CN107151655A - 一种细胞扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
一种细胞扩增的方法,能够高效率地扩增造血干细胞。主要采用UM171及间充质干细胞联合培养基。本法培养细胞扩增量高、细胞活性好。
Description
技术领域
本发明涉及细胞扩增领域,特别是造血干细胞系包扩增领域.
背景技术
自1989[1]年第一例脐带血移植开展以来,脐带血作为造血干细胞(hematopoieticstem cells,HSCs)的重要来源一直备受关注,脐带血移植的优势在于其不需要严格的人类白细胞主要抗原(human leukocyte antigen,HLA)配型,对供者无伤害且不存在伦理问题,感染风险小,可冷冻保存使用便捷[2,3]等。制约其在临床中大量应用的最主要障碍在于脐带血中HSCs的数量有限,移植后会导致造血恢复延迟,感染风险增加等问题[4]。而双份脐带血移植则会增加移植的风险,导致植入延迟等问题出现,且会增加患者经济负担[5]。近年来国内外一直尝试对脐带血来源造血干祖细胞(hematopoieticstemprogenitorcells,HSPCs)进行体外扩增,以解决其细胞数量不足的问题。目前HSPCs扩增技术主要有细胞因子扩增技术,化学分子扩增技术,联合培养扩增技术以及三维培养***的应用[6]。涉及脐血源HSPCs扩增实验已经进入临床实验阶段,并证实了扩增后HSPCs的安全性及有效性[7],但最佳的扩增条件至今尚没有明确的共识。
造血微环境在HSCs的成长分化过程中扮演重要角色,体外培养过程中能否更有效的模拟造血微环境,是决定HSPCs体外扩增效果的重要先决条件。间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSC)作为造血微环境的重要组成部分,可以分泌造血生长因子和细胞因子,为HSPCs的增殖提供信号,研究表明其与HSPCs共培养可以显著提高扩增效率[8]。UM 171是造血干细胞龛中筛选出的选择性的人HSCs再生激动剂,可以选择性的增加长期HSPCs的再生[9]。鉴于以上结果,为更有效的模拟造血微环境,本发明采用与脐血同源的MSC与UM171联合应用于脐血HSPCs的体外扩增培养,取得了较好的效果,目前该方法国内外均无相关报道。
发明内容
附图说明
图1是倒置显微镜下观察MSCs及CD34+细胞培养形态,a为MSC贴壁培养细胞照片(X200);b为UM171组培养细胞照片(X40)
图2是流式细胞仪对MSCs表面抗原检测结果
图3是光学显微镜下观察MSCs分化诱导成像(X200),a图为MSCs成骨诱导后细胞照片;b图为MSCs成脂诱导后细胞照片;c图为成软骨诱导后细胞照片。
图4是各组培养过程不同时间点细胞总数变化情况
图5是各组细胞培养后流式检测情况
图6是细胞凋亡流式检测图a图为对照组凋亡流式检测图;b图为联合组凋亡流式检测图
图7是倒置显微镜下观察各谱系集落形成(X200),其中a图为CFU-E;b图为BFU-E;c图为CFU-GM;d图为CFU-GEMM
具体实施方式
一、材料
1.标本采集:实验用脐带及脐血均源自307医院产科,报经医院伦理委员会批准(伦理编号KY-2016-8-36)并征得产妇及家属同意。健康足月顺产产妇娩出胎盘后,无菌剪刀采集脐带30cm,并收集于相应脐血储存于脐血采集袋中。
2.实验用试剂:UM171(美国Selleck公司);无血清扩增培养基(StemSpanTMSFEMⅡ,美国StemCell公司)、甲基纤维素培养基(MethoCultTM,美国StemCell公司);干细胞因子(SCF,美国R&D Systems)、促血小板生成素(TPO,美国R&D Systems)、fms样酪氨酸激3(FLT3,美国R&D Systems);Ficoll淋巴细胞分离液(美国GE医疗集团);胎牛血清(FBS,美国Gibco公司)、磷酸盐缓冲液(PBS,美国Gibco公司)、双抗(美国Gibco公司)、DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)、成骨诱导培养基(美国Gibco公司)、成脂诱导培养基(美国Gibco公司)、成软骨诱导培养基(美国Gibco公司);Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)、胰蛋白酶(美国Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA,德国MACS公司);乙二胺四乙酸缓冲液(EDTA,德国MACS公司);CD34 MicroBead Kit UltraPure(德国MACS公司)。
