CN104177492B

CN104177492B - FGFR2c胞外段类似物及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104177492B
Application number: CN201410347938.0A
Authority: CN
Inventors: 汪炬; 陈安安
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2014-07-21
Filing date: 2014-07-21
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2034-07-21
Also published as: US20170204157A1; WO2016011935A1; JP2017522052A; CN104177492A

Abstract

本发明公开一种FGFR2c胞外段类似物及其编码基因与应用。该类似物选自氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型wsFGFR2c；或是与野生型wsFGFR2c的氨基酸序列至少有80％同源性的序列；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示S252W突变型msFGFR2c；或是与S252W突变型msFGFR2c的氨基酸序列至少有80％同源性的序列。将编码类似物的基因和表达载体重组，得到表达重组载体；将重组载体导入宿主细胞中，得到转基因细胞株。发酵该转基因细胞株，得到FGFR2c胞外段类似物。该FGFR2c胞外段类似物、编码基因、重组载体和转基因细胞株均可用于制备用于抑制EGF信号通路的药物。

Description

FGFR2c胞外段类似物及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种FGFR2c胞外段类似物及其编码基因与应用。

背景技术

FGF信号具有促进细胞增殖，诱导新生血管形成等重要生理作用。肿瘤的发生与发展过程与FGF信号通路也有十分密切的关系。典型的FGF受体由细胞外区、跨膜区和细胞内区组成，它们都为单链的糖蛋白分子。细胞外区为3个免疫球蛋白样结构域(Ⅰ～Ⅲ)，分别命名为D1，D2和D3，在D1和D2之间有一个由4～8个酸性氨基酸组成的酸盒；跨膜区是一个穿膜螺旋；细胞内区是酪氨酸激酶区(PTK)。FGF受体胞外段(如D1-D3区)可用于抑制FGF信号，并用于***、皮肤炎症等。文献报道的FGFR2c亚型胞外段其序列有采用自第147至第366个氨基酸(Ju Wang,Xue-ting Liu,Hui Huang,et al.Antitumor Activity of aRecombinant Soluble Ectodomain of Mutant Human Fibroblast Growth Fac torReceptor-2IIIc.Mol Cancer Ther2011；10:1656-1666.)，也有采用自第151至第377个氨基酸(何颖，汪炬等.FGFR2IIIc胞外段的原核表达及其对***癌细胞增殖的抑制作用.中国生物工程杂志.2009,29(7):7～11.文中指出是150～366aa，实际上通过引物扩增出来的是151～377aa)具有抑制肿瘤细胞增殖作用，但存在着溶解性不太好、较不稳定等问题。

EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。也是肿瘤治疗中重要的分子靶点。对EGF信号的抑制往往导致其他酪氨酸激酶信号的激活，如FGF信号，并产生耐药。因此，有必要寻找能够同时抑制EGF以及FGF信号的分子，对肿瘤的治疗效果更好。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种FGFR2c胞外段类似物，使其蛋白稳定性更好。

本发明的另一目的在于提供所述的FGFR2c胞外段类似物的编码基因。

本发明的再一目的在于提供所述的FGFR2c胞外段类似物及其编码基因的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种FGFR2c胞外段类似物(sFGFR2c)，选自如下多肽：

(1)野生型wsFGFR2c：氨基酸序列如下所示；或是与野生型wsFGFR2c的氨基酸序列至少有80％同源性的序列；

所述的野生型wsFGFR2c的氨基酸序列：

NKRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVL；

(2)S252W突变型msFGFR2c：氨基酸序列如下所示；或是与S252W突变型msFGFR2c的氨基酸序列至少有80％同源性的序列；

所述的S252W突变型msFGFR2c的氨基酸序列为：

NKRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERWPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVL；

所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因，选自如下核苷酸序列：

(1)①编码野生型wsFGFR2c的核苷酸序列，如下所示；或

②因遗传密码的简并性而与(1)①的核苷酸序列不同的序列；或

③与(1)①或(1)②的核苷酸序列至少有80％同源性的序列；

所述的编码野生型wsFGFR2c的核苷酸序列为：

AACAAGAGAGCACCATACTGGACCAACACAGAAAAGATGGAAAAGCGGCTCCATGCTGTGCCTGCGGCCAACACTGTCAAGTTTCGCTGCCCAGCCGGGGGGAACCCAATGCCAACCATGCGGTGGCTGAAAAACGGGAAGGAGTTTAAGCAGGAGCATCGCATTGGAGGCTACAAGGTACGAAACCAGCACTGGAGCCTCATTATGGAAAGTGTGGTCCCATCTGACAAGGGAAATTATACCTGTGTGGTGGAGAATGAATACGGGTCCATCAATCACACGTACCACCTGGATGTTGTGGAGCGATCGCCTCACCGGCCCATCCTCCAAGCCGGACTGCCGGCAAATGCCTCCACAGTGGTCGGAGGAGACGTAGAGTTTGTCTGCAAGGTTTACAGTGATGCCCAGCCCCACATCCAGTGGATCAAGCACGTGGAAAAGAACGGCAGTAAATACGGGCCCGACGGGCTGCCCTACCTCAAGGTTCTCAAGGCCGCCGGTGTTAACACCACGGACAAAGAGATTGAGGTTCTCTATATTCGGAATGTAACTTTTGAGGACGCTGGGGAATATACGTGCTTGGCGGGTAATTCTATTGGGATATCCTTTCACTCTGCATGGTTGACAGTTCTG；

