CN105238758A - 一种体外获得造血干/祖细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物领域，公开了一种体外获得人多能干细胞来源的造血干/祖细胞的方法。本发明所述方法用添加了ITS的stemlineⅡ的基础培养基进行培养人多能干细胞，并在不同时期添加不同的细胞因子；添加细胞因子BMP4和Activin？A培养4天后，换用细胞因子VEGF和SCF培养2天；换用造血干/祖细胞维持及扩增相关的细胞因子培养8天，获得的造血干/祖细胞具备造血分化多潜能性。实验证实添加嘧啶吲哚衍生物UM171提高了多能干细胞向造血干/祖细胞分化的效率一倍以上，具有良好的应用前景。

Description

一种体外获得造血干/祖细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种体外高效获得人多能干细胞来源的造血干/祖细胞的方法。

背景技术

造血干细胞：(hematopoieticstemcell，HSC)是骨髓中的多能干细胞，能够***形成两种类型的细胞：一种仍然作为干细胞，但另一种成为祖细胞(progenitorcell)，即次一级的干细胞，又称为爆发集落形成单位(burstformingunits，BFUs)和集落形成单位(colony-formingunits，CFUs)，它们可***形成多种类型的细胞群，包括：粒性白细胞、单核细胞、血小板、红细胞、T细胞与B细胞等。造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所有造血细胞和免疫细胞的起源。

体内畸胎瘤生血模式虽然能获得造血干细胞，但该分化体系技术复杂，变量太多，获得的造血干/祖细胞效率低下，而且体内畸胎瘤模型分离造血干/祖细胞困难，耗时(仅仅畸胎瘤形成就得耗时2个月以上)，容易引入异种病原污染。体内分化畸胎瘤法获得血液细胞存在效率低下、过程繁琐等问题。

目前体外诱导人多能干细胞定向分化为血液细胞的方法主要有以下几种：1)EB法；2)多能干细胞与基质细胞共培养法；3)2D单层诱导法。体内分化方法主要是畸胎瘤法。

通过EB法获得血液细胞效率低下、无法获得真正的HSC；通过基质细胞共培养获得血液细胞效率低，不可控的因素众多造成的效率不稳定，也无法获得真正的HSC；2D单层诱导法可以通过优化体系在无血清、无饲养层及成分确定的诱导分化培养基的条件下开展，需要解决的问题仍然是提高分化效率和获得真正的HSC。

综上，目前体外诱导人多能干细胞定向分化为造血细胞存在定向分化效率低下、获得的造血干/祖细胞多潜能性差等瓶颈，具体表现为人多能干细胞向血液细胞分化的效率低，饲养细胞及血清等成分容易引入病原污染，无法满足临床移植GMP级别要求，亟需发展出新的体外诱导人多能干细胞定向分化为血液细胞的方法。

发明内容

本发明针对上述问题，通过筛选小分子化合物及优化无血清、无饲养细胞的途径提高了多能干细胞向造血分化的效率，并且所获人的造血干/祖细胞的百分率和得率明显提高，体外集落形成实验表明成功获得分化来源的多潜能造血干/祖细胞，为临床多能干细胞分化来源的造血干/祖细胞应用奠定了基础。

发明人利用人多能干细胞2D单层诱导法发现，嘧啶吲哚衍生物UM171可以提高人多能干细胞向血液细胞分化的效率，CFU实验证明获得的血液细胞含有包括造血干细胞在内的多潜能造血干/祖细胞。

UM171((1r，4r)-N1-(2-benzyl-7-(2-methyl-2H-tetrazol-5-yl)-9H-pyrimido[4，5-b]indol-4-yl)cyclohexane-1，4-diamine，其结构式如下：

本发明提供的体外一种体外获得人造血干/祖细胞的方法，包含以下步骤：步骤1：将无饲养层培养传代40-70代的人多能干细胞用EDTA消化法制备hES克隆，种植到matrigel包被过的细胞培养板上，补加mTeSR培养24小时；

