JP2021533743A - Gfral細胞外ドメイン及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインが開示される。本開示は、本明細書に提供されるGFRAL細胞外ドメインを使用して、GDF15ペプチド等のGFRALリガンドの活性をスクリーニング及び評価するための方法及び組成物に更に関する。本明細書に提供されるGFRAL細胞外ドメインを使用して、肥満症を処置し、食欲を低減させ、且つ/又は体重を低減させるための方法及び組成物も開示される。
Description
本開示は、GFRAL細胞外ドメイン並びに本明細書に提供されるGFRAL細胞外ドメインを使用するための方法及び組成物に関する。本開示は、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)の活性をスクリーニング及び評価するための細胞ベースのアッセイ並びにGFRAL細胞外ドメイン及びGFRALリガンドを使用した処置方法に更に関する。GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)の活性をスクリーニング及び評価するのに有用な細胞及びキットも提供される。
成長/分化因子15(GDF15)は、癌悪液質、腎及び心不全、アテローム性動脈硬化症及び代謝を含む様々な生物学的機能に関係しているトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)サイトカインスーパーファミリーの多様なメンバーである(Breit et al.,Growth Factors 2011;29(5):187−95)。GDF15と体重調節との関係は、当初、血清中のGDF15レベルの増大が、進行性前立腺癌を有する個人の体重減少と相関するという観察に基づいて示唆された(Johnen et al.,Nat Med 2007;13(11):1333−40)。異種移植された前立腺腫瘍を有するマウスでは、上昇したGDF15レベルは、食物摂取の減少により媒介される顕著な体重、脂肪及び除脂肪組織損失にも関連し、GDF15の抗体の投与により逆転させることができた(Johnen et al.,Nat Med 2007;13(11):1333−40)。加えて、マウスにおける長期間のCDF15発現の上昇は、食物摂取、体重及び体脂肪蓄積の減少と同時に耐糖能の改善をもたらす(正常及び肥満を引き起こす食事状態の両方において)ことが示されている(Macia et al.,PLoS One 2012;7(4):e34868)。食欲及び体重に関連したGDF15の代謝作用は、GDF15を、肥満症及び/又は関連した併存症を患っている患者に対する有望な治療法とする。
GFRAL、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)受容体αファミリーのオーファンメンバーは、GDF15に対する高親和性受容体である。GFRALは、GDF15の食欲抑制効果にも必要であり得る。肥満症のマウスの食物摂取及び体重におけるGDF15−媒介減少は、GFRALノックアウトマウスで消失した(Yang et al.,Nat Med 2017;23(10):1158−66)。GFRALは、GDF15刺激に対する応答において細胞内シグナリングを誘発するために共受容体RETと関連する必要がある(Yang et al.,Nat Med 2017;23(10):1158−66)。
潜在的な治療薬としての組換えGDF15タンパク質が報告されており、より多くのものが研究中である(Xiong et al.,Sci Transl Med 2017;9(412):eaan8732)。従って、そのような治療的タンパク質の活性を迅速且つ効果的に評価するアッセイは、望ましいスクリーニングツールであろう。GDF15及びGFRALに関するアッセイは、国際公開第2017/121865号パンフレット、国際公開第2017/152105号パンフレット及び国際公開第2018/071493号パンフレットに記載されている。同様に、治療的GDF15組成物の活性を改善するための新規な方法及び組成物も有益であろう。
本開示は、様々な実施形態において、GFRALリガンド(例えば、GDF15、例えばGDF15ペプチド)の活性を検出及び試験するための新規な方法及びアッセイを提供する。GFRALリガンド(例えば、本明細書に開示した方法に従って活性についてスクリーニングされたGDF15ペプチド)を単独で又は可溶性GFRAL(例えば、D2及びD3細胞外ドメインを含むが、D1細胞外ドメインを含まないもの)と組み合わせて使用する、肥満症及び関連する障害の処置のための方法及び組成物も開示する。
様々な実施形態において、本開示は、より詳細には、GFRALリガンドの活性を評価するための細胞ベースの方法及びアッセイに関する。細胞ベースの効力アッセイは、多くの場合、生物学的生成物の生物学的活性を決定するための好ましいフォーマットであり、それは、それらが生成物により誘発される生物学的応答を測定することができ、動物ベースのアッセイと比較して短期間で結果を生成できるためである。加えて、多くの細胞ベースの効力アッセイは、生成物の作用機序との明白な相関を有する。従って、このようなアッセイは、広く使用されており、多くの場合に医薬品登録及び市販前承認のために医薬品管理当局に提供される。
様々な実施形態において、本明細書に開示した細胞ベースの方法及びアッセイは、細胞ベースのシグナル伝達アッセイであり、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)のGFRALシグナリング活性を決定するのに有用であり得る。様々な実施形態において、本開示は、GDF15ペプチドの活性を検出する方法を提供し、この方法は、(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;(b)細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることと;(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む可溶性GFRAL又はその機能的変異体は、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、配列番号3のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号25のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体(配列番号14、15、16又は17のアミノ酸配列を含む)を含む。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される。他の実施形態では、GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
細胞ベースの方法及びアッセイのいくつかの実施形態では、細胞は、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALと同時に接触される。いくつかの他の実施形態では、細胞は、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALと連続で接触される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、二元複合体中にある。
細胞ベースの方法及びアッセイのいくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである。
細胞ベースの方法及びアッセイのいくつかの実施形態では、細胞は、内因性GFRALを発現しない。細胞ベースの方法及びアッセイのいくつかの実施形態では、細胞は、部分又は全長GFRAL(例えば、膜貫通ドメイン及び更に細胞質ドメインを含むヒトGFRAL)を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性GDF15を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効GDF15遺伝子を含むGDF15ノックアウト(KO)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、MCF7細胞(例えば、ATCC(登録商標)HTB−22(商標))、乳癌細胞である(例えば、Comsa et al.,Anticancer Res 2015;35(6):3147−54を参照されたい)。いくつかの実施形態では、細胞は、SH−SY5Y細胞(例えば、ATCC(登録商標)CRL−2266(商標))、骨髄神経芽腫細胞である。更に他の実施形態では、細胞は、HEK293A−GDF15ノックアウト(KO)細胞である。他の例示的な細胞型も本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチド、可溶性GFRAL及び細胞表面受容体キナーゼ、例えばRETが三元複合体を形成するときに誘導される。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、可溶性GFRALの非存在下でGDF15ペプチドと接触された細胞において誘導されない。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、GDF15の下流のシグナル伝達応答、例えばERK又はAKTシグナリング)である。
生物学的応答は、いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及び/又は可溶性GFRALと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、キナーゼ又は酵素活性アッセイ、全細胞の放射標識32P−オルトホスフェートとのインキュベーション、2次元ゲル電気泳動、免疫ブロットアッセイ(例えば、ウェスタンブロット)、AlphaLISA(登録商標)アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、細胞ベースのELISAアッセイ、細胞内フローサイトメトリー、免疫細胞化学(ICC)、免疫組織化学(IHC)、質量分析、多検体プロファイリング(例えば、ホスホ−タンパク質多重アッセイ)及び蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)から選択される1つ以上のアッセイを用いて検出される。
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ERKは、ERK1又はERK2である。いくつかの実施形態では、ERKは、ERK1(MAPK3又はPRKM3とも称される)である。いくつかの実施形態では、ERKは、ERK2(MAPK1、PRKM1又はPRKM2とも称される)である。
他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORの1つ以上から選択される。例示的な下流標的には、S6キナーゼが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、AKT(PKB又はRACとも称される)は、AKT1、AKT2又はAKT3である。いくつかの実施形態では、RASは、H−RAS、K−RAS又はN−RASである。
生物学的応答は、いくつかの他の実施形態では、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼ及び/又は細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである。いくつかの他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、RET−ERK経路における細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ERK、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ERK、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ERK(例えば、ERK1又はERK2)である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ERK1及び/又はERK2である。
いくつかの他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、RET−AKT経路における細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、AKT、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、AKT、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTORの1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、AKT(例えば、AKT1、AKT2又はAKT3)である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、AKT1、AKT2及び/又はAKT3である。いくつかの実施形態では、RET−AKT経路における下流標的は、S6キナーゼである。
様々な他の実施形態において、本開示は、GDF15ペプチドの活性を検出する方法を提供し、この方法は、(a)GFRAL細胞外ドメイン(例えば、可溶性GFRAL細胞外ドメイン)及び細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;(b)細胞をGDF15ペプチドと接触させることと;(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD2及びD3を含む。
様々な他の実施形態において、本開示は、GDF15ペプチドの活性を検出する方法を提供し、この方法は、(a)GFRAL細胞外ドメイン(例えば、可溶性GFRAL細胞外ドメイン)及び細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;(b)細胞をGDF15ペプチドと接触させることと;(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD2及びD3を含み;細胞は、GFRALを内因的に発現しない。
様々な実施形態において、接触された細胞における生物学的応答は、細胞シグナリング又はシグナル伝達(例えば、タンパク質キナーゼのリン酸化)に関連した応答である。様々な実施形態において、生物学的応答は、キナーゼ又は酵素活性アッセイ、全細胞の放射標識32P−オルトホスフェートとのインキュベーション、2次元ゲル電気泳動、免疫ブロットアッセイ(例えば、ウェスタンブロット)、AlphaLISA(登録商標)アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、細胞ベースのELISAアッセイ、細胞内フローサイトメトリー、免疫細胞化学(ICC)、免疫組織化学(IHC)、質量分析、多検体プロファイリング(例えば、ホスホ−タンパク質多重アッセイ)及び蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)から選択される1つ以上のアッセイを用いて検出される。他の例示的な生物学的応答には、遺伝子転写、タンパク質発現、毒性、サイトカイン放出、細胞増殖、細胞運動性若しくは形態、細胞成長停止又は細胞死(例えば、アポトーシス)に関連した細胞応答が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、可溶性GFRAL細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される。いくつかの実施形態では、テザーは、GFRAL膜貫通ドメイン又はその機能的断片である。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、天然GFRAL膜貫通ドメインのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号18のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、テザーは、GFRAL細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである。
いくつかの実施形態では、テザーは、グリコホスファチジルイノシトール(GPI)又はGPIリンカー付加を指示することが可能な配列である。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号19のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号20のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号21のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、テザーは、膜挿入配列である。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号22のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号23のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの他の実施形態では、テザーは、膜挿入脂肪酸である。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含むGFRAL細胞外ドメインは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、配列番号3のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号25のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体(配列番号14、15、16又は17のアミノ酸配列を含む)を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を更に含む(例えば、融合される)。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される。他の実施形態では、GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである。
いくつかの実施形態では、細胞は、内因性GFRALを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、全長GFRALを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性GDF15を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効GDF15遺伝子を含むGDF15 KO細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、MCF7細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、SH−SY5Y細胞である。更に他の実施形態では、細胞は、HEK293A−GDF15 KO細胞である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチド、GFRAL細胞外ドメイン及び細胞表面受容体キナーゼ(例えば、RET)が三元複合体を形成するときに誘導される。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、GDF15の下流、例えばERK又はAKTシグナリングのシグナル伝達応答)である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。増大又は減少した発現又は活性を有するタンパク質は、本明細書に記載される例示的なタンパク質のいずれか、例えばRET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、本明細書に開示した例示的なアッセイのいずれかを用いて検出される。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ERKは、ERK1又はERK2である。
他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORの1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、AKTは、AKT1、AKT2又はAKT3である。
生物学的応答は、いくつかの他の実施形態では、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼ及び/又は細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである。いくつかの他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、RET−ERK経路における細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ERK、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ERK、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ERK(例えば、ERK1又はERK2)である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ERK1及び/又はERK2である。
いくつかの他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、RET−AKT経路における細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、AKT、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、AKT、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTORの1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、AKT(例えば、AKT1、AKT2又はAKT3)である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、AKT1、AKT2及び/又はAKT3である。いくつかの実施形態では、RET−AKT経路における下流標的は、S6キナーゼである。
様々な実施形態において、GDF15ペプチドの活性を検出するための単離及び改変された細胞が更に本明細書に提供される。様々な実施形態において、細胞は、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する。様々な実施形態において、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠く。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含むGFRAL細胞外ドメインは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、配列番号3のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号25のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体(配列番号14、15、16又は17のアミノ酸配列を含む)を含む。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される。他の実施形態では、GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである。
いくつかの実施形態では、細胞は、内因性GFRALを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、全長GFRALを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性GDF15を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効GDF15遺伝子を含むGDF15 KO細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの他の実施形態では、細胞は、MCF7細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、SH−SY5Y細胞である。更に他の実施形態では、細胞は、HEK293A−GDF15 KO細胞である。
様々な実施形態において、GDF15ペプチドの活性を決定するためのキットが更に本明細書に提供される。様々な実施形態において、キットは、GDF15ペプチドと接触するための細胞と、接触された細胞における生物学的応答を検出する手段とを含む。様々な実施形態において、細胞は、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する、単離及び改変された細胞である。
様々な実施形態において、例えば肥満症又は肥満症関連の障害の処置における、食欲の低減及び/又は対象の体重の低減等における治療方法並びに本明細書に開示したGFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)及びGFRAL細胞外ドメインの使用も本明細書に提供される。様々な実施形態において、本明細書に記載される治療方法及び使用は、肥満症又は肥満症関連の障害、例えば癌、体重障害並びに/又は代謝疾患及び障害の処置に有用である。肥満症と同時に発生し得るか、又は過剰な体重を有することの直接若しくは間接的な結果であり得る例示的な肥満症関連の障害及び状態は、本明細書に開示されている。これらには、癌、II型糖尿病(T2DM)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、高トリグリセリド血症及び心血管系疾患が含まれるが、これらに限定されない。