(2)①编码S252W突变型msFGFR2c的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示；或

②因遗传密码的简并性而与(2)①的核苷酸序列不同的序列；或

③与(2)①或(2)②的核苷酸序列至少有80％同源性的序列；

所述的编码S252W突变型msFGFR2c的核苷酸序列为：

AACAAGAGAGCACCATACTGGACCAACACAGAAAAGATGGAAAAGCGGCTCCATGCTGTGCCTGCGGCCAACACTGTCAAGTTTCGCTGCCCAGCCGGGGGGAACCCAATGCCAACCATGCGGTGGCTGAAAAACGGGAAGGAGTTTAAGCAGGAGCATCGCATTGGAGGCTACAAGGTACGAAACCAGCACTGGAGCCTCATTATGGAAAGTGTGGTCCCATCTGACAAGGGAAATTATACCTGTGTGGTGGAGAATGAATACGGGTCCATCAATCACACGTACCACCTGGATGTTGTGGAGCGATGGCCTCACCGGCCCATCCTCCAAGCCGGACTGCCGGCAAATGCCTCCACAGTGGTCGGAGGAGACGTAGAGTTTGTCTGCAAGGTTTACAGTGATGCCCAGCCCCACATCCAGTGGATCAAGCACGTGGAAAAGAACGGCAGTAAATACGGGCCCGACGGGCTGCCCTACCTCAAGGTTCTCAAGGCCGCCGGTGTTAACACCACGGACAAAGAGATTGAGGTTCTCTATATTCGGAATGTAACTTTTGAGGACGCTGGGGAATATACGTGCTTGGCGGGTAATTCTATTGGGATATCCTTTCACTCTGCATGGTTGACAGTTCTG；

一种表达重组载体，含有所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因；

所述的表达重组载体优选为将所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因克隆至表达载体得到，或是将所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因和其他基因重组，再克隆至表达载体得到；

所述的表达载体包括原核表达载体和真核表达载体；优选为pET3c载体、pCDNA3.1载体、pIRESneo3载体、pPICZαA载体或pFastBac载体；

所述的其他基因优选为编码免疫球蛋白表位标记序列的基因或编码Fc区的基因；

一种转基因细胞株，是将上述表达重组载体转染到宿主细胞中得到；

所述的宿主细胞优选为CHO细胞、大肠杆菌、昆虫细胞和酵母细胞中的任一种；

一种融合蛋白，含有上述FGFR2c胞外段类似物的氨基酸序列；

所述的融合蛋白优选为免疫球蛋白表位标记序列或Fc区与上述FGFR2c胞外段类似物连接得到；

上述任一项多肽或上述任一项核苷酸序列用于抑制EGF信号通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖；

上述表达重组载体、上述宿主细胞和上述融合蛋白中的任一项用于抑制EGF信号通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖；

一种用于抑制EGF信号通路和抗肿瘤的药物，其活性成分包括上述任一项核苷酸序列、上述任一项多肽、上述载体、上述宿主细胞或上述融合蛋白。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明在于利用FGFR2c胞外段类似物或其药用组合物阻断如EGF信号通路，阻止其激活，从而抑制肿瘤及其他以EGFR为靶点的疾病。

附图说明

图1是实施例1中FGFR2c胞外段类似物(sFGFR2c)的SDS-PAGE图；其中，泳道M为蛋白Marker，泳道1为诱导的野生型wsFGFR2c，泳道2为未诱导的野生型wsFGFR2c，泳道3为诱导的S252W突变型msFGFR2c，泳道4为未诱导的S252W突变型msFGFR2c。

图2是实施例1中sFGFR2c的蛋白杂交图；其中，泳道1为野生型wsFGFR2c，泳道2为S252W突变型msFGFR2c。

图3是实施例7中sFGFR2c、sFGFR2c(147-366aa)和sFGFR2c(151-377aa)稳定性比较图和肿瘤细胞抑制效果比较图；其中图A是sFGFR2c稳定性的电泳图，图B是sFGFR2c(147-366aa)稳定性的电泳图，图C是sFGFR2c(151-377aa)稳定性的电泳图。

图4是实施例8中sFGFR2c与EGFR的结合能力的co-IP图；其中，wsFGFR2c为野生型FGFR2c胞外段类似物，msFGFR2c为S252W突变型msFGFR2cFGFR2c胞外段类似物。

图5是实施例8中sFGFR2c对DU145细胞增殖影响的CCK8结果图；其中，wsFGFR2c为野生型FGFR2c胞外段类似物，msFGFR2c为S252W突变型FGFR2c胞外段类似物，▲代表与空白对照组相比，P＜0.01；代表与EGF单独诱导组相比，P＜0.01。

图6是实施例8中FGFR2c胞外段类似物对EGFR/ERK信号通路影响的蛋白杂交鉴定图；其中，wsFGFR2c为野生型FGFR2c胞外段类似物，msFGFR2c为S252W突变型FGFR2c胞外段类似物。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。所用到的细胞株和载体均为商业化产品。F开头的引物一般为上游引物，R开头的引物一般为下游引物。

