JP2022511390A - 分割インターロイキン模倣体およびその使用 - Google Patents

分割インターロイキン模倣体およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】分割インターロイキン模倣体およびその使用に関する。【解決手段】活性化されると、ＩＬ－２受容体βγＣヘテロ二量体（ＩＬ－２ＲβγＣ）、ＩＬ－４受容体αγＣヘテロ二量体（ＩＬ－４ＲαγＣ）、またはＩＬ－１３受容体ａサブユニット（ＩＬ－１３Ｒα）に結合する条件付きで活性な受容体アゴニストが、条件付きで活性な受容体アゴニストの成分および条件付きで活性な受容体アゴニストを使用するための方法と同様に開示される。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、２０１８年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７０１５２号に基づく優先権を主張し、該出願を参照することにより、該出願全体を本明細書の一部として組み込む。
がん治療用のＩＬ－２およびＩＬ－４など、主要な免疫サイトカインであるインターロイキンの大きな可能性により、変異および／または化学修飾によってそれらの治療特性を改善するための多くの試みが展開された。しかしながら、これらのアプローチは、天然ＩＬ－２またはＩＬ－４と密接に結び付いているため、低い安定性およびＩＬ－２受容体αサブユニット（ＩＬ－２Ｒα）、ＩＬ－４受容体αγｃヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）、またはＩＬ－１３受容体αサブユニット（ＩＬ－１３Ｒα）に対する結合などの望ましくない特性を排除することができない。
一態様において、本開示は、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分を含む、非天然の条件付きで活性な受容体アゴニストを提供し、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は融合タンパク質に存在せず、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は、全体として、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、
（ａ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000001
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、少なくとも８アミノ酸の長さのらせん形ペプチドドメインであり、
（ｃ）Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000002
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｄ）Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000003
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉ）括弧内のアミノ酸残基は、存在するか、または存在しない場合があり、
（ｉｉ）第１のポリペプチド成分は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの少なくとも１つを含むが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々を含まず、
（ｉｉｉ）第２のポリペプチド成分は、第１のポリペプチド成分に存在しないＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々を含み、
第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は、個々に活性な受容体アゴニストではなく、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチドは相互作用して、ＩＬ－２受容体βγｃヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）、ＩＬ－４受容体αγｃヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）、ＩＬ－１３アルファ、またはＩＬ－４Ｒアルファ／ＩＬ１３Ｒアルファのヘテロ二量体の活性なアゴニストを形成する。第１および第２のポリペプチドの多数の実施形態が本明細書で提供される。例示的な実施形態において、
（ｉ）第１のポリペプチド成分は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの１つを含み、第２のポリペプチド成分は、第１のポリペプチド成分に存在しないＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの３つを含み、または
（ｉｉ）第１のポリペプチド成分は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの２つを含み、第２のポリペプチド成分は、第１のポリペプチド成分に存在しないＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの２つを含む。他の例示的な実施形態において、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、
（ｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ２を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を含み、
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を含み、
（ｉｖ）第１のポリペプチドは、Ｘ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含み、
（ｖ）第１のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ２を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ３およびＸ４を含み、
（ｖｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ２およびＸ４を含み、
（ｖｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ２およびＸ３を含み、
（ｖｉｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ２およびＸ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ４を含み、
（ｉｘ）第１のポリペプチドは、Ｘ２およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ３を含み、
（ｘ）第１のポリペプチドは、Ｘ３およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ２を含み、
（ｘｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ４を含み、
（ｘｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ３を含み、
（ｘｉｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ２を含み、または
（ｘｉｖ）第１のポリペプチドは、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１を含む。
他の例示的な実施形態において、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は、非共有結合し得、かつ／または第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は、受容体を介して互いに間接的に結合し得る。さらなる例示的な実施形態において、第１のポリペプチド成分は、第１の標的ドメインをさらに含み、かつ／または第２のポリペプチド成分は、第２の標的ドメインをさらに含み、一部の実施形態において、第１の標的ドメインは、存在する場合、第１のポリペプチドとの翻訳融合物であり、第２の標的ドメインは、存在する場合、第２のポリペプチドとの翻訳融合物である。一部の実施形態において、標的ドメインは、細胞表面タンパク質に結合し得る。
別の態様において、本開示は、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうち、１、２、または３つを含むが、４つ全てを含まないポリペプチドを提供し、
（ａ）Ｘ１は、存在する場合、ペプチド
Figure 2022511390000004
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、存在する場合、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
（ｃ）Ｘ３は、存在する場合、ペプチド
Figure 2022511390000005
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｄ）Ｘ４は、存在する場合、ペプチド
Figure 2022511390000006
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
括弧内のアミノ酸残基は、存在するか、または存在しない場合がある。ポリペプチドの多数の実施形態が提供される。いくつかの例示的な実施形態において、ポリペプチドは、
（ｉ）Ｘ１を含み、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｉｉ）Ｘ２を含み、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｘ３を含み、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｉｖ）Ｘ４を含み、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を除外するポリペプチド、
（ｖ）Ｘ１およびＸ２を含み、Ｘ３およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｖｉ）Ｘ１およびＸ３を含み、Ｘ２およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｖｉｉ）Ｘ１およびＸ４を含み、Ｘ２およびＸ３を除外するポリペプチド、
（ｖｉｉｉ）Ｘ２およびＸ３を含み、Ｘ１およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｉｘ）Ｘ２およびＸ４を含み、Ｘ１およびＸ３を除外するポリペプチド、
（ｘ）Ｘ３およびＸ４を含み、Ｘ１およびＸ２を除外するポリペプチド、
（ｘｉ）Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含み、Ｘ４を除外するポリペプチド、
（ｘｉｉ）Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を含み、Ｘ３を除外するポリペプチド、
（ｘｉｉｉ）Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を含み、Ｘ２を除外するポリペプチド、ならびに
（ｘｉｖ）Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、Ｘ１を除外するポリペプチドを含む。
別の例示的な実施形態において、ポリペプチドは標的ドメインをさらに含み、ポリペプチドとの翻訳融合物である標的ドメインを含むがこれに限定されない。一部の実施形態において、標的ドメインは、細胞表面タンパク質に結合し得る。
他の態様において、本開示は、開示された任意の実施形態のポリペプチド、第１のポリペプチド、または第２のポリペプチドをコードする核酸、プロモーターに機能可能に連結された核酸を含む発現ベクター、本明細書に開示される核酸および／または発現ベクターを含む宿主細胞、ならびに開示される任意の実施形態の条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、または宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本開示はがんを治療する方法も提供し、該方法は、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分が腫瘍の細胞で相互作用してがんを治療する条件下で、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の実施形態の条件付きで活性な受容体アゴニストを投与することを含む。
別の態様において、本開示は、がんを治療するためのおよび／または対象における免疫応答を調節するための薬剤として使用するために開示される任意の実施形態の条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本開示は、ＩＬ－２受容体またはＩＬ－４受容体を刺激する方法を提供し、該方法は、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分が受容体で相互作用する条件下で、対象に、本明細書に開示される任意の実施形態の条件付きで活性な受容体アゴニストを投与することを含む。
以下の図は、例としての実施形態に準拠している。
図１Ａ～１Ｃ。デノボサイトカイン模倣体のコンピュータによる設計。図１Ａ）設計された非分割模倣体は４つのらせんを有し、３つの模倣ＩＬ－２はｈＩＬ－２Ｒβγｃと相互作用するが、第４は定位置で最初の３つを保持する。上：第１世代の設計では、ＩＬ－２のコア要素（らせんＨ１～Ｈ４）のそれぞれが、クラスター化された理想的な断片データベース（サイズ：４アミノ酸）からの断片アセンブリを使用して個別に理想化された。下：第２世代の設計では、コア要素は代わりに各らせんの長さを＋／－８アミノ酸変更できるように、各分離らせんの形状を再現するパラメトリック方程式を使用して構築された。図１Ｂ）らせん対は理想的なループ断片（サイズ：ｇｅｎ－１およびｇｅｎ－２についてそれぞれ４アミノ酸または７アミノ酸、方法を参照）を使用して再連結され、代表的な例は、らせんの各対を連結する新しく構築された要素とともに示される。図１Ｃ）図１Ｂで作成されたらせんヘアピンは、完全に連結したタンパク質骨格を作成するために、全ての可能な組み合わせで組み立てられた。 ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の特性。結合実験（バイオレイヤー干渉法）では、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５を８０℃で２時間インキュベーションしても、顕著に結合が失われることはないが、ヒトおよびマウスのＩＬ－２は急速に活性を失うことが示される。 図３Ａ～３Ｃ。ヒトインターロイキン－４（ｈＩＬ－４）模倣体（ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４）へのｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の再改変。図３Ａ）ＩＬ－４ＲαおよびγＣ（ＰＤＢコード３ＢＰＬから）との複合体におけるＩＬ－４の構造に構造的に整列させたＮｅｏ－２／１５。ＩＬ－４Ｒαと接触し、Ｎｅｏ－２／１５にグラフティングされた１４個のＩＬ－４残基が標識されている。図３Ｂ）Ｎｅｏ－２／１５と比較して、１６個のアミノ酸変異を有する新しいタンパク質のＮｅｏｌｅｕｋｉｎ－４（Ｎｅｏ－４）。これらの変異は標識されており、これらのうちの１３個は、ＩＬ－４Ｒαとの接触を媒介するＩＬ－４残基に由来し（パネル「ａ）」に示される）、これらのうちの３個（Ｈ８Ｍ、Ｋ６８Ｉ、およびＩ９８Ｆ、図中の下線）は、ランダム変異誘発および高結合親和性バリアントのスクリーニングを使用した定向進化によって導入された。図３Ｃ）Ｎｅｏ－４が、ＩＬ－４と同様に、単独でＩＬ－４Ｒαに結合し、γｃ単独に対して親和性を有しないが、ＩＬ－４Ｒαが溶液中に存在する場合、γＣに結合することを示すバイオレイヤー干渉法データ。 図４Ａ～４Ｄ。３つの異なるデノボ設計されたＩＬ－２模倣体からの情報を組み合わせた、４つの一般的ならせんのそれぞれの結合残基における全体的な配列保存。配列ロゴは、Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２７、Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２９、およびＧ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ３６（図１１～１３）の３つの独立したＳＳＭ変異誘発ライブラリーからの結合実験（ヘテロ二量体マウスＩＬ－２Ｒβγｃを使用）から得た組み合わせデータを使用して作成された。これらのタンパク質は全て、マウスおよびヒトＩＬ－２の機能的な高親和性デノボ模倣体であり、Ｎｅｏ－２／１５とは異なるトポロジーを有するものもあるが、全て４つのらせんＨ１（図４Ａ、Ｎｅｏ－２／１５ １－２２は配列番号０４であり、ＩＬ－２ ６－２７は配列番号２４８であり、ＩＬ－１５ １－１５は配列番号２４９である）、Ｈ３（図４Ｂ、Ｎｅｏ－２／１５ ３４－５５は配列番号０５であり、ＩＬ－２ ８２－１０３は配列番号２５０であり、ＩＬ－１５ ５９－８０は配列番号２５１である）、Ｈ２’（図４Ｃ、Ｎｅｏ－２／１５ ５８－７６は配列番号０７であり、ＩＬ－２ ５０－６８は配列番号２５２であり、ＩＬ－１５ ３４－５２は配列番号２５３である）およびＨ４（図４Ｄ、Ｎｅｏ－２／１５ ８０－１００は配列番号０６であり、ＩＬ－２ １１１－１３１は配列番号２５４であり、ＩＬ－１５ ９３－１１３は配列番号２５５である）を含む。ロゴは、独立して、各らせんの組み合わせ情報を示す。各ロゴの下の線グラフは、Ｎｅｏ－２／１５配列の各アミノ酸の確率スコアを示す（高いほど保存されていることを意味する）。水平の実線は、Ｎｅｏ－２／１５アミノ酸が確率スコア≧３０％を有する位置を強調している（つまり、これらのアミノ酸は、試験された全てのデノボＩＬ－２模倣体の結合集団で全体的に濃縮されているため、より一般的に受容体結合に寄与する）。Ｎｅｏ－２／１５の各らせんのトポロジーは、各ロゴの左側に示されている。ヒトＩＬ－２およびＩＬ－１５におけるＮｅｏ－２／１５らせんの配列および対応するらせんの配列（構造的に整列した）をグラフの下に示し、Ｎｅｏ－２／１５らせんおよび結合界面の独自性を強調している。 図５Ａ～５Ｄ。Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０の実験的最適化。図５Ａ～５Ｃ）図５Ａ）５０ｎＭ、図５Ｂ）２ｎＭ、および図５Ｃ）０．１ｎＭのＩＬ－２Ｒβγｃヘテロ二量体による増加する選択の連続ラウンド後の特定の位置での濃縮を示すＧ１＿ｎｅｏ２＿４０単一部位変異誘発ライブラリーのヒートマップ。これらの濃縮データに基づいて、コンビナトリアルライブラリーは、１．５×１０６のヌクレオチド多様性で設計された。図５Ｄ）最初のコンビナトリアルライブラリーで利用可能なアミノ酸残基は、有利（元の配列の上に示される）および有害（元の配列の下に示される）であると予測される残基を示すように描かれ、元の配列の描写において、黒は、コンビナトリアルライブラリーに表示される残基を示し、灰色は、コンビナトリアルライブラリーに表示されない残基を示す。 図６Ａ～６Ｅ。Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２７の実験的最適化。図６Ａ）１０ｎＭ、図６Ｂ）１ｎＭ、図６Ｃ）０．１ｎＭ、および図６Ｄ）０．１ｎＭ ＩＬ－２ＲβγＣヘテロ二量体による増加する選択の連続ラウンド後の特定の位置での濃縮を示すＧ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２７単一部位変異誘発ライブラリーのヒートマップ。これらの濃縮データに基づいて、コンビナトリアルライブラリーは、５．３×１０６のヌクレオチド多様性で設計された。図６Ｅ）最初のコンビナトリアルライブラリーで利用可能なアミノ酸残基は、有利であると予測される残基を示すように描かれ、黒は、コンビナトリアルライブラリーに表示される開始配列の残基を示す。 図７Ａ～７Ｅ。Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２９の実験的最適化。図７Ａ）１０ｎＭ、図７Ｂ）１ｎＭ、図７Ｃ）０．１ｎＭ、および図７Ｄ）０．１ｎＭ ＩＬ－２ＲβγＣヘテロ二量体による増加する選択の連続ラウンド後の特定の位置での濃縮を示すＧ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２９単一部位変異誘発ライブラリーのヒートマップ。これらの濃縮データに基づいて、コンビナトリアルライブラリーは、２．９×１０６のヌクレオチド多様性で設計された。図７Ｅ）最初のコンビナトリアルライブラリーで利用可能なアミノ酸残基は、有利であると予測される残基を示すように描かれ、黒は、コンビナトリアルライブラリーに表示される開始配列の残基を示す。 図８Ａ～８Ｅ。Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ３６の実験的最適化。図８Ａ）１０ｎＭ、図８Ｂ）１ｎＭ、図８Ｃ）０．１ｎＭ、および図８Ｄ）０．１ｎＭ ＩＬ－２ＲβγＣヘテロ二量体による増加する選択の連続ラウンド後の特定の位置での濃縮を示すＧ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ３６単一部位変異誘発ライブラリーのヒートマップ。これらの濃縮データに基づいて、コンビナトリアルライブラリーは、２．７×１０６のヌクレオチド多様性で設計された。図８Ｅ）最初のコンビナトリアルライブラリーで利用可能なアミノ酸残基は、有利であると予測される残基を示すように描かれ、黒は、コンビナトリアルライブラリーに表示される開始配列の残基を示す。 図９Ａ～９Ｂ。複数のＩＬ－２／ＩＬ－１５デノボ設計された模倣体、第１世代の円二色性（ＣＤ）熱変性実験。図９Ａ）熱変性曲線および図９Ｂ）波長スキャン。 図１０Ａ～１０Ｂ。実験的に最適化された複数のＩＬ－２／ＩＬ－１５デノボ設計された模倣体、第１世代の円二色性（ＣＤ）熱変性実験。図１０Ａ）熱変性曲線および図１０Ｂ）波長スキャン。 図１１Ａ～１１Ｄ。ＩＬ－２／ＩＬ－１５模倣体設計、第２世代用の円二色性熱融解。図１１Ａおよび図１１Ｃ）熱変性曲線および図１１Ｂおよび図１１Ｄ）波長スキャン。 図１２Ａ～１２Ｃ。ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の発現、精製、および熱変性の特性。図１２Ａ）アフィニティーカラムでの発現および精製を示すＳＤＳトリス－トリシンゲル電気泳動。図１２Ｂ）２５℃～９５℃の熱融解中の２２２ｎｍでの円二色性は、堅牢な温度安定性を示す。図１２Ｃ）２５℃、９５℃の後、再び２５℃での円二色性波長スキャン。ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５が９５℃で完全に融解せず、２５℃に冷却した後に完全にリフォールディングすることを示す。 図１３Ａ～１３Ｂ。非結合界面位置での単一点システイン変異体に対するｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の堅牢性。図１３Ａ）タンパク質の発現またはＩＬ－２Ｒβγｃへの結合を妨害することなく、個別にシステインに変異させることができる、ｎｅｏｌｕｋｉｎ－２／１５における点変異体の位置を示す模式図。受容体結合への干渉を回避する位置が選択された。図１３Ｂ）バイオレイヤー干渉法を使用して測定されたＩＬ－２ＲβγＣとＮｅｏｌｕｋｉｎ－２／１５システイン変異体の会合動態。全てのバリアントは、Ｎｅｏ－２／１５とほぼ同様に受容体と会合する。 図１４Ａ～１４Ｃ。ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４の発現、精製、および熱変性の特性。図１４Ａ）アフィニティーカラムでの発現および精製を示すＳＤＳトリス－トリシンゲル電気泳動。図１４Ｂ）２５℃～９５℃の熱融解中の２２２ｎｍでの円二色性は、堅牢な温度安定性を示す。図１４Ｃ）２５℃、９５℃の後、再び２５℃での円二色性波長スキャン。ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４が９５℃で完全に融解せず、２５℃に冷却した後に完全にリフォールディングすることを示す。 図１５Ａ～Ｃ。分割Ｎｅｏ－２／１５バリアントは、ヒトＩＬ－２受容体に結合することにより、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５活性を再構成することができる。ａ．らせんＨ１＋Ｈ３－Ｈ２’－Ｈ４（それぞれＮｅｏ２Ａ１およびＮｅｏ２Ｂ１）間で分割されたＮｅｏ－２／１５のヒトＩＬ－２受容体へのバイオレイヤー干渉結合アッセイ。結合データは、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で収集され、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）データ分析ソフトウェアバージョン９．０．０．１０を使用して処理した。結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、０．５％脱脂粉乳）中、１μｇ／ｍｌで３００秒間、ビオチン化標的受容体ヒトγｃをストレプトアビジン被覆バイオセンサー（ＳＡ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定した。γｃ標的受容体をバイオセンサーにローディングした後、バイオセンサーを結合緩衝液のみに浸漬してベースライン測定を実施し、次に、標的分析対象タンパク質を含むウェルにバイオセンサーを浸漬した後（会合ステップ）、センサーをベースライン／緩衝液（解離）に戻して浸漬することによって結合動態を観察した。会合ステップでは、分析対象タンパク質（すなわち、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５、Ｎｅｏ２Ａ１、Ｎｅｏ２Ｂ１、および等モル比のＮｅｏ２Ａ１＋Ｎｅｏ２Ｂ１）を濃縮ストックから結合緩衝液に希釈して最終濃度を１００ｎＭにした。ヒトＩＬ－２Ｒβも飽和濃度（２５０ｎＭ）で溶液に加えた。ｂ．前述の実験プロトコルに従って、らせんＨ１－Ｈ３＋Ｈ２’－Ｈ４（それぞれＮｅｏ２Ａ２およびＮｅｏ２Ｂ２）に分割されたＮｅｏ－２／１５のバイオレイヤー干渉結合アッセイ。ｃ．前述の実験プロトコルに従って、らせんＨ１－Ｈ３－Ｈ２’＋Ｈ４（それぞれＮｅｏ２Ａ３およびＮｅｏ２Ｂ３）に分割されたＮｅｏ－２／１５のバイオレイヤー干渉結合アッセイ。 図１６Ａ～Ｃ。Ｓｐｌｉｔ－Ｎｅｏ－２／１５バリアントは、マウスＣＴＬＬ－２細胞株においてＳＴＡＴ５リン酸化により細胞シグナル伝達を刺激する。ａ．ＣＴＬＬ－２細胞は、サイトカインを含まない培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム、＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％Ｐ／Ｓ）で、アッセイ前に２時間飢餓状態にした。細胞を９６ウェルプレートに播種し、タンパク質試料の段階希釈を含むＲＰＭＩ培地に再懸濁した。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５、Ｎｅｏ２Ａ１、Ｎｅｏ２Ｂ１、および等モル比のＮｅｏ２Ａ１＋Ｎｅｏ２Ｂ１。細胞を３７℃で１５分間刺激し、ホルムアルデヒドを１．５％まで添加し、室温で１０分間インキュベーションすることにより、即時固定した。細胞は、４℃の冷１００％メタノールに３０分間再懸濁することにより、透過処理された。固定および透過処理した細胞をＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ ｐＨ７．２）で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で１：５０希釈されたＡｌｅｘａ（商標）Ｆｌｕｏｒ６４７と結合した抗ＳＴＡＴ５ ｐＹ６９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２時間室温でインキュベーションした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で測定した。用量反応曲線をロジスティックモデルに適合させ、最大半量有効濃度（ＥＣ５０値）を、刺激されていない細胞のＭＦＩを差し引き、最大シグナル強度に正規化した後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍデータ分析ソフトウェアを使用して計算した。ｂ．前述の実験プロトコルに従って、らせんＨ１－Ｈ３＋Ｈ２’－Ｈ４（それぞれＮｅｏ２Ａ３およびＮｅｏ２Ｂ３）に分割されたＮｅｏ－２／１５のバイオレイヤー干渉結合アッセイ。ｃ．前述の実験プロトコルに従って、らせんＨ１－Ｈ３－Ｈ２’＋Ｈ４（それぞれＮｅｏ２Ａ２およびＮｅｏ２Ｂ２）に分割されたＮｅｏ－２／１５のバイオレイヤー干渉結合アッセイ。 図１７Ａ～Ｂ。分割Ｎｅｏ２／１５バリアントと標的ドメインの融合物は、ＩＬ－２受容体に結合する。ａ．Ｎｅｏ２ＡおよびＮｅｏ２Ｂは、抗ＥＧＦＲおよび抗Ｈｅｒ２ ＤＡＲＰｉｎ標的ドメインに融合したタンパク質バリアントを分割する。ｂ．マウスＩＬ－２受容体への分割－Ｎｅｏ－２／１５タンパク質融合のバイオレイヤー干渉結合アッセイ。結合データは、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で収集され、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）データ分析ソフトウェアバージョン９．０．０．１０を使用して処理した。結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、０．５％脱脂粉乳）中、１μｇ／ｍｌで３００秒間、ビオチン化標的受容体ヒトγｃをストレプトアビジン被覆バイオセンサー（ＳＡ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定した。標的受容体をバイオセンサーにローディングした後、バイオセンサーを結合緩衝液のみに浸漬してベースライン測定を実施し、次に、標的タンパク質を含むウェルにバイオセンサーを浸漬した後（会合ステップ）、センサーをベースライン／緩衝液（解離）に戻して浸漬することによって結合動態を観察した。会合ステップでは、分析対象タンパク質（すなわち、ａＨｅｒ２Ｎｅｏ２Ａ１＋Ｎｅｏ２Ｂ１－ａＥＧＦＲ、ａＨｅｒ２Ｎｅｏ２Ａ２＋Ｎｅｏ２Ｂ２－ａＥＧＦＲ、ａＨｅｒ２Ｎｅｏ２Ａ３＋Ｎｅｏ２Ｂ３－ａＥＧＦＲ）を等モル量で濃縮ストックから結合緩衝液に希釈して最終濃度を１００ｎＭにした。マウスＩＬ－２Ｒβも飽和濃度（２５０ｎＭ）で溶液に加えた。 図１８Ａ～Ｃ。Ｈｅｒ２およびＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞の表面での分割Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の標的再構成。ａ．Ｎｅｏ２ＡおよびＮｅｏ２Ｂは、抗ＥＧＦＲおよび抗Ｈｅｒ２ ＤＡＲＰｉｎ標的ドメインに融合したタンパク質バリアントを分割する。ｂ．Ｈｅｒ２＋／ｅＧＦＰ＋、ＥＧＦＲ＋／ｉＲＦＰ＋またはＨｅｒ２＋／ｅＧＦＰ＋およびＥＧＦＲ＋／ｉＲＦＰ＋表面マーカーの発現のために形質導入された改変Ｋ５６２腫瘍細胞株。ｃ．前述の４つのＫ５６２細胞株の表面に対するＨｅｒ２を標的としたＮｅｏ２Ａバリアント（ａＨｅｒ２Ｎｅｏ２Ａ１、ａＨｅｒ２Ｎｅｏ２Ａ２およびａＨｅｒ２Ｎｅｏ２Ａ３）およびＥＧＦＲを標的としたＮｅｏ２Ｂ変異体（Ｎｅｏ２Ｂ１－ａＥＧＦＲ、Ｎｅｏ２Ｂ２－ａＥＧＦＲおよびＮｅｏ２Ｂ３－ａＥＧＦＲ）の機能的再構成アッセイ。全ての細胞株を同等の比率で混合し（ウェルあたり５０，０００個の各細胞タイプ）、２００．０００細胞／ウェルでＶ底プレートに移した。細胞は、等モル比の抗Ｈｅｒ２－Ｎｅｏ２、抗Ｈｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ＋抗ＥＧＦＲ－Ｎｅｏ２Ｂバリアントとともに、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．５％ＢＳＡ）中１０ｎＭの最終濃度で３０分間、室温でインキュベーションした。次に、細胞を２回洗浄し（ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．５％ＢＳＡ）、続いて次の成分とともに５分間インキュベーションした。５０ｎＭのビオチン化可溶性ヒト共通ガンマ受容体、５０ｎＭの可溶性ヒトＩＬ－２Ｒβ、および１５ｎＭのストレプトアビジン－フィコエリトリン複合体（ＳＡＰＥ）。細胞を再度洗浄し、ＬＳＲＩＩ機器でフローサイトメトリーによって分析した。Ｈｅｒ２＋細胞はｅＧＦＰ蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８／５０８）で選別され、ＥＧＦＲ＋細胞はｉＲＦＰ蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝６３７／６７０）で選別され、Ｈｅｒ２＋／ＥＧＦＲ＋細胞はｅＧＦＰおよびｉＲＦＰの同時発現によって特定された。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５活性の再構成およびＩＬ－２受容体への結合は、細胞の各サブセットの表面でのＰＥ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５６１／５８２）蛍光を分析することによって特定された。 図１９Ａ～Ｃ。Ｈｅｒ２およびＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞の表面で機能的再構成を可能にするためには、分割－Ｎｅｏ－２／１５バリアントの両断片が必要である。ａ．下記マーカーを発現する４つのＫ５６２細胞株の表面に対するＨｅｒ２を標的としたＮｅｏ２Ａバリアント（ａＨｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ１）およびＥＧＦＲを標的としたＮｅｏ２Ｂバリアント（Ｎｅｏ２Ｂ１－ａＥＧＦＲ）の機能的再構成アッセイ。なし、Ｈｅｒ２＋／ｅＧＦＰ＋、ＥＧＦＲ＋／ｉＲＦＰ＋、Ｈｅｒ２＋／ｅＧＦＰ＋／ＥＧＦＲ＋／ｉＲＦＰ＋。全ての細胞株を同等の比率で混合し（ウェルあたり５０，０００個の各細胞タイプ）、２００．０００細胞／ウェルでＶ底プレートに移した。細胞は、抗Ｈｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ１、Ｎｅｏ２Ｂ１－抗ＥＧＦＲまたは抗Ｈｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ１＋Ｎｅｏ２Ｂ１－抗ＥＧＦＲとともに、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．５％ＢＳＡ）中８１０ｎＭの最終濃度で３０分間、室温でインキュベーションした。次に、細胞を２回洗浄し（ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．５％ＢＳＡ）、続いて次の成分とともに５分間インキュベーションした。５０ｎＭのビオチン化可溶性ヒト共通ガンマ受容体、５０ｎＭの可溶性ヒトＩＬ－２Ｒβ、および１５ｎＭのストレプトアビジン－フィコエリトリン複合体（ＳＡＰＥ）。細胞を再度洗浄し、ＬＳＲＩＩ機器でフローサイトメトリーによって分析した。Ｈｅｒ２＋細胞はｅＧＦＰ蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８／５０８）で選別され、ＥＧＦＲ＋細胞はｉＲＦＰ蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝６３７／６７０）で選別され、Ｈｅｒ２＋／ＥＧＦＲ＋細胞はｅＧＦＰおよびｉＲＦＰの同時発現によって特定された。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５活性の再構成およびＩＬ－２受容体への結合は、細胞の各サブセットの表面でのＰＥ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５６１／５８２）蛍光を分析することによって特定された。観察されたように、両断片は、二重陽性細胞の表面で機能的なＮｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５活性を再構成するために必要である。ｂ．ａＨｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ２およびＮｅｏ２Ｂ２－ａＥＧＦＲを使用した（ａ）に記載したのと同じアッセイ。ｃ．ａＨｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ３およびＮｅｏ２Ｂ３－ａＥＧＦＲを使用した（ａ）に記載したのと同じアッセイ。 図２０Ａ～Ｂ。免疫細胞サブタイプの高特異的活性化のための分割Ｎｅｏ－２プラットフォームの代替作用機序の図解。ａ．特定の免疫細胞サブタイプ（例えば、ＣＤ８＋、ＣＡＲ Ｔ細胞または制御性Ｔ細胞）の増殖を刺激するための分割Ｎｅｏ－２の２つの表面マーカーへの選択的標的化。ｂ．分割Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５システムによる腫瘍およびＴ細胞の同時標的化により、標的腫瘍細胞の環境で免疫細胞サブセットの特異的増殖を誘導する。 図２１Ａ。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４分割断片は、組み合わせると完全な活性を再構成することができる。らせんＨ１（Ｎｅｏ４Ａ１）＋Ｈ３－Ｈ２’－Ｈ４（Ｎｅｏ４Ｂ１）に分割されたＮｅｏ－４のヒトＩＬ－４受容体へのバイオレイヤー干渉結合アッセイ。結合データは、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で収集され、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）データ分析ソフトウェアバージョン９．０．０．１０を使用して処理した。結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、０．５％脱脂粉乳）中、１μｇ／ｍｌで３００秒間、ビオチン化標的受容体ヒトγｃをストレプトアビジン被覆バイオセンサー（ＳＡ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定した。標的受容体をバイオセンサーにローディングした後、結合緩衝液単独でベースライン測定を実施し、次に、指示濃度の標的タンパク質を含むウェルにバイオセンサーを浸漬した後（会合ステップ）、センサーをベースライン／緩衝液に戻して浸漬する（解離）ことによって結合動態を観察した。会合ステップでは、分析対象タンパク質（すなわち、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４、Ｎｅｏ４Ａ１、Ｎｅｏ４Ｂ１および等モル比のＮｅｏ４Ａ１＋Ｎｅｏ４Ｂ１）を濃縮ストックから結合緩衝液に希釈して１００ｎＭの最終濃度にし、ヒトＩＬ－４Ｒαも溶液に飽和濃度（２５０ｎＭ）で添加した。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「ａ」および「ａｎ」という用語は、「１つ」、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈される。文脈上特に必要がない限り、本明細書で使用される単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。
文脈上明らかに別段の必要がない限り、本記載および特許請求の範囲全体を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」などの語は、排他的意味の対語としての包括的意味、または網羅的意味で、すなわち、「含むが、これらに限定されない」の意味で解釈されたい。単数または複数を使用する単語は、複数または単数もそれぞれ含む。さらに、「本明細書における（ｈｅｒｅｉｎ）」、「先に（ａｂｏｖｅ）」、および「以下に（ｂｅｌｏｗ）」という単語、ならびに類似の趣旨の単語は、本出願で使用される場合、全体としての本出願を指すものであり、本出願のいずれの特定の部分を指すものではない。
