JP7432650B2

JP7432650B2 - 改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性のための、治療用免疫グロブリンｇ４の設計

Info

Publication number: JP7432650B2
Application number: JP2022069326A
Authority: JP
Inventors: チエン・ユーミン; ジェンジアン・リ; シュアンクオ・シュー; タン・ジジュン; チャオ・フアン; ジーチャン・チェン
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2024-02-16
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: WO2018119380A2; CN118047864A; US11542337B2; JP2020504608A; WO2018119380A3; CN110461869A; US20200109208A1; CN110461869B; JP2022109960A; JP7062669B2; KR20190095946A; EP3559029A2

Description

関連出願の相互引用
本出願は、２０１６年１２月２３日出願の米国仮特許出願第６２／４３８６８４号に基づく優先権の利益を主張し、全ての目的に関してその内容全体を引用により本明細書中に包含させる。

発明の背景
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびそれらの誘導体産物（例えば、Ｆｃ－融合タンパク質）は、これらのタイプの生物製剤の安全性、有効性および高品質のために、最も困難なヒト疾患のいくつかの処置において重要な役割を果たす。モノクローナル抗体市場は急速に成長しており、モノクローナル抗体製品の世界全体での売上高は、２０２０年までに約１２５０億ドルに達し得ると推定されている。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、治療用抗体の最も高頻度に用いられるバックボーンである。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の４つのサブクラスがある。ＩｇＧ４は、ＩｇＧ４抗体の抗炎症活性のために免疫エフェクター機能の動員が望まれない用途に好ましいサブクラスである。

免疫グロブリンＧアイソタイプ４（ＩｇＧ４）は、重鎖および結合している軽鎖（半分子）と別の分子からの重鎖および軽鎖の対とを交換することによってＦａｂアームを交換することができ、結果として二重特異性抗体をもたらすことが可能な動的分子である。ＩｇＧ４Ｆａｂアーム交換は、ＣＨ３ドメイン中の決定基と共にＩｇＧ４コア－ヒンジ配列に起因するとされてきた。治療用野生型ＩｇＧ４は、Ｆａｂアームを内因性ヒトＩｇＧ４と交換することが報告されており、これはそれらの治療活性に影響を及ぼし得る。治療用ＩｇＧ４を設計するときにインビボでのＦａｂアーム交換を防ぐために、ヒンジ領域内のセリン２２８をプロリンに変異させて（ＥＵナンバリングではＳ２２８Ｐ）、治療用ＩｇＧ４を産生することが多い。しかしながら、そのような変異は、望ましくないバイオアナリシスおよびバイオプロセシング挙動を引き起こし得る。

従って、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を有する治療用ＩｇＧ４分子の設計が依然として必要とされている。

発明の概要
特定の態様において、本発明は、重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖が、（ａ）位置１９６のリシン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４ＣＨ１領域；または、（ｂ）位置２１７のセリン残基の置換、位置２２０のグリシン残基の置換、位置２２４のプロリン残基の置換または位置２２５のプロリン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む、ＩｇＧ４抗体を提供する。要すれば、ＩｇＧ４抗体は、重鎖ヒンジ領域中の位置２２８のセリン残基の置換をさらに含む。好ましくは、ＩｇＧ４抗体は、置換を含まない対応するＩｇＧ４分子（“非修飾ＩｇＧ４抗体”または“野生型抗体”とも称する）と比較して改善されたバイオアナリシス特性またはバイオプロセシング特性を有する。例えば、位置２２８のセリン残基は、プロリンに置換される（Ｓ２２８Ｐ）。説明すると、位置１９６のリシン残基はプロリンに置換される（Ｋ１９６Ｐ）；位置２１７のセリン残基はプロリンに置換される（Ｓ２１７Ｐ）；位置２２０のグリシン残基はスレオニンに置換される（Ｇ２２０Ｔ）；位置２２４のプロリン残基はヒスチジンに置換される（Ｐ２２４Ｈ）；位置２２５のプロリン残基はスレオニンに置換される（Ｐ２２５Ｔ）。要すれば、ＩｇＧ４抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。要すれば、ＩｇＧ４抗体は、全長抗体またはＦ(ａｂ)_２のような抗体フラグメントである。ある特定の側面において、ＩｇＧ４抗体は、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ４、ｅＴａｕ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｌａｇ３、ＰＤ１、ＰＤＬ１またはＩＲから選択される標的分子に結合する。例えば、ＩｇＧ４抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖における置換を含む。説明すると、ＩｇＧ４抗体は、配列番号２２、２５、２７、２８または２９から選択されたアミノ酸配列を含む。例えば、改善されたバイオアナリシス特性は、ＰｒｏＰａｃＳＣＸ－１０、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ－１０、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＣＭ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ（登録商標）Ｓ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＮＰＲ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＴＡＴ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－２ＳＷ、ＳＯＵＲＣＥ（商標）１５Ｓ４．６／１００ＰＥＩ、ＭｏｎｏＳ（登録商標）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＢＩＯＰｏｌｙＭＡ－ＳＣＸ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｘ（登録商標）ＷＣＸ－ＮＰ、ＰｒｏｔｅｏｍｉｘＳＣＸ－ＮＰまたはＰｒｏｔｅｏｍｉｘＷＣＸ－ＮＰを含むが、これらに限定されない、分析的陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）樹脂の単一ピーク溶出挙動を含む。説明すると、バイオプロセシング特性は、ＰｏｒｏｓＨＳ、ＰｏｒｏｓＸＳ、カルボキシ－メチル－セルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤＡＢＸＴＭ、アガロースに固定化したスルホプロピルおよびアガロースに固定化したスルホニル、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓ、３０Ｓ、ＳＰセファロース、ＣＭセファロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤカルボキシ－スルホン、ＷＰＣＢＸ、ＷＰスルホニック、ハイドロセルＣＭ、ハイドロセルＳＰ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、マクロプレップハイＳ、マクロプレップＣＭ、セラミックハイパーＤＳ、セラミックハイパーＤＣＭ、セラミックハイパーＤＺ、トリスアクリルＭＣＭ、トリスアクリルＬＳＣＭ、トリスアクリルＭＳＰ、トリスアクリルＬＳＳＰ、ＳｐｈｅｒｏｄｅｘＬＳＳＰ、ＤＯＷＥＸ微細メッシュ強酸性カチオン樹脂、ＤＯＷＥＸＭＡＣ－３、ＭａｔｒｅｘセルファインＣ５００、ＭａｔｒｅｘセルファインＣ２００、フラクトゲルＥＭＤＳＯ３－、フラクトゲルＥＭＤＳＥ、フラクトゲルＥＭＤＣＯＯ－、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、Ｄｉａｉｏｎ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、ＴＳＫゲルＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、ＴＳＫゲルＳＰ－５ＰＷ、トヨパールＣＭ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、トヨパールＳＰ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、ＣＭ（２３、３２、５２）、ＳＥ（５２、５３）、Ｐ１１、Ｅｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＣまたはＥｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＳを含むが、これらに限定されない、ＣＥＸ樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む。

特定の態様において、本発明は、（ａ）位置１９６のリシン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４重鎖ＣＨ１領域；または、（ｂ）位置２１７のセリン残基の置換、位置２２０のグリシン残基の置換、位置２２４のプロリン残基の置換または位置２２５のプロリン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４重鎖ヒンジ領域、を含む融合タンパク質を提供する。要すれば、ＩｇＧ４抗体は、Ｋ１９６Ｐ、Ｓ２１７Ｐ、Ｇ２２０Ｔ、Ｐ２２４ＨまたはＰ２２５Ｔから選択される少なくとも１つの変異を含む。要すれば、融合タンパク質は、ＩｇＧ４重鎖ヒンジ領域中の位置２２８でのセリン残基の置換（例えば、Ｓ２２８変異）をさらに含む。好ましくは、融合タンパク質は、未修飾融合タンパク質（すなわち、ＩｇＧ４重鎖の位置１９６、２１７、２２０、２２４または２２５のアミノ酸修飾を含まない）と比較して改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を有する。

特定の態様において、本発明は、ヒトＩｇＧ４重鎖の位置１９６、２１７、２２０、２２４または２２５の少なくとも１つの残基を置換することによりＩｇＧ４抗体を修飾することを含む、ＩｇＧ４抗体のバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を改善するための方法であって、ここで、修飾ＩｇＧ４抗体が、非修飾ＩｇＧ４抗体と比較して改善されたバイオアナリシス特性またはバイオプロセシング特性を有する、方法を提供する。例えば、修飾ＩｇＧ４抗体は、Ｋ１９６Ｐ、Ｓ２１７Ｐ、Ｇ２２０Ｔ、Ｐ２２４ＨまたはＰ２２５Ｔから選択される少なくとも１つの変異を含む。要すれば、ＩｇＧ４抗体はＳ２２８Ｐ変異を含む。要すれば、ＩｇＧ４抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。要すれば、ＩｇＧ４抗体は、全長抗体またはＦ(ａｂ)_２のような抗体フラグメントである。ある特定の側面において、ＩｇＧ４抗体は、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ４、ｅＴａｕ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｌａｇ３、ＰＤ１、ＰＤＬ１またはＫＩＲから選択される標的分子に結合する。説明すると、改善されたバイオアナリシス特性は、ＰｒｏＰａｃＳＣＸ－１０、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ－１０、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＣＭ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ（登録商標）Ｓ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＮＰＲ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＴＡＴ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－２ＳＷ、ＳＯＵＲＣＥ（商標）１５Ｓ４．６／１００ＰＥＩ、ＭｏｎｏＳ（登録商標）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＢＩＯＰｏｌｙＭＡ－ＳＣＸ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｘ（登録商標）ＷＣＸ－ＮＰ、ＰｒｏｔｅｏｍｉｘＳＣＸ－ＮＰまたはＰｒｏｔｅｏｍｉｘＷＣＸ－ＮＰを含むが、これらに限定されない、分析的陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）樹脂の単一ピーク溶出挙動を含む。要すれば、該単一ピーク溶出挙動は、配合薬剤に対してＣＥＸ－ＨＰＬＣを用いるチャージバリアント分析法の開発に用いられる。説明すると、バイオプロセシング特性は、ＰｏｒｏｓＨＳ、ＰｏｒｏｓＸＳ、カルボキシ－メチル－セルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤＡＢＸＴＭ、アガロースに固定化したスルホプロピルおよびアガロースに固定化したスルホニル、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓ、３０Ｓ、ＳＰセファロース、ＣＭセファロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤカルボキシ－スルホン、ＷＰＣＢＸ、ＷＰスルホニック、ハイドロセルＣＭ、ハイドロセルＳＰ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、マクロプレップハイＳ、マクロプレップＣＭ、セラミックハイパーＤＳ、セラミックハイパーＤＣＭ、セラミックハイパーＤＺ、トリスアクリルＭＣＭ、トリスアクリルＬＳＣＭ、トリスアクリルＭＳＰ、トリスアクリルＬＳＳＰ、ＳｐｈｅｒｏｄｅｘＬＳＳＰ、ＤＯＷＥＸ微細メッシュ強酸性カチオン樹脂、ＤＯＷＥＸＭＡＣ－３、ＭａｔｒｅｘセルファインＣ５００、ＭａｔｒｅｘセルファインＣ２００、フラクトゲルＥＭＤＳＯ３－、フラクトゲルＥＭＤＳＥ、フラクトゲルＥＭＤＣＯＯ－、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、Ｄｉａｉｏｎ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、ＴＳＫゲルＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、ＴＳＫゲルＳＰ－５ＰＷ、トヨパールＣＭ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、トヨパールＳＰ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、ＣＭ（２３、３２、５２）、ＳＥ（５２、５３）、Ｐ１１、Ｅｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＣまたはＥｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＳを含むが、これらに限定されない、ＣＥＸ樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む。