步骤2：换用添加了ITS的stemlineⅡ的基础培养基进行培养，并在不同时期添加不同的细胞因子；添加细胞因子BMP4和ActivinA培养4天后，换用细胞因子VEGF和SCF培养2天；换用造血干/祖细胞维持及扩增相关的细胞因子培养8天，获得人造血干/祖细胞。

作为优选，步骤1所述hES克隆为几十到几百个hES细胞的克隆团块。

作为优选，BMP4浓度为10-30ng/ml，ActivinA浓度为8-12ng/ml。更优选地，BMP4浓度为20ng/ml，ActivinA浓度为10ng/ml。

作为优选，VEGF的浓度为30-50ng/ml，SCF浓度为40-60ng/ml。更优选地，VEGF的浓度为40ng/ml，SCF浓度为50ng/ml。

作为优选，所述使用造血干/祖细胞维持及扩增相关的细胞因子为SCF、Flt-3L、TPO、IL-3、IL-6与UM171的组合。

作为优选，所述细胞因子浓度为SCF40-60ng/ml，FLT-3L40-60ng/ml，TPO8-12ng/ml，IL-340-60ng/ml，IL-640-60ng/ml，UM17140-50ng/ml。更优选地，所述细胞因子浓度为SCF50ng/ml)，FLT-3L50ng/ml，TPO10ng/ml，IL-350ng/ml，IL-650ng/ml，UM17145ng/ml。

实验证实，嘧啶吲哚衍生物UM171能够提高人多能干细胞(ES，iPS)向造血干/祖细胞定向分化的效率，通过该方法获得的造血干/祖细胞具备造血分化多潜能性。提高了多能干细胞向造血干/祖细胞分化的效率达一倍以上(见附图2)，获得的造血干/祖细胞具备造血分化多潜能性，具有良好的应用前景。

术语与定义

mTeSR：mTeSR是一种无血清的用于hES/iPS维持培养的商品化培养基，用前将400ml基础培养基(Catalog#05851)和100ml5×添加物(Catalog#05852)充分混匀，作为hES/iPS维持培养的完全培养基。

stemlineII：StemlinII作为hES/iPS造血分化的基础培养基(Catalog:#S0192；Sigma-Aldrich)是一种无血清、无动物源性成分的商品化的造血干细胞培养基，可用于扩增骨髓、脐带血和动员的外周血中的造血干细胞，该培养基可维持已分化造血细胞和未分化造血细胞的平衡，并实现两种类型细胞最大程度的扩增。

ITS：ITS(Cat.No:41400-045,Gibco)作为一种常用的培养基添加物，可以促进多种贴壁细胞的生长，减少细胞对血清的依赖性。用法：作为hES/iPS造血分化基础培养基的添加物，100X使用。

附图说明

图1为本发明所述分化过程示意图。

图2为UM171提高多能干细胞来源的CD34+CD45+细胞的百分率。

图3示分化过程中添加UM71分选多能干细胞来源的CD34+CD45+细胞形成的造血各谱系CFU。

具体实施方式

本发明公开了一种获得人多能干细胞来源的造血干/祖细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：人多能干细胞的维持培养：

人多能干细胞使用H1、H9细胞株或者病人来源的iPS细胞株，在Matrigel上进行无饲养层培养(mTeSR)，hES克隆汇合度达80％左右时进行传代，传代使用EDTA消化法，根据细胞密度，按照1:4～1:5的比例，每4～5天传代1次，用于造血诱导分化实验的hES在40～70代之间。

实施例2：人多能干细胞的2D单层造血诱导分化：

分化采用文献报道的方法，并进行适当改进。hES细胞在matrigel汇合度达80％左右，用EDTA消化法制备较小的hES克隆(几十到几百个hES细胞克隆团块)，按照1:30-1:35/孔(12孔板)的比例种植到matrigel包被过的细胞培养板上，补加mTeSR到1ml/孔。培养24h后，开始进行造血诱导分化，分化过程分三步，培养基为stemlineⅡ+ITS+细胞因子组合(在分化的不同阶段使用不同的细胞因子组合)，具有分化过程如附图1所示。第一步(D0-D4)：添加细胞因子BMP4(20ng/ml)和ActivinA(10ng/ml)，第二步(D4-D6)：添加VEGF(40ng/ml)和SCF(50ng/ml)，第三步(D6-D14)：使用的细胞因子为造血干/祖细胞维持及扩增相关细胞因子，包括：SCF(50ng/ml)，FLT-3L(50ng/ml)，TPO(10ng/ml)，IL-3(50ng/ml)，IL-6(50ng/ml)。D14收集细胞，制备单细胞悬液，进行免疫表型分析及集落培养实验。