实施例1野生型及突变型FGFR2c胞外段类似物多肽基因在大肠杆菌中的表达

本实施例描述野生型wsFGFR2c和S252W突变型msFGFR2c的制备过程。

一、FGFR2c胞外段类似物多肽基因的制备：

1、用Trizol法从人胎盘组织(从广东某医院经产妇同意获得新鲜胎盘组织)提取野生型FGFR2c胞外段总RNA，并建立cDNA文库；

(1)用Trizol法抽提mRNA：使用Trizol试剂进行抽提，具体步骤见文献“张志成.突变型βFGFR2IIIc胞外段的原核表达、体外复性及活性研究.暨南大学硕士论文,2007:46-47”。

(2)进行RT-PCR以获得cDNA：

计算好整个逆转录PCR各成分的用量，先在PCR管内加入步骤(1)制备的样品总RNA和DEPC处理水，在PCR仪上进行RNA预变性，条件为65℃，10min。预变性后立即***冰中。然后再添加逆转录反应中的其他成分，进行逆转录反应，得到cDNA。具体如下：

逆转录PCR程序：30℃，10min；42℃，1h；70℃，10min。

2、引物的设计：

本发明中引物合成均来自于北京六合华大基因科技股份有限公司。

本发明中限制性内切酶均来自于TaKaRa。

野生型wsFGFR2c基因引物序列如下：

F1：5’-CGCATATGAACAAGAGAGCACCATAC-3’；划横线为Nde Ⅰ酶切位点；

R1：5’-ATGGATCCCTATTA CAGAACTGTCAACCATGC-3’；划横线为BamH I酶切位点。

为获得编码S252W突变型msFGFR2c的基因，设计一对定点突变引物，如下：

F2：5’-TTGTGGAGCGATGGCCTCACCGGCCCAT-3’；

R2：5’-ATGGGCCGGTGAGGCCATCGCTCCACAA-3’。

3、FGFR2c胞外段类似物基因序列的扩增：

为扩增野生型FGFR2c胞外段类似物基因，使用野生型wsFGFR2c引物(F1和R1)对步骤1得到的cDNA进行PCR，得到野生型wsFGFR2c基因。

为扩增突变型FGFR2c胞外段类似物基因，利用重叠延伸PCR法，以野生型wsFGFR2c基因为模板，分别使用突变型PCR引物，扩增得到S252W突变型msFGFR2c基因。

上述PCR的扩增体系和反应条件如下(PrimerSTAR max来自TaKaRa)：

野生型FGFR2c PCR反应体系：

重叠PCR进行点突变获得S252W突变型msFGFR2c基因包括两个步骤：

第一步PCR反应体系：

第二步PCR反应体系：

反应条件为：96℃5min；94℃15s、60℃15s、72℃5s，31个循环；72℃10min。

4、收集、纯化、鉴定步骤：

1％浓度的琼脂糖电泳，切胶，使用DNA凝胶回收试剂盒(TIANGEN，DP209)回收DNA，回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9。

二、野生型及突变型的FGFR2c胞外段类似物多肽基因重组载体的构建：

1、以双酶切和连接反应构建重组质粒

分别将PCR扩增的序列与pET3c载体(来自美国Invitrogen公司)同时进行Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，酶切反应条件：37℃水浴4h；

pET3c质粒和FGFR2c基因分别经Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，使用T4DNA连接酶进行连接，按T4DNA连接酶说明书操作，配制反应体系，连接反应条件为16℃水浴12h，得到连接产物。

2、重组质粒的表达和鉴定

I、CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α菌株：先用CaCl₂制备大肠杆菌DH5α感受态，接着使用上述步骤得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，具体步骤见文献“张志成.突变型βFGFR2IIIc胞外段的原核表达、体外复性及活性研究.暨南大学硕士论文,2007:46”。

II、重组质粒的双酶切鉴定：

用接种环多次挑取单菌落分别至于含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的5ml LB培养基中，并做好标记，37℃摇床震荡培养12h，抽提质粒(按照OMEGA质粒小提试剂盒操作方法)，进行双酶切鉴定(使用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切)，选取双酶切鉴定成功的单克隆送生工生物公司测序，获得测序正确的pET3c-FGFR2c、pET3c-S252W-FGFR2c两种重组质粒。

三、FGFR2c胞外段类似物多肽基因在大肠杆菌中的表达：

(1)按照上述CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α菌株的方法，同理将上述两种重组质粒分别转入到大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)工程菌种中，获得表达菌株；

(2)按体积比1：50的接种比例将BL21(DE3)表达菌株接种到含有质量体积比0.1％Amp的灭菌的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养。

当菌体OD600达到0.6～0.8时，设对照组和诱导组：诱导组加0.84M IPTG至终浓度为0.84mM，37℃诱导表达3h；对照组不做任何处理。

以SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白表达情况，结果如图1所示。结果表明，IPTG能较好地诱导BL21(DE3)表达菌株表达FGFR2c胞外段类似物。

四、FGFR2c胞外段类似物多肽的收集与纯化：

(1)按步骤三的方法获得IPTG诱导后的菌体，接着4℃、6000rpm离心30min收集菌体沉淀。

(2)按菌体：破碎缓冲液＝1g：(8～10)ml的比例，超声破碎菌体，破碎完成后4℃、18000rpm离心60min，收集破碎的上清。破碎条件是：工作3s，停5s，破碎时间为18min，振幅为65％，破碎缓冲液为：0.15M NaCl、25mM磷酸钠缓冲液(PB，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠搭配得到)、2mM EDTA，pH＝7.5。

