＫ２９３細胞については存在する所見が少なく、現在、大量のタンパク質を生産するための日常的なハイスループットトランスフェクションを支援するための、バイオリアクターにおける長期培養のＨＥＫ２９３のシードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）に関する報告はない。

特許出願、特許公報、およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、各個々の参考文献が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

組換えポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを生成するために、ＨＥＫ２９３由来細胞株などのヒト細胞株を培養するための最適な方法が依然として必要とされている。特に、ＨＥＫ２９３細胞は、バイオリアクター内で培養した場合、剪断応力に対して感受性であり、生存率が低いことが見出されており、スピナーフラスコ（Ｍｏｈｄ Ｚｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ：Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ ３：１－５）および中空糸フィルター（Ｒｏｃｋｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｉｎ ａｎ ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＨＥＫ ２９３ ｃｅｌｌｓ．Ｐａｐｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ：Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＸＶＩ．Ｔａｍｐａ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）においても剪断応力に対してＨＥＫ２９３培養物が感受性であることが報告されている。したがって、バイオリアクターにおいてより高い生産性およびより堅牢な性能を提供するために、アポトーシスに対する耐性を有するＨＥＫ２９３細胞株が必要とされている。

これらの要求および他の要求を満たすために、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含むＨＥＫ２９３細胞株が本明細書で提供される。有利には、これらの細胞株およびその培養物は、限定するものではないが、抗体（または抗原結合抗体断片）、抗原、酵素、ワクチンおよびウイルスベクターを含む組換えポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド生成物の生成に使用を見出すことができる。

一態様では、組換えポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれにおける機能喪失変異と、（ｂ）組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、を含むＨＥＫ２９３細胞株を、該ポリペプチドの生成に適した条件下で培養することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは染色体外ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＨＥＫ２９３細胞株の染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体もしくはその抗原結合断片、抗原、酵素、またはワクチンである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片（例えば、診断用または治療用の抗体またはその抗原結合断片）である。いくつかの実施形態では、細胞株は、７日間で約６５０ｍｇ／Ｌの力価で組換えポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞株から組換えポリペプチドを単離することをさらに含む。

別の態様では、ウイルスベクターを生成する方法であって、（ａ）ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれにおける機能喪失変異、（ｂ）ウイルスゲノム、ならびに（ｃ）ウイルスキャプシドをコードする１種以上のポリヌクレオチド、を含むＨＥＫ２９３細胞株を、該ウイルスベクターの生成に適した条件下で培養することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞株からウイルスベクターを単離することをさらに含む。

上記実施形態のいずれかのうちのいくつかの実施形態では、細胞株は細胞培養培地において培養される。いくつかの実施形態では、細胞株は、約６．７～約７．３、約６．９～約７．１、約６．９５～約７．０５、または約７．０のｐＨにおいて培養される。いくつかの実施形態では、細胞株は、溶存酸素（ＤＯ）設定値約３０％で培養される。いくつかの実施形態では、細胞株は、約１３Ｗ／ｍ^３の体積当たりの電力入力（ｐｏｗｅｒ ｉｎｐｕｔ ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ）（Ｐ／Ｖ）を付与する撹拌速度で培養される。いくつかの実施形態では、細胞株は、少なくとも約１０Ｌの体積で培養される。いくつかの実施形態では、細胞株は、少なくとも約２５Ｌの体積で培養される。いくつかの実施形態では、細胞株は３５Ｌバイオリアクターで培養される。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞株を３５Ｌバイオリアクター内で６０日間培養することを含む。いくつかの実施形態では、細胞株は、細胞株を３５Ｌバイオリアクターでの６０日間の培養後、少なくとも８５％の細胞生存率を維持する。いくつかの実施形態では、細胞株は、約２０Ｌ～約３５Ｌの作業体積で３５Ｌバイオリアクター内で培養される。いくつかの実施形態では、細胞株は流加培養条件下で培養される。いくつかの実施形態では、細胞株は灌流培養条件下で培養される。

別の態様では、細胞培養培地と、各細胞がヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含む複数のＨＥＫ２９３細胞と、を含む細胞培養物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、３５Ｌバイオリアクター培養に十分な細胞密度である。いくつかの実施形態では、細胞は、３５Ｌバイオリアクター培養に十分な細胞密度で、６０日間維持される。いくつかの実施形態では、細胞株は、細胞株を３５Ｌバイオリアクター培養での６０日間の培養後、少なくとも８５％の細胞生存率を維持する。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、２．６７×１０^７Ｗ／ｍ^３のエネルギー散逸速度（ＥＤＲ）の剪断応力への曝露後、７５％を超える細胞生存率を維持する。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、１μＭスタウロスポリンへの７０時間の曝露後、７５％を超える細胞生存率を維持する。いくつかの実施形態では、複数の細胞は各々、Ｂａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む。いくつかの実施形態では、細胞株は、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは染色体外ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト細胞株の染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体もしくはその抗原結合断片、抗原、酵素、またはワクチンである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片（例えば、診断用または治療用の抗体またはその抗原結合断片）である。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、７日間で約６５０ｍｇ／Ｌの力価で組換えポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、細胞株は、組換えポリヌクレオチドをさらに含む。

別の態様では、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含むＨＥＫ２９３細胞株（例えば、単離されたＨＥＫ２９３細胞株）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む。いくつかの実施形態では、細胞株は、ウイルスゲノムと、ウイルスキャプシドをコードする１種以上のポリヌクレオチドとをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞株は、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは染色体外ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト細胞株の染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体もしくはその抗原結合断片、抗原、酵素、またはワクチンである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片（例えば、診断用または治療用の抗体またはその抗原結合断片）である。いくつかの実施形態では、細胞株は、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれのポリヌクレオチドおよび機能的コピーを含む対応する単離されたヒト細胞株よりも高い力価の組換えポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、細胞株は、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離されたヒト細胞株よりも剪断応力に対して耐性である。いくつかの実施形態では、細胞株は、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離されたヒト細胞株よりもアポトーシスに対して耐性である。いくつかの実施形態では、細胞株は、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離されたヒト細胞株よりもスタウロスポリンに対して耐性である。

別の態様では、上記実施形態のいずれか１つに記載の細胞株と、細胞培養培地とを含む細胞培養物が本明細書で提供される。

本明細書において説明される種々の実施形態の特性のうちの１つ、一部、または全てが、組み合わされて、本開示の他の実施形態を形成し得るということが理解されるものとする。本開示のこれらの実施形態および他の態様は、当業者には明らかとなると思われる。本開示のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態によってさらに説明される。

ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞株（実施例１に記載のようにＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子をノックアウトしたもの））と、親ＨＥＫ２９３細胞株との比較の図。図１Ａは、細胞株を１μＭスタウロスポリンへ曝露して、アポトーシスを誘導した後の細胞生存率を示す図。図１Ｂ～１Ｄは、ＤＫＯおよび親細胞株の剪断応力に対する感受性を評価するために、流動制限装置（ｆｌｏｗ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）（ＦＣＤ）を使用したことの効果を、ＦＣＤ後の全溶解（図１Ｂ）、ＦＣＤ前後の生細胞密度（ＶＣＤ）（図１Ｃ）、およびＦＣＤ前後の生存率（図１Ｄ）について示す図。

ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ一過性トランスフェクションのＮ：Ｐ比およびＤＮＡ濃度の最適化を示す図。トランスフェクションを、Ｎ：Ｐ比５～１２．５およびＤＮＡ濃度０．７５～１．５μｇ／ｍＬにわたって試験した（図２Ａ）。図２Ｂおよび図２Ｃは、３０ｍＬのチューブスピンスケールでＮ：Ｐ比７．５およびＤＮＡ濃度１μｇ／ｍＬでＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞をトランスフェクトすることの、７日間の生成培養物にわたる生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率に対する効果（図２Ｂ）、ならびに７日目の力価（図２Ｃ）を示す。

１Ｌ振盪フラスコから制御された２ＬバイオリアクターへのＨＥＫ２９３ ＤＫＯシードトレインのスケールアップの効果を示す図。バイオリアクター＃１：ｐＨ設定値７、不感帯±０．０３およびＤＯ設定値３０％。バイオリアクター＃２：ｐＨ設定値７、不感帯±０．４、およびＤＯ設定値６０％。１Ｌ振盪フラスコおよび２Ｌバイオリアクターを３～４日ごとに２５日間継代させる。（図３Ａ）生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率、（図３Ｂ）グルコースおよび乳酸、（図３Ｃ）オフラインｐＨ、ならびに（図３Ｄ）ｐＯ_２。（図３Ｅ）３０ｍＬチューブスピンからの７日目のトランスフェクション力価。

１Ｌ振盪フラスコから制御された３５ＬバイオリアクターへのＨＥＫ２９３ ＤＫＯシードトレインのスケールアップを示す図。１Ｌ振盪フラスコおよび３５Ｌバイオリアクターを３～４日ごとに６０日間継代させた。（図４Ａ）生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率、（図４Ｂ）グルコースおよび乳酸、ならびに（図４Ｃ）オフラインｐＨ。（図４Ｄ）３０ｍＬチューブスピンからの７日目のトランスフェクション力価。

１Ｌ振盪フラスコおよび３５Ｌバイオリアクターシードトレインから供給された細胞を使用して、６０日間にわたって３０ｍＬチューブスピンでＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞をトランスフェクトした後の７日目の生成物品質属性を示す図。グリコシル化種：（図４Ｅ）解析されたグリコシル化種、（図４Ｆ）Ｇ０Ｆ、（図４Ｇ）Ｇ１Ｆ、（図４Ｈ）Ｇ２Ｆ、（図４Ｉ）Ｇ０、および（図４Ｌ）Ｍ５。電荷変異体（図４Ｊ）酸性種、（図４Ｍ）主要種、および（図４Ｋ）塩基性種。サイズ変異体：（図４Ｎ）高分子量種（ＨＭＷＳ）。

３０ｍＬ振盪フラスコと比較した、制御されたａｍｂｒ１５バイオリアクターにおけるＨＥＫ２９３ ＤＫＯ一過性トランスフェクションの結果を示す図。（図５Ａ）７日間の生成培養物にわたる、生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率、（図５Ｂ）グルコースおよび乳酸、（図５Ｃ）浸透圧およびｐＨ、（図５Ｄ）ｐＯ_２、ならびに（図５Ｅ）力価。

３０ｍＬチューブスピンから１０Ｌウェーブバッグへの、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ一過性トランスフェクションのスケールアップの結果を示す図。（図６Ａ）７日間の生成培養物にわたる、生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率、（図６Ｂ）グルコースおよび乳酸、（図６Ｃ）浸透圧およびｐＨ、ならびに（図６Ｄ）ｐＯ_２。（図６Ｅ）７日目の力価。

本開示は、アポトーシスおよび剪断応力に対する耐性が改善された細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株）を提供する。これらの細胞株は、バイオリアクター（例えば、シードトレインバイオリアクター）において堅牢な性能を示し、撹拌タンクバイオリアクターにおける３５Ｌパイロットスケールでのヒト細胞株の長期培養または１０Ｌウェーブバッグバイオリアクターにおける生成の改善を可能にすることが実証された。したがって、本開示の細胞株は、例えば、細胞培養および細胞培養の方法（例えば、組換えポリヌクレオチド、組換えポリペプチドおよびウイルスベクター生成の方法）において用途を見出すことができる。

一態様では、組換えポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれにおける機能喪失変異と、（ｂ）組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、を含むＨＥＫ２９３細胞株を、該ポリペプチドの生成に適した条件下で培養することを含む方法が本明細書で提供される。

別の態様では、ウイルスベクターを生成する方法であって、（ａ）ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれにおける機能喪失変異、（ｂ）ウイルスゲノム、ならびに（ｃ）ウイルスキャプシドをコードする１種以上のポリヌクレオチド、を含むＨＥＫ２９３細胞株を、該ウイルスベクターの生成に適した条件下で培養することを含む方法が本明細書で提供される。

別の態様では、細胞培養培地と、各細胞がヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含む複数のＨＥＫ２９３細胞と、を含む細胞培養物が本明細書で提供される。

別の態様では、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含むＨＥＫ２９３細胞株（例えば、単離されたＨＥＫ２９３細胞株）が本明細書で提供される。
Ｉ．定義

本開示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物または生体系に限定されず、言うまでもなく多様であり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、必要に応じて２つ以上のそのような分子の組合せを含む。

本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者であれば容易に理解する、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」が付く値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。値に関して本明細書で使用される「約」という用語は、最大でその値の９０％～１１０％を包含する（例えば、約１．０～約３．０の第１および第２のＴＩＲの相対的翻訳強度は、０．９～３．３の範囲にある相対的翻訳強度を指す）。

本明細書に記載される本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、態様および実施形態「からなる」、ならびに態様および実施形態「から本質的になる」を含むことを理解されたい。