特定の態様において、本発明は、ＩｇＧ４重鎖の位置１９６、２１７、２２０、２２４または２２５の少なくとも１つの残基を置換することによりＩｇＧ４重鎖ＣＨ１またはヒンジ領域を修飾することを含む、ＩｇＧ４重鎖ＣＨ１またはヒンジ領域を含む融合タンパク質のバイオアナリシス特性またはバイオプロセシング特性を改善する方法であって、ここで、修飾融合タンパク質が、非修飾融合タンパク質と比較して改善されたバイオアナリシス特性またはバイオプロセシング特性を有する、方法を提供する。例えば、修飾された融合タンパク質は、Ｋ１９６Ｐ、Ｓ２１７Ｐ、Ｇ２２０Ｔ、Ｐ２２４ＨまたはＰ２２５Ｔから選択された少なくとも１つの変異を含む。要すれば、融合タンパク質はＳ２２８Ｐ変異を含む。好ましくは、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む。

特定の態様において、本発明は、（１）上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質；および、（２）薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物を提供する。例えば、医薬組成物は液体製剤である。例えば、医薬組成物は、非経腸送達、皮下送達、静脈内送達、筋肉内送達、経鼻送達、または肺送達用に製剤される。要すれば、医薬組成物は、併用療法のための別のモノクローナル抗体をさらに含む。

特定の態様において、本発明は、上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

特定の態様において、本発明は、上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

特定の態様において、本発明は、（プロモーターに作動可能に連結された）上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞である。

特定の態様において、本発明は、上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、該ＩｇＧ４抗体または融合タンパク質の発現に適する条件下で培養することを含む、上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質を製造する方法を提供する。要すれば、該方法は、ＩｇＧ４抗体または融合タンパク質を単離することをさらに含む。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞である。

特定の態様において、本発明は、対象（例えば、ヒト）において癌を処置する方法であって、治療的有効量の上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供する。

特定の態様において、本発明は、対象（例えば、ヒト）において自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する方法であって、治療的有効量の上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供する。

図１は、治療用ＩｇＧ４分子のＣＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ヒンジにおいてセリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ）を有する全ての治療用ＩｇＧ４分子についてＣＥＸ－ＨＰＬＣカラム上での２ピーク溶出挙動が観察された。全ての治療用ＩｇＧ１分子および野生型ＩｇＧ４についてＣＥＸ－ＨＰＬＣカラム上での単一ピーク溶出挙動が観察された。ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法は、１０μｇの一定の総注入タンパク質質量で、２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ５．０から２０ｍＭＭＥＳ、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０（０－６分）の塩勾配溶出を用いた。図２は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣの、ｍＡｂ１１、ピーク１およびピーク２についてのＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。２つのクロマトグラムは非常によく重なり、これは、２ピークにサイズの相違または凝集体の形成がないことを示す。分析的ＳＥＣを、ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）のＷａｔｅｒｓＨＰＬＣシステムに設置されたＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＫｉｎｇｏｆＰｒｕｓｓｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）のＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬカラムを用いて行った。該方法は、１００μｇの一定の総注入タンパク質質量を用いて、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、ｐＨ６．８を、１ｍＬ／分の流速で用いた。溶出したタンパク質をＵＶ２８０ｎｍでモニターした。図３は、治療用ｍＡｂ１１についてＣＥＸ－ＨＰＬＣで形成されたピーク１およびピーク２についてのｉＣＥ２８０プロファイルを示す。２つのクロマトグラムは非常によく重なり、これらの２つのピークに電荷差がないことが示される。図４は、ｍＡｂ１１のＣＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムならびにピーク１およびピーク２の再注入を示す。ピーク１およびピーク２の再注入は、依然として、２つの類似の溶出パターンをもたらした。ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法は、１０μｇの一定の総注入タンパク質質量で、異なるｐＨで、２０ｍＭＭＥＳから２０ｍＭＭＥＳ、１ＭＮａＣｌの塩勾配溶出（０－６０分）を用いた。図５ａは、異なるｐＨでのｍＡｂ１１のＣＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。２ピーク溶出挙動がｐＨ５．０で観察された。ｐＨの変化は、２つのピークの比を変えた。ｐＨを上げると、第一のピークの割合が高くなり、一方で、ｐＨを下げると、第二のピークの割合が高くなった。図５ｂは、異なるｐＨでのｍＡｂ３のＣＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。イピリムマブについては、異なるｐＨで、単一ピーク溶出挙動が観察された。ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法は、１０μｇの一定の総注入タンパク質質量で、ｐＨを変えて、２０ｍＭＭＥＳから２０ｍＭＭＥＳ、１ＭＮａＣｌの塩勾配溶出（０－６０分）を用いた。

図６ａ－６ｂは、ｍＡｂ４およびｍＡｂ１２の別個の注入（ａ）または１：１比での複合（コンボ）抗体（ｂ）の例示的なＣＥＸ－ＨＰＬＣｅ－ｇｒａｍを示す。ｍＡｂ１２は広い２ピーク溶出挙動を有するため、それはｍＡｂ４と重なり、２つの１：１比のコンボ抗体をＣＥＸカラム上に注入するときにチャージバリアント特性化を困難にする。図６ｃ－６ｄは、ｍＡｂ４およびｍＡｂ１２の別個の注入（ｃ）または１：１比でのコンボ抗体（ｄ）の例示的なＣＥＸ－ＨＰＬＣｅ－ｇｒａｍを示す。ｍＡｂ１２－ｗは狭い単一ピークの溶出挙動を有するため、それはｍＡｂ４と重ならず、２つの１：１比のコンボ抗体をＣＥＸカラム上に注入するときにチャージバリアント特性化が容易になる。従って、両抗体のチャージバリアントプロファイルは保持され、かつ明確に特徴付けることができた。ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法は、一定の総注入タンパク質質量１０μｇを用いて、２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ５．０から２０ｍＭＭＥＳ、６００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０（０－６０分）の塩勾配溶出を用いた。図７は、２ピーク溶出挙動が、ＩｇＧ１ではなくＩｇＧ４についての調製用ＣＥＸ樹脂でも観察されたことを示す。３０ＣＶ中、塩化ナトリウム（０－１．０Ｍ）を含む４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝５．０；樹脂：１０ｇ／Ｌ樹脂の充填を有するＰｏｒｏｓＸＳ。図８ａ－８ｂは、ｍＡｂ１０について異なる電気伝導度での塩段階的溶出を示す。（ａ）低電気伝導度での段階的塩溶出クロマトグラム；（ｂ）高電気伝導度での塩勾配溶出クロマトグラム。２つの伝導度は、図７におけるｐＨ５．０での塩勾配溶出中に見いだされ得る。図９は、ｍＡｂ１１およびそのフラグメントについてのＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＳＥＣプロファイルは、ペプシンおよびパパインそれぞれを用いて高純度のＦ(ａｂ')_２およびＦ(ａｂ)フラグメントの産生が成功したことを示した。

図１０は、ｍＡｂ１１およびそのフラグメントについてのＣＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ｍＡｂ１１Ｆ(ａｂ')_２フラグメントは、固定化ペプシン（Thermo Fisher Scientific）を用いて作製された。ｍＡｂ１１Ｆ(ａｂ)フラグメントは、固定化パパイン（Thermo Fisher Scientific）を用いて作製された。予想通り、ｍＡｂ１１について２ピーク溶出挙動が観察された。２ピーク溶出挙動は、ｍＡｂ１１Ｆ(ａｂ')_２フラグメントについても観察され、ＦｃではなくそのＦ(ａｂ')_２が、２ピーク溶出挙動に寄与し得ることが示唆された。ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））Ｆｃテイルを有するＦｃ融合タンパク質であるｍＡｂ１３もまた、ＣＥＸ－ＨＰＬＣカラム上で試験した。ＣＥＸカラム上のｍＡｂ１３についての単一ピーク溶出挙動はさらに、Ｆｃテイルが２ピーク溶出挙動に関与していないことを確認する。２ピーク溶出挙動に関与している可能性があるＩｇＧ４フラグメントをさらに絞り込むために、Ｆ(ａｂ)もまたＣＥＸ－ＨＰＬＣカラムに注入した。興味深いことに、Ｆ(ａｂ)について、２ピーク溶出挙動ではなく単一ピーク溶出挙動が観察された。この結果は、ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））ヒンジの重要な役割が２ピーク溶出挙動にあることを示唆する。従って、ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））Ｆ(ａｂ')_２の存在は、２ピーク溶出挙動に関与すると結論付けられる。図１１は、定常重鎖１（ＣＨ１）およびヒンジ領域についての、ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））およびＩｇＧ１のアミノ酸配列アライメントを示す。ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））とＩｇＧ１との間に合計１２個のアミノ酸の相違があり、それらを緑色および黄色でハイライトしている。ＩｇＧ４において最初に同定されたシステインアミノ酸は、重鎖と軽鎖との間に鎖間ジスルフィド結合を形成し、従ってシステインは、ＩｇＧ４の無傷の（インタクトな）構造を維持するために対応するセリンに変異されなかった。ＩｇＧ４における残りの１１アミノ酸（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣカラム挙動に対する影響を評価するために、ＩｇＧ１中の対応するアミノ酸を個々に変異させた。図１２は、変異体についてのＣＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ｍＡｂ１２－４ｃ、ｍＡｂ１２－７、ｍＡｂ１２－９、ｍＡｂ１２－１０、ｍＡｂ１２－１１およびｍＡｂ１２－ｗについて、単一ピーク溶出挙動が観察された。ｍＡｂ１２－ｗは、ヒンジ領域におけるセリンからプロリンへの変異のない野生型ｍＡｂ１２である。ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法は、一定の総注入タンパク質質量１０μｇを用いる、２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ５．０から２０ｍＭＭＥＳ、６００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０（０－６０分）の塩勾配溶出を用いた。図１３ａ－１３ｈは、変異体の減少しないインタクトな質量を示す。減少しないインタクトな質量スペクトルは、ｍＡｂ１２、ｍＡｂ１２－ｗ、ｍＡｂ１２－４ｃ、ｍＡｂ１２－７、ｍＡｂ１２－９、ｍＡｂ１２－１０、ｍＡｂ１２－１１およびＨＣＡ１９５（ｂｉｏ－ｒａｄからの野生型組換えヒトＩｇＧ４κ）の発現の成功を確認する。同上

図１４は、ＨＣＡ１９５およびｍＡｂ１２－ｗのＦａｂアーム交換現象で減少しないインタクトな質量を示す。ｍＡｂ１２－ｗおよびＨＣＡ１９５は両方とも、ヒンジ領域中にＣＰＰＣ変異を有さない野生型ＩｇＧ４である。新しい二重特異性抗体ピークが観察されたために、Ｆａｂアーム交換が検出された。ｍＡｂ１２－ｗをＨＣＡ１９５と混合し、脱気したＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、０．５ｍＭ還元型グルチオン（ＧＳＨ；Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。ｍＡｂ１２－ｗおよびＨＣＡ１９５の両方の終濃度は、２０μｇ／ｍＭであった。混合物（７０μＬ）を３７℃にて２４時間インキュベートした。次いで、サンプルを、インタクトな質量を試験する前に、４℃にて保存した。図１５は、ＨＣＡ１９５およびｍＡｂ１２のＦａｂアーム交換の結果、低減しないインタクトな質量を示す。ｍＡｂ１２はヒンジ領域中にＣＰＰＣモチーフを含むため、Ｆａｂアーム交換は検出されなかった。図１６は、ＨＣＡ１９５およびｍＡｂ１２－４ｃのＦａｂアーム交換の結果、減少しないインタクトな質量を示す。ｍＡｂ１２－４ｃはヒンジ領域中にＣＰＰＣモチーフを含むため、Ｆａｂアーム交換は検出されなかった。図１７は、ＨＣＡ１９５およびｍＡｂ１２－７のＦａｂアーム交換の結果、減少しないインタクトな質量を示す。ｍＡｂ１２－７はヒンジ領域中にＣＰＰＣモチーフを含むため、Ｆａｂアーム交換は検出されなかった。図１８は、ＨＣＡ１９５およびｍＡｂ１２－９のＦａｂアーム交換の結果、減少しないインタクトな質量を示す。ｍＡｂ１２－９はヒンジ領域中にＣＰＰＣモチーフを含むため、Ｆａｂアーム交換は検出されなかった。図１９は、ＨＣＡ１９５およびｍＡｂ１２－１０のＦａｂアーム交換の結果、減少しないインタクトな質量を示す。ｍＡｂ１２－１０はヒンジ領域中にＣＰＰＣモチーフを含むため、Ｆａｂアーム交換は検出されなかった。図２０は、ＨＣＡ１９５およびｍＡｂ１２－１１のＦａｂアーム交換の結果、減少しないインタクトな質量を示す。ｍＡｂ１２－１１はヒンジ領域中にＣＰＰＣモチーフを含むため、Ｆａｂアーム交換は検出されなかった。図２１は、ｍＡｂ１２変異についてのＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す。ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、全ての変異体がｍＡｂ１２として妥当な結合を有することを示唆する。変異はｍＡｂ１２の結合活性を変えなかった。