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基は以下のように省略される。アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
本発明の任意の態様の全ての実施形態は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、組み合わせて使用することができる。
第１の態様において、本開示は、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分を含む、非天然の条件付きで活性な受容体アゴニストを提供し、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は融合タンパク質に存在せず、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は、全体として、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、
（ａ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000007
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
（ｃ）Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000008
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｄ）Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000009
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉ）括弧内のアミノ酸残基は、存在するか、または存在しない場合があり、
（ｉｉ）第１のポリペプチド成分は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの少なくとも１つを含むが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々を含まず、
（ｉｉｉ）第２のポリペプチド成分は、第１のポリペプチド成分に存在しないＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々を含み、
第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は、個々に活性な受容体アゴニストではなく、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチドは相互作用して、ＩＬ－２受容体βγｃヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）、ＩＬ－４受容体αγｃヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）、ＩＬ－１３アルファ、またはＩＬ－４Ｒアルファ／ＩＬ１３Ｒアルファのヘテロ二量体の活性なアゴニストを形成する。
以下の実施例に示すように、２０１９年６月２９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３８７０３号に詳細に記載されているように、およびＳｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９に記載されているように、Ｘ１～Ｘ４の全てを含むポリペプチドは、以前に、（ａ）ＩＬ－２受容体βγｃヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）に結合するＩＬ－２およびインターロイキン１５（ＩＬ－１５）の模倣体であるが、ＩＬ－２ＲαもしくはＩＬ－１５Ｒαの結合部位を有しないこと、または（ｂ）ＩＬ－４受容体αγｃヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）もしくはＩＬ－１３受容体αサブユニット（ＩＬ－１３Ｒα）に結合するＩＬ－４の模倣体であること（天然のＩＬ－４および本明細書に記載のＩＬ－４模倣体は、ＩＬ－１３受容体と交差反応し、ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ１３Ｒαヘテロ二量体を形成する）が示された。全長ポリペプチドは、超安定であり、天然のサイトカインよりも親和性が高いヒトおよびマウスのＩＬ－２ＲβγＣまたはＩＬ－４ＲαγＣに結合し、ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－１５Ｒαとは無関係に、またはＩＬ－１３Ｒαとは無関係に、下流細胞シグナル伝達を誘発することが示された。全長ポリペプチドは、例えば、がんを治療するために使用することができる。
対照的に、本開示は、意外にも、個別には受容体アゴニストではない列挙する別個の第１および第２のポリペプチドを含む条件付きで活性な受容体アゴニストを実証したが、両ポリペプチドは、非共有結合的に相互作用して、ＩＬ－２受容体βγＣヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）、ＩＬ－４受容体αγＣヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）、ＩＬ－１３アルファ、またはＩＬ－４Ｒアルファ／ＩＬ１３Ｒアルファのヘテロ二量体の活性なアゴニストを形成することができる。「分割成分」（すなわち、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）間のこの非共有相互作用の親和性は、相互作用が、適切な受容体の存在下でのみ起こり、また両分割成分が共存する場合にのみ発生するようなものである。したがって、現開示の条件付きで活性な受容体アゴニストは、Ｘ１～Ｘ４の全てを含むポリペプチドを使用することができる任意の用途に使用することができる。さらに、条件付きで活性な受容体アゴニストにより、アゴニストの共存依存性再構成、ひいては受容体の条件付き活性化が可能になる。
本明細書で使用されるタンパク質模倣体という用語は、別のタンパク質の機能の特定態様を模倣するタンパク質を指す。２つのタンパク質は、通常、異なるアミノ酸配列および／または異なる構造を有する。本明細書では、とりわけ、ＩＬ－２およびＩＬ－１５の条件付きで活性な模倣体が提供される。これらの条件付きで活性な模倣体が模倣するＩＬ－２およびＩＬ－１５の機能の態様は、ＩＬ－２Ｒβγｃのヘテロ二量体化の誘導であり、ＳＴＡＴ５のリン酸化につながる。ＩＬ－２およびＩＬ－１５はどちらもＩＬ－２Ｒβγｃのヘテロ二量体化を介してシグナルを伝達するため、これらの条件付きで活性な模倣体は、ＩＬ－２およびＩＬ－１５の両生体機能を模倣する。これらの条件付きで活性な模倣体は、本明細書では、ＩＬ－２の模倣体、ＩＬ－１５の模倣体、またはＩＬ－２およびＩＬ－１５の両方の模倣体と呼ばれ得る。
ＩＬ－４の条件付きで活性な模倣体も提供される。これらの条件付きで活性な模倣体は、ＩＬ－４の特定機能を模倣することができる。これらの模倣体が模倣するＩＬ－４の機能は、ＩＬ－４Ｒαγｃのヘテロ二量体化（および／またはＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－１３Ｒαのヘテロ二量体化）の誘導である。
一実施形態において、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチドは相互作用し、ＩＬ－２受容体βγＣヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）のアゴニストを形成する。別の実施形態において、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチドは相互作用し、ＩＬ－４受容体αγＣヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）、ＩＬ－１３アルファ、またはＩＬ－４Ｒアルファ／ＩＬ１３Ｒアルファのヘテロ二量体のアゴニストを形成する。
天然ｈＩＬ－２は、長い不規則なループで連結された４つのらせんを含む。Ｎ末端らせん（Ｈ１）は、ベータサブユニットおよびガンマサブユニットの両方と相互作用し、第３のらせん（Ｈ３）は、ベータサブユニットと相互作用し、Ｃ末端らせん（Ｈ４）は、ガンマサブユニットと相互作用し、アルファサブユニットと相互作用する表面は、不規則な第２のらせん（Ｈ２）および２つの長いループによって形成され、一方はＨ１をＨ２に連結し、他方はＨ３とＨ４を連結する。理想的なタンパク質を設計および産生し、該タンパク質では、Ｈ１、Ｈ３およびＨ４は、理想的な構造ドメインで置き換えられ、限定されるものではないが、Ｈ１、Ｈ３およびＨ４に刺激されてＩＬ－２ＲβγｃまたはＩＬ－４Ｒαγｃの界面を呈するらせんおよびベータ鎖（それぞれ、ドメインＸ１、Ｘ３およびＸ４と称する）を含み、Ｈ２は、より良好な充填を供する理想的ならせん（ドメインＸ２と称する）と置き換えられる。実施例に示されているように、広範な変異研究が行われており、各ペプチドドメインのアミノ酸配列が、ＩＬ－２またはＩＬ－４受容体への結合を失うことなく広範囲にそれぞれ修飾できること、およびドメインが、ＩＬ－２またはＩＬ－４受容体への条件付き結合を維持しながら、任意の順序で配置できることを実証している。ポリペプチドは、Ｌアミノ酸およびグリシン、Ｄ－アミノ酸およびグリシン、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。本明細書に記載されるように、理想的なタンパク質は、単独では関連する受容体とほとんど結合しない２つのポリペプチドに分割することができるが、混在すると受容体活性を再構成することができる。タンパク質は、通常、タンパク質の機能に干渉しない部位で分割される（例えば、リンカーを用いる実施形態のリンカーセクション）。加えて、非分割タンパク質のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインを任意の順序で共にループ状にできるように、分割タンパク質はドメインの任意の組み合わせを含むことができる。
したがって、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、第１および第２のポリペプチドにおいて任意の順序であり、非限定的な実施形態において、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、
（ｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ２を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を含み、
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を含み、
（ｉｖ）第１のポリペプチドは、Ｘ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含み、
（ｖ）第１のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ２を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ３およびＸ４を含み、
（ｖｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ２およびＸ４を含み、
（ｖｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ２およびＸ３を含み、
（ｖｉｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ２およびＸ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ４を含み、
（ｉｘ）第１のポリペプチドは、Ｘ２およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ３を含み、
（ｘ）第１のポリペプチドは、Ｘ３およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１およびＸ２を含み、
（ｘｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ４を含み、
（ｘｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ３を含み、
（ｘｉｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ２を含み、または
（ｘｉｖ）第１のポリペプチドは、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、第２のポリペプチドは、Ｘ１を含む。
第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の２つ以上のドメインを含む場合、ドメインは、一部の実施形態において、任意の好適な長さまたはアミノ酸組成のアミノ酸リンカーによって分離され得る。リンカーの必要性はなく、一実施形態において、いずれのドメイン間にもリンカーは存在しない。他の実施形態において、アミノ酸リンカーは、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドにおけるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のドメイン間の０、１、または２つの接合部間に存在し得る。アミノ酸リンカーは、用途に適切であると考えられる任意の長さであり得る。いくつかの態様において、リンカーは、Ｎ末端またはＣ末端にあり、２つのドメインを連結しないにもかかわらず、リンカーと称される。いくつかの態様において、リンカーは、２つのドメインを連結する非分割タンパク質に存在したため、リンカーと称される。
これらの実施形態の全てにおいて、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４は、任意の好適な長さであり、これは、各ドメインが、配列番号４、５、および６のペプチド以外の任意の好適な数の追加アミノ酸をそれぞれ含み得ることを意味する。括弧内の残基は任意であるため、存在する場合と存在しない場合がある。当業者によって理解されるように、これは、例えば、
Figure 2022511390000010
 のＮ末端の６アミノ酸およびＣ末端の５アミノ酸残基が任意であることを意味する。当業者によってさらに理解されるように、（ｉ）１つのＮ末端アミノ酸が存在しない場合、それは最もＮ末端のアミノ酸（すなわち、配列番号４ではＮ末端のＰ残基）であり、（ｉｉ）２つのＮ末端アミノ酸が存在しない場合、それは２つの最もＮ末端のアミノ酸（すなわち、配列番号４ではＮ末端のＰＫジペプチド）であり、（ｉｉｉ）１つのＣ末端アミノ酸残基が存在しない場合、それは最もＣ末端のアミノ酸（すなわち、配列番号４ではＣ末端のＩ残基）であり、（ｉｖ）２つのＣ末端アミノ酸残基が存在しない場合、それは２つの最もＣ末端のアミノ酸（すなわち、配列番号４ではＣ末端のＮＩジペプチド）であるなど。したがって、先に例示したように、１つ以上の任意のアミノ酸残基が存在しない場合があること、任意の残基に存在しないアミノ酸が関連するペプチド末端から隣接していることは、当業者に明らかであろう。
一実施形態において、Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000011
の全長と同一性を有するペプチドを含み、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000012
 の全長と同一性を有するペプチドを含み、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000013
 の全長に対して同一性を有するペプチドを含み、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％である。
様々な実施形態において、Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000014
 の全長と同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000015
 の全長と同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000016
 の全長と同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％である。
特定の実施形態において、
（ｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000017
 の全長と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000018
 の全長と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000019
 の全長と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000020
 の全長と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000021
 の全長と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000022
 の全長と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000023
 の全長と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000024
 の全長と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000025
 の全長と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｖ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000026
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000027
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000028
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｖ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000029
 の全長と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000030
 の全長と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000031
 の全長と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、または
（ｖｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000032
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000033
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000034
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。
これらの実施形態において、同じ一次アミノ酸配列を有するが、括弧で示されるように任意の残基の位置が異なる、配列番号４、５、および６の異なるバージョンが示されている。
さらなる実施形態において、
Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000035
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000036
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、かつ／または
Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000037
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。
配列番号４、配列番号５、および配列番号６の任意の残基が存在する別の実施形態において、
（ａ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000038
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｃ）Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000039
の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｄ）Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000040
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。
配列番号４、配列番号５、および配列番号６の選択された任意の残基が存在する別の実施形態において、
（ａ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000041
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｃ）Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000042
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000043
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。
配列番号４、配列番号５、および配列番号６の任意の残基が存在する様々な実施形態において、Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000044
 の全長と同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000045
 の全長と同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000046
 の全長と同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％である。
特定の実施形態において、
（ｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000047
 の全長と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000048
 の全長と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000049
 の全長と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000050
 の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000051
 の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000052
 の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000053
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000054
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000055
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｖ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000056
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000057
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000058
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｖ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000059
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000060
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000061
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｖｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000062
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000063
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000064
の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｖｉｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000065
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000066
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000067
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｖｉｉｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000068
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000069
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000070
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｘ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000071
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000072
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000073
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｘ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000074
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000075
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000076
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、または
（ｘｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000077
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000078
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000079
 の全長と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。
一実施形態において、条件付きで活性な受容体アゴニストは、条件付きで活性な受容体アゴニストであるＩＬ－２／１５模倣体であり、
（ｉ）Ｘ１は、残基７のＬ、残基８のＨ、残基１１のＨ、残基１４のＹ、残基１８のＭのうちの１、２、３、４、もしくは５つ全てを含み、付番は、任意の残基が存在することに基づいて、配列番号４に対してなされ、かつ／または
（ｉｉ）Ｘ３は、残基３のＤ、残基４のＹ、残基６のＦ、残基７のＮ、残基１０のＬ、残基１１のＩ、残基１３のＥ、もしくは残基１４のＥのうちの１、２、３、４、５、６、７もしくは８つ全てを含み、付番は、任意の残基が存在することに基づいて、配列番号５に対してなされる。さらなる実施形態において、（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基１９のＩを含み、付番は、任意の残基が存在することに基づいて、配列番号６に対してなされる。
配列番号４、５、および６では、いくつかのアミノ酸残基が太字でマークされている。
Figure 2022511390000080
 では、アミノ酸残基のＥ１０、Ｌ１３、Ｙ１４、Ｄ１５、およびＬ１７（存在する任意の残基に基づいて番号が付けられている）は太字でマークされ、
Figure 2022511390000081
 では、アミノ酸残基のＬ１、Ｙ４、Ｎ７、Ｌ１０、Ｉ１１、およびＩ１５（存在する任意の残基に基づいて番号が付けられている）は太字でマークされ、
Figure 2022511390000082
 では、アミノ酸残基のＩ１２、Ｑ１６、およびＷ１８（存在する任意の残基に基づいて番号が付けられている）は、太字でマークされている。
一実施形態において、
（ａ）配列番号４のアミノ酸（ＡＡ）配列に対するＸ１のアミノ酸置換は、太字でマークされた３つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた２つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた１つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされたアミノ酸残基で発生せず、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列に対するＸ３のアミノ酸置換は、太字でマークされた３つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた２つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた１つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされたアミノ酸残基で発生せず、かつ／または
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列に対するＸ４のアミノ酸置換は、太字でマークされた２つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた１つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされたアミノ酸残基で発生しない。
別の実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列に対するＸ２のアミノ酸置換は、太字でマークされたアミノ酸残基では発生しない。
条件付きで活性な受容体アゴニストであるＩＬ－２模倣体の別の実施形態において、参照ペプチドドメイン（すなわち、配列番号４、５、または６）に対するアミノ酸置換は、太字でマークされたアミノ酸残基では発生しない。以下に示すように、配列番号４、５、および６は、受容体への結合に関与する太字の残基をそれぞれ含む。
Figure 2022511390000083
 アミノ酸残基のＥ１０、Ｌ１３、Ｙ１４、Ｄ１５、およびＬ１７（存在する任意の残基に基づいて番号が付けられている）は、この実施形態では不変であり、
Figure 2022511390000084
 アミノ酸残基のＬ１、Ｙ４、Ｎ７、Ｌ１０、Ｉ１１、およびＩ１５（存在する任意の残基に基づいて番号が付けられている）は、この実施形態では不変であり、
Figure 2022511390000085
 アミノ酸残基のＩ１２、Ｑ１６、およびＷ１８（存在する任意の残基に基づいて番号が付けられている）は、この実施形態では不変である。
さらなる実施形態において、Ｘ２が、ペプチド
Figure 2022511390000086
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである場合、アミノ酸残基のＷ１３は不変であり、括弧内の残基は任意である。一実施形態において、任意の残基が存在し、別の実施形態において、任意の残基は存在しない。
条件付きで活性な受容体アゴニストであるＩＬ－２模倣体の別の実施形態において、参照ペプチドドメイン（すなわち、配列番号４、５、または６）に対するアミノ酸置換は、太字でマークされた４、３、または２以上のアミノ酸残基では発生しない。
別の実施形態において、条件付きで活性な受容体アゴニストは、条件付きで活性な受容体アゴニストであるＩＬ－４／ＩＬ－１３模倣体であり、
Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000087
 と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000088
 と、その長さに沿って、少なくとも３７％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000089
 と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉ）Ｘ１は、残基７のＩ、残基８のＴまたはＭ、残基１１のＥ、残基１４のＫ、および残基１８のＳを含み、
（ｉｉ）Ｘ３は、残基３のＲ、残基４のＦ、残基６のＫ、残基７のＲ、残基１０のＲ、残基１１のＮ、残基１３のＷ、および残基１４のＧを含む。
さらなる実施形態において、（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基１９のＦを含む。
様々な実施形態において、Ｘ１は、
Figure 2022511390000090
 の全長と同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、
Figure 2022511390000091
 の全長と同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、
Figure 2022511390000092
 の全長と同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％である。特定の実施形態において、
（ｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000093
 と、その長さに沿って、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000094
 と、その長さに沿って、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000095
 と、その長さに沿って、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000096
 と、その長さに沿って、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000097
 と、その長さに沿って、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000098
 と、その長さに沿って、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉｉ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000099
 と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000100
 と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000101
 と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、または
（ｉｖ）Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000102
 と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000103
 と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000104
 と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
いずれの場合も、
（Ａ）Ｘ１は、残基７のＩ、残基８のＴまたはＭ、残基１１のＥ、残基１４のＫ、および残基１８のＳを含み、（Ｂ）Ｘ３は、残基３のＲ、残基４のＦ、残基６のＫ、残基７のＲ、残基１０のＲ、残基１１のＮ、残基１３のＷ、および残基１４のＧを含む。
条件付きで活性な受容体アゴニストであるＩＬ－４／ＩＬ－１３模倣体の別の実施形態において、参照ペプチドドメイン（すなわち、配列番号８、９、または１０）に対するアミノ酸置換は、太字でマークされたアミノ酸残基では発生しない。以下に示すように、配列番号８、９、および１０は、太字の残基をそれぞれ含む。
Figure 2022511390000105
 アミノ酸残基のＥ１０、Ｅ１１、Ａ１２、Ｌ１３、Ｋ１４、Ｄ１５、Ａ１６およびＬ１７は、この実施形態では不変である
Figure 2022511390000106
 アミノ酸残基のＦ４、Ａ５、Ｋ６、Ｒ７、Ｆ８、Ｅ９、Ｒ１０、およびＮ１１は、この実施形態では不変である
Figure 2022511390000107
 アミノ酸残基のＩ１１、Ｉ１２、Ｔ１３、Ｉ１４、Ｌ１５、Ｑ１６、Ｓ１７、Ｗ１８、Ｆ１９、およびＦ２０は、この実施形態では不変である
さらなる実施形態において、Ｘ２が、ペプチド
Figure 2022511390000108
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである場合、アミノ酸残基のＷ１３は不変である。
別の実施形態において、参照ペプチドドメインに対するアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは、所与のアミノ酸を、同様の生理化学的特性を有する残基で置き換えることができることを意味し、例えば、１つの脂肪族残基を別の残基に置換すること（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａなどを互いに）、または１つの極性残基を別の残基に置換すること（ＬｙｓとＡｒｇ間、ＧｌｕとＡｓｐ間、またはＧｌｎとＡｓｎ間など）である。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する領域全体の置換が知られている。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書に記載されるアッセイのいずれか１つで試験して、所望の活性、例えば、天然または参照ポリペプチドの抗原結合活性および特異性が保持されていることを確認することができる。アミノ酸は、側鎖の特性の類似性に従って、グループ化することができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））。（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然の残基は、共通の側鎖特性に基づいたグループに分類することができる。（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換では、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換する必要がある。特定の保存的置換には、例えば、ＡｌａをＧｌｙもしくはＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎもしくはＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａもしくはＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎもしくはＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕもしくはＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅもしくはＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇ、Ｇｌｎ、もしくはＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕ、Ｔｙｒ、もしくはＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔ、Ｌｅｕ、もしくはＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、および／またはＰｈｅをＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｅｕに、が含まれる。
