JP2022180511A - 胎児ヘモグロビンの発現レベルを増加させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年10月27日に提出された中国特許出願20171102770
86の優先権を享有することを主張する。当該中国特許出願の開示内容は、その全体が引
用により本出願に取り込まれる。
率よく且つ安全に遺伝子修飾し、γグロビンと胎児ヘモグロビンの発現をアップレギュレ
ーションし、疾患を治療する目的を達成することを含む、サラセミアと鎌状赤血球貧血な
どの貧血疾患の治療に使用される細胞治療スキームに関する。
の遺伝的要因によって引き起こされる一組の溶血性貧血疾患である。遺伝的遺伝子欠陥に
より、ヘモグロビン内の一種または複数のグロビンペプチド鎖の合成が欠失したり不足し
たりして、貧血または溶血性病態が引き起こされる。ヘモグロビンを合成するグロビン鎖
の減少または欠失は、異常なヘモグロビン構造を引き起こしてしまい、このような異常な
ヘモグロビンを含有する赤血球は、変形能が低下し、寿命が短くなり、骨髄内でin s
itu溶血が発生する可能性があり、末梢血循環に入った後に脾臓などの臓器によって予
め破壊され、貧血、体内の鉄沈着、さらには異常な発達さえも引き起こされてしまう。異
なるグロビン鎖遺伝子変異の多様性と複雑さのため、グロビン欠失のタイプ、数、および
臨床症状の変動が非常に大きい。
る。グロビンペプチド鎖生成障害の種類により、α型、β型、δ型、δβ型に分けられる
。サラセミアは現在、世界で最も一般的な遺伝子欠陥の遺伝的疾患の一つである。統計に
よると、全世界の人口の4.83%に変異したグロビン遺伝子があり、その中には、1.
67%にα、βサラセミアヘテロ接合体が含まれ、それとともに、1.92%に鎌状赤血
球変異したヘモグロビンが含まれ、0.95%にヘモグロビンEが含まれ、0.29%に
ヘモグロビンCなどが含まれる。これによって疾患の症状を伴う異常ヘモグロビンを保有
する世界的な出生率は0.024%以上であり、これは一般的な遺伝子欠陥疾患である。
発症メカニズムは、βグロビンペプチド鎖の遺伝子変異に起因し、ほとんどの患者は点突
然変異であるが、少数の患者は大きいフラグメントの遺伝子欠失である。遺伝子欠失と特
定の点突然変異により、βグロビンペプチド鎖の一部の合成が完全に阻害される可能性が
あり、このタイプはβ0サラセミアと呼ばれる。少数の点突然変異により、β鎖の合成は
部分的に阻害され、それでもペプチド鎖合成の一部が保持され、このタイプはβ+サラセ
ミアと呼ばれる。組み合わせによって異なる臨床症状が示される可能性がある。β-サラ
セミア遺伝子変異には多くの種類が有し、統計によると、世界には300種類以上の遺伝
子異常が有し、100種類以上の変異点がすでに発見されており、現在中国国内臨床で2
8種類が報告されている。その中で、よく見られる変異は6種類あり、β41-42(-
TCTT欠失)は約45%を占め、IVS-II654(CからTへの点突然変異)は約
24%を占め、β17(AからTへの点突然変異)は約14%を占め、TATAボックス
-28(AからTへの点突然変異)は約9%を占め、B71-72(+A挿入変異)は約
2%を占め、β26(GからAへの点突然変異)は約2%を占める。
う一つはβ0とβ+サラセミアのダブルヘテロ接合体である。βグロビンペプチド鎖の生
成がほぼ完全に阻害されるため、体内ではβグロビン鎖を生成することができず、α鎖と
β鎖とからなる正常なヘモグロビンAの合成が減少または消失する。過剰なα鎖タンパク
質は赤血球内のγ鎖と結合してヘモグロビンFを形成することができるが、出生後、γ合
成はだんだん阻害される(ヘモグロビン鎖合成切り換えとも呼ばれる)ため、過剰なα鎖
は赤血球に沈着して封入体を形成し、赤血球膜の表面に付着する。これによって、赤血球
膜の特性が変化し、細胞が硬くなり、変形能が低下し、骨髄内で破壊されて「無効な造血
」になってしまう。サラセミアの一部の赤血球は骨髄で成長して成熟し、最終的に末梢血
循環に放出されることができるが、局所的な末梢微小循環(脾臓などの臓器)を通過する
と、変形能が低下するため、機械的な破壊を受けやすい。上記の理由により、患児は臨床
上で、出生時に無症状であるが、出生後、HbF(胎児ヘモグロビン)発現のため、且つ
赤血球の寿命が120日と長いため、多くの場合は6ヵ月後、γ鎖合成が生理学的に阻害
されることにより、ヘモグロビン鎖の合成がβ鎖に切り替えられると共に、遺伝子欠陥の
ためβ鎖が合成できず、細胞の病理学的な変化により破壊が増加し、慢性溶血性貧血を示
し、さらに骨髄構成の変化を引き起こす。治療中に繰り返して輸血する必要があり、これ
によってヘモジデリン沈着症が引き起こされ、重要な臓器機能に影響を与える。
ラセミアとの違いは、当該貧血症の変異部位が単一であることであり、これは、βグロビ
ンの単一の塩基変異により、正常なβ遺伝子の6番目のコドンがGAG(グルタミン酸を
コードする)からGTG(バリン)に変異したからである。変異ホモ接合体の状態では、
正常なαグロビンと異常なβグロビンは、HbSと呼ばれる四量体複合体を形成し、この
四量体は、酸素を持つ能力が正常なヘモグロビンの能力の半分であり、脱酸素状態で凝集
してポリマーになる。形成されたポリマーの配向方向は、膜と平行で細胞膜に緊密に接触
しているため、ポリマーの数がある程度になると、細胞膜は通常の凹型から鎌型に変える
。鎌状赤血球は変形能に乏しく、破砕しやすくて溶血を起こし、血管の閉塞、損傷、壊死
などを引き起こす。
的な除鉄療法、造血幹細胞移植、胎児ヘモグロビン誘発薬物療法、および探索的遺伝子療
法が含まれる。現在、すべての治療法の中で唯一の治癒希望のある方法は同種造血幹細胞
移植である。トーマスが1981年にサラセミア患者に初の造血幹細胞移植を行って成功
を収めて以来、世界中の複数のサラセミア研究センターで造血幹細胞移植技術が使用され
、しかも従来の輸血と除鉄治療法を成功的に置き換えた。しかし、HLAの完全に一致す
るドナーが非常に足りなく、且つ移植後のGVHD(graft-versus-hos
t disease、移植片対宿主病)による死亡のため、サラセミア治療における造血
幹細胞移植の広範な適用はまだ制限されている。これと同時に、研究者はサラセミアの治
療のための薬剤を持続的に研究している。現在、FDAによって唯一に承認された臨床治
療のための経口薬はヒドロキシウレアであり、主に胎児ヘモグロビンの発現を誘発するこ
とで疾患の臨床症状を緩和するが、この薬剤の臨床効果は一貫的ではなく、しかも大きな
副作用があり、並びに用量関連の骨髄阻害があるため、β-サラセミアと鎌状赤血球貧血
などの関連貧血疾患を治療するための新しい治療法の開発が緊急である。
ル文章または要約、公開済みまたは未公開の特許出願、登録した特許、メーカーの仕様書
、プロトコルなどを含む)は言及により本文に取り込まれる。しかしながら、ここに引用
された文献が実際に本発明の既存技術であると認めるわけではない。
新世帯の造血幹細胞を開発した。既存技術による造血幹細胞と比べて、この造血幹細胞は
、BCL11Aエンハンサーの遺伝子ノックアウト効率が大幅に増加し、これにより、分
化成熟後の赤血球の胎児ヘモグロビンの発現が大幅に増加し、既存技術におけるBCL1
1Aエンハンサーの編集効率が低く、胎児ヘモグロビンの発現が臨床適用を満たせないと
いう問題をある程度で解決した。また、本発明は、遺伝子編集後の造血幹細胞の培養およ
び分化の策略をさらに改善し、造血幹細胞から成熟赤血球への分化プロセスを大幅に短縮
するだけでなく、採取した成熟赤血球の数をも大幅に増加させ、これによって臨床適用の
要件を一部満たすことができる。
1.ヒト造血幹細胞の2番染色体の60495219番目から60495336番目の
BCL11Aのゲノム領域を遺伝子編集技術によって破壊することを含む、
ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン(HbF)の発現を増加させる方法。
2.前記遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、
TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR/Cas遺伝子編集技術である、項1に記
載の方法。
3.前記遺伝子編集技術がCRISPR/Cas9遺伝子編集技術である、項2に記載
の方法。
4.前記BCL11Aゲノムの標的ヌクレオチド配列は、配列番号3~配列番号25か
ら選択されるいずれか一つの配列と相補的である、項1~3のいずれか一項に記載の方法
。
5.前記BCL11Aゲノムの編集を実現するように、配列番号3~配列番号25から
選択されるいずれか一つの配列を含むsgRNAを前記造血幹細胞に導入することを含む
、項3または4に記載の方法。
6.前記sgRNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオ
により修飾されたものである、項5に記載の方法。
7.前記化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及び/または3
つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体による修飾
である、項6に記載の方法。
8.前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞
に導入する、項3~7のいずれか一項に記載の方法。
9.前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチドとをエレクトロポレーショ
ンによって一緒に前記造血幹細胞に導入する、項8に記載の方法。
10.前記エレクトロポレーションの条件は、200~600V、0.5~2msであ
る、項9に記載の方法。
-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾されたsgRNAを造血
幹細胞に導入することを含む、CRISPR/Cas9システムを介してインビトロで造
血幹細胞を効率的に編集する方法。
12.前記sgRNAとCas9をコードするヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞
に導入する、項11に記載の方法。
13.sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチドとをエレクトロポレーション
によって一緒に前記造血幹細胞に導入する、項12に記載の方法。
14.前記エレクトロポレーションの条件は、200~600V、0.5~2msであ
る、項13に記載の方法。
15.項1~14のいずれか一項に記載の方法によって得られた造血幹細胞。
16.胎児ヘモグロビン(HbF)の発現が遺伝子改変によって増加したヒト造血幹細
胞であって、前記造血幹細胞の2番染色体の60495219番目から60495336
番目のBCL11Aゲノム領域における一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊さ
れた、胎児ヘモグロビン(HbF)の発現が遺伝子改変によって増加したヒト造血幹細胞
。
17.項15または16に記載の造血幹細胞を分化培養することにより得られた、成熟
赤血球になる前の分化の異なる段階にある前駆細胞。
18.項15または16に記載の造血幹細胞を分化培養することにより得られた成熟赤
血球。
19.胎児ヘモグロビン(HbF)の発現が遺伝子改変によって増加した成熟赤血球ま
たはその前駆細胞を製造する方法であって、
(a)項1~14のいずれか一項に記載の方法を使用して遺伝子改変された造血幹細胞
を得ることと、
(b)造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地を使用して、前記遺伝子改変された造血
幹細胞に対して造血幹細胞の赤血球系増殖および分化を行うこととを含み、
前記造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地は、基礎培地と、成長因子組成物とを含み
、前記成長因子組成物は、幹細胞成長因子(SCF)、インターロイキン3(IL-3)
、およびエリスロポエチン(EPO)を含む、方法。
20.赤血球系分化脱核培地を使用して造血幹細胞の赤血球分化および脱核を行うこと
をさらに含み、
前記赤血球分化脱核培地は、基礎培地、成長因子、およびプロゲステロン受容体とグル
ココルチコイド受容体の拮抗薬および/または阻害剤を含む、
項19に記載の方法。
み、前記プロゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬および/または阻害
剤は、下記化合物(I)~(IV)から選択されるいずれか1つまたは2つ以上である、
項20に記載の方法。
23.項15または16に記載の造血幹細胞、若しくは項17または22に記載の前駆
細胞、若しくは項18または22に記載の成熟赤血球を含む、組成物。
24.項15または16に記載の造血幹細胞、若しくは項17または22に記載の前駆
細胞、若しくは項18または22に記載の成熟赤血球を含む、医療製品。
25.項15または16に記載の造血幹細胞、若しくは請求項17または22に記載の
前駆細胞、若しくは項18または22に記載の成熟赤血球の、それの必要がある被験者の
疾患の予防または治療における使用。
26.前記疾患が貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の
輸血を必要とする他の疾患である、項25に記載の使用。
27.前記疾患はβ-サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、請求項26に記載の使
用。
28.前記被験者はヒトである、請求項25~27のいずれか一項に記載の使用。
29.被験者の疾患を予防または治療するための薬剤または医療製品の調製における、
項15または16に記載の造血幹細胞、若しくは項17または22に記載の前駆細胞、若
しくは項18または22に記載の成熟赤血球の使用。
30.前記疾患が貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の
輸血を必要とする他の疾患である、項29に記載の使用。
32.前記被験者はヒトである、項29~31のいずれか一項に記載の使用。
33.配列番号3~配列番号25から選択される一つのヌクレオチド配列を含む、sg
RNA構築体。
34.2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオ修飾を含む、項3
3に記載の構築体。
35.前記化学修飾は、配列番号3~配列番号25から選択される一つのヌクレオチド
配列の5’末端の最初の1つ、2つ、及び/または3つの塩基及び/または3’末端の最
後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体による修飾である、項34に記載の構築体。
36.項33~35のいずれか一項に記載の構築体を含むベクター、宿主細胞または製
剤。
37.造血幹細胞の遺伝子編集における、項33~35のいずれか一項に記載の構築体
の使用。
38.項15または16に記載の造血幹細胞、項17または22に記載の前駆細胞、若
しくは項18または22に記載の成熟赤血球を被験者に投与することを含む、被験者の貧
血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の輸血を必要とする他の