発明の詳細な説明
特定の側面において、本発明は、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵナンバリングに基づく）を有する治療用ＩｇＧ４分子が、望ましくないバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を有するという発見に、少なくとも部分的に基づいている。この問題を解決するために、出願人は、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を有する変異型ＩｇＧ４分子を設計した。

１．定義
用語“免疫グロブリン”は、４つすべてがジスルフィド結合によって相互連結されている、２対のポリペプチド鎖、１対の低分子量軽（Ｌ）鎖および１対の重（Ｈ）鎖からなる構造的に関連した糖タンパク質のクラスである。免疫グロブリンの構造はよく特徴付けられている。例えば、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＣｈ．７（Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）を参照のこと。すなわち、各重鎖は、一般的に、重鎖可変領域（本明細書中、Ｖ_ＨまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、一般的に、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、一般的に、軽鎖可変領域（本明細書中、Ｖ_ＬまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、一般的に、１つのドメインＣ_ＬまたはＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存性の高い領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される超可変性の領域（または、構造的に定義されたループの配列および／または形態において超可変性であり得る超可変領域）にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、一般的には、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)も参照のこと）。

多くの場合、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔらの、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載の方法により実施される。このナンバリングシステムを用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの、短縮またはそれへの挿入に対応する数個のまたは追加のアミノ酸を含む場合がある。例えば、重鎖可変ドメインは、ＶＨＣＤＲ２の残基５２の後に１個のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔの番号付けは、“標準的な”Ｋａｂａｔの番号付け配列を有する抗体の配列の相同性の領域でのアライメントにより、所定の抗体に対して決定され得る。

あるいは、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔらの、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)にも記載されているＥＵインデックスによって実施される。このナンバリングは、本明細書全体で用いられる。

本明細書中、用語“抗体”（Ａｂ）は、一般的な生理的条件下で抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子のフラグメント、またはそれらのいずれかの誘導体を意味する。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体（Ａｂ）の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および補体活性化の古典的な経路における第一の成分であるＣ１ｑのような補体系の成分を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。用語“抗体”は、他に特に記載されない限り、酵素的切断、ペプチド合成、および組換え技術などの任意の既知の技術によって提供される、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体などの抗体様ポリペプチド、およびヒト化抗体、二重特異性抗体、ならびに抗原への特異的結合能保持する抗体フラグメント（抗原結合フラグメント）を含む。定常領域ドメイン、特に、存在する場合は、Ｆｃドメイン中の定常領域ドメインは、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプのものである。従って、各重鎖は、好ましくは、ＩｇＧ４ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。

本明細書で用いる用語“ヒト抗体”は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で用いる用語“ヒト抗体”は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことを意図しない。

用語“キメラ抗体”は、１つの抗体由来の１以上の領域および複数の他の抗体由来の１以上の領域を含む抗体を意味する。用語“キメラ抗体”は、二価および多価抗体を含む。キメラ抗体は、当技術分野で周知の組換え法により産生される（例えば、Cabilly et al., PNAS USA 81, 3273-3277 (1984)、Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984)、Boulianne et al., Nature 312, 643-646 (1984)、EP125023、Neuberger et al., Nature 314, 268-270 (1985)、EP171496、EP173494、WO86/01533、EP184187、Sahagan et al., J. Immunol. 137, 1066-1074 (1986)、WO87/02671、Liu et al., PNAS USA 84, 3439-3443 (1987)、Sun et al., PNAS USA 84, 214-218 (1987)、Better et al., Science 240, 1041-1043 (1988)およびHarlow et al., Antibodys: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)参照）。

“ヒト化抗体”は、重鎖および軽鎖のフレームワークドメインおよび定常ドメイン中の特定のアミノ酸配列が、ヒトにおける免疫応答を回避するまたは無効にするために置換されている、非ヒト種に由来する抗体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。一般的に、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力（capacity）を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト哺乳動物などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見いだされない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに高めるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ここで、超可変ループの全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつＦＲ領域の全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、一般的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、一般的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。さらに詳細には、Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992)を参照のこと。

本明細書で用いる“単離された抗体”は、異なる抗原特異性を有する異なる抗体を実質的に含まない抗体を意味することを意図する。しかしながら、特定のヒト標的抗原のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離された抗体は、例えば他の種（種相同体など）由来の他の関連抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化合物を実質的に含まなくてよい。

本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。従って、用語“ヒトモノクローナル抗体”は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を意味する。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合し、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニックまたはトランスクロモゾーム非ヒト動物から得られるＢ細胞を含む、ハイブリドーマによって作製され得る。

本明細書で用いる用語“結合”は、所定の抗原に対する抗体の結合についての文脈中、一般的に、例えば、リガンドとして抗原を、被検物として抗体を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定されるとき、約１０^－７Ｍ未満、例えば約１０^－８Ｍ未満、約１０^－９Ｍ未満、約１０^－１０Ｍ未満、または約１０^－１１Ｍもしくはそれ未満のＫ_Ｄに相当する親和性での結合を意味する。

本明細書で用いる“アイソタイプ”は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる、免疫グロブリン（サブ）クラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭを意味する。

用語“二重特異性抗体”は、２つの異なる結合特異性を有する任意の抗体、例えば、同じ標的抗原上、またはより一般的には、異なる標的抗原上に位置し得る、２つの異なるエピトープに結合する抗体を含むことを意図する。

本明細書で用いる用語“エフェクター細胞”は、免疫応答の認識フェーズおよび活性化フェーズとは対照的に、免疫応答のエフェクターフェーズに関与する免疫細胞を意味する。免疫細胞の例としては、骨髄系またはリンパ系起源の細胞、例えば、リンパ球（細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＢ細胞およびＴ細胞など）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば好中球、顆粒球、マスト細胞および好塩基球が挙げられる。いくつかのエフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を実行する。ある態様において、エフェクター細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができるナチュラルキラー細胞のように、ＡＤＣＣを誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的死滅および免疫系の他の成分への抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与している。ある態様において、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食することができる。エフェクター細胞上の特定のＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子によって調節され得る。

用語“処置”または“処置する”は、症状または疾患状態を緩和すること、改善すること、阻止または根絶（治癒）することを目的として、有効量の本発明の治療的活性分子を投与することを意味する。

“有効量”とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量および期間での有効な量を意味する。抗体の治療的有効量は、個体の病状、年齢、性別および体重、ならびにその個体において所望の応答を誘発する抗体の能力などの因子によって変わり得る。治療的有効量はまた、抗体または抗体部分の毒性または有害作用が、治療的に有益な効果を上回ることもある。

用語“Ｆａｂアーム交換”および“半分子交換”は本明細書中互換的に用いられ、ＩｇＧ４重鎖および付着した軽鎖（半分子）が、別のＩｇＧ４分子由来の重鎖－軽鎖対と置換される、ヒトＩｇＧ４のタンパク質修飾の一種を意味する。従って、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの異なるＦａｂアームを有し得る（結果として二重特異性分子となる）が、それらのＦｃドメイン構造は変化しないままである。Ｆａｂアーム交換は、インビボで天然に起こり、精製された血球細胞または還元型グルタチオンなどの還元剤によってインビトロで誘導され得る。

用語“タンパク質”および“ポリペプチド”は、他にこれと異なる記載がされない限り、本明細書中互換的に用いられる。

用語“ポリヌクレオチド”は、他にこれと異なる記載がされない限り、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡを含む。

本明細書中、用語“含む”は、“包含する”と解釈されるべきである。

本明細書中、用語“野生型”とは、それが天然に存在し得るか、または環境から単離され得るＩｇＧ４分子を意味し、これは、いかなる遺伝子操作された変異も含まない。

２．発明のさらなる側面および態様
特定の態様において、本発明は、疾患の処置における使用のための、修飾ＩｇＧ４分子（修飾ＩｇＧ４抗体または抗体変異体とも称される）または修飾融合タンパク質を提供する。本発明はまた、修飾ＩｇＧ４抗体または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドならびに該修飾ＩｇＧ４抗体または融合タンパク質を発現する細胞株を提供する。治療的有効量の修飾ＩｇＧ４抗体または融合タンパク質を投与することを含む疾患の処置方法がさらに提供される。

特定の態様において、本明細書における置換変異体の表記は、文字とそれに続く数字とそれに続く文字からなる。最初の文字は野生型タンパク質におけるアミノ酸を示す。数字は、アミノ酸置換が行われているアミノ酸位置を意味し、２番目の文字は、野生型アミノ酸を置換するために用いられるアミノ酸を示す。抗体（例えば、ＩｇＧ４分子）可変ドメインおよび定常ドメイン中の残基は、従来、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号付けされている。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７年、Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA （以降、“Ｋａｂａｔらの文献”と称する）に記載されている。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列中の相同性の残基を、“標準的な”Ｋａｂａｔ番号付け配列とアライメントすることにより、目的の抗体（例えば、ＩｇＧ４分子）について決定することができる。あるいは、アミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ－インデックスまたはＥＵナンバリングシステム（Ｋａｂａｔらの、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)にも記載される）により行われ得る。抗体中のアミノ酸残基のさらなるナンバリングシステムは、ＩＭＧＴナンバリングシステムである（Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)）。本明細書中では、Ｋａｂａｔ番号付けシステムが用いられることが特に指示されている場合を除き、ＥＵナンバリングシステムが用いられる。

