CN105854017A - 一种治疗β-地中海贫血的试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗β‑地中海贫血的试剂及其应用,所述的试剂通过降低miR‑144/451基因的表达水平或miR‑144/451量的来治疗β‑地中海贫血。本发明构建miR‑144/451基因敲除β‑地贫鼠模型,将β‑珠蛋白基因敲除的β‑地中海贫血鼠和miR‑144/451基因敲除鼠通过遗传学培植方法,基因型鉴定得到的miR‑144/451基因敲除的β‑地贫鼠模型,该类β‑地中海贫血小鼠的贫血由重度改为轻度,全血细胞分析提示红细胞计数及血红蛋白水平明显增高,脾脏体积减小,小鼠红细胞形态大小均匀,说明小鼠贫血症状明显改善,miR‑144/451基因敲除的β‑地贫鼠为研究贫血改善的分子机制提供可靠的体内模型。利用降低β‑地中海贫血血细胞中的miR‑144/451的方法治疗β‑地中海贫血具有潜在的巨大经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,更具体地说,涉及一种治疗人类β-地中海贫血的试剂及其应用。
背景技术
人类β-地中海贫血是由β珠蛋白基因突变引起的遗传性疾病,为人类最常见的单基因遗传病,主要分布在地中海地区、中非洲、亚洲、南太平洋地区以及中国南方地区,在我国,广东、广西、海南、澳门及香港五省区为高发区。目前已发现的β-地贫的突变达200多种。流行病学调查显示,全球目前有β珠蛋白突变基因携带者超过7500万,2009年广西壮族自治区妇幼卫生监测到重症β-地贫发生率为2.58%。β-地中海贫血的发病机制是由于β珠蛋白基因突变引起β珠蛋白肽链合成减少或完全缺如,造成与其匹配的α链相对过剩,过剩的α链在红细胞膜上沉淀形成包涵体,最终导致红细胞前体细胞凋亡增加等引起严重慢性溶血性贫血。
临床上β-地贫分轻、中、重三种。轻、中型无症状或症状较轻。重症地贫又称Cooley贫血,生长发育迟缓,头颅变形呈典型性“地中海贫血貌”,肝脾因代偿性造血呈进行性肿大,血常规及红细胞形态异常,基因检测可鉴定β-珠蛋白的点突变或缺失。目前,定期输血及口服铁螯合剂作为β-地中海贫血的常规治疗,临床应用广泛。但长期输血及β地中海贫血疾病本身均导致肠道铁吸收增加形成铁负荷过重,心肌、肝、胰、脑等实质性脏器的铁沉积以及继发感染均可引起相关脏器的功能障碍及衰竭,最终威胁患者生命。骨髓移植及异体造血干细胞移是一种治疗β-地贫的有效方法,可达到完全治愈效果。但由于对配子要求高,成功率低,术后需长期抗免疫治疗,毒副作用大,加上昂贵费用,限制了多数患者尤其是发展中国家及贫困地区患者的移植治疗。
近年来应用慢病毒载体在患者体内导入正常的β珠蛋白基因或纠正β珠蛋白突变基因的治疗取得很大进展,研究已表明β珠蛋白基因组控制区域(β-LCR)调控异常和该基因的突变均可引起β珠蛋白合成障碍,特异性影响血红蛋白的生成。通过导入正常β珠蛋白基因、启动子或促进β-LCR功能均可促进β珠蛋白的表达,起到改善β地中海贫血的作用。Cavazzana等研究运用病毒载体将正常β珠蛋白基因导入重症βE/β0成年地中海贫血,激活红系细胞中高迁移率族蛋白A2(HMGA2)转录,提高γ珠蛋白表达,血红蛋白水平维持在9-10克/分升,约1/3的血红蛋白由病毒载体编码的β-珠蛋白基因所产生。诸如此类将β珠蛋白基因通过不同途径转入造血细胞祖细胞后,使得动物模型或患者体内β珠蛋白表达升高的报道较 多,可改善贫血,但由于此类技术需要病毒载体转入患者基因组中,可能导致患者体内基因突变诱发肿瘤,且在如何选择导入备选的造血干细胞上存在困难,相关病毒载体的稳定性欠佳,导入β基因的干细胞在患者体内是否能长期存活等原因,限制了该类技术方法进一步临床应用。
人类β样珠蛋白基因座包含有ε、γ、δ和β珠蛋白基因。ε、γ珠蛋白基因分别在胚胎早期造血组织卵黄囊及造血肝组织中呈高表达。伴随胎儿的发育成熟,ε、γ珠蛋白基因表达沉默,β珠蛋白表达增加,由血红蛋白A(HbA)逐渐替代胎儿血红蛋白(HbF)。目前研究已证实发现β地中海贫血婴儿在出生3至6月内无明显贫血,直至3至6月后γ珠蛋白合成减少时贫血明显,并证实提高HbF的合成可改善β地中海贫血。也有研究提示β地中海贫血患者红细胞中HbF水平与患者的贫血程度呈负相关,未经输血及HbF诱导治疗的中间型β地中海贫血患者,HbF水平与患者总血红蛋白水平呈正相关。越来越多的证据表明促进HbF表达可达到有效治疗β地中海贫血的作用。目前诱导HbF治疗主要包括γ-珠蛋白的药物诱导治疗、γ-珠蛋白基因再激活这两个方面,药物诱导治疗存在或多或少的毒副作用,目前对其安全性一直存在争议,例如其中的羟基脲对生育能力存在影响,且有导致恶性肿瘤形成的可能性。γ-珠蛋白基因再激活同样存在诱导基因突变诱发肿瘤等。因此,此类HbF诱导治疗由于治疗效果的不确切性,治疗费用较高,其临床应用有效数据有限,限制了该类药物的应用。