(3)在一些原核表达的菌中，FGFR2c胞外段类似物蛋白以包涵体形式表达，则通过包涵体清洗以及变复性技术来获得活性形式的FGFR2c胞外段类似物蛋白(具体方法可参考专利ZL200710029286.6实施例1)。

(4)通过Western Blot进行检测，一抗为Bek抗体(c-17)(santa CruzBiotechnology)，二抗为兔二抗(cat NO.AS006,Asbio)。结果如图2所示，表明FGFR2c胞外段类似物能被FGFR抗体特异性识别。

实施例2FGFR2c胞外段类似物在哺乳动物细胞中表达

该实施例描述通过在哺乳动物细胞中的重组表达野生型wsFGFR2c、S252W突变型msFGFR2c基因制备潜在糖基化形式的FGFR2IIIc胞外段类似物多肽的方法。

1、引物设计如下：

F3：5’-ATATGGATCCGCCGCCACC ATG AACAAGAGAGCACCATAC-3’；划横线为BamH I酶切位点；

R3：5’-GCGCAAGCTTTCATTA CAGAACTGTCAACCATGC-3’；划横线为HindⅢ酶切位点。

2、载体构建：

载体pCDNA3.1(-)(购买于美国Invitrogen公司)作为表达载体；

以实施例1得到的pET3c-FGFR2c、pET3c-S252W-FGFR2c为模板，以F3和R3为引物，进行PCR，反应体系和条件同实施例1。将得到的野生型wsFGFR2c基因、S252W突变型msFGFR2c基因分别连接到pCDNA3.1(-)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，由此产生的载体称为pCDNA3.1-FGFR2c、pCDNA3.1-FGFR2c-S252W、(具体步骤同实施例1，所用的双酶切的酶为BamH I和HindⅢ)。

3、pCDNA3.1-FGFR2c、pCDNA3.1-FGFR2c-S252W分别转染293细胞

(1)按照去内毒素质粒小提试剂盒的方法(购买于OMEGA公司)抽提质粒，得到pCDNA3.1-FGFR2c、pCDNA3.1-FGFR2c-S252W质粒；

(2)选用人胚肾细胞293T细胞(ATCC，CRL-3216)为宿主细胞，以添加了胎牛血清(FBS，终浓度为10％v/v)的DMEM培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱培养细胞生长至融合；

(3)转染24h前，用质量体积比0.25％的胰酶消化对数期生长的293T细胞，用无双抗的DMEM培养基吹打细胞成悬液，铺于六孔板中，每孔2×10⁵个，使其在转染时完全贴壁，且细胞密度达到50％-60％；

(4)用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒(购买于美国Invirtogen公司)进行转染，具体转染步骤如下：

①LipofectamineTM2000的稀释：按六孔板每孔的量计算：5μLLipofectamineTM2000加到250μL opti-MEM培养基的比例稀释，静置5min；

②待转染质粒的稀释：按六孔板每孔的量计算：4μg待转染质粒加到250μL opti-MEM培养基的比例稀释；

③将步骤①和步骤②得到的稀释液等体积混合，静置20min，每孔加500μL混合液，每孔补加1.5ml opti-MEM培养基；37℃、5％CO₂的培养箱培养4-6h后换成含体积百分比10％FBS的DMEM培养基；转染24h后，小心吸去旧的培养基，换上含10％(v/v)FBS的DMEM完全培养基，继续培养。

4、FGFR2c胞外段类似物蛋白质的纯化与鉴定：

4℃、18000rpm离心30min收集培养液上清，蛋白质纯化步骤为：

使用肝素亲和层析柱(GE 17-0998-01 50ml)，用双蒸水冲洗柱子3个柱体积后用亲和层析平衡液平衡柱子，流速为5ml/min，平衡至少3个柱体积后将步骤(2)得到的上清上样，上样完成后继续用亲和层析平衡液冲洗3个柱体积，换成肝素洗脱液进行洗脱，在波长为280nm处收集单一的洗脱峰，得到野生型wsFGFR2c多肽和S252W突变型msFGFR2c多肽，-70℃保存，用于后续试验。

亲和层析平衡液：25mM HEPES、0.15M NaCl，pH＝7.5；

肝素洗脱液：25mM HEPES、1.5M NaCl，pH＝7.5；

流速为5ml/min。

通过Western Blot进行鉴定。结果表明FGFR2c胞外段类似物能被FGFR抗体特异性识别。

实施例3FGFR2c胞外段类似物在CHO细胞中表达

1、引物设计：

上游引物F4：5’-ATATGCTAGCGCCGCCACC ATG AACAAGAGAGCACCATAC-3’；划横线为Nhe I酶切位点；

下游引物R4：5’-GCGCGAATTCTCATTA CAGAACTGTCAACCATGC-3’划横线为EcoR I酶切位点。

2、载体构建：

载体pIRESneo3(购自Clontech公司)作为表达载体；

按实施例2步骤2操作，所用的引物为F4和R4，所用的限制性内切酶为Nhe I和EcoRI。由此产生的载体称为pIRESneo3-FGFR2c、pIRESneo3-FGFR2c-S252W。