表１は、ヒンジ領域またはＣＨ１領域中に１つまたは複数の変異を含む数例の修飾ＩｇＧ４抗体を示す。

特定の態様において、本発明は、（ａ）位置１９６のリシン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４ＣＨ１領域；または（ｂ）位置２１７のセリン残基の置換、位置２２０のグリシン残基の置換、位置２２４のプロリン残基の置換もしくは位置２２５のプロリン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む重鎖ならびに軽鎖を含む、ＩｇＧ４抗体を提供する。要すれば、ＩｇＧ４抗体は、重鎖ヒンジ領域において位置２２８のセリン残基の置換をさらに含む。好ましくは、ＩｇＧ４抗体は、置換を含まない対応するＩｇＧ４分子（“非修飾ＩｇＧ４抗体”または“野生型抗体”とも称する）と比較して、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を有する。例えば、位置２２８のセリン残基は、プロリンに置換される（Ｓ２２８Ｐ）。説明すると、位置１９６のリシン残基は、プロリンに置換される（Ｋ１９６Ｐ）；位置２１７のセリン残基はプロリンに置換される（Ｓ２１７Ｐ）；位置２２０のグリシン残基はスレオニンに置換される（Ｇ２２０Ｔ）；位置２２４のプロリン残基はヒスチジンに置換される（Ｐ２２４Ｈ）；位置２２５のプロリン残基はスレオニンに置換される（Ｐ２２５Ｔ）。要すれば、ＩｇＧ４抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。要すれば、ＩｇＧ４抗体は全長抗体またはＦ(ａｂ)_２などの抗体フラグメントである。ある特定の側面において、ＩｇＧ４抗体は、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ４、ｅＴａｕ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｌａｇ３、ＰＤ１、ＰＤＬ１またはＫＩＲから選択される標的分子に結合する。例えば、ＩｇＧ４抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖内における置換を含む。説明すると、ＩｇＧ４抗体は、配列番号２２、２５、２７、２８または２９から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、改善されたバイオアナリシス特性は、ＰｒｏＰａｃＳＣＸ－１０、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ－１０、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＣＭ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ（登録商標）Ｓ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＮＰＲ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＴＡＴ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－２ＳＷ、ＳＯＵＲＣＥ（商標）１５Ｓ４．６／１００ＰＥＩ、ＭｏｎｏＳ（登録商標）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＢＩＯＰｏｌｙＭＡ－ＳＣＸ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｘ（登録商標）ＷＣＸ－ＮＰ、ＰｒｏｔｅｏｍｉｘＳＣＸ－ＮＰまたはＰｒｏｔｅｏｍｉｘＷＣＸ－ＮＰを含むが、これに限定されない、分析的陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む。例示として、バイオプロセシング特性は、ＰｏｒｏｓＨＳ、ＰｏｒｏｓＸＳ、カルボキシ－メチル－セルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤＡＢＸＴＭ、アガロースに固定化したスルホプロピルおよびアガロースに固定化したスルホニル、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓ、３０Ｓ、ＳＰセファロース、ＣＭセファロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤカルボキシ－スルホン、ＷＰＣＢＸ、ＷＰスルホニック（WP Sulfonic）、ヒドロセルＣＭ、ヒドロセルＳＰ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、Ｍａｃｒｏ－ＰｒｅｐＨｉｇｈＳ、Ｍａｃｒｏ－ＰｒｅｐＣＭ、セラミックハイパーＤＳ、セラミックハイパーＤＣＭ、セラミックハイパーＤＺ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＭＣＭ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＬＳＣＭ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＭＳＰ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＬＳＳＰ、ＳｐｈｅｒｏｄｅｘＬＳＳＰ、ＤＯＷＥＸファインメッシュ強酸性カチオン樹脂、ＤＯＷＥＸＭＡＣ－３、ＭａｔｒｅｘセルファインＣ５００、ＭａｔｒｅｘセルファインＣ２００、フラクトゲルＥＭＤＳＯ３－、フラクトゲルＥＭＤＳＥ、フラクトゲルＥＭＤＣＯＯ－、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、Ｄｉａｉｏｎ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、ＴＳＫＧｅｌＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、ＴＳＫＧｅｌＳＰ－５ＰＷ、トヨパールＣＭ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、トヨパールＳＰ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、ＣＭ（２３、３２、５２）、ＳＥ（５２、５３）、Ｐ１１、Ｅｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＣまたはＥｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＳを含むが、これらに限定されない、ＣＥＸ樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む。

特定の態様において、本発明は、（ａ）位置１９６のリシン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４重鎖ＣＨ１領域；または（ｂ）位置２１７のセリン残基の置換、位置２２０のグリシン残基の置換、位置２２４のプロリン残基の置換または位置２２５のプロリン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４重鎖ヒンジ領域を含む、融合タンパク質を提供する。要すれば、ＩｇＧ４抗体は、Ｋ１９６Ｐ、Ｓ２１７Ｐ、Ｇ２２０Ｔ、Ｐ２２４ＨまたはＰ２２５Ｔから選択される少なくとも１つの変異を含む。要すれば、融合タンパク質は、ＩｇＧ４重鎖ヒンジ領域における位置２２８の置換セリン残基の置換（例えば、Ｓ２２８変異）をさらに含む。好ましくは、融合タンパク質は、非修飾融合タンパク質（すなわち、ＩｇＧ４重鎖の位置１９６、２１７、２２０、２２４または２２５にアミノ酸修飾を含まない）と比べて、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を有する。

特定の態様において、本発明は、ＩｇＧ４抗体のバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を改善する方法であって、該方法は、ヒトＩｇＧ４重鎖の位置１９６、２１７、２２０、２２４または２２５の少なくとも１つの残基を置換することによりＩｇＧ４抗体を修飾することを含み、ここで、修飾ＩｇＧ４抗体は、非修飾ＩｇＧ４抗体と比較して、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を有する、方法を提供する。例えば、修飾ＩｇＧ４抗体は、Ｋ１９６Ｐ、Ｓ２１７Ｐ、Ｇ２２０Ｔ、Ｐ２２４ＨまたはＰ２２５Ｔから選択される少なくとも１つの変異を含む。要すれば、ＩｇＧ４抗体は、Ｓ２２８Ｐ変異を含む。要すれば、ＩｇＧ４抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。要すれば、ＩｇＧ４抗体は、全長抗体またはＦ(ａｂ)_２などの抗体フラグメントである。ある特定の側面において、ＩｇＧ４抗体は、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ４、ｅＴａｕ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｌａｇ３、ＰＤ１、ＰＤＬ１またはＫＩＲから選択される標的分子に結合する。説明すると、改善されたバイオアナリシス特性は、ＰｒｏＰａｃＳＣＸ－１０、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ－１０、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＣＭ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ（登録商標）Ｓ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＮＰＲ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＴＡＴ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－２ＳＷ、ＳＯＵＲＣＥ（商標）１５Ｓ４．６／１００ＰＥＩ、ＭｏｎｏＳ（登録商標）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＢＩＯＰｏｌｙＭＡ－ＳＣＸ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｘ（登録商標）ＷＣＸ－ＮＰ、ＰｒｏｔｅｏｍｉｘＳＣＸ－ＮＰまたはＰｒｏｔｅｏｍｉｘＷＣＸ－ＮＰを含むが、これに限定されない、分析的陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む。要すれば、単一ピーク溶出挙動は、併用薬剤に対してＣＥＸ－ＨＰＬＣを用いて電荷変異分析法の開発に用いられる。説明すると、バイオプロセシング特性は、ＰｏｒｏｓＨＳ、ＰｏｒｏｓＸＳ、カルボキシ－メチル－セルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤＡＢＸＴＭ、アガロースに固定化したスルホプロピルおよびアガロースに固定化したスルホニル、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓ、３０Ｓ、ＳＰセファロース、ＣＭセファロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤカルボキシ－スルホン、ＷＰＣＢＸ、ＷＰスルホニック、ヒドロセルＣＭ、ヒドロセルＳＰ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、Ｍａｃｒｏ－ＰｒｅｐＨｉｇｈＳ、Ｍａｃｒｏ－ＰｒｅｐＣＭ、セラミックハイパーＤＳ、セラミックハイパーＤＣＭ、セラミックハイパーＤＺ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＭＣＭ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＬＳＣＭ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＭＳＰ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＬＳＳＰ、ＳｐｈｅｒｏｄｅｘＬＳＳＰ、ＤＯＷＥＸファインメッシュ強酸性カチオン樹脂、ＤＯＷＥＸＭＡＣ－３、ＭａｔｒｅｘセルファインＣ５００、ＭａｔｒｅｘセルファインＣ２００、フラクトゲルＥＭＤＳＯ３－、フラクトゲルＥＭＤＳＥ、フラクトゲルＥＭＤＣＯＯ－、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、Ｄｉａｉｏｎ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、ＴＳＫＧｅｌＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、ＴＳＫＧｅｌＳＰ－５ＰＷ、トヨパールＣＭ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、トヨパールＳＰ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、ＣＭ（２３、３２、５２）、ＳＥ（５２、５３）、Ｐ１１、Ｅｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＣまたはＥｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＳを含むが、これらに限定されない、ＣＥＸ樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む。

特定の態様において、本発明は、ＩｇＧ４重鎖ＣＨ１またはヒンジ領域を含む融合タンパク質のバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を改善する方法であって、該方法は、ＩｇＧ４重鎖の位置１９６、２１７、２２０、２２４または２２５の少なくとも１つの残基を置換することによりＩｇＧ４重鎖ＣＨ１またはヒンジ領域を修飾することを含み、ここで、修飾融合タンパク質は、非修飾融合タンパク質と比べて、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を有する、方法を提供する。例えば、修飾融合タンパク質は、Ｋ１９６Ｐ、Ｓ２１７Ｐ、Ｇ２２０Ｔ、Ｐ２２４ＨまたはＰ２２５Ｔから選択される少なくとも１つの変異を含む。要すれば、融合タンパク質は、Ｓ２２８Ｐ変異を含む。好ましくは、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む。

特定の態様において、本発明は、（１）上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質；ならびに、（２）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。例えば、医薬組成物は液体製剤である。例えば、医薬組成物は、非経腸、皮下、静脈内、筋肉内、経鼻、または肺送達のために製剤される。要すれば、医薬組成物は、併用療法のための別のモノクローナル抗体をさらに含む。

特定の態様において、本発明は、上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド（プロモーターに作動可能に連結されている）を含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞である。

特定の態様において、本発明は、上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質を産生する方法であって、上記のＩｇＧ４抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、該ＩｇＧ４抗体または融合タンパク質の発現に適する条件下で培養することを含む方法を提供する。要すれば、この方法は、ＩｇＧ４抗体または融合タンパク質を単離することをさらに含む。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞である。

３．抗体の作製方法
抗体の作製方法は当技術分野で周知である。好ましい態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒらの、Nature 256, 495 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法により作製され得るか、または組換えＤＮＡ法により作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。モノクローナル抗体は、任意の適切な供給源から得ることができる。従って、例えば、モノクローナル抗体は、例えば表面上に抗原を発現する細胞、または目的の抗原をコードする核酸の形態の、目的の抗原で免疫したマウスから得たマウス脾臓Ｂ細胞から調製したハイブリドーマから得ることができる。モノクローナル抗体はまた、ラット、イヌ、または霊長動物などの免疫化ヒトまたは非ヒト哺乳動物の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマからも得ることができる。

上記のようなアミノ酸置換、欠失または挿入などのさらなる修飾は、当技術分野で周知の標準的組換えＤＮＡ技術を用いて実施することができる。

一態様において、本発明の抗体はヒト抗体である。指示されたヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモゾームマウスを用いて産生され得る。そのようなトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソミックマウスには、本明細書中、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称されるマウスが含まれ、本明細書ではまとめて“トランスジェニックマウス”と称する。

ＨｕＭＡｂマウスは、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子最小遺伝子座（miniloci）を、内因性のμおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と共に含む（Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)）。従って、該マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧ，κモノクローナル抗体を生成する（Lonberg, N. et al. (1994), 前出；Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994)、Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) および Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)に記載される）。ＨｕＭＡｂマウスの調製は、Taylor, L. et al., Nucleic acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)に詳細に記載されている。米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、同第５，７７０，４２９号、同第５，５４５，８０７号、ＷＯ９８／２４８８４、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９３／１２２７、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／０３９１８およびＷＯ０１／０９１８７も参照のこと。

ＨＣｏ７マウスは、それらの内因性軽鎖（カッパ）遺伝子にＪＫＤ破壊を有し（Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)に記載のような）、それらの内因性重鎖遺伝子にＣＭＤ破壊を有し（ＷＯ０１／１４４２４の実施例１に記載のような）、ＫＣｏ５ヒトκ軽鎖トランスジーンを有し（Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)に記載のような）、およびＨＣｏ７ヒト重鎖トランスジーンを有する（米国特許第５，７７０，４２９号に記載のような）。