一実施形態において、配列番号４に対するＸ１のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択される。
Figure 2022511390000109
一実施形態において、条件付きで活性な受容体アゴニストは条件付きで活性なＩＬ－４模倣体であり、７番目はＩ、８番目はＭまたはＴ、１１番目はＥ、１４番目はＫ、および１８番目はＳである。
別の実施形態において、条件付きで活性な受容体アゴニストは、条件付きで活性なＩＬ－２模倣体であり、７番目がＩである、８番目がＭまたはＴである、１１番目がＥである、１４番目がＫである、および１８番目がＳである、のうちの１、２、３、４、または５つが該当しない。
別の実施形態において、配列番号５に対するＸ３のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択される。
Figure 2022511390000110
別の実施形態において、条件付きで活性な受容体アゴニストは、条件付きで活性なＩＬ－４／ＩＬ－１３模倣体であり、３番目はＲであり、４番目はＦであり、６番目はＫであり、７番目はＲであり、１０番目はＲであり、１１番目はＮであり、１３番目はＷであり、１４番目はＧである。
別の実施形態において、条件付きで活性な受容体アゴニストは、条件付きで活性なＩＬ－２模倣体であり、３番目がＲである、４番目がＦである、６番目がＫである、７番目がＲである、１０番目がＲである、１１番目がＮである、１３番目がＷである、および１４番目がＧである、のうちの１、２、３、４、５、６、７または８つ全てが該当しない。
このような実施形態のいずれにおいても、条件付きで活性な受容体アゴニストでは、配列番号５に対して１７番目にＨ、Ｋ、Ｌ、ＮおよびＲのアミノ酸残基に加えてシステイン、または配列番号５に対して２０番目にＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｓ、およびＹのアミノ酸残基に加えてシステインがさらに認められる。したがって、この実施形態において、配列番号５に対するＸ３のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択することができる。
Figure 2022511390000111
別の実施形態において、配列番号６に対するＸ４のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択される。
Figure 2022511390000112
別の実施形態において、条件付きで活性な受容体アゴニストは、条件付きで活性なＩＬ－４／ＩＬ－１３模倣体であり、１９番目はＩである。別の実施形態において、条件付きで活性な受容体アゴニストは、条件付きで活性なＩＬ－２模倣体であり、１９番目はＩではない。
このような実施形態のいずれかにおいて、条件付きで活性な受容体アゴニストでは、配列番号６に対して３番目にＥ、Ｇ、ＨおよびＫのアミノ酸残基に加えてシステインがさらに認められる。したがって、この実施形態において、配列番号６に対するＸ４のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択することができる。
Figure 2022511390000113
本明細書に記載されるように、ドメインＸ２は構造ドメインであり、したがって、関連する他のドメインと連結し（すなわち、同じポリペプチド内で、または第１および第２のポリペプチドの非共有相互作用時に）、それらを折り畳むことを可能にする任意のアミノ酸配列が使用され得る。必要な長さは、使用される第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの仕様に依存し、８アミノ酸以上であり得る。１つの例示的かつ非限定的な実施形態において、Ｘ２は、
Figure 2022511390000114
 と、その長さに沿って、少なくとも２０％、２７％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。一実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列に対するアミノ酸変化は、保存的アミノ酸置換である。別の実施形態において、Ｗ１３アミノ酸残基は不変である。さらなる実施形態において、配列番号７に対するＸ２のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択される。
Figure 2022511390000115
別の実施形態において、ポリペプチドは、ＩＬ－４／ＩＬ－１３模倣体であり、１１番目はＩである。別の実施形態において、ポリペプチドは、ＩＬ－２模倣体であり、１１番目はＩではない。
このような実施形態のいずれにおいても、ポリペプチドではさらに、配列番号７に対して５または１６番目にシステインが認められる。
あるいは、このような実施形態のいずれにおいても、ポリペプチドではさらに、配列番号７に対して１、２、５、９または１６番目にシステインが認められる。
したがって、配列番号７に対するＸ２のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択することができる。
Figure 2022511390000116
様々な特定の実施形態において、
（ｉ）Ｘ２は、
Figure 2022511390000117
 と、その長さに沿って、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉ）Ｘ２は、
Figure 2022511390000118
 と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉｉ）Ｘ２は、
Figure 2022511390000119
 と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｖ）Ｘ２は、ペプチド
Figure 2022511390000120
 の全長と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000121
 の全長と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000122
 の全長と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000123
 の全長と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｖ）Ｘ２は、ペプチド
Figure 2022511390000124
 の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000125
 の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000126
 の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000127
 の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｖｉ）Ｘ２は、ペプチド
Figure 2022511390000128
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000129
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000130
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000131
 の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｖｉｉ）Ｘ２は、ペプチド
Figure 2022511390000132
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000133
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000134
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000135
 の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｖｉｉｉ）Ｘ２は、ペプチド
Figure 2022511390000136
 の全長と少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ１は、ペプチド
Figure 2022511390000137
 の全長と少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド
Figure 2022511390000138
 の全長と少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド
Figure 2022511390000139
 の全長と少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。
上記の（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の例示的な実施形態において、配列番号７に記載された任意のアミノ酸残基が存在する。上記の（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の例示的な実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４のペプチドは、配列番号４、５、および６に示されている。上記の（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の例示的な実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４のペプチドは、配列番号３２０、３２１、および３２２に示されている。
様々な実施形態において、
（ｉ）第１のポリペプチド成分は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの１つを含み、第２のポリペプチド成分は、第１のポリペプチド成分に存在しないＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの３つを含み、または
（ｉｉ）第１のポリペプチド成分は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの２つを含み、第２のポリペプチド成分は、第１のポリペプチド成分に存在しないＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの２つを含む。
さらなる実施形態において、
（ａ）第１のポリペプチドは、Ｘ１を含み、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を除外し、第２のポリペプチドは、Ｘ３－Ｚ１－Ｘ２－Ｚ２－Ｘ４を含み、Ｘ１を除外する融合タンパク質であり、
（ｂ）第１のポリペプチドは、Ｘ４を含み、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を除外し、第２のポリペプチドは、Ｘ１－Ｚ１－Ｘ３－Ｚ２－Ｘ２を含み、Ｘ４を除外する融合タンパク質であり、
（ｃ）第１のポリペプチドは、Ｘ１－Ｚ１－Ｘ３を含み、Ｘ２およびＸ４を除外する融合タンパク質であり、第２のポリペプチドは、Ｘ２－Ｚ１－Ｘ４を含み、Ｘ１およびＸ３を除外する融合タンパク質であり、
Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立して、任意のアミノ酸リンカーである。Ｚ１および／またはＺ２は、用途に適切であると考えられるように、第１および／または第２のポリペプチド内のドメインを分離するための任意の数のアミノ酸残基を含み得る。１および／またはＺ２リンカーは、任意の好適な長さおよびアミノ酸組成のものであり得る。一実施形態において、Ｚ１およびＺ２は両方とも存在せず、別の実施形態において、１および２の両方が存在し、さらなる実施形態において、Ｚ１およびＺ２の一方が存在し、他方は存在しない。
他の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と（配列番号４～７）、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のペプチドを含み、括弧内の残基は、存在するか、または存在しない場合がある。
Figure 2022511390000140
他の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と（配列番号４～７）、それぞれ少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、括弧内の残基は、存在するか、または存在しない場合がある。
Figure 2022511390000141
他の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と（配列番号４～７）、それぞれ少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、括弧内の残基は、存在するか、または存在しない場合がある。
Figure 2022511390000142
他の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％、それぞれ同一であり、括弧内の残基は、存在するか、または存在しない場合がある。
Figure 2022511390000143
他の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と、それぞれ少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、括弧内の残基は、存在するか、または存在しない場合がある。
Figure 2022511390000144
他の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と、それぞれ少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、括弧内の残基は、存在するか、または存在しない場合がある。
Figure 2022511390000145
一実施形態において、任意のアミノ酸の１つ以上または全てが存在し、別の実施形態において、任意のアミノ酸の１つ以上または全てが存在しない。他の実施形態において、
（ｉ）Ｘ１は、配列番号４または配列番号３２０のアミノ酸配列の全長と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ２は、配列番号７のアミノ酸配列の全長と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、配列番号５または配列番号３２１のアミノ酸配列の全長と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、配列番号６または配列番号３２２のアミノ酸配列の全長と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉ）Ｘ１は、配列番号４または配列番号３２０のアミノ酸配列の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ２は、配列番号７のアミノ酸配列の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、配列番号５または配列番号３２１のアミノ酸配列の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、配列番号６または配列番号３２２のアミノ酸配列の全長と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｉｉ）Ｘ１は、配列番号４または配列番号３２０のアミノ酸配列の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ２は、配列番号７のアミノ酸配列の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、配列番号５または配列番号３２１のアミノ酸配列の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、配列番号６または配列番号３２２のアミノ酸配列の全長と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉｖ）Ｘ１は、配列番号４または配列番号３２０のアミノ酸配列の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ２は、配列番号７のアミノ酸配列の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、配列番号５または配列番号３２１のアミノ酸配列の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、配列番号６または配列番号３２２のアミノ酸配列の全長と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、または
（ｖｉ）Ｘ１は、配列番号４または配列番号３２０のアミノ酸配列の全長に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ２は、配列番号７のアミノ酸配列の全長に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、配列番号５または配列番号３２１のアミノ酸配列の全長に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、配列番号６または配列番号３２２のアミノ酸配列の全長に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。
上記の（ｉ）から（ｖｉ）の例示的な実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４のペプチドは、配列番号４、５、および６に示されている。上記の（ｉ）から（ｖｉ）の例示的な実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４のペプチドは、配列番号３２０、３２１、および３２２に示されている。
別の実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、以下に示される第１および第２のポリペプチドの１対と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である（下線付き残基または「Ｘ」残基は任意であり、存在する場合、任意のドメインの各残基は、任意のアミノ酸を含み得る）。
（ｉ）
第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ２Ａ）
Figure 2022511390000146
 および
第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ２Ｂ）
Figure 2022511390000147
 （ｉｉ）
第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３－Ｘ２’
Figure 2022511390000148
 および
第２のポリペプチドＸ４
Figure 2022511390000149
 （ｉｉｉ）
第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３
Figure 2022511390000150
 および
第２のポリペプチドＸ２－Ｘ４
Figure 2022511390000151
 （ｉｖ）
第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ４Ａ）
Figure 2022511390000152
 第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ４Ｂ）
Figure 2022511390000153
 （ｖ）
第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ２Ａ）
Figure 2022511390000154
 および
第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ２Ｂ）
Figure 2022511390000155
 （ｖｉ）
第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３－Ｘ２’
Figure 2022511390000156
 および
第２のポリペプチドＸ４
Figure 2022511390000157
 （ｖｉｉ）
第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３
Figure 2022511390000158
 および
第２のポリペプチドＸ２－Ｘ４
Figure 2022511390000159
 （ｖｉｉｉ）
第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ４Ａ）
Figure 2022511390000160
 第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ４Ｂ）
Figure 2022511390000161
 （ｉｘ）
第１のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｈ１－Ｈ３’
Figure 2022511390000162
 第２のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｈ２－Ｈ４
Figure 2022511390000163
 （ｘ）
第１のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｈ１－Ｈ３’
Figure 2022511390000164
 第２のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｈ２－Ｈ４
Figure 2022511390000165
 （ｘｉ）
第１のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｈ１－Ｈ３’－Ｈ２＿
Figure 2022511390000166
 第２のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｈ４
Figure 2022511390000167
 （ｘｉｉ）
第１のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｈ１－Ｈ３’－Ｈ２＿
Figure 2022511390000168
 第２のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｈ４
Figure 2022511390000169
 （ｘｉｉｉ）
第１のポリペプチド（Ｘ１）
Figure 2022511390000170
 第２のポリペプチド（Ｘ３－Ｘ２’－Ｘ４）
Figure 2022511390000171
例示的な実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、上記の実施形態（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に示される第１および第２のポリペプチドの１対と、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである（下線付き残基または「Ｘ」残基は任意であり、存在する場合、任意のドメインの各残基は、任意のアミノ酸を含み得る）。
例示的な実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、上記の実施形態（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に示される第１および第２のポリペプチドの１対と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである（下線付き残基または「Ｘ」残基は任意であり、存在する場合、任意のドメインの各残基は、任意のアミノ酸を含み得る）。
例示的な実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、上記の実施形態（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に示される第１および第２のポリペプチドの１対と、１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである（下線付き残基または「Ｘ」残基は任意であり、存在する場合、任意のドメインの各残基は、任意のアミノ酸を含み得る）。
さらなる種々の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ、配列番号１１～９４、１９０～２１６、２４７、および配列番号２７５～３００のアミノ酸配列内に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメイン（表１に定義される（ただし、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインとして記載される）と、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のペプチドを含む。
表１は、多くのバリアントについて、２つの配列番号を提供する。第１の配列番号は、リンカーの位置を任意なものおよび可変的なものとして記載し（表では下線を付けて示す）、第２の配列番号は、必要に応じて、リンカーの位置を含む。表１は、配列番号１１～９４、１９０～２１６、２４７、および配列番号２７５～３００（第２列を参照）のポリペプチドのドメイン配置を示す一方、配列は、ドメインを分離する下線付きのアミノ酸リンカーを示す。例えば、ドメイン配置Ｈ１－＞Ｈ４－＞Ｈ２’－＞Ｈ３（Ｘ１－Ｘ４－Ｘ２－Ｘ３配置に対応する）を有する配列番号１１を参照されたい。
Figure 2022511390000172
この配置に基づいて、当業者には明らかであるように、配列番号１１において、Ｘ１ドメインは、ＳＴＫＫＷＱＬＱＡＥＨＡＬＬＤＷＱＭＡＬＮＫ（配列番号２７１）であり、Ｘ４ドメインは、ＥＮＬＮＲＡＩＴＡＡＱＳＷＩＳ（配列番号２７２）であり、Ｘ２ドメインは、ＬＤＫＡＥＤＩＲＲＮＳＤＱＡＲＲＥＡＥＫ（配列番号２７３）であり、Ｘ３ドメインはＲＤＬＩＳＮＡＱＶＩＬＬＥＡＲ（配列番号２７４）である。同様に、各Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの配列番号１１～９４、１９０～２１６、２４７、および配列番号２７５～３００のアミノ酸配列は、本明細書の教示に基づいて、当業者には明らかであろう。当業者によって理解されるように、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、および／またはＸ４アミノ酸は、配列番号１１－９４、１９０－２１６、２４７、および配列番号２７５～３００に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインに対して、Ｎ末端および／またはＣ末端で付加（１、２、３、４、または５以上）アミノ酸を含み得る。
Figure 2022511390000173
Figure 2022511390000174
Figure 2022511390000175
Figure 2022511390000176
Figure 2022511390000177
Figure 2022511390000178
Figure 2022511390000179
Figure 2022511390000180
Figure 2022511390000181
特定の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ、配列番号９０の１型または２型のアミノ酸配列内に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメイン（表１に定義される（ただし、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインとして記載される）と、それぞれ２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一であり、該型は同じ一次アミノ酸配列を有するが、任意／可変リンカー残基がわずかに異なる。様々な実施形態において、この実施形態は、配列番号９０の１型または２型に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、および／またはＸ４ドメインのバリアントを含み、これらは配列番号２７５～３００に示される配列番号９０の一次アミノ酸配列に対する変異を組み込む。
本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせの一実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、アルファらせん形ドメインである。別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々のアミノ酸の長さは、独立して、少なくとも約８、１０、１２、１４、１６、または１９以上のアミノ酸の長さである。他の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々のアミノ酸の長さは、独立して、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、または５０以下のアミノ酸の長さである。さらなる種々の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々のアミノ酸の長さは、独立して、長さ約８～１０００、８～５００、８～４００、８～３００、８～２００、８～１００、８～５０、１０～１０００、１０～５００、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～５０、１２～１０００、１２～５００、１２～４００、１２～３００、１２～２００、１２～１００、１２～５０、１４～１０００、１４～５００、１４～４００、１４～３００、１４～２００、１４～１００、１４～５０、１６～１０００、１６～５００、１６～４００、１６～３００、１６～２００、１６～１００、１６～５０、１９～１０００、１９～５００、１９～４００、１９～３００、１９～２００、１９～１００、または約１９～５０アミノ酸の長さである。
一実施形態において、第１のポリペプチド成分および／または第２のポリペプチド成分は、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。
別の実施形態において、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は、非共有結合である。本明細書で述べたように、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は、個々に活性な受容体アゴニストではなく、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチドは相互作用して、ＩＬ－２受容体βγｃヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）、ＩＬ－４受容体αγｃヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）、ＩＬ－１３アルファ、またはＩＬ－４Ｒアルファ／ＩＬ１３Ｒアルファヘテロ二量体の活性なアゴニストを形成する。したがって、この実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、相互作用して活性なアゴニストを形成し得る。この相互作用は、非共有相互作用などの任意の好適な相互作用であり得る。相互作用は、第１および第２のポリペプチドの直接非共有結合、または間接相互作用を含み得る。一実施形態において、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分は、ＩＬ－２受容体βγＣヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）、ＩＬ－４受容体αγＣヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）、ＩＬ－１３アルファ、またはＩＬ－４Ｒアルファ／ＩＬ１３Ｒアルファヘテロ二量体などの受容体を介して互いに間接的に結合する。
受容体への結合を決定する方法は当技術分野で知られており、本明細書に記載され、例えば、バイオレイヤー干渉結合アッセイである。一部の実施形態において、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチドが対象とする受容体で相互作用する場合、それらは共存して、１０００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性でその受容体に結合する。例えば、本発明の分割ＩＬ－２模倣体は、共存して、１０００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性でＩＬ－２受容体βγｃヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）に結合する。同様に、一例として、本発明の分割ＩＬ－４模倣体は、共存して、１０００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性でＩＬ－４受容体αγｃヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）に結合する。いくつかの態様において、分割模倣体が共存して結合する受容体の受容体活性化作用は、ＳＴＡＴ５リン酸化によって測定される。
別の態様において、本開示は、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうち、１、２、または３つを含むが、４つ全てを含まないポリペプチドを提供し、
（ａ）Ｘ１は、存在する場合、ペプチド
Figure 2022511390000182
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、存在する場合、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
（ｃ）Ｘ３は、存在する場合、ペプチド
Figure 2022511390000183
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｄ）Ｘ４は、存在する場合、ペプチド
Figure 2022511390000184
 の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
括弧内のアミノ酸残基は、存在するか、または存在しない場合がある。
この態様のポリペプチドは、例えば、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせの条件付きで活性な受容体アゴニストを生成するために使用することができる（すなわち、この態様のポリペプチドは、本開示の条件付きで活性な受容体アゴニストの第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかである）。したがって、当業者には明らかであるように、上記に開示される第１および第２のポリペプチドの全ての実施形態および実施形態の組み合わせ、上記のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全ての実施形態および実施形態の組み合わせは、本開示のこの態様のポリペプチドに等しく適用可能である。一実施形態において、
（ａ）配列番号４のアミノ酸（ＡＡ）配列に対するＸ１のアミノ酸置換は、太字でマークされた３つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた２つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた１つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされたアミノ酸残基で発生せず、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列に対するＸ３のアミノ酸置換は、太字でマークされた３つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた２つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた１つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされたアミノ酸残基で発生せず、かつ／または
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列に対するＸ４のアミノ酸置換は、太字でマークされた２つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた１つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされたアミノ酸残基で発生しない。
別の実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列に対するＸ２のアミノ酸置換は、太字でマークされたアミノ酸残基では発生しない。
様々な実施形態において、ポリペプチドは、以下からなる群から選択され得る。
（ｉ）Ｘ１を含み、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｉｉ）Ｘ２を含み、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｉｉｉ）Ｘ３を含み、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｉｖ）Ｘ４を含み、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を除外するポリペプチド、
（ｖ）Ｘ１およびＸ２を含み、Ｘ３およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｖｉ）Ｘ１およびＸ３を含み、Ｘ２およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｖｉｉ）Ｘ１およびＸ４を含み、Ｘ２およびＸ３を除外するポリペプチド、
（ｖｉｉｉ）Ｘ２およびＸ３を含み、Ｘ１およびＸ４を除外するポリペプチド、
（ｉｘ）Ｘ２およびＸ４を含み、Ｘ１およびＸ３を除外するポリペプチド、
（ｘ）Ｘ３およびＸ４を含み、Ｘ１およびＸ２を除外するポリペプチド、
（ｘｉ）Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含み、Ｘ４を除外するポリペプチド、