3、pIRESneo3-FGFR2c、pIRESneo3-FGFR2c-S252W分别转染CHO-DG44细胞

(1)用无内毒素质粒大提试剂盒抽提质粒，得到pIRESneo3-FGFR2c、pIRESneo3-FGFR2c-S252W质粒；

(2)分别用步骤(1)得到的质粒转染中华仓鼠卵巢细胞CHO-DG44细胞(Invitrogen公司)，转染步骤同实施例2；经嘌呤霉素高压(400ng/ml)筛选后得到稳定克隆的重组CHO细胞；

(3)取重组CHO细胞，按5×10⁵个/ml接种于1.5L含4mmol/L谷氨酰胺、0.68mg/L次黄嘌呤、0.194mg/L胸腺嘧啶的proCHO5培养基中，用5L摇瓶培养，在转速为110r/min的条件下，37℃培养72h后，转至31℃继续培养216h；

(4)收获1.5L培养体积下细胞培养液上清，取500ml经0.45μm滤膜过滤，按照实施例2的方法使用肝素亲和层析柱纯化目的蛋白，并通过Western Blot进行鉴定。结果表明FGFR2c胞外段类似物能被FGFR抗体特异性识别。

实施例4FGFR2c胞外段类似物多肽在酵母细胞中表达

1、引物设计：

上游引物F5：5’-ATATCTCGAGGCCGCCACC ATG AACAAGAGAGCACCATAC-3’；划横线为Xho I酶切位点；

下游引物R5：5’-GCGCTCTAGATCATTA CAGAACTGTCAACCATGC-3’；划横线为Xba Ⅰ酶切位点。

2、载体的构建：

所用的载体为毕赤酵母表达载体pPICZαA(Invitrogen)。

按实施例2步骤2操作，所用的引物为F5和R5，所用的酶为Xho I和Xba Ⅰ。由此产生的载体称为pPICZαA-FGFR2c、pPICZαA-FGFR2c-S252W。

3、大肠杆菌DH5α菌的转化及鉴定：

按照实施例1中CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α菌株的方法，将pPICZαA-FGFR2c和pPICZαA-FGFR2c-S252W分别转入大肠杆菌DH5α菌中。在含Zeocin(100μg/ml)抗生素的LB平板上对转化的DH5α进行初步筛选，挑平板上生长的单菌落在37℃、220rpm振荡培养16h，小量提质粒及酶切鉴定(使用Xho I和Xba Ⅰ进行双酶切鉴定)，挑选阳性克隆送至公司测序。

4、酵母细胞X33的转化：

将提纯的质粒(分别为pPICZαA-FGFR2c和pPICZαA-FGFR2c-S252W)用Sac I酶酶切线性化后(酶切体系是10×buffer2μl、质粒10μl、Sac I1μl，加ddH₂O至20μl)，分别电转化毕赤酵母X33感受态细胞，具体如下：取80μl X33感受态细胞和20μl线性化的质粒混匀后转入预冷的0.2cm间隙的电击杯中，冰浴5min；电脉冲能转化电压1800V、4.3ms电击转化；立即加入1mL预冷的1M山梨醇至杯中，用移液器轻轻混匀后转到1.5mL EP管中，涂布于含有100μg/ml Zeocin的高渗完全培养基(YPDS)平板，28℃培养2～3d。

5、重组菌株的鉴定和诱导表达：具体步骤参见文献“王丁丁等.一种融合抗体ScFv-Fc通用表达载体的构建.中国生物工程杂志.2011,31(8):110-117”中的融合抗体ScFv-Fc的表达。

6、FGFR2c胞外段类似物蛋白质的纯化与鉴定

(1)通过离心从发酵培养基中除去酵母细胞；

(2)使用8000KD的柱式超滤器浓缩培养基，初步分离和纯化重组FGFR2c胞外段类似物；

(3)使用肝素柱亲和层析(同实施例2)，进一步纯化含FGFR2c胞外段类似物的浓缩物，并通过Western Blot进行鉴定。结果表明FGFR2c胞外段类似物能被FGFR抗体特异性识别。

实施例5FGFR2c胞外段类似物在杆状病毒及感染的昆虫细胞中的表达

1、按照实施例2的方法获得载体pFastBac-FGFR2c和pFastBac-FGFR2c-S252W(引物同实施例2，pFastBac载体来自Invitrogen)。

2、转化大肠杆菌DH10Bac感受态

大肠杆菌感受态DH10Bac(来自Invitrogen)从-80℃中取出后放到冰上溶解；取5μL质粒在无菌条件下加到大肠杆菌感受态DH10Bac中，冰上放置30min，42℃热激45s，热激后立刻放到冰上，静置2分钟；加0.9ml室温的S.O.C.培养基(Cat.No.15544-034)，225rpm(37℃)震荡45min；用S.O.C.培养基按体积比1：10比例稀释培养物，取100μL稀释液涂到含有50μg/ml卡那(kanamycin)、10μg/ml四环素(tetracycline)、7μg/ml庆大霉素(gentamicin)、200mg/ml IPTG和20mg/mL X-gal的LB平板上，将涂好的平板放到37℃培养24h；次日，挑取白斑在含有50μg/ml kana的LB液体培养基上培养，菌液进行PCR鉴定；将鉴定正确的菌液接种到5ml培养基中，37℃培养过夜；提取阳性杆粒。利用Bac-to-bac HT Vector kit(购自invitrogen公司，cat.1058-027)试剂盒抽提重组质粒DNA，琼脂糖电泳检测转化结果。