疾患を治療または予防する方法。
39.前記疾患はβ-サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、項38に記載の方法。
40.前記被験者はヒトである、項39に記載の方法。
41.項33~35のいずれか一項に記載のsgRNAの構築体、または項36に記載
のベクターを含む、被験者の貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のため
に大量の輸血を必要とする他の疾患を治療または予防するキット。
42.Cas9mRNAをさらに含む、項41に記載のキット。
血患者の造血幹細胞のBCL11Aのエンハンサー部位を遺伝子編集して臨床治療の要件
を満たす。編集された造血幹細胞が赤血球系に分化すると、γグロビンと胎児ヘモグロビ
ン(HbF)の発現を有意に増加させることができ、動物モデルの造血系を再構築するこ
とができる。また、オフターゲット分析により、本発明の方法は安全性が高く、遺伝子編
集による副作用はほとんど検出されていない。
sgRNAや形質転換条件などのCRISPR/Casシステムの各条件を最適化するこ
とによって、BCL11Aエンハンサーが効率的に編集された造血幹細胞を取得すること
に係る。実験の結果、本発明で得られた造血幹細胞のインビトロでの赤血球系分化および
動物モデルのインビボでの造血系の再構築の機能が正常であることは証明され、安全性を
有し、臨床治療の標準を満たすことはオフターゲット分析により証明された。
必要とする他の疾患(例えば、β-サラセミアと鎌状赤血球貧血)の治療または予防に使
用される、臨床治療レベルを満たす遺伝子編集された造血幹細胞、赤血球前駆体、または
成熟赤血球を提供する。
含む、造血幹細胞の遺伝子編集に使用されるsgRNA(例えば、化学修飾されたsgR
NA)を提供する。
方法を提供する。
血幹細胞を効率的に修飾することである。例えば、臍帯血または骨髄からCD34陽性の
造血幹細胞を得て、Cas9と所定のsgRNAとを、最適化されたエレクトロポレーシ
ョン条件によって造血幹細胞に導入し、造血幹細胞を遺伝子編集して、遺伝子編集された
造血幹細胞を実験動物に移植して当該造血幹細胞が造血系を再構築する能力を評価しても
よい。前記sgRNAは、「CRISPR RGEN TOOLS」ソフトウェアなど、
複数の設計ソフトウェアを用いて、BCL11A(+58)部位などのBCL11Aのエ
ンハンサーに対して設計することができる。一部の実施形態では、設計されたsgRNA
は、例えば、前記sgRNAの5’および3’末端の3つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾、及びヌクレオチド間の3’チオ修飾など、化学修飾される。Cas9mR
NAと、異なるsgRNAとの組み合わせをテストすることで高効率のsgRNAを得る
ことができる。一部の実施形態では、前記造血幹細胞は、臨床レベルの磁気カラム選別に
よって得られ、遺伝子編集に使用されるCas9タンパク質をコードするヌクレオチドお
よび化学修飾されたsgRNAは、インビトロ転写実験を通じて得られる。遺伝子編集さ
れた造血幹細胞を赤血球系へ分化させ、赤血球生成の割合を検出する。例えば、遺伝子編
集された造血幹細胞を、放射計で照射されたNPGマウスに移植して造血系を再構築する
能力を評価してもよいし、患者のCD34陽性の造血幹細胞を分離して遺伝子編集効率、
赤血球計分化能、γグロビンおよび胎児ヘモグロビンの発現を評価してもよい。
ンハンサー部位を遺伝子編集することを含む、胎児ヘモグロビン(HbF)の発現を増加
させる方法を提供する。編集プロセスは、造血幹細胞BCL11Aのエンハンサー部位の
標的配列に対してsgRNAを設計する。BCL11Aのエンハンサーには、その転写開
始点からの距離(kilо-base数)に応じて+62、+58、+55と命名された
部位がある。BCL11A遺伝子の赤血球系エンハンサーは、胎児ヘモグロビン(HbF
)の発現を負に調節することができ、転写開始点から55kb(kbは、1000の塩基
を表す)、58kb、62kb離れた位置は重要な調節領域であることが報告されている
。+55、+58、+62部位について研究した研究者もいるが、上記三つの部位の前後
の遺伝子配列は何れも1000bp以上であり、合計で約6000bpであるため、具体
的にはどの領域を編集すると理想の編集効果を実現できるか、当業者は分からず、+58
という一つの部位にとっても、遺伝子編集効率にも大きな差がある(Bauer,D.E
.et al. An erythroid enhancer of BCL11A
subject to genetic variation determines
fetal hemoglobin level. Science. 342,253
-257(2013)、及びCanver MC, et al. BCL11Aのエン
ハンサーdissection by Cas9-mediated in situ
saturating mutagenesis. Nature. 2015 Nov
12;527(7577):192-7参照)。そのため、編集効率にとって極めて重
要な具体的な領域を見つけることは、当業者が最初に直面する問題である。
、配列番号2に示される)は遺伝子編集の効率に大きな影響を与え、本発明のsgRNA
が標的とする領域は、効率よく且つ臨床応用を達成できる編集可能な領域である。この1
50bpのゲノム配列は、ヒト2番染色体の60495197番目から60495346
番目までの領域に位置する(本明細書ではchr2:60495197-6049534
6と略記する)。
編集を効率的に実現することができ、その中で、比較的に効率的な候補sgRNAは何れ
も、胎児ヘモグロビンの発現を有意に増加させることができる。ある文献報告によると、
+55、+58、+62部位に対してsgRNAsライブラリーを設計し、CRISPR
/Cas9を利用して細胞モデルによるスクリーニングをした結果、標的される+58の
「GATAA」部位が重要な調節制御の配列であり、すなわち、「GATAA」配列を含
むsgRNAによる胎児ヘモグロビンの発現の増加効果が最も顕著であることが分かった
。しかしながら、本発明で見出されたsgRNAによってアンカーされた+58近傍の領
域は、既存技術に開示された重要な「GATAA」塩基部位とは異なることに注意すべき
である。本発明のsgRNAにより導入される遺伝子編集は、胎児ヘモグロビンの発現を
大幅に増加させ、臨床的治療に十分適用できる。
集技術、TALEN遺伝子編集技術、およびCRISPR/Cas(例えば、CRISP
R/Cas9)遺伝子編集技術、および将来発見される他の遺伝子編集方法など、任意の
遺伝子編集方法を用いて前記知った効率的な遺伝子編集領域を編集し、遺伝子編集条件を
最適化し、効率的な編集の目的を実現することができると、当業者は理解できる。よって
、本発明は、任意の利用可能な遺伝子編集方法によって本発明で同定された配列3~25
から選択されるBCL11A遺伝子の標的配列の技術構成をカバーする。一部の好ましい
実施形態では、本発明は、CRISPR/Cas9遺伝子編集技術によって効率的な遺伝
子編集を実現する技術構成に係る。
ば、CRISPR/Cas9システムのような、自然に存在するまたは人工的に設計され
た様々なCRISPR/Casシステムを含むが、これらに限られていない。自然に存在
するCRISPR/Casシステム(Naturally occurring CRI
SPR/Cas system)は、細菌と古細菌が長期的な進化中に形成した適応性免
疫防御であり、侵入するウイルスおよび外因性DNAと対抗することができる。例えば、
CRISPR/Cas9の作動原理は、crRNA(CRISPR-derived R
NA)が塩基対を通してtracrRNA(trans-activating RNA
)と結合してtracrRNA/crRNA複合体を形成し、この複合体は、ヌクレアー
ゼCas9タンパク質をガイドしてcrRNAとペアになっている配列標的部位で二本鎖
DNAを切断する。tracrRNAとcrRNAを人工的に設計することにより、ガイ
ド作用を有するsgRNA(single guide RNA)を改変形成し、Cas
9がDNAを部位特異的に切断することをガイドするようにすることができる。RNA指
向性dsDNA結合タンパク質として、Cas9エフェクターヌクレアーゼは、RNA、
DNA、およびタンパク質に共局在化することができるため、巨大な改変可能性を有する
。CRISPR/Casシステムには、クラス1、クラス2、またはクラス3のCasタ
ンパク質が使用可能である。本発明の一部の実施形態では、前記方法にはCas9が使用
される。その他の適用されるCRISPR/Casシステムは、WO201317677
2、WO2014065596、WO2014018423、US8,697,359に
記載されているシステムと方法を含むが、これらに限られていない。
子に係る。
guide RNA)」、または、「シングルガイドRNA」、「合成されたガイドRN
A」または「ガイドRNA」は、置き換えて使用できる。本発明のsgRNAは、目標配
列を標的とするガイド配列を含む。好ましい実施形態では、本発明のsgRNAはさらに
tracr配列とtracrシャペロン配列とを含む。
17~20bpの配列であってもよく、しかも「指導配列」または「スペーサー」と置き
換えて使用することができる。CRISPR複合体を形成する背景において、「標的配列
」は例えば、ガイド配列がそれに相補的になるように設計された配列であり、標的配列と
ガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、CRISPR複合体の形成を促進する。
前記ハイブリダイゼーションは、「標的配列」と「ガイド配列」または「指導配列」とが
、ハイブリダイゼーションを引き起こしてCRISPR複合体の形成を促進するのに十分
な相補性を持っていればよいが、完全な相補は必要ではない。
は、造血幹細胞におけるBCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列)とが、ワトソンアン
ドクリークにより発見されたヌクレオチドペアリング原則によってハイブリダイズするこ
とができることを指す。当業者が理解できるように、十分な相補性がある限り、「ガイド
配列」は標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、それらの間に100%
の完全な相補の必要はない。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを
使用して最適なアラインメントを行う場合、ガイド配列およびそれに対応する標的配列間
の相補程度は約75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%
以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、9
9%以上またはそれ以上であってもよい。最適なアラインメントは、配列をアラインする
ための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定でき、Smith-Watermanア
ルゴリズム、Needleman-Wimschアルゴリズム、Burrows-Whe
eler Transformに基づいたアルゴリズムなどを含む。
イド配列と標的配列がハイブリダイズして1つ以上のCasタンパク質と複合することを
含む)により、標的配列中または標的配列の近く(例えば、標的配列から1、2、3、4
、5、6、7、8、9、10、20、50またはそれ以上の塩基対の範囲内)の1つの鎖
または2つの鎖の切断が引き起こされる。理論に拘束されるつもりはなく、tracr配
列は、野生型tracr配列の全部または一部を含むことができ、例えば、野生型tra
cr配列の約20以上、23以上、26以上、29以上、32以上、35以上、38以上
、41以上、44以上、47以上、50以上、53以上、56以上、59以上、62以上
、65以上、70以上、75以上、80以上、85以上、またはそれ以上のヌクレオチド
または上記からなるtracr配列はさらにCRISPR複合体の一部を形成することが
でき、例えば、tracr配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に操作可能に連結
されたtracrシャペロン配列の全部または一部とハイブリダイズする。
してCRISPR複合体の形成に寄与するのに十分な相補性を有する。「標的配列」と「
ガイド配列」または「指導配列」とのハイブリダイゼーションと同様に、その機能を発揮
するのに十分である限り、完全な相補は必要ではない。一部の実施形態では、最適なアラ
インメントの場合、tracr配列はtracrシャペロン配列の長さに沿って少なくと
も50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%の相補性を有する。
336番目までのBCL11Aゲノム領域は、GRCh38標準によるヒト遺伝子配列に
おける位置によって定義される。この位置付けが標準の異なるヒトゲノム配列を参照する
と、それらの位置が異なる場合があることを、当業者は理解するはずである。しかしなが
ら、当業者は、標準の異なるヒト遺伝子配列を参照する時の当該領域の対応する位置を分
かることができる。一部の実施形態では、造血幹細胞における2番染色体上の、6049
5219番目から60495336番目までのBCL11Aゲノム領域を破壊することは
、この領域に、ヌクレオチド配列の「付加および/または削除(indel)」を導入す
ることを含み、例えば、任意のタイプ(例えば、A、T、C、Gから選択される)および
/または数量(例えば、1~20、1~15、1~10、1~9、1~8、1~7、1~
6、1~5、1~4、1~3、1~2個)のヌクレオチドのindelを導入することを
含む。一部の実施形態では、前記破壊は、元のヌクレオチド配列を新しいヌクレオチド配
列で置き換えることを含む。一部の実施形態では、前記破壊は、前記領域にヌクレオチド
配列をノックイン(knоck-in)またはノックアウト(knock-out)する
ことを含む。
願は配列番号2に示される150bp塩基領域に対してsgRNAを設計し、sgRNA
配列は、配列番号2の配列の少なくとも17、好ましくは18、好ましくは19、または
好ましくは20の連続したヌクレオチドの配列に相補的である必要がある。
から60495222番目まで、特に60495219番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号9を含む
sgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム領
域の編集を実現するように、配列番号9の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入する
ことに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(例え
ば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V、0
.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコードする
ヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sgRN