近十余年以来,microRNA(miRNA)一直是分子生物学领域的研究热点,目前已发现miRNAs是一类由非蛋白编码基因转录物形成茎环结构前体,经酶剪切成熟后形成的长度为18~25个核苷酸的小RNA分子。miRNAs可以在转录后水平参与调控真核生物的基因表达,其通过不完全的碱基互补,作用于特异性靶基因,形成强大的调控网络,导致靶基因稳定性降低或表达减少,在各种细胞的发育、增殖、分化以及细胞死亡等过程中起到举足轻重的作用。在红细胞生成方面充分证据表明,miRNAs对红细胞发育至关重要。大量体内外实验中发现miR-144/451在红细胞发育及珠蛋白合成中有重要作用。miR-144和miR-451是一个双顺反子miRNA基因位点,两者相距约100个碱基,该基因簇共享相同的转录调控启动子,在成熟红细胞表达最多。RNA测序研究表明,后期红细胞总miRNA池中miR-451的表达占据约50%。我们的体内模型证实miR-144/451在红细胞发育成熟中起到重要作用。miR-144/451表达紊乱会引起相应的红细胞疾病。
β-地中海贫血患者的生存质量差,平均寿命短,为家庭、社会均造成严重负担,如何早期诊断,探索有效的治疗方法,对整个人类具有重要价值。因此研究和开发相对安全的靶向治疗药物成为β-地中海贫血治疗的一个方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗β-地中海贫血的方法,通过降低miR-144/451基因的表达水平或减少有功能的成熟miR-144/451的量的方法,改善β-地中海贫血的贫血症状。
为了解决上述技术问题,本发明实施例公开了一种治疗β-地中海贫血的方法,包括:通过最终降低红细胞中miR-144/451基因的表达水平或/和功能的方法,可以治疗β-地中海贫血。
进一步的,所述降低miR-144/451基因的表达水平的方法包括:降低miR-144和miR-451成熟序列表达或/和功能的方法、调节前体或原始miR-144和miR-451RNA表达的方法、调节miR-144/451基因调控以降低成熟miR-144/451表达的方法、改变miR-144,miR-451调控的分子生物途径来改变miR-144/451表达和功能的方法。
进一步的,所述降低miR-144/451基因的表达水平的方法包括:小核酸药物、化学药物、生物遗传学方法、基因治疗(包括针对造血干细胞、胚胎干细胞和多能诱导干细胞)和基因敲除技术等方法。
进一步的,所述调节miR-144和miR-451前体或原始RNA表达的方法包括:改变启动子序列和功能,改变Gata-1、KLF1等转录因子活性。
进一步的,所述降低miR-144和miR-451成熟序列表达或/和功能的方法为shRNA、siRNA、RNAi、反义序列、LNA技术(Locked nucleicAcids)和Crispr-Cas9结合miR-144/451序列抑制miR-144/451的成熟序列表达和功能。
更进一步的,一种根据本方法治疗β-地中海贫血的实验方法,包括以下步骤:
S1:准备好相关实验试剂;
S2:β-globin-/+和miR-144/451-/-基因敲除的雄性小鼠各两只、C57/BL6雌性小鼠若干只,通过繁殖得到大量的基因敲除β-地中海贫血鼠,miR-144/451基因敲除鼠和miR-144/451基因敲除的β-地贫鼠模型;
S3:按照SPF(Specefic pathogen Free无特定病原体)级饲养标准饲养小鼠,湿度控制在40%-70%,温度控制在20-25℃,用已灭菌处理的饲料、垫料和饮水一周更换二到三次;
S4:合笼方式为1只基因敲除的雄鼠和1-5只基因敲除的雌鼠交配进行繁殖,发现雌鼠有怀孕表现立即分笼生育,并及时记录小鼠父母系来源;
S5:小鼠DNA提取:取3周龄的小鼠尾部末端组织,大小约0.5cm,放入1.5ml EP管中,每管加l00μl/95℃裂解液,静置20分钟,冷却后加入l00μl中和液混匀,取以上的含鼠DNA的上清液用于PCR(聚合酶链式反应)进行小鼠基因型鉴定;
S6:小鼠DNA的PCR。下列反应物构成20μl的PCR反应体系:鼠尾DNA2μl、引物1μ1,DNA聚合酶混合物10μl,双蒸水7μl。混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增:预变性,95℃,5分钟;变性,95℃,40秒;退火,60.5℃,40秒;延伸,72℃,1分钟,循环;72℃,5分钟;
S7:进行琼脂糖凝胶电泳:取琼脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE电泳缓冲液中,微波炉中加热至沸腾,将溶解澄清的琼脂物室温冷却至60℃加入Goldview 5μl或EB 3μl混匀,缓缓倒入已置好梳子的胶板中,室温放置30min待凝胶完全凝固后轻轻拔出梳子;将制备好的1.5%琼脂糖凝胶放入电泳槽,加入1xTAE溶液至高出凝胶表面;取PCR反应终产物10μl加样到胶孔中,电压100V电泳,时间为30分钟;