例えば、特定の態様において、本開示は、GDF15ペプチドを対象に投与することにより、肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法を提供し、GDF15ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞において生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有するものである。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、ERK活性化若しくはシグナリング又はAKT活性化若しくはシグナリング)である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、T2DM、NASH、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
特定の他の態様において、本開示は、対象の肥満症又は肥満症関連の障害の処置におけるGDF15ペプチドの使用を提供し、GDF15ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞において生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有するものである。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、ERK活性化若しくはシグナリング又はAKT活性化若しくはシグナリング)である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、T2DM、NASH、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
特定の他の態様において、本開示は、GDF15ペプチドを対象に投与することにより、食欲及び/又は体重を低減させる方法を提供し、GDF15ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞において生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有するものである。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、ERK活性化若しくはシグナリング又はAKT活性化若しくはシグナリング)である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。
特定の他の態様において、本開示は、対象の食欲及び/又は体重の低減におけるGDF15ペプチドの使用を提供し、GDF15ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞において生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有するものである。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、ERK活性化若しくはシグナリング又はAKT活性化若しくはシグナリング)である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。
特定の他の態様において、本開示は、肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法を提供し、この方法は、GDF15ペプチド及びGFRAL(例えば、可溶性GFRAL)を対象に投与することを含み、GDF15ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有し、GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、可溶性GFRALである。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメイン及び任意選択的にシグナルペプチドからなる。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、GFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含むGFRAL細胞外ドメインは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、配列番号3のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号25のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む可溶性GFRALである。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、連続で投与される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、ERK活性化若しくはシグナリング又はAKT活性化若しくはシグナリング)である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。GDF15ペプチド及びGFRALは、例えば、薬学的に許容され得る担体を含む1つ以上の好適な治療組成物中に処方され得るか、又は患者への投与のために再構成される前に保存のために包装(例えば、凍結乾燥)され得る。投与は、任意の好適な経路、例えば静脈内、皮下、非経口、筋内等により得る。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、T2DM、NASH、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
特定の他の態様において、本開示は、対象の肥満症又は肥満症関連の障害の処置におけるGDF15ペプチド及びGFRAL(例えば、可溶性GFRAL)の使用を提供し、GDF15ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有し、GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、可溶性GFRALである。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含むGFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号3のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号25のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む可溶性GFRALである。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、連続で投与される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、ERK活性化若しくはシグナリング又はAKT活性化若しくはシグナリング)である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、T2DM、NASH、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
特定の他の態様において、本開示は、食欲及び/又は体重を低減させる方法を提供し、この方法は、GDF15ペプチド及びGFRAL(例えば、可溶性GFRAL)を対象に投与することを含み、GDF15ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有し、GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、可溶性GFRALである。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメイン及び任意選択的にシグナルペプチドからなる。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含むGFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号3のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号25のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む可溶性GFRALである。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、連続で投与される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、ERK活性化若しくはシグナリング又はAKT活性化若しくはシグナリング)である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。GDF15ペプチド及びGFRALは、例えば、薬学的に許容され得る担体を含む1つ以上の好適な治療組成物中に処方され得るか、又は患者への投与のために再構成される前に保存のために包装(例えば、凍結乾燥)され得る。投与は、任意の好適な経路、例えば静脈内、皮下、非経口、筋内等により得る。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。
特定の他の態様において、本開示は、対象の食欲及び/又は体重の低減におけるGDF15ペプチド及びGFRAL(例えば、可溶性GFRAL)の使用を提供し、GDF15ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有し、GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、可溶性GFRALである。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメイン及び任意選択的にシグナルペプチドからなる。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含むGFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号3のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号25のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む可溶性GFRALである。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、連続で投与される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答(例えば、ERK活性化若しくはシグナリング又はAKT活性化若しくはシグナリング)である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。
本明細書に記載される治療方法及び使用のいくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体(配列番号14、15、16又は17のアミノ酸配列を含む)を含む。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される。他の実施形態では、GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
更に他の態様では、本開示は、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)に結合することができるGFRAL細胞外ドメインを提供する。本開示は、より詳細には、様々な実施形態において、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを提供する。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD2及びD3を含み、且つドメインD1を欠く。いくつかの実施形態では、ドメインD1を欠くGFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を含むGFRAL細胞外ドメインと比較してGDF15への結合活性の増大を示す。いくつかの実施形態では、ドメインD1を欠くGFRAL細胞外ドメインは、GFRAL細胞外ドメインがGDF15に結合されるか又はGDF15と複合体化されるとき、ドメインD1を含むGFRAL細胞外ドメインと比較してRET活性化及び/又はシグナリングの効力の増大を示す。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、細胞表面上に発現されない。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される。いくつかの他の実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、可溶性である。
様々な実施形態において、本開示は、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む可溶性GFRALも提供する。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメイン及び任意選択的にシグナルペプチドからなる。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む可溶性GFRAL又はその機能的変異体は、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、可溶性GFRAL又はその機能的変異体は、配列番号3のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号25のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
更に他の態様では、本開示は、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定する方法及びそのような薬剤を医薬組成物中に処方する方法を提供する。
例えば、特定の態様において、本開示は、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、(a)単離及び改変された細胞を薬剤及びGDF15ペプチドと接触させることと;(b)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、細胞は、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現し;薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、薬剤の非存在下でGDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答に対して増大又は減少される場合、GDF15活性を調節すると決定される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GDF15抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GFRAL抗体である。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体(配列番号14、15、16又は17のアミノ酸配列を含む)を含む。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
特定の態様において、本開示は、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;(b)細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることと;(c)前記細胞を薬剤と接触させることと;(d)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含み、且つドメインD1を欠く。いくつかの実施形態では、薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、GDF15ペプチド、可溶性GFRAL及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触された細胞における生物学的応答に対して増大される場合、GDF15活性を調節するか又は増大させると決定される。他の実施形態では、薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、GDF15ペプチド、可溶性GFRAL及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触された細胞における生物学的応答に対して減少される場合、GDF15活性を調節するか又は減少させると決定される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GDF15抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GFRAL抗体である。
いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号1又は配列番号2を含む可溶性GFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ、ヒスチジン(His)タグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、可溶性GFRAL又はその機能的変異体は、配列番号3のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号25のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体(配列番号14、15、16又は17のアミノ酸配列を含む)を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を更に含む(例えば、融合される)。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ若しくはmycタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
特定の他の態様において、本開示は、薬剤を含む医薬組成物を製造する方法であって、(a)本明細書に記載される例示的な同定方法のいずれかにより、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定することと;(b)薬剤を医薬組成物中に処方することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GDF15抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GFRAL抗体である。
特定の他の態様において、本開示は、対象における肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であって、(a)本明細書に記載される例示的な同定方法のいずれかにより、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定することと;(b)薬剤を対象に投与することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GDF15抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GFRAL抗体である。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、T2DM、NASH、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
特定の他の態様において、本開示は、対象における食欲及び/又は体重を低減させる方法であって、(a)本明細書に記載される例示的な同定方法のいずれかにより、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定することと;(b)薬剤を対象に投与することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GDF15抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GFRAL抗体である。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、対象は、30以上の肥満度指数を有する。
一態様では、GDF15ペプチドの活性を検出する方法であって、(i)(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;(b)細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることであって、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む、接触させることと;(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することと;又は(ii)(a)細胞表面受容体キナーゼ並びにドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを発現する細胞を提供することと;(b)細胞をGDF15ペプチドと接触させることと;(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含む方法が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く。いくつかの実施形態では、方法は、細胞表面受容体キナーゼ及びGFRAL細胞外ドメインを発現する細胞を提供することを含み、(i)GFRAL細胞外ドメインは、可溶性GFRAL細胞外ドメインであるか、又は(ii)GFRAL細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される。
いくつかの実施形態では、テザーは、(i)GFRAL膜貫通ドメイン又はその機能的断片であるか;(ii)配列番号18のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(iii)GFRAL細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインであるか;(iv)グリコホスファチジルイノシトール(GPI)であるか;(v)配列番号19のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号20のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号21のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか;(vi)膜挿入配列であるか、(vii)配列番号22のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号23のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか;又は(viii)膜挿入脂肪酸である。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化される。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、(i)配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(ii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;(iii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;(iv)配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(v)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;(vi)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;(vii)配列番号3のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;又は(viii)配列番号25のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又はその機能的変異体は、(i)配列番号13、14、15、16若しくは17のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(ii)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;又は(iii)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、(i)アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化され;(ii)ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合され;(iii)脂肪酸に抱合され;(iv)ペグ化を有し、及び/又は(v)グリコシル化を有する。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、(i)内因性細胞表面受容体キナーゼ;(ii)外因性細胞表面受容体キナーゼ;及び/又は(iii)RET受容体チロシンキナーゼである。