Aは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾されたも
のであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及び/
または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体に
よる修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の60
495203番目から60495222番目まで、特に60495219番目のBCL1
1Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細
胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの
赤血球を含む医療製品に係る。
から60495227番目まで、特に60495224番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号10を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号10の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495208番目から60495227番目まで、特に60495224番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495236番目まで、特に60495233番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号11を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号11の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495217番目から60495236番目まで、特に60495233番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495237番目まで、特に60495234番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号12を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号12の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495218番目から60495237番目まで、特に60495234番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495238番目まで、特に60495235番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号13を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号13の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495219番目から60495238番目まで、特に60495235番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495240番目まで、特に60495223番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号16を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号16の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495221番目から60495240番目まで、特に60495223番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495241番目まで、特に60495238番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号14を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号14の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495222番目から60495241番目まで、特に60495238番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495242番目まで、特に60495239番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号15を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号15の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495223番目から60495242番目まで、特に60495239番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495247番目まで、特に60495244番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号17を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号17の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495228番目から60495247番目まで、特に60495244番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495248番目まで、特に60495245番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号18を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号18の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495229番目から60495248番目まで、特に60495245番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495249番目まで、特に60495246番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号19を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号19の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495230番目から60495249番目まで、特に60495246番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495250番目まで、特に60495247番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号20を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号20の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495231番目から60495250番目まで、特に60495247番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495253番目まで、特に60495250番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号21を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号21の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495234番目から60495253番目まで、特に60495250番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495254番目まで、特に60495251番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号22を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号22の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495235番目から60495254番目まで、特に60495251番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495255番目まで、特に60495238番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号4を含む
sgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム領
域の編集を実現するように、配列番号4の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入する
ことに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(例え
ば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V、0
.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコードする
ヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sgRN
Aは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾されたも
のであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及び/
または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体に
よる修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の60
495236番目から60495255番目まで、特に60495238番目のBCL1
1Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細
胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの
赤血球を含む医療製品に係る。
から60495266番目まで、特に60495263番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号3を含む
sgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム領
域の編集を実現するように、配列番号3の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入する
ことに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(例え
ば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V、0
.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコードする
ヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sgRN
Aは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾されたも
のであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及び/
または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体に
よる修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の60
495247番目から60495266番目まで、特に60495263番目のBCL1
1Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細
胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの
赤血球を含む医療製品に係る。
から60495271番目まで、特に60495268番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号8を含む
sgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム領
域の編集を実現するように、配列番号8の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入する
ことに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(例え
ば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V、0
.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコードする
ヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sgRN
Aは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾されたも
のであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及び/
または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体に
よる修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の60
495252番目から60495271番目まで、特に60495268番目のBCL1
1Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細
胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの
赤血球を含む医療製品に係る。
から60495272番目まで、特に60495269番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号7を含む
sgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム領
域の編集を実現するように、配列番号7の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入する
ことに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(例え