S8:凝胶成像:电泳结束后,取出凝胶置于凝胶成像分析仪下拍照,小鼠电泳基因型片段为:β-地中海贫血小鼠鉴定是,一条大小为567bp(base pair,碱基)的条带为野生型正常鼠,一条大小为1000bp的条带为纯合子β-地中海贫血小鼠;出现以上两条条带的为β-地中海贫血杂合子;miR-144/451野生型小鼠为290bp;纯合子190bp;heterozygous(-/+)250bp和190bp。
所述裂解液为0.5M EDTA40μl、lON NaOH5μl和100ml蒸馏水在PH为8时混合的混合物;所述中和液为1M Tris-HCl4ml和蒸镏水定容至100ml的混合溶液;所述聚合酶混合物包括:Taq DNA聚合酶,dNTPs,MgCl2和反应缓冲液。
依照本方法在降低miR-144/451基因表达治疗β-地中海贫血中的应用模型在贫血研究中的应用。
依照本方法在针对降低miR-144/451表达水平基因敲除β-地贫鼠模型治疗贫血药物筛选中的应用。
依照本方法在构建得到所述的miR-144/451基因敲除β-地贫鼠模型。
相比于现有技术,本发明的有益效果为:
通过遗传学培植的方法敲除β-地中海贫血模型小鼠体内的miR-144/451后,检测小鼠外周血各项指标,发现β-地中海贫血模型小鼠由重度贫血转为轻度贫血,表现为红细胞计数及血红蛋白水平升高。且发现缺失表达miR-144/451的β-地中海贫血小鼠脾脏明显减小,由此确定降低miR-144/451的表达及功能可对β-地中海贫血启动治疗作用。
附图说明
图1是miR-144和miR-451在小鼠胚胎肝、骨髓及外周血中过表达;
图2是不同基因型小鼠外周血红细胞形态;
图3是不同基因型小鼠脾脏形态及脾脏重量比较;
图4是不同基因型小鼠鉴定凝胶电泳图,左图为miR-144/451基因型鉴定电泳图,右图为β-het基因型鉴定电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的保护范围内。
本实施例涉及的miR-144/451成熟序列、前体序列和原始序列如下:
(1)小鼠和人类的miR-144和miR-451成熟序列(完全保守)如下:
1.Mature sequence mmu-miR-144-5p(MIMAT0016988):
5’-GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGU-3’;
2.Mature sequence mmu-miR-144-3p(MIMAT0000156):
5’-UACAGUAUAGAUGAUGUACU-3’
3.Mature sequence mmu-miR-451a(MIMAT0001632):
5’-AAACCGUUACCAUUACUGAGUU-3’
4.Mature sequence mmu-miR-451b(MIMAT0025178):
5’-UGGGAGCAGCAAGAGAACCGU-3’
(2)miR-144/451成熟序列的反义核酸序列如下:
miR-144-5p成熟序列的反义序列:5’-ACTTACAGTATATGATGATATCC-3’
miR-144-3p成熟序列的反义序列:5’-AGTACATCATCTATACTGTA-3’
miR-451a成熟序列的反义序列:5’-AACTCAGTAATGGTAACGGTTT-3’
miR-451b成熟序列的反义序列:5’-ACGGTTCTCTTGCTGCTCCCA-3’
(3)小鼠miR-144和miR-451前体序列(precursor sequence)及反义序列如下:
Pre-miR-144:>mmu-mir-144MI0000168
5’-GGCUGGGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGUUUGUGAUGAGACACUACAGUAUAGAUGAUGUACUAGUC-3’
Pre-miR-144:>mmu-mir-144MI0000168反义序列
5’-GACUAGUACAUCAUCUAUACUGUAGUGUCUCAUCACAAACUUACAGUAUAUGAUGAUAUCCCAGCC-3’
Pre-miR-451a:>mmu-mir-451a MI0001730
5’-CUUGGGAAUGGCGAGGAAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGGUAACGGUUCUCUUGCUGCUCCCACA-3’
Pre-miR-451a:>mmu-mir-451a MI0001730反义序列
5’-UGUGGGAGCAGCAAGAGAACCGUUACCAUUACUAAACUCAGUAAUGGUAACGGUUUCCUCGCCAUUCCCAAG-3’