いくつかの実施形態では、細胞は、(i)内因性GFRAL;(ii)全長GFRAL;及び/又は(iii)内因性GDF15を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効GDF15遺伝子を含むGDF15ノックアウト(KO)細胞である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、(i)GDF15ペプチド、可溶性GFRAL又はGFRAL細胞外ドメイン及び細胞表面受容体キナーゼが三元複合体を形成するときに誘導され;(ii)可溶性GFRALの非存在下でGDF15ペプチドと接触された細胞において誘導されず;及び/又は(iii)GDF15ペプチド及び/又は可溶性GFRALと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は(i)ERK1、ERK2、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質であるか;又は(ii)AKT1、AKT2、AKT3、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的から選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GDF15ペプチド及び/又は可溶性GFRALと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。
いくつかの実施形態では、(i)タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼであるか;(ii)タンパク質キナーゼ及び/又は細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであるか;又は(iii)タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、(i)ERK1、ERK2、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質キナーゼであるか;又は(ii)AKT1、AKT2、AKT3、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的から選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質キナーゼである。
一態様において、GDF15ペプチドの活性を検出するための単離及び改変された細胞が本明細書に提供され、細胞は、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、(i)可溶性GFRAL細胞外ドメインであるか;又は(ii)テザーによって細胞表面に付着される。いくつかの実施形態では、テザーは、(i)GFRAL膜貫通ドメイン又はその機能的断片であるか;(ii)配列番号18のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(iii)GFRAL細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインであるか;(iv)グリコホスファチジルイノシトール(GPI)であるか;(v)配列番号19のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号20のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号21のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか;(vi)膜挿入配列であるか;(vii)配列番号22のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号23のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか;又は(viii)膜挿入脂肪酸である。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化される。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、(i)配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(ii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;(iii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;(iv)配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(v)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;(vi)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;(vii)配列番号3のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;又は(viii)配列番号25のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、(i)内因性細胞表面受容体キナーゼ;(ii)外因性細胞表面受容体キナーゼ;及び/又は(iii)RET受容体チロシンキナーゼである。
いくつかの実施形態では、細胞は、(i)内因性GFRAL;(ii)全長GFRAL;及び/又は(iii)内因性GDF15を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効GDF15遺伝子を含むGDF15ノックアウト(KO)細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、MCF7細胞、SH−SY5Y細胞及びHEK293A−GDF15 KO細胞から選択される。
一態様では、GDF15ペプチドの活性を決定するためのキットであって、GDF15ペプチドと接触するための、請求項19〜29のいずれか一項に記載の細胞と;接触された細胞における生物学的応答を検出する手段とを含むキットが本明細書に提供される。
一態様では、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む可溶性GFRALが本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化される。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、(i)配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(ii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;(iii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;(iv)配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(v)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;(vi)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;(vii)配列番号3のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;又は(viii)配列番号25のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。
一態様では、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定する方法が本明細書に提供され、この方法は、(a)請求項19〜29のいずれか一項に記載の細胞を薬剤及びGDF15ペプチドと接触させることと;(b)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、薬剤の非存在下でGDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答に対して増大又は減少される場合、GDF15活性を調節すると決定される。
一態様では、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定する方法が本明細書に提供され、この方法は、(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;(b)細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることであって、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含み、且つドメインD1を欠く、接触させることと;(c)前記細胞を薬剤と接触させることと;(d)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、薬剤は、(i)接触された細胞における生物学的応答が、GDF15ペプチド、可溶性GFRAL及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触された細胞における生物学的応答に対して増大される場合、GDF15活性を調節するか又は増大させるか;又は(ii)接触された細胞における生物学的応答が、GDF15ペプチド、可溶性GFRAL及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触された細胞における生物学的応答に対して減少される場合、GDF15活性を調節するか又は減少させると決定される。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化される。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、(i)配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(ii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;(iii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;(iv)配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(v)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;(vi)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;(vii)配列番号3のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;又は(viii)配列番号25のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗GDF15抗体及び抗GFRAL抗体から選択される抗体である。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現、活性又はリン酸化レベルの増大又は減少である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、RET−ERK経路にあり、且つERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、RET−AKT経路にあり、且つAKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド又はその機能的変異体は、(i)配列番号13、14、15、16若しくは17のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;(ii)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;又は(iii)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、(i)アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化され;(ii)ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合され;(iii)脂肪酸に抱合され;(iv)ペグ化を有し;及び/又は(v)グリコシル化を有する。
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の用語が詳細な説明全体を通して定義されている。本明細書で特に定義しない限り、本開示に関連して使用される全ての科学及び技術用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される「GFRAL」又は「GDNFファミリー受容体α−様」は、(1)GDF15に結合し;及び(2)GDF15と複合体化されるとき、全長GFRALに関連した生物学的応答、例えばRET細胞表面受容体への結合及びその活性化を促進し、且つ/又はGDF15刺激に対する応答おける細胞内シグナリング(例えば、RET−ERKシグナリング、RET−AKTシグナリング)を促進することができる、任意の天然に存在する全長GFRAL受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を有するGFRAL受容体ポリペプチド又はその任意の変異体若しくは機能性断片を指す。いくつかの実施形態では、GFRALは、全長哺乳動物GFRAL(例えば、ヒト、サル、ラット又はマウスGFRAL)又はその変異体若しくは機能性断片である。いくつかの実施形態では、GFRALは、全長ヒトGFRAL又はその変異体若しくは機能性断片である。ヒトGFRALに関する例示的なアミノ酸及び核酸配列が本明細書に提供される。例えば、全長ヒトGFRALに関する例示的な配列(アミノ酸:配列番号9(UniProt Ref.配列:Q6UXV0);核酸:配列番号24(NCBI Ref.配列:NM_207410.2))並びにその例示的な変異体及び機能性断片を含む表1を参照されたい。例示的なヒトGFRALは、Li et al.(J Neurochem 2005;95(2):361−76)及び国際公開第2003/076569号パンフレットにも記載されている。
本明細書で使用される用語「受容体」は、「リガンド」と呼ばれる生理活性分子に結合する細胞関連タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、受容体は、GFRALであり、リガンドは、GDF15である。本開示のGFRAL受容体ポリペプチドは、「膜結合」又は「可溶性」であり得る。
本明細書で使用される「GFRALリガンド」は、GFRAL受容体ポリペプチドに結合する生理活性分子又はその変異体若しくは機能性断片を指す。GFRALリガンドは、GFRALの拮抗薬又は作動薬であり得る。いくつかの実施形態では、GFRALリガンドは、GDF15ペプチドである。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、全長ペプチド又はGFRALを作動若しくは拮抗する能力を保持するその断片であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド又は断片は、追加のペプチド又は他の治療的、薬物動態学的又は担体部分に更に抱合又は融合され得る。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合され得る。例えば、脂肪酸抱合GDF15ペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/200078号パンフレットに開示されている任意のそのようなペプチドであり得る。いくつかの他の実施形態では、GDF15ペプチドは、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン(HSA)又はマウス血清アルブミン(MSA)に融合され得る。更に他の実施形態では、GDF15ペプチドは、α−1−アンチトリプシン又は免疫グロブリン定常領域(例えば、免疫グロブリンG1定常領域)に融合され得る。GDF15融合ペプチドは、例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/198199号パンフレット又は国際公開第2017/109706号パンフレットに開示されている任意のそのようなペプチドであり得る。いくつかの他の実施形態では、ペプチド又は断片は、修飾ペプチド又は断片が非修飾GDF15ペプチドの1つ以上の機能を保持するように、例えば配列バリエーションを組み込むことにより、ペプチド若しくは断片のN−及び/若しくはC末端に短いペプチド配列を付加することにより、且つ/又はペグ化及び/若しくはグリコシル化することにより、更に修飾され得る。
本明細書で使用される「可溶性GFRAL」は、細胞膜に結合しないか又は細胞膜中に固定されないGFRAL受容体ポリペプチド又はその変異体若しくは機能性断片を指す。可溶性受容体ポリペプチドは、通常、膜貫通及び細胞内ドメイン又は細胞膜に対する他の結合、例えばグリコホスホイノシトールを欠くリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体ポリペプチドは、追加のアミノ酸残基、例えば免疫グロブリン定常領域配列(例えば、ヒト免疫グロブリンG1 Fc配列)又はポリペプチドの精製を提供するか若しくは基質へのポリペプチドの付着のための部位を提供する親和性タグ(例えば、アミロイドβ前駆体タンパク質(App)タグ又はヒスチジン(His)タグ)を含むことができる。可溶性受容体ポリペプチドは、一般に、膜貫通及び細胞内ポリペプチドセグメントが、それぞれ膜固定又はシグナル伝達を提供するのに十分なセグメント部分を欠く場合、これらのセグメントを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、GFRALは、可溶性GFRAL(例えば、可溶性ヒトGFRAL)である。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、GFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性GFRALは、十分な長さの膜貫通ドメインを欠き、それにより細胞膜上に存在しないか又は細胞膜中に固定されないGFRAL細胞外ドメインを含む。
本明細書で使用される「膜結合GFRAL」は、細胞膜に結合するか又は細胞膜中に固定されているGFRAL受容体ポリペプチド又はその変異体若しくは機能性断片を指す。いくつかの実施形態では、GFRALは、膜結合GFRAL(例えば、膜結合ヒトGFRAL)である。いくつかの実施形態では、膜結合GFRALは、GFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜結合GFRALは、細胞表面に係留されたGFRAL細胞外ドメイン含む。
本明細書で使用される用語「係留される」は、ポリペプチドの物理的修飾(例えば、ポリペプチドを細胞表面に局在化させるドメイン又は脂肪アシル化部位の付加)を指す。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される。いくつかの実施形態では、テザーは、GFRAL膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、テザーは、GFRAL膜貫通ドメイン機能性断片である。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、天然GFRAL膜貫通ドメインのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号18のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、テザーは、GFRAL細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである。
いくつかの実施形態では、テザーは、グリコホスファチジルイノシトール(GPI)又はGPIリンカー付加を指示することが可能な配列である。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号19のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号20のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号21のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、テザーは、膜挿入配列、例えば自律的膜挿入配列又は参照により本明細書に組み込まれるVergeres et al.,J Biol Chem 1995;270(7):3414−22に記載されている配列である。例示的な膜挿入配列には、シトクロムb5の膜貫通C末端ドメイン(配列番号22及び23)(例えば、Vergeres et al.,J Biol Chem 1995;270(7):3414−22を参照されたい)が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号22のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号23のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの他の実施形態では、テザーは、膜挿入脂肪酸である。いくつかの他の実施形態では、テザーは、GFRALの細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、GFRAL細胞外ドメインを細胞表面に局在化させる。
本明細書で使用される用語「変異体」は、参照(非改変)天然アミノ酸配列に関連して改変されている配列を指す。改変配列は、参照配列に関連した1つ以上のアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入(又はコドンの対応する置換、欠失及び/若しくは挿入)を含む。変異体は、参照配列の物理的操作を必ずしも必要としない。配列は、参照配列と比較して異なるアミノ酸を含む限り、それがどのように合成されたかに関わらず、「変異体」と見なされる。特定の実施形態では、変異体は、参照配列と比較して高いアミノ酸配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ポリペプチドが参照配列又は参照配列の対応するセグメント(例えば、機能性断片)と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する限り、アミノ酸置換、欠失及び/又は挿入を有するポリペプチドを包含する。参照配列は、例えば、ヒトGFRAL(配列番号9;UniProt Ref.配列:Q6UXV0)であり得る。参照配列は、例えば、ヒトGFRALの機能性断片、例えばGFRALの全長細胞外結合ドメイン(配列番号4;UniProt Ref.配列:Q6UXV0のアミノ酸20〜351)でもあり得る。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ヒトGFRALの全長細胞外結合ドメインの変異体である。
いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠く(例えば、配列番号1を参照されたい)。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号1である。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメイン配列は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む(例えば、配列番号2を参照されたい)。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号2である。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)(例えば、配列番号3又は配列番号25を参照されたい)。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号3である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号25である。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号3又は配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号3又は配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号3又は配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、GFRAL及び/又はGFRAL細胞外ドメインは、配列番号3又は配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。