ば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V、0
.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコードする
ヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sgRN
Aは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾されたも
のであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及び/
または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体に
よる修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の60
495253番目から60495272番目まで、特に60495269番目のBCL1
1Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細
胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの
赤血球を含む医療製品に係る。
から60495276番目まで、特に60495273番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号6を含む
sgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム領
域の編集を実現するように、配列番号6の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入する
ことに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(例え
ば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V、0
.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコードする
ヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sgRN
Aは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾されたも
のであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及び/
または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体に
よる修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の60
495257番目から60495276番目まで、特に60495273番目のBCL1
1Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細
胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの
赤血球を含む医療製品に係る。
から60495283番目まで、特に60495280番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号5を含む
sgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム領
域の編集を実現するように、配列番号5の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入する
ことに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(例え
ば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V、0
.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコードする
ヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sgRN
Aは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾されたも
のであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及び/
または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体に
よる修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の60
495264番目から60495283番目まで、特に60495280番目のBCL1
1Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細
胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの
赤血球を含む医療製品に係る。
から60495318番目まで、特に60495301番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号24を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号24の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495299番目から60495318番目まで、特に60495301番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495338番目まで、特に60495335番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号25を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号25の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495319番目から60495338番目まで、特に60495335番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
から60495339番目まで、特に60495336番目のBCL11Aゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
(HbF)の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TALEN遺伝子編集技術またはCRISPR
/Cas9遺伝子編集技術であり、好ましくはCRISPR/Cas9遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記BCL11Aゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号23を含
むsgRNAのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記BCL11Aゲノム
領域の編集を実現するように、配列番号23の配列を含むsgRNAを造血幹細胞に導入
することに係り、好ましくは、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチド(
例えば、mRNA)とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、200~600V
、0.5~2msのエレクトロポレーション条件で前記sgRNAと、Cas9をコード
するヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記sg
RNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾され
たものであり、例えば、化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及
び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁
体による修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の2番染色体の
60495320番目から60495339番目まで、特に60495336番目のBC
L11Aゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血
幹細胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及び
この赤血球を含む医療製品に係る。
効果的に生成することができ、すなわち、効率的に遺伝子編集することができる。本発明
の好ましいsgRNAは、配列番号3~配列番号25から選択されるいずれか一つであり
、前記sgRNAが対応する標的配列の切断部位の配列は、chr2:60495219
~chr2:60495336の間(すなわち、2番染色体上の60495219番目と
60495336番目との間)に位置する。
のゲノム配列の位置、及び各sgRNAによって引き起こされるCas9切断部位を示し
ている。
されたCas9切断部位は、BCL11A遺伝子の60495219番目から60495
336番目のゲノム領域に集中していることが明らかになった。
クターを含むsgRNAの組成物をさらに含む。
有し、標的配列とハイブリダイズし、CRISPR複合体と標的配列との配列特異的結合
をガイドする任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアライン
メントアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを行う場合、ガイド配列およびそれ
に対応する標的配列間の相補程度は約80%以上、85%以上、90%以上、95%以上
、97.5%以上、99%以上またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列を
アラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定でき、その非限定的な例に
は、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wimschア
ルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づいたアルゴリ
ズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、Clustal
W、Clustai X、BLAT、Novoalign(Novocraft Tec
hnologies,ELAND(Illumina,San Diego,CA))、
SOAP(sоap.genоmics.оrg.cnで入手可能)およびMaq(ma
q.sourceforge.netで入手可能)が含まれる。一部の実施形態では、ガ
イド配列の長さは、約10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、
16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21以上、22以上、23以上、
24以上、25以上、26以上、27以上、28以上、29以上、30以上、35以上、
40以上、45以上、50以上、55以上、60以上、65以上、70以上、75以上、
またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、ガイド配列の長さ
は、約75未満、70未満、65未満、60未満、55未満、50未満、45未満、40
未満、35未満、30未満、25未満、20未満、15未満、12未満、またはそれより
少ないヌクレオチドであってもよい。CRISPR複合体と標的配列の配列特異的結合を
ガイドするガイド配列の能力は、任意の適切な測定方法により評価することができる。例
えば、対応する標的配列を有する宿主細胞に、CRISPR複合体を形成するには十分な
CRISPRシステムのコンポーネント(テストされるガイド配列を含む)を提供しても
よく、例えば、CRISPR配列コンポーネントをコードするベクターを使用してトラン
スフェクションし、そして標的配列内の優先的な切断(例えば、本明細書に記載のSur
veyorにより測定する)を評価することで行うことができる。同様に、標的ポリヌク
レオチド配列の切断は、試験管内で、標的配列、CRISPR複合体(テストされるガイ
ド配列と、ガイド配列と異なる対照ガイド配列とを含む)のコンポーネントを提供し、標
的配列へのテストと対照ガイド配列の結合または切断率を比較して評価することができる
。また、当業者に既知の他の測定方法を使用して上記測定と評価を行うことができる。
れたものである。「化学修飾されたsgRNA」とは、sgRNAについて行った特定の
化学修飾であり、例えば、その5’末端および3’末端の3つの塩基に対する2’-O-
メチル類縁体による修飾および/またはヌクレオチド間の3’チオによる修飾である。
られる。第一に、sgRNAは一本鎖RNAであり、半減期が非常に短いため、細胞に入
ると急速に分解する(最長12時間)が、Cas9タンパク質とsgRNAとが結合して
遺伝子編集の役割を発揮するには少なくとも48時間がかかる。そのため、化学修飾され
たsgRNAは細胞に入った後、安定して発現し、Cas9タンパク質に結合した後、効
率的にゲノムを遺伝子編集してIndelsを生成することができる。第二に、未修飾の
sgRNAは細胞膜を透過する能力が低く、細胞または組織に効果的に入って対応する機
能を発揮することができない。化学修飾されたsgRNAは細胞膜を透過する能力が一般
的に強化されている。本発明において、本分野で常用の化学修飾方法を使用することがで
き、sgRNAの安定性(半減期を延長する)と細胞膜への侵入能力を向上させることが
できる限り、いずれも使用できる。実施例に使用されている具体的な化学修飾の他に、例
えば、Deleavey GF1,Damha MJ. Designing chem
ically modified oligonucleotides for tar
geted gene silencing. Chem Biol.2012 Aug
24;19(8):937-54、およびHendel et al. Chemic
ally modified guide RNAs enhance CRISPR-
Cas genome editing in human primary cell
s. Nat Biotechnol. 2015 Sep;33(9):985-98
9の文献に報告された化学修飾方法など、その他の修飾方法を含む。
ド(例えば、mRNA)をエレクトロポレーションによって造血幹細胞に導入する。例え
ば、250~360V、0.5~1ms;250~300V、0.5~1ms;250V
、1ms;250V、2ms;300V、0.5ms;300V、1ms;360V、0
.5ms;または360V、1msのエレクトロポレーション条件で造血幹細胞に導入す
る。一部の実施形態では、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチドとをエ
レクトロポレーションによって一緒に造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記
sgRNAをエレクトロポレーションによってCasを発現する造血幹細胞に導入する。
ば、ARCAキャップを含むmRNAである。一部の実施形態では、前記Cas9をコー
ドするヌクレオチドはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターにある。一部の実
施形態では、前記Cas9をコードするヌクレオチドは、例えば、配列番号26の配列を
含む。一部の実施形態では、前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチドとは
同一のベクターにある。
された造血幹細胞を分化培養することにより得られた、成熟赤血球の前の分化の異なる段
階にある前駆細胞、及び前記遺伝子改変された造血幹細胞を分化培養することにより得ら
れた成熟赤血球に係る。
子改変された造血幹細胞を分化培養することにより得られた、成熟赤血球の前の分化の異
なる段階にある前駆細胞、または前記遺伝子改変された造血幹細胞を分化培養することに
より得られた成熟赤血球を含む、本発明の方法により得られた医薬組成物に係る。
用いられる経路を介して、それを必要とする被験者に投与することができる。投与量は、
被験者の病状および一般的な健康状況に基づいて具体的に決めることができる。
ドするヌクレオチドを造血幹細胞に送達する方法を提供する。一部の実施形態では、前記
送達として、通常のウイルスおよびウイルスに基づかない遺伝子移転方法によって前記構
築体を造血幹細胞またはその他の宿主細胞に導入することができる。非ウイルス送達系は
、DNAプラスミド、RNA(例えば、本明細書に記載されているベクター転写物)、裸
の核酸、及びリポソームを含む。ウイルスベクター送達系は、DNAとRNAウイルスを
含み、細胞への送達のための遊離または組み込まれたゲノムを有する。一部の実施形態で
は、発明者は、エレクトロポレーションを利用してCas9とsgRNAのコード遺伝子
を造血幹細胞に導入して造血幹細胞BCL11A遺伝子の具体的な配列を遺伝子編集する
。実験を繰り返した後、発明者は、200~600v、0.5ms~2msのエレクトロ
ポレーション条件下でCas9をコードするヌクレオチドおよびsgRNAを一緒に造血
幹細胞に導入する場合の遺伝子編集効率は、他のエレクトロポレーション条件下での遺伝
子編集効率より有意に高いことを発見した。
共にエレクトロポレーションによってCD34+造血幹細胞に導入し、効率的な遺伝子編
集効率(Indels%で表される)を生成する。実施例のデータによって、Cas9
mRNAと一緒にエレクトロポレーションを行ったのは化学修飾されていないsgRNA
である場合、そのIndels効率は2.7%しかなく、化学修飾されたsgRNAのエ
レクトロポレーションを行った時に得られたIndels効率(効率は少なくとも10%
以上)よりはるかに低いことは示されている。
異と呼ばれる。
and progenitor cells,HSPCs)」は、さまざまな血球を発
生させる最も原始的な造血細胞であり、その主な特徴は、強力な増殖能、多方向分化能、
及び自己再生能を有することである。そのため、さまざまな血球を分化・補充するだけで
はなく、幹細胞の特性と数量を自己再生により維持することもできる。造血幹細胞は分化
および増殖能力が異なり、不均一性がある。多能性造血幹細胞は最も原始的であり、最初
に定方向多能性造血幹細胞、例えば、顆粒球系、赤血球系、単核系、及び巨核球‐血小板
系を生成できる骨髄系造血幹細胞、及びBリンパ球とTリンパ球を生成できるリンパ系幹
細胞など、に分化する。この二種の幹細胞は、造血幹細胞の基本的な特徴を持っていなが
らわずかに分化し、それぞれ「骨髄成分」とリンパ球の発生に関与するので、定方向多能
性造血幹細胞と呼ばれる。これらはさらに造血前駆細胞に分化する。この細胞は原始的な
血球でもあるが、造血幹細胞の多くの基本的な特徴を失っている。例えば、多方向分化能
力を失って、1系統または密接に関連する2系統の細胞にしか分化できなくなったり、繰
り返し再生する能力を失い、数量を補うために造血幹細胞の増殖分化に依存するしかなく
なったり、増殖の可能性が限られており、数回しか***することができなくなったりする
。造血前駆細胞が分化して生成できる血液細胞株の数に応じて、また単能性造血前駆細胞
(1つの血液細胞株のみに分化する)とオリゴ能性造血前駆細胞(2~3つの血液細胞株
に分化できる)に分けられる。本発明の「造血幹細胞」という用語は、多能性造血幹細胞
、定方向多能性造血幹細胞、及び造血前駆細胞を含み、不均一性の異なる造血幹細胞の総
称である。
SPCs)は、骨髄、臍帯血、または末梢血単核細胞(Peripheral bloo
d mononuclear cell,PBMC)に由来し得る。
o Kimの研究チームによって開発されたsgRNAの設計のための専用のウェブサイ
ト名であり、そのウェブサイトアドレスはwww.rgenome.net/about/で
ある。
の専用のツールウェブサイト名であり、そのウェブサイトアドレスはtide-calc
ulator.nki.nlである。
CD33、CD19、CD56、CD71、CD235a」は血液系細胞の膜タンパク質
マーカーである。
結合部位としてマウスで最初に発見され、Evi9と名付けられた。その後、この遺伝子
はヒトゲノムでも発見され、2番染色体の短腕2p13部位に位置付けられ、主にBリン
パ球の胚中心に発現する。
である。ヘモグロビンは、高等生物の体内で酸素運搬に関与するタンパク質である。ヘモ
グロビンは4つの鎖、すなわち、2つのα鎖と2つのβ鎖とからなり、各鎖には1つの鉄
原子を含む環状ヘムがある。酸素は鉄原子に結合し、生体での使用のために赤血球によっ
て輸送される。
によって造血幹細胞BCL11Aの具体的な配列を遺伝子編集した後に得られる造血幹細
胞に係る。また、この造血幹細胞を含む製品も本発明の範囲内である。
めに大量の輸血を必要とする他の疾患から選択される疾患の治療に使用できる。特に、β
-サラセミアまたは鎌状赤血球貧血の治療に使用できる。
ンビトロで分化培養することによって得られた赤血球に係る。
胞の赤血球系の増殖および分化工程により処理することによって得られた、造血幹細胞か
ら成熟赤血球への各分化段階の前駆細胞に係る。
程、及び造血幹細胞の赤血球系の分化脱核の工程を含む。
を使用して造血幹細胞を培養する。
成長因子組成物とを含み、前記成長因子組成物は、幹細胞成長因子、すなわちSCF、イ
ンターロイキン3、すなわち、IL-3、およびエリスロポエチン、すなわちEPOを含
む。
ゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬および/または阻害剤を含む。
2つのステップで成熟赤血球に分化させることができる。既存技術と比較して、本発明の
インビトロでの分化培養を使用する場合、所要時間がわずか14日であり、時間的に短く
なり、21日以上が必要である既存技術と比べて、サイクルは大幅に短縮されている。
プロゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬および/または阻害剤は、下
記化合物(I)~(IV)から選択されるいずれか1つまたは2つ以上である。
NTM SFEM II(STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.)、
IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium
)、X-VIVO 15、alpha-MEM、RPMI 1640、DF12などの基
礎培地を含む。前記成長因子について、例えば、基礎培地としてSTEMSPANTM
SFEM IIが選択された場合、追加する必要がある成長因子は、50~200ng/
ml SCF、10~100ng/ml IL-3、1~10U/ml EPOを含み、
なお、Uの単位の定義として、特定の条件下で、1分で1μmоlの基質を変換できるタ
ンパク質の量、すなわち、1 IU=1μmоl/分である。現在、国内外のほとんどの
臨床実験室は、「I」(国際)という文字を省略し、すなわち、IUをUに省略している
。EPO、すなわちエリスロポエチンは、主に低酸素症または貧血に対応して腎臓から分
泌される糖タンパク質であり、本実施形態では、造血幹細胞の分化を促進することができ
る。通常は作用を発揮する時間は7日くらいである。
合、100X ITS(insuin-transferrin-selenium)(
培地中のITSの各物質の最終濃度として、インスリンの濃度は0.1mg/ml、ヒト
トランスフェリンは0.0055mg/ml、セレン元素は6.7*10-6mg/ml
である)(すなわち、主にインスリン、ヒトトランスフェリンおよびセレン元素を含む)
、10~50μg/mlビタミンC、0.5~5%BSA(Bovine serum
albuin、ウシ血清アルブイン)、成長因子、例えば、50~200ng/ml S
CF、10~100ng/ml IL-3、1~10U/ml EPOを添加する必要が
ある。
できる。例えば、STEMSPANTM SFEM II((STEM CELLS T
ECHNOLOGIESから購入)や、Thermo Fisherから購入したIMD
M、DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、Alpha MEM
、DMEMなど、本分野で一般的に使用される基礎培地が挙げられる。
ン、及びセレン元素を含む)、L-グルタミン、ビタミンC、及びウシ血清アルブミンな
ど他の成分をさらに添加することができる。例えば、IMDM培地に、ITS、2mM
L-グルタミン、10~50μg/mlのビタミンC、及び0.5~5質量%のBSA(
ウシ血清アルブミン)を添加することができる。また、上記DF12には、同じ濃度のI
TS、L-グルタミン、ビタミンC、及びウシ血清アルブミンを添加することができる。
Knockout DMEMには、同じ濃度のITS、L-グルタミン、ビタミンC、及
びウシ血清アルブミンを添加することができ、RPMI 1640には、同じ濃度のIT
S、L-グルタミン、ビタミンC、及びウシ血清アルブミンを添加することができ、Al
pha MEMには、同じ濃度のITS、L-グルタミン、ビタミンC、及びウシ血清ア
ルブミンを添加することができ、DMEMにも同じ濃度のITS、L-グルタミン、ビタ
ミンC、及びウシ血清アルブミンを添加することができる。ここで、各基礎培地に添加さ
れるITSの濃度として、インスリン濃度が0.1mg/ml、ヒトトランスフェリンが
0.0055mg/ml、セレン元素が6.7×10-6mg/mlであってもよい。ま
た、添加されるITSの各成分の濃度も、実際のニーズに合わせて調整できる。ITSは
Thermofisherから購入でき、必要に応じて適切な最終使用濃度に調整できる
。
ゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬を含む。
SFEM II(STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.)、IMD
M(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、X
-VIVO 15、alpha-MEM、RPMI 1640、DF12などの基礎培地
を含む。さらに成長因子を含み、例えば、基礎培地としてSTEMSPANTM SFE
M IIが選択された場合、追加する必要がある成長因子は、1~10U/ml EPO
、100~1000μg/ml human transferrin(ヒトトランスフ
ェリン)、0.5~10μmоl/.mlのミフェプリストン(Mifepriston
e)などの化学的小分子を含む。
合、例えばITS(insuin-transferrin-selenium)(培地
中のITSの各物質の最終濃度として、インスリンの濃度は0.1mg/ml、ヒトトラ
ンスフェリンは0.0055mg/ml、セレン元素は6.7×10-6mg/mlであ
る)(すなわち、主にインスリン、ヒトトランスフェリンおよびセレン元素を含む)、1
0~50μg/mlビタミンC、0.5~5%BSA(Bovine serum al
buin、ウシ血清アルブイン)、成長因子、例えば、1~10U/ml EPO、10
0~1000μg/mlヒトトランスフェリン、0.5~10μmоl/.mlのミフェ
プリストン(Mifepristone)などの化学的小分子を添加する必要がある。
できる。例えば、STEMSPANTM SFEM II((STEM CELLS T
ECHNOLOGIESから購入)や、Thermo Fisherから購入したIMD
M、DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、Alpha MEM
、DMEMなど、本分野で一般的に使用される基礎培地が挙げられる。
フェリン、及びセレン元素を含む)、L-グルタミン、ビタミンC、及びウシ血清アルブ
ミンなど他の成分をさらに添加することができる。例えば、IMDM培地に、ITS、2
mM L-グルタミン、10~50μg/mlのビタミンC、及び0.5~5質量%のB
SA(ウシ血清アルブミン)を添加することができる。また、上記DF12には、同じ濃
度のITS、L-グルタミン、ビタミンC、及びウシ血清アルブミンを添加することがで
きる。Knockout DMEMには、同じ濃度のITS、L-グルタミン、ビタミン
C、及びウシ血清アルブミンを添加することができ、RPMI 1640には、同じ濃度
のITS、L-グルタミン、ビタミンC、及びウシ血清アルブミンを添加することができ
、Alpha MEMには、同じ濃度のITS、L-グルタミン、ビタミンC、及びウシ
血清アルブミンを添加することができ、DMEMにも同じ濃度のITS、L-グルタミン
、ビタミンC、及びウシ血清アルブミンを添加することができる。ここで、各基礎培地に
添加されるITSの濃度として、インスリン濃度が0.1mg/ml、ヒトトランスフェ
リンが0.0055mg/ml、セレン元素が6.7×10-6mg/mlであってもよ
い。また、添加されるITSの各成分の濃度も、実際のニーズに合わせて調整できる。I
TSはThermofisherから購入でき、必要に応じて適切な最終使用濃度に調整
できる。
に合成された小分子であり、この小分子は、プロゲステロン受容体とグルココルチコイド
受容体の拮抗薬であり、構造式は次の通りである。
8297などを含む、その他のプロゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗
薬および阻害剤も本発明で使用することができる。化学構造式は次の通りである。
よって生成することができる:a)本発明に記載のいずれかの方法を使用して、ヒト臍帯
血からCD34陽性HSPCsを分離して遺伝子改変すること;b)遺伝子改変されたH
SPCsを、5~10日、例えば、5日、6日、7日、8日、9日、10日、増殖および
分化させて、例えば、赤芽球(erythroblast)、有核赤血球、未成熟赤血球
および網赤血球などのような赤血球前駆細胞を得ること、c)赤血球前駆細胞をさらに7
日間分化処理して成熟赤血球を得ること。
よって生成することができる:
a)磁気ビーズ選別により、ヒト臍帯血からCD34陽性HSPCsを分離すること;
b)本発明に記載のいずれかの方法を使用して前記CD34陽性HSPCsを遺伝子改