ＨＣｏ１２マウスは、それらの内在性軽鎖（ｋａｐｐａ）遺伝子にＪＫＤ破壊を有し（Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)に記載のような）、それらの内因性重鎖遺伝子にＣＭＤ破壊を有し（ＷＯ０１／１４４２４の実施例１に記載のような）、ＫＣｏ５ヒトκ軽鎖トランスジーンを有し（Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)に記載のような）、およびＨＣｏ１２ヒト重鎖トランスジーンを有する（ＷＯ０１／１４４２４の実施例２に記載のような）。

ＫＭマウス系統において、内因性のマウスκ軽鎖遺伝子は、Chen et al., ENBO J. 12, 811-820(1993)に記載されたようにホモ接合性に破壊され、かつ内因性のマウス重鎖遺伝子は、ＷＯ０１／０９１８７の実施例１に記載されたようにホモ接合性に破壊されている。このマウス系統は、Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)に記載されたような、ヒトκ軽鎖トランスジーン、ＫＣｏ５を有する。このマウス系統はまた、ＷＯ０２／４３４７８に記載されたような第１４番染色体フラグメントｈＣＦ（ＳＣ２０）から構成されるヒト重鎖トランスクロモソームを担持する。

これらのトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞を用いて、周知技術によりヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。そのようなトランスジェニック非ヒト動物、本発明において用いられる抗体の発現のための作動可能なコーディング核酸配列を含む非ヒト動物、１以上の標的コード核酸配列で安定的にトランスフェクトされた非ヒト動物などは、本発明のさらなる特徴である。

本発明で用いるヒトモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、または本発明で用いるその他の種が起源である抗体はまた、目的の免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列についてトランスジェニックである別の非ヒト哺乳動物または植物の作製ならびにそこからの回収可能な形態での抗体の産生を通じて、トランスジェニックで作製されてもよい。哺乳動物でのトランスジェニック産生に関連して、抗体を、ヤギ、ウシまたはその他の哺乳動物のミルクで産生し、かつそれから回収してもよい。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、同第５，７５６，６８７号、同第５，７５０，１７２号および同第５，７４１，９５７号を参照のこと。

さらに、本発明で用いるヒト抗体または他の種由来の抗体を、当技術分野において周知の技術を用いて、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびその他の技術を含むが、これらに限定されないディスプレイ型の技術によって作製してもよく、結果として得られる分子を、そのような技術が当技術分野において周知であるので、親和性成熟などの、さらなる成熟に供してもよい（例えば、Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (phage display), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (phage display), Hanes and Pluckthun, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (ribosomal display), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (phage display), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hoogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992)、および米国特許第５，７３３，７４３号を参照のこと）。ディスプレイ技術を利用してヒトのものではない抗体を産生する場合、そのような抗体をヒト化してもよい。

さらなる側面において、本発明は、本発明の修飾抗体または融合タンパク質を産生する方法であって、宿主細胞において該修飾抗体または融合タンパク質をコードする核酸構築物を発現させること、および要すれば該修飾抗体または融合タンパク質を精製することを含む方法を提供する。

さらなる態様において、本発明の修飾抗体または融合タンパク質は、以下からなる群より選択される化合物と連結されている：細胞毒性薬剤；放射性同位体；タキサンなどのプロドラッグもしくは薬剤；サイトカイン；および、ケモカイン。そのような化合物を抗体に連結（コンジュゲート）する方法は、当技術分野で周知である。

４．医薬組成物および処置方法
さらなる側面において、本発明は、本明細書中、上記で定義された修飾抗体または融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995に記載のものなどの従来技術に従って、薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび賦形剤と共に製剤され得る。

薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび賦形剤は、選択された本発明の化合物および選択された投与方法に適しているべきである。医薬組成物の担体および他の成分に対する適合性は、本発明の選択された化合物または医薬組成物の所望の生物学的特性に対する著しい悪影響の欠失（例えば、抗原結合に対する実質的影響を欠く（１０％またはそれ未満の相対的阻害、５％またはそれ未満の相対的阻害など））に基づいて決定される。

本発明の医薬組成物はまた、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０などの、非イオン性界面活性剤）、安定化剤(例えば、糖類もしくはタンパク質不含有アミノ酸)、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、および／または医薬組成物中に含まれることに好適なその他の材料が含まれてもよい。

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルを、患者にとって毒性がない状態で、特定の患者、組成物、および投与方法について所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変えてもよい。選択された投与量レベルは、用いられる特定の本発明の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の***速度、処置の期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬剤、化合物および／または材料、処置されるべき患者の年齢、性別、体重、病状、全般的な健康および以前の病歴、ならびに医療技術分野において周知の同様の因子を含む、種々の薬物動態学的因子によって変わり得る。

当技術分野における通常の技術知識を有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物で用いられる本発明の化合物の用量を所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる、一般的に、本発明の組成物の好適な日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最小の用量である化合物の量であり得る。そのような有効用量は通常、上記の因子によると考えられる。要すれば、投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入または皮下投与である。有効な日用量の医薬組成物を、１日を通じて適当な間隔で別個に投与される２回、３回、４回、５回、６回、またはそれより多くの分割用量として、要すれば、単位投与量形態で投与してもよい。

一態様において、本発明の医薬組成物は、非経腸的に投与される。本明細書で用いる用語“非経腸投与”および“非経腸的に投与される”は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与方法を意味し、上皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含む。

本発明の修飾抗体または融合タンパク質は、多くの疾患の処置および／または予防に用いることができ、広範な種類の好適な標的分子から選択される任意の抗原に結合する。本発明の一態様において、本発明の修飾抗体または融合タンパク質は、以下からなる群より選択される抗原を結合する：エリスロポエチン、ベータ－アミロイド、ｔａｕ、トロンボポイエチン、インターフェロン－α（２ａおよび２ｂ）、インターフェロン－β（１ｂ）、インターフェロン－γ、ＴＮＦＲＩ（ＣＤ１２０ａ）、ＴＮＦＲＩＩ（ＣＤ１２０ｂ）、ＣＤ１３７、ＩＬ－１Ｒ１型（ＣＤ１２１ａ）、ＩＬ－１Ｒ２型（ＣＤ１２１ｂ）、ＩＬ－２、ＩＬ２Ｒ（ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒ－β（ＣＤ１２３）、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－３Ｒ（ＣＤ１２３）、ＩＬ－４Ｒ（ＣＤ１２４）、ＩＬ－５Ｒ（ＣＤ１２５）、ＩＬ－６Ｒ－α（ＣＤ１２６）、－β（ＣＤ１３０）、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５ＢＰ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＴＣＲ可変鎖、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ－Ｌ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ４Ｒ、ＣＣＲ５Ｒ、ＴＧＦ－β１、－β２、－β３、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＦ－Ｒ（ＣＤ７４）、Ｍ－ＣＳＦ－Ｒ（ＣＤ１１５）、ＧＭ－ＣＳＦＲ（ＣＤ１１６）、可溶性ＦｃＲＩ、ｓＦｃＲＩＩ、ｓＦｃＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＶＥＧＦ、アルファ－４インテグリン、Ｃｄ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＦｃαＲＩ、ＦｃεＲＩ、アセチルコリン受容体、ｆａｓ、ｆａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープＥ２、組織因子、組織因子および第ＶＩＩ因子の複合体、ＥＧＦｒ、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＶＬＡ－１、２、３、ｏｒ４、ＬＦＡ－１、ＭＡＣ－１、１－セレクチン、ＰＳＧＬ－１、ＩＣＡＭ－Ｉ、Ｐ－セレクチン、ペリオスチン、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、Ｓｉｇｌｅｃ８、ＴＮＦ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＸ３ＣＬ１、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦａｌｐｈａ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＮＧＦ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＮＫＧ２Ｄ、白血球関連免疫グロブリン様受容体（ＬＡＩＲ）、Ｉｙ４９、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２６、ＢＳＴ－２、ＭＬ－ＩＡＰ（アポトーシスタンパク質の黒色腫阻害剤）、カテプシンＤ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｒ、ＣＤ８６、Ｂ細胞受容体、ＣＤ７９、ＰＤ－１、Ｌａｇ３およびＴ細胞受容体。

ある特定の側面において、修飾ＩｇＧ４抗体または融合タンパク質は、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ４、ｅＴａｕ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｌａｇ３、ＰＤ１、ＰＤＬ１またはＫＩＲから選択される標的分子に結合する。

別の特定の態様において、本発明の修飾抗体または融合タンパク質は、悪性疾患および／または転移性疾患、例えば黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫、脳関連腫瘍、乳癌、ＯＳＣＣ、大腸癌、腎臓癌(renal cancer または kidney cancer)、膵臓癌、ＨＮＳＣＣ、胸腺腫、肺癌、皮膚癌、喉頭癌、肝臓癌、耳下腺癌、胃癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、精巣の癌精巣、白血病およびリンパ腫の処置に用いるためのものである。

１つの特定の態様において、本発明の修飾抗体または融合タンパク質は、炎症性疾患および自己免疫疾患、例えばリウマチ性関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、喘息、１型糖尿病、ＳＬＥ、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）およびＣＯＰＤの処置に用いるためのものである。

本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、それらは、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用された全ての図および全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、引用により本明細書中に明示的に組み込まれる。

実施例
実施例１
改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性のための治療用ＩｇＧ４の設計
Ｉ．序章
治療用ＩｇＧ４抗体を、Ｆａｂアーム交換を阻止するためにＣｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（ＣＰＰＣ）モチーフを有するようにヒンジ領域中で遺伝子操作する［１０、１５、１６］。しかしながら、治療用ＩｇＧ４のコア－ヒンジ領域におけるセリン－から－プロリンへの置換は、医薬品原薬のロバスト性、製造およびその品質管理（ＣＭＣ）開発への挑戦である。ＣＰＰＣ修飾を有する全ての治療用ＩｇＧ４抗体について、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）で２ピーク溶出挙動が観察され、ロバストな製造のための生物分析法の開発およびバイオプロセシングの開発への障害となっている。ここでは、本発明者らは、タンパク質工学および変異誘発を組み合わせることにより、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性のための、ＣＨ１ドメインまたはヒンジ領域中の単一の点変異を有する次世代治療用ＩｇＧ４抗体の設計を提示する。分子モデリングおよびシミュレーションは、ＩｇＧ４における単一の点変異についてさえも、有意な二次構造および／またはヒンジ領域フレキシビリティの変化が起こり得ることを示唆しており、これは、予期されないＣＭＣ挙動をもたらし得る。従って、治療用ＩｇＧ４抗体ならびに他のＩｇＧアイソタイプを設計するときにはＣＭＣ挙動を注意深く考慮すべきである。

免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、治療用抗体の開発のために最も頻繁に用いられるバックボーンであり、４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に細分される。ＩｇＧアイソタイプのうち、ＩｇＧ４は、古典的な補体経路を活性化することができないために免疫エフェクター機能の動員が望ましくない用途に好ましいサブクラスである［１］。ＩｇＧ４は、血漿中の２つの同一抗原を架橋することができないという点で他のＩｇＧアイソタイプとは異なる動作をし、これは機能的に一価としても知られている［２］。インビボ試験において、ＩｇＧ４は、別の分子由来の重軽鎖対で重鎖および付着した軽鎖（半分子）を交換することによって（Ｆａｂアーム交換［４］としても公知）、二重特異性抗体を形成するために二つの異なる抗原を架橋することができることが明らかになった［３］。Ｆａｂアーム交換は、予測不可能なＦａｂアーム組合せのために、ＩｇＧ４ヒト免疫療法にとって大きな不利益となり得る。インビボで治療用ＩｇＧ４と内因性ヒトＩｇＧ４とを交換すると、結果として、未知のかつ望ましくない特異性を有する二重特異性抗体が生じる。機能的に一価の二重特異性抗体の形成は、本来の標的抗原を架橋する治療用ＩｇＧ４の能力を変化させ、それはヒト免疫療法の薬物動態および有効性ならびに薬力学に影響を及ぼし得る［５］。