用語「同一性」又は「相同性」は、配列を比較することにより決定される、2つ以上のポリペプチドの配列間の関係を指す。「同一性」は、2つ以上のアミノ酸残基のストリングの一致数によっても決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、数学的モデル又はコンピュータープログラム(即ちアルゴリズム)によって対処される、ギャップアライメント(存在する場合)を有する2つ以上の配列の小さい方の間の同一一致のパーセントを測定する。関連タンパク質の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法には、「Computational Molecular Biology」(Lesk AM,ed.,Oxford University Press,New York,1988);及び「Biocomputing:Informatics and Genome Projects」(Smith DW,ed.,Academic Press,New York,1993)に記載されているものが含まれるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法に使用されるGFRALは、GFRALの変異体、例えばヒトGFRALの変異体又はその機能的断片である。そのような変異体は、用語「GFRAL」により包含される。用語「GFRAL変異体」は、(1)GDF15に結合し;及び(2)GDF15との複合体化にある場合、全長GFRALの能力に関連した生物学的応答を促進する、例えばRET細胞表面受容体に結合し且つ活性化し、及び/又は細胞内シグナリング(例えば、RET−ERKシグナリング、RET−AKTシグナリング)を促進する能力を保持するGFRAL変異体を指す。GFRAL変異体は、切断GFRAL、GFRAL類似体又はGFRAL誘導体であり得る。用語「切断GFRAL」は、野生型GFRALの機能性断片を意味する。野生型GFRALの機能性断片は、例えば、全長GFRAL細胞外ドメイン又はドメインD2及びD3のみを含むGFRAL細胞外ドメインを含むことができる。用語「GFRAL類似体」は、野生型GFRALの1つ以上のアミノ酸残基が他の天然若しくは非天然アミノ酸残基で置換されており、且つ/又は1つ以上の天然若しくは非天然アミノ酸残基が野生型GFRALに追加されている、改変GFRALを意味する。用語「GFRAL誘導体」は、1つ以上の天然又は非天然アミノ酸残基の置換、追加又は欠失を有するか又は有さない、化学的に修飾された野生型GFRALを意味し、ここで、少なくとも1つの置換基は、野生型GFRALに存在しない。典型的な修飾には、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル及びペグ化が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「GFRAL細胞外ドメイン」は、膜貫通及び細胞内(細胞質)ドメインを欠くGFRAL受容体ポリペプチドを指す。GFRAL細胞外ドメインは、N末端シグナルペプチドを含み得るか又は含み得ず、任意の種に由来し得る。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、哺乳動物GFRAL(例えば、ヒト、サル、ラット又はマウスGFRAL)の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ヒトGFRALの細胞外ドメインである。用語「GFRAL細胞外ドメイン」は、野生型GFRAL細胞外ドメイン及びGFRAL細胞外ドメイン変異体を含む。
GFRAL細胞外ドメイン内には、3つの別個のシステインリッチサブドメイン:ドメイン1(D1)、ドメイン2(D2)及びドメイン3(D3)が存在する。GFRALの特定の特性は、これらのサブドメインの活性及び/又は結合親和性に起因し得る。例えば、ドメインD2内のアミノ酸残基は、GDF15に結合するGFRALの相互作用界面アミノ酸として同定されている。同様に、ドメインD3内のアミノ酸残基は、RETに結合するGFRALの相互作用界面アミノ酸として同定されている。例えば、国際公開第2017/152105号パンフレットを参照されたい。用語「GFRAL細胞外ドメイン」は、これらのドメイン(D1、D2及びD3)の1つ、2つ又は3つ全部を含むGFRAL細胞外ドメインを包含する。いくつかの実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1、D2及びD3を含む。他の実施形態では、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠く。いくつかの実施形態では、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインは、N末端シグナルペプチドを更に含む。
例示的なGFRAL配列及びコンストラクトを表1に示す。
本開示は、少なくとも部分的に、GFRAL細胞外ドメインに対する特定の改変が、例えば、GDF15活性アッセイにおいて且つ治療的組み合わせにおいて、野生型GFRAL細胞外ドメインを超える機能的利点を付与するという発見に基づいている。例えば、実施例3〜11を参照されたい。いくつかの実施形態では、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を含む対応するGFRAL細胞外ドメインと比較してGDF15への結合活性の増大を示す。いくつかの実施形態では、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメイン(GDF15との複合体において)は、ドメインD1を含む対応するGFRAL細胞外ドメイン(GDF15との複合体において)と比較してET活性化及びシグナリングにおける効力の増大を示す。
GFRAL D1ドメインは、6つのN−グリコシル化部位を含み、異種N−グリコシル化及び全長GFRAL細胞外ドメインの分子質量の18kDまでの増加をもたらす(Goodman et al.,Cell Rep 2014;8(6):1894−1904)。GFRAL D2ドメインは、GDF15に結合し、RET細胞外ドメインの膜近位システインリッチ領域と相互作用することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、GFRAL D1ドメイン上の炭水化物の存在と、全長GFRAL細胞外ドメインの折り畳みとは、GDF15及びRET細胞外ドメインとのGFRAL D2ドメインの相互作用を遮蔽又は阻害する可能性がある。
例えば、本明細書に提供される実施例に記載されているように、全長GFRAL細胞外ドメインからドメインD1を除去した後、GDF15及びドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメイン(GFRAL(D2D3))は、GDF15及び全長GFRAL細胞外ドメイン(GFRAL(ECD))よりも小さく、よりコンパクトな複合体を形成する可能性がある。理論に束縛されるものではないが、このより小さくよりコンパクトな複合体は、RET細胞外ドメインの二量体化によって形成されたポケット内により良好に適合し、RETへのGFRAL(D2D3)/GDF15複合体の結合活性を増大させ得る。これは、RETの活性化におけるGFRAL(D2D3)/GDF15複合体の効力の増大をもたらし、治療的及び細胞ベースのアッセイ目的の両方に利益を提供し得る。GFRAL(ECD)/GDF15のより大きい複合体は、安定性が比較的低い可能性がある。また、細胞表面上のRETとの結合後、表面RETとのより大きい複合体の相互作用は、結合アッセイの観察に基づいてより小さい複合体ほど強くなく、従ってRET活性化及びシグナリングにおける効力を減少させる可能性がある。
いくつかの実施形態では、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインの利点は、GDF15ペプチドの効力又は有効性を評価するための増強されたアッセイを提供することができる。いくつかの実施形態では、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインのこれらの利点は、GFRAL単独又はGDF15ペプチドとの組み合わせ(例えば、脂肪酸抱合又はアルブミン融合GDF15ペプチド)を投与することにより、肥満症又は関連障害の処置において改善された治療的利点を提供する可能性がある。
特定の態様において、本明細書の開示は、(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;(b)細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることと;(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含む、GDF15ペプチドの活性を検出するための細胞ベースのアッセイを特徴とし、ここで、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む。
特定の他の態様において、本開示は、(a)GFRAL細胞外ドメイン(例えば、可溶性GFRAL細胞外ドメイン)及び細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;(b)細胞をGDF15ペプチドと接触させることと;(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含む、GDF15ペプチドの活性を検出するための細胞ベースのアッセイを特徴とし、ここで、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD2及びD3を含む。
本明細書で使用される「GDF15」及び「GDF15ペプチド」は、哺乳動物起源の任意のGDF15ポリペプチド又はその変異体若しくは機能性断片を指す。様々な実施形態において、GDF15ペプチドは、ヒトGDF15ペプチド又はその変異体若しくは機能性断片である。様々な実施形態において、ヒトGDF15は、シグナルペプチド(アミノ酸1〜29)、プロペプチド(アミノ酸30〜196)及び112個のアミノ酸成熟GDF15ペプチド(アミノ酸197〜308(配列番号13としても特定))を含む308個のアミノ酸前タンパク質(配列番号12;UniProt Ref.配列:Q99988)として合成されるが(例えば、Bootcov et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1997;94(21):11514−9を参照されたい)、これらのサブ配列間の境界は、僅かに異なり得る。例えば、様々な実施形態において、ヒトGDF15前タンパク質(配列番号12;UniProt Ref.配列:Q99988)は、シグナルペプチド(アミノ酸1〜29)、プロペプチド(アミノ酸30〜194)及び成熟GDF15ペプチド(アミノ酸195〜308)に細分され得る。様々な実施形態において、成熟GDF15ペプチドは、配列番号12のアミノ酸197〜308を含み、本明細書で配列番号13と特定される。様々な他の実施形態において、成熟GDF15ペプチドは、配列番号12のアミノ酸200〜308を含み、配列番号14と特定される。
加えて、配列バリエーションが報告されている。例えば、配列番号12のアミノ酸202、269及び288は、それぞれAsp、Glu及びAlaとして報告されている(例えば、Hromas et al.,Biochim Biophys Acta 1997;1354(1):40−4;Lawton et al.,Gene 1997;203(1):17−26)を参照されたい)。アミノ酸202にAsp置換を含む例示的な配列変異体(「GDF15 H6D変異体」)は、例えば、Amaya−Amaya et al.,J Immunol Res 2015;2015:270763に記載されている。
GDF15ペプチドの変異体又はその機能的断片は、1つ以上のアミノ酸欠失、追加及び/又は置換を任意の所望の組み合わせで含み得る。アミノ酸配列バリエーション(例えば、アミノ酸欠失、追加及び/又は置換による)の量は、成熟GDF15ペプチドの活性(例えば、GFRALシグナリング活性)を保存するように制限される。いくつかの実施形態では、成熟GDF15ペプチドの変異体は、配列番号13に対する約1〜約20、約1〜約18、約1〜約17、約1〜約16、約1〜約15、約1〜約14、約1〜約13、約1〜約12、約1〜約11、約1〜約10、約1〜約9、約1〜約8、約1〜約7、約1〜約6又は約1〜約5のアミノ酸欠失、追加又は置換を任意の所望の組み合わせで有する。代わりに又は加えて、変異体は、配列番号13の全長にわたって測定した場合、配列番号13と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。様々な実施形態において、GDF15ペプチド又は変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。様々な実施形態において、GDF15ペプチド又は変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する。様々な実施形態において、GDF15ペプチド又は変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。様々な実施形態において、GDF15ペプチド又は変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。
本明細書に開示したGDF15ペプチド及び変異体は、例えば、親和性タグ(例えば、Hisタグ)、ペグ化、グリコシル化、融合(例えば、ヒト又はマウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域との)及び抱合(例えば、脂肪酸との)等の追加の修飾も含み得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/200078号パンフレットに開示されている抱合を参照されたく;また、両方とも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/198199号パンフレット及び国際公開第2017/109706号パンフレットに開示されている融合も参照されたい。親和性タグ、ペグ化、グリコシル化、融合、抱合又はペプチドに対する所望の生理学的応答(例えば、所望のpK、クリアランス、半減期、溶解度等)を支持し得る任意の追加の修飾を含むか又はそれらによって修飾されているGDF15ペプチド及び変異体は、用語「GDF15ペプチド」に包含される。
理論に束縛されることを望むものではないが、GDF15は、GFRAL受容体に特異的に結合し、GFRAL受容体は、GDF15刺激に対する応答における細胞内シグナリングを誘発するために、共受容体RETとの関連を必要とすることが報告されている(Yang et al.,Nat Med 2017;23(10):1158−1166)。生物学的に活性なGDF15は、1つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合した成熟ペプチドの25kDホモダイマーであることも一般に知られている。従って、GDF15ペプチドがGDF15の変異体である場合、いずれのアミノ酸欠失、追加及び/又は置換も、一般に、受容体結合又はペプチド−ペプチド界面に関与しない位置に存在する。例えば、配列番号12の216、222、223、225、237、239、241、252、253、254、257、258、260、261、264、265、268、269、270、273、275、276、279、297、299、300及び308位のアミノ酸は、ペプチド−ペプチド界面に関与すると考えられている。これらの位置の任意のアミノ酸置換は、一般に、望ましくなく、いずれの置換も一般に保存的置換である。表面に露出されるが、種間で保存されていないアミノ酸は、いくつかの実施形態では、ペプチドを折り畳むか又はその活性を破壊することなく他のアミノ酸で置換され得る。任意のそのようなGDF15の変異体は、本開示のGDF15ペプチドとして使用することができる。そのような変異体は、第2の薬剤、例えば治療薬、検出可能な標識並びに/又は望ましいpK、クリアランス、半減期及び/若しくはペプチドに対する他の生理学的応答を支持する薬剤にも抱合され得る(例えば、ヒスチジンタグ化、アルブミンタグ化又は脂肪酸タグ化GDF15ペプチド変異体)。本明細書に開示したGDF15ペプチド及び変異体は、GDF15の天然に存在する及び合成の変異体を含む。例示的な変異体には、(i)GDF15 H6D変異体(例えば、参照により本明細書に組み込まれるAmaya−Amaya et al.,J Immunol Res 2015;2015:270763を参照されたい);(ii)免疫グロブリン定常領域とのGDF15の融合(例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれるXiong et al.,Sci Transl Med 2017;9(412):eaan8732;及び国際公開第2012/138919号パンフレットを参照されたい);(iii)α−1−アンチトリプシンとのGDF15の融合(例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2016/102580号パンフレットを参照されたい);(iv)GDF15 N−末端及び/又はC−末端への短ペプチドの追加(例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/202936号パンフレットを参照されたい);(v)例えば、溶解度を改善するための配列バリエーション(例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第9,161,966号明細書を参照されたい);及び(vi)ペグ化及び/又はグリコシル化(例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2015/0023960 A1号明細書及び米国特許第9,161,966号明細書を参照されたい)が含まれるが、これらに限定されない。
追加の変異体には、本明細書に開示したもの(例えば、配列番号15〜17を参照されたい)並びに全て参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2013/148117号パンフレット、国際公開第2014/120619号パンフレット、国際公開第2015/197446号パンフレット、国際公開第2015/198199号パンフレット、国際公開第2016/069921号パンフレット、国際公開第2016/018931号パンフレット及び国際公開第2016/102580号パンフレットに記載されている他のものが含まれる。国際公開第2013/148117号パンフレット、国際公開第2014/120619号パンフレット、国際公開第2015/197446号パンフレット、国際公開第2015/198199号パンフレット、国際公開第2016/069921号パンフレット、国際公開第2016/018931号パンフレット又は国際公開第2016/102580号パンフレットに記載されている任意のGDF15ペプチド又は変異体を本開示のGDF15ペプチドとして使用することができる。
例示的なGDF15配列を表2に示す。
本明細書で使用される「活性」は、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)が生物学的プロセスにおける変化を達成する能力を指す。いくつかの実施形態では、GFRALリガンドの活性は、GFRALリガンドが、そのリガンドと接触された細胞において、規定された生物学的応答を誘発又は誘導するか否かによって決定される。いくつかの実施形態では、細胞ベースの活性アッセイの結果は、試験分子を参照基準又は参照分子と比較した場合、「相対活性」として表される。相対活性の使用により、試験されるべき分子と参照分子との間の同じアッセイでの直接比較が可能となり、それにより最終的な報告するべき結果への影響又は実行毎の変動が低減される。
細胞ベースの活性アッセイでは、参照分子を通常使用して相対活性を割り当てて、活性の測定値が、試験するべき様々な分子にわたって正規化されることを確実にする。本明細書で使用される場合、GFRALリガンド活性アッセイの「参照分子」は、既知の生物学的活性を有するGFRALリガンドを指す。例えば、GFRALリガンドは、既知の生物学的活性を有するGDF15ペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、参照分子は、野生型又は組換え野生型GDF15ペプチド(例えば、ヒト又は組換えヒトGDF15)である。他の実施形態では、参照分子は、野生型又は組換え野生型GDF15ペプチドの変異体(例えば、ヒト又は組換えヒトGDF15の変異体、ここで、GDF15変異体の生物学的活性は、既知である)である。更に他の実施形態では、参照分子は、治療的使用のためのGDF15の代表的なバッチである。いくつかの実施形態では、細胞は、培養プレート内で成長し、ある範囲の濃度にわたって試験されるべき参照分子及びGFRALリガンドによって刺激される。いくつかの実施形態では、濃度の範囲は、0〜最大濃度の用量応答の範囲全体を包含する。いくつかの他の実施形態では、全用量応答曲線は、S字形である。
本明細書で使用される「生物学的応答」は、細胞がGFRALリガンド、例えばGDF15ペプチドと接触した後の細胞における応答を指す。生物学的応答には、例えば、細胞シグナリング又はシグナル伝達(例えば、タンパク質キナーゼのリン酸化)、遺伝子転写、タンパク質発現、毒性、サイトカイン放出、細胞増殖、細胞運動性若しくは形態、細胞成長停止又は細胞死(例えば、アポトーシス)に関する任意の応答が含まれ得る。
様々な実施形態において、GDF15ペプチド等のGFRALリガンドと接触させた後の細胞における生物学的応答は、本明細書に記載されるか又は当技術分野で既知の例示的なアッセイのいずれかを用いて評価又は測定され得る。様々な実施形態において、アッセイは、細胞又は細胞の培養物をGFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触させ、細胞又は培養物の1つ以上の特性が接触後に変化したか否かを決定することを含む。様々な実施形態において、変化は、RNA発現のレベル、タンパク質発現のレベル、タンパク質活性のレベル、タンパク質修飾(例えば、タンパク質リン酸化)のレベル、レポーターシグナル、毒性、サイトカイン放出、細胞増殖、細胞運動性若しくは形態、細胞成長停止及び/又は細胞死(例えば、アポトーシス)のレベルにおいて検出され得る。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した、接触した細胞におけるタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、細胞内タンパク質上のセリン、チロシン又はスレオニン残基のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、ERK(例えば、ERK1、ERK2)のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、AKT(例えば、AKT1、AKT2、AKT3)のリン酸化を含む。
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、タンパク質の発現、活性及び/又はリン酸化レベルを評価する1つ以上のアッセイを用いて検出される。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、キナーゼ又は酵素活性アッセイ、全細胞の放射標識32P−オルトホスフェートとのインキュベーション、2次元ゲル電気泳動、免疫ブロットアッセイ(例えば、ウェスタンブロット)、AlphaLISA(登録商標)アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、細胞ベースのELISAアッセイ、細胞内フローサイトメトリー、免疫細胞化学(ICC)、免疫組織化学(IHC)、質量分析、多検体プロファイリング(例えば、ホスホ−タンパク質多重アッセイ)及び蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)から選択される1つ以上のアッセイを用いて検出される。
用語「シグナル伝達」は、細胞表面受容体を介して、特定の連続した一連の分子を介して、刺激に対する特定の細胞応答をもたらす核内の遺伝子への細胞外刺激の伝達を含む生化学的プロセスを指す。シグナル伝達は、一般に、細胞活性を管理し、細胞作用を調整する伝達システムの一部である。そのような伝達システムを介して、細胞は、細胞外状態における変化を認知し、それに応答することができる。本開示の様々な実施形態において、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触された細胞は、シグナル伝達応答を開始することによってGFRALリガンドの存在に応答する。様々な実施形態において、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)及びGFRAL受容体ポリペプチド(例えば、可溶性GFRAL)と接触された細胞は、シグナル伝達応答を開始することによってGFRALリガンド及びGFRAL受容体ポリペプチドの存在に応答する。様々な実施形態において、細胞は、内因的又は外因的に細胞表面受容体キナーゼを発現している細胞である。様々な実施形態において、細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである。様々な実施形態において、細胞は、外因性GFRAL細胞外ドメインも発現する。
GFRAL、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)受容体αファミリーのオーファンメンバーは、GDF15に直接結合する受容体として同定されている。しかしながら、GDF15刺激に対する応答における細胞内シグナリングを誘発するために、GDF15との複合体のGFRALは、典型的にはRET細胞表面受容体キナーゼに結合し、それを活性化する。GDF15は、典型的には、GFRALのみ又はRETのみを発現している細胞において下流シグナルを誘導しないが、GDF15シグナルは、GFRAL及びRETの両方を発現している細胞において検出され得る。理論に束縛されることを望むものではないが、GDF15のインビボ活性は、三元複合体を形成することによってGFRAL及びRETの両方によって媒介されると考えられる。様々な実施形態において、GDF15ペプチド及びGFRAL受容体ポリペプチド(例えば、可溶性GFRAL)は、二元複合体を形成する。様々な実施形態において、二元複合体は、RETに結合して三元複合体を形成する。様々な実施形態において、GDF15−GFRAL−RET三元複合体の形成は、RETを活性化し、RET媒介細胞内シグナリングを刺激する。