3、重组杆状病毒pFastBac载体的转染的具体方法见文献“谢秋玲等.重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达.昆虫学报.July2009,52(7):743-748”。

4、FGFR2c胞外段表达：

收集上清和细胞，16000rpm、4℃离心30min后对上清及细胞沉淀进行SDS-PAGE电泳，并通过Western Blot进行鉴定。结果表明FGFR2c胞外段类似物能被FGFR抗体特异性识别。

实施例6FGFR2c-Fc段融合蛋白在酵母细胞的表达

1、Fc段基因的获取

(1)引物设计：

F9-Fc：

5’-CCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTG-3’；

F8-Fc：

5’-AAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC-3’；

F7-Fc：

5’-TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTG-3’；

F6-Fc：

5’-TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCAGCAAG-3’；

R6-Fc：

5’-CAGGGACACCTGGTTCTTGGTCATTTCCTCTCGAGAGGGTGGCAGGGTGTACACCTGGGGTTCCCTGGGCTGGCCCTTGGCCTTGCTGATGGTTTTCTC-3’；

R7-Fc：

5’-TCTTGTAGTTGTTCTCGGGCTGGCCGTTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGGTAGAAGCCCTTCACCAGGCAGGTCAGGGACACCTGGTTCTT-3’；

R8-Fc:

5’-CCCTGCTGCCATCTGCTCTTGTCCACGGTCAGCTTGCTGTACAGGAAGAAGCTGCCGTCGCTGTCCAGCACTGGGGGGGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCGG-3’；

R9-Fc:

5’-CTTGCCGGGGGACAGGCTCAGGCTCTTCTGGGTGTAGTGGTTGTGCAGGGCCTCGTGCATCACGCTGCAGCTGAACACGTTGCCCTGCTGCCATCTGCTC-3’。

(2)经4步PCR获得Fc段目的基因，第一步是以F6-Fc和R6-Fc为引物进行PCR，1％浓度的琼脂糖电泳，切胶回收(TIANGEN，DP209)；第二步以F7-Fc和R7-Fc为引物，第一步PCR产物为模板，进行PCR，然后切胶回收；第三步以F8-Fc和R8-Fc为引物，第二步PCR产物为模板，进行PCR，然后切胶回收；第四步以F9-Fc和R9-Fc为引物，第三步PCR产物为模板，进行PCR，然后切胶回收；

PCR反应体系：

2、通过PCR和重叠PCR分别扩增获得FGFR2c胞外段、Fc段和FGFR2c-L-Fc目的基因。

以pET3c-FGFR2c质粒段基因为模板，F5-FGFR2c和R10-FGFR2c为引物，PCR得到FGFR2c模板片段；以Fc段基因为模板，F11-Fc和R11-Fc为引物，PCR得到Fc段模板片段。

(1)引物设计如下：均为5’-3’

F5-FGFR2c：5’-ATATCTCGAGGCCGCCACC ATG AACAAGAGAGCACCATAC-3’；划横线为Xho I酶切位点；

R10-FGFR2c：5’-CGACCCACCACCGCCGGAGCCACCGCCACC CAGAACTGTCAACCATGC-3’；

F11-Fc：5’-GGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCCCAAGAGCTGCGACAAG-3’；

R11-Fc：5’-ATATTCTAGATCATTACTTGCCGGGGGACAGG-3’；划横线为Xba Ⅰ酶切位点。

(2)PCR反应体系和反应条件如下：

PCR反应体系

(3)按照实施例1中PCR产物切胶回收的方法回收FGFR2c和Fc段DNA：

重叠PCR反应体系：

反应条件为：96℃5min；94℃15s、60℃15s、72℃5s，5个循环；72℃10min。

(4)上述5个循环完成后加F5-FGFR2c和R11-Fc引物各3μL，再进行30个循环，PCR产物切胶回收的方法按照实施例1，得到FGFR2c-L-Fc基因。

3、按照实施例4的方法，将FGFR2c-L-Fc基因构建到pPICZαA表达载体，并以双酶切鉴定和测序结果显示成功构建FGFR2c-L-Fc-pPICZαA重组质粒；

4、按照实施例4的方法，诱导表达以及纯化鉴定融合蛋白FGFR2c-L-Fc，结果表明融合蛋白FGFR2c-L-Fc能被FGFR抗体特异性识别。

实施例7稳定性比较

按文献(刘雪婷.野生型和突变型FGFR2Ⅲc胞外段的原核表达及其对肿瘤的抑制作用.暨南大学硕士论文.2008：8)中的方法制备得到S252W突变型msFGFR2c(147-366)和野生型FGFR2c(147-366)，以及按文献(何颖，汪炬等.FGFR2IIIc胞外段的原核表达及其对***癌细胞增殖的抑制作用.中国生物工程杂志.2009,29(7):7～11)中的方法制备得到S252W突变型msFGFR2c(151-377)和野生型FGFR2c(151-377)。