「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形または複数形で使用されるとき、一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡであっても、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。したがって、例えば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドとしては、限定するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖、もしくはより典型的には二本鎖であってもよく、または一本鎖領域および二本鎖領域を含んでいてもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。このような領域内の鎖は、同じ分子由来であっても、または異なる分子由来であってもよい。これらの領域は、これらの分子のうちの１種以上の全てを含み得るが、より典型的には、これらの分子のうちのいくつかの領域のみを含む。三重らせん領域の分子のうちの１つは、多くの場合、オリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的には、ｃＤＮＡを含む。この用語は、１種以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、骨格が安定性または他の理由のために修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡが、本明細書で意図される用語としての「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどのまれな塩基、またはトリチウム化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡが、本明細書で定義される「ポリヌクレオチド」という用語に含まれる。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は、修飾されていないポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的、および／または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞（単純細胞および複雑細胞など）のＤＮＡおよびＲＮＡの特徴的化学形態を包含する。

「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、本明細書において同義に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に修飾された、または介入により、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分もしくは毒素とのコンジュゲーションにより修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１種以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドもまたこの定義に含まれる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、具体的には抗体を包含する。

遺伝子内の「機能喪失変異」とは、対応する遺伝子産物の１種以上の機能を低減または排除する、遺伝子内の遺伝子操作または変異（例えば、置換、欠失、挿入、重複、フレームシフトまたは転座）を指す。いくつかの実施形態では、機能喪失変異は、対応する遺伝子産物の１種以上の機能を排除するヌル変異、例えば、コード配列の一部または全部を除去する欠失である。いくつかの実施形態では、機能喪失変異とは、遺伝子の発現における低下、例えば、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲｉ、ｍｉＲＮＡ、モルホリノなどによるノックダウンをもたらす遺伝子操作のことを指す。

「組換え」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはウイルスベクターを改変するために使用される場合、ポリヌクレオチド／ポリペプチド／ウイルスベクターを天然に含有しないかまたは生成しない宿主細胞に導入されているか、または宿主細胞によって生成されたポリヌクレオチド／ポリペプチド／ウイルスベクターを指す。ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはウイルスベクター自体は、天然に存在しないもの（例えば、ヒト化抗体）であってもよく、または天然に存在してもよいが宿主細胞との関連では存在しないもの（例えば、典型的には自然界で抗体を生成しないヒト細胞型によって生成されるヒト抗体）であってもよい。

本明細書で使用される、「宿主細胞」（または「組換え宿主細胞」）は、遺伝子的に変更されているか、または組換えプラスミドもしくはベクターなどの外因性もしくは非天然のポリヌクレオチドの導入によって遺伝子的に変更され得る細胞を指すことが意図される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すように意図されることを理解されたい。変異または環境的影響のいずれかに起因して、後続の世代においてある特定の改変が起こる場合があるため、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。

本明細書で使用される場合、「ＨＥＫ２９３細胞株」は、その系統が最終的に元のＨＥＫ２９３細胞株、例えば、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５７３（商標）によって表される細胞株にまで遡ることができ、および／または記載されるようにヒト胎児腎臓細胞をアデノウイルス５型ＤＮＡの断片で形質転換すると生成することができる任意の細胞を指す（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９－７４）。この用語には、例えば、Ｂａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子に変異を導入することによって遺伝子改変され、必要に応じて組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトされ、および／またはウイルスベクター（例えば、組換えウイルスベクター）に感染したＨＥＫ２９３細胞株が含まれる。ＨＥＫ２９３細胞株は、１９番染色体に組み込まれた４ｋｂのアデノウイルスゲノム断片を有する偽三倍体であることが公知である（Ｌｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３３：４２３－４２９）。ＨＥＫ２９３ゲノムおよびトランスクリプトームの特徴は記載されている（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４７６７ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ５７６７）。

本明細書で使用される「培養培地」（「細胞培養培地」という用語を、本明細書では同義に使用することができる）は、本開示の細胞株の増殖を支援する任意の組成物またはブロスを指す。好適な培養培地は、液体または固体であり、任意の栄養素、塩、緩衝液、元素、ならびに細胞の増殖および生存を支援する他の化合物を含有してもよい。一般的な培養培地の栄養素は、窒素、炭素、アミノ酸、炭水化物、微量元素、ビタミン、およびミネラルの供給源を含み得る。これらの栄養素は、（規定された培養培地中の）個々の成分として、または複合エキスの構成成分（例えば、酵母エキスまたは植物／動物の加水分解物もしくはペプチド）として添加されてもよい。培養培地は、血清などの動物由来成分を含むことができ、または動物起源を含まないこともある。培養培地は化学的に規定することができる。培養培地は、急速な成長を支援するために栄養素に富んでいてもよく、またはより遅い成長を支援するために栄養素が最低限であってもよい。培養培地はまた、汚染生物の成長を阻害するか、または汚染生物を殺滅するために使用される任意の薬剤（例えば、抗生物質または抗真菌剤）を含有してもよい。培養培地はまた、誘導性プロモータまたは酵素の活性を制御するために使用される任意の化合物を含有してもよい。

本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の生物学的活性を呈する限り抗体断片を包含する。

「単離」抗体とは、その自然環境の成分から同定および分離され、かつ／または回収された抗体である。その自然環境の汚染物質成分は、抗体の試験的、診断的、または治療的使用を妨害するであろう物質であり、それらとしては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）例えば、ローリー法によって決定して９５重量％超、いくつかの実施形態では、９９重量％超の抗体になるまで、（２）例えば、スピニングカップシークエネータを使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個残基を得るのに充分な程度まで、または（３）例えば、クマシーブルーまたはシルバー染色を使用して、還元または非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質性が得られるまで精製される。単離抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体を含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から成る、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結される一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、その後にいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し；その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。

「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含有する可変ドメインである免疫グロブリンの他の部分と比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメイン（総称して、ＣＨ）、ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含有する。

抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「Ｖ_Ｈ」と称されることがある。軽鎖の可変ドメインは、「Ｖ_Ｌ」と称されることがある。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の高い部分であり、抗原結合部位を含有する。

「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が抗体間で広く異なり、かつ各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布してはいない。これは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方における、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、ベータ－シート構造を接続し、かついくつかの場合では、ベータ－シート構造の一部を形成するループを形成する３つのＨＶＲによって接続されたベータシート立体配置を大いに採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＨＶＲは、ＦＲ領域によって近接して互いに結び付いており、他方の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与などのさまざまなエフェクター機能を呈する。

任意の哺乳類種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（「κ」）およびラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの一方に割り当てられ得る。

ＩｇＧ「アイソタイプ」または「サブクラス」という用語は、本明細書で使用される場合、それらの定常領域の化学的および抗原的特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。

それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、γ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は周知であり、例えば、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）に一般に記載されている。抗体は、抗体と１種以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有会合によって形成される、より大きい融合分子の一部であり得る。

「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書において同義に使用され、以下に記載のように、その実質的にインタクトな形態の抗体を指し、抗体断片をさすものではない。これらの用語は、具体的には、Ｆｃ領域を含有する重鎖を含む抗体を指す。

本明細書における目的のための「裸抗体」は、細胞傷害性部分または放射標識にコンジュゲートされていない抗体である。

「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体断片は、抗原結合断片である。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。

抗体のパパイン消化により、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と、容易に結晶化するその能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が生成される。ペプシンで処理すると、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋する能力を有するＦ（ａｂ’）_２断片が得られる。

「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。一実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、密接に非共有会合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種における構造に類似の「二量体」構造で会合し得るように、可動性ペプチドリンカによって共有結合し得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＨＶＲを３つしか含まないＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。

Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖定常ドメインおよび第１の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元々は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖに関する概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈuｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９－３１５を参照されたい。

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ－ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位が作製される。ダイアボディは二価または二重特異性であり得る。ダイアボディについては、例えば、以下により詳細に説明されている：欧州特許出願公開第４０４，０９７号明細書；国際公開第１９９３／０１１６１号パンフレット；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）。トリアボディおよびテトラボディについては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）にも記載されている。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な変異、例えば、天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。ある特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、該標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られたものである。例えば、この選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの特有のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列が、例えば、標的への親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養におけるその生成を改善し、インビボでのその免疫原性を低減し、多重特異性抗体を作製するなどのようにさらに変更されてもよく、かつ変更された標的結合配列を含む抗体が本開示のモノクローナル抗体でもあることを理解されたい。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体製剤は、それらが典型的には他の免疫グロブリンで汚染されていないという点で有利である。

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、および／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基により置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの改変を加えて、抗体の性能をさらに洗練させることができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み、超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲのうちの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号明細書、および第７，０８７，４０９号明細書も参照されたい。

「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、および／または本明細書に開示されヒト抗体を作製するための技術のうちのいずれかを使用して作製された抗体である。このヒト抗体の定義では、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は具体的に除外されている。ヒト抗体は、当技術分野で公知のさまざまな技術、例えば、ファージディスプレイライブラリを使用して作製され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６－９５（１９９１）に記載されている方法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８－７４（２００１）もまた参照されたい。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化されたキセノマウスに抗原を投与することによって調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号明細書および第６，１５０，５８４号明細書を参照されたい）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体に関する、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）もまた参照されたい。

用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」とは、本明細書で使用される場合、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に画定されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨに３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。天然抗体において、Ｈ３およびＬ３が６つのＨＶＲのうち最も高い多様性を呈し、特にＨ３が抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際には、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ抗体は、軽鎖の不在下で機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）を参照されたい。

いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）。Ｃｈｏｔｈｉａは、そうではなく、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。ＡｂＭ ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の妥協案を示し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲのそれぞれに由来する残基を以下に記載する。

ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬにおいて、２４～３６または２４～３４（Ｌ１）、４６～５６または５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７または８９～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて、２６～３５（Ｈ１）、５０～６５または４９～６５（Ｈ２）、および９３～１０２、９４～１０２、または９５～１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、Ｋａｂａｔら、（上記）に従ってナンバリングされる。

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

「Ｋａｂａｔのような可変ドメイン残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置ナンバリング」という用語、およびそれらの変形は、Ｋａｂａｔら、（上記）における抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインの編集に使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用しても、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従った残基５２ａ）を含み、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従った残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所与の抗体に対して、抗体の配列と「標準の」Ｋａｂａｔによってナンバリングされた配列との相同領域におけるアライメントによって決定され得る。

Ｋａｂａｔナンバリングシステムは一般に、可変ドメイン（およそ軽鎖の残基１～１０７および重鎖の残基１～１１３）内の残基に言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵ指標」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基について言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記で報告されるＥＵ指標）。「ＫａｂａｔのようなＥＵ指標」とは、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。

「直鎖状抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，８（１０）：１０５７－１０６２）に記載の抗体を指す。簡潔には、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
ＩＩ．細胞株

ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含むＨＥＫ２９３細胞株（例えば、単離ＨＥＫ２９３細胞株）が本明細書で提供される。

ヒトＢａｘ 遺伝子（Ｂｃｌ２ｌ４としても公知）は、アポトーシス促進性Ｂｃｌ－２ファミリーメンバーをコードする。アポトーシス中、ＢａｘおよびＢａｋはミトコンドリア膜を透過し、膜電位の喪失およびシトクロムｃの放出をもたらし、最終的にプログラムされた細胞死を引き起こすカスパーゼタンパク質の活性化をもたらす（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２３１－２４１）。ＢａｘまたはＢａｋのいずれかは、ミトコンドリア外膜を、アポトーシスのミトコンドリア経路または内因性経路の際に透過性にするために必要とされる。いくつかの実施形態では、ヒトＢａｘ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号５８１によって記載される遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、ヒトＢａｘ遺伝子は、以下のヒトＢａｘアイソフォームの１種以上をコードする。Ｘ１（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿０１６８８２５６６．１を参照されたい）、ゼータ（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２７８３６０．１を参照されたい）、ラムダ（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２７８３５９．１を参照されたい）、ガンマ（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２７８３５８．１を参照されたい）、１（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２７８３５７．１を参照されたい）、シグマ（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿６２０１１９．２を参照されたい）、デルタ（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿６２０１１８．２を参照されたい）、アルファ（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿６２０１１６．２を参照されたい）、およびベータ（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４３１５．１を参照されたい）。