Ｆａｂアーム交換は、ＩｇＧ４の２つの独特の構造的特徴：コア－ヒンジ領域におけるＣｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（ＣＰＳＣ）モチーフおよびＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９アミノ酸に起因している［４、６］。Ｒ４０９およびＫ４０９は、それぞれＩｇＧ４およびＩｇＧ１に対する２つのＣＨ３ドメイン間の主要接触面(primary interface)である。Ｋ４０９残基を有するＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン間の強い非共有相互作用とは異なり、ＩｇＧ４ではＣＨ３－ＣＨ３相互作用ははるかに弱く、これはＲ４０９が鎖間水素結合ネットワークの適切な形成を妨げ［７］、それにより解離を可能にし、ＩｇＧ４をＦａｂアーム交換しやすくするためである［８］。ＩｇＧ４のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｋの変異は抗体の安定化を助ける。コア－ヒンジ領域におけるＣＰＰＣおよびＣＰＳＣモチーフは、ＩｇＧ１とＩｇＧ４との間の別の大きな違いである。ＩｇＧ１のＣＰＰＣモチーフ由来のプロリンによって誘導される相対的な剛性は、鎖内ジスルフィド結合の形成を妨げる［９］。それとは異なり、ＩｇＧ４中のＣＰＳＣモチーフは、より高いヒンジフレキシビリティおよび鎖内ジスルフィド結合を採用する能力を可能にする。結果として、減少しないＳＤＳ－ＰＡＧＥによって証明されるように、非共有結合的に結合した半分子が形成されており［９、１０］、それは次いで、二重特異性抗体を形成するために、他の半分子と相互作用し得る。この課題を解決するために、セリンからプロリンへの置換が導入されて、ヒンジ領域がＩｇＧ１に見られるものにより類似するようになった［１０］。ＣＰＰＣモチーフを有する修飾ＩｇＧ４ヒンジはより安定であり、そしてインビボでの内因性ヒトＩｇＧ４とのＦａｂアーム交換を回避する。２つの近年ＦＤＡで承認された抗ＰＤ－１（プログラム細胞死－１）ＩｇＧ４癌療法剤であるニボルマブおよびペムブロリズマブは、両方とも、ＣＰＰＣモチーフを有する修飾されたヒンジを含む［１１－１３］。さらに、ヒンジ領域内にセリン－から－プロリンへの置換を有する他の多数のＩｇＧ４抗体は、現在、前臨床治験または臨床治験中である［１４］。簡単なセリン－から－プロリンへの変異（ＣＰＰＣ）が、治療用ＩｇＧ４にリスクや課題を引き起こすことなくインビボでｆａｂアーム交換を阻止し得ることが認識されている。しかしながら、そのような変異は、望ましくない生物分析的挙動およびバイオプロセシング挙動を引き起こし得る。従って、改善されたバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を有する治療用ＩｇＧ４分子の設計が依然として必要とされている。

ＩＩ．材料および方法
１．ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法
分析的ＣＥＸ－ＨＰＬＣを、ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）のＷａｔｅｒｓＨＰＬＣシステムに設置されたＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）のＰｒｏＰａｃＳＣＸ－１０ＬＣカラムを用いて行った。該方法は、１０μｇの一定総注入タンパク質質量を用いて、２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ５．０から２０ｍＭＭＥＳ、１Ｍまたは０．６ＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０（０－６０分）での塩勾配溶出を用いた。溶出したタンパク質をＵＶ２８０ｎｍでモニターした。

２．凝集分析のためのＳＥＣ法
分析的ＳＥＣを、ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）のＷａｔｅｒｓＨＰＬＣシステムに設置されたＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＫｉｎｇｏｆＰｒｕｓｓｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）のＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬカラムを用いて行った。この方法では、１００μｇの一定総注入タンパク質質量を用いて、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、ｐＨ６．８を１ｍＬ／分の流速で用いた。溶出したタンパク質をＵＶ２８０ｎｍでモニターした。

３．クロマトグラフィー装置および方法
全てのクロマトグラフィー試験を、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアバージョン６．３（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）をインストールしたＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＡＥＫＴＡＡＶＡＮＴシステムを用いて行った。ＰｏｒｏｓＸＳ樹脂を、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨＵＳＡ）から購入したオムニフィットカラム（０．６６ｃｍＩ．Ｄ×１０ｃｍベッド高）に充填した。充填し、かつ調整された（conditioned）カラムを、５カラム容量（ＣＶ）の２５ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した。ＣＥＸカラムに１ｇ／Ｌ樹脂をｐＨ５で充填し、次いで２０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）中、３０ＣＶ０－１ＭＮａＣｌ勾配とした。カラムを３ＣＶの１ＭＮａＣｌで再生させ、３ＣＶの１ＭＮａＯＨで消毒し、最後に、各泳動後に０．１ＭＮａＯＨ中に保存した。タンパク質濃度を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）から購入したＮａｎｏＤｒｏｐ２０００を用いて測定した。全ての試験を室温で行った。

４．ＩＣＥ２８０法
画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）をｉＣＥ２８０アナライザー（ＣｏｎｖｅｒｇｅｎｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて行い、電荷変異体を調べた。キャピラリーを有する分離カートリッジをＣｏｎｖｅｒｇｅｎｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。このキャピラリーをガラス基板上に固定し、２ピースの中空糸膜によって陰極液および陽極液から分離した。ＩｇＧサンプルを、脱イオン水で希釈する前に、２ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを種々のｐＩマーカー、１％メチルセルロース溶液およびPharmalyte（ファルマライト）３－１０と混合することにより調製した。混合物を遠心分離し、上清を、最適な解像度を達成するために種々の時間をかけてステーション内に集めた。ＩＥＦトレースの最終画像を、２８０ｎｍ重水素ランプ検出器によって捕捉した。

５．ペプシン消化を用いた抗ＣＤ１３７（Ｓ２２８Ｐ）のＦ(ａｂ')_２ドメインの調製
アガロース固定化されたペプシンを、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。抗ＣＤ１３７（Ｓ２２８Ｐ）を、３７℃にて水浴中、４時間かけて、ｐＨ４．５にて、ペプシン－アガロースで消化した（２０ｍｇの抗ＣＤ１３７（Ｓ２２８Ｐ）当たり、０．２５ｍＬのペプシン－アガロース）。消化産物をｐＨ７．０に調整し、その後、ｐＨ７．０に予め平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムに流すことによって精製した。小さいＦｃフラグメントを１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ洗浄中に洗い流し、そしてＦ(ａｂ')_２ドメインを２５ｍＭリン酸緩衝液洗浄中に集め、消化されていないｍＡｂおよびＦｃドメインをＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム上に保持した。

６．パパイン消化を用いた抗ＣＤ１３７（Ｓ２２８Ｐ）のＦ(ａｂ)ドメインの調製
アガロース固定化されパパインをＴｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。抗ＣＤ１３７（Ｓ２２８Ｐ）を、３７℃にて水浴中、４時間かけて、ｐＨ７にて、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭシステイン・ＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ；ｐＨ７．０（１０ｍｇの抗ＣＤ１３７（Ｓ２２８Ｐ）当たり、０．２５ｍＬパパインアガロース）中パパイン－アガロースにより消化した。固定化タンパク質Ａカラムを用いて、消化されていないｍＡｂおよびＦｃフラグメントからＦａｂフラグメントを分離した。

７．細胞株および培養条件
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、調整すみの血清不含有ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させ、そして３日毎に振とうフラスコ中で継代した。細胞を、８％ＣＯ_２の湿式雰囲気下、３７℃のインキュベーター中でオービタルシェーカープラットフォーム上で１３０ｒｐｍにてインキュベートした。

８．ＩｇＧ４－抗ＣＤ１３７変異体の構築
部位特異的突然変異は、ＣＨ１およびヒンジ領域において単一のアミノ酸置換を用いて行った。ＩｇＧ４－抗ＣＤ１３７プラスミドの鋳型ＤＮＡを、２つの重複プライマーを用いて、それらのうち１つが標的変異を含む突然変異誘発反応の前に、メチル化した。変異誘発産物を大腸菌コンピテント細胞に形質転換し、そこで非メチル化直鎖状変異ＤＮＡを環状化して、複製した。プラスミドＤＮＡを単離し、ＰｕｒｅＬｉｎｋＨｉＰｕｒｅＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉｐｒｅｐキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製した。

９．ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ懸濁液細胞における抗ＣＤ１３７およびその変異体の一過性発現
トランスフェクションの１日前に、細胞を３００万個の細胞／ｍｌで播種し、８％ＣＯ_２で３７℃にて、１３０ｒｐｍで回転しているオービタルシェーカープラットフォーム上で撹拌した。トランスフェクションの日（０日目）に、細胞を６００万個の細胞／ｍｌに希釈し、５０ｍｌの培養容量で２５０ｍｌ振とうフラスコに加えた。５０マイクログラムのプラスミドＤＮＡをＯｐｔｉ－ＰｒｏＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に希釈し、総容量を２．０ｍｌとし、混合した。別のチューブで、１６０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＣＨＯ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）もまた、Ｏｐｔｉ－ＰｒｏＳＦＭで希釈して総容量を２．０ｍｌとした。希釈したＤＮＡ溶液および希釈したトランスフェクション試薬を穏やかに混合し、室温にて５分間インキュベートした。ＤＮＡ－トランスフェクション試薬混合物を２５０ｍｌフラスコ中の新たに希釈した細胞にゆっくり添加した。トランスフェクトした細胞を、１３０ｒｐｍで回転しているオービタルシェーカープラットフォーム上、３７℃にて８％ＣＯ_２でインキュベートした。１日目に、培養液に、１０ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯＦｅｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および３００μｌのＥｘｐｉＣＨＯＥｎｈａｎｃｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した；インキュベーション温度およびＣＯ_２を、それぞれ３２℃および５％にシフトさせた。培養物に、６日目に２回目のフィード培地のボーラス添加を行い、１３日目に回収した。抗ＣＤ１３７およびその変異体の両方が、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ一過性発現系においてロバスト性に発現され、標的領域におけるアミノ酸置換がＩｇＧ４合成に影響を及ぼさないことが示された。

１０．抗ＣＤ１３７結合アッセイ
アッセイプレートを、重炭酸緩衝液中の１００μＬ（２μｇ／ｍＬ）のヒトＣＤ１３７マウスＩｇＧｂ２で、室温にて１時間、コーティングした。次いで、プレートを、３００μＬのＳｅａＢｌｏｃｋ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ＃３７５２７）で、室温にて１時間、ブロッキングした。対照(基準）物質およびサンプルを、Ｔｅｋｎｏｖａアッセイ希釈緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ－＃Ｄ５１２０）中で１μｇ／ｍＬに希釈し、次いで２倍に連続希釈した。

ブロッキング緩衝液をデカントし、プレートを３００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ）で３回洗浄した。サンプルおよび対照標準（１００μＬ）をプレートに添加し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄後、１００μＬの二次抗体（抗ヒトＩｇＧ４Ｆｃ、ＨＲＰ；Ｔｅｋｎｏｖａ希釈剤中、１：１０００）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。