1、SDS-PAGE电泳检测sFGFR2c稳定性

将S252W突变型msFGFR2c多肽(实施例1制备得到)和野生型wsFGFR2c多肽(实施例1制备得到)，S252W突变型msFGFR2c(147-366)、野生型FGFR2c(147-366)，S252W突变型msFGFR2c(151-377)、野生型FGFR2c(151-377)分别通过25mM HEPES缓冲液透析12h，接着用0.22μm的滤膜过膜，再用25mM HEPES缓冲液稀释至蛋白浓度均为100μg/ml。各取2ml置于4℃冰箱，第1、3、5、7天同一时刻各取上清160μl(每次取样的时候都需4℃、16000rpm离心15min，弃沉淀)，将取样的样品置于-70℃。然后SDS-PAGE电泳检测蛋白质稳定情况。同时，用透析过膜的蛋白溶液作为对照。

2、结果

实验结果如图3所示：图3A为本发明制备的FGFR2c类似物的稳定性电泳图，泳道1是作为对照的S252W突变型msFGFR2c，泳道2、3、4、5分别是S252W突变型msFGFR2c第1、3、5、7天样品；泳道6是作为对照的野生型wsFGFR2c，泳道7、8、9、10分别是野生型wsFGFR2c第1、3、5、7天样品。从图中可以看出本发明制备的FGFR2c类似物基本上没有降解，蛋白比较稳定。

图3B为按文献制备的S252W突变型msFGFR2c(147-366aa)和野生型FGFR2c(147-366aa)的稳定性电泳图，泳道1是作为对照的S252W突变型msFGFR2c(147-366)，泳道2、3、4、5分别是S252W突变型msFGFR2c(147-366)第1、3、5、7天样品；泳道6是作为对照的野生型FGFR2c(147-366)，泳道7、8、9、10分别是野生型FGFR2c(147-366)第1、3、5、7天样品。从图中看出，野生型和S252W突变在第1、3天有少量降解出现(泳道2、3、7、8)，第5天进一步降解(泳道4、9)，到第7天的时候基本上降解完全(泳道5、10)。

图3C为按文献制备的S252W突变型msFGFR2c(151-377aa)和野生型FGFR2c(151-377aa)的稳定性电泳图，泳道1是作为对照的S252W突变型msFGFR2c(151-377aa)，泳道2、3、4、5分别是S252W突变型msFGFR2c(151-377aa)第1、3、5、7天样品；泳道6是作为对照的野生型FGFR2c(151-377aa)，泳道7、8、9、10分别是野生型FGFR2c(151-377aa)第1、3、5、7天样品。从图中看出，野生型和S252W突变在第1、3天有降解出现(泳道2、3、7、8)，第5天进一步降解(泳道4、9)，到第7天的时候基本上降解完全(泳道5、10)。

结论：本发明构建的FGFR2c胞外段类似物比现有技术FGFR2c胞外段(147-366aa)、FGFR2c胞外段(151-377aa)更稳定，有利于提高工艺的得率。

实施例8 FGFR2c胞外段类似物通过DU145细胞EGF信号的抑制抑制肿瘤

1、细胞培养

***癌DU145细胞(来自ATCC)传代培养于50cm²细胞培养瓶(购买于Thermo)中，添加含有10％(v/v)胎牛血清的1640培养基，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。培养过程中，当细胞间的汇合程度达80％左右时即可进行传代，使用质量体积比0.25％胰蛋白酶液消化细胞，正常传代时细胞的密度至少达5×10⁵个/mL。

2、免疫共沉淀(Co-IP)检测sFGFR2c与外源和内源EGFR结合

(1)人胚肾细胞293T细胞(ATCC，CRL-3216)过表达EGFR

1)转染和诱导：

①转染：具体方法同实施例2lipofectamineTM2000脂质体转染

②诱导：培养24后用1×PBS洗涤去残余培养基，换含有0.5％(v/v)FBS的DMEM的饥饿培养基，12h后进行诱导。具体步骤：将含有EGF(20ng/ml)或FGF-2(20ng/ml)或wsFGFR2c(1μg/ml，实施例1制备)或msFGFR2c(1μg/ml，实施例1制备)的3％(v/v)FBS的DMEM培养基加入6孔板中，每孔2ml；第1个孔只加3％(v/v)FBS的DMEM培养基，第2个孔加3％(v/v)FBS的DMEM培养基+wsFGFR2c，第3个孔加3％(v/v)FBS的DMEM培养基+wsFGFR2c+EGF，第4个孔加3％(v/v)FBS的DMEM培养基+wsFGFR2c+FGF-2，第5个孔加3％(v/v)FBS的DMEM培养基+msFGFR2c，第6个孔加3％(v/v)FBS的DMEM培养基+msFGFR2c+EGF，第7个孔加3％(v/v)FBS的DMEM培养基+msFGFR2c+FGF-2。