本明細書で使用される用語「複合体」は、互いに親和性を有する少なくとも2つの部分間の非共有結合的関連(例えば、化学的又は生化学的)を指す。複合体の例としては、抗原/抗体、レクチン/アビジン、標的ポリヌクレオチド/プローブオリゴヌクレオチド、抗体/抗抗体、受容体/リガンド(例えば、GFRAL及びGDF15)、酵素/リガンド、ポリペプチド/ポリペプチド、ポリペプチド/ポリヌクレオチド、ポリペプチド/共因子、ポリペプチド/基質、ポリペプチド/阻害剤、ポリペプチド/小分子間等の非共有結合的関連が挙げられる。用語「二元複合体」は、2つのそのような部分、例えば受容体及びリガンド(例えば、GFRAL及びGDF15)間の非共有結合的関連を意味する。用語「三元複合体」は、3つの部分、例えば受容体、共受容体及びリガンド(例えば、GFRAL、GDF15及びRET)間の非共有結合的関連を意味する。
本明細書で使用される「RET」は、GDF15と複合体化した場合にGFRALに結合することができ、GFRALによって活性化される、任意の天然に存在する全長RET受容体ポリペプチドのアミノ酸配列又はその任意の変異体若しくは機能性断片を有するRET受容体ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、RETは、全長哺乳動物RET(例えば、ヒト、サル、ラット又はマウスRET)又はその変異体若しくは機能性断片である。いくつかの実施形態では、RETは、全長ヒトRETである。
「RET」は、「トランスフェクション中に再配列された」の略語であり、これは、ヒトリンパ腫細胞から採取したDNAでトランスフェクトした後、3T3線維芽細胞株内でRET遺伝子のDNA配列が再配列されることが最初に発見されたためである。ヒトRET遺伝子の天然の選択的スプライシングは、タンパク質RETの3つの異なるアイソフォーム:RET51、RET43及びRET9の生成をもたらす。これら3つのアイソフォームは、同じ1063アミノ酸をそれらのN末端に共有するが、それらの細胞質C末端にそれぞれ51、43及び9個の異なるアミノ酸を含む。3つの全アイソフォームは、本明細書では用語「RET」に包含される。受容体チロシンキナーゼに典型的であるが、RETは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内キナーゼドメインを有する。例えば、Mulligan,Nat Rev Cancer 2014;14(3):173−86を参照されたい。
様々な実施形態において、RET活性化は、RETがGDF15との複合体のGFRALに結合されるときに起こる。様々な実施形態において、RET活性化は、GDF15、GFRAL及びRETが三元複合体(即ちGDF15−GFRAL−RET三元複合体)を形成するときに起こる。様々な実施形態において、RET活性化は、RET二量体化と、RET細胞内キナーゼドメインにおける特定の残基のリン酸化とを含む。RET細胞内ドメインにおけるそのようなリン酸化された残基は、ホスホリパーゼCγ(PLCγ)等のシグナリング分子又は様々なアダプタータンパク質との直接的な相互作用を促進し得、これは、多数の下流シグナリング経路の活性化に繋がり得る。
GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)の活性は、様々な実施形態において、それがリガンドと接触された細胞において規定された生物学的応答を誘発又は誘導するか否かによって決定される。いくつかの実施形態では、規定された生物学的応答は、シグナル伝達応答である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、当技術分野で既知の方法に従って測定することができる、ERK/MAPK経路、PI3K/AKT経路、タンパク質キナーゼC経路、JAK/STAT経路、JNK経路、p38経路及びRAC1経路の1つ以上の活性化を含む。
シグナル伝達のための主な機構の1つは、タンパク質リン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、GFRALリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質のリン酸化と比較した、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触された細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。
本明細書で使用される「タンパク質キナーゼ」は、リン酸基をリン酸ドナーから基質タンパク質中のアクセプターアミノ酸に移動する酵素を指す。タンパク質キナーゼは、アクセプターアミノ酸特異性に基づいて分類され得る。2つの最もよく特徴付けられたタイプのタンパク質キナーゼは、タンパク質セリン/スレオニンキナーゼ(アクセプターとしてタンパク質アルコール基を有するタンパク質キナーゼ)及びタンパク質チロシンキナーゼ(アクセプターとしてタンパク質フェノール基を有するタンパク質キナーゼ)である。RET及び活性化RETによって直接又は間接的にリン酸化される全タンパク質キナーゼは、用語「タンパク質キナーゼ」に包含されることが意図される。例示的なタンパク質キナーゼは、本明細書に記載されており、他のものは、当技術分野で既知である。RET受容体相互作用及びシグナル伝達経路は、例えば、Mulligan、Nat Rev Cancer 2014;14(3):173−86に概説されている。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ERK/MAPK経路(本明細書で「RET−ERK」経路とも称される)の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ERK(ERK1、ERK2)、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ERK(ERK1、ERK2)、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2の1つ以上から選択される。RET−ERK経路における例示的な細胞内タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2並びにその任意の上流モジュレーター及び下流標的を含む。いくつかの実施形態では、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、GFRALリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したRET−ERK経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、PI3K/AKT経路(本明細書で「RET−AKT」経路とも称される)の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、AKT(AKT1、AKT2、AKT3)、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、AKT(AKT1、AKT2、AKT3)、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTORの1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、RET−AKT経路における下流標的は、S6キナーゼである。RET−AKT経路における例示的な細胞内タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTOR並びにその任意の上流モジュレーター及び下流標的を含む。いくつかの実施形態では、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、GFRALリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したRET−AKT経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、タンパク質キナーゼC経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、タンパク質キナーゼCである。いくつかの実施形態では、RET活性化は、ホスホリパーゼCγ(PLCγ)のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、リン酸化PLCγは、タンパク質キナーゼC経路を活性化する。例えば、Mullican et al.,Nat Med 2017;23(10):1150−7を参照されたい。いくつかの実施形態では、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、GFRALリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したタンパク質キナーゼC経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、JAK/STAT経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、JAK1及びJAK2の1つ以上から選択される。JAK/STAT経路における例示的な細胞内タンパク質は、JAK1、JAK2及びSTAT3(RETシグナリングに関与している(例えば、Mulligan,Nat Rev Cancer 2014;14(3):173−86を参照されたい))並びにJAK3、TYK2、STAT1、STAT2及びSTAT5を含む。いくつかの実施形態では、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、GFRALリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したJAK/STAT経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、JNK経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、JNK1、JNK2、TAK1、MKK4及びMKK7の1つ以上から選択される。JNK経路における例示的な細胞内タンパク質は、JNK1、JNK2、TAK1、MKK4及びMKK7を含む。いくつかの実施形態では、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、GFRALリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したJNK経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、p38経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、MKK3、MKK6、p38 MAPK(例えば、MAPK11、MAPK12、MAPK13及びMAPK14)、MSK1、MSK2、MK2、MK3、MNK1及びMNK2の1つ以上から選択される。p38経路における例示的な細胞内タンパク質は、MKK3、MKK6、p38 MAPK(例えば、MAPK11、MAPK12、MAPK13及びMAPK14)、MSK1、MSK2、MK2、MK3、MNK1及びMNK2を含む。いくつかの実施形態では、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、GFRALリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したp38経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、RAC1経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、PKN2である。RAC1経路における例示的な細胞内タンパク質は、RAC1及びPKN2を含む。いくつかの実施形態では、GFRALリガンド(例えば、GDF15ペプチド)と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、GFRALリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したRAC1経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼ及び/又は細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである。
様々なアッセイがタンパク質リン酸化を測定するために開発されている。リン酸化チロシン/セリン/スレオニン残基又は特定のリン酸化タンパク質キナーゼに対するホスホ特異的抗体の発見は、タンパク質キナーゼのリン酸化を測定する免疫学アッセイ、例えば免疫ブロットアッセイ(例えば、ウェスタンブロット)、AlphaLISA(登録商標)アッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を可能にする。いくつかの他のアッセイは、セリン/スレオニンキナーゼ又はチロシンキナーゼが合成基質ポリペプチドをリン酸化する能力を測定する(例えば、Pike,Methods Enzymol 1987;146:353−62;Hunter,J Biol Chem 1982;257(9):4843−8;Wang et al.,J Biol Chem 1992;267(24):17390−6を参照されたい)。そのようなアッセイは、放射性標識を使用する場合がある。
本開示の特定の態様において、GFRALリガンドと接触される細胞は、内因的に又はコンストラクト若しくはベクターによるトランスフェクションを介して外因的に細胞表面受容体キナーゼを発現している細胞である。特定の態様において、細胞は、外因性GFRAL細胞外ドメインも発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性GFRAL又は内因性GFRAL細胞外ドメインを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性GDF15を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、操作性GDF15遺伝子を含むGDF15 KO細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、GFRAL細胞外ドメインを外因的に発現するようにコンストラクト又はベクターでトランスフェクトされる。例示的な細胞には、動物細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、動物細胞は、哺乳動物、例えばヒト、霊長類又は齧歯類を起源とする。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、MCF7細胞、SH−SY5Y細胞又はHEK293A−GDF15 KO細胞である。
本明細書で使用される「発現」は、細胞による核酸分子の転写及び翻訳を指す。
本明細書で使用される用語「コンストラクト」は、細胞内での特定の核酸の転写及び/又は翻訳を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え手段又は直接化学合成を含むヒト介入によって生成された核酸分子を指す。コンストラクトは、プラスミド、ウイルス又は核酸断片の一部であり得る。コンストラクトは、組み込み可能なDNA断片(即ち遺伝的組換えによって宿主ゲノムに組み込み可能な断片)及び関心のある遺伝子又は核酸配列を含むDNA断片の組み込みを可能にする他のビヒクルも含むことができる。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、制御エレメント及びRET細胞表面受容体キナーゼをコードする遺伝子又は核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、制御エレメント及びGFRAL細胞外ドメインをコードする遺伝子又は核酸配列を含む。例示的な制御エレメントには、プロモーター系、mRNA発現のレベルを制御するための調節エレメント、リボソーム結合部位をコードする配列並びに転写及び翻訳を終止する配列が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「内因性」は、生物を起源とするか又は生物内で生成される物質を指す。「内因性」遺伝子又はタンパク質は、種に存在し、またその種に由来する遺伝子又はタンパク質である。
本明細書で使用される用語「外因性」は、生物の外部を起源とするか又は生物の外部で生成される物質又は分子を指す。外因性遺伝子は、トランスフェクトされた細胞に対して、異なる種由来(「異種」遺伝子)又は同じ種由来(「同種」遺伝子)であり得る。トランスフェクトされた細胞は、組換え細胞とも称され得る。
本明細書で使用される用語「組換え」は、宿主細胞内に天然に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。組換え分子は、天然に存在しない方法で互いに連結した2つ以上の天然に存在する配列を含み得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む。
本明細書に記載されるGFRALリガンド及びGFRAL細胞外ドメインは、様々な実施形態において、組換え発現方法を使用して生成することができる。宿主細胞を使用した組換えタンパク質発現は、当技術分野で日常的に使用されている。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、ペプチドの配列をコードし、転写及び翻訳される核酸を含むように人工的に操作され、任意選択的にペプチドを細胞成長培地に分泌する細胞を指す。組換え生成を目的として、ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸は、典型的には従来の方法によって合成又はクローン化され、発現ベクターに組み込まれるであろう。例示的な宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚腎臓(HEK)細胞(例えば、HEK293、HEK293T、HEK293F、HEK293S)、サル腎臓(COS)細胞(例えば、COS−1、COS−7)、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞(例えば、BHK−21)、アフリカミドリザル腎臓細胞(例えば、BSC−1)、HeLa細胞、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、骨髄腫細胞(例えば、NS0、653、SP2/0)、リンパ腫細胞、大腸菌(E.coli)又は他の細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞又はそれらの任意の派生物、不死化又は形質転換細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、CHO細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、HEK細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、HEK293T、HEK293F又はHEK293S細胞である。いくつかの実施形態では、HEK293S細胞は、変化したグリコシル化パターン(例えば、より短いグリコシル化鎖)を有する組換えタンパク質(例えば、組換えGFRALリガンド又はGFRAL細胞外ドメイン)を生成し得る。
治療方法及び組成物
本明細書に記載される新規なGFRAL受容体ポリペプチド及び細胞ベースの活性アッセイを使用して評価されたGDF15ペプチドは、多くの治療的又は予防的用途に使用することができる。それらには、体脂肪蓄積の減少及び肥満症の処置、肥満症の発症の予防、体重の低減、体重増加の逆転又は遅延、食欲の低減、食料効率の減少及び代謝障害の処置が含まれるが、これらに限定されない。従って、本開示は、GDF15ペプチドを単独で又はGFRAL受容体ポリペプチド(例えば、可溶性GFRAL)と組み合わせて投与することにより、肥満症及び肥満症関連の状態を処置する方法を提供する。本開示は、GDF15ペプチドを単独で又はGFRAL受容体ポリペプチド(例えば、可溶性GFRAL)と組み合わせて投与することにより、例えば過体重又は肥満の対象において、食欲を低減させ、且つ/又は体重を低減させる方法を更に提供する。例えば、肥満症の処置、食欲の低減及び/又は体重の低減におけるGDF15ペプチド単独又はGFRAL受容体ポリペプチドとの組み合わせの使用も提供される。本明細書に提供される治療方法及び使用は、肥満症並びに/又は過剰な体重に関連した任意の多様な障害及び状態の処置又は予防に有用であり得る。
本明細書に記載される新規なGFRAL受容体ポリペプチド及び細胞ベースの活性アッセイを使用して評価されたGDF15ペプチドは、多くの治療的又は予防的用途に使用することができる。それらには、体脂肪蓄積の減少及び肥満症の処置、肥満症の発症の予防、体重の低減、体重増加の逆転又は遅延、食欲の低減、食料効率の減少及び代謝障害の処置が含まれるが、これらに限定されない。従って、本開示は、GDF15ペプチドを単独で又はGFRAL受容体ポリペプチド(例えば、可溶性GFRAL)と組み合わせて投与することにより、肥満症及び肥満症関連の状態を処置する方法を提供する。本開示は、GDF15ペプチドを単独で又はGFRAL受容体ポリペプチド(例えば、可溶性GFRAL)と組み合わせて投与することにより、例えば過体重又は肥満の対象において、食欲を低減させ、且つ/又は体重を低減させる方法を更に提供する。例えば、肥満症の処置、食欲の低減及び/又は体重の低減におけるGDF15ペプチド単独又はGFRAL受容体ポリペプチドとの組み合わせの使用も提供される。本明細書に提供される治療方法及び使用は、肥満症並びに/又は過剰な体重に関連した任意の多様な障害及び状態の処置又は予防に有用であり得る。
本明細書で使用される用語「処置する」及びその同根語は、疾患、障害若しくは状態(例えば、心不全)又はその少なくとも1つの識別可能な症状の寛解を指す。いくつかの実施形態では、「処置する」は、必ずしも患者により識別可能ではない、少なくとも1つの測定可能な物理的パラメーターの寛解を指す。いくつかの実施形態では「処置する」は、物理的に(例えば、識別可能な症状の安定化)、生理学的に(例えば、物理的パラメーターの安定化)又は両方で疾患、障害又は状態の進行を阻害することを指す。いくつかの実施形態では、「処置する」は、疾患、障害又は状態の進行を遅延させるか又はその進行を逆転させることを指す。本明細書で使用される「処置する」及びその同根語は、所与の疾患、障害若しくは状態の発症を遅延させるか又は獲得のリスクを低減することも包含する。
用語「対象」及び「患者」は、任意のヒト又は非ヒト動物を指すために本明細書で互換的に使用される。非ヒト動物は、全脊椎動物(例えば、哺乳動物及び非哺乳動物)、例えば任意の哺乳動物を含む。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル及びブタが挙げられる。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
過体重又は肥満である対象は、多様な代謝障害のリスクの増大及び重大な健康上の問題を有する。これらは、多くの場合、最初に、代謝症候群の一部として現れ、代謝症候群は、血圧の上昇、高い血糖、腹部の周りの過剰な体脂肪及び異常な血中コレステロールレベルにより特徴付けられる。次いで、重大な健康上の問題、例えばII型糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、卒中、癌、変形性関節症、睡眠時無呼吸、脂質異常症、インスリンの上昇(インスリン抵抗性)及び低換気症候群が発症し得る。II型糖尿病は、いくつかの他の重大な健康上の問題、例えば糖尿病性神経症、糖尿病性腎症及び糖尿病性網膜症を生じる場合もある。GDF15ペプチドを単独で又はGFRAL受容体ポリペプチド(例えば、可溶性GFRAL)と組み合わせて使用する治療法を必要とする対象は、一般に、過体重又は肥満である。一般に、成人ヒトは、成人が25〜29.9の肥満度指数(BMI)(人の体重(キログラム)をその人の身長(メートル)の2乗で除算することにより得られる測定値)を有する場合に過体重と見なされ、成人ヒトは、成人が30以上のBMIを有する場合に肥満と見なされる。しかしながら、このガイドラインは、人種差を考慮するように調整することができる。例えば、人種の調整により、27.5以上のBMIを有するアジア人は、肥満と見なされ得る(WHO Expert Consultation,Lancet 2004;363(9403):157−63)。代謝障害を発症するリスクが増大した対象も、GDF15ペプチド単独又はGFRAL受容体ポリペプチド(例えば、可溶性GFRAL)との組み合わせを使用する治療法の候補である。例えば、糖尿病前症又は100〜125mg/dLの高い空腹時血糖レベルを有する対象は、II型糖尿病を有する対象(126mg/dL以上の空腹時血糖レベルを有するもの)と同様にこの治療法の候補である。