（ｘｉｉ）Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を含み、Ｘ３を除外するポリペプチド、
（ｘｉｉｉ）Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を含み、Ｘ２を除外するポリペプチド、ならびに
（ｘｉｖ）Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、Ｘ１を除外するポリペプチド。
一実施形態において、ポリペプチドは、以下に記載される第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドと、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む（下線付き残基は任意であり、存在する場合、各任意の残基は、任意のアミノ酸を含み得る）。
（ｉ）
第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ２Ａ）
Figure 2022511390000185
 および
第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ２Ｂ）
Figure 2022511390000186
 （ｉｉ）
第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３－Ｘ２’
Figure 2022511390000187
 および
第２のポリペプチドＸ４
Figure 2022511390000188
 （ｉｉｉ）
第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３
Figure 2022511390000189
 および
第２のポリペプチドＸ２－Ｘ４
Figure 2022511390000190
 （ｉｖ）
第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ４Ａ）
Figure 2022511390000191
 第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ４Ｂ）
Figure 2022511390000192
 （ｖ）
第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ２Ａ）
Figure 2022511390000193
 および
第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ２Ｂ）
Figure 2022511390000194
 （ｖｉ）
第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３－Ｘ２’
Figure 2022511390000195
 および
第２のポリペプチドＸ４
Figure 2022511390000196
 （ｖｉｉ）
第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３
Figure 2022511390000197
 および
第２のポリペプチドＸ２－Ｘ４
Figure 2022511390000198
 （ｖｉｉｉ）
第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ４Ａ）
Figure 2022511390000199
 第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ４Ｂ）
Figure 2022511390000200
 （ｉｘ）
第１のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｈ１－Ｈ３’
Figure 2022511390000201
 第２のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｈ２－Ｈ４
Figure 2022511390000202
 （ｘ）
第１のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｈ１－Ｈ３’
Figure 2022511390000203
 第２のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｈ２－Ｈ４
Figure 2022511390000204
 （ｘｉ）
第１のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｈ１－Ｈ３’－Ｈ２＿
Figure 2022511390000205
 第２のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｈ４
Figure 2022511390000206
 （ｘｉｉ）
第１のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｈ１－Ｈ３’－Ｈ２＿
Figure 2022511390000207
 第２のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｈ４
Figure 2022511390000208
 （ｘｉｉｉ）
第１のポリペプチド（Ｘ１）
Figure 2022511390000209
 第２のポリペプチド（Ｘ３－Ｘ２’－Ｘ４）
Figure 2022511390000210
例示的な実施形態において、ポリペプチドは、上記の実施形態（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に示される第１または第２のポリペプチドと、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む（下線付き残基または「Ｘ」残基は任意であり、存在する場合、任意のドメインの各残基は、任意のアミノ酸を含み得る）。
例示的な実施形態において、ポリペプチドは、上記の実施形態（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に示される第１または第２のポリペプチドと、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む（下線付き残基または「Ｘ」残基は任意であり、存在する場合、任意のドメインの各残基は、任意のアミノ酸を含み得る）。
例示的な実施形態において、ポリペプチドは、上記の実施形態（ｉ）～（ｖｉｉｉ）に示される第１または第２のポリペプチドと、少なくとも１００％同一のアミノ酸配列を含む（下線付き残基または「Ｘ」残基は任意であり、存在する場合、任意のドメインの各残基は、任意のアミノ酸を含み得る）。
別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、存在する場合、配列番号１１～９４、１９０～２１６、２４７、および配列番号２７５～３００からなる群から選択されるアミノ酸配列内に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメイン（表１に定義される）と、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、存在する場合、配列番号９０の１型または２型のアミノ酸配列内に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメイン（表１に定義される（ただし、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインとして記載される）と、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、該型は同じ一次アミノ酸配列を有するが、任意／可変リンカー残基がわずかに異なる。様々な実施形態において、この実施形態は、配列番号９０の１型または２型に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、および／またはＸ４ドメインのバリアントを含み、これらは配列番号２７５～３００に示される配列番号９０の一次アミノ酸配列に対する変異を組み込む。
本明細書に記載の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、およびポリペプチドは、化学的に合成されるか、または組換え発現され得る（ポリペプチドが遺伝的にコード化可能である場合）。ポリペプチドは、インビボで半減期の延長を促進する安定化化合物などの他の化合物に連結され、限定されるものではないが、アルブミン、ＰＥＧ化（１つ以上のポリエチレングリコール鎖の結合）、ＨＥＳ化、ＰＡＳ化、グリコシル化を含み、またはＦｃ融合もしくは脱免疫バリアントとして産生され得る。このような結合は、共有結合または非共有結合であり得る。例えば、部分を含むポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）の付加は、ポリペプチドのシステイン残基への、マレイミド基（「ＰＥＧ－ＭＡＬ」）に連結された（ｌｉｎｋｅｄ）ＰＥＧ基の結合を含み得る。ＰＥＧ－ＭＡＬの好適な例は、メトキシＰＥＧ－ＭＡＬ ５ｋＤ、メトキシＰＥＧ－ＭＡＬ ２０ｋＤ、メトキシ（ＰＥＧ）２－ＭＡＬ ４０ｋＤ、メトキシＰＥＧ（ＭＡＬ）２ ５ｋＤ、メトキシＰＥＧ（ＭＡＬ）２ ２０ｋＤ、メトキシＰＥＧ（ＭＡＬ）２ ４０ｋＤ、またはこれらの任意の組み合わせである。米国特許第８，１４８，１０９号も参照されたい。他の実施形態において、ＰＥＧは、分岐鎖ＰＥＧおよび／または複数のＰＥＧ鎖を含み得る。
一実施形態において、安定化化合物は、限定されないが、ＰＥＧ含有部分を含み、ポリペプチドのシステイン残基で連結される。別の実施形態において、システイン残基は、Ｘ２ドメインに存在する。一部の実施形態において、システイン残基は、例えば、Ｘ２ドメインのいくつかの位置のいずれか１つに存在する。このような一部の実施形態において、Ｘ２ドメインは、少なくとも１９アミノ酸の長さであり、システイン残基は、それらの１９アミノ酸に対して１、２、５、９または１６番目にある。さらなる実施形態において、ＰＥＧ含有部分を含むがこれに限定されない安定化化合物は、マレイミド基を介してシステイン残基と連結する。
さらなる実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、およびポリペプチドは、標的ドメインをさらに含み得る。この実施形態において、条件付きの受容体アゴニストは、目的の標的に向けることができる。標的ドメインは、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および／またはポリペプチドに共有結合または非共有結合し得る。標的ドメインが非共有結合している実施形態において、ストレプトアビジン－ビオチンリンカーを含むがこれに限定されない、そのような非共有結合のための任意の好適な手段を使用することができる。
別の実施形態において、標的ドメインは、存在する場合、ポリペプチドとの翻訳融合物である。この実施形態において、ポリペプチドおよび標的ドメインは、翻訳融合物において互いに直接隣接してもよく、または意図された目的に好適なポリペプチドリンカーによって連結されてもよい。このような例示的なリンカーとしては、ＷＯ２０１６／１７８９０５、ＷＯ２０１８／１５３８６５（特に、１３ページ）、およびＷＯ２０１８／１７０１７９（特に、段落［０３１６］～［０３１７］）に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、好適なリンカーとしては、限定されるものではないが、ＧＧＧＧＧ（配列番号９５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号９６）、ＧＧＧＧＧＧ（配列番号９７）、ＧＧＳＧＧＧ（配列番号９８）ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号９９）、ＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号１００）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０１）、および［ＧＧＧＧＸ］ｎ（配列番号１０２）が挙げられ、式中、ＸはＱ、ＥまたはＳであり、ｎは、２～５である。
標的ドメインは、目的の標的に結合するポリペプチドドメインまたは小分子である。１つの非限定的な実施形態において、標的ドメインは、細胞表面タンパク質に結合し、この実施形態において、細胞は、好適な標的ドメインによって結合され得る表面タンパク質を含む、目的とする任意の細胞型であり得る。一実施形態において、細胞表面タンパク質は、腫瘍細胞、腫瘍血管成分細胞、腫瘍微小環境細胞（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）、他のがん細胞および免疫細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）からなる群から選択される細胞の表面に存在する。細胞表面タンパク質が、腫瘍細胞、血管成分細胞、腫瘍微小環境細胞（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）の表面に存在する場合、任意の好適な腫瘍細胞、血管成分細胞、または腫瘍微小環境細胞の表面マーカーは、標的とされ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＴＲＯＰ２、ＲＯＲ１、ＲＯＮ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－ＤＣ、ＨＬＤ－ＤＲ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ－７２、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、葉酸結合タンパク質、Ａ３３、Ｇ２５０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、フェリチン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、Ｌｅｙ、ＣＡ－１２５、ＣＡ１９－９、上皮成長因子、ｐ１８５ＨＥＲ２、ＩＬ－２受容体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ）、線維芽細胞活性化タンパク質、テネイシン、メタロプロテイナーゼ、エンドシアリン、血管内皮成長因子、ａｖＢ３、ＷＴ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、ＰＲ１、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロンシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点タンパク質、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、フコシルＧＭ１、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａｌ、ｓＬｅ（動物）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＶ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳＬ***タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、レグマイン、Ｔｉｅ３、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＰＤＧＦＲ－Ｂ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＲＯＲ２、ＴＲＡＩＬ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｃ２、ＧＡＧＥ、ＥＧＦＲ、ＣＭＥＴ、ＨＥＲ３、ＭＵＣ１５、ＣＡ６、ＮＡＰＩ２Ｂ、ＴＲＯＰ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬｏｒｆ１８６、ＲＯＮ、ＬＹ６Ｅ、ＦＲＡ、ＤＬＬ３、ＰＴＫ７、ＳＴＲＡ６、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＥＭ２３８、ＵＰＫ１Ｂ、ＶＴＣＮ１、ＬＩＶ１、ＲＯＲ１、Ｆｏｓ関連抗原１、ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体－ＩＢ型、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ．００１２０３）、Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ－００３４８６）、ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１２４４９）、０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ３６１４８６）、ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００５８２３）、Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質担体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００６４２４）、Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、ｓｅｍａドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型および１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０４０８７８）、ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、理研ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２、理研ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ３５８６２８）、ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ２７５４６３）、ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１７７６３）、ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ．ｓｕｂ．－－８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺がん関連遺伝子１、前立腺がん関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号．ＡＦ４５５１３８）、ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１７６３６）、ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形腫由来の成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００３２０３またはＮＭ００３２１２）、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２６００４）、ＣＤ７９ｂ（ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０００６２６）、ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ホスファターゼアンカータンパク質１ａを含むＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０３０７６４）、ＨＥＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０）、ＮＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１８７２８）、ＭＤＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＣ０１７０２３）、ＩＬ２０Ｒアルファ、（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１８４９７１）、ブレビカン（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２２９０５３）、Ｅｐｈｂ２Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００４４４２）、ＡＳＬＧ６５９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＸ０９２３２８）、ＰＳＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ２９７４３６）、ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ２６０７６３）、ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ４４３１７７．１）、ＣＤ２２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ－００１７６２．１）、ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９アルファ、免疫グロブリン関連アルファ、Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合的に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面で複合体を形成するＢ細胞特異的タンパク質は、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達する、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７７４．１）、ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化されるＧタンパク質共役型受容体は、リンパ球の遊走および体液性防御に機能し、ＨＩＶ－２感染、およびおそらくＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、白血病の発症に関与する、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７０７．１）、ＨＬＡ－ＤＯＢ（ペプチドに結合してＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００２１１１．１）、Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５、細胞外ＡＴＰによって開閉されるイオンチャネルは、シナプス伝達および神経新生に関与している可能性があり、欠乏は特発性排尿筋不安定性の病態生理学に寄与する可能性がある、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００２５５２．２）、ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７７３．１）、ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質は、Ｂ細胞の活性化およびアポトーシスを調節し、機能の喪失は全身性紅斑性狼瘡患者の疾患活動性の増加と関連している、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号．ＮＰ００５５７３．１）、ＦＣＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１、Ｃ２型Ｉｇ様およびＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインの推定受容体は、Ｂリンパ球の分化に関与している可能性がある、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ４４３１７０．１）、またはＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２、Ｂ細胞の発達およびリンパ腫形成に関与すると推定される免疫受容体、転座による遺伝子の調節解除が一部のＢ細胞悪性腫瘍で生じる、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ１１２５７１．１）を含み得るが、これらに限定されない。
別の実施形態において、標的ドメインは、免疫細胞表面マーカーに結合する。この実施形態において、標的は、任意の好適な免疫細胞の細胞表面タンパク質であり、該細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージを含むが、これらに限定されない。標的ドメインは、任意の好適な免疫細胞表面マーカー（内在性免疫細胞か改変免疫細胞かを問わない、改変ＣＡＲ－Ｔ細胞を含むが、これに限定されない）を標的とし得、該マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５４、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＴＬＡ－４を含むが、これらに限定されない。別の実施形態において、標的ドメインは、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＲＯＰ２、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ３３、ＣＤ２２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ１２３、ネクチン－４、組織因子抗原、ＣＤ１５４、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）またはＭＵＣ１６に結合し、かつ／または、標的ドメインは、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＲＯＰ２、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ３３、ＣＤ２２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ１２３、ネクチン－４、組織因子抗原、ＣＤ１５４、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）またはＭＵＣ１６に結合する。
これら全ての実施形態において、標的ドメインは、目的の標的に結合する任意の好適なポリペプチドであり、本開示のポリペプチドに組み込まれ得る。非限定的な実施形態において、標的ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、モノボディ、ナノボディ、ダイアボディ、抗体（単一特異性または二重特異性の抗体を含む）を含み得るが、これらに限定されず、細胞標的化オリゴペプチドが、ＲＧＤインテグリン結合ペプチド、デノボ設計されたバインダー、アプタマー、二環ペプチド、コノトキシン、葉酸などの小分子、および細胞表面に結合するウイルスを含むが、これらに限定されない。
本開示の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、およびポリペプチドは、本開示の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、およびポリペプチドには存在しない、Ｎ末端、Ｃ末端、または両端に追加の残基を含む場合があり、これらの追加の残基は、参照ポリペプチドに対して本開示のポリペプチドまたはペプチドドメインのパーセント同一性の決定には含まれない。このような残基は、用途に好適な任意の残基であり、検出タグ（すなわち、蛍光タンパク質、抗体エピトープタグなど）、アダプター、精製の目的に好適なリガンド（Ｈｉｓタグなど）、ポリペプチドなどに機能性を付加する他のペプチドドメインを含むが、これらに限定されない。このような基の結合に好適な残基は、システイン、リジンまたはｐ－アセチルフェニルアラニン残基を含み得るか、または米国特許第９，６７６，８７１号および同第９，７７７，０７０号に開示されるトランスグルタミナーゼとの反応に好適なアミノ酸タグなどのタグであり得る。
さらなる態様において、本発明は、遺伝的にコードされ得る本開示の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、およびポリペプチドをコードする、単離された核酸を含む核酸を提供する。単離された核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。このような単離された核酸配列は、コードされたタンパク質の発現および／または精製を促進するのに有用な追加の配列を含み、ポリＡ配列、修飾コザック配列、ならびにエピトープタグ、輸送シグナル、および分泌シグナル、核局在化シグナル、および形質膜局在化シグナルをコードする配列を含むが、これらに限定されない。本明細書の教示に基づいて、どの核酸配列が本発明のポリペプチドをコードするかは、当業者には明らかであろう。
別の態様において、本開示は、好適な制御配列に機能可能に連結された本発明の任意の態様の核酸を含む発現ベクターを提供する。「発現ベクター」は、核酸コード領域または遺伝子を、遺伝子産物の発現をもたらすことができる任意の制御配列と機能可能に連結するベクターを含む。本発明の核酸配列に機能可能に連結された「制御配列」は、核酸分子の発現をもたらすことができる核酸配列である。制御配列は、核酸配列の発現を指示するように機能する限り、隣接している必要がない。したがって、例えば、介在性で翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列と核酸配列との間に存在し、プロモーター配列は依然コード配列と「機能可能に連結された」とみなされ得る。このような他の制御配列には、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、およびリボソーム結合部位が含まれるが、これらに限定されない。このような発現ベクターには、プラスミドおよびウイルス系の発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物系において、開示される核酸配列の発現を駆動するために使用される制御配列は、構成的でもよく（様々なプロモーターのいずれかによって駆動され、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含むが、これらに限定されない）、または誘導性でもよい（いくつかの誘導性プロモーターのいずれかによって駆動され、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含むが、これらに限定されない）。発現ベクターは、エピソームとして、あるいは宿主染色体ＤＮＡへの組み込みにより、宿主生物において複製可能でなければならない。様々な実施形態において、発現ベクターは、プラスミド、ウイルス系のベクター（限定されないが、レトロウイルスベクターまたは腫瘍溶解性ウイルスを含む）、または任意の他の好適な発現ベクターを含んでもよい。一部の実施形態において、発現ベクターは、治療上の利益のためにインビボでポリペプチドを発現するように、本開示の方法で投与され得る。非限定的な実施形態において、発現ベクターは、細胞治療標的（限定されないが、ＣＡＲ－Ｔ細胞または腫瘍細胞を含む）をトランスフェクションまたは形質導入して、本明細書に開示される治療方法を達成するために使用され得る。
さらなる態様において、本開示は、本明細書に開示される発現ベクターおよび／または核酸を含む宿主細胞を提供し、宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかであり得る。細胞は、下記に限定されないが、細菌の形質転換、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、またはリポソーム媒介性、ＤＥＡＥデキストラン媒介性、ポリカチオン媒介性、またはウイルス媒介性のトランスフェクションを含む技術を使用して、本発明の発現ベクターを組み込むように一時的または安定的に改変され得る。（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照）。本発明によるポリペプチドを産生する方法は、本発明の追加的な部分である。この方法は、（ａ）本発明のこの態様に従って、ポリペプチドの発現を促す条件下で、宿主を培養するステップと、（ｂ）任意で、発現ポリペプチドを回収するステップと、を含む。発現ポリペプチドは、無細胞抽出物から回収することができるが、好ましくは、培養培地から回収される。
別の態様において、本開示は、本開示の任意の態様または実施形態の１つ以上の条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、例えば、以下に記載される本開示の方法において使用することができる。医薬組成物は、本開示のポリペプチドに加えて、（ａ）凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、（ｂ）界面活性剤、（ｃ）増量剤、（ｄ）張度調整剤、（ｅ）安定剤、（ｆ）防腐剤、および／または（ｇ）緩衝剤を含み得る。
一部の実施形態において、医薬組成物中の緩衝剤は、トリス緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、ホスフェート緩衝剤、シトレート緩衝剤、またはアセテート緩衝剤である。医薬組成物は、凍結乾燥保護剤、例えば、スクロース、ソルビトール、またはトレハロースも含み得る。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、防腐剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびこれらの様々な混合物を含む。他の実施形態において、医薬組成物は、グリシンのような増量剤を含む。さらに他の実施形態において、医薬組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、またはこれらの組み合わせを含む。医薬組成物はまた、張度調整剤、例えば、製剤をヒトの血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物も含み得る。例示的な張度調整剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、および塩酸アルギニンが含まれる。他の実施形態において、医薬組成物は、安定剤、例えば、目的のタンパク質と組み合わせると、凍結乾燥または液体の形態での目的のタンパク質の化学的不安定性および／または物理的不安定性を実質的に防止または低減する分子、をさらに含む。例示的な安定剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、および塩酸アルギニンが含まれる。
条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、医薬組成物中の唯一の活性剤であり得るか、または組成物は、用途に適した１つ以上の他の活性剤をさらに含み得る。
さらなる態様において、本開示は、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分が腫瘍の細胞で相互作用してがんを治療する条件下で、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせの治療上有効な量の条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを治療するための方法を提供する。条件付きで活性な受容体アゴニストを投与するための実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、一緒に投与され得るか、または別個の医薬製剤で投与され得る。
本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、下記のうちの１つ以上を達成することを意味する。（ａ）対象の腫瘍および／または転移のサイズまたは体積を低減すること、（ｂ）対象の腫瘍および／または転移のサイズまたは体積の任意の増加を制限すること、（ｃ）生存率を向上すること、（ｄ）がんに関連する症状の重症度を低減すること、（ｅ）がんに関連する症状の進行を制限または予防すること、ならびに（ｆ）がんに関連する症状の悪化を抑制すること。
本方法は、任意の好適ながんを治療するために使用することができ、該がんは、結腸がん、黒色腫、腎細胞がん、頭頸部扁平上皮がん、胃がん、尿路上皮がん、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝細胞がん、膵臓がん、メルケル細胞がん、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がん、およびマイクロサテライト不安定性、腫瘍の遺伝子変異数、ＰＤ－Ｌ１発現レベル、または免疫スコアアッセイ（ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒによって開発された）などの診断テストにより選択される任意の腫瘍型を含むが、これらに限定されない。
対象は、がんを有する任意の対象であり得る。一実施形態において、対象は、哺乳動物であり、限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどが含まれる。
一実施形態において、第１の標的ドメインは細胞マーカーに結合し、第２の標的ドメインは第２の別個の細胞マーカーに結合し、同じまたは近くの細胞上でのこれらの２つのマーカーの共発現は、より一般的に、他の組織より腫瘍で生じ、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、第１の標的ドメインが第１の細胞マーカーに結合し、第２の標的ドメインが第２の細胞マーカーに結合した後にのみ相互作用する。この実施形態は、例えば、それ自体は腫瘍細胞で濃縮されていないが、共発現が腫瘍で濃縮されている別個のマーカーに結合する２つの標的ドメインを使用する。
別の実施形態において、第１のポリペプチド成分は、第１の標的ドメインを含み、第２のポリペプチド成分は、第２の標的ドメインを含み、第１の標的ドメインは、第１の腫瘍細胞マーカーに結合し、第２の標的ドメインは、第１の腫瘍細胞マーカーと同じまたは異なり得る第２の腫瘍細胞マーカーに結合し、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、第１の標的ドメインが第１の腫瘍細胞マーカーに結合し、第２の標的ドメインが第２の腫瘍細胞マーカーに結合した後にのみ相互作用する。
別の実施形態において、第１のポリペプチド成分は、第１の標的ドメインを含み、第２のポリペプチド成分は、第２の標的ドメインを含み、第１の標的ドメインは、腫瘍細胞マーカーに結合し、第２の標的ドメインは、免疫細胞マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、樹状細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）に結合し、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、第１の標的ドメインが腫瘍細胞マーカーに結合し、第２の標的ドメインが免疫細胞マーカーに結合した後にのみ相互作用する。
一実施形態において、第１の標的ドメインは細胞マーカーに結合し、第２の標的ドメインは第２の別個の細胞マーカーに結合し、これらの２つのマーカーの共発現は、より一般的に、一部の他の細胞型より腫瘍細胞で生じ、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、第１の標的ドメインが第１の細胞マーカーに結合し、第２の標的ドメインが同一細胞上の第２の細胞マーカーに結合した後にのみ相互作用する。この実施形態は、例えば、それ自体は腫瘍細胞で濃縮されていないが、共発現が腫瘍で濃縮されている別個のマーカーに結合する２つの標的ドメインを使用する。