ヒトＢａｋ 遺伝子（ＢＣＬ２アンタゴニスト／キラー１、Ｂａｋ１、Ｃｄｎ１、Ｂｃｌ２ｌ７、、およびＢａｋ－様としても公知）は、アポトーシス促進性Ｂｃｌ－２ファミリーメンバーをコードする。アポトーシス中、ＢａｘおよびＢａｋはミトコンドリア膜を透過し、膜電位の喪失およびシトクロムｃの放出をもたらし、最終的にプログラムされた細胞死を引き起こすカスパーゼタンパク質の活性化をもたらす（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２３１－２４１）。いくつかの実施形態では、ヒトＢａｋ 遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号５７８によって記載される遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、ヒトＢａｋ 遺伝子は、以下のヒトＢａｋアイソフォームの１種以上をコードする。Ｘ１（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿０１１５１３０８２．１を参照されたい）、Ｘ２（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿０１１５１３０８１．１を参照されたい）および標準アイソフォーム（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１７９．１を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、機能喪失変異は、１つ以上の置換、挿入、欠失および／またはフレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態では、機能喪失変異は欠失を含む。ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子におけるさまざまな機能喪失変異が知られている。例えば、ＢａｘおよびＢａｋの変異は、さまざまな癌において記載されている。例えば、ＢａｘおよびＢａｋについてのＯＭＩＭエントリー６０００４０および６００５１６、ならびにＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）エントリー（それぞれｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ／ｇｅｎｅ／ａｎａｌｙｓｉｓ？ｌｎ＝ＢＡＸおよびｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ／ｇｅｎｅ／ａｎａｌｙｓｉｓ？ｌｎ＝ＢＡＫ１）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＢａｘまたはＢａｋにおける機能喪失変異は、限定するものではないが、アポトーシスの促進、ミトコンドリア膜電位の喪失、ミトコンドリア外膜細孔形成およびシトクロムｃの放出を含む、ＢａｘまたはＢａｋの１つ以上の機能（例えば、アポトーシス促進機能）を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＢａｘまたはＢａｋにおける機能喪失変異は、ＢａｘまたはＢａｋタンパク質の発現を低減または排除する。いくつかの実施形態では、ＢａｘまたはＢａｋにおける機能喪失変異は、例えば、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲｉ、ｍｉＲＮＡ、モルホリノなどによる、ＢａｘまたはＢａｋタンパク質の発現を低減または排除する遺伝子操作を指す。いくつかの実施形態では、Ｂａｘの機能喪失変異は、Ｂａｋの機能喪失変異を有する細胞におけるアポトーシスおよび／またはミトコンドリア膜電位の喪失、ミトコンドリア外膜孔形成、またはシトクロムｃの放出に対する感受性を阻害し、および／またはＢａｋの機能喪失変異は、Ｂａｘの機能喪失変異を有する細胞におけるアポトーシスおよび／またはミトコンドリア膜電位の喪失、ミトコンドリア外膜孔形成、またはシトクロムｃの放出に対する感受性を阻害する。例えば、Ｂａｘ機能が損なわれている場合にＢａｋ機能を低下させることは、正常なＢａｘ機能の状況でＢａｋ機能を低下させることよりもアポトーシスに対する感受性に対してはるかに劇的な効果を有することが実証されている（例えば、Ｃｈａｎｄｒａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１９０５１－１９０６１を参照されたい）。

ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を有するＨＥＫ２９３細胞株を操作する技術は公知である。いくつかの実施形態では、本明細書に例示するように、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術（Ｃｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５：３３０－３４０）を使用して、ＢａｘおよびＢａｋに機能喪失変異（例えば、欠失）を導入することができる。ヒト細胞に変異を導入するための他の技術としては、限定するものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発、化学的突然変異誘発、挿入突然変異誘発などが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含むＨＥＫ２９３細胞株は、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含むＨＥＫ２９３細胞株、またはヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のうちの１つのみの機能的コピーを含むＨＥＫ２９３細胞株と比較して、アポトーシスに対する耐性の増加、剪断応力に対する耐性の増加、スタウロスポリンに対する耐性の増加、および組換えポリペプチド（例えば、細胞培養において）の生成の増加のうちの１つ以上を示す。
組換えポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗原、酵素およびワクチン

いくつかの実施形態では、本開示の細胞株（例えば、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含むＨＥＫ２９３細胞株）は、組換えポリヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、組換えポリペプチド（例えば、抗体または抗体断片の１つ以上の鎖）をコードする。

いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド（例えば、組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド）は染色体外ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムへのポリヌクレオチドの組み込みなしに細胞株に導入される。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは一過性トランスフェクションによって細胞株に導入される。一過性トランスフェクションは、組換えポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込むことなく細胞株に導入することが知られている。そのため、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノムと共に複製されず、（例えば、細胞***、分解などに起因する）有限期間後に失われる。ＨＥＫ２９３細胞株を一過性にトランスフェクトするための方法は当技術分野で公知であり（例えば、ｄｅ Ｌｏｓ Ｍｉｌａｇｒｏｓ Ｂａｓｓａｎｉ Ｍｏｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６６：４９３－５１４を参照されたい）、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションのためのキットは市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって販売されている一過性ＨＥＫ２９３細胞トランスフェクションのためのＥｘｐｉ２９３（商標）発現系を参照されたい）。

他の実施形態では、組換えポリヌクレオチド（例えば、組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド）は、宿主細胞ゲノム、例えばヒト細胞株の染色体上に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、安定なトランスフェクションによって細胞株に導入される。安定なトランスフェクションは、非ゲノムＤＮＡの安定な遺伝を介して、または組換えポリヌクレオチドの宿主細胞ゲノムへの組み込みを介して（例えば、宿主細胞染色体上への組み込みによって）、組換えポリヌクレオチドを細胞株に導入することが知られている。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ランダムな組み込みによって宿主細胞ゲノムに組込まれる。例えば、組換えポリヌクレオチドは選択マーカー（例えば、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８などの抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードするもの）をコードすることができ、組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトされた細胞は、選択マーカーを介して（例えば、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８などの抗生物質を含む細胞培養培地を使用して、選択マーカーを発現しない細胞を殺滅させることによって、）１回以上の選択に供することができる。ＨＥＫ２９３細胞へのランダムな組み込みのための技術およびキットは、当技術分野で公知である；例えば、ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｇｉｂｃｏ－ｃｅｌｌ－ｃｕｌｔｕｒｅ－ｂａｓｉｃｓ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｂａｓｉｃｓ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｍｅｔｈｏｄｓ／ｓｔａｂｌｅ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照されたい。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、部位特異的な組み込みまたは標的化された組み込みによって宿主細胞ゲノムに組み込まれる。例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換え、またはＦＬＰ－ＦＲＴ組換えなどの技術を使用して、組換えポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムの標的部位に組み込むことができる。ＨＥＫ２９３細胞における部位特異的な組み込みまたは標的化された組み込みを使用するための技術およびキットは、当技術分野において公知であり（例えば、Ｃａｌｌｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１：ｅ０１６１４７１を参照されたい）、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）２９３細胞株は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能である。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドをコードする。例示的な組換えポリペプチドを下記に列挙する。いくつかの実施形態では、本開示のＨＥＫ２９３細胞株によって生成される組換えポリペプチドは、例えば、原核生物、真菌、昆虫または非ヒト哺乳動物細胞で生成される同等のポリペプチドの修飾と比較して、ヒト細胞での生成に特徴的な１つ以上の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を含む。例えば、ＨＥＫ２９３細胞において発現される類似のタンパク質とＣＨＯ細胞において発現される類似のタンパク質との間におけるグリコシル化の違いが実証されている（例えば、Ｃｒｏｓｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６１：３３６－３４８を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示のＨＥＫ２９３細胞株によって生成される組換えポリペプチドは、図４Ｅに示される例示的および非限定的なグリカンの１種以上を含むグリコシル化修飾を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリヌクレオチドは、抗原をコードする。いくつかの実施形態では、抗原は、ポリペプチド抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、ペプチド抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、治療用抗原または診断用抗原である。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリヌクレオチドは、酵素をコードする。いくつかの実施形態では、酵素は、治療用酵素または診断用酵素である。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリヌクレオチドは、ワクチンをコードする。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ペプチドワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、弱毒生、不活化、トキソイド、またはサブユニット／組換えワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、ロタウイルス、天然痘、水痘、黄熱病、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、ポリオ、狂犬病、Ｈｉｂ疾患、ヒトパピローマウイルス、百日咳、肺炎球菌疾患、髄膜炎菌性疾患、帯状疱疹、破傷風、およびジフテリアの１種以上に対するものである。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリヌクレオチドは、ウイルスゲノムを含み、および／またはウイルスキャプシドをコードする。下記のセクションＩＶにおいてより詳細に記載されるように、本開示の細胞株は、とりわけ、ウイルスベクターを生成する方法において用途を見出すことができる。いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、ウイルスゲノム（例えば、目的のウイルスベクターのウイルスゲノム）と、ウイルスキャプシドをコードする１種以上のポリヌクレオチドとを含む。例えば、ＨＥＫ２９３細胞株は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの生成のためにアデノウイルスに感染させることができるパッケージング細胞株を作製するために、それらのゲノム中にＡＡＶ遺伝子（例えば、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子）を含むように改変されている（例えば、Ｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１３０１５－１３０２７を参照されたい）。ＨＥＫ２９３細胞株はまた、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの生成のための生成細胞株を作製するために、そのゲノム中にＡＡＶ遺伝子（例えば、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子）ならびにアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ）を含むように改変されている（例えば、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：６１３－６２４を参照されたい）。

いくつかのの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、発現ベクターを含む。発現ベクターには、以下のエレメントの１つ以上が含まれる：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモータ、および転写終結配列のうちの１つ以上が含まれる。

本開示の組換えポリペプチドは、直接的にのみではなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組み換え的に生成され得る。この異種ポリペプチドは、好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端にて特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識およびプロセシング（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。

いくつかの実施形態では、発現ベクターは複製起点を含む。一般に、ベクターにおいて、この配列は、宿主染色体ＤＮＡとは無関係にベクターの複製を可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（ＳＶ４０起点は、初期プロモータを含有するため、典型的に使用され得る）。他の実施形態では、ベクターは複製起点を含まない（例えば、組換えポリヌクレオチドが宿主細胞染色体上に組み込まれる場合）。

いくつかの実施形態では、安定なトランスフェクションに関して上記で示唆したように、発現ベクターは選択遺伝子または選択マーカーを含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完する、または（ｃ）複合培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止する薬物を利用する。異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を付与し、それ故に選択レジメンで生き残るタンパク質を生成する。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの別の例は、抗体をコードする核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉおよび－ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換された細胞は、形質転換体を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で培養することによって同定される。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。代替として、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、形質転換体を、ＧＳ阻害剤であるＬ－メチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）を含有する培養培地中で培養することによって同定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅系は、上述のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用することができる。代替として、目的のＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、および別の選択可能なマーカー、例えば、アミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換または共形質転換された宿主細胞（具体的には、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などの選択マーカー用の選択剤を含有する培地中での細胞増殖によって選択することができる。例えば、米国特許第４，９６５，１９９号明細書を参照されたい。

いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモータを含む。発現ベクターおよびクローニングベクターは、一般に、宿主生物によって認識され、かつ組換えポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモータを含有する。哺乳動物宿主細胞中でのベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモータ、例えば、アクチンプロモータもしくは免疫グロブリンプロモータから、ヒートショックプロモータから得られるプロモータによって、このようなプロモータが宿主細胞系と適合性であることを条件として、制御され得る。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモータおよび後期プロモータは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモータは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号明細書に開示されている。この系の変形は、米国特許第４，６０１，９７８号明細書に記載されている。チミジンキナーゼプロモータの制御下で、マウス細胞における単純ヘルペスウイルスからのヒトβ－インターフェロンｃＤＮＡの発現に関して、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８－６０１（１９８２）も参照されたい。代替として、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列をプロモータとして使用することができる。

いくつかの実施形態では、発現ベクターはエンハンサーエレメントを含む。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、およびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモータの活性化のための増強エレメントに関しては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７－１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列の５’位または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモータから５’部位に位置する。

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、転写ターミネータ、例えば、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は一般的に、真核細胞またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時折、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号パンフレットおよびそれに開示される発現ベクターを参照されたい。
抗体および抗体断片

いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリヌクレオチドは抗体またはその抗原結合断片をコードする。例えば、いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、抗体もしくは抗体断片、または一本鎖抗体もしくは抗体断片の重鎖および軽鎖をコードする。本開示の細胞株または細胞培養物を使用して、抗体または抗体断片を作製するためにするための例示的な方法は、下記のセクションＩＶに詳細に記載される。

いくつかの実施形態では、抗体（または抗体断片）は診断用抗体である。例えば、抗体を使用して、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリ、または他の免疫アッセイによって、試料中の１種以上の診断用抗原を検出することができる。非限定的な例として、例えば、さまざまな癌の治療において使用される診断アッセイのために、ＨＥＲ２（例えば、ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍を同定するための、ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔを参照されたい）、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体（例えば、、ＥＲまたはＰＲを過剰発現する腫瘍を同定するための、ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．のＥＲ／ＰＲ ｐｈａｒｍＤｘキットを参照されたい）、ならびにＰＤ－Ｌ１（例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍を同定するためのＶｅｎｔａｎａ ＳＰ２６３およびＳＰ１４２アッセイを参照されたい）を検出するために診断用抗体が使用されている。