二、方法
(一)实验分组
依据是否与MSC共培及是否添加UM171将实验分为以下四组:对照组、UM171培养组、MSC共培养组、UM171及MSC共培养组。每次培养设3个副孔,重复6次。
(二)细胞制备
1.MSC制备:采集到的脐带在无菌条件下应用含1%双抗的生理盐水反复冲洗,手术剪剪至1mm3小块,转移至含有0.2%Ⅱ型胶原酶的DMEM/F12培养基中,置于37℃震荡消化1h,得到的消化液分别过100目及50目滤网,滤液900×g离心15min洗涤2遍,弃上清后重悬于培养基中(包含20%FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1%双抗及DMEM/F12培养基)。
2.脐血CD34+细胞制备:脐血与PBS按1:2稀释,50ml离心管中加入20ml Ficoll密度梯度淋巴分离液,倾斜离心管,缓慢加入30ml稀释后各血样至分离液上层。4℃下400×g离心30min,吸取中层灰白色单个核细胞层至50ml离心管中,加入5倍体积PBS混匀后400×g离心10min清洗2次,加入含0.5%BSA EDTA缓冲液300μl重悬并计数。采用德国美天尼公司CD34磁珠分选技术,将上述单个核细胞悬液分别加入100μl FcR Blocking reagent和CD34MicroBeadsUltraPure混匀后置于4℃冰箱孵育30min。孵育完成后加入10ml MACS缓冲液1700rpm离心10min,去上清加入MACS缓冲液500μl重悬。500μl MACS缓冲液预湿分选柱,将上述悬液过柱子后,500μlMACS缓冲液清洗3次,将分选柱移出磁场,加入2mlMACS缓冲液,迅速用配套活塞推出液体至15ml离心管中,计数备用。
(三)细胞扩增培养
1.对照组:对照组采用StemSpanⅡ无血清培养基,添加100ng/ml SCF,100ng/mlFLT3,50ng/ml TPO六孔板中细胞接种密度为1╳105/孔,置于37℃5%CO2培养箱培养10天。
2.UM171扩增组:采用StemSpanⅡ无血清培养基,添加100ng/ml UM171,以及100ng/ml SCF,100ng/mlFLT3,50ng/ml TPO,取适量培养基于六孔板中,分选的CD34+细胞接种密度为1×105/孔,置于37℃5%CO2培养箱中,间隔3~4天换液,培养10天后行指标检测。
3.脐带MSC共培养组:上述细胞制备得到的脐带MSC贴壁培养48h后去除未贴壁细胞继续培养,间隔3~4天换液1次。待细胞90%融合后,0.25%胰蛋白酶消化并传代,3次传代后以5×104/孔浓度铺于6孔板中,加入MSC培养基,待细胞贴壁90%融合后采用GWXJ80型60Co照射,总剂量为10Gy,去除培养基,加入StemSpanⅡ无血清培养基,并添加100ng/mlSCF,100ng/mlFLT3,50ng/ml TPO,按1×105/孔密度接种上述细胞制备得到的CD34+细胞,置于37℃5%CO2培养箱培养10天,间隔3~4天换液。
4.UM171及MSC共培养组:参照脐带MSC共培养组培养方法,培养基中额外添加100ng/ml UM171。
(五)流式检测
采用BD FACSCalibur流式检测仪,取培养前及培养后细胞悬液20μl均分为2管,1管加入FITC标记的抗体CD34,PE标记的抗体CD133,APC标记的抗体CD38;2管加入1管对应同型对照抗体FITC标记的抗体Mouse IgG2a,PE标记的抗体Mouse IgG1,APC标记的抗体MouseIgG2a。各管涡旋震荡后室温下避光孵育15min,加入适量PBS,500×g室温水平离心5min,弃上清液,加入PBS 100μl上机测定。
(六)MSC诱导分化实验
脐带MSCs贴壁培养至第三代,融合70%,去除培养基,分别添加成骨诱导培养基,成脂诱导培养基及成软骨诱导培养基,间隔3~4天换液,培养21天固定后分别行碱性磷酸酶染色、油红O染色和阿尔新蓝染色。
(七)集落培养实验
采用MethoCuhTmGF(H4434)培养体系,六孔板中加入培养基1ml/孔,CD34+细胞接种密度为1000/孔,置于37℃5%CO2培养箱培养14天,计数各系集落数目。
(八)细胞凋亡实验