さらなる実施形態において、第１のポリペプチド成分は、第１の標的ドメインを含み、第２のポリペプチド成分は、第２の標的ドメインを含み、第１の標的ドメインは、第１の免疫細胞マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、樹状細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）に結合し、第２の標的ドメインは、第１の免疫細胞マーカーと同じまたは異なり得る第２の免疫細胞マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、樹状細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）に結合し、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、第１の標的ドメインが第１の免疫細胞マーカーに結合し、第２の標的ドメインが第２の免疫細胞マーカーに結合した後にのみ相互作用する。
さらなる態様において、本開示は、本開示の条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を対象に投与することにより、対象の免疫応答を調節するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分が免疫細胞で相互作用して免疫応答を調節する条件下で、条件付きで活性な受容体アゴニストを対象に投与することを含む。
本明細書で使用される場合、調節される「免疫応答」とは、刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ４またはＣＤ８）、制御性Ｔ細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球、好酸球、または好中球などの免疫系の細胞による応答を指す。一部の実施形態において、応答は、特定の抗原に特異的であり（「抗原特異的応答」）、それらの抗原特異的受容体を介したＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、またはＢ細胞による応答を指す。一部の実施形態において、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。これらの細胞によるこのような応答は、例えば、細胞毒性、増殖、サイトカインまたはケモカイン産生、輸送、またはファゴサイトーシスを含み、応答を受ける免疫細胞の性質に依存し得る。本明細書に記載の組成物および方法の一部の実施形態において、調節される免疫応答は、Ｔ細胞媒介性である。
一部の態様において、免疫応答は、抗がん免疫応答である。一部のこのような態様において、本明細書に記載の条件付きで活性なＩＬ－２模倣体は、がんを有する対象において抗がん免疫応答を調節するために対象に投与される。
一部の態様において、免疫応答は、組織修復免疫応答である。一部のこのような態様において、本明細書に記載される条件付きで活性なＩＬ－４模倣体は、対象の組織修復免疫応答を調節するために、それを必要とする対象に投与される。
一部の態様において、免疫応答は、創傷治癒免疫応答である。一部のこのような態様において、本明細書に記載される条件付きで活性なＩＬ－４模倣体は、対象の創傷治癒免疫応答を調節するために、それを必要とする対象に投与される。
一部の態様において、対象における第２の治療剤に対する免疫応答を調節するための方法が提供される。一部のこのような態様において、本方法は、有効量の第２の治療剤と組み合わせて、本開示のポリペプチドを対象に投与することを含む。第２の治療剤は、例えば、化学療法剤または抗原に特異的な免疫療法剤であり得る。一部の態様において、抗原に特異的な免疫療法剤は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む。一部の態様において、本開示のポリペプチドは、治療剤に対する対象の免疫応答を増強する。免疫応答は、例えば、Ｔ細胞応答（ＣＡＲ－Ｔ細胞応答を含む）の改善、先天性Ｔ細胞免疫応答の増強、炎症の低下、制御性Ｔ細胞の活性阻害、またはこれらの組み合わせによって増強することができる。
いくつかの態様において、本発明の条件付きで活性なサイトカイン模倣体、例えば、本明細書に記載の条件付きで活性なＩＬ－４模倣体は、生体材料に含浸されるか、さもなければ結び付き、生体材料は、対象に導入される。一部の態様において、生体材料は、移植可能な医療装置の構成要素であり、装置は、例えば、生体材料でコーティングされるであろう。このような医療装置には、例えば、血管および動脈の移植片が含まれる。条件付きで活性なＩＬ－４および／またはＩＬ－４関連生体材料は、例えば、創傷治癒および／または組織の修復および再生を促進するために使用することができる。
別の態様において、本開示は、ＩＬ－２受容体またはＩＬ－４受容体を刺激する方法を提供し、該方法は、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分が受容体で相互作用する条件下で、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせの条件付きで活性な受容体アゴニストを対象に投与することを含む。
本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」とは、治療される疾患（例えば、がん）を治療および／または制限するのに有効な、条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞の量を指す。条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、典型的には、上記に開示されたものなどの医薬組成物として製剤化され、任意の好適な経路を介して投与することができ、経路には、従来の薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含む投薬単位で、吸入スプレーによる経口、眼、静脈内、皮下、腹腔内および小胞内を含むが、これらに限定されない。特定の一実施形態において、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、粘膜に投与され、眼内、吸入、または鼻腔内の投与を含むが、これらに限定されない。別の特定の実施形態において、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、経口投与される。このような特定の実施形態は、液滴、ネブライザ、スプレー、または他の好適な製剤を介して投与され得る。
担当の医療関係者によって決定されるように、任意の好適な投薬範囲を使用することができる。投薬計画は、所望の最適な応答（例えば、治療的応答または予防的応答）を提供するように調整され得る。条件付きで活性な受容体アゴニストまたはポリペプチドの好適な投薬範囲は、例えば、０．１ｕｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、あるいは、０．５μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、１ｕｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、または５ｕｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一部の実施形態において、推奨用量は、特に局所投与される場合、０．１ｍｃｇ／ｋｇ未満であり得る。他の実施形態において、推奨用量は、体重／ｍ２（すなわち、体表面積）に基づくことができ、かつ／または固定用量（例えば、０．０５～１００ｍｇ）で投与することができる。条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、単回ボーラスで送達することができ、または主治医によって決定される場合、２回以上（例えば、２、３、４、または５回以上）投与することができる。
条件付きで活性な受容体アゴニスト、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、唯一の予防剤または治療剤として投与されるか、または１つ以上の他の予防剤または治療剤と一緒に（すなわち、組み合わせてまたは別々に）投与され、腫瘍切除、化学療法、放射線療法、免疫療法などを含むがこれらに限定されない。
上記の教示に照らして、本開示の多数の修正および変形が可能である。
実施例１．
天然のサイトカインの機能部位を再現するものの、それ以外はトポロジーまたはアミノ酸配列において無関係である、デノボサイトカイン模倣体を設計するためのコンピュータによるアプローチを説明する。この戦略は、ＩＬ－２受容体βγＣヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）に結合するが、ＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－１５Ｒαの結合部位を有しないＩＬ－２およびインターロイキン１５（ＩＬ－１５）のデノボ非分割模倣体を設計するために使用された。設計は、超安定であり、天然のサイトカインよりも高い親和性でヒトおよびマウスのＩＬ－２ＲβγＣに結合し、ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－１５Ｒαとは無関係に、下流細胞シグナル伝達を誘発する。実験的に最適化された模倣体であるｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の結晶構造は、設計モデルに非常に近く、マウスＩＬ－２Ｒβγｃ複合体についての最初の構造情報を提供する。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、黒色腫および結腸がんのマウスモデルにおいて、ＩＬ－２と比較して、非常に効果的な治療活性を有し、毒性が低減され、免疫原性の兆候を有しない。
多くのサイトカインは複数の異なる受容体サブユニットと相互作用し、ほとんどの天然のタンパク質と同様に、安定性を損なうが機能にとって重要な非理想的な構造的特徴を含んでいる。所望の受容体サブユニット（複数可）と相互作用する構造要素が、空間に固定され、理想化された球状タンパク質構造が、これらの要素を支持するように構築される、コンピュータによるプロトコルが開発された。コンビナトリアル断片アセンブリを使用して、知識ベースのループクロージャと組み合わせた分離らせんのパラメトリック構築を伴う短い線形エピトープを支持した（図１ａ－ｂ）。このアプローチは、ヒトＩＬ－２Ｒβγｃ（ｈＩＬ－２Ｒβγｃ）に対するヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）およびヒトＩＬ－１５（ｈＩＬ－１５）の相互作用表面を模倣するが、ＩＬ－２受容体アルファ（ＩＬ－２Ｒα）の相互作用表面を完全に欠いている、相互作用表面を有する安定な理想化されたタンパク質をデノボ設計する試みによって試験された。
ＩＬ－２Ｒβγｃを結合し、活性化する非分割ＩＬ－２／ＩＬ－１５模倣体のコンピュータによる設計：天然ｈＩＬ－２は、長い不規則なループによって連結された４つのらせんを含む。Ｎ末端らせん（Ｈ１）は、ＩＬ－２受容体のベータおよびガンマの両サブユニットと相互作用し、第３のらせん（Ｈ３）は、ベータサブユニットと相互作用し、Ｃ末端らせん（Ｈ４）は、ガンマサブユニットと相互作用し、アルファサブユニットと相互作用する表面は、不規則な第２のらせん（Ｈ２）および２つの長いループによって形成され、一方は、Ｈ１をＨ２に連結し、他方は、Ｈ３とＨ４を連結する。Ｈ１、Ｈ３、およびＨ４によって形成される界面をベータおよびガンマで再現し、Ｈ２をより良好な充填を提供する通常のらせんに置き換える理想的なタンパク質が設計された。らせんＨ１、Ｈ３、およびＨ４（図１ａを参照）を、結合部位のテンプレートとして使用した一方、らせんＨ２は、高度に表現されたクラスター形成された断片（方法を参照）のデータベースを使用して再構築された（Ｈ２’）。らせん対は、同じデータベースから抽出されたループで連結され（図１ｂを参照）、結果として得られたらせんヘアピンは完全に連結された骨格に結合され（図１ｃを参照）、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）コンビナトリアルフレキシブル骨格配列の設計計算は、ｈＩＬ－２ＲβγＣ（方法を参照）の存在下で実行された。酵母ディスプレイによる実験的特性評価のために、上から４つのコンピュータによる設計および８つの単一ジスルフィドで一括りにされる変異（表２を参照）が選択された（方法を参照）。８つの設計は、低ナノモル濃度で、蛍光タグ付きベータ－ガンマキメラＩＬ－２受容体に結合することが見出された。最良の非ジスルフィド設計（Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０）は、部位飽和変異誘発、続いてマウスＩＬ－２Ｒβγｃに対して親和性を増大する置換の選択および組み合わせに供した（ｍＩＬ－２Ｒβγｃ、図５を参照）。最適化された設計（Ｅ．ｃｏｌｉで組換え発現され、低ナノモル濃度またはピコモル濃度でさえ、ＩＬ－２応答性マウス細胞のインビトロでｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘発することが見出され（表３、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）、ただし、熱安定性は比較的低かった（Ｔｍ～＜４５℃、図９および１０を参照）。安定性を改善するために、コンピュータによる設計プロトコルを繰り返し、最も親和性の高い第１ラウンド設計の骨格（Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ、トポロジー：Ｈ１－＞Ｈ４－＞Ｈ２’－＞Ｈ３）から開始し、ループ構築プロセスとらせん長のパラメトリック変動とを組み合わせた（＋／－８アミノ酸、図１ａの下部パネルを参照）。この第２のアプローチは、らせんの各対を連結するループの実質的により多くの組み合わせの探索を可能にすることにより、モデルの品質を改善した。Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆの２７のＲｏｓｅｔｔａ（商標）配列の再設計（表４を参照）とともに、第２世代の１４の最良設計が実験的に特性評価され、１つを除く全てが低ナノモル濃度でＩＬ－２受容体に結合することがわかった。３つの最も高い親和性および安定性の設計（１つの配列再設計および２つの新規模倣体）は、ＭＩＬ－２ＲβγＣ結合の部位飽和変異誘発（図６～８）、続いてヒトおよびマウスの両ＩＬ－２ＲβγＣに対して親和性を増大する置換の選択および組み合わせに供した。成熟設計（表５を参照）は、超安定性を維持しながら、結合の増強を示した（（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照））。最上の設計であるｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５（本明細書ではＮｅｏ－２／１５とも称される）は、ヒトまたはマウスのＩＬ－２とはまったく異なる新規なトポロジーおよび配列をもつ１００残基のタンパク質である（構造トポロジーに依存しないアラインメントにおいて、８９残基を超えるｈＩＬ－２と２９％の配列同一性、および７６整列残基を超えるｍＩＬ－２と１６％の配列同一性）。
ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の機能的特性：Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、ヒトおよびマウスのＩＬ－２Ｒβγｃに高い親和性で結合し、ＩＬ－２Ｒαとは相互作用しない（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。ヒトおよびマウスＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒβγｃ）に対するＮｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の親和性は、対応する天然ＩＬ－２サイトカインの親和性よりも有意に高い。天然ＩＬ－２とは対照的に、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、ヒトおよびマウスの両ＩＬ－２応答性細胞、およびマウスの初代Ｔ細胞でＩＬ－２Ｒα非依存性シグナル伝達を誘発する（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、その高い結合親和性により、天然のヒトまたはマウスのＩＬ－２よりも強力に、ＩＬ－２Ｒα細胞を活性化する。初代細胞では、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、おそらくＩＬ－２Ｒα結合性が完全に欠如しているため、Ｓｕｐｅｒ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα－細胞に対してより活性が高く、ＩＬ－２Ｒα＋に対してより活性が低い。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は超安定であり（図１２参照）、８０℃で２時間インキュベーション後もｈＩＬ－２ＲβγＣに対する結合親和性を失わない一方、ｈＩＬ－２およびＳｕｐｅｒ－２は１０分後に完全に不活性化されている（半不活化時間＝それぞれ約４．２分および約２．６分、図２）。同様に、エクスビボ初代細胞培養では、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、９５℃で６０分間煮沸した後、Ｔ細胞の生存を効果的に促進した一方、これらの条件はＩＬ－２とＳｕｐｅｒ－２の両方を不活性化した（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。熱変性の研究は、他の多くの設計模倣体で行われ、それらの熱安定性も同様に実証された（図１１を参照）。サイトカイン様分子のこの前例のない安定性は、コールドチェーン貯蔵の必要性を排除するだけでなく、変異（図８および１３を参照）、遺伝子融合、および天然ＩＬ－２（図３を参照）を大幅に超える化学修飾に対する堅牢性を示唆している。
ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の治療への応用：ＩＬ－２の臨床使用は主に毒性によって制限されてきた。ヒトにおけるＩＬ－２毒性の原因となる相互作用は、完全には理解されていないが、マウスモデルでは、毒性はＴ細胞に依存せず、ＩＬ－２Ｒα鎖（ＣＤ２５＋）の欠損動物では緩和される。したがって、ＩＬ－２Ｒαとの相互作用を弱めるためにＩＬ－２を再改変することに多くの努力が向けられてきたが、ＣＤ２５結合部位の変異は非常に不安定化する可能性がある。ＩＬ－２の固有の低い安定性、および密接に進化したＣＤ２５依存性は、再改変されたＩＬ－２化合物の翻訳に対して障壁となっている。ＩＬ－２Ｒβγｃを二量体化してＩＬ－２と同様のシグナル伝達を誘発するが、ＣＤ２５に対する親和性を有しないため、他の試みはＩＬ－１５に集中してきた。しかしながら、ＩＬ－１５は、主に抗原提示細胞およびナチュラルキラー細胞が呈するＩＬ－１５α（ＣＤ２１５）受容体による、トランス提示に依存している。天然ＩＬ－１５の安定性の低さ、およびトランス提示への依存も、再改変の取り組みに対する大きな障壁となっている。
無感作マウスの用量漸増研究により、ｍＩＬ－２が、ＣＤ２５＋細胞への優先的結合と一致して、制御性Ｔ細胞を優先的に増殖させることが示される一方、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進し、最高用量のみで試験された制御性Ｔ細胞の増殖を誘導しないか最小限に誘導する。同様に、気道炎症のマウスモデルでは、通常、組織に常在するＣＤ８＋Ｔ細胞のごく一部を誘導し、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、リンパ器官でＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋抗原に特異的なＴｒｅｇを増加させることなく、Ｔｈｙ１．２－ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加をもたらす（データは示されていない、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。
ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の治療効果は、免疫原性が低いＢ１６Ｆ１０黒色腫、および免疫原性がより高いＣＴ２６結腸がんマウスモデルで試験された。ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５による単剤処置は、両がんモデルにおいて腫瘍増殖の用量依存的な遅延をもたらした。ＣＴ２６結腸がんでは、単剤処置は組換えｍＩＬ－２で観察されたものよりも改善された有効性を示した（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫では、抗黒色腫抗体ＴＡ９９（抗ＴＲＰ１）との併用処置は、腫瘍増殖の有意な遅延をもたらした一方、ＴＡ９９処置単独ではほとんど効果がなかった（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。長期生存実験（８週間）では、ＴＡ９９と組み合わせたｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、ｍＩＬ－２と比較して、毒性が大幅に低下し、全体的に優れた治療効果を示した（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。ｍＩＬ－２とＴＡ９９の組み合わせで処置されたマウスは着実に体重が減少し、全体的な健康状態は安楽死を必要とする程度まで低下した一方、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５とＴＡ９９の組み合わせではほとんど低下は観察されなかった（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。治療効果と一致して、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５治療は、腫瘍内ＣＤ８：Ｔｒｅｇ比の有意な増加をもたらし（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）、これは既に効果的な抗腫瘍免疫応答５８と相関している。ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５によるＣＤ８：Ｔｒｅｇ比の増加は、用量および抗原に依存し（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５、ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）、最適な治療効果は、より高い用量で、他の免疫療法と組み合わせて得られた（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。まとめると、これらのデータは、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５が、免疫賦活剤活性のようなＩＬ－２に由来する予測される恒常利益を示すが、ＣＤ２５＋の優先的結合に関連する有害作用がないことを示している。ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の治療効果はＣＡＲ－Ｔモデルで試験された。０．５×１０６個のＲＡＪＩ腫瘍細胞を接種したＮＳＧマウスを、未処置のままにしたか、０．８×１０６個の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（腫瘍細胞接種後に７日間の点滴）で処置したか、または腫瘍接種後の８～１４日目で２０μｇ／日のヒトＩＬ－２もしくはｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５のいずれかに加えて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞で同様に処置した。予想通り、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の抗腫瘍効果を有意に増強し、腫瘍の増殖を遅らせ、マウスの生存を延長することが示された（（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照））。
タンパク質模倣体のデノボ設計は、タンパク質に基づく治療薬の分野を変革する可能性があり、治療特性が増強され、副作用が低減されたバイオスーペリア分子の開発を可能にし、組換えＩＬ－２およびｈＩＬ－２の改変バリアントとは異なって、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、Ｅ．ｃｏｌｉで可溶性発現でき（図１７を参照）、高温で活性を保持し、ＩＬ－２Ｒαと相互作用せず、新しい機能の改変を可能にする実質的な配列変化に対して堅牢である（図７）。
ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の堅牢なモジュール性。ジスルフィドステープリングおよびＩＬ－４模倣体への再改変：Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、高度なモジュラーであるため、その安定性を増加させる、または結合優先度を変更するなど、その特性を容易に調整することができる。このモジュール性および堅牢性は、コンピュータ設計により、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の機能を維持する安定性を増強する単一ジスルフィドステープルを導入することによって活用された。一例では、好ましい幾何学的配置を有する位置の対を検索し、続いて可動性骨格を最小化することにより、ジスルフィド架橋を導入した。最終的な設計では、残基３８と７５の間に単一ジスルフィドが導入され、らせんＨ３およびＨ２が安定化された。この戦略は、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５（Ｔｍ＞９５℃）の安定性を高めた一方、その配列および機能はほとんど影響を受けなかった（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６５，ｐｇ．１８６，Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１９を参照）。ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５のモジュール特性を使用して、その結合優先度を変更した。インターロイキン－２ファミリーの全てのサイトカインは、γｃと相互作用し、共通のアーキテクチャを共有する。したがって、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、ＩＬ－２Ｒβ（らせんＨ１およびＨ３）と相互作用する結合部位の半分のアミノ酸のみを変更することによって、ＩＬ－２ファミリーの別のサイトカイン模倣体に変換できるものと仮定された。構想の実証として、ヒトインターロイキン－４（ｈＩＬ－４）は、ＩＬ－２と広範な構造的相同性を共有し、再生医療に応用できる可能性があるため、標的として選択された。Ｎｅｏ－２／１５モデルをＩＬ－４受容体に結合したヒトＩＬ－４の構造に整列させ、Ｎｅｏ－２／１５の１４残基を変異させて、ＩＬ－４とＩＬ４ｒの相互作用を媒介する構造位置でＩＬ－４のアミノ酸と一致させることにより、Ｎｅｏ－２／１５は、ヒトＩＬ－４受容体（ＩＬ－４ＲαおよびγＣを含む）と結合し、ヒトＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ＲβおよびγＣを含む）と結合しないように変更された（図３）。ランダム変異誘発を使用した定向進化および高結合親和性バリアントのスクリーニングによって、結合をさらに最適化し、２つの付加アミノ酸置換を導入し、ＩＬ－４タンパク質からグラフティングされた１４個の元の残基のうちの１つを修飾することによって、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５から、合計１６個の変異を有する新しいタンパク質Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４を創出した。得られた最適設計のｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４（表６を参照）は、Ｅ．ｃｏｌｉから組換え発現および精製され、結合について試験された。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４は、ＩＬ－４Ｒα受容体に高い親和性で結合し、協同してＩＬ－４ＲαγＣに結合し（図３参照）、ＩＬ－２受容体に対していかなる親和性でも結合せず（データは示していない）、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４は、ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の優れた熱安定性を保持し（図１４ｂ、ｃを参照）、ＩＬ－１３受容体に対するＩＬ－４の天然の交差反応性を考えると、予想通り、ＩＬ－１３受容体に結合する（データは示していない）。
方法
デノボサイトカイン模倣体のコンピュータによる設計：デノボサイトカイン模倣体の設計は、設計用テンプレートとしてのＩＬ－２Ｒβγｃ受容体との四次複合体中のｈＩＬ－２の構造を定義することによって開始した。検査後、結合部位を構成する残基は、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）メタデータ（ＰＤＢＩｎｆｏＬａｂｅｌｓ）を使用してホットスポットとして定義された。構造は、ＰｙＲｏｓｅｔｔａ（商標）でプログラムされた新しい模倣体設計プロトコルにフィードされ、これは、標的テンプレートを構成するコア－二次構造要素を自動的に検出し、設計用の完全なＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓ（商標）互換情報を備えて得られるデノボ模倣骨格を生成する。簡単には、模倣構築アルゴリズムは、次のように機能する。第１世代の設計では、非常に理想的な断片（断片サイズが４アミノ酸）のクラスター化データベースからのループを使用して再構築することにより、各コア要素が理想化された。理想化後、模倣構築プロトコルは、全ての可能な組み合わせの対により、理想化された要素を再連結することを目的としている。これを行うには、データベースからの配列に依存しない断片のコンビナトリアル断片アセンブリを使用し、続いて潜在的なソリューションのデカルト制約の骨格最小化を使用する（すなわち、構築断片のＮ端およびＣ端が２つの二次構造を連結するのに十分近い場合）。最小化後、ソリューションでは、非常に理想的な断片が含まれること（すなわち、２つの連結要素を構成するあらゆる重複断片もデータベース内に含まれる）、および骨格が標的（コンテキスト）受容体と衝突しないことが検証される。次に、各位置で最も可能性の高いアミノ酸を決定するために、通過する骨格ソリューションを、断片の同じデータベースを使用して特性を明らかにした（この情報は設計のメタデータにコード化された）。次に、連結された二次構造の対のソリューションを組み合わせて再結合し、グラフ理論の連結された構成要素を使用することによって、完全に連結された骨格を生成した。ソリューションの数は要素の対ごとに指数関数的に増加するため、断片の組み合わせの各ステップで、コア要素の対間の相互連結が短いものを優先するように設計をランク付けし、次のステップに進むために最上位のソリューションのみを保持した。次に、可能なアミノ酸の同一性を層互換性のあるものに制限するため、完全に連結されたソリューションを、層（界面、コア、非コア表面、表面）ごとに特性を明らかにした。最後に、ホットスポット、互換性のある構築断片のアミノ酸および層に関する全ての情報が組み合わされた（ホットスポットは、アミノ酸の確率よりも優先され、アミノ酸の確率は層よりも優先される）。次に、これらの完全に特性が明らかにされた骨格は、可動性骨格の設計およびフィルタリングのためにＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓ（商標）に渡された。第２世代の設計については、２つのアプローチを採った。第１のアプローチでは、最良の第１世代最適化設計の配列再設計が実行された（Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ、）。第２のアプローチでは、Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆを標的テンプレートとして使用して、新しい模倣体が改変された。この第２世代の模倣体設計プロトコルは、第１世代で説明されたものと似ていたが、２つの重要な違いがあった。まず、コア断片は、もはや断片から構築されなかったが、代わりに、標的らせんの各々を可能な限り近くに再現させた反復二次構造をもたらす反復性のφ角およびψ角（ωは１８０°に固定）の媒介変数方程式を見出すことによって、らせんに曲率を有する可能性を与えるために（最終パラメータ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、あらゆるＸ－アミノ酸についてφ角およびψ角での「ピッチ」を可能にし、これらの媒介変数方程式を使用することで、ループ構築プロセスと組み合わせて（最大／最小８アミノ酸）、標的構造中のコア要素の各々のサイズを随意に変更することが可能になり（サイズを拡大または縮小する）、コア要素のサイズが減少しても、ホットスポットが結合部位から除去されないようにした。第２世代の設計における２つ目の違いは、二次構造のコア要素を再連結する代わりに、７アミノ酸の断片サイズが使用され、２つ以上の断片のコンビナトリアルアセンブリが許容されなかったことである（すなわち、単一の断片で、二次構造の対を閉じることができるはずである）。残りの設計アルゴリズムは、本質的に、第１世代で採用されたものと同様であった。使用されたＲｏｓｅｔｔａ（商標）エネルギー関数は、第１世代および第２世代の設計でそれぞれ、「ｔａｌａｒｉｓ２０１３」および「ｔａｌａｒｉｓ２０１４」であった。
デノボ模倣体の骨格設計に使用される非常に理想的な断片のデータベースは、ＲＣＳＢタンパク質データバンクから公開されている非重複性のタンパク質構造の広範なデータベースを使用して、新しいＲｏｓｅｔｔａ（商標）アプリケーション「ｋｃｅｎｔｅｒｓ＿ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ＿ｏｆ＿ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」で構築され、これは、第１世代の設計に使用される４－ｍｅｒデータベース用の１６７６７ＰＤＢ、および第２世代設計に使用される７－ｍｅｒデータベース用の７０６２ＰＤＢで構成された。
酵母ディスプレイ：酵母を、線状化ｐＥＴｃｏｎ３ベクターと一緒に、ディスプレイ用のタンパク質をコードする遺伝子で形質転換した。ベクターを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による１００倍の過剰消化によって線状化し、次いで、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。遺伝子は、５’および３’末端の両方に、ベクターとの５０塩基の重複を含み、相同組換えによって、遺伝子が、ベクター上のＡＧＡ２遺伝子とｍｙｃタグとの間に、インフレームで配置されるようにした。前述のように、酵母を、Ｃ－Ｔｒｐ－Ｕｒａ培地で増殖させた後、ＳＧＣＡＡ培地で誘導した。誘導の１２～１８時間後、細胞を冷やしたディスプレイ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ）で洗浄し、４℃で撹拌しながら、様々な濃度のビオチン化受容体（ヒトあるいはマウスＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、またはヒトＩＬ－４Ｒα）とともにインキュベーションした。約３０分後、細胞を冷やした緩衝液中で再度洗浄し、次いでＦＩＴＣと結合した抗ｃ－Ｍｙｃ抗体（３×１０６細胞あたり１ｕＬ）およびストレプトアビジン－フィコエリトリン（酵母１００μＬ体積当たり１μＬ）とともに、氷上で５分間インキュベーションした。次に、酵母を洗浄し、フローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６）で計数するか、またはＦＡＣＳ（Ｓｏｎｙ ＳＨ８００）で選別した。最初の受容体インキュベーションが、ビオチン化ＩＬ－２Ｒγと非ビオチン化ＩＬ－４Ｒαとの組み合わせで行った実験では、非ビオチン化受容体が、モル過剰で提供された。
変異誘発および親和性成熟：エラープローンＰＣＲに基づく変異誘発の場合、変異させる設計をｐＥＴｃｏｎ３ベクターにクローニングし、ＭｕｔａＧｅｎｅ（商標）ＩＩ変異誘発キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の指示に従って使用して増幅し、ヌクレオチドあたり約１％の変異頻度を得た。１μｇのこの変異遺伝子を、１μｇの線状化ｐＥＴｃｏｎ３ベクターとともに、１０８程度の形質転換効率で、ＥＢＹ１００酵母にエレクトロポレーションした。酵母を、集団が収束するまで、受容体の濃度を徐々に減少させながら、連続して複数回誘導および選別した。各選別間で、酵母を、Ｃ－Ｔｒｐ－Ｕｒａ培地で再増殖させた。
部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）ライブラリーは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔの合成ＤＮＡから構築された。各設計テンプレートの各アミノ酸について、ＰＣＲ増幅で、縮重ＮＮＫコドンを含む５’ＰＣＲ産物、および３’ＰＣＲ産物がそれぞれもたらされるように、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを設計した。ＣＯＦおよびＣＯＲプライマーによる「左」および「右」産物の増幅から、一連のテンプレート産物が得られ、それぞれ、異なる残基位置での縮重ＮＮＫコドンからなっていた。各設計について、これらの産物をプールして、ＳＳＭライブラリーを得た。ＳＳＭライブラリーは、Ｂｅｎａｔｕｉｌらによって前述されたプロトコルを使用して、線状化ｐＥＴＣＯＮ３ベクターとともに、調整されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のＥＢＹ１００細胞にエレクトロポレーションすることによって、形質転換された。
コンビナトリアルライブラリーは、多義ヌクレオチドを含むＧｅｎｓｃｒｉｐｔの合成ＤＮＡから構築され、同様に、線状化ｐＥＴＣＯＮ３ベクターに形質転換された。
タンパク質発現：設計されたタンパク質配列をコードする遺伝子を合成し、ｐＥＴ－２８ｂ（＋）Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド発現ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｎ末端６ｘＨｉｓタグおよびトロンビン切断部位）にクローニングした。次いで、プラスミドを化学的に形質転換受容性のあるＥ．ｃｏｌｉ Ｌｅｍｏ２１細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（商標）およびＭ塩を使用してタンパク質発現を実施し、ＯＤ６００が約０．８に達するまで培養物を３７℃で増殖させた後、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で発現を誘導し、温度を１８℃に下げた。約１８時間の発現後、細胞を採取し、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ１１０Ｐマイクロフルイダイザを用いて、１８，０００ｐｓｉで溶解した後、２４，０００ｇで２０分間遠心分離して可溶性画分を清澄化した。可溶性画分は、固定化金属親和性クロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）、続いてＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ １０／３００ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。精製されたｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５は、溶液における化学種の分子量の質量分析（ＭＳ）検証（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、単量体状態および分子量を検証するためのサイズ排除－多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗｙａｔｔ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ならびにエンドトキシンレベル（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）によって特徴づけられた。