いくつかの実施形態では、抗体（または抗体断片）は治療用抗体である。例示的な治療用抗体としては、限定するものではないが、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）、デュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標）、Ａｓｔｒａ－Ｚｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）、２Ｃ４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、オビヌツズマブ（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、オクレリズマブ（ＯＣＲＥＶＵＳ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ、Ｃｏｒｉｘｉａ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、アポリズマブ、アセリズマブ（ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アトリズマブ、バピネオズマブ、ビバツズマブメルタンシン（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カンツズマブメルタンシン、セデリズマブ（ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セルトリズマブペゴール、シドフシツズマブ（ｃｉｄｆｕｓｉｔｕｚｕｍａｂ）、シドツズマブ（ｃｉｄｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ（ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ（ｍｏｔｏｖｉｚｕｍａｂ）、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ（ｎｏｌｏｖｉｚｕｍａｂ）、ヌマビズマブ（ｎｕｍａｖｉｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリブズマブ、パソコリズマブ（ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペクフシツズマブ（ｐｅｃｆｕｓｉｔｕｚｕｍａｂ）、ペクツズマブ（ｐｅｃｔｕｚｕｍａｂ）、ペキセリズマブ、ラリビズマブ（ｒａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ、レスリビズマブ（ｒｅｓｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、レスリズマブ、レシビズマブ（ｒｅｓｙｖｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ、ソンツブマブ（ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、タカツズマブ トテラキセタン（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タドシズマブ（ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ、テフィバズマブ（ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、トシリズマブ、トラリズマブ（ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ツコツズマブ セルモロイキン（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツクシツズマブ（ｔｕｃｕｓｉｔｕｚｕｍａｂ）、ウマビズマブ（ｕｍａｖｉｚｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、ビジリズマブ、および組換え完全ヒト型配列の、インターロイキン－１２ ｐ４０ タンパク質を認識するように遺伝子改変された完全長ＩｇＧ_１ λ抗体である、抗インターロイキン－１２（ＡＢＴ－８７４／Ｊ６９５、Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が挙げられる。治療的使用のためにＥＭＡまたはＦＤＡによって承認されたモノクローナル抗体の非限定的なリストは、ｗｗｗ．ａｃｔｉｐ．ｏｒｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ａｐｐｒｏｖｅｄ－ｂｙ－ｔｈｅ－ｅｍａ－ａｎｄ－ｆｄａ－ｆｏｒ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ－ｕｓｅ／に見出すことができる。

抗体および抗体断片の特徴を、下記に非限定的に記載する。
特定の抗体ベースの方法

モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製することができ、ヒト－ヒトハイブリドーマに関しては、例えば、Ｈｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３－２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）にさらに記載された。さらなる方法としては、ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の生成について、例えば米国特許第７，１８９，８２６号明細書に記載される方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。所望のモノクローナル抗体がハイブリドーマから単離されると、それらをコードしているポリヌクレオチドを発現ベクターへとサブクローニングすることができ、本明細書に記載される方法のいずれかによってＨＥＫ２９３細胞株中で発現させることで抗体を生成することができる。
ライブラリ由来の抗体

本開示の抗体は、所望される活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、実施例３に記載の方法などのファージディスプレイライブラリを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてこのようなライブラリをスクリーニングするためのさまざまな方法が当技術分野で公知である。さらなる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説されており、例えば、ｔｈｅ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）にさらに記載されている。

特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリ内でランダムに再結合され、次いでＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されているような、抗原結合ファージに対してスクリーニングすることが可能である。ファージは、典型的には、抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとしてディスプレイする。免疫源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替として、ナイーブレパートリは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）によって記載されるように、（例えば、ヒトから）クローニングされて、いかなる免疫化も伴うことなく、広範囲の非自己抗原および自己抗原に対する単一抗体源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリは、幹細胞から再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダムな配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、非常に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されているように、インビトロで再配列を達成することによって、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、および第２００９／０００２３６０号明細書が挙げられる。

ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体

特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）に開示されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来の可変領域）、およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれから変化させられた「クラス切り替え」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

特定の実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体が、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。通常、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来する１つ以上の可変ドメインを含み、ＦＲ（またはその一部）はヒト抗体配列に由来する。必要に応じて、ヒト化抗体はまた、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復するか、または向上させるために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。

ヒト化抗体およびそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、および第７，０８７，４０９号明細書；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）のグラフティングについて記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「表面再構成」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへのアプローチである「ガイドセレクション（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を記載」）にさらに記載されている。

ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域としては、限定するものではないが、「ベストヒット（ｂｅｓｔ－ｆｉｔ）」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）；ヒト成熟（体細胞性変異された）フレームワーク領域またはヒト生殖系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）；ならびにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）。

特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知のさまざまな技術を使用して作製することができる。ヒト抗体は一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。ヒト抗体は、例えば、非限定的に、本明細書に記載される方法のいずれかによって、発現ベクターからＨＥＫ２９３細胞株中で発現させることによって作製することができる。

ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製することもできる。その後、このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
抗体断片

抗体断片は、酵素消化などの伝統的な手段または組換え技術によって作製することができる。特定の状況下では、全抗体ではなく抗体断片を使用することが有利である。より小さいサイズの断片により、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセスの改善がもたらされ得る。特定の抗体断片に関する概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４を参照されたい。

抗体断片を作製するためにさまざまな技術が開発されている。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化により得られていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかし、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞から直接生成させることができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖ抗体断片は全て、Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌され得るため、これらの断片の容易な大量生成が可能になる。抗体断片は上記の抗体ファージライブラリから単離することができる。代替として、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）_２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片については、米国特許第５，８６９，０４６号明細書に記載されている。抗体断片を作製するための他の技術は、当業者には明らかである。特定の実施形態では、抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号パンフレット；米国特許第５，５７１，８９４号明細書；および第５，５８７，４５８号明細書を参照されたい。ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、したがって、それらは、インビボでの使用中の非特異的結合の低減に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでのエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる。上記の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編を参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されているような「直鎖状抗体」であり得る。このような直鎖状抗体は、単一特異性または二重特異性であり得る。
多重特異性抗体

多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、これらのエピトープは、通常、異なる抗原由来である。このような分子が通常２つの異なるエピトープのみに結合する（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）一方で、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合、この表現に包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）として調製することができる。

二重特異性抗体の作製方法は、当技術分野で公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な作製は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づき、これらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７－５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の混合物を生成する可能性があり、これらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常親和性クロマトグラフィー工程によって行われるこの正しい分子の精製は、幾分厄介であり、生成物収率は低い。同様の手順が、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５－３６５９（１９９１）に開示されている。

二重特異性抗体を作製するための当技術分野で公知の１つのアプローチは、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）」または「空洞への突起挿入（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ－ｉｎｔｏ－ｃａｖｉｔｙ）」アプローチである（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書を参照されたい）このアプローチにおいて、２つの免疫グロブリンポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチド）が各々界面を含む。一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面が他方の免疫グロブリンポリペプチドの対応する界面と相互作用し、それにより、２つの免疫グロブリンポリペプチドの会合を可能にする。これらの界面は、一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ノブ」または「突起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ）」（これらの用語は、本明細書で同義に使用され得る）は、他方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ホール」または「空洞（ｃａｖｉｔｙ）」（これらの用語は、本明細書で同義に使用され得る）に対応するように操作することができる。いくつかの実施形態では、ホールは、ノブと同一または同様の大きさのものであり、２つの界面が相互作用するときに、一方の界面のノブが他方の界面の対応するホール内に位置付け可能であるように好適に位置付けられる。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、ヘテロ多量体を安定させ、かつ他の種、例えば、ホモ多量体よりもヘテロ多量体の形成を好むと考えられる。いくつかの実施形態では、このアプローチを使用して、２つの異なる免疫グロブリンポリペプチドのヘテロ多量体化を促進し、異なるエピトープに対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリンポリペプチドを含む二重特異性抗体を作製することができる。

いくつかの実施形態では、ノブは、小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖で置き換えることによって構築され得る。いくつかの実施形態では、ホールは、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖で置き換えることによって構築され得る。ノブまたはホールは、元の界面に存在してもよく、または合成的に導入することもできる。例えば、ノブまたはホールは、界面をコードする核酸配列を変更させて、少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基を少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基で置き換えることによって合成的に導入され得る。核酸配列を変更させるための方法としては、当技術分野で周知の標準の分子生物学技術を挙げることができる。さまざまなアミノ酸残基の側鎖体積を、以下の表に示す。いくつかの実施形態では、元の残基は、小さい側鎖体積（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリン）を有し、ノブを形成するための移入残基は、天然に存在するアミノ酸であり、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含み得る。いくつかの実施形態では、元の残基は、大きい側鎖体積（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン）を有し、ホールを形成するための移入残基は、天然に存在するアミノ酸であり、アラニン、セリン、トレオニン、およびバリンを含み得る。

^ａアミノ酸の分子量は、水の分子量を差し引いたものである。値は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，４３^ｒｄ ｅｄ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９６１によるものである。
^ｂ値は、Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：１０７－１２３，１９７２によるものである。
^ｃ値は、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：１－１４，１９７５によるものである。アクセス可能な表面積は、この参考文献の図６～図２０に定義されている。

いくつかの実施形態では、ノブまたはホールを形成するための元の残基は、ヘテロ多量体の三次元構造に基づいて特定される。三次元構造を得るための当技術分野で公知の技術としては、Ｘ線結晶学およびＮＭＲを挙げることができる。いくつかの実施形態では、界面は、免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ３ドメインである。これらの実施形態では、ヒトＩｇＧ_１のＣＨ３／ＣＨ３界面は、４つの逆平行β鎖上に位置する各ドメイン上に１６個の残基を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、変異残基は、好ましくは、ノブがパートナーＣＨ３ドメイン内の補償ホールではなく周囲の溶媒によって収容され得る危険性を最小限に抑えるように、これらの２つの中央逆平行β鎖上に位置する。いくつかの実施形態では、２つの免疫グロブリンポリペプチド内の対応するノブおよびホールを形成する変異は、以下の表に提供される１つ以上の対に対応する。

変異は、元の残基、続いて、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムを使用した位置、次に、移入残基で表示されている（残基は全て一文字のアミノ酸コードで示されている）。複数の変異は、コロンで区切られている。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドは、上の表２に列記される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、表２の左側の欄に列記される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第１の免疫グロブリンポリペプチドと、表２の右側の欄に列記される１つ以上の対応するアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第２の免疫グロブリンポリペプチドとを含む。ノブおよびホール形成対の非限定的な例として、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むＣＨ３ドメインを含む第１の免疫グロブリンポリペプチドと、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を含むＣＨ３ドメインを含む第２の免疫グロブリンポリペプチドとを含む。

各半抗体は、米国特許第７，６４２，２２８号明細書に記載されているように、操作されたノブ（突起）またはホール（空洞）のいずれかを重鎖内に有することができる。手短に言えば、ＣＨ３ノブ変異体を最初に作製することができる。次いで、パートナーＣＨ３ドメイン上のノブに近接している残基３６６、３６８および４０７をランダム化することによって、ＣＨ３ホール変異体のライブラリを作製することができる。特定の実施形態では、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４骨格中に、ノブ変異がＴ３６６Ｗを含み、ホール変異がＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。他の免疫グロブリンアイソタイプにおける同等の変異は、当業者によって作製可能である。さらに、当業者には、二重特異性抗体に使用される２つの半抗体が同じアイソタイプであることが好ましいことが容易に理解されると思われる。

多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を作製するための例示的かつ非限定的な技術をセクションＩＶに提供する。