変すること;
c)追加の成長因子を無血清培地(Serum-free medium(SFME)
)に添加し、5~10日、例えば、5日、6日、7日、8日、9日、10日、増殖および
分化した後、HSPCsを赤血球前駆細胞に分化させること(この段階の培地を、造血幹
細胞赤血球系増殖および分化培地(HSPCs erythroid expansio
n and differentiatiоn medium;HEEDMと略記する)
となづける);
d)追加の成長因子を無血清培地(Serum-free medium(SFME)
)に添加し、7日間分化した後、成熟した赤血球を得ること(この段階の培地を、造血幹
細胞赤血球系分化脱核培地(HSPCs erythroid differentia
tiоn enucleatiоn medium;HEDEMと略記する)となづける
)。
つのステップで成熟赤血球を得ることができ、全工程時間は10~18日、11~17日
、12~16日、13~15日、10~17日、10~16日、10~15日、または1
0~14日であってもよく、この時間は、3つのステップまたは4つのステップの方法を
使用する既存技術の少なくとも21日のサイクルを大幅に短縮した。
加した成熟赤血球またはその前駆細胞を製造する方法に係り、この方法は、(a)本発明
に係る遺伝子改変方法を使用して造血幹細胞を得ることと、(b)上記造血幹細胞赤血球
系増殖および分化培地を使用して、遺伝子改変された造血幹細胞に対して造血幹細胞赤血
球系増殖および分化を行うこととを含む。
成熟赤血球またはその前駆細胞を製造する方法に係り、この方法は、(a)本発明に係る
遺伝子改変方法を使用して造血幹細胞を得ることと、(b)上記造血幹細胞赤血球系増殖
および分化培地を使用して、遺伝子改変された造血幹細胞に対して造血幹細胞赤血球系増
殖および分化を行うことと、(c)赤血球系分化脱核培地を使用して造血幹細胞赤血球系
の分化および脱核を行うこととを含む。本発明はまた、造血幹細胞または成熟赤血球の前
駆細胞の増殖および/分化における、上記方法で使用される造血幹細胞赤血球系増殖およ
び分化培地および/または赤血球系分化脱核培地の使用に係る。
および成長の過程で特殊化される現象を指し、すなわち、生体の細胞または組織の特徴及
び機能が変化して細胞または組織に与えられた機能を実行する現象を指す。一般に、その
中の比較的に単純な系が性質の異なる2つ以上の部分系に分かれる現象を指す。
理として、血液中の異なる成分の比重に差があり、低速密度勾配遠心分離の場合、異なる
細胞成分を分離することができる。赤血球と顆粒球の密度は成層液体の密度より高く、f
icоll液体に会ったら、赤血球はすぐにひも状に凝縮してチューブの底に蓄積する。
成層液体の密度に相当する単核細胞のみが血漿層と成層液体、すなわち、造血幹細胞が存
在する白い膜層との間に濃縮され、後続の磁気ビーズ選別によって取得することができる
。本発明において、単核細胞は、市販のリンパ球分離チューブを用いて得られる。
細胞を指し、酸素、アミノ酸、二酸化炭素などの栄養素を運ぶ機能を持っている。成熟し
た赤血球にはミトコンドリアと細胞核はない。
CD4とCD8陽性Tリンパ球によって生成するサイトカインを指し、その主な生物学的
機能は、骨髄における造血幹細胞の増殖と分化の調節に寄与することである。
とは、erythroblasts、すなわち、赤血球前駆細胞によって分泌される成長
因子を指す。成体では、腎皮質と腎尿細管の周りの間質細胞及び肝臓によって分泌される
糖タンパク質がある。EPOは、造血幹細胞を刺激して赤血球に分化させることができる
。
マスト細胞成長因子(MGF)、キットリガンド(KL)、及びスチール因子(SLF)
を含む。
PCs細胞が大量に増殖し、赤血球系前駆細胞に分化するのを助ける培養システムを指す
。本発明において、この培地は、基礎培地と成長因子添加剤との2つの主要成分を含む。
基礎培地は無血清システムであり、STEMSPANTM SFEM II(STEM
CELLS TECHNOLOGY Inc.)であってもよく、または、IMDM(I
scove’s Modified Dulbecco’s Medium)に、さらに
ITS(Thermofisher)と、L-gulutamin(Thermofis
her)と、ビタミンCと、ウシ血清アルブミンとを追加してもよい。成長因子添加剤は
、IL-3、SCF、EPOの異なる濃度の組み合わせである。
駆細胞がさらに脱核した赤血球に増殖分化することを助ける培地を指す。本発明において
、この培地は、基礎培地と、成長因子および化学的小分子添加剤との2つの主要成分を含
む。基礎培地は無血清システムであり、STEMSPANTM SFEM II(STE
M CELLS TECHNOLOGY Inc.)であってもよく、または、IMDM
(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)に、さ
らにITS(Thermofisher)と、L-gulutamin(Thermof
isher)と、ビタミンCと、ウシ血清アルブミンとを追加してもよい。成長因子およ
び化学的小分子添加剤は、EPOとヒトトランスフェリン、及び化学的小分子ミフェプリ
ストンを含む。
ACS MicroBeads(MACSマイクロ磁気ビーズ)を用いて細胞を特異的に
標識し、磁気標識後、これらの細胞を強力で安定した磁場に配置された選別カラムに通す
。選別カラムのマトリックスは、高勾配磁場を築く。
磁場から外すと、カラム内に残った磁気標識された細胞は溶出でき、これによって、標識
された細胞画分と標識されていない細胞画分の両方を取得することができる。
記載の遺伝子改変方法により、3つの異なる臍帯血に由来する造血幹細胞を改変し、効率
的な遺伝子編集を実現することができ、効率は少なくとも40%以上、例えば、50%以
上、60%以上、70%以上、80%以上、または90%以上に達する。例えば、好まし
いsgRNAに対しても、平均的な遺伝子編集効率は80%に達する。
幹細胞をマウスに移植し、遺伝子編集されていない造血幹細胞を移植したマウスと比べて
、遺伝子編集された造血幹細胞を移植した後、マウスのヒトhCD45発現率は増加し続
け、末梢血サンプルでは、6週目の20%から16週目の60%に増加し、16週目の骨
髄での割合は90%にも達しており、脾臓では70%に達している。これは、遺伝子編集
された造血幹細胞は、マウスモデルの造血系に迅速かつ効率的に移植でき、細胞の体内分
化機能は正常であることを示している。
の造血幹細胞を改変してから、本発明の「二段階方法」という分化方法を用いて分化し、
すなわち、造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地を用いて増殖および分化をし、そして
造血幹細胞赤血球系分化脱核培地を用いてさらに分化する。テストした結果、分化した赤
血球のヘモグロビン(hemoglobin、HBG)の発現が、元の赤血球のHBG発
現と比べて20%~90%増加し、さらに100%増加し、すなわち、約1倍(元の2倍
)と増加し、胎児のヘモグロビンの発現も、元の赤血球の胎児ヘモグロビンの発現と比べ
て20%~90%、さらに100%も増加し、すなわち、約1倍(元の2倍)と増加し、
さらに200%、すなわち、約2倍(元の3倍)と増加し、さらに300%、すなわち、
約3倍(元の4倍)と増加し、さらに400%、すなわち、約4倍(元の5倍)と増加し
、さらに500%、すなわち、約5倍以上(元の6倍以上)と増加したことは示された。
みを目的としており、本発明の保護範囲を限定するものとして解釈されるべきではないこ
とは、当業者にとって自明である。したがって、本発明の実質的な保護範囲は、添付の請
求の範囲およびその均等物によって限定される。
1-1:K562細胞を使用してエレクトロポレーション条件を調べる
造血幹細胞の供給源が少なく、一回単離するコストが高いため、本実施例では、エレク
トロポレーション条件を調べるためのモデル細胞株として、癌細胞株K562(ATCC
社から購入、ウェブサイト:https://www.atcc.оrg)を選択した。
実験ロット一:5×105のK562細胞をエレクトロポレーションにより形質転換し
、GFPmRNA(配列番号1に示す配列)の量は5μgであり、BTX830エレクト
ロポレーターを使用し、それぞれ250V 1ms、360V 1ms、400V 1m
s、500V 1msの条件下で、4日後にGFP発現及び7-AAD発現をフローサイ
トメトリー解析実験により検出した。GFPはエレクトロポレーションの効率を表し、7
-AADはエレクトロポレーション後の細胞の成長状態、すなわち生存能力(viabi
lity)を表す。
atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaatt
ttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactac
ctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaaacgg
catgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaa
gacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatg
gaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatgga
atcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactcc
aattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaa
agagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaatag
、上記GFPmRNAの量は5μgであり、BTX830エレクトロポレーターを使用し
、それぞれ250V 1ms、250V 2ms、300V 0.5ms、300V 1
ms、360V 0.5ms、360V 1msの条件下で、4日後にGFP発現及び7
-AAD発現をフローサイトメトリー解析実験により検出した。GFPはエレクトロポレ
ーションの効率を表し、7-AADはエレクトロポレーション後の細胞の成長状態、すな
わち生存能力(viability)を表す。
、上記GFPmRNAの量は5μgであり、BTX830エレクトロポレーターを使用し
、それぞれ250V 1ms、250V 1ms、300V 1ms、300V 1ms
の条件下で、4日後にGFP発現及び7-AAD発現をフローサイトメトリー解析実験に
より検出した。GFPはエレクトロポレーションの効率を表し、7-AADはエレクトロ
ポレーション後の細胞の成長状態、すなわち生存能力(viability)を表す。そ
の結果は図2と図3に示す。
トロポレーション条件下で、GFPのエレクトロポレーションの4日後の蛍光顕微鏡の写
真を示す図である。「V」はパルス電圧を表し、「ms」はパルス時間を表す。
ション条件下で、GFPのエレクトロポレーションの4日後の、フローサイトメトリー解
析による7-AADとGFP発現の統計分析を示す図である。フローサイトメトリー解析
での7-AAD陰性は細胞生存率を表し、7-AAD(7-アミノ-アクチノマイシンD
)は、正常な原形質膜を通過できない核酸色素である。アポトーシスと細胞死のプロセス
において、原形質膜への7-AADの通過性は徐々に増加し、適切な波長の励起光の励起
下で明るい赤色の蛍光を発することができる。7-AAD陰性は正常な生細胞であり、G
FP効率はエレクトロポレーション効率を表す。「250-1」を例にして、250V電
圧、1msのパルス時間を表す。
レーション条件下で、エレクトロポレーション効率と細胞生存率の総合的指標が最も高い
ことを示し、それからの実験で後続実験のエレクトロポレーション条件として使用される
。
胞に導入する
前のステップで効率および生存率が最も高い条件、すなわち、300V 1msを選択
し、5×105の造血幹細胞(ALLCELLS(上海)社から購入、www.allc
ells.c)に上記GFPmRNAをエレクトロポレーションにより形質転換し、4日
後にGFPとCD34の発現状況を検出した。結果を図4と図5に示す。
mRNAをエレクトロポレーションにより造血幹細胞に導入して4日後の蛍光顕微鏡の写
真を示す図である。それぞれ、明視野、緑のチャネル、赤のチャネル、明視野と緑のチャ
ネルのオーバーレイの四つの視野を含む。
クトロポレーションにより造血幹細胞に導入して4日後の、GPFとCD34タンパク質
の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。図5の中の対照群は
造血幹細胞であるが、GFPmRNAが導入されておらず、CD34抗体が染色されない
状況をフローサイトメトリーで解析したものである。
クトロポレーション条件下で、臍帯血由来の造血幹細胞におけるGFPの発現の比率が高
いことを示している。
ションによりBCL11A部位を編集する
A、BCL11Aのエンハンサー58K部位(この標的58K部位の配列は配列番号2
に示される)について、「CRISPR RGEN TOOLS」ソフトウェアを使用し
てBCL11A(+58)部位に対して複数のsgRNAを設計し、化学修飾されたsg
RNAを合成した。情報は図6、7、8に示す。
ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaa
ctgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc
cer-1と呼ばれることもある):
cacaggctccaggaagggtt
cer-2と呼ばれることもある):
atcagaggccaaacccttcc
cer-3と呼ばれることもある):
ctaacagttgcttttatcac
cer-4と呼ばれることもある):
ttgcttttatcacaggctcc
cer-5と呼ばれることもある):
ttttatcacaggctccagga
cer-6と呼ばれることもある):
tttatcacaggctccaggaa
cer-7と呼ばれることもある):
tgggtggggtagaagaggac
ncer-8と呼ばれることもある):
gggcgtgggtggggtagaag
ncer-9と呼ばれることもある):
ttagggtgggggcgtgggtg
ancer-10と呼ばれることもある):
attagggtgggggcgtgggt
ancer-11と呼ばれることもある):
gattagggtgggggcgtggg
ancer-12と呼ばれることもある):
tctgattagggtgggggcgt
ancer-13と呼ばれることもある):
ctctgattagggtgggggcg
ancer-14と呼ばれることもある):
cacgcccccaccctaatcag
ancer-15と呼ばれることもある):
ttggcctctgattagggtgg
ancer-16と呼ばれることもある):
tttggcctctgattagggtg
ancer-17と呼ばれることもある):
gtttggcctctgattagggt
ancer-18と呼ばれることもある):
ggtttggcctctgattaggg
ancer-19と呼ばれることもある):
aagggtttggcctctgatta
ancer-20と呼ばれることもある):
gaagggtttggcctctgatt