采用BDAnnexin V PE Apoptosis kit细胞凋亡检测试剂盒,分别取各组培养后细胞,经PBS洗涤离心后采用缓冲液调整细胞浓度至1*106/ml,取100μl细胞液至5ml离心管中,加入5μl PE膜联蛋白以及5μl 7-ADD,室温避光反应15min,加入400μl缓冲液后行流式测量。
三、统计学分析方法
采用SPSS18.0软件进行统计处理,扩增后细胞数量及流式测量细胞百分比均以表示,组间细胞扩增后数量、细胞流式表型比例以及各系集落培养结果比较采用方差分析,两组之间上述数据比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
四、结果
(一)、MSC表型测定
间充质干细胞置于37℃5%CO2培养箱体外培养,培养第3天可见成克隆增长的梭形贴壁细胞,传代后1周细胞融合可达90%(见图1),取第3代细胞胰酶消化后流式测定CD105,HLA-DR,CD73,CD90,CD14,CD34,CD19,CD45及SSEA-4等细胞表型(见图2)。结果可见未分化MSC高表达CD105,CD73,CD90,表达率均高于99%,不表达CD14,CD34,CD19,CD45,HLA-DR,表达效率均低于1%,MSC标志物SSEA-4表达率在0.98±0.51%。MSCs经诱导分化可形成成骨细胞(图3a),脂肪细胞(图3b),和软骨细胞(图3c),证明其具多谱系分化潜能。
图1中a为MSC贴壁培养1周后,细胞成梭形形态,成纤维细胞状,细胞间成网状、辐射状排列(X200);b为UM171组培养10天后,CD34+细胞呈圆形状态,聚集成团悬浮于培养基中(X40)
图3中a图为MSCs成骨诱导后细胞体积变大,呈重叠生长,细胞基质钙盐逐渐沉积形成多层钙结节,碱磷酶染色阳性;b图为MSCs成脂诱导后,成纤维样细胞逐渐变成圆形细胞,并可观察到高折光性的空泡脂滴,脂滴油红O染色呈阳性;c图为成软骨诱导后细胞慢慢变小,间隙逐渐增大,细胞呈不规则形状,形成软骨基质,阿尔新蓝染色呈阳性。
(二)、磁珠分选效果
CD34+细胞的纯度和活力分别采用流式细胞仪和台盼蓝染色分析,经检验分离得到细胞的纯度和存活率分别为(96.46±2.92)%和(92.63±3.56)%。
(三)、扩增效果比较
对照组CD34+细胞10天培养后细胞总数扩增3.7倍,CD34+细胞扩增3.5倍;UM171组经10天培养后细胞总数扩增14倍,CD34+细胞扩增13.5倍(见图1b);MSCs共培养组细胞总数扩增11倍,CD34+细胞扩增10倍;联合培养组细胞总数在第10天扩增达22倍,CD34+细胞扩增21倍,扩增后3组细胞总数及CD34+及CD133+差异均存在统计学意义。各组细胞培养情况见图4,各组培养后细胞总数、CD34+及CD133+细胞数见表1。
表1 培养后各组细胞总数及CD34+细胞数情况
(四)、流式检测结果
各组培养10天后收获细胞进行流式检测,结果显示UM171联合MSCs组得到CD34+CD38-细胞比例为(91.49±2.67)%,较MSCs及UM171组均存在显著差异,含UM171培养体系CD133细胞比例较单独MSCs培养组存在差异。各组细胞培养后流式检测情况见表2。
表2 培养后各组细胞流式表型情况
2.5细胞凋亡实验
见图6,对照组细胞早期凋亡比例约为1.5%晚期凋亡比例为1%,死亡细胞约3%;余三组细胞早期凋亡比例约为1%,晚期凋亡比例约为1%,组别间无明显差异。
2.6集落培养效果
分别对未扩增脐血及三组扩增后CD34+行集落培养,培养第3天可见集落形成,扩增后细胞经甲基纤维素培养14天后集落形成良好(见图7),各组集落计数见表3。数据分析显示,MSCs扩增组集落形成能力较其他各组存在差异,在红系及粒系形成能力方面差异较为明显,扩增体系中包含UM171的两组与脐血对照组无明显差异。
表3 扩增前后各组细胞集落培养情况
脐血来源HSPCs体外扩增体系较多,从最初的添加细胞因子向多种手段联合应用发展,以期获得更好的扩增效果,但长期体外培养对HSPCs干性损伤较大,研究表明体外培养时间控制在2周以内可以更好地保留扩增后细胞干细胞特性。造血微环境是能够支持造血干细胞定居、自我更新以及繁殖分化的特殊生理环境,造血组织中的非造血细胞对造血增值分化发挥着特殊作用,目前的扩增体系也大都基于模拟造血微环境对HSPCs行体外扩增。体外培养过程中造血微环境对干性保持起着重要作用,MSCs作为造血微环境的重要组份,其作为饲养层与CD34+细胞共培养,可通过分泌细胞因子、生长因子和黏附分子细胞支持HSPCs的生长和增殖,提高其生存率和自我更新能力[9]。既往研究表明MSCs经传代培养后,细胞因子分泌能力有所下降。实验中采用与脐血同源的第3代MSCs,其流式表型及诱导分化能力较为稳定。