实施例3：对照研究

实验对照组：

基础培养基：stemlineⅡ+ITS

细胞因子组合：D0-D4:BMP4+ActivinA，D4-D6:vEGF+SCF，D6-D14:SCF+Flt-3L+TPO+IL-3+IL-6；所述细胞因子浓度为SCF50ng/ml，FLT-3L50ng/ml，TPO10ng/ml，IL-350ng/ml，IL-650ng/ml。

实验组：

基础培养基：stemlineⅡ+ITS

细胞因子组合：D0-D4:BMP4+ActivinA，D4-D6:vEGF+SCF，D6-D14:SCF+Flt-3L+TPO+IL-3+IL-6+UM171(100nM)，使用的细胞因子包括：SCF，FLT-3L，TPO，IL-3，IL-6。所述细胞因子浓度为SCF50ng/ml，FLT-3L50ng/ml，TPO10ng/ml，IL-350ng/ml，IL-650ng/ml，UM17145ng/ml。

与对照组相比，添加UM171后，H1分化来源的CD34+CD45+造血干/祖细胞的百分率明显提高。结果见附图2。说明UM171能够显著提高人多能干细胞来源的造血干/祖细胞的分化效率。

参照以上方法，在H9，humaniPS细胞株验证，趋势与H1类似，即添加UM171可以提高人多能干细胞来源的造血干/祖细胞的分化效率。

实施例4：

添加UM171后，H1分化来源的CD34+CD45+造血干/祖细胞在CFU培养基上能够形成CFU-GEMM，BFU-E，CFU-G，CFU-M，CFU-GM等多个谱系集落，表明含有多潜能的造血干/祖细胞(附图3)。

附图3：在添加UM171条件下，H1分化来源的CD34+CD45+造血干/祖细胞在H4434半固体培养基上培养14d形成的典型的造血谱系集落。

包括证实培养起始细胞存在造血干/祖细胞的集落CFU-GEMM，以及分别证实培养起始细胞存在红系、粒系、单核/巨噬系、粒-单核/巨噬系的集落B/CFU-E、CFU-G、CFU-M、CFU-GM。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种体外获得人造血干/祖细胞的方法，包含以下步骤：

步骤1：将无饲养层培养传代40-70代的人多能干细胞用EDTA消化法制备hES克隆，种植到matrigel包被过的细胞培养板上，补加mTeSR培养24小时；

步骤2：换用添加了ITS的stemlineⅡ的基础培养基进行培养，并在不同时期添加不同的细胞因子；添加细胞因子BMP4和ActivinA培养4天后，换用细胞因子VEGF和SCF培养2天；换用造血干/祖细胞维持及扩增相关的细胞因子培养8天，获得人造血干/祖细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述hES克隆为含几十到几百个hES细胞的克隆团块。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，BMP4浓度为10-30ng/ml，ActivinA浓度为8-12ng/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，BMP4浓度为20ng/ml，ActivinA浓度为10ng/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，VEGF的浓度为30-50ng/ml，SCF浓度为40-60ng/ml。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，VEGF的浓度为40ng/ml，SCF浓度为50ng/ml。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述使用造血干/祖细胞维持及扩增相关的细胞因子为SCF、Flt-3L、TPO、IL-3、IL-6与UM171的组合。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子浓度为SCF40-60ng/ml，FLT-3L40-60ng/ml，TPO8-12ng/ml，IL-340-60ng/ml，IL-640-60ng/ml，UM17140-50ng/ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子浓度为SCF50ng/ml，FLT-3L50ng/ml，TPO10ng/ml，IL-350ng/ml，IL-650ng/ml，UM17145ng/ml。