Pre-miR-451b:>mmu-mir-451b MI0021960
5’-UGUGGGAGCAGCAAGAGAACCGUUACCAUUACUAAACUCAGUAAUGGUAACGGUUUCCUCGCCAUUCCCAAG-3’
Pre-miR-451b:>mmu-mir-451b MI0021960反义序列
5’-CUUGGGAAUGGCGAGGAAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGGUAACGGUUCUCUUGCUGCUCCCACA-3’
(4)人类miR-144和miR-451的前体序列(precursor sequence)如下:
Pre-miR-144:>hsa-mir-144MI0000460
5’-UGGGGCCCUGGCUGGGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGUUUGCGAUGAGACACUACAGUAUAGAUGAUGUACUAGUCCGGGCACCCCC-3’
Pre-miR-451a:>hsa-mir-451a MI0001729
5’-CUUGGGAAUGGCAAGGAAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGGUAAUGGUUCUCUUGCUAUACCCAGA-3’
Pre-miR-451b:>hsa-mir-451b MI0017360
5’-UGGGUAUAGCAAGAGAACCAUUACCAUUACUAAACUCAGUAAUGGUAACGGUUUCCUUGCCAUUCCCA-3’
(5)小鼠的miR-144和miR-451的原始序列(primary sequence)如SEQ ID NO.1。
(6)小鼠的miR-144和miR-451的原始序列反向互补链序列SEQ ID NO.2。
(7)人类的miR-144和miR-451的原始序列为SEQ ID NO.3。
(8)人类的miR-144和miR-451的原始序列反向互补链序列为SEQ ID NO.4。
(9)小鼠的miR-144和miR-451的启动子序列为SEQ ID NO.5。
(10)人类的miR-144和miR-451的启动子序列为SEQ ID NO.6。
(11)小鼠的miR-144和miR-451上游序列中gata-1绑定位点序列为SEQ ID NO.7。
一种根据本方法治疗β-地中海贫血的实验方法,包括以下步骤:
S1:准备好相关实验试剂
(1)本实施例涉及的实验试剂如下表所示:
(2)本实施例涉及的主要自配试剂如下表所示:
(3)本实施例中应用到的PCR引物:
(3.1)实时荧光定量PCR用引物:
miR-144 上游引物5’-GGATATCATCATATACTGTAAGT-3
miR-451 上游引物5’-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3’
下游引物为GeneCopoeia公司All-in-One miRNAqRT-PCRDetection Kit中的通用引物。
3.2)基因型鉴定引物:
miR451 上游引物:5’-TTCTGCCTGTAACTCTGGATCCCTAAGAGA
miR451 下游引物-1:5’-GGGTACCCAGACTAGTACATCATCTATA
miR451 下游引物-2:5’-ATCCCCTCGAGGGACCTAATAACTTC
(3.3)β-地中海贫血小鼠鉴定引物序列:
Thal 上游-1:5‘-GCTTTCCAGCAGGCACTAAC-3’
Thal 下游-1:5‘-AGGAGGAGGGGAAGCTGATA-3’
Thal 上游-2:5‘-GGCAAAGGATGTGATACGTGGAAG-3’
Thal 下游-2:5‘-CCAGTTTCACTAATGACACAAACATG-3’
S2:扬州大学非编码RNA中心由美国宾夕法尼亚大学附属费城儿童医院引进β-globin-/+和miR-144/451-/-基因敲除雄性小鼠各两只,扬州大学比较中心C57/BL6雌性小鼠若干只,目前已繁殖得到大量的基因敲除β-地中海贫血鼠,miR-144/451基因敲除鼠和miR-144/451基因敲除的β-地贫鼠模型参见:1,Yu D,dos Santos C O,Zhao G,et al.miR-451protects against erythroid oxidant stress by repressing 14-3-3ζ[J].Genes&development,2010,24(15):1620-1633.2,Yang B,Kirby S,Lewis J,et al.1995.A mousemodel for beta0-thalassemia.Proc Natl Acad Sci U S A.1995,92(25):11608-11612.上述两篇参考文献的内容全文并入本申请说明书并作为说明书的一部分可以作为后续程序的修改依据,文献中所使用的试剂也作为本申请所使用的试剂被全文并入。