ancer-21と呼ばれることもある):
actcttagacataacacacc
ancer-22と呼ばれることもある):
cttcaaagttgtattgaccc
ancer-23と呼ばれることもある):
ctcttagacataacacacca
23のsgRNAを設計した。
NA(配列番号26に示す配列)および上記の設計された化学修飾された23のsgRN
Aを合成した。その中で、23のsgRNAに対する化学修飾は、sgRNAの5’末端
の最初の3つの塩基及び3’末端の最後の3つの塩基の2’-O-メチル類縁体による修
飾およびヌクレオチド間の3’チオ修飾である。下記の化学式に示すように、左側は化学
修飾されたsgRNAであり、右側は修飾されていないsgRNAである。
ALLCELLS(上海)社から購入、www.allcells.cоm)に上記23
の化学修飾されたsgRNAをエレクトロポレーションにより形質転換し、4日後にTI
DEでIndels効率を分析した。その結果は図9に示す。同様に、本実施例では、比
較として、化学修飾されていないsgRNAについても同じ方法でエレクトロポレーショ
ンにより形質転換したが、化学修飾されていないsgRNAのIndels効率は2.7
%しかなく、それからの実施例で使用されたのはいずれも化学修飾されたsgRNAであ
る。
クトロポレーションにより形質転換してから4日後に当該CD34陽性の造血幹細胞のゲ
ノムを抽出し、sgRNAの切断部位の左と右それぞれ約450bp、全長903bpの
フラグメントを選択して増幅した。増幅に使用したプライマー配列を以下に示す
リバースプライマー:gggaagctccaaactctcaa(配列番号30)
で、切断部位は3’末端の右側にある(Cong L,et al.Science.2
013)。
グ時に使用した上流および下流プライマーの配列は、配列番号27と配列番号28に示さ
れる。シーケンシングの結果についてTIDEソフトウェアでIndelsの生成効率を
統計分析した。TIDEソフトウェアは、Indels効率をオンラインで分析するソフ
トウェアであり、Sangerシーケンシングの結果を基に、Indelsにより引き起
こされたダブルピーク変異の効率を分析した。tide.deskgen.cоmを参照
できる。
NAがいずれも造血幹細胞の遺伝子編集に成功し、効果的にIndelsを生成でき、効
率が少なくとも10%であることは示された。その中で、最も効率的なのはEnhanc
er-2である。
gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcc
cagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgaca
gcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctat
ctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtgga
agaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccacca
tctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatg
atcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagct
ggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgcca
gactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctg
attgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaa
ggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaaga
acctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatg
atcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaa
agagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagt
tcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaag
cagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaaga
tttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctc
tggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtg
gtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgct
gcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatga
gaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtg
aagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaa
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、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5およびEnha
ncer-6を選択し、300V 1msのエレクトロポレーション条件下で、Cas9
mRNAと、Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、E
nhancer-5およびEnhancer-6をエレクトロポレーションにより臍帯血
由来の造血幹細胞に導入してから4日後にIndels効率を検出した。その結果は図1
0に示す。図10は、Cas9 mRNAとBCL11Aのエンハンサー‐2 sgRN
A、Enhancer-3 sgRNA、Enhancer-4 sgRNA、Enha
ncer-5 sgRNAおよびEnhancer-6 sgRNAをエレクトロポレー
ションにより3つの異なる臍帯血由来のCD34陽性造血幹細胞に導入してから4日後、
上記と同じ方法を使用してTIDEソフトウェア分析によるIndelsの生成効率の統
計分析を示す図である。
も効率的な遺伝子編集を実現し、効率は少なくとも40%以上であり、その中で、最も効
率が高いのは、Enhancer-2 sgRNAであり、平均的な遺伝子編集効率は8
0%にも達しており、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer
-5およびEnhancer-6より有意に高いと共に、既存の文献で報告されている造
血幹細胞での遺伝子編集効率よりも高いことは示された(Xu,et al.Molec
ular Therapy.2017;DeWitt,et al.Sci Trans
l Med.2016)。
が行われた。
本実験は、遺伝子編集された臍帯血由来の造血幹細胞のコロニー形成単位(CFU、c
olony-formation units)の検出に係る。
300V 1msのエレクトロポレーション条件を選択し、Cas9mRNAおよびE
nhancer-2をエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、
800~1000の細胞を1ml H4434(カナダSTEM CELLS TECH
NOLOGIESから購入)とIMDM(Thermo Fisherから購入)および
FBS(Thermo Fisherから購入)の混合液に再懸濁し、14日後にCFU
-M、BFU-E、CFU-E、CFU-G、CFU-GM、GEMMなど形成された異
なる形のコロニー数を顕微鏡で観察し、その結果を図11に示す。図11は、Cas9
mRNAとBCL11Aのエンハンサー‐2 sgRNAをエレクトロポレーションによ
り臍帯血由来のCD34陽性造血幹細胞に導入してから2日後、インビトロコロニー形成
実験(CFU検出)を実施し、14日後に異なる血液系のコロニー数をカウントした結果
を示す図である。BFU-E、CFU-M、CFU-GM、CFU-E、CFU-G、C
FU-MMは、赤血球系、骨髄系、リンパ系などの血液系の異なる系統のコロニー形成を
表す。その中で、Mockは遺伝子編集されていない細胞を表す。
された細胞のインビトロ分化機能が正常であり、血液系の異なる系統のコロニー(クロー
ン)に分化することができることは示されている。
構築
300V 1msのエレクトロポレーション条件を選択し、Cas9mRNAおよびE
nhancer-2をエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、
放射計で照射されたNPG免疫不全マウスモデル(北京維通達生物技術有限公司(Bei
jing Vitalstar Biotechnology,Inc.)から購入)に
移植した。移植して6週間、8週間、10週間、12週間、16週間後、末梢血でヒトC
D45陽性細胞とマウスCD45の発現を検出すると共に、移植して16週間後の骨髄と
脾臓でヒトCD45とマウスCD45の発現を検出し、その結果は図12と図14に示す
。マウスへの移植方法は次の通りである。細胞移植の24時間前に、1.0Gyの照射を
行ってマウスモデルの骨髄を除去した。そして、20μL 0.9%生理食塩水で再懸濁
した1.0×106の細胞をマウスの尾静脈に注射し、クリーングレードの動物舎に飼育
した。
伝子編集された造血幹細胞をマウスモデルに移植した後、遺伝子編集された細胞は時間が
経つにつれて、ヒト由来hCD45の発現率が増加し続け、末梢血サンプルでは、6週目
の20%から16週目の60%に増加し、16週目の骨髄での割合は90%にも達してお
り、脾臓では70%に達している。これは、遺伝子編集された造血幹細胞は、マウスモデ
ルの造血系に迅速かつ効率的に移植でき、細胞の体内分化機能は正常であることを示して
いる。既存の文献報告から明らかに、6週間後の末梢血におけるCD45の発現率は1~
10%であり、16週間後のCD45の発現率は20~40%であり、骨髄におけるCD
45の発現率は50%くらいである。よって、本発明の動物実験結果は、既存の分野で報
告されている移植実験結果よりも明らかに優れている(Xu,et al.Molecu
lar Therapy.2017;DeWitt,et al.Sci Transl
Med.2016;Mettananda,et al. Nature Commu
nications.2017)。
D4、CD8、CD33、CD56、CD19などのヒト細胞膜タンパク質の発現を検出
し、その結果は図13、14、15に示す。その結果、遺伝子編集された細胞はこれらの
タンパク質を正常に発現でき、T細胞、B細胞、マクロファージなどの血液系の細胞に分
化でき、マウスモデルの造血系を効率的に再構築できることを示している。既存の文献で
報告されている結果と比較して、まずCD3、CD4、CD8、CD33、CD19、h
CD56など6つの細胞膜表面タンパク質を検出してマウスの血液におけるT細胞、骨髄
細胞、B細胞及びNK細胞などの発現状況を判断し、移植されたヒト造血幹細胞がマウス
の造血系を再構築する能力をより正確に評価した。これに対して、既存の文献では、CD
3、CD19、CD56、CD33などのタンパク質の発現のみをテストしている。次に
、末梢血、骨髄、及び脾臓など3つの重要な血液系関連組織における上記の6つのタンパ
ク質の発現プロファイルを検出し、マウスの造血系を再構築する能力をより全面的に評価
した。これに対して、既存の文献では、骨髄のみが検出の組織とされている(Chang
,et al.Methods & Clinical Development.20
17;DeWitt,et al.Sci Transl Med.2016;Mett
ananda,et al.Nature Communications.2017)
。
ことができる。再構築マウスモデルの細胞で遺伝子編集が行われたか否かについての判定
結果を図16に示す。移植前の細胞と移植して16週間後の末梢血、骨髄、脾臓のゲノム
を抽出し、目標フラグメントを増幅してSangerシーケンシングを行い、TIDEソ
フトウェアでIndels効率を分析した。その結果、移植して16週間後の末梢血、骨
髄、脾臓のヒト細胞がいずれも遺伝子編集され、効率は50~70%の範囲で移植前の細
胞に似ていることは示されている。
よび胎児ヘモグロビンの発現の検出
4-1.赤血球の分化
300V 1msのエレクトロポレーション条件を選択し、Cas9mRNAおよびE
nhancer-2をエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、
次の「二段階法」分化スキームを使用して分化させた。
、そして造血幹細胞の赤血球系分化脱核培地を使用して分化させることである。
SFEM IIであり、成長因子は、50~200ng/ml SCF、10~100n
g/ml IL-3、1~10U EPO/mlであり、培養条件は、造血幹細胞の赤血
球系増殖および分化培地を使用して造血幹細胞1.0×105cells/mlを培養し
、7日間増殖した。
M IIであり、成長因子は、1~10U EPO、100~1000μg/mlヒトト
ランスフェリンであり、化学的小分子は0.5~10μmのミフェプリストン(Mife
pristone)であり、前のステップで培養した1.0×106cells/mlの
細胞を造血幹細胞赤血球系分化脱核培地で5日間分化させた。
照群は何れも効率的に赤血球に分化でき、CD71とCD235aの発現率は何れも90
%以上である。
上記の赤血球が分化した細胞のmRNAを抽出し、cDNAに逆転写し、BCL11A
、HBB、HBGなどの遺伝子の発現を蛍光定量PCRによって検出し、その結果を図1
8に示す。その結果、BCL11Aのエンハンサー部位の遺伝子がノックアウトされた細
胞のBCL11A遺伝子発現が1倍ダウンレギュレーションされ、HBG発現が1倍と増
加した。
ーサイトメトリー解析の結果、BCL11Aのエンハンサー部位の遺伝子がノックアウト
された細胞は、胎児ヘモグロビンの発現が約1倍と増加したことは示されている。
遺伝子編集
5-1.β-サラセミア患者の末梢血からの造血幹細胞の単離
従来の磁気ビーズ選別によってCD34陽性の造血幹細胞を得た。結果を図20に示す
。
300V 1msのエレクトロポレーション条件を選択し、Cas9 mRNAとEn
hancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-
5およびEnhancer-6をエレクトロポレーションにより、β-サラセミア患者の
末梢血からの造血幹細胞に導入し、4日後、Indels効率を検出し、その結果を図2
1に示す。3名の異なる患者の末梢血からの造血幹細胞において、5つのsgRNAは何
れも効率的な遺伝子編集を実現でき、その中で、Enhancer-2の効率が最も高く
、70%以上にも達していることは示されている。
よるγグロビンおよび胎児ヘモグロビンの発現の検出
実施例5で遺伝子編集された造血幹細胞をインビトロで赤血球系分化させ、その方法は
実施例4-1を参照できる。分化の結果を図22に示す。実験の結果、対照群、Enha