２を超える結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。

いくつかの実施形態では、２鎖タンパク質は、多重特性性抗体または二重特異性抗体の一部である。多重特性抗体または二重特異性抗体は、本開示の２つ以上の一価抗体を含有する。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第１の抗原結合ドメインは、１つ以上の重鎖定常ドメインを含み、この１つ以上の重鎖定常ドメインは、第１のＣＨ１（ＣＨ１_１）ドメイン、第１のＣＨ２（ＣＨ２_１）ドメイン、第１のＣＨ３（ＣＨ３_１）ドメインから選択され、二重特異性抗体の第２の抗原結合ドメインは、１つ以上の重鎖定常ドメインを含み、この１つ以上の重鎖定常ドメインは、第２のＣＨ１（ＣＨ１_２）ドメイン、第２のＣＨ２（ＣＨ２_２）ドメイン、および第２のＣＨ３（ＣＨ３_２）ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の抗原結合ドメインの１つ以上の重鎖定常ドメインは、第２の抗原結合ドメインの別の重鎖定常ドメインと対形成される。いくつかの実施形態では、ＣＨ３_１およびＣＨ３_２ドメインはそれぞれ、突起または空洞を構成し、ＣＨ３_１ドメインにおける突起または空洞が、ＣＨ３_２ドメインにおける空洞または突起にそれぞれ位置決め可能である。いくつかの実施形態では、ＣＨ３_１およびＣＨ３_２ドメインは、前記突起と空洞との間の界面で会合する。ＣＨ３_１およびＣＨ３_２ドメインにおけるアミノ酸置換の例示的なセットが本明細書の表２に示されている。いくつかの実施形態では、ＣＨ２_１およびＣＨ２_２ドメインはそれぞれ、突起または空洞を構成し、ＣＨ２_１ドメインにおける突起または空洞が、ＣＨ２_２ドメインにおける空洞または突起にそれぞれ位置決め可能である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２_１およびＣＨ２_２ドメインは、前記突起と空洞との間の界面で会合する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧのＣＨ３_１および／またはＣＨ３_２ドメインは、米国特許第８，２１６，８０５号明細書の図５に示されているアミノ酸ナンバリングによる３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９８、３９９、４０５、４０７、および４０９からなる群から選択される残基における１つ以上のアミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態では、突起は、アルギニン（Ｒ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基、チロシン（Ｙ）残基、およびトリプトファン（Ｗ）残基からなる群から選択される１つ以上の導入残基を含有する。いくつかの実施形態では、空洞は、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、およびバリン（Ｖ）残基からなる群から選択される１つ以上の導入残基を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３および／またはＣＨ２ドメインはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ２Ａサブタイプ、ＩｇＧ２Ｂサブタイプ、ＩｇＧ３、サブタイプ、またはＩｇＧ４サブタイプ）に由来する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙを含み、他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ｔを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ａを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｆ４０５Ａを含み、他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４Ｗを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６ＹおよびＦ４０５Ａを含み、他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４ＷおよびＹ４０７Ｔを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６ＷおよびＦ４０５Ｗを含み、他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４ＳおよびＹ４０７Ａを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｆ４０５ＷおよびＹ４０７Ａを含み、他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６ＷおよびＴ３９４Ｓを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｆ４０５Ｗを含み、他方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４Ｓを含む。変異は、元の残基、続いてＫａｂａｔナンバリングシステムを使用した位置、次に、移入残基で表示されている。米国特許第８，２１６，８０５号明細書の図５のナンバリングも参照されたい。
単一ドメイン抗体

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号明細書を参照されたい）。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部からなる。
抗体変異体

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列の改変（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。本抗体のアミノ酸配列変異体は、本抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入、および／または置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組合せにより、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特性を有することを条件とする。主題の抗体のアミノ酸配列が作製されるときにアミノ酸の変更がその配列に導入されてもよい。
Ｆｃ領域変異体

特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸改変が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域変異体が作製され得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。

特定の実施形態では、本開示は、全てではなく、いくつかのエフェクター機能を有することにより、インビボでの抗体の半減期が重要ではあるが、特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途に望ましい候補となる抗体変異体を企図する。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低下／消失を確認するために、インビトロおよび／またはインビボの細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、およびＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号明細書（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照されたい）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号明細書（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。代替としては、非放射性アッセイ法を採用してもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリ用非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、および ＣｙｔｏＴｏｘ ９６^{（登録商標）}非放射性細胞毒性試験法（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞が含まれる。代替として、または追加として、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。また、抗体がＣ１ｑに結合することができず、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号パンフレットおよび第ＷＯ２００５／１００４０２号パンフレットのＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；およびＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期決定もまた、当技術分野において公知の方法を使用して実行することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照されたい）。

エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５および２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号明細書）。

ＦｃＲへの結合が改善または減少した特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号明細書；国際公開第２００４／０５６３１２号パンフレット、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照されたい。）

特定の実施形態では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、および／または３３４位（残基のＥＵナンバリング）での置換を有するＦｃ領域を含む。例示的な一実施形態では、抗体は、そのＦｃ領域に以下のアミノ酸置換：Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３ＡおよびＫ３３４Ａを含む。

いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９／５１６４２号パンフレット、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、変更された（すなわち、改善されたか、または減少したかのいずれか）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす変更が、Ｆｃ領域において行われる。

半減期が増大し、母体ＩｇＧを胎児に移入する役割を果たす新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））への結合が向上した抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号明細書（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうち１つ以上における置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を伴うもの（米国特許第７，３７１，８２６号明細書）が挙げられる。Ｆｃ領域の変異体の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号明細書；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；および国際公開第９４／２９３５１号パンフレットも参照されたい。
抗体誘導体

本開示の抗体は、当技術分野で公知の、容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するように、さらに改変され得る。特定の実施形態では、抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため、製造上の利点を有すると思われる。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分枝型であっても、非分枝型であってもよい。抗体に付着しているポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが付着している場合には、それらは同じ分子であっても、異なった分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／またはタイプは、限定するものではないが、改良される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうかなどの考慮事項に基づいて決定することができる。
ＩＩＩ．細胞培養物

ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含むＨＥＫ２９３細胞株（例えば、単離されたＨＥＫ２９３細胞株）を含む細胞培養物が本明細書で提供される。上記のセクションＩＩに記載される例示的な細胞株を含む本開示のＨＥＫ２９３細胞株のいずれも、本開示の細胞培養物において用途を見出すことができる。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞培養物は、本開示の複数のＨＥＫ２９３細胞と、細胞培養培地とを含む。ＨＥＫ２９３細胞を培養するのに適した細胞培養培地は当技術分野で公知であり、市販されている；例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｇｉｂｃｏ）、および必要に応じて血清を補添されたＡＴＣＣ製剤化イーグル最小必須培地（ＡＴＣＣカタログ番号３０－２００３）を参照されたい。細胞培養培地には、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^（商標）薬物など）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終密度で存在する無機化合物と定義される）、ならびにグルコースまたは等価エネルギー源が補添され得る。任意の他の必要な補添物質も、適切な濃度で含むことができる。

いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、３５Ｌバイオリアクター培養に十分な細胞密度である。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、７、１４、２１、３０、４５、または６０日間、３５Ｌバイオリアクター培養に十分な細胞密度で維持される。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、（例えば、流加培養で）約０．４×１０^６細胞／ｍＬ～約６×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度である。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、（例えば、灌流培養で）約０．４×１０^６細胞／ｍＬ～約１．０×１０^８細胞／ｍＬ の細胞密度である。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞培養物は、２．６７×１０^７Ｗ／ｍ^３のエネルギー散逸速度（ＥＤＲ）の剪断応力への曝露後に、５０％超、６０％超、または７５％超の細胞生存率を維持する。特定の実施形態では、本開示の細胞培養物は、２．６７×１０^７Ｗ／ｍ^３エネルギー散逸速度（ＥＤＲ）の剪断応力への曝露後に、７５％超の細胞生存率を維持する。いくつかの実施形態では、本開示の細胞培養物の細胞は、２．６７×１０^７Ｗ／ｍ^３のエネルギー散逸速度（ＥＤＲ）の剪断応力への曝露後に、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、または３０％未満の全溶解を示す。細胞を剪断応力に曝露するための例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、細胞を流動制限装置（ＦＣＤ；Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５：１９７－２０３；およびＭｏｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９８：７７２－７８８）に通過させることが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞培養物の細胞は、１μＭのスタウロスポリンへの７０時間の曝露後、５０％超、６０％超、７５％超、または８０％超の細胞生存率を維持する。いくつかの実施形態では、本開示の細胞培養物の細胞は、１μＭのスタウロスポリンへの６０時間の曝露後、７０％超、７５％超、８０％超、または８５％超の細胞生存率を維持する。いくつかの実施形態では、本開示の細胞培養物の細胞は、１μＭスタウロスポリンへの５０時間の曝露後、８０％超、８５％超、または９０％超の細胞生存率を維持する。特定の実施形態では、本開示の細胞培養物の細胞は、１μＭスタウロスポリンへの７０時間の曝露後、７５％超の細胞生存率を維持する。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の組換えポリペプチドを生成する本開示のＨＥＫ２９３細胞株を含む）は、組換えポリペプチド（例えば、抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体）を、７日間で少なくとも約５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６００ｍｇ／Ｌ、または約６００ｍｇ／Ｌの力価で生成する。特定の実施形態では、本開示の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の組換えポリペプチドを生成する本開示のＨＥＫ２９３細胞株を含む）は、７日間で約６５０ｍｇ／Ｌの力価で組換えポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞株は、組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを一過性にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、３０ｍＬ細胞培養物（例えば、約２×１０^６細胞／ｍＬで播種）である。
ＩＶ 生成方法

組換えポリペプチドを生成する方法であって、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本開示のＨＥＫ２９３細胞株を、ポリペプチドの生成に適した条件下で培養することを含む方法が本明細書で提供される。ウイルスベクターを生成する方法であって、ウイルスゲノムと、ウイルスキャプシドをコードする１種以上のポリヌクレオチドとを含む本開示のＨＥＫ２９３細胞株を、ウイルスベクターの生成に適した条件下で培養することを含む方法も本明細書で提供される。

本開示の細胞株のいずれか（例えば、セクションＩＩに記載）または本開示の細胞培養物（例えば、セクションＩＩＩに記載）を、本開示の方法において使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞株は、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含むＨＥＫ２９３細胞株である。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、細胞培養培地中で培養される。例示的かつ非限定的な細胞培養培地および細胞培養培地の説明は、上記のセクションＩＩＩに提供されている。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．９５～約７．０５、または約７のｐＨで培養される。特定の実施形態では、本開示の細胞株は、ｐＨ設定値７．０、不感帯±０．０３で培養される。いくつかの実施形態では、培養ｐＨは、酸としてＣＯ_２および塩基として１ Ｍ炭酸ナトリウムを使用して制御される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、溶存酸素（ＤＯ）設定値約３０％において培養される。いくつかの実施形態では、培養ＤＯは、オープンパイプスパージャ（ｏｐｅｎ ｐｉｐｅ ｓｐａｒｇｅｒ）を介して空気および純酸素ガスをスパージングすることによって制御される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、約１３Ｗ／ｍ^３の体積当たりの電力入力（Ｐ／Ｖ）を付与する撹拌速度で培養される。体積当たりの電力入力は、以下の式を使用して計算することができる。

式中、

いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、少なくとも約１０Ｌ、少なくとも約１５Ｌ、少なくとも約２０Ｌ、少なくとも約２５Ｌ、少なくとも約３０Ｌ、少なくとも約３５Ｌ、少なくとも約５０Ｌ、少なくとも約６０Ｌ、少なくとも約７５Ｌ、または約１００Ｌの体積で培養される。いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、約１０Ｌ～約３５Ｌ、約１５Ｌ～約３５Ｌ、約２０Ｌ～約３５Ｌ、約２５Ｌ～約３５Ｌ、約３５Ｌ～約１００Ｌ、または約１０Ｌ～約１００Ｌの体積で培養される。いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、少なくとも約１０Ｌ、少なくとも約１５Ｌ、少なくとも約２０Ｌ、少なくとも約２５Ｌ、少なくとも約３０Ｌ、または少なくとも約３５Ｌの体積を有するバイオリアクターで培養される。いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、少なくとも約２０Ｌ、少なくとも約２５Ｌ、少なくとも約３０Ｌ、または少なくとも約３５Ｌの作業体積で培養される。いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、約１０Ｌ～約３５Ｌ、約１５Ｌ～約３５Ｌ、約２０Ｌ～約３５Ｌ、または約２５Ｌ～約３５Ｌの作業体積で培養される。バイオリアクター体積が作業体積以上であることを条件として、バイオリアクター体積と作業培養体積との上記の全ての組み合わせが企図される。例えば、特定の実施形態では、細胞株は、約２０Ｌ～約３５Ｌの作業体積で３５Ｌバイオリアクター培養で培養される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、少なくとも５０日間、または少なくとも６０日間培養される。いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、３５日間、５０日間または６０日間培養される。バイオリアクター体積が作業体積以上であることを条件として、バイオリアクター体積、作業培養体積、および培養期間の上記の全ての組み合わせが企図される。いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、３５Ｌバイオリアクター培養物で少なくとも３５日間、少なくとも５０日間、または少なくとも６０日間培養される。特定の実施形態では、本開示の細胞株は、３５Ｌバイオリアクター培養で６０日間培養される。いくつかの実施形態では、本開示の細胞培養物は、細胞株を３５Ｌバイオリアクター培養での６０日間の培養後、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％の細胞生存率を維持する。特定の実施形態では、本開示の細胞培養物は、細胞株を３５Ｌバイオリアクター培養での６０日間の培養後、少なくとも８５％の細胞生存率を維持する。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、流加培養条件下で培養される。流加培養下では、培養中に１種以上の化合物または栄養素が細胞培養物に添加される。生産後、培養物を収穫し、生成物を収集する。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、灌流培養条件下で培養される。灌流培養下で、新鮮な培養培地を培養物に供給し、廃棄物／副生成物を連続的に除去する。灌流培養は、流加培養よりも高い細胞密度での培養を可能にすることが知られている。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本開示の細胞株から生成物、例えば、組換えポリペプチドおよび／またはウイルスベクターを単離することをさらに含む。生成物の単離および精製の例示的かつ非限定的な方法は、下記に、より詳細に記載される。