S3:按照SPF(Specific pathogen Free无特定病原体)级饲养标准饲养小鼠。湿度控制在40%-70%,温度控制在20-25℃,用已灭菌处理的饲料、垫料和饮水一周更换二到三次。
S4:合笼方式为1只基因敲除的雄鼠和1-5只基因敲除的雌鼠交配进行繁殖,发现雌鼠有怀孕表现如阴栓或腹部呈梨形立即分笼生育并及时记录小鼠父母系来源。
S5:小鼠DNA提取:取3周龄的小鼠尾部末端组织,大小约0.5cm,放入1.5ml EP管中,每管加l00μl裂解液,95℃ 20min。冷却后加入l00μl中和液,混匀,取以上的含鼠DNA的上清液用于PCR进行小鼠基因型鉴定。
S6:小鼠DNA的聚合酶链式反应(PCR):引物由上海生工生物工程有限公司提供。PCR反应体系:下列反应物构成20μl的反应体系。鼠尾DNA2μl,引物(20μmol)μ1,DNA聚合酶混合物(Taq DNA聚合酶,dNTPs,MgCl2和反应缓冲液)10μl,双蒸水7μl。混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增:预变性,95℃,5分钟;变性,95℃,40秒;退火,60.5℃,40秒;延伸,72℃,1分钟;循环;72℃,5分钟。
S7:进行琼脂糖凝胶电泳:取琼脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE电泳缓冲液中,微波炉中加热至沸腾,将溶解澄清的琼脂物室温冷却至60℃加入Goldview 5μl或EB 3μl混匀,缓缓倒入已置好梳子的胶板中,室温放置30min待凝胶完全凝固后轻轻拔出梳子。将制备好的1.5%琼脂糖凝胶放入电泳槽,加入1xTAE溶液至高出凝胶表面。取PCR反应终产物10μl加样到胶孔中。电压100V电泳,时间为30分钟。
S8:凝胶成像:电泳结束后,取出凝胶置于凝胶成像分析仪下拍照,小鼠电泳基因型片段为:β-地中海贫血小鼠鉴定是,一条大小为567bp(base pair,碱基)的条带为野生型正常鼠,一条大小为1000bp的条带为纯合子β-地中海贫血小鼠;出现以上两条条带的为β-地中海贫血杂合子。miR-144/451野生型小鼠为290bp;纯合子190bp;heterozygous(-/+)250bp和190bp。
实施例1
如图1所示,A:小鼠怀孕期为20天,胚胎肝是哺乳动物胚胎期的造血器官。我们在芯片资料中发现,14.5天的胚胎肝红细胞中,β-het(β-地中海贫血杂合子。注:β-地中海贫血纯合子为胚胎致死,无法出生)的miR-451比wt(wild type,野生型)鼠表达高出50-80%(p<0.01);B:比较β-het小鼠及wt小鼠外周血中miR-144和miR-451的表达,提示β-het时外周血中的miR-144和miR-451表达均显著性上调(p<0.01);C:比较β-het小鼠骨髓中网织红细胞及有核红细胞的miR-144和miR-451表达,提示β-het时骨髓Retic(网织红细胞)及NRBC(有核红细胞)中的miR-144/451表达量均显著上调(p<0.01)。
实施例2
不同基因型小鼠外周血各项指标比较如下表所示:
index | wt | mko | βhet | mko/βhet |
WBC(*10^9/l) | 7.28±2.86 | 6.25±1.66 | 36.69±13.50** | 8.24±2.76** |
RBC(*10^12/l) | 10.10±1.46 | 10.51±1.15 | 7.25±1.24** | 11.2±0.65 |
Hb(g/dl) | 130.18±20.61 | 117.11±14.37** | 81.46±13.33** | 102.25±8.42** |
HCT(%) | 55.87±7.53 | 53.48±5.11 | 35.81±5.61** | 48.52±3.30** |
PLT(*10^12/l) | 1074.06±305.27 | 1013.67±398.53 | 1775.77±631.75** | 1352.50±292.81** |
RDW(%) | 17.01±0.77 | 23.24±1.31** | 37.75±2.73** | 30.93±3.23** |
取小鼠外周血后,全血细胞分析仪检测外周血各项指标,与wt小鼠比较发现,mko小鼠外周血中血红蛋白(Hb)显著降低,红细胞分布宽度(RDW)增加,提示红细胞大小不均匀,轻度贫血。βhet小鼠为重度贫血,红细胞(RBC)、Hb、红细胞压积(HCT)均显著下降,RDW升高,提示红细胞大小不均一,通过遗传学方法去除βhet小鼠体内的miR-144/451后,得到的mko/βhet小鼠的RBC、Hb和HCT各项指标显著升高,提示贫血改善,跟βhet比较,RDW下降,提示红细胞大小均一。