特定の態様において、本開示は、対象における肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法に関する。本明細書で使用される用語「肥満症」は、過剰な体脂肪が健康に負の影響を有し得るほど蓄積した状態を指し、これは、次に、平均余命の減少及び/又は健康上の問題の増加を引き起こし得る。場合により、対象は、対象の肥満度指数(BMI)が20kg/m2、21kg/m2、22kg/m2、23kg/m2、24kg/m2、25kg/m2、26kg/m2、27kg/m2、28kg/m2、29kg/m2又は30kg/m2を超える場合に肥満と見なされ得る。場合により、肥満症は、少なくとも100mg/dLの空腹時ブドウ糖レベル、少なくとも150mg/dLの血漿トリグリセリドレベル、男性では40mg/dL未満、女性では50mg/dL未満のHDLコレステロール、少なくとも130/85mmHgの血圧及び男性では40インチを超える、女性では35インチを超える腹部ウエスト周囲の1つ以上によっても特徴付けられ得る。
用語「肥満症関連の障害」は、肥満症と同時に発生し得るか、又は過剰な体重を有することの直接若しくは間接的な結果であり得る任意の状態を指す。この用語は、代謝疾患及び障害に加えて、例えば癌、体重障害を包含する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害及び/又は代謝疾患若しくは障害である。例えば、癌、II型糖尿病(T2DM)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、高トリグリセリド血症及び心血管系疾患等、例示的な肥満症関連の障害は、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される用語「体重障害」は、過剰な体重及び/又は亢進した食欲に関連した状態を指す。対象の年齢、身長、性別及び健康状態を含む様々なパラメーターは、参照の健康な個人と比較して対象が過体重であるか否かを決定するために使用される。例えば、対象は、対象のBMIの評価により、過体重又は肥満と見なされ得る。場合により、18.5〜24.9kg/m2の範囲のBMIを有する成人は、正常な体重を有すると見なされ得;25〜29.9のkg/m2のBMIを有する成人は、過体重(肥満前)と見なされ得;30kg/m2以上のBMIを有する成人は、肥満と見なされ得る。亢進した食欲は、多くの場合に過剰な体重に寄与する。例えば、夜食症候群を含む、亢進した食欲に関連したいくつかの状態が存在し、夜食症候群は、朝の食欲不振により特徴付けられ、夕方の多食は、多くの場合、不眠症に関連するが、視床下部への損傷に関連する場合がある。
用語「代謝障害」及び本明細書で同様に使用される用語は、肥満症、II型糖尿病(T2DM)、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高トリグリセリド血症、高血糖、代謝症候群、高血圧、心血管系疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症(慢性腎臓疾患を含むが、これに限定されない)、神経障害、胃不全麻痺及び他の代謝障害を含むが、これらに限定されない。
用語「代謝疾患又は障害」は、高インスリン血症、異常な耐糖能、肥満症、腹部又は上半身コンパートメントへの脂肪の再分布、高血圧、高トリグリセリド、低高密度リポタンパク質(HDL)粒子及び高低密度リポタンパク質(LDL)粒子により特徴付けられる脂質異常症を含むが、これらに限定されない、関連した形質のクラスターを指す。代謝疾患又は障害を有する対象は、T2DM及び例えばアテローム性動脈硬化症を発症するリスクがある。
本明細書で使用される用語「代謝症候群」は、心臓疾患並びに糖尿病及び卒中のような他の疾患のリスクを上昇させるリスク因子のクラスターを指す。これらのリスク因子には、腹部脂肪(即ち殆どの男性でウエストヒップ比>0.9又はBMI>30kg/m2);高血糖(即ち絶食後少なくとも100mg/dL);高トリグリセリド(即ち血流中少なくとも150mg/dL);低HDL(即ち男性では40mg/dL以下、女性では50mg/dL以下);及び130/85mmHg以上の血圧(世界保健機構)が含まれるが、これらに限定されない。
特定の態様において、本開示は、対象における遺伝的肥満症、例えばプラダー・ウィリー症候群、レプチン変異及び/又はメラノコルチン4受容体変異を処置する方法にも関する。
例示的な実施形態は、GDF15ペプチドを対象に投与することにより、肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であり、GDF15ペプチドは、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有する。GDF15ペプチドは、単独で又は第2の薬剤(例えば、GFRAL受容体ポリペプチド、例えば可溶性GFRAL)と組み合わせて投与され得、また任意の許容され得る製剤、投与量及び投与レジメンで投与され得る。
別の例示的な実施形態は、GDF15ペプチドをGFRALと組み合わせて対象に投与することを含む、肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であり、GDF15ペプチドは、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ/又はGFRALシグナリング活性を有し、GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、可溶性GFRALである。いくつかの実施形態では、GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。
本明細書で使用される「組み合わせて」投与される又は「共投与される」は、2つ以上の異なる処置が、医学的状態(例えば、肥満症)を有する対象の苦痛中に対象に送達されることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、2つ以上の処置は、対象が疾患又は障害と診断された後、疾患又は障害が治癒又は排除される前に送達される。いくつかの実施形態では、1つの処置の送達は、第2の処置の送達が開始したときに依然として存在し、従って重なりが存在する。いくつかの実施形態では、第1及び第2の処置は、同時に開始される。これらのタイプの送達は、本明細書では「同時(simultaneous)」、「同時発生(concurrent)」又は「同時(concomitant)」送達と称される場合がある。他の実施形態では、1つの処置の送達は、第2の処置の送達が開始する前に終了する。このタイプの送達は、本明細書では、「連続(succesive)」又は「連続(sequential)」送達と称される場合がある。いくつかの実施形態では、GDF15ペプチド及びGFRALは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、GDF15及びGFRALは、連続で投与される。
同時投与のいくつかの実施形態では、2つの処置(例えば、GDF15ペプチド及びGFRAL)は、同じ製剤中に含まれる。そのような製剤は、任意の適切な形態において且つ任意の好適な経路によって投与することができる。いくつかの実施形態では、2つの処置(例えば、GDF15ペプチド及びGFRAL)は、混合物中に含まれる。いくつかの実施形態では、2つの処置(例えば、GDF15ペプチド及びGFRAL)は、複合体中にある。いくつかの実施形態では、2つの処置(例えば、GDF15ペプチド及びGFRAL)は、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、2つの処置は、GDF15ペプチド及びGFRALを含む。いくつかの実施形態では、GFRAL(例えば、可溶性GFRAL)は、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む。
同時投与の他の実施形態では、2つの処置(例えば、GDF15ペプチド及びGFRAL)は、任意の適切な形態において且つ任意の好適な経路により、別個の製剤として投与される。いくつかの実施形態では、2つの処置は、GDF15ペプチド及びGFRALを含む。いくつかの実施形態では、例えば、GDF15ペプチド及びGFRALは、同時発生的に又は任意の順序で異なる時点で連続して投与され得;いずれの場合にも、それらは、所望の治療又は予防効果を提供するために十分近い時間に投与されるべきである。いくつかの実施形態では、GFRAL(例えば、可溶性GFRAL)は、ドメインD2及びD3を含むが、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む。
GDF15抗体ペプチド及び/又はGFRAL受容体ポリペプチド(例えば、可溶性GFRAL)を含む好適な製剤又は組成物を提供し、且つそのような組成物を対象又は実験動物に投与するために従来の製薬慣行が用いられる。医薬組成物を処方する方法は、当技術分野で既知である(例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”Mack Publishing Co.,Easton,PAを参照されたい)。適切な製剤は、投与経路に依存する。
以下の実施例は、本開示の説明的な実施形態を提供する。当業者は、本開示の趣旨又は範囲を変更することなくなされ得る多数の修正形態及び変形形態を認識するであろう。そのような修正形態及び変形形態は、本開示の範囲内に包含される。提供される実施例は、本開示を決して限定するものではない。
実施例1:GDF15結合アッセイのために生成される組換え可溶性GFRAL細胞外ドメイン
方法:ヒトGFRAL(D2D3)−App(配列番号3)、ヒトGFRAL(D2D3)−His(配列番号25)、ヒトGFRAL(ECD)−His(配列番号6)及びヒトGFRAL(ECD)−Fc(配列番号7)遺伝子コンストラクト(図1)をジェンバンク及びUniProtデータベース(NCBI Ref.配列:NM_207410.2;UniProt Ref.配列:Q6UXV0)からのヒトGFRALの遺伝子ヌクレオチド及びタンパク質配列に従って作製した。Vector NTiソフトウエア及びBlastを使用することによって配列をシグナルペプチド(S.P.)及び機能性ドメインについて分析した。全長ヒトGFRAL細胞外ドメイン(GFRAL(ECD))、ヒトGFRAL細胞外ドメインのD2D3領域(GFRAL(D2D3))及び精製タグ、例えばHis(6ヒスチジン)、App(アミロイドβ前駆体タンパク質)又はFc(ヒトIgG1 Fc)を含む遺伝子コンストラクトを設計し、合成し、HEK293T若しくはHEK293F細胞内又はCHO細胞内での遺伝子発現のためのCMVプロモーターの制御下でpRS5a発現ベクターバックボーンにクローン化した。ヒトRET細胞外ドメイン(RET−ECD)をヒトIgG1 Fcと融合することにより、ヒトcRET(ECD)−Fc(配列番号8)(図1)を作製した。ヒトCD33シグナルペプチド(配列番号10)を各コンストラクトのN末端に融合して、タンパク質分泌を指示した。
方法:ヒトGFRAL(D2D3)−App(配列番号3)、ヒトGFRAL(D2D3)−His(配列番号25)、ヒトGFRAL(ECD)−His(配列番号6)及びヒトGFRAL(ECD)−Fc(配列番号7)遺伝子コンストラクト(図1)をジェンバンク及びUniProtデータベース(NCBI Ref.配列:NM_207410.2;UniProt Ref.配列:Q6UXV0)からのヒトGFRALの遺伝子ヌクレオチド及びタンパク質配列に従って作製した。Vector NTiソフトウエア及びBlastを使用することによって配列をシグナルペプチド(S.P.)及び機能性ドメインについて分析した。全長ヒトGFRAL細胞外ドメイン(GFRAL(ECD))、ヒトGFRAL細胞外ドメインのD2D3領域(GFRAL(D2D3))及び精製タグ、例えばHis(6ヒスチジン)、App(アミロイドβ前駆体タンパク質)又はFc(ヒトIgG1 Fc)を含む遺伝子コンストラクトを設計し、合成し、HEK293T若しくはHEK293F細胞内又はCHO細胞内での遺伝子発現のためのCMVプロモーターの制御下でpRS5a発現ベクターバックボーンにクローン化した。ヒトRET細胞外ドメイン(RET−ECD)をヒトIgG1 Fcと融合することにより、ヒトcRET(ECD)−Fc(配列番号8)(図1)を作製した。ヒトCD33シグナルペプチド(配列番号10)を各コンストラクトのN末端に融合して、タンパク質分泌を指示した。
追加のコンストラクト、His−GDF15を、N末端6ヒスチジンタグ化ヒトGDF15(配列番号11)をコードするように設計した(図1)。コンストラクトを合成し、GDF15−由来GFRAL複合体の共トランスフェクション及び共精製のためにpRS5a発現ベクターバックボーンにクローン化した。
新しいコンストラクト:
・ヒトGFRAL(D2D3)−App
・ヒトGFRAL(D2D3)−His
・ヒトGFRAL(ECD)−His
・ヒトGFRAL(ECD)−Fc
・ヒトcRET(ECD)−Fc
・ヒトHis−GDF15
・ヒトGFRAL(D2D3)−App
・ヒトGFRAL(D2D3)−His
・ヒトGFRAL(ECD)−His
・ヒトGFRAL(ECD)−Fc
・ヒトcRET(ECD)−Fc
・ヒトHis−GDF15
細胞株:ヒト胚腎臓細胞縣濁液細胞株HEK293T又はHEK293F若しくはCHO細胞を、一過性トランスフェクションと、組換えGFRAL(D2D3)−App、GFRAL(D2D3)−His、GFRAL(ECD)−His、GFRAL(ECD)−Fc、cRET(ECD)−Fc及び本開示の他のタンパク質又はタンパク質複合体の生成とのためにフリースタイル293発現培地(FS293)中で37℃において増殖させた。
試薬:トランスフェクション及びタンパク質生成のために、PureLink ExpiエンドトキシンフリーGigaプラスミド精製キット(ThermoFisher Scientific、Waltham MA)を使用して、エンドトキシンフリープラスミドDNAを生成した。ポリエチレンイミン溶液(PEI)をトランスフェクションに使用した。Ni−NTAスーパーフローカートリッジ(Qiagen、Germantown MD)及びHiTrapタンパク質Aカラム(GE Healthcare Life Sciences、Marlborough MA)をタンパク質精製に使用した。
組換えタンパク質の発現及び精製:精製組換えGFRAL及びcRETタンパク質並びにこれらのタンパク質のHis−GDF15との共発現複合体を生成するために、発現ベクターをFS293培地中に希釈し、1:2.5(w/w)の比でPEI溶液と混合してDNA/PEI複合体を形成した後、それに応じてHEK293T又はHEK293F細胞培養物又はCHO細胞培養物に添加した。例えば、1mgの発現プラスミドDNAを2.5mgのPEIと複合体化させて、1リットルのHEK293細胞培養物を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの4日後、トランスフェクトした細胞培養物から上清を回収し、濾過し、適切な親和性カラムに通して組換えタンパク質を精製した。Hisタグ化タンパク質は、Qiagen Ni−NTAスーパーフローカートリッジにより精製し、Appタグ化タンパク質は、抗App mAb(モノクローナル抗体)を抱合したセファロース樹脂により、Fc融合物は、タンパク質Aカラムにより精製した。ニッケルカラムに結合したタンパク質を350mMイミダゾールで溶出した。GFRAL(ECD)−Hisコンストラクト単独について、Superdex200カラム(GE Healthcare Life Sciences、Marlborough MA)によるサイズ排除クロマトグラフィーによってモノマー種の追加の精製を行った後、実験に使用した。抗App mAb抱合セファロース樹脂又はタンパク質Aカラムに結合したタンパク質を、150mM NaClで補充した50mMクエン酸溶液(pH 3.0)で溶出した後、1M Tris HCLで中和した。続いて、溶出したタンパク質画分を緩衝液交換し、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中で濃縮した。精製組換えHis−GDF15を、大腸菌(E.coli)を使用して米国特許第2017/204149号明細書に記載されているように生成し、プレートベースのcRET結合及び細胞アッセイのために、ビオチン化するか、又は組換えGFRAL ECDタンパク質とのインビトロ再構成のためにそのままで使用した。
実施例2:可溶性GFRAL細胞外ドメインタンパク質とGDF15との共発現及び共精製
方法:GFRAL(D2D3)−App/His−GDF15及びGFRAL(ECD)−Fc/His−GDF15複合体を生成するために、実施例1に記載したPEI方法を使用した3リットルのHEK293T又はHEK293F培養物の一過性トランスフェクションのためにHis−GDF15ベクターDNAを等量のhGFRAL(D2D3)−Appベクター又はhGFRAL(ECD)−Fcベクターと混合した。トランスフェクションの4日後、GFRAL(D2D3)−App/His−GDF15複合体(図2A〜B及び3)及びGFRAL(ECD)−Fc/His−GDF15複合体(図4A〜B)を、それぞれNi−NTAカートリッジ及びタンパク質Aカラムを通して精製した。溶出したタンパク質画分を緩衝液交換し、DPBS中で濃縮し、SDS−PAGE電気泳動、サイズ排除及び質量分析で分析した。
方法:GFRAL(D2D3)−App/His−GDF15及びGFRAL(ECD)−Fc/His−GDF15複合体を生成するために、実施例1に記載したPEI方法を使用した3リットルのHEK293T又はHEK293F培養物の一過性トランスフェクションのためにHis−GDF15ベクターDNAを等量のhGFRAL(D2D3)−Appベクター又はhGFRAL(ECD)−Fcベクターと混合した。トランスフェクションの4日後、GFRAL(D2D3)−App/His−GDF15複合体(図2A〜B及び3)及びGFRAL(ECD)−Fc/His−GDF15複合体(図4A〜B)を、それぞれNi−NTAカートリッジ及びタンパク質Aカラムを通して精製した。溶出したタンパク質画分を緩衝液交換し、DPBS中で濃縮し、SDS−PAGE電気泳動、サイズ排除及び質量分析で分析した。
GFRAL(D2D3)−App/His−GDF15複合体を3000ml培養培地から精製した(溶出プロファイルは示されない)。図2Aは、例示的なHis−GDF15及びGFRAL(D2D3)−Appコンストラクトを示す。図2Bは、SDS−PAGE分析による画分のスクリーニングを示す。図2Bに示す単一タンパク質バンドは、GFRAL(D2D3)−Appモノマー(24.6kD)及びHis−GDF15ダイマーの両方を含む(ダイマーが26.6kD、モノマーが13.3kD)。
共発現したGFRAL(D2D3)−App/His−GDF15複合体を以下のように分析した:数個の画分から濃縮した複合体は、還元条件下のSDS−PAGEにより明らかなように、共発現GFRAL(D2D3)−App及びHis−GDF15を含む(図3)。複合体は、24.6kD GFRAL(D2D3)−App及び13.3kD His−GDF15を含む。共発現GFRAL(D2D3)−App/His−GDF15複合体(20μg)をサイズ排除により更に分析した(データは示さず)。ピークは、GFRAL(D2D3)−App/His−GDF15複合体の存在を示す。二元複合体におけるGFRAL(D2D3)−App及びHis−GDF15の分子質量も還元条件下で分析した。24355ダルトンピークは、GFRAL(D2D3)−Appポリペプチドであり、そこから精製プロセス中にグリシンをN末端から切り取り、アスパラギン酸及びセリンをC末端から切り取った。
GFRAL(ECD)−Fc/His−GDF15複合体をタンパク質Aカラムから親和性精製した。図4Aは、非還元条件下のSDS−PAGEにより分析した、His−GDF15/GFRAL(ECD)−Fc複合体を含む画分を示す。図4Bは、還元条件下のSDS−PAGEにより明らかなように、図4Aの画分から濃縮した複合体がHis−GDF15及びGFRAL(ECD)−Fcを含むことを示す。
精製により、1.6mgのGFRAL(D2D3)−App/His−GDF15及び14mgのGFRAL(ECD)−Fc/His−GDF15複合体が得られた。これらを更にcRET−発現細胞活性化アッセイに使用した(図7及び8)。
実施例3:可溶性組換えGFRAL変異体とのGDF15複合体は、RET−Fcタンパク質被覆プレートに結合する
ビオチン化組換えHis−GDF15(ビオチン)を精製全長GFRAL(D2D3)−App、GFRAL(ECD)−His又はGFRAL(ECD)−Fcポリペプチド(実施例1に記載したように調製)と混合して、二元分子複合体を形成した。次いで、複合体を希釈し、組換えcRET(ECD)−Fcで被覆したプレートと共にインキュベートした。
ビオチン化組換えHis−GDF15(ビオチン)を精製全長GFRAL(D2D3)−App、GFRAL(ECD)−His又はGFRAL(ECD)−Fcポリペプチド(実施例1に記載したように調製)と混合して、二元分子複合体を形成した。次いで、複合体を希釈し、組換えcRET(ECD)−Fcで被覆したプレートと共にインキュベートした。
方法:可溶性GDF15/GFRAL複合体をインビトロで生成するために、実施例1で精製した組換えGFRAL(D2D3)−App、GFRAL(ECD)−His及びGFRAL(ECD)−Fcタンパク質を、50μM CaCl2で補充したDPBS中の等モル量のビオチン化His−GDF15(1250pM)と新たに混合した。この混合物を室温で60分間インキュベートして、複合体を形成させた。作製した複合体は、4℃で安定であり、更に精製することなく、プラスチックプレートに被覆したcRET(ECD)−Fcに対するインビトロ結合アッセイに直接使用した。His−GDF15(ビオチン)/GFRAL(D2D3)−App、His−GDF15(ビオチン)/GFRAL(ECD)−His及びHis−GDF15(ビオチン)/GFRAL(ECD)−Fcを含む3つの異なるGDF15/GFRAL ECD複合体を同じ方法で調製した。精製組換えHis−GDF15(L294R)、294位のロイシン残基がアルギニンに置き換わった非機能性突然変異(米国特許第2017/204149号を参照されたい)を野生型His−GDF15と同じ方法で調製した。His−GDF15(L294R)をGFRAL(ECD)−Hisと混合して、GDF15/GFRAL/cRET相互作用についての陰性対照を生成した。
野生型GDF15との複合体の可溶性GFRAL細胞外ドメインが、固定化cRETに結合できるか否かを決定するために、組換えヒトcRET(ECD)−FcをDPBS中のメソスケールディスカバリー(MSD)標準結合プレート(1μgタンパク質/ml)上に4℃で一晩被覆した。洗浄及びブロッキング後、プレートを2X段階希釈の異なるGDF15/GFRAL複合体及び対照と共に60分間インキュベートし、次いでストレプトアビジンスルホタグと共にインキュベートした(図5)。
試薬:
・被覆プレートを洗浄するための緩衝液:500μM CaCl2を含有するDPBS
・被覆緩衝液:250μM CaCl2を含有するDPBS
・ブロッキング緩衝液:DPBS、250μM CaCl2を含有する5% BSA
・希釈緩衝液:2% BSA、250μM CaCl2で補充した1X TBST(25mM Tris、150mM NaCl、0.05% Tween 20)
・洗浄溶液:500μM CaCl2で補充した1X TBST
・被覆プレートを洗浄するための緩衝液:500μM CaCl2を含有するDPBS
・被覆緩衝液:250μM CaCl2を含有するDPBS
・ブロッキング緩衝液:DPBS、250μM CaCl2を含有する5% BSA
・希釈緩衝液:2% BSA、250μM CaCl2で補充した1X TBST(25mM Tris、150mM NaCl、0.05% Tween 20)
・洗浄溶液:500μM CaCl2で補充した1X TBST
結果:精製成分で新たに作製した全GFRAL/GDF15複合体は、ストレプトアビジンで検出するプレート上に被覆したcRET(ECD)−Fcに結合することができた。GFRAL(D2D3)−App複合体は、全長GFRAL−由来対応物(GFRAL(ECD)−His及びGFRAL(ECD)−Fc)よりも僅かに強い、GDF15への結合活性を示した(図5)。
実施例4:単独及び突然変異GDF15(L294R)と混合した可溶性GFRAL(ECD)−Hisは、固定化cRET(ECD)−Fcタンパク質に結合しない
方法:精製ビオチン化His−GDF15及びGFRAL(ECD)−His又はHis−GDF15(L294R)及びGFRAL(ECD)−Hisの混合物を実施例3に記載したように調製した。個々のタンパク質His−GDF15(L294R)及びGFRAL(ECD)−Hisも対照として含めた。cRET(ECD)−Fcで被覆したプレートへのタンパク質の結合を、ビオチン化マウス抗6xHisタグモノクローナル抗体と、次いでストレプトアビジンスルホタグとを使用して検出し、実施例3に記載した方法により別様に検出した。
方法:精製ビオチン化His−GDF15及びGFRAL(ECD)−His又はHis−GDF15(L294R)及びGFRAL(ECD)−Hisの混合物を実施例3に記載したように調製した。個々のタンパク質His−GDF15(L294R)及びGFRAL(ECD)−Hisも対照として含めた。cRET(ECD)−Fcで被覆したプレートへのタンパク質の結合を、ビオチン化マウス抗6xHisタグモノクローナル抗体と、次いでストレプトアビジンスルホタグとを使用して検出し、実施例3に記載した方法により別様に検出した。
結果:His−GDF15(ビオチン)/GFRAL(ECD)−His複合体は、cRET(ECD)−Fcへの強い結合を示した。対照的に、His−GDF15(L294R)/GFRAL(ECD)−His混合物、His−GDF15(L294R)突然変異単独及びGFRAL(ECD)−His単独は、cRET(ECD)−Fcへの有意な結合を示さなかった(図6)。
実施例5:His−GDF15と組み合わせた可溶性GFRAL(D2D3)−Appは、SH−SY5Y細胞においてpERK及びpAKTを誘導する