細胞培養および組換えポリヌクレオチド／ポリペプチド生成のための技術を、下記に非限定的な様式で記載する。
宿主細胞の選択およびトランスフェクション

宿主細胞は、上記のセクションＩＩに記載される例示的な選択マーカーの使用を含むさまざまな手段によって培養中に選択することができる。

ヒト細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株）のトランスフェクションに適した技術は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して細胞にＤＮＡを導入することによってトランスフェクトされる。ＨＥＫ２９３細胞のＰＥＩトランスフェクションのための例示的な方法は、本明細書に記載され、当技術分野で公知である（例えば、ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／を参照されたい。）。
宿主細胞の培養

本開示の宿主細胞は、さまざまな培地において培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号明細書；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号パンフレット；または米国再発行特許第３０，９８５号明細書に記載の培地のいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^（商標）薬物など）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終密度で存在する無機化合物と定義される）、ならびにグルコースまたは等価エネルギー源が補添され得る。
生物学的に活性なポリペプチドの精製

細胞から調製された組換えポリペプチド（例えば、抗体）は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーが典型的に好ましい精製工程のうちの１つである。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は、本抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスにより、アガロースで達成され得るよりも速い流速および短い処理時間が可能になる。抗体がＣ_Ｈ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ^（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質を精製するための他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。

一般に、研究、試験、および臨床で使用するための抗体を調製するためのさまざまな方法論が当技術分野で十分に確立されており、上述の方法論と一致しており、かつ／または当業者によって目的とする特定の抗体に適切であると見なされている。
ウイルスベクターの精製

細胞から調製されたウイルスベクターは、例えば、生成されたウイルスベクターの種類に応じて、さまざまな手段を使用して精製することができる。精製されたウイルスベクター調製物とは、粒子が天然に存在した場合、または最初に調製された場合にさらに存在し得る他の成分の少なくともいくつかを欠くウイルスベクター／粒子の調製物を指す。したがって、例えば、単離されたウイルスベクター／粒子は、培養溶解物または生成培養物上清などの供給源混合物から、それらを濃縮するための精製技術を使用して調製することができる。濃縮は、さまざまな方法で、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合によって、または感染性によって測定することができ、または供給源混合物中に存在する第２の潜在的干渉物質、例えば生成培養汚染物質を含む汚染物質またはヘルパーウイルスを含む工程内汚染物質、培地成分などに関連して測定することができる。

アデノウイルスベクター／粒子の作製のための多数の方法が当技術分野で公知である。例えば、ガッティッド（ｇｕｔｔｅｄ）型アデノウイルスベクターの場合、アデノウイルスベクターゲノムおよびヘルパーアデノウイルスゲノムをパッケージング細胞株（例えば、２９３細胞株）にトランスフェクトすることができる。いくつかの実施形態では、ヘルパーアデノウイルスゲノムは、そのパッケージングシグナルに隣接する組換え部位を含み得、両方のゲノムは、リコンビナーゼを発現するパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができ（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを使用してもよい）、その結果、目的のアデノウイルスベクターは、ヘルパーアデノウイルスよりも効率的にパッケージングされる（例えば、ｅ．ｇ．，Ａｌｂａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１８－２７を参照されたい）。ＡＡＶベクターは、例えば、以前に記載されたように（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２）、ヒト２９３細胞のトリプルプラスミド共トランスフェクションによって作製することができる。例示的な単離／精製方法では、ＡＡＶベクターを前述のようにカラム精製することができる（Ｐａｓｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２３８２－１２３９２）。

レンチウイルスベクター／粒子の作製のための多数の方法が当技術分野で公知である。例えば、第３世代レンチウイルスベクターの場合、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を有する目的のレンチウイルスゲノムを含むベクターを、ｒｅｖ遺伝子を含むベクターと共にパッケージング細胞株（例えば、２９３細胞株）に共トランスフェクトすることができる。目的のレンチウイルスゲノムはまた、Ｔａｔの非存在下で転写を促進するキメラＬＴＲを含む（Ｄｕｌｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３－７１を参照されたい）。レンチウイルスベクターは、さまざまな方法（例えば、Ｓｅｇｕｒａ ＭＭ，ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１３（７）：９８７－１０１１）を使用して収集および精製することができる。

ＨＳＶ粒子の作製のための多数の方法が当技術分野で公知である。ＨＳＶベクター／粒子は、標準的な方法を用いて収集および精製することができる。例えば、複製欠損ＨＳＶベクターの場合、前初期（ＩＥ）遺伝子の全てを欠く目的のＨＳＶゲノムを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７およびＩＣＰ０などのウイルス生成に必要な遺伝子を提供する補完細胞株にトランスフェクトすることができる（例えば、Ｓａｍａｎｉｅｇｏ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３３０７－２０を参照されたい）。ＨＳＶベクターは、さまざまな方法（例えば、Ｇｏｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１４４：６３－７９）を使用して収集および精製することができる。

本開示は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されることになる。しかし、これらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例および実施形態が例示のみを目的とするものであり、それを考慮に入れたさまざまな改変または変化が当業者に提案され、本出願精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることは理解されよう。
実施例１：より堅牢なＨＥＫ２９３細胞株の作製および試験

上記のように、ＨＥＫ２９３細胞は剪断応力に感受性であり、バイオリアクター内で培養した場合に低い生存率をもたらす傾向がある。アポトーシスに対する耐性を有する細胞株は、バイオリアクターにおいてより高い生産性およびより堅牢な性能を示すと仮定した。抗アポトーシスＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ）を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術（Ｃｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５：３３０－３４０）を使用して、アポトーシス促進性遺伝子ＢａｘおよびＢａｋを欠失させることによって操作した。アポトーシス中、ＢａｘおよびＢａｋはミトコンドリア膜を透過し、最終的にプログラムされた細胞死を引き起こすカスパーゼタンパク質の活性化をもたらす（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２３１－２４１）。ＣＨＯ細胞株におけるＢａｘおよびＢａｋの欠失は、より高い培養生存率およびトランスフェクション力価と相関することが以前に示されていた（Ｍａｃａｒａｅｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９：１０５０－１０５８）。ＢａｘおよびＢａｋの抑制または欠失を伴う培養物の生存率および生産性の改善が報告されている（Ｃｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５：３３０－３４０；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．８：５０９－５２２；Ｇｒａｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１０：１４４６－１４５６）。これらの研究は、野生型と比較して、ＣＨＯ ＤＫＯ生成培養物において、より高い生存率（Ｃｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５：３３０－３４０；Ｍａｃａｒａｅｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９：１０５０－１０５８；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．８：５０９－５２２））、より高いＤＮＡ取り込みレベル（Ｍａｃａｒａｅｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９：１０５０－１０５８）、より高いトランスフェクション効率（Ｍａｃａｒａｅｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９：１０５０－１０５８）、より大きなミトコンドリア質量（Ｍｉｓａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９：７２７－７３７）、および改善されたミトコンドリア膜電位（Ｍｉｓａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｈｃｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９：７２７－７３７）の観察を報告した。

ＨＥＫ２９３ ＤＫＯを、バイオリアクターにおいてより高い生産性および堅牢な性能を示すＨＥＫ２９３細胞株を作製するために試験および特徴付けした。
方法
細胞培養

ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞株を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術Ｃｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５：３３０－３４０）を使用することによって作製した。ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞を、表１のシードトレイン培地を使用して、以前に記載されたように（Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１２：１８３２－１８４２）、振盪フラスコ中でシードトレインとして培養した。

スタウロスポリンアッセイ

振盪フラスコ中のＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３ ＤＫＯシードトレイン培養物を０．８×１０^６細胞／ｍＬで播種し、未処理か、または１μＭスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６９４２）で処理した。生存率のために培養物を毎日サンプリングした。
流動制限装置（ＦＣＤ）

ＦＣＤ（Ｍｏｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９８：７７２－７８８）を使用して、ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞に対する剪断応力の影響を評価した。手短に言うと、シリンジポンプ（ハーバード装置、型番３３）を使用して、流速７０ｍＬ／分またはエネルギー散逸速度（ＥＤＲ）２．６７×１０^７Ｗ／ｍ^３で細胞をＦＣＤに通過させた。ＦＣＤを通過する前に、全細胞試料（陽性対照）を水中０．２ｇ／Ｌサポニン（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号０１６３）で１：１に希釈して細胞を溶解し、－８０℃で保存した。ＦＣＤを通過させた後、培養物を８３０×ｇで遠心分離し、上清を０．２ｇ／Ｌサポニンで１：１に希釈し、－８０℃で保存した。試料を解凍し、Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）についてアッセイした。ＦＣＤ後の全溶解（％）は、以下の式１を使用して計算した。ＦＣＤを通過する前後の生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率用にも培養物をサンプリングした。

トランスフェクション

一過性トランスフェクションを、５０ｍＬチューブスピンまたは１２５ｍＬ振盪フラスコにおいて３０ｍＬの作業体積で、２２Ｌウェーブバッグにおいて１０Ｌの作業体積で、またはａｍｂｒ１５マイクロバイオリアクターにおいて１２ｍＬの作業体積で行った。

３０ｍＬのトランスフェクションのために、細胞を、５０ｍＬチューブスピン（Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、カタログ番号ＳＶ９２０５０）または１２５ｍＬバッフルなし振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３１１４３）中の２５．５ｍＬの生成培地（表１参照）に２×１０^６細胞／ｍＬで播種し、振盪インキュベーターにおいて、３７℃、５％ＣＯ_２で、それぞれ２２５ｒｐｍ、軌道直径５０ｍｍ（Ｋｕｈｎｅｒ、型番ＩＳＦ１－Ｘ）または１２５ｒｐｍ、軌道直径２５ｍｍ（例えば、Ｋｕｈｎｅｒ、Ｉｎｎｏｖａ）で、トランスフェクションの２時間前に平衡化した。全てのトランスフェクションは、標準的なヒトＩｇＧ１（ｈｕＩｇＧ１）抗体をコードするＤＮＡを用いて行った。トランスフェクトするために、表示量のＤＮＡおよび７．５ ｍＭ の２５ｋＤａの直鎖状ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号１０１）を、３ｍＬの無血清培地（例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ還元血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１９８５０６２））中で１５分間インキュベートした後、平衡化細胞に添加した。加水分解物、アミノ酸および塩、ならびにグルコースを含有する２．６ｍＬ溶液を、トランスフェクションの２４時間後に添加した。このプロセスを、より小さい作業体積またはより大きい作業体積に対して比例的に規模を調整した。
細胞数、力価および生成物品質の測定

生細胞密度（ＶＣＤ）、生存率、代謝産物、ｐＨおよび／またはガスについて１～４日毎に培養物をサンプリングし、Ｖｉ－ＣＥＬＬ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ＦＬＥＸ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）またはＡＢＬ９０ ＦＬＥＸ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）を使用して測定した。上清試料からのＨｕＩｇＧ１抗体力価を、プロテインＡ ＨＰＬＣアッセイを使用して決定した。凝集レベル、酸性および塩基性変異体、ならびにさまざまなグリコフォームを含むＨｕＩｇＧ１抗体生成物の品質属性を、それぞれ、サイズ排除ＨＰＬＣ、画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）、および親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）ＨＰＬＣを使用して決定した。
Ｎ：Ｐ実験

上記のようにトランスフェクションを行った。最も高い力価をもたらす条件を決定するために、完全な要因実験により、ＰＥＩ：ＤＮＡ（Ｎ：Ｐ）比５、７．５、１０および１２．５、ならびにＤＮＡ濃度０．７５、１．０、１．２５および１．５μｇ／ｍＬを試験した。Ｎ：Ｐ比７．５およびＤＮＡ濃度１μｇ／ｍＬが、最高力価をもたらした（図２Ａ）ので、その後の全てのトランスフェクションに使用した。
２Ｌおよび３５Ｌバイオリアクターのシードトレイン

ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞をシードトレインとして、２つの制御された２Ｌバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）で２５日間培養した。バイオリアクター＃１は、ｐＨ設定値７．０、不感帯±０．０３およびＤＯ設定値３０％空気飽和を使用し、バイオリアクター＃２は、ｐＨ設定値７．０、不感帯±０．４およびＤＯ設定値６０％空気飽和を使用した。培養ｐＨは、酸としてＣＯ_２および塩基として１Ｍ炭酸ナトリウムを使用して制御し、ＤＯは、オープンパイプスパージャを介して空気および純酸素ガスをスパージングすることによって制御した。温度を３７℃の設定値に維持し、ピッチブレードインペラ（ｐｉｔｃｈｅｄ ｂｌａｄｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）を使用して２７５ｒｐｍで撹拌した。

その後、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞をシードトレインとして３５Ｌバイオリアクター（Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ）中で６０日間、ｐＨ設定値７．０、不感帯±０．０３およびＤＯ設定値３０％空気飽和を用いて培養した。培養ｐＨおよびＤＯは、２Ｌバイオリアクターと同じように制御した。温度を設定値３７℃に維持し、フラットブレードインペラを使用して５０ ｒｐｍで撹拌した。
ａｍｂｒ１５マイクロバイオリアクターシステム