实施例3
如图2所示,取不同基因型小鼠外周血,血涂片后进行瑞士吉姆萨染色,中性树胶封片后显微镜观察,wt小鼠外周血红细胞成双凹圆盘状,形态大小均一;β-het小鼠外周形态大小不一,可见靶形红细胞,网织红细胞增多;而mko/βhet小鼠外周血形态跟β-het比较发现,中心淡染区明显减少,无靶形红细胞数减少,红细胞形态大小较均一,提示贫血改善。
实施例4
如图3所示,成年哺乳动物主要由骨髓造血,贫血时,包括脾脏在内的髓外器官可代偿性造血,导致髓外器官体积变大。取成年8周的wt、mko、β-het和mko/βhet四组不同基因型小鼠脾脏,比较脾脏形态大小(A图)和重量(B图)。结果显示,和wt相比,miR-144/451敲除鼠(B)的脾脏平均增大0.5到1倍,提示轻度贫血。但β-地贫鼠(C)脾脏增大特别明显,平均增大6倍,说明重度贫血。但和miR-144/451敲除鼠杂交后,即去除β-地贫鼠中miR-144/451后,杂交的β-地贫鼠(D)脾脏增大只有1.5倍,说明代偿性造血明显下降,贫血明显减轻。
实施例5
如图4所示小鼠基因型鉴定凝胶电泳图,左图是miR-144/451基因敲除小鼠杂交后的基因型 鉴定条带,0为电泳marker,泳道1、2和10为正常小鼠,大小为290碱基(base pair,bp),电泳道3、8和9为miR-144/451杂合子小鼠,电泳道4到7,大小为156bp,为miR-144/451敲除纯合子小鼠。右图为β-地中海贫血小鼠基因型降低电泳图,其中0为marker,电泳道1、2、3、6和7为β-地中海贫血野生型,电泳道4和5为杂合子。
本发明所述的降低miR-144/451基因表达在治疗β-地中海贫血中的应用模型在贫血研究中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明所述的针对降低miR-144/451表达水平基因敲除β-地贫鼠模型在治疗贫血药物筛选中的应用也在本发明的保护范围之内。
通过本发明方法构建得到所述的miR-144/451基因敲除β-地贫鼠模型也在本发明的保护范围之内。
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述,该描述没有限制性,附图中所示的也只是本发明的实施方式之一,实际的结构并不局限于此。所以,如果本领域的普通技术人员受其启示,在不脱离本发明创造宗旨的情况下,不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例,均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种治疗β-地中海贫血的试剂,其特征在于:所述的试剂能够降低红细胞中miR-144/451基因的表达水平或/和功能。
2.根据权利要求1所述的治疗β-地中海贫血的试剂,其特征在于:所述降低红细胞中miR-144/451基因的表达水平和/或功能的试剂包括:用于降低miR-144和miR-451成熟序列表达或/和功能的方法、调节前体或原始miR-144和miR-451 RNA表达的方法、调节miR-144/451基因调控以降低成熟miR-144/451表达的方法、改变miR-144和miR-451调控的分子生物途径来改变miR-144/451表达和功能的试剂。
3.根据权利要求2所述的治疗β-地中海贫血的试剂,其特征在于:所述降低miR-144/451红细胞中基因的表达水平和/或功能的试剂包括:小核酸药物、化学药物、生物遗传学方法、基因治疗(包括针对造血干细胞、胚胎干细胞和多能诱导干细胞)和/或能够敲除miR-144/451基因的试剂。
4.根据权利要求2所述的治疗β-地中海贫血的试剂,其特征在于:所述调节miR-144和miR-451基因调控以降低成熟miR-144/451表达的试剂包括:能够改变启动子序列和功能,改变Gata-1、KLF1等转录因子活性的试剂。
5.根据权利要求3所述的治疗β-地中海贫血的试剂,其特征在于:所述降低miR-144和miR-451成熟序列表达或/和功能的试剂为shRNA、siRNA、RNAi、反义序列、LNA技术(Lockednucleic Acids)和Crispr-Cas9结合miR-144/451序列抑制miR-144/451的成熟序列表达和功能。
6.权利要求5所述的治疗β-地中海贫血的试剂,其特征在于所述的试剂包括:miR-144上游引物5’-GGATATCATCATATACTGTAAGT-3
miR-451上游引物5’-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3’
下游引物为GeneCopoeia公司All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit中的通用引物。