方法:共発現及び共精製His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App及びHis−GDF15/GFRAL(ECD)−Fc複合体を実施例2に記載したように生成した。再構成した可溶性His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体を、各成分を培養培地中で予備混合し、室温で60分間インキュベートすることにより別々に精製した成分から調製した。次いで、タンパク質複合体を使用してSH−SY5Y細胞を直接刺激し、その後、免疫ブロットアッセイによるリン酸化ERK及びAKTタンパク質レベルの決定のために細胞溶解物を調製した。共発現共精製した複合体、予備混合した複合体及び個々のタンパク質を培養培地中で規定濃度に希釈し、次いでSH−SY5Y細胞を15分間刺激するために使用し、その後、検出した。GFRα1及びcRETを介してシグナル伝達する組換えGDNFタンパク質(Peprotech、Rocky Hill NJ)をSH−SY5Y細胞活性化の陽性対照として使用した。His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体によるSH−SY5Y細胞の活性化を、リン酸化ERK及びリン酸化AKTに対する抗体を用いる免疫ブロットアッセイによって検出した。
方法:共発現及び共精製His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App及びHis−GDF15/GFRAL(ECD)−Fc複合体を実施例2に記載したように生成した。再構成した可溶性His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体を、各成分を培養培地中で予備混合し、室温で60分間インキュベートすることにより別々に精製した成分から調製した。次いで、タンパク質複合体を使用してSH−SY5Y細胞を直接刺激し、その後、免疫ブロットアッセイによるリン酸化ERK及びAKTタンパク質レベルの決定のために細胞溶解物を調製した。共発現共精製した複合体、予備混合した複合体及び個々のタンパク質を培養培地中で規定濃度に希釈し、次いでSH−SY5Y細胞を15分間刺激するために使用し、その後、検出した。GFRα1及びcRETを介してシグナル伝達する組換えGDNFタンパク質(Peprotech、Rocky Hill NJ)をSH−SY5Y細胞活性化の陽性対照として使用した。His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体によるSH−SY5Y細胞の活性化を、リン酸化ERK及びリン酸化AKTに対する抗体を用いる免疫ブロットアッセイによって検出した。
細胞培養及び処理方法:SH−SY5Y細胞(American Type Culture Collection(ATCC)CRL−2266)を、10%熱不活性化FBS(Hyclone;SH30071.03)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Life Technologies;15140−122)を含有するDMEM/F12 Ham培地(Life Technologies;11320−033)中の12ウェルポリ−d−リシン被覆プレート(Corning;354470)に400,000細胞/ウェルで播種した。48時間後、培地を上述したような且つ更に1.5μMレチノイン酸を含む新鮮な培地と交換した。24時間後、培地を無血清DMEM/F12で2時間置き換えた。次いで、細胞をタンパク質又は対照で15分間処理し、温DPBSで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。
ウェスタンブロット方法:細胞を、プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル(Pierce;78441)を含有するRIPA緩衝液(Life Technologies;89900)中で溶解した。溶解物を変性させ、還元し、NuPAGE 4〜12%ビス−トリスゲル(Life Technologies;NP0336BOX)中で150Vにおいて2時間泳動した。Invitrogen iBlot 2機器を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜(Life Technologies;IB23001)に25Vで6分間転写した。次いで、0.1% Tween−20(TBST)を含有するトリス緩衝生理食塩水中の5%乾燥ミルク中において膜を室温で1時間ブロックし、続いて5% BSA(Sigma;A8022)を含有するTBST中の1次抗体中において4℃で一晩インキュベートした。膜をTBST中で室温において3回、各々10分間洗浄し、次いで5% BSAを含有するTBST中において室温で1時間、2次抗体中でインキュベートした。次いで、膜をTBST中で室温において3回、各々20分間洗浄した。次いで、化学発光検出試薬(GE Healthcare;RPN2235;又はPerkin Elmer;NEL103001EA)を使用してウェスタンブロットを可視化した。
抗体:
・ホスホ−AKT(Ser473)(Cell Signaling;4060)−1:2000希釈
・ホスホ−p44/42 MAPK(ERK1/2)(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling;4370)−1:2000希釈
・β−アクチン−HRP(Abcam;ab49900)−1:10,000希釈
・抗ウサギIgG、HRP−結合(Cell Signaling;7074)−1:10,000希釈
・ホスホ−AKT(Ser473)(Cell Signaling;4060)−1:2000希釈
・ホスホ−p44/42 MAPK(ERK1/2)(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling;4370)−1:2000希釈
・β−アクチン−HRP(Abcam;ab49900)−1:10,000希釈
・抗ウサギIgG、HRP−結合(Cell Signaling;7074)−1:10,000希釈
結果:共発現及び共精製His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体と予備混合His−GDF15/GFRAL(D2D3)−Appとは、SH−SY5Y細胞においてERK及びAKTのリン酸化を濃度依存的に誘導することができた(図7、レーン3〜5及び12)。対照的に、共発現His−GDF15/GFRAL(ECD)−Fc複合体は、プレート上に固定化された組換えcRET(ECD)−Fcへの結合にも関わらず(図5)、同じ細胞内でERK又はAKTのリン酸化を刺激しなかった(図7、レーン6〜8)。理論に束縛されることを望むものではないが、GFRAL(ECD)のC末端のFcの存在は、GDF15/GFRAL(ECD)と、細胞表面上のRETの細胞外領域との機能性シグナリング複合体の形成を妨げる立体障害を形成する可能性があり、従って(RET自動リン酸化及びシグナリングに必要不可欠な)RET二量体化をもたらさない。加えて、精製された個々の成分は、SH−SY5Y細胞においてERK及びAKTのリン酸化を刺激しなかった(図7、レーン9〜11)。
実施例6:GDF15と組み合わせた可溶性GFRAL(D2D3)は、MCF7細胞においてpERK及びpAKTを誘導する
方法:共発現及び再構成(予備混合)His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体を実施例2及び5に記載したように調製した。GDNFタンパク質(GFRα1及びcRETを介してシグナル伝達する)をMCF7細胞活性化の陽性対照として使用した。
方法:共発現及び再構成(予備混合)His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体を実施例2及び5に記載したように調製した。GDNFタンパク質(GFRα1及びcRETを介してシグナル伝達する)をMCF7細胞活性化の陽性対照として使用した。
細胞培養及び処理方法:MCF7細胞(ATCC;HTB−22)を、10%熱不活性化FBS(Hyclone;SH30071.03)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Life Technologies;15140−122)を含有するEMEM培地(ATCC;30−2003)中、1ウェル当たり100,000細胞で12ウェル組織培養処理プレートに播種した。48時間後、培地を無血清EMEMに24時間交換した。次いで、細胞をタンパク質又は対照で15分間処理し、温DPBSで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。
ウェスタンブロット方法:ウェスタンブロットを実施例5に記載したように行った。
結果:共発現His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体は、SH−SY5Y細胞における結果とは対照的に(図7、レーン3〜5)、MCF7細胞においてERK及びAKTのリン酸化を誘導するように見えなかった(図8、レーン3〜5)。しかしながら、個々の成分からの再構成(予備混合)His−GDF15/GFRAL(D2D3)−Appは、ERK及びAKTのリン酸化を誘導することができた(図8、レーン12)。SH−SY5Y細胞による結果と同様に、共発現His−GDF15/GFRAL(ECD)−Fc複合体は、MCF7細胞においてリン酸化ERK及びAKTを誘導しなかった(図8、レーン6〜8)。精製した個々の成分もMCF7細胞においてERK及びAKTのリン酸化を刺激しなかった(図8、レーン9〜11)。
実施例7:SH−SY5Y及びMCF7細胞におけるERK及びAKTリン酸化の誘導は、GDF15/GFRAL(D2D3)複合体の用量依存性である
方法:実施例5及び6では、再構成(予備混合)His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体は、MCF7及びSH−SY5Y細胞においてERK及びAKTリン酸化を刺激することができた。ERK及びAKTリン酸化が再構成His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体の濃度に依存するか否かを決定するために、希釈した組換えHis−GDF15(28nM、83nM及び250nM)を培養培地中で等量のGFRAL(D2D3)−Appと混合した。この混合物を室温で60分間インキュベートして、複合体を形成させた。次いで、タンパク質複合体を直接使用してMCF7及びSH−SY5Y細胞を15分間刺激した後、実施例5のように、免疫ブロットアッセイによるリン酸化ERK及びAKTレベルの決定のために細胞溶解物を調製した。GDNFタンパク質をSH−SY5Y細胞及びMCF7細胞活性化の陽性対照として使用した。
方法:実施例5及び6では、再構成(予備混合)His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体は、MCF7及びSH−SY5Y細胞においてERK及びAKTリン酸化を刺激することができた。ERK及びAKTリン酸化が再構成His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体の濃度に依存するか否かを決定するために、希釈した組換えHis−GDF15(28nM、83nM及び250nM)を培養培地中で等量のGFRAL(D2D3)−Appと混合した。この混合物を室温で60分間インキュベートして、複合体を形成させた。次いで、タンパク質複合体を直接使用してMCF7及びSH−SY5Y細胞を15分間刺激した後、実施例5のように、免疫ブロットアッセイによるリン酸化ERK及びAKTレベルの決定のために細胞溶解物を調製した。GDNFタンパク質をSH−SY5Y細胞及びMCF7細胞活性化の陽性対照として使用した。
細胞培養及び処理方法:SH−SY5Y細胞を実施例5に記載したように培養及び処理した。MCF7細胞を実施例6に記載したように培養及び処理した。
ウェスタンブロット方法:ウェスタンブロットを実施例5に記載したように行った。
結果:MCF7及びSH−SY5Y細胞におけるERK及びAKTリン酸化の再構成His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体誘導は、複合体の濃度に依存するように見える(図9)。刺激されたSH−SY5Y細胞は、刺激されたMCF7細胞よりも高い、ERK及びAKTのリン酸化の総レベルを示した。
実施例8:His−GDF15及びGFRAL(D2D3)−Appのプレインキュベーションの延長は、MCF7及びSH−SY5Y細胞を活性化できる複合体を再構成するために必要ではない
以下の実験は、部分的には、再構成His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体を使用した、MCF7及びSH−SY5Y細胞におけるERK及びAKTリン酸化の誘導に必要な刺激時間を決定するために行った。また、His−GDF15及びGFRAL(D2D3)−App(MCF7及びSH−SY5Y細胞に添加する前)の共インキュベーションの延長がERK及びAKTリン酸化の誘導に必要であるか否かを評価するために実験を行った。
以下の実験は、部分的には、再構成His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体を使用した、MCF7及びSH−SY5Y細胞におけるERK及びAKTリン酸化の誘導に必要な刺激時間を決定するために行った。また、His−GDF15及びGFRAL(D2D3)−App(MCF7及びSH−SY5Y細胞に添加する前)の共インキュベーションの延長がERK及びAKTリン酸化の誘導に必要であるか否かを評価するために実験を行った。
方法:再構成His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体を以下のように調製した。フォーマット(a):30nM(SH−SY5Y細胞刺激の場合)又は100nM(MCF7細胞刺激の場合)のHis−GDF15を培養培地中で等濃度のGFRAL(D2D3)−Appと混合し、室温で60分間インキュベートして複合体を形成させた後、MCF7及びSH−SY5Y細胞培養物に添加した。フォーマット(b):同じ濃度のHis−GDF15を培養培地中で等濃度のGFRAL(D2D3)−Appと混合した後、MCF7及びSH−SY5Y細胞培養物に直ちに添加した。フォーマット(a)の結果をフォーマット(b)の結果と並行して比較した。GDNFタンパク質を3.3nMでSH−SY5Y細胞及びMCF7細胞活性化の陽性対照として使用した。
細胞培養及び処理方法:SH−SY5Y細胞を実施例5に記載したように培養及び処理した。MCF7細胞を実施例6に記載したように培養及び処理した。
ウェスタンブロット方法:ウェスタンブロットを実施例5に記載したように行った。
結果:MCF7細胞を100nM複合体で5、10及び15分間(図10A、レーン3、5及び7)処理した際、15分の時点(レーン7)が最高のリン酸化ERK及びAKTのレベルを得た。30nM複合体で同じ時間処理したSH−SY5Y細胞も同じであった(図10B、レーン3、5及び7)。プレインキュベーション時間のなかった(即ち混合後、直ちに細胞に添加された)再構成(予備混合)His−GDF15/GFRAL(D2D3)−AppでのMCF7及びSH−SY5Y細胞の15分間の刺激も高いレベルのリン酸化ERK及びAKTを生じた(図10A〜B、レーン9)。これらの結果は、His−GDF15及びGFRAL(D2D3)−Appが互いに急速に相互作用して、RETを発現する細胞を刺激することができる複合体を形成し得ることを示唆している。His−GDF15及びGFRAL(D2D3)−Appに、共インキュベーション時間の延長は必要ではない。
実施例9:GFRAL(D2D3)−AppのHis−GDF15又は脂肪酸−GDF15との組み合わせは、MCF7細胞におけるERKリン酸化を強く刺激する
以下の実験は、部分的には免疫ブロットベースのアッセイを高スループットのプレートベースのアッセイ(AlphaLISA)に変換するために、部分的にはHis−GDF15/GFRAL(D2D3)−App及びHis−GDF15/GFRAL(ECD)−His複合体の効力を比較するために行った。
以下の実験は、部分的には免疫ブロットベースのアッセイを高スループットのプレートベースのアッセイ(AlphaLISA)に変換するために、部分的にはHis−GDF15/GFRAL(D2D3)−App及びHis−GDF15/GFRAL(ECD)−His複合体の効力を比較するために行った。
方法:3つの形態のGDF15をGFRAL(D2D3)−App又はGFRAL(ECD)−Hisと組み合わせて(実施例8に記載したように)、6つの異なるGDF15/GFRAL複合体を生成し、その直後にERKリン酸化の誘導のためにMCF7細胞培養物に添加した。GFD15サンプルは、DPBS pH 7.4中でHis−GDF15、脂肪酸−GDF15(国際公開第2015/200078号パンフレットに記載されているような)及びMSA−GDF15(国際公開第2015/198199号パンフレット及び国際公開第2017/109706号パンフレットに記載されているようなマウス血清アルブミン−GDF15融合物)を含んでいた。GDNFタンパク質をMCF7細胞活性化の陽性対照として使用した。
細胞培養及び処理方法:MCF7細胞を、10%熱不活性化FBS(Hyclone;SH30071.03)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Life Technologies;15140−122)を含有するEMEM培地(ATCC;30−2003)中、1ウェル当たり5,000細胞で384ウェルポリ−d−リシン被覆プレートに播種した。48時間後、培地を無血清EMEMに24時間交換した。次いで、細胞をタンパク質又は対照で15分間処理した。次いで、細胞を氷上に5分間配置し、溶解緩衝液(キットからの、Perkin Elmer;ALSU−PERK−A10K)を各ウェルに加えた。次いで、細胞を350RPMで室温において10分間振盪した。溶解物を、AlphaLISAを行うまで−80℃で保存した。
AlphaLISA方法:ホスホ−ERKレベルを、AlphaLISA SureFire Ultraキット(Perkin Elmer、ALSU−PERK−A10K)を用いて検出し、アッセイを製造業者により説明されるように行った。簡単に言えば、5μlの希釈アクセプタービーズを384ウェルOptiPlate(Perkin Elmer、6007290)の各ウェルに加え;次いで10μlの溶解物を加えた後、5μlの希釈ドナービーズを加え;次いでプレートを1000RPMで10秒間遠心分離し、室温で2時間インキュベートし、次いで標準的なAlphaScreen設定を使用してEnvision機器で読み取った。
結果:GFRAL(D2D3)−Appと複合体化したHis−GDF15は、AlphaLISAにより測定して、MCF7細胞におけるERKリン酸化を用量依存的に誘導した(28nM〜250nM)(図11A〜B)。250nM濃度でGFRAL(D2D3)−Appと複合体化した脂肪酸−GDF15は、同様のERKリン酸化のレベルを誘導した。同じ濃度でGFRAL(D2D3)−Appと複合体化したMSA−GDF15は、比較的少ないERKリン酸化を誘導したが、レベルは、培地のみの対照よりも僅かに上であった。この結果は、GDF15/GFRAL複合体と細胞表面RETとの適切な相互作用を妨げる立体障害を形成し得る、GDF15ダイマーのN末端の2つの大きいMSAポリペプチドの永続的な存在に起因する可能性がある。
GFRAL(D2D3)−Appタンパク質と比較して、全長GFRAL(ECD)−Hisタンパク質(250nM濃度でHis−GDF15又は脂肪酸−GDF15と複合体化される場合)は、培地対照レベルを超えるが、低いERKリン酸化誘導を示した。絶対ホスホ−ERK AlphaLISAアッセイシグナル単位(図11A)及び培地対照と比較したリン酸化ERKシグナルの倍数増加の両方を示すデータ(図11B)である。
実施例10:GFRAL(D2D3)−AppのHis−GDF15又は脂肪酸−GDF15との組み合わせは、SH−SY5Y細胞におけるERKリン酸化を強く刺激する
方法:以下の実験は、SH−SY5Y細胞培養物を試験した以外、実施例9に記載されているように行った。
方法:以下の実験は、SH−SY5Y細胞培養物を試験した以外、実施例9に記載されているように行った。
細胞培養及び処理方法:SH−SY5Y細胞を、10%熱不活性化FBS(Hyclone;SH30071.03)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Life Technologies;15140−122)を含むDMEM/F12 Ham培地(Life Technologies;11320−033)中、1ウェル当たり10,000細胞で384ウェルポリ−d−リシン被覆プレートに播種した。48時間後、培地を上述したような且つ更に1.5μMレチノイン酸を含む新鮮な培地と交換した。24時間後、培地を無血清DMEM/F12で2時間置き換えた。次いで、細胞をタンパク質又は対照で15分間処理した。次いで、細胞を氷上に5分間配置し、溶解緩衝液(キットからの、Perkin Elmer;ALSU−PERK−A10K)を各ウェルに加えた。細胞を350RPMで室温において10分間振盪した。溶解物を、AlphaLISAを行うまで−80℃で保存した。
AlphaLISA方法:ホスホ−ERKレベルを実施例9に記載したように検出した。
結果:MCF7細胞と同様に、His−GDF15/GFRAL(D2D3)−App及び脂肪酸−GDF15/GFRAL(D2D3)−App複合体は、SH−SY5Y細胞におけるERKリン酸化の誘導において、それらのGFRAL(ECD)−His対応物よりも強力であった(図12A〜B)。しかしながら、GFRAL(ECD)−Hisを含む複合体の活性は、MCF7細胞よりもSH−SY5Y細胞においてより高いように見えた。
加えて、MCF7細胞と同様に、GFRALタンパク質と複合体化したMSA−GDF15は、SH−SY5Y細胞においてERKリン酸化の誘導を殆ど示さなかった。絶対ホスホ−ERK AlphaLISAアッセイシグナル単位(図12A)及び培地対照と比較したリン酸化ERKシグナルの倍数増加の両方を示すデータ(図12B)である。
実施例11:MCF7細胞におけるERKリン酸化は、GFRAL(D2D3)及び脂肪酸−GDF15の用量に依存する
方法:これらの実験では、脂肪酸−GDF15を様々な濃度でGFRAL(D2D3)−Appと組み合わせて、MCF7細胞においてERKリン酸化を誘導する各々の相対的な能力を比較した。実験方法は、実施例9に記載したように行った。
方法:これらの実験では、脂肪酸−GDF15を様々な濃度でGFRAL(D2D3)−Appと組み合わせて、MCF7細胞においてERKリン酸化を誘導する各々の相対的な能力を比較した。実験方法は、実施例9に記載したように行った。
細胞培養及び処理方法:MCF7細胞を実施例9に記載したように培養及び処理した。
AlphaLISA方法:ホスホ−ERKレベルを実施例9に記載したように検出した。
結果:より高い濃度の脂肪酸−GDF15及びGFRAL(D2D3)−Appの両方を含む複合体は、培地対照を超える、ERKリン酸化のより高い誘導をもたらした(表3)。
最大pERKシグナルを達成する2つの比が存在し、脂肪酸−GDF15濃度をGFRAL(D2D3)−Appの濃度に又はその濃度を超えて増大させると、ピーク値からのシグナルの減少をもたらし得る。この仮説は、三元複合体モデルと一致している。脂肪酸−GDF15濃度がGFRAL(D2D3)の濃度と一致するか又はその濃度を超えるにつれて、単一GFRAL(D2D3)−Appタンパク質との脂肪酸−GDF15複合体の形成が増大し得る。そのような複合体は、二量体化し、且つ能動的にシグナル伝達する2つのRETタンパク質に結合することができる、2つのGFRAL(D2D3)−Appタンパク質を有する脂肪酸−GDF15複合体とは対照的に、2つのRETタンパク質に結合すると予測されない。従って、アッセイ、が異なるGDF15ベースの材料の効力を正確に比較するように、アッセイにおけるGDF15コンストラクトの濃度は、GFRAL(D2D3)コンストラクトの濃度を超えないことが理想的である。
MCF7細胞におけるERKリン酸化に対するGFRAL(D2D3)−Appと組み合わせた脂肪酸−GDF15の用量依存的な結果は、再現性がある(表4)。
番号付き実施形態
実施形態1.GDF15ペプチドの活性を検出する方法であって、
(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;
(b)細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることと;
(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む、方法。
実施形態1.GDF15ペプチドの活性を検出する方法であって、
(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;
(b)細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることと;
(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む、方法。
実施形態2.可溶性GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む、実施形態1の方法。
実施形態3.可溶性GFRALは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態1又は2の方法。
実施形態4.可溶性GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態1〜3のいずれか1つの方法。
実施形態5.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態1〜3のいずれか1つの方法。
実施形態6.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態1〜3のいずれか1つの方法。
実施形態7.可溶性GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態1〜3のいずれか1つの方法。