最終作業体積１２ｍＬ、の温度設定値３７℃、およびＤＯ設定値３０％空気飽和を用いて、上記のようにａｍｂｒ１５マイクロバイオリアクターシステム（Ｈｓｕ，Ｗ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４：６６７－６７８を参照されたい）でトランスフェクションを行った。反復実験における４つの事例の要因実験では、ピッチブレードインペラを使用して、撹拌速度６３０ｒｐｍ対１４００ｒｐｍ、および設定値７．０の周囲でｐＨ不感帯±０．０３対±０．３を評価した。培養ｐＨは、酸としてＣＯ_２および塩基として０．５Ｍ炭酸ナトリウムを使用して制御し、ＤＯは、スパージチューブを介して空気および純酸素ガスをスパージングすることによって制御した。１～２日ごとに、消泡剤（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を各ａｍｂｒ１５バイオリアクターに添加した。
ウェーブバッグバイオリアクターシステム

ウェーブバッグバイオリアクターシステムは、加熱された揺動プラットフォーム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、型番２０／５０ＥＨＴ）、ガス混合ボックス（Ｄａｓｇｉｐ、型番ＭＸ４／４）、ならびに入口および出口ガスフィルタおよびサンプリングポートを備えた２２Ｌ公称体積ウェーブバッグ（例えば、ＴｈｅｒｍｏまたはＭｅｉｓｓｎｅｒ；カスタム品）からなっていた。最終作業体積１０Ｌ、温度設定値３７℃、揺動速度２０ｒｐｍ、揺動角度８°、および直接的なｐＨ制御はせずに、流量２７標準リットル／時（ｓｌｐｈ）で空気中５％ ＣＯ２のガスオーバーレイで、上記のようにトランスフェクションを実施した。
結果

アポトーシスを受けるＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞株の感受性、および剪断応力に対するその感受性を試験した。アポトーシスを誘導するために、スタウロスポリンをＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３ ＤＫＯ培養物に添加した。スタウロスポリンを添加すると、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞は、ＨＥＫ２９３細胞と比較して高い生存率を維持した（図１Ａ）。このことから、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞はアポトーシスに対してより耐性であると推測された。

剪断応力の影響を評価するために、ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３ ＤＫＯ培養物を流動制限装置（ＦＣＤ；Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５：１９７－２０３；Ｍｏｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９８：７７２－７８８）に通過させた。ＦＣＤは、制御された流量で細胞を狭い流路に通過させることによって、２．６７×１０^７ Ｗ／ｍ^３のエネルギー散逸速度（ＥＤＲ）に相当する激しい流体力および増加した剪断応力を細胞に与えた。ＦＣＤを通過した後、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞は、ＨＥＫ２９３細胞と比較して、より高い細胞密度、より高い生存率、および溶解の減少を示し（図１Ｂ～１Ｄ）、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞がＨＥＫ２９３細胞よりも剪断応力に対して耐性であることを示した。したがって、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞株は、ＢａｘおよびＢａｋの欠失によって所望の表現型特性を実証している。

ＰＥＩ（Ｎ）対ＤＮＡ（Ｐ）の比およびＰＥＩおよびＤＮＡの量は、一過性トランスフェクションの生産性に有意に影響を与え得る（Ｄｅｌａｆｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２７：１０３－１１１；Ｍａｃａｒａｅｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９：１０５０－１０５８；Ｃｈｏｏｓａｋｏｏｎｋｒｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９２：１７１０－１７２２；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：１３６－１４３）。最も高い力価を生じるＨＥＫ２９３ ＤＫＯ一過性トランスフェクション条件を決定するために、３０ｍＬのチューブスピンの生成培養物を２×１０^６細胞／ｍＬで播種し、要因実験を行って、さまざまなＮ：Ｐ比（５、７．５、１０、１２．５）およびＤＮＡ濃度（０．７５、１．０、１．２５、１．５μｇ／ｍＬ）を試験した。Ｎ：Ｐ比７．５およびＤＮＡ濃度１μｇ／ｍＬにより、最も高い力価が得られた（図２Ａ）。

この最適化された条件を使用して、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ一過性トランスフェクション性能を３０ｍＬチューブスピンのＨＥＫ２９３と比較した。両方の細胞型は、トランスフェクションにおいて同様の増殖および生存率を示し、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯおよびＨＥＫ２９３培養物について、最終日の生存率はそれぞれ６８．５％および７４．９％であった（図２Ｂ）。これは、これらのトランスフェクション培養物の生存率低下がアポトーシスではなく壊死によって誘導されることを示唆する。生産性に関して、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ培養物は、ＨＥＫ２９３培養物よりも４０％高い力価を発現した（図２Ｃ）。理論に拘束されることを望むものではないが、生産性の差は、ＨＥＫ２９３培養物に対する剪断応力の亜致死効果、またはＢａｘおよびＢａｋを欠失させる生物学的効果に起因し得ると考えられる。最適化されたＮ：Ｐ比７．５およびＤＮＡ濃度１μｇ／ｍＬを、スケールアップ／ダウンの対照として３０ｍＬスケールの全てのさらなるＨＥＫ２９３ ＤＫＯトランスフェクションに使用した。

要約すると、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞株は、ＨＥＫ２９３親細胞株よりもアポトーシスおよび剪断応力に対して耐性であった。この特性により、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞株は、組換えタンパク質のハイスループット一過性生成に有利になり、および生物製剤、ウイルスベクター、およびワクチンの安定な生成などの他のＨＥＫ２９３用途に有利になる可能性がある。
実施例２：ＨＥＫ２９３シードトレインのスケールアップ

細胞塊を効率的に生成して、大規模（１０Ｌ）トランスフェクションを支援するために、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯシードトレインを、複数の振盪フラスコではなく３５Ｌ制御バイオリアクターで培養した。定期的に継代された（すなわち、３～４日ごとに分割）作業体積２０～３５Ｌのシードトレインバイオリアクターは、２×１０^６細胞／ｍＬで週に２回播種された４０～７０Ｌのトランスフェクションを開始するのに十分な細胞を提供する。これにより、ハイスループットの大規模な一過性生産運転の日常的な実行が可能になる。

３５ＬバイオリアクターでＨＥＫ２９３ ＤＫＯシードトレインを試験する前に、２つの２Ｌバイオリアクターで異なるｐＨおよび溶存酸素（ＤＯ）制御条件を最初に評価した。バイオリアクター＃１は、ｐＨ設定値７．０、不感帯±０．０３およびＤＯ設定値３０％を使用した。これらはＣＨＯ安定細胞株培養の典型的な条件である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ｍＡｂｓ．２：４６６－４７７；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９：１１７３－１１８６；Ｙｕｋ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２７：１３９７－１４０６）。バイオリアクター＃２は、振盪フラスコのｐＨおよびＤＯ条件により近い傾向の、ｐＨ設定値７．０、不感帯±０．４、およびＤＯ設定値６０％を使用した。ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞を振盪フラスコおよび２Ｌバイオリアクター内で並行して３～４日ごとに合計２５日間継代し、増殖および代謝産物をモニターした。

２ＬバイオリアクターＨＥＫ２９３ ＤＫＯシードトレインを、振盪フラスコシードトレインと比較したところ、両方とも同様のピーク細胞密度まで増殖し、同様の生存率を維持した（図３Ａ）。これは、シードトレイン全体にわたる同様のグルコース消費および乳酸生成と相関する（図３Ｂ）。バイオリアクター＃２は、振盪フラスコと同様のｐＨおよびＤＯの傾向を示した（図３Ｃおよび３Ｄ）。シードトレインからの細胞を、３０ｍＬのチューブスピントランスフェクションに４週間にわたって毎週使用した。興味深いことに、振盪フラスコのシードトレインから供給された細胞からの力価と比較して、振盪フラスコのｐＨおよびＤＯ条件を模倣したバイオリアクター＃２から供給された細胞からは、やや低い力価が観察され、より厳密な制御（図３Ｅ）を用いたバイオリアクター＃１から供給された細胞からは同様の力価が観察された。振盪フラスコシードトレインにおける異なる混合は、細胞の高い生産性を説明し得る。バイオリアクターでは、狭いｐＨ不感帯条件が、シードトレイン細胞および／またはそれらの使用済み培地に影響を与え、トランスフェクションにより適していた可能性がある。これは、（１）一過性トランスフェクション中のＤＮＡ／ＰＥＩ複合体と細胞表面とのより最適な静電荷相互作用をもたらす、（２）ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体の核への細胞内輸送を促進する、または（３）組換えタンパク質の転写、翻訳、および分泌を増強する、生物学的改変を必然的に伴う。

続いて、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯシードトレインを、バイオリアクター＃１条件（ｐＨ設定値７．０、狭い不感帯±０．０３およびＤＯ設定値３０％）を使用し、本発明者らの２Ｌバイオリアクターの体積当たりの電力入力（１３Ｗ／ｍ^３）と一致させて、３５Ｌバイオリアクターにスケールアップした。ＨＥＫ２９３ ＤＫＯの振盪フラスコおよび３５Ｌバイオリアクターシードトレインを並行して３～４日ごとに合計６０日間継代し、増殖および代謝産物について定期的にモニターした。ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞は、解凍後最大１５０日間、同等のトランスフェクション生産性を示したが、バイオリアクターの故障／セットアップ（大きな労働力を要する操作）の頻度と、液体－空気界面でのバイオリアクターのガラス壁上の細胞残屑がバイオリアクター内での連続継代から蓄積しないことを確実にすることとのバランスをとるために、バイオリアクターに６０日間の期間を選択した。これは、新しい振盪フラスコを継代ごとに使用した振盪フラスコシードトレイン手順とは対照的である。

バイオリアクターＨＥＫ２９３ ＤＫＯシードトレインは、振盪フラスコシードトレインと比較してわずかに高いピーク細胞密度および低い生存率を達成した（図４Ａ）。予想通り、ｐＨ制御により、バイオリアクターシードトレインは、振盪フラスコよりも多くのグルコースを消費し、多くの乳酸を生成した（図４Ｂ）。このグルコース消費は、２Ｌバイオリアクターシードトレインとは異なり（図３Ｂ）、スパージングおよび混合を含むスケール差のためと思われる。バイオリアクターの継代中のｐＨスパイクを除いて、バイオリアクターシードトレインはそのｐＨ７．０、不感帯±０．０３を維持した（図４Ｃ）。バイオリアクターは、ＤＯ設定値３０％および類似の２Ｌバイオリアクターと同様の傾向を維持した。９週間にわたって毎週、シードトレインからの細胞を３０ｍＬのチューブスピントランスフェクションに使用した。バイオリアクターと振盪フラスコシードトレインとの間の上記の違いにもかかわらず、振盪フラスコおよび３５Ｌバイオリアクターから供給された細胞は、９週間のトランスフェクションにわたって同様の力価（図４Ｄ）および生成物品質（図４Ｅ～４Ｎ）を生じた。ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞株は、シードトレインのバイオリアクターにおいて堅牢な性能を示した。バイオリアクターシードトレインは、５０％以下のシードトレイン培養物を使用して生成培養物を播種することを可能にするピーク細胞密度まで増殖し（２×１０^６細胞／ｍＬで）、生成における使用済み培地の体積を最小化する。シードトレインによる５０％超の使用済み培地を生産に持ち越すと、一過性タンパク質発現に悪影響を及ぼすことが示された（Ｔｕｖｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：１２３－１３６）。

これらのデータは、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯシードトレインを３５Ｌバイオリアクターで最大６０日間培養して毎週のトランスフェクションを供給できることを実証している。これは、撹拌タンク、制御されたバイオリアクターにおける、パイロットスケール（３５Ｌ）でのＨＥＫ２９３シードトレインの長期培養を記載した最初の報告である。１．８Ｌバイオリアクターで１０日間ＨＥＫ２９３細胞を培養した報告があるが（Ｌｉｓｔｅ－Ｃａｌｌｅｊａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：９９５１－９９６０）、本明細書で実証されたシードトレイン戦略は、最大６０日間３５Ｌの培養を支援して、日常的なハイスループット大規模一過性トランスフェクションを供給する。

多数の論文が、高密度で播種したトランスフェクションから高力価を達成することを記載している（Ｒａｊｅｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１２：９７７－９８６；Ｂａｃｋｌｉｗａｌ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９９：７２１－７２７；Ｒａｊｅｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５３：２２－２６；Ｂｌａｈａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１０９：７－１３；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９９：１０８－１１６；Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１３４：３８－４６）。しかし、これらの報告では、生成培養物を異なる日に複数回播種または希釈し、高い培養密度を得るために遠心分離および培地交換に依存した。これは、シードトレイン培養物を培地で希釈することによって、生成培養物をトランスフェクションの日にのみ播種した、ハイスループット操作をより助長するアプローチである本明細書に記載のトランスフェクションプロセスとは異なる。
実施例３：ＨＥＫ２９３のトランスフェクションおよび生産の最適化およびスケールアップ