ｈＩＬ－２（アミノ酸１～１３３）、ｈＩＬ－２Ｒα（アミノ酸１～２１７）、ｈＩＬ－２Ｒβ（アミノ酸１～２１４）、ｈＩＬ－２Ｒγ（アミノ酸１～２３２）、ｍＩＬ－２（アミノ酸１～１４９）、ＭＩＬ－２Ｒα細胞外ドメイン（アミノ酸１～２１３）、ｍＩＬ－２Ｒβ細胞外ドメイン（アミノ酸１～２１５）、およびｍγＣ細胞外ドメイン（アミノ酸１～２３３）を含むヒトおよびマウスのＩＬ－２複合体成分は、先に１７，４９記載したように、バキュロウイルス発現系を使用して分泌および精製された。全てのタンパク質は、ＨＢＳで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００サイジングカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて＞９８％の均一性まで精製された。純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって確認した。ビオチン化ヒトＩＬ－２およびマウスＩＬ－２受容体サブユニットの発現のために、Ｃ末端ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）－ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号３０３）を含むタンパク質を、記載のとおり、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーにより発現および精製し、次に、可溶性ＢｉｒＡリガーゼ酵素を含む０．５ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ ｐＨ８．３、１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、および５００ｍＭビオチン（Ｓｉｇｍａ）でビオチン化した。過剰なビオチンは、ＨＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。
円二色性（ＣＤ）：遠紫外ＣＤ測定は、ＡＶＩＶ分光計モデル４２０を用いて、１ｍｍ光路長のキュベット内のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で、約０．２０ｍｇ／ｍｌ（本文で別段に明記しない限り）のタンパク質濃度で行った。２５～９５℃の温度で融解し、２２２ｎｍで吸収シグナルをモニタリングした（２℃／分のステップ、ステップごとに３０秒の平衡化）。波長スキャン（１９５～２６０ｎｍ）を、２５℃および９５℃で収集し、急速リフォールディング後（約５分）、２５℃で再収集した。
ＳＴＡＴ５リン酸化研究：インビトロ研究：約２ｘ１０５ＹＴ－１、ＩＬ－２Ｒα＋ＹＴ－１、またはＣＴＬＬ－２細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、ｈＩＬ－２、ｍＩＬ－２、Ｓｕｐｅｒ－２、または改変ＩＬ－２模倣体の段階希釈を含むＲＰＭＩ完全培地に再懸濁した。細胞を３７℃で１５分間刺激し、ホルムアルデヒドを１．５％まで添加し、室温で１０分間インキュベーションすることにより、即時固定する。細胞の透過処理は、氷冷１００％メタノールに４℃で３０分間再懸濁することで達成される。固定および透過処理した細胞をＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］ｐＨ７．２）で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と結合した抗ＳＴＡＴ５ ｐＹ６９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２時間室温でインキュベーションする。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）でＭＦＩを測定した。用量反応曲線をロジスティックモデルに適合させ、最大半量有効濃度（ＥＣ５０値）を、刺激されていない細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を差し引き、最大シグナル強度に正規化した後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍデータ分析ソフトウェアを使用して計算する。実験は３回行われ、３回実施され、同様の結果である。エクスビボ研究：脾臓およびリンパ節を野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＢ６、１２９Ｓ４－Ｉｌ２ｒａｔｍ１Ｄｗ（ＣＤ２５ＫＯ）マウスから採取し、選別緩衝液（２％ウシ胎児血清を含むｐＨ７．２リン酸緩衝生理食塩水）で単一細胞懸濁液にする。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞懸濁液をビオチン結合抗Ｂ２２０、ＣＤ８、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｔｅｒ１１９、およびＣＤ１９抗体で１：１００に氷上で３０分間染色することによるネガティブ選択によって濃縮される。選別緩衝液で洗浄後、抗ビオチンマイクロビーズ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を１０７個の全細胞あたり２０μＬで細胞懸濁液に添加し、２０分間氷上でインキュベーションする。細胞を洗浄し、再懸濁した後、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マグネット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してネガティブ選択を実施する。約１ｘ１０５の濃縮細胞を、ｍＩＬ－２、Ｓｕｐｅｒ－２、またはＮｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５の１０倍段階希釈液と５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ完全培地の９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で２０分間刺激し、４％ＰＦＡで固定し、４℃で３０分間インキュベーションする。固定後、細胞を採取し、選別緩衝液で２回洗浄し、透過処理のために氷上で３０分間９０％氷冷メタノールを含むｄＨ２Ｏ５００μＬで再度固定する。細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、抗ＣＤ４－ＰｅｒＣＰを含むＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（１：３００）、抗ＣＤ４４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００（１：２００）、抗ＣＤ２５－ＰＥ－Ｃｙ７（１：２００）および抗ｐＳＴＡＴ５－ＰＥ ｐＹ６９４の試料あたり５μＬで室温、暗所で４５分間染色する。細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈで洗浄し、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析するために選別緩衝液に再懸濁する。
データ表
Figure 2022511390000211
Figure 2022511390000212
Figure 2022511390000213
Figure 2022511390000214
Figure 2022511390000215
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Figure 2022511390000217
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Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５－Ｈ８Ｙ－Ｋ３３ＥのＩＬ２受容体への結合を、バイオレイヤー干渉法によって測定したところ、ＩＬ２Ｒベータ単独に対して試験した場合と、ＩＬ２Ｒベータ－ガンマ複合体に対して試験した場合との両方で、ＩＬ２－Ｒベータに対して、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２よりも結合親和性が高いことがわかった。この親和性の増加は、主に、ＩＬ２－Ｒベータからの解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）の改善に起因していた。
Figure 2022511390000219
実施例２：標的免疫療法のための分割サイトカイン模倣体
デノボタンパク質は、理想的なタンパク質構造の規則に従って設計されており、極端な熱安定性や変異堅牢性などの稀な生化学的特性を提供する。したがって、デノボ設計されたタンパク質は、条件付きで活性なタンパク質治療薬の開発に使用する理想的な候補である。ここでは、最近開発されたデノボ設計されたＩＬ－２模倣タンパク質であるＮｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５に基づいて、高度に標的化された免疫療法のための分割サイトカイン模倣体の開発について報告する。このシステムは、標的細胞の表面に共存することによって、活性を再構成する条件付きで活性な治療用タンパク質の送達を可能にする。潜在的な分割部位を特定し、ＩＬ－２受容体への結合、細胞シグナル伝達、および標的腫瘍細胞の表面での共存依存性活性化により、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５活性の再構成の成功を実証した。また、別のデノボ設計されたサイトカイン模倣体であるＮｅｏｌｅｕｋｉｎ－４へのこの適用も実証する。
Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５（Ｎｅｏ２）の潜在的な分割部位を特定するために、タンパク質の構造を評価して、タンパク質の機能に及ぼす有害な影響を最小限にする分割位置を見出した。その結果、３つの例示的な分割位置を定義した。（ｉ）らせん要素Ｈ１（Ｎｅｏ２Ａ１）とＨ３’－Ｈ２－Ｈ４（Ｎｅｏ２Ｂ１）の間、（ｉｉ）らせん要素Ｈ１－Ｈ３’（Ｎｅｏ２Ａ２）とＨ２－Ｈ４（Ｎｅｏ２Ｂ２）の間、（ｉｉｉ）らせん要素Ｈ１－Ｈ３’－Ｈ２（Ｎｅｏ２Ａ３）とＨ４（Ｎｅｏ２Ｂ３）の間（図１５）。分割Ｎｅｏ２断片は、ヒトＩＬ－２受容体への結合能力（図１５）およびＩＬ－２応答性ＣＴＴＬ－２細胞でのシグナル伝達（図１６）を分析することによって特性評価された。個々の分割断片では、ほとんどの場合、ＩＬ－２Ｒβγへの結合およびシグナル伝達能力は無視できるほどであるが、相補的な分割断片の等モルの組み合わせでは強力な活性を示した。
分割－Ｎｅｏ２の開発により、タンパク質の共存依存性の再構成が可能になり、したがって分割－Ｎｅｏ２の条件付き活性化が可能になる。Ｎｅｏ２Ａ断片およびＮｅｏ２Ｂ断片の共存を可能にするために、最初に標的ドメインへの遺伝子融合を実施した（図１７）。Ｎｅｏ２Ａ１、Ｎｅｏ２Ａ２、およびＮｅｏ２Ａ３は、１５残基の可動性リンカー（ＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＳＧ、配列番号１００）によって、Ｈｅｒ２を標的として設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）のＣ末端に融合された。Ｎｅｏ２Ｂ１、Ｎｅｏ２Ｂ２、およびＮｅｏ２Ｂ３は、１５残基の可動性リンカー（ＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＳＧ、配列番号１００）によって、ＥＧＦＲを標的として設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）のＮ末端に融合された。次に、分割断片の組み合わせ後のＩＬ－２Ｒβγへの結合を再構成する能力を評価し、融合が分割Ｎｅｏ－２の再構成能力を妨害しなかったことを実証している（図１７）。
分割Ｎｅｏ２システムの共存依存性活性化および標的選択性を評価するために、改変Ｋ５６２細胞株の表面でＥＧＦＲおよびＨｅｒ２を標的とした分割Ｎｅｏ－２／１５を用いたインビトロアッセイを実施した（図１８ａ）。４つの改変細胞株を使用した。（ｉ）表面受容体なし、（ｉｉ）Ｈｅｒ２＋／ｅＧＦＰ＋、（ｉｉｉ）ＥＧＦＲ＋／ｉＲＦＰ＋、（ｉｖ）Ｈｅｒ２＋／ｅＧＦＰ＋ＥＧＦＲ＋／ｉＲＦＰ＋（図１８ｂ）。４つの細胞株を同等の比率で混合し、標的の分割Ｎｅｏ２断片と１５分間インキュベーションした。続いて、細胞を洗浄し、ビオチン化ＩＬ－２受容体および蛍光ストレプトアビジン－フィコエリトリン複合体（ＳＡＰＥ）の混合物とともにインキュベーションした。最後に、細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で分析した。Ｎｅｏ－２活性の再構成に成功すると、標的細胞の表面にＰＥによる蛍光標識がもたらされた（図１８ｃ）。完全Ｎｅｏ２が単一の抗Ｈｅｒ２標的ドメイン（ａＨｅｒ２－Ｎｅｏ２）で標的化された場合、Ｈｅｒ２＋およびＨｅｒ２＋／ＥＧＦＲ＋の表面に強いＩＬ－２受容体結合が観察された。Ｎｅｏ２Ａ１およびＮｅｏ２Ｂ１の分割断片が両方ともＨｅｒ２（ａＨｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ１＋ａＨｅｒ２－Ｎｅｏ２Ｂ１）を標的とした場合にも同様の結合が観察され、必要に応じて、両断片を同じ細胞表面マーカーに送達できたことを実証している。さらに、各分割断片がＨｅｒ２またはＥＧＦＲ（ａＨｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ１＋Ｎｅｏ２Ｂ１－ａＥＧＦＲ、ａＨｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ２＋Ｎｅｏ２Ｂ２－ａＥＧＦＲ、ａＨｅｒ２－Ｎｅｏ２Ａ３＋Ｎｅｏ２Ｂ３－ａＥＧＦＲ）のいずれかを標的とした場合、二重陽性Ｈｅｒ２＋／ＥＧＦＲ＋の表面で高度に選択的な再構成が観察された。さらなる研究により、分割Ｎｅｏ２断片の各組み合わせについて、Ｋ５６２細胞の表面でＩＬ－２受容体を動員できるためには、両断片が同時に存在する必要があることが実証された（図１９）。これらの結果は、特に標的細胞の表面で所望の活性を再構成するための分割サイトカイン模倣体の高い選択性を実証している。
分割サイトカイン模倣技術の適用は、腫瘍関連抗原を標的とすることに限定されない。所与の適用では、選択的に刺激される免疫細胞の特定のサブセットを標的にすることは、疾患を治療するために免疫応答を指揮するのに有益であろう。例えば、この適用は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、または改変ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を特異的に増大して抗腫瘍応答を増強するだけでなく、制御性Ｔ細胞を標的にして強力な免疫を抑制するのに役立つ（図２０ａ）。さらに、いくつかのシナリオでは、混合標的化アプローチを展開でき、すなわち、一方の分割断片は腫瘍細胞または腫瘍微小環境を標的とし、他方の断片を免疫細胞に送達する（図２０ｂ）。
最後に、ここに記載する方法論を他のデノボ設計されたインターロイキンに移行できることを実証するために、新しい条件付きで活性なＩＬ－４模倣体を創出した（図２１）。これを達成するために、ｈＩＬ－４アルファ受容体に結合するため、ｈＩＬ－２ベータ受容体への結合界面を変更する分割Ｎｅｏ－２に特定の変異を導入することに成功した。
実施例２で使用される例示的な分割Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－２／１５バリアントの配列
Ｈ１（Ｎｅｏ２Ａ１）ＰＫＫＫＩＱＬＨＡＥＨＡＬＹＤＡＬＭＩＬＮＩＶＫＴＮＳ（配列番号２５６）
Ｈ３－Ｈ２’－Ｈ４ Ｎｅｏ２Ｂ１）ＴＮＳＰＰＡＥＥＫＬＥＤＹＡＦＮＦＥＬＩＬＥＥＩＡＲＬＦＥＳＧＤＱＫＤＥＡＥＫＡＫＲＭＫＥＷＭＫＲＩＫＴＴＡＳＥＤＥＱＥＥＭＡＮＡＩＩＴＩＬＱＳＷＩＦＳ（配列番号２５７）
Ｈ１－Ｈ３－Ｈ２’Ｎｅｏ２Ａ３
ＰＫＫＫＩＱＬＨＡＥＨＡＬＹＤＡＬＭＩＬＮＩＶＫＴＮＳＰＰＡＥＥＫＬＥＤＹＡＦＮＦＥＬＩＬＥＥＩＡＲＬＦＥＳＧＤＱＫＤＥＡＥＫＡＫＲＭＫＥＷＭＫＲＩＫＴＴＡＳ（配列番号２５８）
Ｈ４（Ｎｅｏ２Ｂ３）ＴＴＡＳＥＤＥＱＥＥＭＡＮＡＩＩＴＩＬＱＳＷＩＦＳ（配列番号２５９）
Ｈ１－Ｈ３（Ｎｅｏ２Ａ２）ＰＫＫＫＩＱＬＨＡＥＨＡＬＹＤＡＬＭＩＬＮＩＶＫＴＮＳＰＰＡＥＥＫＬＥＤＹＡＦＮＦＥＬＩＬＥＥＩＡＲＬＦＥＳＧＤ（配列番号２６０）
Ｈ２’－Ｈ４（Ｎｅｏ２Ｂ２）ＤＱＫＤＥＡＥＫＡＫＲＭＫＥＷＭＫＲＩＫＴＴＡＳＥＤＥＱＥＥＭＡＮＡＩＩＴＩＬＱＳＷＩＦＳ（配列番号２６１）
実施例２で使用される例示的な分割Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ－４配列
Ｈ１ Ｎｅｏ４Ａ１）
Figure 2022511390000220
 Ｈ３－Ｈ２’－Ｈ４（別称Ｎｅｏ４Ｂ１）
Figure 2022511390000221
 実施例２で使用される例示構築物
Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－Ｚ２－Ｘ４－Ｅ０１＿ＥＧＦＲ＿ＤＡＲＰｉｎ
Figure 2022511390000222
 Ｇ３＿Ｈｅｒ２＿ＤＡＲＰｉｎ＿Ｘ１
Figure 2022511390000223
 Ｇ３＿Ｈｅｒ２＿ＤＡＲＰｉｎ＿Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－Ｚ３－Ｘ４
Figure 2022511390000224
 Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－Ｚ２－Ｘ４－Ｅ０１＿ＥＧＦＲ＿ＤＡＲＰｉｎ
Figure 2022511390000225
 Ｘ２－Ｚ２－Ｘ４－Ｅ０１＿ＥＧＦＲ＿ＤＡＲＰｉｎ
Figure 2022511390000226
 Ｘ４－Ｅ０１＿ＥＧＦＲ＿ＤＡＲＰｉｎ
Figure 2022511390000227
 Ｇ３＿Ｈｅｒ２＿ＤＡＲＰｉｎ＿Ｘ１－Ｚ１－Ｘ３
Figure 2022511390000228
 Ｇ３＿Ｈｅｒ２＿ＤＡＲＰｉｎ＿Ｘ１－Ｚ１－Ｘ３－Ｚ２－Ｘ２
Figure 2022511390000229

Claims (141)

  1. 第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分を含む、非天然の条件付きで活性な受容体アゴニストであって、前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチド成分が、融合タンパク質に存在せず、前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチド成分が、全体として、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、
    （ａ）Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000230
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ２が、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
    （ｃ）Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000231
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000232
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｉ）括弧内のアミノ酸残基が、存在するか、または存在しない場合があり、
    （ｉｉ）前記第１のポリペプチド成分が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの少なくとも１つを含むが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々を含まず、
    （ｉｉｉ）前記第２のポリペプチド成分が、前記第１のポリペプチド成分に存在しないＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々を含み、
    前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチド成分が、個々に活性な受容体アゴニストではなく、前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチドが相互作用して、ＩＬ－２受容体βγｃヘテロ二量体（ＩＬ－２Ｒβγｃ）、ＩＬ－４受容体αγｃヘテロ二量体（ＩＬ－４Ｒαγｃ）、ＩＬ－１３アルファ、またはＩＬ－４Ｒアルファ／ＩＬ１３Ｒアルファのヘテロ二量体の活性なアゴニストを形成する、条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  2. （ａ）Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000233
     の全長と、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ２が、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
    （ｃ）Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000234
     の全長と、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000235
     の全長と、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  3. （ａ）Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000236
     の全長と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ２が、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
    （ｃ）Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000237
     の全長と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000238
     の全長と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  4. （ａ）Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000239
     の全長と同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ２が、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
    （ｃ）Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000240
     の全長と同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000241
     の全長と同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  5. （ａ）Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000242
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000243
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000244
     （配列番号６の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  6. （ａ）Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000245
     の全長と、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000246
     の全長と、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000247
     の全長と、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  7. （ａ）Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000248
     の全長と、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000249
     の全長と、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000250
     の全長と、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  8. （ａ）Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000251
     の全長と、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000252
     の全長と、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000253
     の全長と、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  9. （ａ）Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000254
     の全長と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000255
     の全長と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000256
     の全長と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  10. Ｘ２が、少なくとも８アミノ酸の長さである、請求項１～９のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  11. Ｘ２が、ペプチド
    Figure 2022511390000257
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、括弧内のアミノ酸残基が、存在するか、または存在しない場合がある、請求項１～１０のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  12. （ｉ）Ｘ１が、残基７のＬ、残基８のＨ、残基１１のＨ、残基１４のＹ、残基１８のＭのうちの１、２、３、４、もしくは５つ全てを含み、付番は、任意の残基が存在することに基づいて配列番号４に対してなされ、かつ／または
    （ｉｉ）Ｘ３が、残基３のＤ、残基４のＹ、残基６のＦ、残基７のＮ、残基１０のＬ、残基１１のＩ、残基１３のＥ、もしくは残基１４のＥのうちの１、２、３、４、５、６、７もしくは８つ全てを含み、付番は、任意の残基が存在することに基づいて配列番号５に対してなされる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  13. （ｉｉｉ）Ｘ４が、残基１９のＩを含み、付番は、任意の残基が存在することに基づいて配列番号６に対してなされる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  14. Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000258
     と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000259
     と、その長さに沿って、少なくとも３７％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000260
     と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｉ）Ｘ１が、残基７のＩ、残基８のＴまたはＭ、残基１１のＥ、残基１４のＫ、および残基１８のＳを含み、
    （ｉｉ）Ｘ３が、残基３のＲ、残基４のＦ、残基６のＫ、残基７のＲ、残基１０のＲ、残基１１のＮ、残基１３のＷ、および残基１４のＧを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  15. Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000261
     と、その長さに沿って、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000262
     と、その長さに沿って、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000263
     と、その長さに沿って、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｉ）Ｘ１が、残基７のＩ、残基８のＴまたはＭ、残基１１のＥ、残基１４のＫ、および残基１８のＳを含み、
    （ｉｉ）Ｘ３が、残基３のＲ、残基４のＦ、残基６のＫ、残基７のＲ、残基１０のＲ、残基１１のＮ、残基１３のＷ、および残基１４のＧを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  16. Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000264
     と、その長さに沿って、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000265
     と、その長さに沿って、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000266
     と、その長さに沿って、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｉ）Ｘ１が、残基７のＩ、残基８のＴまたはＭ、残基１１のＥ、残基１４のＫ、および残基１８のＳを含み、
    （ｉｉ）Ｘ３が、残基３のＲ、残基４のＦ、残基６のＫ、残基７のＲ、残基１０のＲ、残基１１のＮ、残基１３のＷ、および残基１４のＧを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  17. Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000267
     と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000268
     と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000269
     と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｉ）Ｘ１が、残基７のＩ、残基８のＴまたはＭ、残基１１のＥ、残基１４のＫ、および残基１８のＳを含み、
    （ｉｉ）Ｘ３が、残基３のＲ、残基４のＦ、残基６のＫ、残基７のＲ、残基１０のＲ、残基１１のＮ、残基１３のＷ、および残基１４のＧを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  18. Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000270
     と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000271
     と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000272
     と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｉ）Ｘ１が、残基７のＩ、残基８のＴまたはＭ、残基１１のＥ、残基１４のＫ、および残基１８のＳを含み、
    （ｉｉ）Ｘ３が、残基３のＲ、残基４のＦ、残基６のＫ、残基７のＲ、残基１０のＲ、残基１１のＮ、残基１３のＷ、および残基１４のＧを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  19. （ｉｉｉ）Ｘ４が、残基１９のＦを含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  20. 参照ペプチドドメインに対するアミノ酸（ＡＡ）置換が、太字でマークされた３つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた２つ以下のアミノ酸残基で発生するか、太字でマークされた１つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされたアミノ酸残基で発生しない、請求項１～１９のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  21. 参照ペプチドドメインに対するアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  22. 配列番号４に関連するアミノ酸残基が以下からなる群から選択される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
    Figure 2022511390000273
  23. ７番目がＩであり、８番目がＭまたはＴであり、１１番目がＥであり、１４番目がＫであり、１８番目がＳである、請求項２２に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  24. ７番目がＩである、８番目がＭまたはＴである、１１番目がＥである、１４番目がＫである、および１８番目がＳである、のうちの１、２、３、４、または５つが該当しない、請求項２２に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  25. 配列番号５に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
    Figure 2022511390000274
  26. 配列番号５に対して１７または２０番目にシステイン置換を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  27. ３番目がＲであり、４番目がＦであり、６番目がＫであり、７番目がＲであり、１０番目がＲであり、１１番目がＮであり、１３番目がＷであり、１４番目がＧである、請求項２５または２６に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  28. ３番目がＲである、４番目がＦである、６番目がＫである、７番目がＲである、１０番目がＲである、１１番目がＮである、１３番目がＷである、および１４番目がＧである、のうちの１、２、３、４、５、６、７または８つ全てが該当しない、請求項２５または２６に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  29. 配列番号６に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
    Figure 2022511390000275
  30. 配列番号６に対して３番目にシステイン置換を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  31. １９番目がＩである、請求項３０または３１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  32. １９番目がＩではない、請求項３０または３１に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  33. Ｘ２が、
    Figure 2022511390000276
     と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  34. 配列番号７に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項１１または３３に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
    Figure 2022511390000277
  35. 配列番号７に対して、１、２、５、９、１２、または１６番目にシステイン置換を含む、請求項１１、３３、または３４に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  36. １１番目がＩである、請求項３４または３５に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  37. １１番目がＩではない、請求項３４または３５に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  38. （ｉ）前記第１のポリペプチド成分が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの１つを含み、前記第２のポリペプチド成分が、前記第１のポリペプチド成分に存在しないＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの３つを含み、または
    （ｉｉ）前記第１のポリペプチド成分が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの２つを含み、前記第２のポリペプチド成分が、前記第１のポリペプチド成分に存在しないＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの２つを含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  39. （ｉ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ１を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、
    （ｉｉ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ２を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を含み、
    （ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ３を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を含み、
    （ｉｖ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ４を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含み、
    （ｖ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ１およびＸ２を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ３およびＸ４を含み、
    （ｖｉ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ１およびＸ３を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ２およびＸ４を含み、
    （ｖｉｉ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ１およびＸ４を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ２およびＸ３を含み、