洗浄後、１００μＬのＤａｋｏＴＭＢを添加し、１０分間インキュベートした。１００μＬの１Ｎ硫酸を用いて反応を停止させた。吸光度を、Ｍ５プレートリーダー（Molecular Devices）上でＳｏｆｔｍａｘソフトウェアを用いて、バックグラウンド補正として４５０ｎｍから６５０ｎｍで再調整した。ＥＣ５０値を、吸光度値対ｌｏｇサンプル濃度、および各希釈における対照から計算した。相対結合力パーセントは、対照(基準）物質ＥＣ５０を試験サンプルＥＣ５０で割ってパーセントとして計算した。

１１．インタクトな質量分析
ＬＣ－ＭＳは、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴｏＦ）質量分光計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）と接続させたＡｃｑｕｉｔｙＵＨＰＬＣを用いて実施した。Ｑ－ＴｏＦのキャピラリー電圧は３０００Ｖに設定され、サンプルコーン電圧は８０Ｖに設定された。分析方法は、既報のものと同じであった［１７］。要するに、精製サンプルを、還元のために、３７℃にて２０分間、５ｍＭＤＴＴと共にインキュベートし、それを０．２％（ｖ：ｖ）の終濃度にギ酸を添加することにより停止させた。還元サンプルを、０．１％ギ酸を含む２０％アセトニトリルで平衡化した逆相（ＲＰ）カラム（１０μｍ、２．１ｘ１００ｍＭＰｏｒｏｓ（登録商標）、Applied Biosystems、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）上に０．５μｇ注入し、次いで、２０％から５０％のアセトニトリルで、２５分間、０．２５ｍＬ／分の流速で、勾配溶出した。質量スペクトルは、ｍ／ｚ５００から４０００までスキャンした；次いで、組み合わせたデータを、ＭａｘＥｎｔ１アルゴリズム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてデコンボリューションした。

Ｆａｂアーム交換条件：ｍＡｂ１２変異をＨＣＡ１９５と混合し、脱気ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、０．５ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ；Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。ｍＡｂ１２変異およびＨＣＡ１９５の両方の終濃度は、２０μｇ／ｍＭであった。混合物（７０μＬ）を、３７℃にて２４時間、インキュベートした。その後、サンプルを、インタクト質量分析試験の前に４℃で保存した［４］。

ＩＩＩ．結果および考察
本発明者らは、ここで、ヒンジ領域中のセリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ）は、しかしながら、種々のＩｇＧ４ＣＭＣ開発のためのとてつもない課題の原因となることを報告する（表２参照）。

分析的ＣＥＸカラム上の２ピーク溶出挙動は、ＣＰＰＣモチーフ修飾変異を有する全ての治療用ＩｇＧ４で観察されたが（図１ｂ）、一方、単一ピーク溶出挙動は、全てのＩｇＧ１および野生型ＩｇＧ４（ｍＡｂ７－ｗ、およびｍＡｂ１２－２）で観察された（図１ａ、ｃ）。ＣＥＸカラムでの２ピーク溶出挙動は、他の試験によって以前にも報告されており、特定の分子［１８］または特定の樹脂［１９］に起因していた。Ｌｕｏら［１８］は、相補性決定（ＣＤＲ）領域における一次構造中に４個の疎水性残基に囲まれたヒスチジン残基を有するＩｇＧ４についてのＣＥＸでの２ピーク溶出挙動を報告しており、ＣＤＲ中のヒスチジン－プロトン化－ベースの電荷変異体の分離にそれを関連付けている。しかしながら、本発明者らの抗体配列分析は、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１１およびｍＡｂ１２が、ＣＤＲ中に同様のヒスチジン残基を含まないが、２ピーク溶出挙動を示すことを示した；ｍＡｂ４およびｍＡｂ６は、ＣＤＲ中に同様のヒスチジン残基を含むが、単一ピーク溶出挙動を示す。Ｇｕｏら［１９］は、ＰｏｒｏｓＸＳ樹脂上のモノクローナル抗体の表面誘発された３ピーク溶出挙動を報告し、ｐｏｒｏｓＸＳ樹脂のバイモーダルな（bi-modal）細孔径分布が、タンパク質に対する２つの結合部位を誘導し、それが２ピーク挙動の原因であると結論付けた。しかしながら、２ピーク溶出挙動は、本発明者らの試験で用いた全ての変異型ＩｇＧ４分子について、非多孔性樹脂ＰｒｏｐａｃＳＣＸ－１０樹脂上でも観察された。変異型ＩｇＧ４と野生型ＩｇＧ４とのあいだの唯一の違いは、ヒンジ領域中のＣＰＰＣおよびＣＰＳＣモチーフである。明らかに、ヒンジ領域中のセリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ）は、ＣＥＸカラム上でのこれらの２ピーク溶出挙動を引き起こした。

２つのピークを分離し、そしてピーク分画をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム上に注入した。２つのＳＥＣクロマトグラム（図２）は、９９％を超える純度で極めてよく重複しており、このことは、２つのピークについてサイズ相違または凝集体形成がないことを示唆している。同様の電荷プロファイルがピーク１およびピーク２について観察され（図３）、これらの２つのピークについて大きな電荷差がないことを示唆している。２ピーク画分もまた、同じ条件下でＣＥＸカラム上に個々に再注入された。２つの画分の再注入は、元の変異型ＩｇＧ４と全く同じ２ピーク溶出挙動を示し（図４）、樹脂上で変異型ＩｇＧ４について２つの異なる結合立体配座があり得て、２つの集団は溶出後に交換可能であったことが示唆される。ＣＥＸ操作ｐＨを変えると、２ピーク比が変化した。ｐＨを上げると、第一のピークの割合が高くなり、一方でｐＨを下げると、第二のピークの割合が高くなった（図５）。変異型ＩｇＧ４の２ピーク溶出挙動は、一例として、電荷分散分析のための分析的ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法開発への課題を提起する。２ピーク溶出は、２つのピークが電荷の差に基づいて分離されていないので電荷変異体プロファイルを定量化することを困難にし、２ピークの比は、操作条件（例えば、ｐＨ）を変えることによって変えることができる。さらに、併用療法は、最近最も有望な癌免疫治療に関する免疫理論（immune-stimulatory cancer theory）となっており、併用電荷変異体分析のためのロバスト分析法の開発が早急に必要とされている。ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））の二重ピーク溶出挙動は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣにおいて幅広い溶出プロファイルをもたらし、これは通常、組み合わせた分子とのクロマトグラム干渉を引き起し、組み合わせた薬物電荷変異体の特性解析を不可能にする（図６）。２ピーク溶出挙動はまた、分取用ＣＥＸ樹脂でも観察され（図７）、ロバストな市販のＣＥＸ精製プロセスを開発することは困難である。ｍＡｂ１０は、本明細書中、一例として用いられた。塩勾配溶出中に２ピーク溶出挙動が観察されたため、段階的溶出中に異なる電気伝導度条件を用いることができる。図８に示すように、より低い溶出電気伝導度が幅広い溶出ＣＶを与え（図８ａ）、一方で、より高い電気伝導度が小さい溶出ＣＶを与えた（図８ｂ）。しかしながら、表３に示すように、電気伝導度が高いほど、溶出プールの不純物レベルおよびＨＭＷレベルが高くなった。溶出条件は、ｐＨ５での塩勾配溶出に基づいて選択された。塩勾配溶出中の２つのピーク電気伝導度に対応する２つの異なる溶出条件を用いた。

構造の観点からＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））の２ピーク溶出挙動をより理解するために、ｍＡｂフラグメントの酵素的生成を実施した。固定化ペプシンおよび固定化パパインを用いて、ｍＡｂ１１のＦ(ａｂ')_２およびＦ(ａｂ)フラグメントを生成した（方法の節に詳述する）。Ｆ(ａｂ')_２は、それがＩｇＧ４ヒンジを有する２つのＦ(ａｂ)の結合であるという点でＦ(ａｂ)とは異なる。ＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイル（図９）は、ペプシンおよびパパインをそれぞれ用いて、高純度のＦ(ａｂ')２およびＦ(ａｂ)の成功裏の生成を示唆する。最初に、ｍＡｂ１１Ｆ(ａｂ')２を、全長ｍＡｂ１１と同じ条件下でＣＥＸ－ＨＰＬＣカラムに注入した。図１０に示すように、ｍＡｂ１１Ｆ(ａｂ')_２フラグメントについても２つのピーク溶出挙動が観察され、このことは、Ｆｃテイルではなく、Ｆ(ａｂ')_２が２ピーク溶出挙動の原因であり得ることを示唆する。ｍＡｂ１３、ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））Ｆｃテイルを含むＦｃ融合タンパク質もまた、ＣＥＸ－ＨＰＬＣカラムで試験した。ＣＥＸカラム上のｍＡｂ１３の単一ピーク溶出挙動（図１０）は、Ｆｃテイルが２ピーク溶出挙動に関与しないことをさらに裏付ける。２ピーク溶出挙動に関与している可能性があるＩｇＧ４フラグメントをさらに絞り込むために、Ｆ(ａｂ)もＣＥＸ－ＨＰＬＣカラムに注入した。興味深いことに、Ｆ(ａｂ)では、２ピーク溶出挙動ではなく、単一ピーク溶出挙動が観察された。この結果は、２ピーク溶出挙動におけるＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））ヒンジの重要な役割が示唆されている。従って、ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））Ｆ(ａｂ')２の存在が２ピーク溶出挙動の原因であると結論付けられる。

本発明のＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））配列に対する一点突然変異誘発を、バイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を改善するための次世代治療用ＩｇＧ４を設計する可能性について探求した。当初、野生型ＩｇＧ４のセリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ）は、Ｆａｂアーム交換を防ぐためにＣＰＰＣモチーフを有するＩｇＧ１ヒンジを模倣するように設計されていたが、この変異は特定の溶液条件でＣＥＸカラムに望ましくない２ピーク溶出挙動も引き起こした。本発明のＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））に対する別の一点突然変異は、Ｆａｂアーム交換を妨げ、そして同様にバイオアナリシス特性およびバイオプロセシング特性を改善することが望ましい。ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））の単一のアミノ酸をＩｇＧ１中の対応するアミノ酸に変異させることによってそのような特性を達成するために、ヒンジのセリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ）に対する同様のアプローチが試みられた。ＩｇＧ４（セリン－からプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））Ｆ(ａｂ')_２が２ピーク溶出挙動の原因であると同定されたため、Ｆｃ領域は、配列アライメント中に考慮されなかった。図１中の全てのＩｇＧ１およびＩｇＧ４は同じカッパ軽鎖を有するので、軽鎖配列は整列されていなかった。各抗体はそれ自体がユニークな可変重鎖（Ｖ_Ｈ）領域を有するため、ＩｇＧ４のＶ_Ｈ領域は、２ピーク溶出挙動に関与することができず、配列アライメントからも除外されている。従って、ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））およびＩｇＧ１についてのアミノ酸配列アライメントを、図１１に示すように、定常重鎖１（ＣＨ１）およびヒンジ領域について実施した。合計１２個のアミノ酸の相違が、ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））とＩｇＧ１との間で同定され、緑色および黄色でハイライトされた。ＩｇＧ４において最初に同定されたシステインアミノ酸は、重鎖と軽鎖との間に鎖間ジスルフィド結合を形成し、従って、システインは、ＩｇＧ４のインタクトな構造を維持するために対応するセリンに変異されていなかった。ＩｇＧ４（セリンからプロリンへの変異（ＣＰＰＣ））の残り１１個のアミノ酸は、ＩｇＧ１中で個々に対応するアミノ酸に変異されて、それらのＣＥＸ－ＨＰＬＣカラム挙動への影響を評価された。