ncer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5お
よびEnhancer-6の赤血球系分化効率が互いに近く、いずれもCD71とCD2
35a細胞膜タンパク質を高く発現したことは示されている。
A、HBB、HBG、HBAなどの遺伝子の発現を蛍光定量PCRによって検出し、その
結果を図23に示す。その結果、Enhancer-6を除き、Enhancer-2、
Enhancer-3、Enhancer-4、およびEnhancer-5は何れも細
胞におけるBCL11Aの遺伝子発現をダウンレギュレーションでき、その中で、Enh
ancer-2の効果が最も顕著であり、約1倍とダウンレギュレーションし、また、E
nhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer
-5、及びEnhancer-6がいずれもγグロビン発現を増加させることができ、そ
の中で、Enhancer-2の効果が最も顕著であり、γグロビンの発現が9倍と増加
し、臨床治療の標準に合致することは示されている。既存の文献の結果と比較して、まず
、重症のサラセミア患者に由来する造血幹細胞を最初の評価細胞ソースとして使用し、本
発明の方法が臨床治療の要件を満たすことを正確に検証した。これに対して、既存の文献
は正常のヒト骨髄または末梢血のサンプルしか使用していない。次に、既存の文献で報告
されている胎児ヘモグロビンの増加倍率は4~7倍しかなく、本発明の胎児ヘモグロビン
の発現増加倍率より低い。これは、本発明の実験結果が既存の文献報告よりもはるかに優
れていることを示している(Chang et al.Methods & Clini
cal Development.2017;Mattew C et al. Nat
ure.2015)。
r-3、Enhancer-4、Enhancer-5、及びEnhancer-6がB
CL11Aのエンハンサー部位を遺伝子編集することによる胎児ヘモグロビン(HbF)
と正常ヘモグロビン(HbA)のタンパク質発現量への影響をより正確に評価するために
、本発明では、造血幹細胞を12日間分化させた後に得られた赤血球のタンパク質を抽出
し、HPLC試験(High Performance Liquid Chromat
ography、高速液体クロマトグラフィー)を行った。その結果、1)保持時間が約
5.4分と10分でのクロマトグラフィーピークはそれぞれHbFとHbAを表す。2)
遺伝子編集されていない細胞と比べて、Enhancer-2、Enhancer-3、
Enhancer-4、Enhancer-5、及びEnhancer-6により遺伝子
編集された細胞のHbF発現量はより高く(ピークがより高く、ピーク面積がより大きい
)、HbAの発現量はより低く(ピークがより低く、ピーク面積がより小さい)、これは
、BCL11Aのエンハンサー部位の遺伝子編集はHbFの発現を増加させ、HbAの発
現をダウンレギュレーションしたことを示している。3)その中で、Enhancer-
2のHbF/HbAの比率は約5.28であり、mоckのHbF/HbAの比率は約0
.79であり、6.68倍と増加しており、Enhancer-3、Enhancer-
4、Enhancer-5、及びEnhancer-6がHbF/HbAに対する比率倍
数より有意に高い。臨床上では、本発明の背景技術に記載されているように、重度のβ-
サラセミア患者はβグロビンが欠失するため、血液中のヘモグロビンは少量のHbAと大
多数のHbFとからなり、通常は重度のβ-サラセミア患者のヘモグロビンは20g/L
くらいであり、そのうちHbFは90%以上を占めている。90%の比率を占めているこ
ととして計算すると、遺伝子編集された細胞のHbF発現量は6.68倍増加したので、
最終のヘモグロビン量は20*0.9*6.68+20*0.1=122.24g/Lで
あり、正常なヒトヘモグロビン発現量の範囲は115~150g/Lであり、この結果は
臨床治療の標準に完全に合致している(Antonio Cao,et al.Gene
s in Medicine.2010;2010年『重度のβ-サラセミアの診断と治
療のガイドライン』)。既存の文献と比較して、本発明は、β-サラセミア患者の造血幹
細胞において、胎児ヘモグロビンを改善するためのBCL11Aのエンハンサーの遺伝子
編集の有効性をHPLC実験によって正確に評価した唯一の発明研究であり、しかもその
結果、胎児ヘモグロビンの発現が有意に増加し、重度のβ-サラセミア患者を治療する臨
床要件を満たしていることを示している(Chang et al.Methods &
Clinical Development.2017;Mattew C et a
l. Nature.2015;Lin Ye,et al.PNAS.2016;Ma
tthew H. Proteus,Advances in Experimenta
l Medicine and Biology.2013)
形成
300V 1msのエレクトロポレーション条件を選択し、Cas9mRNAおよびE
nhancer-2をエレクトロポレーションにより貧血患者の末梢血由来の造血幹細胞
に導入し、500~800の細胞を1ml H4434(カナダSTEM CELLS
TECHNOLOGIESから購入)とIMDM(Thermo Fisherから購入
)およびFBS(Thermo Fisherから購入)の混合液に再懸濁し、14日後
にCFU-M、BFU-E、CFU-E、CFU-G、CFU-GM、GEMMなど形成
された異なる形のコロニー数を顕微鏡で観察し、その結果を図25に示す。
た細胞のインビトロでの分化機能が正常であり、血液系の異なる系統のコロニーに分化す
ることができることは示されている。
本実験は遺伝子シーケンシング法に係り、具体的には、遺伝子編集された貧血患者の末
梢血由来の造血幹細胞のオフターゲット効果(оff-target effect)を
次世代シーケンシング技術(Next generation sequencing,
NGS)によって分析する。
nhancer-2をエレクトロポレーションにより貧血患者の末梢血由来の造血幹細胞
に導入し、4日間増殖した後、ゲノムを抽出して次世代シーケンス分析をした。14の潜
在的なオフターゲット部位を、ソフトウェアを介して予測し、その結果を図22に示す。
6%であり、14の潜在的なオフターゲット部位の比率はいずれも0.3%未満であり、
次世代シーケンシング自体のエラーに相当することは示されている。これより明らかに、
シーケンシングエラー範囲内で、遺伝子編集によるオフターゲット現象は検出されていな
いため、この遺伝子編集スキームは安全である。
ncer-2は最良の効果を示している。
ラセミア患者由来の造血幹細胞を遺伝子編集することができ、サラセミアおよび鎌状赤血
球貧血の臨床治療の要件を完全に満たすことができる。そして、化学修飾されたsgRN
Aを使用することにより、遺伝子編集効率が高く、胎児ヘモグロビンの発現が大幅に増加
し、細胞はモデルマウスの造血系を再構築することができる。最後に、オフターゲット分
析によって高い安全性を示している。これに基づいて、本発明により開発された方法は、
従来の造血幹細胞移植治療技術に取って代わって、重度のサラセミアおよび鎌状赤血球貧
血の患者を治癒することができる。
についてのみであり、本発明の範囲を限定するものではないことは、当業者にとって自明
である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求の範囲およびその均等物によ
って限定される。
Claims (39)
- ヒト造血幹細胞の2番染色体の60495219番目から60495336番目のBC
L11Aのゲノム領域を遺伝子編集技術によって破壊することを含む、
ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン(HbF)の発現を増加させる方法。 - 前記遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、TA
LEN遺伝子編集技術またはCRISPR/Cas遺伝子編集技術である、請求項1に記
載の方法。 - 前記遺伝子編集技術がCRISPR/Cas9遺伝子編集技術である、請求項2に記載
の方法。 - 前記BCL11Aゲノムの標的ヌクレオチド配列は、配列番号3~配列番号25から選
択されるいずれか一つの配列と相補的である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法
。 - 前記BCL11Aゲノムの編集を実現するように、配列番号3~配列番号25から選択
されるいずれか一つの配列を含むsgRNAを前記造血幹細胞に導入することを含む、請
求項3または4に記載の方法。 - 前記sgRNAは、2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオによ
り修飾されたものである、請求項5に記載の方法。 - 前記化学修飾は、前記sgRNAの5’末端の最初の1つ、2つ、及び/または3つの
塩基及び/または3’末端の最後の1つの塩基の2’-O-メチル類縁体による修飾であ
る、請求項6に記載の方法。 - 前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導
入する、請求項3~7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチドとをエレクトロポレーションに
よって一緒に前記造血幹細胞に導入する、請求項8に記載の方法。 - 前記エレクトロポレーション条件は、200~600V、0.5~2msである、請求
項9に記載の方法。 - 配列番号3~配列番号25から選択されるいずれか一つの配列を含む、2’-O-メチ
ル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオにより修飾されたsgRNAを造血幹細胞
に導入することを含む、CRISPR/Cas9システムを介してインビトロで造血幹細
胞を効率的に編集する方法。 - 前記sgRNAとCas9をコードするヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入
する、請求項11に記載の方法。 - sgRNAと、Cas9をコードするヌクレオチドとをエレクトロポレーションによっ
て一緒に前記造血幹細胞に導入する、請求項12に記載の方法。 - 前記エレクトロポレーション条件は、200~600V、0.5~2msである、請求
項13に記載の方法。 - 請求項1~14のいずれか一項に記載の方法によって得られた造血幹細胞。
- 胎児ヘモグロビン(HbF)の発現が遺伝子改変によって増加したヒト造血幹細胞であ
って、前記造血幹細胞の2番染色体の60495219番目から60495336番目の
BCL11Aゲノム領域が遺伝子編集技術によって破壊された、ヒト造血幹細胞。 - 請求項15または16に記載の造血幹細胞を分化培養することにより得られた、成熟赤
血球の前の分化の異なる段階にある前駆細胞。 - 請求項15または16に記載の造血幹細胞を分化培養することにより得られた成熟赤血
球。 - 胎児ヘモグロビン(HbF)の発現が遺伝子改変によって増加した成熟赤血球またはそ
の前駆細胞を製造する方法であって、
(a)請求項1~14のいずれか一項に記載の方法を使用して遺伝子改変された造血幹
細胞を得ることと、
(b)造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地を使用して、前記遺伝子改変された造血
幹細胞に対して造血幹細胞赤血球系増殖および分化を行うこととを含み、
前記造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地は、基礎培地と、成長因子組成物とを含み
、前記成長因子組成物は、幹細胞成長因子(SCF)、インターロイキン3(IL-3)
、およびエリスロポエチン(EPO)を含む、方法。 - 赤血球系分化脱核培地を使用して造血幹細胞の赤血球系分化および脱核を行うことをさ
らに含み、
前記赤血球分化脱核培地は、基礎培地、成長因子、およびプロゲステロン受容体とグル
ココルチコイド受容体の拮抗薬および/または阻害剤を含む、
請求項19に記載の方法。 - 請求項15または16に記載の造血幹細胞、若しくは請求項17に記載の前駆細胞、若
しくは請求項18に記載の成熟赤血球を含む、組成物。 - 請求項15または16に記載の造血幹細胞、若しくは請求項17に記載の前駆細胞、若
しくは請求項18に記載の成熟赤血球を含む、医療製品。 - 請求項15または16に記載の造血幹細胞、若しくは請求項17に記載の前駆細胞、若
しくは請求項18に記載の成熟赤血球のそれの必要がある被験者の疾患の予防または治療
における、使用。 - 前記疾患が貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の輸血を
必要とする他の疾患である、請求項24に記載の使用。 - 前記疾患はβ-サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、請求項25に記載の使用。
- 前記被験者はヒトである、請求項24~26のいずれか一項に記載の使用。
- 被験者の疾患を予防または治療するための薬剤または医療製品の調製における、請求項
15または16に記載の造血幹細胞、若しくは請求項17に記載の前駆細胞、若しくは請
求項18に記載の成熟赤血球の使用。 - 前記疾患が貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の輸血を
必要とする他の疾患である、請求項28に記載の使用。 - 前記疾患はβ-サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、請求項29に記載の使用。
- 前記被験者はヒトである、請求項28~30のいずれか一項に記載の使用。
- 配列番号3~配列番号25から選択される一つのヌクレオチド配列を含む、sgRNA
構築体。 - 2’-O-メチル類縁体及び/またはヌクレオチド間3’チオ修飾を含む、請求項32
に記載の構築体。 - 前記化学修飾は、配列番号3~配列番号25から選択される一つのヌクレオチド配列の
5’末端の最初の1つ、2つ、及び/または3つの塩基及び/または3’末端の最後の1
つの塩基の2’-O-メチル類縁体による修飾である、請求項33に記載の構築体。 - 請求項32~34のいずれか一項に記載の構築体を含むベクター、宿主細胞または製剤
。 - 造血幹細胞の遺伝子編集における、請求項32~34のいずれか一項に記載の構築体の
使用。 - 請求項15または16に記載の造血幹細胞、請求項17に記載の前駆細胞、若しくは請
求項18に記載の成熟赤血球を被験者に投与することを含む、被験者の貧血疾患、出血性
疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の輸血を必要とする他の疾患を治療また
は予防する方法。 - 前記疾患はβ-サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、請求項37に記載の方法。
- 前記被験者はヒトである、請求項38に記載の方法。
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---|---|---|---|
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