7.权利要求5所述的试剂在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用。
8.一种降低红细胞中miR-144/451基因的表达水平或/和功能的方法,其特征在于:包括以下步骤,
S1:准备好相关实验试剂;
S2:β-globin-/+和miR-144/451-/-基因敲除的雄性小鼠各两只、C57/BL6雌性小鼠若干只,通过繁殖得到大量的基因敲除β-地中海贫血鼠,miR-144/451基因敲除鼠和miR-144/451基因敲除的β-地贫鼠模型;
S3:按照SPF(Specefic pathogen Free无特定病原体)级饲养标准饲养小鼠,湿度控制在40%-70%,温度控制在20-25℃,用已灭菌处理的饲料、垫料和饮水一周更换二到三次;
S4:合笼方式为1只基因敲除的雄鼠和1-5只基因敲除的雌鼠交配进行繁殖,发现雌鼠有怀孕表现立即分笼生育,并及时记录小鼠父母系来源;
S5:小鼠DNA提取:取3周龄的小鼠尾部末端组织,大小约0.5cm,放入1.5ml EP管中,每管加l00μl/95°C裂解液,静置20分钟,冷却后加入l00μl中和液混匀,取以上的含鼠DNA的上清液用于PCR(聚合酶链式反应)进行小鼠基因型鉴定;
S6:小鼠DNA的PCR:下列反应物构成20μl的PCR反应体系:鼠尾DNA 2μl、引物1μ1,DNA聚合酶混合物10μl,双蒸水7μl。
9.混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增:预变性,95℃,5分钟;变性,95℃,40秒;退火,60.5℃,40秒;延伸,72℃,1分钟,循环;72℃,5分钟;
S7:进行琼脂糖凝胶电泳:取琼脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE电泳缓冲液中,微波炉中加热至沸腾,将溶解澄清的琼脂物室温冷却至60℃加入Goldview 5μl或EB 3μl混匀,缓缓倒入已置好梳子的胶板中,室温放置30min待凝胶完全凝固后轻轻拔出梳子;将制备好的1.5%琼脂糖凝胶放入电泳槽,加入1xTAE溶液至高出凝胶表面;取PCR反应终产物10μl加样到胶孔中,电压100V电泳,时间为30分钟;
S8:凝胶成像:电泳结束后,取出凝胶置于凝胶成像分析仪下拍照,小鼠电泳基因型片段为:β-地中海贫血小鼠鉴定是,一条大小为567bp(base pair,碱基)的条带为野生型正常鼠,一条大小为1000bp的条带为纯合子β-地中海贫血小鼠;出现以上两条条带的为β-地中海贫血杂合子;miR-144/451野生型小鼠为290bp;纯合子190bp;heterozygous (-/+)250bp和190bp。
10.根据权利要求8所述的降低红细胞中miR-144/451基因的表达水平或/和功能的方法,其特征在于:所述裂解液为0.5M EDTA40μl、lON NaOH5μl 和100ml蒸馏水在PH为8时混合的混合物;所述中和液为1M Tris-HCl4ml和蒸镏水定容至100 ml的混合溶液;所述聚合酶混合物包括:Taq DNA 聚合酶,dNTPs,MgCl2和反应缓冲液。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106244555A (zh) * | 2016-08-23 | 2016-12-21 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法 |
CN106520975A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-03-22 | 扬州大学 | 一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法 |
CN107746859A (zh) * | 2017-10-18 | 2018-03-02 | 银丰生物工程集团有限公司 | 靶向血红蛋白hbb突变基因的造血干细胞基因修饰方法 |
CN111278977A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-06-12 | 博雅辑因(北京)生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 |
WO2022040403A1 (en) * | 2020-08-20 | 2022-02-24 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Compositions and method for treating thalassemia |