    （ｖｉｉｉ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ２およびＸ３を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ１およびＸ４を含み、
    （ｉｘ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ２およびＸ４を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ１およびＸ３を含み、
    （ｘ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ３およびＸ４を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ１およびＸ２を含み、
    （ｘｉ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ４を含み、
    （ｘｉｉ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ３を含み、
    （ｘｉｉｉ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ２を含み、または
    （ｘｉｖ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、前記第２のポリペプチドが、Ｘ１を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  40. （ａ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ１を含み、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を除外し、前記第２のポリペプチドが、Ｘ３－Ｚ１－Ｘ２－Ｚ２－Ｘ４を含み、Ｘ１を除外する融合タンパク質であり、
    （ｂ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ４を含み、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を除外し、前記第２のポリペプチドが、Ｘ１－Ｚ１－Ｘ３－Ｚ２－Ｘ２を含み、Ｘ４を除外する融合タンパク質であり、または
    （ｃ）前記第１のポリペプチドが、Ｘ１－Ｚ１－Ｘ３を含み、Ｘ２およびＸ４を除外する融合タンパク質であり、前記第２のポリペプチドが、Ｘ２－Ｚ１－Ｘ４を含み、Ｘ１およびＸ３を除外する融合タンパク質であり、
    Ｚ１およびＺ２のそれぞれが、独立して、任意のアミノ酸リンカーである、請求項１～３９のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  41. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４がそれぞれ、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が、存在するか、または存在しない場合がある、請求項１～４０のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
    Figure 2022511390000278
  42. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、以下に示される第１および第２のポリペプチドの１対と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む（下線付き残基または「Ｘ」残基は任意であり、存在する場合、任意のドメインの各残基は、任意のアミノ酸を含み得る）、請求項１～４１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
    （ｉ）
    第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ２Ａ）
    Figure 2022511390000279
     および
    第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ２Ｂ）
    Figure 2022511390000280
     （ｉｉ）
    第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３－Ｘ２’
    Figure 2022511390000281
     および
    第２のポリペプチドＸ４
    Figure 2022511390000282
     （ｉｉｉ）
    第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３
    Figure 2022511390000283
     および
    第２のポリペプチドＸ２－Ｘ４
    Figure 2022511390000284
     （ｉｖ）
    第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ４Ａ）
    Figure 2022511390000285
     第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ４Ｂ）
    Figure 2022511390000286
     （ｖ）
    第１のポリペプチドＸ１
    Figure 2022511390000287
     および
    第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４
    Figure 2022511390000288
     （ｖｉ）
    第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３－Ｘ２’
    Figure 2022511390000289
     および
    第２のポリペプチドＸ４
    Figure 2022511390000290
     （ｖｉｉ）
    第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３
    Figure 2022511390000291
     および
    第２のポリペプチドＸ２－Ｘ４
    Figure 2022511390000292
     （ｖｉｉｉ）
    第１のポリペプチドＸ１
    Figure 2022511390000293
     第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４
    Figure 2022511390000294
     （ｉｘ）
    第１のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｘ１－Ｘ３’
    Figure 2022511390000295
     第２のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｘ２－Ｘ４
    Figure 2022511390000296
     （ｘ）
    第１のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｘ１－Ｘ３’
    Figure 2022511390000297
     第２のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｘ２－Ｘ４
    Figure 2022511390000298
     （ｘｉ）
    第１のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｘ１－Ｘ３’－Ｘ２
    Figure 2022511390000299
     第２のポリペプチドＮｅｏ４Ｘ４
    Figure 2022511390000300
     （ｘｉｉ）
    第１のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｘ１－Ｘ３’－Ｘ２
    Figure 2022511390000301
     第２のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｘ４
    Figure 2022511390000302
     （ｘｉｉｉ）
    第１のポリペプチド（Ｘ１）
    Figure 2022511390000303
     第２のポリペプチド（Ｘ３－Ｘ２’－Ｘ４）
    Figure 2022511390000304
  43. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４がそれぞれ、配列番号１１～９４、１９０～２１６、２４７、および配列番号２７５～３００のアミノ酸配列内に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメイン（表１に定義される）と、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  44. 前記第１のポリペプチド成分および／または前記第２のポリペプチド成分が、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  45. 前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチド成分が、非共有結合である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  46. 前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチド成分が、受容体を介して互いに間接的に結合している、請求項１～４４のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  47. 前記第１のポリペプチド成分が、第１の標的ドメインをさらに含むか、または前記第２のポリペプチド成分が、第２の標的ドメインをさらに含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  48. 前記第１のポリペプチド成分が、第１の標的ドメインをさらに含み、かつ前記第２のポリペプチド成分が、第２の標的ドメインをさらに含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  49. 前記第１の標的ドメインが、存在する場合、前記第１のポリペプチドとの翻訳融合物であり、前記第２の標的ドメインが、存在する場合、前記第２のポリペプチドとの翻訳融合物である、請求項４７または４８に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  50. 前記第１の標的ドメインおよび前記第２の標的ドメインが共に存在し、前記第１の標的ドメインおよび前記第２の標的ドメインが、同一である、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  51. 前記第１の標的ドメインおよび前記第２の標的ドメインが共に存在し、前記第１の標的ドメインおよび前記第２の標的ドメインが異なる、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  52. 前記第１の標的ドメインおよび／または前記第２の標的ドメインが、細胞表面タンパク質にそれぞれ結合する、請求項４７～５１のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  53. 前記細胞表面タンパク質が、腫瘍細胞、血管成分、腫瘍微小環境（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）、他のがん細胞および免疫細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）からなる群から選択される細胞の表面に存在し、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５４、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＴＬＡ－４を含むが、これらに限定されない免疫細胞表面マーカーである、請求項５２に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  54. 前記第１の標的ドメインおよび前記第２の標的ドメインが、腫瘍細胞、腫瘍血管成分細胞、または腫瘍微小環境細胞の表面マーカーにそれぞれ結合する、請求項５２または５３に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  55. 前記腫瘍細胞、血管成分細胞、または腫瘍微小環境細胞の表面マーカーが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＴＲＯＰ２、ＲＯＲ１、ＲＯＮ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－ＤＣ、ＨＬＤ－ＤＲ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ－７２、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、葉酸結合タンパク質、Ａ３３、Ｇ２５０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、フェリチン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、Ｌｅｙ、ＣＡ－１２５、ＣＡ１９－９、上皮成長因子、ｐ１８５ＨＥＲ２、ＩＬ－２受容体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ）、線維芽細胞活性化タンパク質、テネイシン、メタロプロテイナーゼ、エンドシアリン、血管内皮成長因子、ａｖＢ３、ＷＴ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、ＰＲ１、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロンシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点タンパク質、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、フコシルＧＭ１、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａｌ、ｓＬｅ（動物）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＶ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳＬ***タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ １、レグマイン、Ｔｉｅ３、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＰＤＧＦＲ－Ｂ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＲＯＲ２、ＴＲＡＩＬ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｃ２、ＧＡＧＥ、ＥＧＦＲ、ＣＭＥＴ、ＨＥＲ３、ＭＵＣ１５、ＣＡ６、ＮＡＰＩ２Ｂ、ＴＲＯＰ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬｏｒｆ１８６、ＲＯＮ、ＬＹ６Ｅ、ＦＲＡ、ＤＬＬ３、ＰＴＫ７、ＳＴＲＡ６、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＥＭ２３８、ＵＰＫ１Ｂ、ＶＴＣＮ１、ＬＩＶ１、ＲＯＲ１、Ｆｏｓ関連抗原１、ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体－ＩＢ型、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ．００１２０３）、Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ－００３４８６）、ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１２４４９）、０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ３６１４８６）、ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００５８２３）、Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質担体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００６４２４）、Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、ｓｅｍａドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型および１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０４０８７８）、ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、理研ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２、理研ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ３５８６２８）、ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ２７５４６３）、ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１７７６３）、ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ．ｓｕｂ．－－８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺がん関連遺伝子１、前立腺がん関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号．ＡＦ４５５１３８）、ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１７６３６）、ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形腫由来の成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００３２０３またはＮＭ００３２１２）、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２６００４）、ＣＤ７９ｂ（ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０００６２６）、ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ホスファターゼアンカータンパク質１ａを含むＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０３０７６４）、ＨＥＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０）、ＮＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１８７２８）、ＭＤＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＣ０１７０２３）、ＩＬ２０Ｒアルファ、（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１８４９７１）、ブレビカン（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２２９０５３）、Ｅｐｈｂ２Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００４４４２）、ＡＳＬＧ６５９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＸ０９２３２８）、ＰＳＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ２９７４３６）、ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ２６０７６３）、ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ４４３１７７．１）、ＣＤ２２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ－００１７６２．１）、ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９アルファ、免疫グロブリン関連アルファ、Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合的に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面で複合体を形成するＢ細胞特異的タンパク質は、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達する、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７７４．１）、ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化されるＧタンパク質共役型受容体は、リンパ球の遊走および体液性防御に機能し、ＨＩＶ－２感染、およびおそらくＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、白血病の発症に関与する、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７０７．１）、ＨＬＡ－ＤＯＢ（ペプチドに結合してＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００２１１１．１）、Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５、細胞外ＡＴＰによって開閉されるイオンチャネルは、シナプス伝達および神経新生に関与している可能性があり、欠乏は特発性排尿筋不安定性の病態生理学に寄与する可能性がある、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００２５５２．２）、ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７７３．１）、ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質は、Ｂ細胞の活性化およびアポトーシスを調節し、機能の喪失は全身性紅斑性狼瘡患者の疾患活動性の増加と関連している、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号．ＮＰ００５５７３．１）、ＦＣＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１、Ｃ２型Ｉｇ様およびＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインの推定受容体は、Ｂリンパ球の分化に関与している可能性がある、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ４４３１７０．１）、またはＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２、Ｂ細胞の発達およびリンパ腫形成に関与すると推定される免疫受容体、転座による遺伝子の調節解除が一部のＢ細胞悪性腫瘍で生じる、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ１１２５７１．１）を含み得るが、これらに限定されない群から選択される、請求項５４に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  56. 前記第１の標的ドメインおよび／または前記第２の標的ドメインが、免疫細胞表面マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）に結合し、前記免疫細胞表面マーカーが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５４、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＴＬＡ－４を含み得るが、これらに限定されず、かつ／または前記標的ドメインが、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＲＯＰ２、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ３３、ＣＤ２２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ１２３、ネクチン－４、組織因子抗原、ＣＤ１５４、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）またはＭＵＣ１６に結合する、請求項４７～５５のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  57. 前記第１の標的ドメインおよび前記第２の標的ドメインが、Ｔ細胞表面マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）にそれぞれ結合する、請求項５２または５３に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  58. 前記第１の標的ドメインまたは前記第２の標的ドメインのいずれかが、腫瘍細胞、血管成分細胞、または腫瘍微小環境細胞（例えば、線維芽細胞、浸潤免疫細胞、または間質要素）の表面マーカーに結合し、他の標的ドメインが、免疫細胞表面マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）に結合し、前記免疫細胞表面マーカーが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５４、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＴＬＡ－４を含み得るが、これらに限定されない、請求項５２または５３に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  59. 前記第１の標的ドメインおよび／または前記第２の標的ドメインが、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、モノボディ、ナノボディ、ダイアボディ、抗体（単一特異性または二重特異性の抗体を含む）を含み得るが、これらに限定されず、細胞標的化オリゴペプチドが、ＲＧＤインテグリン結合ペプチド、デノボ設計されたバインダー、アプタマー、二環ペプチド、コノトキシン、葉酸などの小分子、および前記細胞表面に結合するウイルスを含むが、これらに限定されない、請求項４７～５８のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  60. 前記第１の標的ドメインおよび／または前記第２の標的ドメインが、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、モノボディ、ナノボディ、ダイアボディ、および抗体（単一特異性または二重特異性の抗体を含む）を含み得るが、これらに限定されない、請求項４７～５８のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  61. Ｘ２が、
    Figure 2022511390000305
     と、その長さに沿って、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、括弧内の残基が任意である、請求項１～６０のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  62. Ｘ２が、
    Figure 2022511390000306
     と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、括弧内の残基が任意である、請求項１～６０のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  63. Ｘ２が、
    Figure 2022511390000307
     と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、括弧内の残基が任意である、請求項１～６０のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  64. ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうち、１、２、または３つを含むが、４つ全てを含まないポリペプチドであって、
    （ａ）Ｘ１が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000308
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ２が、存在する場合、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
    （ｃ）Ｘ３が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000309
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000310
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    括弧内のアミノ酸残基が、存在するか、または存在しない場合がある、ポリペプチド。
  65. （ａ）Ｘ１が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000311
     の全長と、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ２が、存在する場合、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
    （ｃ）Ｘ３が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000312
     の全長と、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000313
     の全長と、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項６４に記載のポリペプチド。
  66. （ａ）Ｘ１が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000314
     の全長と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ２が、存在する場合、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
    （ｃ）Ｘ３が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000315
     の全長と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000316
     の全長と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項６４に記載のポリペプチド。
  67. （ａ）Ｘ１が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000317
     の全長と同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｂ）Ｘ２が、存在する場合、任意のらせん形ペプチドドメインであり、
    （ｃ）Ｘ３が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000318
     の全長と同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000319
     の全長と同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項６４に記載のポリペプチド。
  68. （ａ）Ｘ１が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000320
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ３が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000321
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000322
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項６４に記載のポリペプチド。
  69. （ａ）Ｘ１が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000323
     の全長と、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ３が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000324
     の全長と、少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000325
     の全長と、少なくとも少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項６４に記載のポリペプチド。
  70. （ａ）Ｘ１が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000326
     の全長と、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ３が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000327
     の全長と、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000328
     の全長と、少なくとも少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項６８に記載のポリペプチド。
  71. （ａ）Ｘ１が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000329
     の全長と、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ３が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000330
     の全長と、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000331
     の全長と、少なくとも少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項６８に記載のポリペプチド。
  72. （ａ）Ｘ１が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000332
     の全長と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｃ）Ｘ３が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000333
     の全長と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
    （ｄ）Ｘ４が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000334
     の全長と、少なくとも少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項６８に記載のポリペプチド。
  73. Ｘ２が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000335
     の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が任意である、請求項６４～７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  74. Ｘ２が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000336
     の全長と、少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が任意である、請求項６４～７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  75. Ｘ２が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000337
     の全長と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が任意である、請求項６４～７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  76. Ｘ２が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000338
     の全長と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が任意である、請求項６４～７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  77. Ｘ２が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000339
     の全長と、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が任意である、請求項６４～７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  78. Ｘ２が、存在する場合、ペプチド
    Figure 2022511390000340
     の全長と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が任意である、請求項６４～７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  79. （ｉ）Ｘ１を含み、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を除外するポリペプチド、
    （ｉｉ）Ｘ２を含み、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を除外するポリペプチド、
    （ｉｉｉ）Ｘ３を含み、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を除外するポリペプチド、
    （ｉｖ）Ｘ４を含み、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を除外するポリペプチド、
    （ｖ）Ｘ１およびＸ２を含み、Ｘ３およびＸ４を除外するポリペプチド、