治療用ｍＡｂ１２変異体についてのＣＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを図１２に示した。単一ピーク溶出挙動が、ｍＡｂ１２－４ｃ、ｍＡｂ１２－７、ｍＡｂ１２－９、ｍＡｂ１２－１０、ｍＡｂ１２－１１およびｍＡｂ１２－ｗについて観察された。インタクトな質量は、これらの変異体の成功裏の変異を確認した（図１３）。ｍＡｂ１２－ｗは、ヒンジ領域においてセリンからプロリンへの変異のない野生型ｍＡｂ１２である；ｍＡｂ１２－ｗは、インタクトな質量によって確認されるように、Ｆａｂアームを別の野生型ＩｇＧ（ＨＣＡ１９５）と交換して二重特異性抗体を形成することができる（図１４）。Ｆａｂアーム交換を防ぐために、セリン２２８をプロリン（ｍＡｂ１２）に変異させた（図１５）。しかしながら、この変異は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ上で予期せぬ２ピーク溶出挙動を生じた。ｍＡｂ１２の予想外の二重ピーク溶出挙動は、リシン１９６からグルタミン（ｍＡｂ１２－４ｃ）、またはセリン２１７からプロリン（ｍＡｂ１２－７）、またはグリシン２４からプロリン（ｍＡｂ１２－９）、またはプロリン２２４からヒスチジン（ｍＡｂ１２－１０）、またはプロリン２２５からスレオニン（ｍＡｂ１２－１１）のさらなる単一の点変異により排除することができる。インタクトな質量はまた、これらの変異体がＦａｂアームを野生型ＩｇＧと交換することができないことを裏付けている（図１６－２０参照）。ＥＬＩＳＡ結合アッセイ（図２１）は、変異体の全てがｍＡｂ１２として妥当な結合活性を有することを示唆した。変異は、ｍＡｂ１２の結合活性を変えなかった。

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配列表
抗CD137抗体野生型重鎖配列 (配列番号1):
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGE INHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYG PGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
抗CD137 野生型軽鎖配列 (配列番号2):
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA
TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAA
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST
YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
mAb1 部分配列 (配列番号3):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP
mAb2 部分配列 (配列番号4):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP
mAb3 部分配列 (配列番号5):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP
mAb4 部分配列 (配列番号6):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP
mAb5 部分配列 (配列番号7):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP
mAb6 部分配列 (配列番号8):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP
mAb7 部分配列 (配列番号9):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb8 部分配列 (配列番号10):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb9 部分配列 (配列番号11):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb10 部分配列 (配列番号12):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb11 部分配列 (配列番号13):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb12 部分配列 (配列番号14):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb7-w 部分配列 (配列番号15):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCP
mAb12-w 部分配列 (配列番号16):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCP
mAb12-1 部分配列 (配列番号17):
ASTKGPSVFPLAPCSKSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb12-2 部分配列 (配列番号18):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGSTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb12-3 部分配列 (配列番号19):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSEGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb12-4a 部分配列 (配列番号20):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb12-4b 部分配列 (配列番号21):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTRTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb12-4c 部分配列 (配列番号22):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTPTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb12-5 部分配列 (配列番号23):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYICNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb12-6 部分配列 (配列番号24):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVNHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
mAb12-7 部分配列 (配列番号25):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVEPKYGPPCPPCP
mAb12-8 部分配列 (配列番号26):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKKGPPCPPCP
mAb12-9 部分配列 (配列番号27):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYTPPCPPCP
mAb12-10 部分配列 (配列番号28):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGHPCPPCP
mAb12-11 部分配列 (配列番号29):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPTCPPCP

Claims

重鎖および軽鎖を含むＩｇＧ４抗体であって、ここで、重鎖が、位置２１７のセリン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域を含み、かつ位置２１７のセリン残基がプロリンに置換されており（Ｓ２１７Ｐ）、かつ
前記ＩｇＧ４抗体が、
（ａ）位置１９６のリシン残基の置換を有する、修飾ＩｇＧ４ＣＨ１領域；または
（ｂ）位置２２０のグリシン残基の置換、位置２２４のプロリン残基の置換または位置２２５のプロリン残基の置換を有する、修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域、
をさらに含み、
ここで、位置１９６のリシン残基がプロリンに置換されている（Ｋ１９６Ｐ）、
位置２２０のグリシン残基がスレオニンに置換されている（Ｇ２２０Ｔ）、
位置２２４のプロリン残基がヒスチジンに置換されている（Ｐ２２４Ｈ）、または
位置２２５のプロリン残基がスレオニンに置換されている（Ｐ２２５Ｔ）、
ＩｇＧ４抗体。
重鎖ヒンジ領域における位置２２８のセリン残基の置換をさらに含む、請求項１に記載のＩｇＧ４抗体。
位置２２８のセリン残基がプロリンに置換されている（Ｓ２２８Ｐ）、請求項２に記載のＩｇＧ４抗体。
非修飾ＩｇＧ４抗体と比較して、改善されたバイオアナリシス特性またはバイオプロセシング特性を有する、請求項１に記載のＩｇＧ４抗体。
ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１に記載のＩｇＧ４抗体。
全長抗体である、請求項１に記載のＩｇＧ４抗体。
抗体フラグメントであり、かつ請求項１に記載の置換を含む、請求項１に記載のＩｇＧ４抗体。
抗体フラグメントがＦ(ａｂ) _２である、請求項７に記載のＩｇＧ４抗体。
ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ４、ｅＴａｕ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｌａｇ３、ＰＤ１、ＰＤＬ１およびＫＩＲから選択される標的分子に結合する、請求項１に記載のＩｇＧ４抗体。
残基の置換が、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖に行われている、請求項１に記載のＩｇＧ４抗体。
改善されたバイオアナリシス特性が、分析的陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む、請求項４に記載のＩｇＧ４抗体。
分析的ＣＥＸ樹脂が、ＰｒｏＰａｃＳＣＸ－１０、ＰｒｏｐａｃＷＣＸ－１０、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＣＭ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ（登録商標）Ｓ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＮＰＲ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＴＡＴ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＰ－２ＳＷ、ＳＯＵＲＣＥ（商標）１５Ｓ４．６／１００ＰＥＩ、ＭｏｎｏＳ（登録商標）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＢＩＯＰｏｌｙＭＡ－ＳＣＸ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｘ（登録商標）ＷＣＸ－ＮＰ、ＰｒｏｔｅｏｍｉｘＳＣＸ－ＮＰおよびＰｒｏｔｅｏｍｉｘＷＣＸ－ＮＰから選択される、請求項１１に記載のＩｇＧ４抗体。
バイオプロセシング特性が、ＣＥＸ樹脂上の単一ピーク溶出挙動を含む、請求項４に記載のＩｇＧ４抗体。
ＣＥＸ樹脂が、ＰｏｒｏｓＨＳ、ＰｏｒｏｓＸＳ、カルボキシ－メチル－セルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤＡＢＸＴＭ、アガロースに固定化されたスルホプロピルおよびアガロースに固定化されたスルホニル、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓ、３０Ｓ、ＳＰセファロース、ＣＭセファロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤカルボキシ－スルホン、ＷＰＣＢＸ、ＷＰスルホン酸、ＨｙｄｒｏｃｅｌｌＣＭ、ＨｙｄｒｏｃｅｌｌＳＰ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、Ｍａｃｒｏ－ＰｒｅｐＨｉｇｈＳ、Ｍａｃｒｏ－ＰｒｅｐＣＭ、セラミックハイパーＤＳ、セラミックハイパーＤＣＭ、セラミックハイパーＤＺ、トリサクリルＭＣＭ、トリサクリルＬＳＣＭ、トリサクリルＭＳＰ、トリサクリルＬＳＳＰ、スフェロデックスＬＳＳＰ、ＤＯＷＥＸＦｉｎｅＭｅｓｈ強酸性カチオン樹脂、ＤＯＷＥＸＭＡＣ－３、マトレックスセルファインＣ５００、マトレックスセルファインＣ２００、フラクトゲルＥＭＤＳＯ３－、フラクトゲルＥＭＤＳＥ、フラクトゲルＥＭＤＣＯＯ－、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、Ｄｉａｉｏｎ弱酸性および強酸性陽イオン交換体、ＴＳＫＧｅｌＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、ＴＳＫＧｅｌＳＰ－５ＰＷ、トヨパールＣＭ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、トヨパールＳＰ（６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ）、ＣＭ（２３、３２、５２）、ＳＥ（５２、５３）、Ｐ１１、Ｅｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＣおよびＥｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＳから選択される、請求項１３に記載のＩｇＧ４抗体。
位置２１７のセリン残基の置換を有する修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む融合タンパク質であって、ここで位置２１７のセリン残基がプロリンに置換されており（Ｓ２１７Ｐ）、かつ前記融合タンパク質が：
（ａ）位置１９６のリシン残基の置換を有する、修飾ＩｇＧ４重鎖ＣＨ１領域；または
（ｂ）位置２２０のグリシン残基の置換、位置２２４のプロリン残基の置換、または位置２２５のプロリン残基の置換を有する、修飾ＩｇＧ４重鎖ヒンジ領域
をさらに含み、
ここで、位置１９６のリシン残基がプロリンに置換されている（Ｋ１９６Ｐ）、
位置２２０のグリシン残基がスレオニンに置換されている（Ｇ２２０Ｔ）、
位置２２４のプロリン残基がヒスチジンに置換されている（Ｐ２２４Ｈ）、または
位置２２５のプロリン残基がスレオニンに置換されている（Ｐ２２５Ｔ）、
融合タンパク質。
ＩｇＧ４重鎖ヒンジ領域の位置２２８のセリン残基の置換をさらに含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
ヒトＩｇＧ４重鎖の位置２１７のセリン残基をプロリンに置換し（Ｓ２１７Ｐ）、かつ位置１９６、２２０、２２４または２２５の少なくとも１つの残基を置換することによりＩｇＧ４抗体を修飾することを含む、ＩｇＧ４抗体のバイオアナリシス特性またはバイオプロセシング特性を改善する方法であって、ここで、修飾ＩｇＧ４抗体は、非修飾ＩｇＧ４抗体と比較して改善されたバイオアナリシス特性またはバイオプロセシング特性を有し、修飾ＩｇＧ４抗体が、Ｋ１９６Ｐ、Ｇ２２０Ｔ、Ｐ２２４ＨおよびＰ２２５Ｔから選択される少なくとも１つの変異を含む、
方法。
ＩｇＧ４抗体がＳ２２８Ｐ変異をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
ＩｇＧ４重鎖の位置２１７のセリン残基をプロリンに置換し（Ｓ２１７Ｐ）、かつ位置１９６、２２０、２２４または２２５の少なくとも１つの残基を置換することによりＩｇＧ４重鎖ＣＨ１またはヒンジ領域を修飾することを含む、ＩｇＧ４重鎖ＣＨ１またはヒンジ領域を含む融合タンパク質のバイオアナリシス特性またはバイオプロセシング特性を改善する方法であって、ここで、修飾融合タンパク質が、非修飾融合タンパク質と比較して改善されたバイオアナリシス特性またはバイオプロセシング特性を有し、修飾融合タンパク質が、Ｋ１９６Ｐ、Ｇ２２０Ｔ、Ｐ２２４ＨおよびＰ２２５Ｔから選択される少なくとも１つの変異を含む、方法。
融合タンパク質がＳ２２８Ｐ変異をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
（１）請求項１に記載のＩｇＧ４抗体または請求項１５に記載の融合タンパク質；および、（２）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
請求項１に記載のＩｇＧ４抗体または請求項１５に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
請求項１に記載のＩｇＧ４抗体または請求項１５に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクター。
請求項１に記載のＩｇＧ４抗体または請求項１５に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞。
哺乳動物細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
請求項１に記載のＩｇＧ４抗体または請求項１５に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、請求項２４に記載の宿主細胞を請求項１に記載のＩｇＧ４抗体または請求項１５に記載の融合タンパク質の発現に適した条件下で培養することを含む、方法。
対象において癌を処置するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１に記載のＩｇＧ４抗体または請求項１５に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
対象において自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１に記載のＩｇＧ４抗体または請求項１５に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。