Ａｍｂｒ１５バイオリアクターは、ＣＨＯ安定細胞株プロセス開発に使用されてきた（Ｗａｌｅｓ ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ（２０１０）Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．９：２２－２５）。しかし、現時点では、ａｍｂｒ１５バイオリアクターにおけるＨＥＫ２９３培養物のトランスフェクション生産条件の最適化について記載した報告はない。

最適なパラメータを特定し、制御されたバイオリアクターにおけるＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞のトランスフェクションの実現可能性を評価するために、上記のようなさまざまな撹拌およびｐＨ条件で、ａｍｂｒ１５マイクロバイオリアクターにおいてトランスフェクションを実施した。反復実験における４つの事例の要因実験では、撹拌速度６３０対１４００、および設定値７．０の周囲でｐＨ不感帯±０．０３対±０．３において評価した。高撹拌および低撹拌を、２つのスケールアップ／ダウン戦略（Ｈｓｕ，Ｗ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４：６６７－６７８）に基づいて選択した：（１）６３０ｒｐｍは、２Ｌバイオリアクターの体積当たりの電力入力（Ｐ／Ｖ）（１３ Ｗ／ｍ^３）と一致し、（２）１４００ｒｐｍは、２Ｌバイオリアクターの最大剪断（インペラ先端速度によって表される）（０．２６ｍ／秒）と一致する。ｐＨ不感帯は、バイオリアクターおよび振盪フラスコ条件を模倣するように選択した。トランスフェクト培養物を増殖および代謝産物についてモニターした。機器の制限のために、対照の事例にはチューブスピンの代わりに３０ｍＬ振盪フラスコを使用した。

振盪フラスコおよびチューブスピンは、３０ｍＬスケールで同等の力価を生じた（データ非掲載）。より高い生細胞密度および生存率は、６３０ｒｐｍでのａｍｂｒの撹拌および厳密な±０．０３ ｐＨ不感帯付近のｐＨ制御と相関した（図５Ａ）。全ての容器にわたる同様のグルコース消費にもかかわらず、ａｍｂｒバイオリアクター培養物は、振盪フラスコ培養物と比較して最終乳酸レベルが低く（図５Ｂ）、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞の代謝がｐＨ制御によって異なり、乳酸が生産終了近くで消費されたことを示した。±０．３の広いｐＨ不感帯は、より少ない塩基添加による低浸透圧レベルと相関し、振盪フラスコ培養物と同様のｐＨ傾向を示した（図５Ｃ）。予想通り、酸素レベルは最も高く、１４００ｒｐｍのａｍｂｒの撹拌を伴う振盪フラスコに最も類似していた（図５Ｄ）。最大収率は、６３０ｒｐｍの撹拌および±０．３０の広いｐＨ不感帯で、ａｍｂｒバイオリアクターにおいて生じた（図５Ｅ）。理論に拘束されることを望むものではないが、これらのより高い力価は、（１）トランスフェクション中の細胞とＤＮＡ／ＰＥＩ複合体とのより最適な相互作用、またはタンパク質発現をより助長する条件、を可能にする６３０ｒｐｍでのより低いレベルの剪断応力、および（２）生産終了近くでｐＨを維持するための塩基添加の減少をもたらす、より低い浸透圧およびより低い最終乳酸と直接相関する広い±０．３ｐＨ不感帯、によるものであり得ると考えられる。

次に、広い±０．３ｐＨ不感帯がａｍｂｒバイオリアクターにおける高収率と相関することを知って、ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ細胞のトランスフェクションをスケールアップし、１０Ｌウェーブバッグおよび３０ｍＬチューブスピンにおいて直接ｐＨ制御なしで評価した。空気中５％ＣＯ_２のガスオーバーレイで、直接ｐＨ制御なしでウェーブバッグおよびチューブスピンを操作した。トランスフェクト培養物を増殖および代謝産物についてモニターした。

３０ｍＬチューブスピン中のトランスフェクト細胞は、１０Ｌウェーブバッグと比較して、より高い細胞密度およびより高い最終生存率に達した（図６Ａ）。しかし、これらの細胞数は、細胞集塊によって混同されている可能性がある。ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ １０Ｌウェーブバッグトランスフェクションは、３０ｍＬ チューブスピン培養物と比較して、より有意な集塊形成（データ非掲載）、より高い最終日乳酸レベル（図６Ｂ）、およびより低い酸素レベル（図６Ｄ）を示した。細胞集塊、乳酸および酸素の違いにもかかわらず、両方の容器型からの細胞は、同様の速度でグルコースを消費し（図６Ｂ）、同様の浸透圧およびｐＨプロファイルを示し（図６Ｃ）、同等の最終力価を生じた（図６Ｅ）。これらのデータは、大規模な１０Ｌウェーブバッグおよび３０ｍＬチューブスピンにおいて同様の力価を生じたＨＥＫ２９３ ＤＫＯトランスフェクション方法を実証する。撹拌タンクバイオリアクターの代わりに、生成のために記載のウェーブバッグシステムを使用すると、プローブおよびオンライン測定、ならびに製造運転間の洗浄および滅菌工程の必要性がなくなる。これは、治療候補同定のためのバイオ医薬品研究努力用材料を生産するための、ハイスループット大規模トランスフェクション実行に関する大きなリソース節約および運用上の利点を提供する。

組み合わせて、本明細書に記載の最適化されたＨＥＫ２９３ ＤＫＯ ３５Ｌバイオリアクターシードトレインおよび１０Ｌ一過性トランスフェクションプロセスは、組換えタンパク質のハイスループット生成を可能にし、治療用臨床候補の同定につながる調査研究を支援する。

ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションは、治療用候補を同定するための抗体および大分子発見キャンペーンのための、組換えタンパク質を迅速に生成する方法として確立されてきた。抗アポトーシスＨＥＫ２９３細胞株を、アポトーシス促進遺伝子ＢａｘおよびＢａｋを欠失させることによって操作した。ＨＥＫ２９３ Ｂａｘ Ｂａｋダブルノックアウト（ＨＥＫ２９３ ＤＫＯ）細胞株はアポトーシスおよび剪断応力に耐性であり、細胞を使用して３５Ｌバイオリアクターシードトレインおよび１０Ｌ高力価一過性生産プロセスを最適化および実行した。定期的に継代されたバイオリアクターシードトレイン（すなわち、３～４日ごとに分割）は、ｐＨ設定値７．０、狭いｐＨ不感帯±０．０３、およびＤＯ設定値３０％を使用した場合に最も生産性が高かった。３５Ｌのバイオリアクターシードトレインは、最大７０Ｌのトランスフェクションを週に２回、最大６０日間開始するのに十分な細胞を提供した。これは、日常的なトランスフェクションのための細胞を供給する、パイロット規模のバイオリアクターにおけるＨＥＫ２９３シードトレインの長期培養の最初の報告であると考えられる。一過性製造プロセスを最適化するために、ａｍｂｒ １５マイクロバイオリアクターを使用してｐＨおよび撹拌パラメータを試験し、ｐＨ設定値７．０、広いｐＨ不感帯±０．４、および６３０ ｒｐｍの撹拌を使用した場合に最も高い力価が生じることが分かった。広いｐＨ不感帯に類似のｐＨを目標として、直接的なｐＨ制御なしで、一過性の製造プロセスを１０Ｌウェーブバッグにスケールアップした。試験した全ての規模でのＨＥＫ２９３ ＤＫＯ一過性トランスフェクションは、７日間で最大６５０ｍｇ／Ｌの高い抗体力価を生じた。ＨＥＫ２９３ ＤＫＯの３５Ｌバイオリアクターシードトレインおよび１０Ｌ高力価製造プロセスの開発は、研究および前臨床研究のための組換えタンパク質の効率的でハイスループットな生成を可能にする。

Claims (48)

1. 組換えポリペプチドを生成する方法であって、
   （ａ）ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれにおける機能喪失変異と、（ｂ）前記組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、を含むＨＥＫ２９３細胞株を、前記ポリペプチドの生成に適した条件下で培養することを含む、方法。
2. 前記組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
3. 前記組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、前記ＨＥＫ２９３細胞株の染色体に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
4. 前記組換えポリペプチドが、抗体もしくはその抗原結合断片、抗原、酵素、またはワクチンである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記組換えポリペプチドが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項４に記載の方法。
6. 前記細胞株が、７日間で約６５０ｍｇ／Ｌの力価で前記組換えポリペプチドを生成する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記組換えポリペプチドを、前記細胞株から単離することをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. ウイルスベクターを生成する方法であって、
   （ａ）ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれにおける機能喪失変異、（ｂ）ウイルスゲノム、ならびに（ｃ）ウイルスキャプシドをコードする１種以上のポリヌクレオチド、を含むＨＥＫ２９３細胞株を、前記ウイルスベクターの生成に適した条件下で培養することを含む、方法。
9. 前記ウイルスベクターを前記細胞株から単離することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記細胞株が、細胞培養培地中で培養される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記細胞株が、約６．７～約７．３のｐＨで培養される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記細胞株が、溶存酸素（ＤＯ）設定値約３０％で培養される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記細胞株が、約１３Ｗ／ｍ^３の体積当たりの電力入力（ｐｏｗｅｒ ｉｎｐｕｔ ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ）（Ｐ／Ｖ）を付与する撹拌速度で培養される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記細胞株が、少なくとも約１０Ｌの体積で培養される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記細胞株が、少なくとも約２５Ｌの体積で培養される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記細胞株が、３５Ｌバイオリアクター培養で培養される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記細胞株を３５Ｌバイオリアクター培養で６０日間培養することを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記細胞株が、前記細胞株を３５Ｌバイオリアクター培養での６０日間の培養後、少なくとも８５％の細胞生存率を維持する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記細胞株が、約２０Ｌ～約３５Ｌの作業体積で前記３５Ｌバイオリアクター培養で培養される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記細胞株が、流加培養条件下で培養される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記細胞株が、灌流培養条件下で培養される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
22. 細胞培養培地と、複数のＨＥＫ２９３細胞とを含む細胞培養物であって、前記複数の細胞のそれぞれが、ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含む、細胞培養物。
23. 前記細胞が、３５Ｌバイオリアクター培養に十分な細胞密度である、請求項２２に記載の細胞培養物。
24. 前記細胞が、３５Ｌバイオリアクター培養に十分な細胞密度で、６０日間維持される、請求項２３に記載の細胞培養物。
25. 前記細胞株が、前記細胞株を３５Ｌバイオリアクター培養での６０日間の培養後、少なくとも８５％の細胞生存率を維持する、請求項２４に記載の細胞培養物。
26. 前記複数の細胞が、２．６７×１０^７ Ｗ／ｍ^３のエネルギー散逸速度（ＥＤＲ）の剪断応力への曝露後に、７５％超の細胞生存率を維持する、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の細胞培養物。
27. 前記複数の細胞が、１μＭスタウロスポリンへの７０時間の曝露後、７５％超の細胞生存率を維持する、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の細胞培養物。
28. 前記複数の細胞のそれぞれが、前記Ｂａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の細胞培養物。
29. 前記細胞株が、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の細胞培養物。
30. 前記組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、請求項２９に記載の細胞培養物。
31. 前記組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ヒト細胞株の染色体に組み込まれている、請求項２９に記載の細胞培養物。
32. 前記組換えポリペプチドが、抗体もしくはその抗原結合断片、抗原、酵素、またはワクチンである、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の細胞培養物。
33. 前記組換えポリペプチドが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項３２に記載の細胞培養物。
34. ７日間で約６５０ｍｇ／Ｌの力価で前記組換えポリペプチドを生成する、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
35. 前記細胞株が組換えポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の細胞培養物。
36. ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含む、単離されたＨＥＫ２９３細胞株。
37. 前記Ｂａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む、請求項３６に記載の細胞株。
38. ウイルスゲノムと、ウイルスキャプシドをコードする１種以上のポリヌクレオチドとをさらに含む、請求項３６または請求項３７に記載の細胞株。
39. 組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３６または請求項３７に記載の細胞株。
40. 前記組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、請求項３９に記載の細胞株。
41. 前記組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、前記ヒト細胞株の染色体に組み込まれている、請求項３９に記載の細胞株。
42. 前記組換えポリペプチドが、抗体もしくはその抗原結合断片、抗原、酵素、またはワクチンである、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の細胞株。
43. 前記組換えポリペプチドが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項４２に記載の細胞株。
44. 前記ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれのポリヌクレオチドおよび機能的コピーを含む対応する単離されたヒト細胞株よりも高い力価の前記組換えポリペプチドを生成する、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の細胞株。
45. 前記ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離されたヒト細胞株よりも剪断応力に対して耐性である、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の細胞株。
46. 前記ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離されたヒト細胞株よりもアポトーシスに対して耐性である、請求項３６～４５のいずれか一項に記載の細胞株。
47. 前記ヒトＢａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離されたヒト細胞株よりもスタウロスポリンに対して耐性である、請求項３６～４６のいずれか一項に記載の細胞株。
48. 請求項３６～４７のいずれか一項に記載の細胞と、細胞培養培地と、を含む細胞培養物。
    

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