    （ｖｉ）Ｘ１およびＸ３を含み、Ｘ２およびＸ４を除外するポリペプチド、
    （ｖｉｉ）Ｘ１およびＸ４を含み、Ｘ２およびＸ３を除外するポリペプチド、
    （ｖｉｉｉ）Ｘ２およびＸ３を含み、Ｘ１およびＸ４を除外するポリペプチド、
    （ｉｘ）Ｘ２およびＸ４を含み、Ｘ１およびＸ３を除外するポリペプチド、
    （ｘ）Ｘ３およびＸ４を含み、Ｘ１およびＸ２を除外するポリペプチド、
    （ｘｉ）Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含み、Ｘ４を除外するポリペプチド、
    （ｘｉｉ）Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４を含み、Ｘ３を除外するポリペプチド、
    （ｘｉｉｉ）Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４を含み、Ｘ２を除外するポリペプチド、ならびに
    （ｘｉｖ）Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含み、Ｘ１を除外するポリペプチド、からなる群から選択される、請求項６４～７８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  80. 前記ポリペプチドが、Ｘ１を含み、Ｘ１が、残基７のＬ、残基８のＨ、残基１１のＨ、残基１４のＹ、残基１８のＭのうち、１、２、３、４、または５つ全てを含み、付番は、任意の残基が存在することに基づいて配列番号４に対してなされる、請求項６４～７９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  81. 前記ポリペプチドが、Ｘ３を含み、Ｘ３が、残基３のＤ、残基４のＹ、残基６のＦ、残基７のＮ、残基１０のＬ、残基１１のＩ、残基１３のＥ、または残基１４のＥのうち、１、２、３、４、５、６、７または８つ全てを含み、付番は、任意の残基が存在することに基づいて配列番号５に対してなされる、請求項６４～８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  82. 前記ポリペプチドが、Ｘ４を含み、Ｘ４が、残基１９のＩを含み、付番は、任意の残基が存在することに基づいて配列番号６に対してなされる、請求項６４～８１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  83. Ｘ１が存在し、Ｘ１が、ペプチド
    Figure 2022511390000341
     と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ１が、残基７のＩ、残基８のＴまたはＭ、残基１１のＥ、残基１４のＫ、および残基１８のＳを含む、請求項６４～７９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  84. Ｘ３が存在し、Ｘ３が、ペプチド
    Figure 2022511390000342
     と、その長さに沿って、少なくとも３７％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３が、残基３のＲ、残基４のＦ、残基６のＫ、残基７のＲ、残基１０のＲ、残基１１のＮ、残基１３のＷ、および残基１４のＧを含む、請求項６４～７９または８３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  85. Ｘ４が存在し、Ｘ４が、ペプチド
    Figure 2022511390000343
     と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項６４～７９、８４、または８４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  86. Ｘ４が、残基１９にＦを含む、請求項８５に記載のポリペプチド。
  87. 参照ペプチドドメインに対するアミノ酸（ＡＡ）置換が、太字でマークされた３つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた２つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされた１つ以下のアミノ酸残基で発生するか、または太字でマークされたアミノ酸残基で発生しない、請求項６４～８６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  88. 参照ペプチドドメインに対するアミノ酸置換が、保存的アミノ酸置換である、請求項６４～８７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  89. Ｘ１が存在し、配列番号４に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項６４～８８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
    Figure 2022511390000344
  90. ７番目がＩであり、８番目がＭまたはＴであり、１１番目がＥであり、１４番目がＫであり、１８番目がＳである、請求項８９に記載のポリペプチド。
  91. ７番目がＩである、８番目がＭまたはＴである、１１番目がＥである、１４番目がＫである、および１８番目がＳである、のうちの１、２、３、４、または５つが該当しない、請求項８９に記載のポリペプチド。
  92. Ｘ３が存在し、配列番号５に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項６４～９１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
    Figure 2022511390000345
  93. 配列番号５に対して、１７または２０番目にシステイン置換を含む、請求項９２に記載のポリペプチド。
  94. ３番目がＲであり、４番目がＦであり、６番目がＫであり、７番目がＲであり、１０番目がＲであり、１１番目がＮであり、１３番目がＷであり、１４番目がＧである、請求項９２または９３に記載のポリペプチド。
  95. ３番目がＲである、４番目がＦである、６番目がＫである、７番目がＲである、１０番目がＲである、１１番目がＮである、１３番目がＷである、および１４番目がＧである、のうちの１、２、３、４、５、６、７または８つ全てが該当しない、請求項９２または９３に記載のポリペプチド。
  96. Ｘ４が存在し、配列番号６に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項６４～９５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
    Figure 2022511390000346
  97. 配列番号６に対して、３番目にシステイン置換を含む、請求項９６に記載のポリペプチド。
  98. １９番目がＩである、請求項９５または９６に記載のポリペプチド。
  99. １９番目がＩではない、請求項９５または９６に記載のポリペプチド。
  100. Ｘ４が存在し、配列番号７に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項６４～９９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
    Figure 2022511390000347
  101. 配列番号７に対して、１、２、５、９、１２、または１６番目にシステイン置換を含む、請求項１００に記載のポリペプチド。
  102. １１番目がＩである、請求項１０１または１０１に記載のポリペプチド。
  103. １１番目がＩではない、請求項１００または１０１に記載のポリペプチド。
  104. 前記ポリペプチドが、以下に列挙される第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドと、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む（下線付き残基は任意であり、存在する場合、任意の各残基は、任意のアミノ酸を含み得る）、請求項６４～１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
    （ｉ）
    第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ２Ａ）
    Figure 2022511390000348
     および
    第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ２Ｂ）
    Figure 2022511390000349
     （ｉｉ）
    第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３－Ｘ２’
    Figure 2022511390000350
     第２のポリペプチドＸ４
    Figure 2022511390000351
     （ｉｉｉ）
    第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３
    Figure 2022511390000352
     および
    第２のポリペプチドＸ２－Ｘ４
    Figure 2022511390000353
     （ｉｖ）
    第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ４Ａ）
    Figure 2022511390000354
     第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ４Ｂ）
    Figure 2022511390000355
     （ｖ）
    第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ２Ａ）
    Figure 2022511390000356
     および
    第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ２Ｂ）
    Figure 2022511390000357
     （ｖｉ）
    第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３－Ｘ２’
    Figure 2022511390000358
     第２のポリペプチドＸ４
    Figure 2022511390000359
     （ｖｉｉ）
    第１のポリペプチドＸ１－Ｘ３
    Figure 2022511390000360
     および
    第２のポリペプチドＸ２－Ｘ４
    Figure 2022511390000361
     （ｖｉｉｉ）
    第１のポリペプチドＸ１（Ｎｅｏ４Ａ）
    Figure 2022511390000362
     第２のポリペプチドＸ３－Ｘ２’－Ｘ４（Ｎｅｏ４Ｂ）
    Figure 2022511390000363
     （ｉｘ）
    第１のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｘ１－Ｘ３’
    Figure 2022511390000364
     第２のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｘ２－Ｘ４
    Figure 2022511390000365
     （ｘ）
    第１のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｘ１－Ｘ３’
    Figure 2022511390000366
     第２のポリペプチド＞Ｎｅｏ４＿Ｘ２－Ｘ４
    Figure 2022511390000367
     （ｘｉ）
    第１のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｘ１－Ｘ３’－Ｘ２
    Figure 2022511390000368
     第２のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｘ４
    Figure 2022511390000369
     （ｘｉｉ）
    第１のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｘ１－Ｘ３’－Ｘ２
    Figure 2022511390000370
     第２のポリペプチドＮｅｏ４＿Ｘ４
    Figure 2022511390000371
     （ｘｉｉｉ）
    第１のポリペプチド（Ｘ１）
    Figure 2022511390000372
     第２のポリペプチド（Ｘ３－Ｘ２’－Ｘ４）
    Figure 2022511390000373
  105. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４が、存在する場合、配列番号１１～９４、１９０～２１６、２４７、および配列番号２７５～３００のアミノ酸配列内に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメイン（表１に定義される）と、それぞれ少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６４～１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  106. ポリペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む、請求項６４～１０５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  107. 前記ポリペプチドが、標的ドメインをさらに含む、請求項６４～１０６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  108. 前記標的ドメインが、前記ポリペプチドとの翻訳融合物である、請求項１０７に記載のポリペプチド。
  109. 前記標的ドメインが、細胞表面タンパク質に結合する、請求項１０８に記載のポリペプチド。
  110. 前記細胞表面タンパク質が、腫瘍細胞、血管成分、腫瘍微小環境（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）、他のがん細胞および免疫細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）からなる群から選択される細胞の表面に存在し、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５４、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＴＬＡ－４を含むが、これらに限定されない免疫細胞表面マーカーである、請求項１０９に記載のポリペプチド。
  111. 前記標的ドメインが、腫瘍細胞、血管成分細胞、または腫瘍微小環境細胞（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）の表面マーカーに結合する、請求項１０７～１１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  112. 前記腫瘍細胞、血管成分細胞、または腫瘍微小環境細胞（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）の表面マーカーが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＴＲＯＰ２、ＲＯＲ１、ＲＯＮ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－ＤＣ、ＨＬＤ－ＤＲ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ－７２、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、葉酸結合タンパク質、Ａ３３、Ｇ２５０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、フェリチン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、Ｌｅｙ、ＣＡ－１２５、ＣＡ１９－９、上皮成長因子、ｐ１８５ＨＥＲ２、ＩＬ－２受容体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ）、線維芽細胞活性化タンパク質、テネイシン、メタロプロテイナーゼ、エンドシアリン、血管内皮成長因子、ａｖＢ３、ＷＴ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、ＰＲ１、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロンシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点タンパク質、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、フコシルＧＭ１、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａｌ、ｓＬｅ（動物）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＶ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳＬ***タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、レグマイン、Ｔｉｅ３、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＰＤＧＦＲ－Ｂ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＲＯＲ２、ＴＲＡＩＬ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｃ２、ＧＡＧＥ、ＥＧＦＲ、ＣＭＥＴ、ＨＥＲ３、ＭＵＣ１５、ＣＡ６、ＮＡＰＩ２Ｂ、ＴＲＯＰ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬｏｒｆ１８６、ＲＯＮ、ＬＹ６Ｅ、ＦＲＡ、ＤＬＬ３、ＰＴＫ７、ＳＴＲＡ６、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＥＭ２３８、ＵＰＫ１Ｂ、ＶＴＣＮ１、ＬＩＶ１、ＲＯＲ１、Ｆｏｓ関連抗原１、ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体－ＩＢ型、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ．００１２０３）、Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ－００３４８６）、ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１２４４９）、０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ３６１４８６）、ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００５８２３）、Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質担体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００６４２４）、Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、ｓｅｍａドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型および１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０４０８７８）、ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、理研ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２、理研ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ３５８６２８）、ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ２７５４６３）、ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１７７６３）、ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ．ｓｕｂ．－－８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺がん関連遺伝子１、前立腺がん関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号．ＡＦ４５５１３８）、ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０１７６３６）、ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形腫由来の成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００３２０３またはＮＭ００３２１２）、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２６００４）、ＣＤ７９ｂ（ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０００６２６）、ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ホスファターゼアンカータンパク質１ａを含むＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０３０７６４）、ＨＥＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０）、ＮＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１８７２８）、ＭＤＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＣ０１７０２３）、ＩＬ２０Ｒアルファ、（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１８４９７１）、ブレビカン（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２２９０５３）、Ｅｐｈｂ２Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００４４４２）、ＡＳＬＧ６５９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＸ０９２３２８）、ＰＳＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ２９７４３６）、ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ２６０７６３）、ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ４４３１７７．１）、ＣＤ２２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ－００１７６２．１）、ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９アルファ、免疫グロブリン関連アルファ、Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合的に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面で複合体を形成するＢ細胞特異的タンパク質は、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達する、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７７４．１）、ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化されるＧタンパク質共役型受容体は、リンパ球の遊走および体液性防御に機能し、ＨＩＶ－２感染、およびおそらくＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、白血病の発症に関与する、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７０７．１）、ＨＬＡ－ＤＯＢ（ペプチドに結合してＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００２１１１．１）、Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５、細胞外ＡＴＰによって開閉されるイオンチャネルは、シナプス伝達および神経新生に関与している可能性があり、欠乏は特発性排尿筋不安定性の病態生理学に寄与する可能性がある、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００２５５２．２）、ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７７３．１）、ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質は、Ｂ細胞の活性化およびアポトーシスを調節し、機能の喪失は全身性紅斑性狼瘡患者の疾患活動性の増加と関連している、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号．ＮＰ００５５７３．１）、ＦＣＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１、Ｃ２型Ｉｇ様およびＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインの推定受容体は、Ｂリンパ球の分化に関与している可能性がある、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ４４３１７０．１）、またはＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２、Ｂ細胞の発達およびリンパ腫形成に関与すると推定される免疫受容体、転座による遺伝子の調節解除が一部のＢ細胞悪性腫瘍で生じる、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ１１２５７１．１）を含み得るが、これらに限定されない群から選択される、請求項１１１に記載のポリペプチド。
  113. 前記標的ドメインが、免疫細胞表面マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）に結合し、前記免疫細胞表面マーカーが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５４、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＴＬＡ－４を含み得るが、これらに限定されない、請求項１０７～１００のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  114. 前記標的ドメインが、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、モノボディ、ナノボディ、ダイアボディ、抗体（単一特異性または二重特異性の抗体を含む）を含み得るが、これらに限定されず、細胞標的化オリゴペプチドが、ＲＧＤインテグリン結合ペプチド、デノボ設計されたバインダー、アプタマー、二環ペプチド、コノトキシン、葉酸などの小分子、および前記細胞表面に結合するウイルスを含むが、これらに限定されない、請求項１０７～１１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  115. 請求項６４～１１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項１～６３のいずれか一項に記載の第１のポリペプチド成分もしくは第２のポリペプチド成分をコードする核酸。
  116. プロモーターに機能可能に連結された請求項１１５に記載の核酸を含む発現ベクター。
  117. 請求項１１５に記載の核酸および／または請求項１１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  118. 請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト、請求項６４～１１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１１５に記載の核酸、請求項１１６に記載の発現ベクター、または請求項１１７に記載の宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  119. がんを治療する方法であって、前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチド成分が前記腫瘍の細胞で相互作用して前記がんを治療する条件下で、それを必要とする対象に、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニストを投与することを含む、方法。
  120. 前記第１のポリペプチド成分が、第１の標的ドメインを含み、前記第２のポリペプチド成分が、第２の標的ドメインを含み、前記第１の標的ドメインが、第１の腫瘍細胞マーカーに結合し、前記第２の標的ドメインが、前記第１の腫瘍細胞マーカーと同じまたは異なり得る第２の腫瘍細胞マーカーに結合し、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、前記第１の標的ドメインが前記第１の腫瘍細胞マーカーに結合し、前記第２の標的ドメインが前記第２の腫瘍細胞マーカーに結合した後にのみ相互作用する、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記第１のポリペプチド成分が、第１の標的ドメインを含み、前記第２のポリペプチド成分が、第２の標的ドメインを含み、前記第１の標的ドメインが、腫瘍細胞マーカーに結合し、前記第２の標的ドメインが、免疫細胞マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）に結合し、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、前記第１の標的ドメインが前記腫瘍細胞マーカーに結合し、前記第２の標的ドメインが前記免疫細胞マーカーに結合した後にのみ相互作用する、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記第１のポリペプチド成分が、第１の標的ドメインを含み、前記第２のポリペプチド成分が、第２の標的ドメインを含み、前記第１の標的ドメインが、第１の免疫細胞マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）に結合し、前記第２の標的ドメインが、前記第１の免疫細胞マーカーと同じまたは異なり得る第２の免疫細胞マーカー（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）に結合し、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、前記第１の標的ドメインが前記第１の免疫細胞マーカーに結合し、前記第２の標的ドメインが前記第２の免疫細胞マーカーに結合した後にのみ相互作用する、請求項１２０に記載の方法。
  123. がんが、結腸がん、黒色腫、腎細胞がん、頭頸部扁平上皮がん、胃がん、尿路上皮がん、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝細胞がん、膵臓がん、メルケル細胞がん、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がん、およびマイクロサテライト不安定性、腫瘍の遺伝子変異数、ＰＤ－Ｌ１発現レベル、または免疫スコアアッセイ（ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒによって開発された）などの診断テストにより選択される任意の腫瘍型からなる群から選択される、請求項１１９～１２２に記載の方法。
  124. がんを治療するおよび／もしくは対象における免疫応答を調節するための薬剤として使用するための、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト、請求項６４～１１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１１５に記載の核酸、請求項１１６に記載の発現ベクター、または請求項１１７に記載の宿主細胞、または請求項１１８に記載の医薬組成物。
  125. 対象における免疫応答を調節する方法であって、前記対象に、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト、請求項６４～１１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１１５に記載の核酸、請求項１１６に記載の発現ベクター、または請求項１１７に記載の宿主細胞、または請求項１１８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  126. 前記免疫応答が、抗がん免疫応答、組織修復免疫応答、または創傷治癒免疫応答である、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記条件付きで活性な受容体アゴニスト、核酸、発現ベクター、宿主細胞、または医薬組成物が生体材料の成分として投与される、請求項１２５または１２６に記載の方法。
  128. 前記ＩＬ－２受容体または前記ＩＬ－４受容体を刺激する方法であって、前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチド成分が前記受容体で相互作用する条件下で、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニストを対象に投与することを含む、方法。
  129. 前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチドが相互作用し、ＩＬ－２受容体βγＣヘテロ二量体（ＩＬ－２ＲβγＣ）の活性なアゴニストを形成する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  130. 前記第１のポリペプチド成分および前記第２のポリペプチドが相互作用し、ＩＬ－４受容体αγＣヘテロ二量体（ＩＬ－４ＲαγＣ）、ＩＬ－１３アルファ、またはＩＬ－４Ｒアルファ／ＩＬ１３Ｒアルファのヘテロ二量体の活性なアゴニストを形成する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  131. 前記括弧内のアミノ酸残基が存在する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  132. 前記括弧内のアミノ酸残基が存在しない、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  133. 前記括弧内のアミノ酸残基が存在する、請求項６４～１１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  134. 前記括弧内のアミノ酸残基が存在しない、請求項６４～１１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  135. Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４がそれぞれ、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と、それぞれ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が、存在するか、または存在しない場合がある、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
    Figure 2022511390000374
  136. Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４がそれぞれ、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と、それぞれ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が、存在するか、または存在しない場合がある、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
    Figure 2022511390000375
  137. Ｘ２が、アミノ酸配列
    Figure 2022511390000376
     の全長と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が任意である、請求項１～６３、１３５、および１３６のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  138. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４がそれぞれ、表１に定義されるように、配列番号９０の１型または２型のアミノ酸配列内に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインと、それぞれ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～６３のいずれか一項に記載の条件付きで活性な受容体アゴニスト。
  139. Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４がそれぞれ、存在する場合、以下に示されるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインの全長と、それぞれ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が、存在するか、または存在しない場合がある、請求項６４～１１４、１３３、または１３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
    Figure 2022511390000377
  140. Ｘ２が、存在する場合、アミノ酸配列
    Figure 2022511390000378
     の全長と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、括弧内の残基が任意である、請求項６４～１１４、１３３、１３４または１３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  141. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４が、存在する場合、表１に定義されるように、配列番号９０の１型または２型のアミノ酸配列内に存在するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメイン（表１に定義される）と、それぞれ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である、請求項６４～１１４、１３３、１３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
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