添加细胞因子作为HSPC体外培养的基础方法,其在调节HSPC增殖、分化、生存中发挥重要作用[11],应用于HSPCs扩增的细胞因子及其组合方式很多,但一般均包含以下3个细胞因子:SCF、TPO以及FLT3,该组合可有效提高细胞存活率、细胞端粒长度、黏附因子表达及干细胞扩增[12,13]。
在造血干细胞龛中通过高通量筛选出小分子化学物质在HSPCs扩增应用越来越广泛,其特点就是在提高扩增效率的同时可以较好的保持细胞干性。UM729是存在于造血干细胞龛中的小分子化合物,它能够增加人的CD34+CD45RA-外周血细胞比例。UM171是UM729的类似合成物,研究表明其扩增能力是UM729的10-20倍,经UM171扩增后CD34+细胞在猕猴体内植入效率可以提高约3倍。UM171对有丝***和表型上原始种群的***速度没有影响。此外,UM171与StemRegenin(SR1)协作可以增加短期性祖细胞的扩张。而UM171自身可以显著扩大长期正常的造血干细胞[8]。本实验中同样发现添加UM171的培养体系在HSPCs扩增中可有效提高CD34+CD38-及CD133细胞比例。
试验结果表明细胞因子联合MSCs或UM171均可对HSPCs进行有效扩增,二者联合应用在提高扩增效率同时可以更有效对CD34+CD38-进行扩增,扩增效率可达20倍,凋亡实验显示MSCs联合UM171在增加扩增效率同时并未增加细胞凋亡比例,集落培养实验表明该方法扩增后细胞较MSCs扩增组的红系及粒系形成能力存在优势。
造血干细胞移植前,患者通常接受清髓的放射治疗,移植的造血干细胞寄宿在照射的基质并增殖分化,最终重建造血***。照射的基质可能刺激造血干细胞,Celebi等人[14]的研究认为照射的MSCs能够更好的模拟造血干细胞龛从而支持HSPCs扩增。Walenda也验证了照射后MSCs扩增的HSPCs中CD34+CD38-比例较未照射提高[15]。实验中我们同样选择照射处理的MSCs对HSPCs进行扩增,取得较好效果。
HSPCs扩增数量与其干性保持的矛盾是目前需探讨的一个重要问题,未分化的HSCs是体外扩增的追求目标,目前技术层面下扩增的更多是祖细胞而非干细胞,多数临床实验研究结果表明,扩增后的HSPCs长期造血功能并未得到明显改善,但高剂量的HSPCs输注后可以显著缩短UCBT患者全血细胞减少期,减少机会感染及移植相关疾病发病率和死亡率,因此HSPCs体外扩增仍具有较好的科研前景。
综上所述,本发明建立了全新的基于模拟造血微环境的HSPC体外培养体系,该体系可实现HSPCs数量扩增一个数量级,培养后CD34+CD38-细胞比率较高,体外实验初步验证了其具有长期造血重建功能,后续将在动物模型上进一步评估其移植后造血重建能力。
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Claims (7)
1.一种造血干细胞体外培养方法,其特征在于采用UM171及间充质干细胞联合培养,包括如下步骤:
1)培养间充质干细胞并传代;
2)加入UM171及间充质干细胞联合培养基。
2.如权利要求1所述的培养方法,其特征在于还包括步骤3)用60Co照射,总剂量为5-15Gy。
3.如权利要求2所述的培养方法,其特征在于还包括步骤4)除去步骤2)的培养基并用无血清培养基培养。
4.如权利要求1-3之一所述的培养方法,其特征在于UM171的浓度为100ng/ml。
5.如权利要求1-3之一所述的培养方法,其特征在于细胞培养时间为2周以内。
6.如权利要求1-3之一所述的培养方法,其特征在于步骤1)中间充质干细胞培养方法为:贴壁培养48h后去除未贴壁细胞继续培养,间隔3~4天换液1次。待细胞90%融合后,0.25%胰蛋白酶消化并传代,3次传代以1×105/孔浓度加入培养器皿中。
7.如权利要求3所述的培养方法,其特征在于步骤4)中无血清培养基中添加100ng/mlSCF,100ng/mlFLT3,50ng/ml TPO,按5×104/孔密度接种分选的CD34+细胞,置于37℃5%CO2培养箱培养10天,间隔3~4天换液。
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李猛等: "脐带间充质干细胞联合UM171对脐血源CD34+细胞的扩增效果研究", 《中华细胞与干细胞杂志(电子版)》 * |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20170912 |