2)Co-IP制样

I、细胞裂解制样

①诱导1h后，先用冰预冷的1×PBS洗两次，把1×PBS彻底吸干。

②将细胞裂解液(碧云天,货号P0013)加入步骤①的细胞中，每孔加入400μL细胞裂解液。

③用细胞刮把所有细胞刮下并收集到EP管。

④振荡器上振荡30s，冰上静置裂解10min，之后4℃、16000rpm离心10min；弃沉淀，取上清，得到细胞裂解液蛋白样品。

II、孵育磁珠、制样

①取磁珠(dynabeadsM-270streptavidin)加入EP管，40μL/管；每管加入600μL1×PBS，重复洗三次。

②去除PBS，每管加入细胞裂解液蛋白样品300μL，与磁珠孵育1h。

③孵育完毕后，用含0.05％(v/v)吐温的PBS清洗磁珠，5min换一次液，重复8次。之后再用PBS洗2次，每次5min。

④吸干PBS，加入5×SDS上样buffer，沸水浴5min，制成Western blot样品。

⑤进行western blot检测，结果如图4所示。

3、CCK8法检测细胞增殖

(1)铺板：DU145细胞传代后长至七到八成满，用胰酶消化，加入含10％(v/v)FBS的1640培养基把细胞稀释至3×10⁴个/mL的细胞悬浮液，再按(4～5)×10³个细胞/孔的量加入到96孔细胞培养板中，即每孔加150μL细胞悬浮液，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

(2)饥饿：吸去原培养基，加入含0.1％活性炭处理血清的1640培养基150μL/孔，饥饿培养24h。

(3)诱导：吸去饥饿培养基，重新加入含0.1％活性炭处理血清的1640培养基，加入sFGFR2c进行诱导150μL/孔；其诱导过程为：96孔板取7列，第1列只加150μl培养基，第2列加培养基+EGF，第3列加培养基+EGF+sFGFR2c(40ng/ml)，第4列加培养基+EGF+sFGFR2c(80ng/ml)，第5列加培养基+EGF+sFGFR2c(160ng/ml)，第6列加培养基+EGF+sFGFR2c(320ng/ml)，第7列加培养基+EGF+sFGFR2c(640ng/ml)，诱导培养48h。

(4)读板：先按CCK8说明书配制好CCK8工作液，再吸干每孔的培养基的溶液，加入CCK8工作液110μL/孔，培养箱中37℃孵育4h，取出轻轻振荡，在酶标仪中读450/570nm双波长吸光值。

4、实验结果

(1)Co-IP检测EGFR与sFGFR2c结合(见图4)

Co-IP实验检测DU145细胞内源表达的EGFR与sFGFR2c的结合能力。结果发现，当有EGF存在的情况下，msFGFR2c(即S252W突变型msFGFR2c，下同)与EGFR的结合力减弱(见图3B)，同样，wsFGFR2c(即野生型wsFGFR2c)的情况也一样。另外，我们还发现，同时加入FGF-2和sFGFR2诱导DU145细胞也能引起EGFR与sFGFR2c相互结合，但这种结合远比sFGFR2c单独诱导或与EGF共同诱导时的小。

(2)EGF诱导DU145细胞增殖，同时加入sFGFR2c进行诱导时，对DU145的增殖具有抑制作用(见图5)。当EGF浓度为5ng/mL时，随着sFGFR2c浓度的增大，对EGF诱导的增殖作用抑制效果越明显，尤其是msFGFR2c，当浓度达160ng/mL时抑制作用最好，相对于对照组抑制率达21.1％，当msFGFR2c诱导浓度继续增大时，其抑制效果有所下降。而野生型wsFGFR2c的抑制效果相对较弱，在320ng/mL时相对于对照组其相对生长率为102.5％，同样，诱导浓度继续增大时，其抑制作用也有所减弱。

(3)sFGFR2c抑制EGFR/ERK信号通路(见图6)

通过western blot检测发现用sFGFR2c诱导DU145细胞后，sFGFR2c能抑制EGF诱导的EGFR和ERK磷酸化(见图6)，在与EGF共同诱导时二者都能抑制EGFR和ERK的激活，且msFGFR2c较wsFGFR2c的抑制作用更强。类似地，sFGFR2c也能抑制由FGF-2诱导的ERK磷酸化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.FGFR2c胞外段类似物在制备抑制EGF信号通路的制剂中的应用，其特征在于所述的FGFR2c胞外段类似物选自如下多肽：

(1)野生型wsFGFR2c：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)S252W突变型msFGFR2c：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述FGFR2c胞外段类似物在制备抑制EGF信号通路的制剂中的应用，其特征在于：所述的FGFR2c胞外段类似物的编码基因选自如下核苷酸序列：

(1)①编码野生型wsFGFR2c的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示；或

②因遗传密码的简并性而与(1)①的核苷酸序列不同的序列，该序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

②因遗传密码的简并性而与(2)①的核苷酸序列不同的序列，该序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述FGFR2c胞外段类似物在制备抑制EGF信号通路的制剂中的应用，其特征在于：所述的制剂的活性成分包括权利要求1所述的FGFR2c胞外段类似物、权利要求2所述的FGFR2c胞外段类似物的编码基因、表达重组载体、转基因细胞株和融合蛋白；

所述的表达重组载体含有权利要求2所述的FGFR2c胞外段类似物的编码基因；

所述的转基因细胞株是将所述的表达重组载体转染到宿主细胞中得到的细胞株；

所述的融合蛋白含有权利要求1所述的FGFR2c胞外段类似物的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述FGFR2c胞外段类似物在制备抑制EGF信号通路的制剂中的应用，其特征在于：所述的宿主细胞为CHO细胞、大肠杆菌、昆虫细胞和酵母细胞中的一种。

5.根据权利要求3所述FGFR2c胞外段类似物在制备抑制EGF信号通路的制剂中的应用，其特征在于：所述的融合蛋白为免疫球蛋白表位标记序列或Fc区与权利要求1所述的FGFR2c胞外段类似物连接得到。