CN114807139A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-07-29 | 上海海洋大学 | 再生小分子miRNA-XU2及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011029903A1 (en) * | 2009-09-10 | 2011-03-17 | Flemming Velin | Method for the preparation of micro-rna and its therapeutic application |
CN103703142A (zh) * | 2011-01-26 | 2014-04-02 | 西菲伊德公司 | 检测肺癌的方法 |
CN104548134A (zh) * | 2015-01-04 | 2015-04-29 | 中国人民解放军第二军医大学 | miR-144及其抑制剂的应用 |
-
2016
- 2016-03-01 CN CN201610115449.1A patent/CN105854017A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011029903A1 (en) * | 2009-09-10 | 2011-03-17 | Flemming Velin | Method for the preparation of micro-rna and its therapeutic application |
CN102573856A (zh) * | 2009-09-10 | 2012-07-11 | 弗莱明·韦林 | 用于制备微小rna 的方法及其治疗性应用 |
CN103703142A (zh) * | 2011-01-26 | 2014-04-02 | 西菲伊德公司 | 检测肺癌的方法 |
CN104548134A (zh) * | 2015-01-04 | 2015-04-29 | 中国人民解放军第二军医大学 | miR-144及其抑制剂的应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
《BLOOD》 * |
《中国小儿血液与肿瘤杂志》 * |
《中国热带医学》 * |
《国际检验医学杂志》 * |
《首都医科大学学报》 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106244555A (zh) * | 2016-08-23 | 2016-12-21 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法 |
CN106520975A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-03-22 | 扬州大学 | 一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法 |
CN107746859A (zh) * | 2017-10-18 | 2018-03-02 | 银丰生物工程集团有限公司 | 靶向血红蛋白hbb突变基因的造血干细胞基因修饰方法 |
CN107746859B (zh) * | 2017-10-18 | 2022-03-01 | 银丰生物工程集团有限公司 | 靶向血红蛋白hbb突变基因的造血干细胞基因修饰方法 |
CN111278977A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-06-12 | 博雅辑因(北京)生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 |
CN111278977B (zh) * | 2017-10-27 | 2022-03-22 | 博雅辑因(北京)生物科技有限公司 | 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 |
WO2022040403A1 (en) * | 2020-08-20 | 2022-02-24 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Compositions and method for treating thalassemia |
CN114807139A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-07-29 | 上海海洋大学 | 再生小分子miRNA-XU2及其应用 |
CN114807139B (zh) * | 2022-05-11 | 2023-11-24 | 上海海洋大学 | 再生小分子miRNA-XU2及其应用 |
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