実施形態8.可溶性GFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)、実施形態1〜7のいずれか1つの方法。
実施形態9.親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグを含む、実施形態8の方法。
実施形態10.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態1〜9のいずれか1つの方法。
実施形態11.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態1〜9のいずれか1つの方法。
実施形態12.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態1〜9のいずれか1つの方法。
実施形態13.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態1〜12のいずれか1つの方法。
実施形態14.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態1〜13のいずれか1つの方法。
実施形態15.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態1〜14のいずれか1つの方法。
実施形態16.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態1〜15のいずれか1つの方法。
実施形態17.細胞は、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALと同時に接触される、実施形態1〜16のいずれか1つの方法。
実施形態18.細胞は、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALと連続で接触される、実施形態1〜16のいずれか1つの方法。
実施形態19.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同じ組成物中にある、実施形態17の方法。
実施形態20.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、混合物中にある、実施形態19の方法。
実施形態21.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、二元複合体中にある、実施形態19の方法。
実施形態22.細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態1〜21のいずれか1つの方法。
実施形態23.細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態1〜21のいずれか1つの方法。
実施形態24.細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである、実施形態1〜23のいずれか1つの方法。
実施形態25.細胞は、内因性GFRALを発現しない、実施形態1〜24のいずれか1つの方法。
実施形態26.細胞は、全長GFRALを発現しない、実施形態1〜25のいずれか1つの方法。
実施形態27.細胞は、内因性GDF15を発現しない、実施形態1〜26のいずれか1つの方法。
実施形態28.細胞は、無効GDF15遺伝子を含むGDF15ノックアウト(KO)細胞である、実施形態1〜27のいずれか1つの方法。
実施形態29.細胞は、哺乳動物細胞である、実施形態1〜28のいずれか1つの方法。
実施形態30.細胞は、ヒト細胞である、実施形態1〜29のいずれか1つの方法。
実施形態31.細胞は、MCF7細胞である、実施形態1〜30のいずれか1つの方法。
実施形態32.細胞は、SH−SY5Y細胞である、実施形態1〜30のいずれか1つの方法。
実施形態33.細胞は、HEK293A−GDF15 KO細胞である、実施形態1〜30のいずれか1つの方法。
実施形態34.生物学的応答は、GDF15ペプチド、可溶性GFRAL及び細胞表面受容体キナーゼが三元複合体を形成するときに誘導される、実施形態1〜33のいずれか1つの方法。
実施形態35.生物学的応答は、可溶性GFRALの非存在下でGDF15ペプチドと接触された細胞において誘導されない、実施形態1〜34のいずれか1つの方法。
実施形態36.生物学的応答は、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態1〜35のいずれか1つの方法。
実施形態37.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態1〜36のいずれか1つの方法。
実施形態38.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態36の方法。
実施形態39.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態36の方法。
実施形態40.細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態36又は実施形態38の方法。
実施形態41.細胞内タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される、実施形態40の方法。
実施形態42.細胞内タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2の1つ以上から選択される、実施形態40又は実施形態41の方法。
実施形態43.ERKは、ERK1又はERK2である、実施形態41又は実施形態42の方法。
実施形態44.細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態36又は実施形態39の方法。
実施形態45.細胞内タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される、実施形態44の方法。
実施形態46.細胞内タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORの1つ以上から選択される、実施形態44又は実施形態45の方法。
実施形態47.AKTは、AKT1、AKT2又はAKT3である、実施形態45又は実施形態46の方法。
実施形態48.生物学的応答は、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態1〜35のいずれか1つの方法。
実施形態49.タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである、実施形態48の方法。
実施形態50.タンパク質キナーゼ及び/又は細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである、実施形態48又は実施形態49の方法。
実施形態51.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態48の方法。
実施形態52.タンパク質キナーゼは、RET−ERK経路における細胞内タンパク質キナーゼである、実施形態48又は実施形態51の方法。
実施形態53.細胞内タンパク質キナーゼは、ERK、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される、実施形態52の方法。
実施形態54.細胞内タンパク質キナーゼは、ERK、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2の1つ以上から選択される、実施形態52又は実施形態53の方法。
実施形態55.細胞内タンパク質キナーゼは、ERKである、実施形態52〜54のいずれか1つの方法。
実施形態56.ERKは、ERK1又はERK2である、実施形態53〜55のいずれか1つの方法。
実施形態57.タンパク質キナーゼは、RET−AKT経路における細胞内タンパク質キナーゼである、実施形態48又は実施形態51の方法。
実施形態58.細胞内タンパク質キナーゼは、AKT、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される、実施形態57の方法。
実施形態59.細胞内タンパク質キナーゼは、AKT、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTORの1つ以上から選択される、実施形態57又は実施形態58の方法。
実施形態60.細胞内タンパク質キナーゼは、AKTである、実施形態57〜59のいずれか1つの方法。
実施形態61.AKTは、AKT1、AKT2又はAKT3である、実施形態58〜60のいずれか1つの方法。
実施形態62.GDF15ペプチドの活性を検出する方法であって、
(a)GFRAL細胞外ドメイン及び細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;
(b)細胞をGDF15ペプチドと接触させることと;
(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD2及びD3を含む、方法。
(a)GFRAL細胞外ドメイン及び細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;
(b)細胞をGDF15ペプチドと接触させることと;
(c)接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD2及びD3を含む、方法。
実施形態63.GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く、実施形態62の方法。
実施形態64.GFRAL細胞外ドメインは、可溶性GFRAL細胞外ドメインである、実施形態62又は実施形態63の方法。
実施形態65.GFRAL細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される、実施形態62又は実施形態63の方法。
実施形態66.テザーは、GFRAL膜貫通ドメイン又はその機能的断片である、実施形態65の方法。
実施形態67.GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号18のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態65又は実施形態66の方法。
実施形態68.テザーは、GFRAL細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである、実施形態65の方法。
実施形態69.テザーは、グリコホスファチジルイノシトール(GPI)である、実施形態65の方法。
実施形態70.GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号19のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号20のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号21のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む、実施形態65又は実施形態69の方法。
実施形態71.テザーは、膜挿入配列である、実施形態65の方法。
実施形態72.GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号22のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号23のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む、実施形態65又は実施形態71の方法。
実施形態73.テザーは、膜挿入脂肪酸である、実施形態65の方法。
実施形態74.GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態62〜73のいずれか1つの方法。
実施形態75.GFRAL細胞外ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態62〜74のいずれか1つの方法。
実施形態76.GFRAL細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態62〜74のいずれか1つの方法。
実施形態77.GFRAL細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態62〜74のいずれか1つの方法。
実施形態78.GFRAL細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態62〜74のいずれか1つの方法。
実施形態79.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態62〜78のいずれか1つの方法。
実施形態80.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態62〜78のいずれか1つの方法。
実施形態81.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態62〜78のいずれか1つの方法。
実施形態82.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態62〜81のいずれか1つの方法。
実施形態83.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態62〜82のいずれか1つの方法。
実施形態84.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態62〜83のいずれか1つの方法。
実施形態85.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態62〜84のいずれか1つの方法。
実施形態86.細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態62〜85のいずれか1つの方法。
実施形態87.細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態62〜85のいずれか1つの方法。
実施形態88.細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである、実施形態62〜87のいずれか1つの方法。
実施形態89.細胞は、内因性GFRALを発現しない、実施形態62〜88のいずれか1つの方法。
実施形態90.細胞は、全長GFRALを発現しない、実施形態62〜89のいずれか1つの方法。
実施形態91.細胞は、内因性GDF15を発現しない、実施形態62〜90のいずれか1つの方法。
実施形態92.細胞は、無効GDF15遺伝子を含むGDF15 KO細胞である、実施形態62〜91のいずれか1つの方法。
実施形態93.細胞は、哺乳動物細胞である、実施形態62〜92のいずれか1つの方法。
実施形態94.細胞は、ヒト細胞である、実施形態62〜93のいずれか1つの方法。
実施形態95.細胞は、MCF7細胞である、実施形態62〜94のいずれか1つの方法。
実施形態96.細胞は、SH−SY5Y細胞である、実施形態62〜94のいずれか1つの方法。
実施形態97.細胞は、HEK293A−GDF15 KO細胞である、実施形態62〜94のいずれか1つの方法。
実施形態98.生物学的応答は、GDF15ペプチド、GFRAL細胞外ドメイン及び細胞表面受容体キナーゼが三元複合体を形成するときに誘導される、実施形態62〜97のいずれか1つの方法。
実施形態99.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態62〜98のいずれか1つの方法。
実施形態100.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態62〜99のいずれか1つの方法。
実施形態101.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態99の方法。
実施形態102.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態99の方法。
実施形態103.細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態99又は実施形態101の方法。
実施形態104.細胞内タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される、実施形態103の方法。
実施形態105.細胞内タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2の1つ以上から選択される、実施形態103又は実施形態104の方法。
実施形態106.ERKは、ERK1又はERK2である、実施形態104又は実施形態105の方法。
実施形態107.細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態99又は実施形態102の方法。
実施形態108.細胞内タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される、実施形態107の方法。
実施形態109.細胞内タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORの1つ以上から選択される、実施形態107又は実施形態108の方法。
実施形態110.AKTは、AKT1、AKT2又はAKT3である、実施形態108又は実施形態109の方法。
実施形態111.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態62〜98のいずれか1つの方法。
実施形態112.タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである、実施形態111の方法。
実施形態113.タンパク質キナーゼ及び/又は細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである、実施形態111又は実施形態112の方法。
実施形態114.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態111の方法。
実施形態115.タンパク質キナーゼは、RET−ERK経路における細胞内タンパク質キナーゼである、実施形態111又は実施形態114の方法。
実施形態116.細胞内タンパク質キナーゼは、ERK、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される、実施形態115の方法。
実施形態117.細胞内タンパク質キナーゼは、ERK、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2の1つ以上から選択される、実施形態115又は実施形態116の方法。
実施形態118.細胞内タンパク質キナーゼは、ERKである、実施形態115〜117のいずれか1つの方法。
実施形態119.ERKは、ERK1又はERK2である、実施形態116〜118のいずれか1つの方法。
実施形態120.タンパク質キナーゼは、RET−AKT経路における細胞内タンパク質キナーゼである、実施形態111又は実施形態114の方法。
実施形態121.細胞内タンパク質キナーゼは、AKT、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的の1つ以上から選択される、実施形態120の方法。
実施形態122.細胞内タンパク質キナーゼは、AKT、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTORの1つ以上から選択される、実施形態120又は実施形態121の方法。
実施形態123.細胞内タンパク質キナーゼは、AKTである、実施形態120〜122のいずれか1つの方法。
実施形態124.AKTは、AKT1、AKT2又はAKT3である、実施形態121〜123のいずれか1つの方法。
実施形態125.GDF15ペプチドの活性を検出するための単離及び改変された細胞であって、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する、単離及び改変された細胞。
実施形態126.GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く、実施形態125の細胞。
実施形態127.GFRAL細胞外ドメインは、可溶性GFRAL細胞外ドメインである、実施形態125又は実施形態126の細胞。
実施形態128.GFRAL細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される、実施形態125又は実施形態126の細胞。
実施形態129.テザーは、GFRAL膜貫通ドメイン又はその機能的断片である、実施形態128の細胞。
実施形態130.GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号18のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態128又は実施形態129の細胞。
実施形態131.テザーは、GFRAL細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである、実施形態128の細胞。
実施形態132.テザーは、グリコホスファチジルイノシトール(GPI)である、実施形態128の細胞。
実施形態133.GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号19のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号20のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号21のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む、実施形態128又は実施形態132の細胞。
実施形態134.テザーは、膜挿入配列である、実施形態128の細胞。
実施形態135.GFRAL細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号22のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号23のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む、実施形態128又は実施形態134の細胞。
実施形態136.テザーは、膜挿入脂肪酸である、実施形態128の細胞。
実施形態137.GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態125〜136のいずれか1つの細胞。
実施形態138.GFRAL細胞外ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態125〜137のいずれか1つの細胞。
実施形態139.GFRAL細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態125〜137のいずれか1つの細胞。
実施形態140.GFRAL細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態125〜137のいずれか1つの細胞。
実施形態141.GFRAL細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態125〜137のいずれか1つの細胞。
実施形態142.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態125〜141のいずれか1つの細胞。
実施形態143.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態125〜141のいずれか1つの細胞。
実施形態144.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態125〜141のいずれか1つの細胞。
実施形態145.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態125〜144のいずれか1つの細胞。
実施形態146.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態125〜145のいずれか1つの細胞。
実施形態147.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態125〜146のいずれか1つの細胞。
実施形態148.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態125〜147のいずれか1つの細胞。
実施形態149.細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態125〜148のいずれか1つの細胞。
実施形態150.細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態125〜148のいずれか1つの細胞。
実施形態151.細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼである、実施形態125〜150のいずれか1つの細胞。
実施形態152.内因性GFRALを発現しない、実施形態125〜151のいずれか1つの細胞。
実施形態153.全長GFRALを発現しない、実施形態125〜152のいずれか1つの細胞。
実施形態154.内因性GDF15を発現しない、実施形態125〜153のいずれか1つの細胞。
実施形態155.無効GDF15遺伝子を含むGDF15 KO細胞である、実施形態125〜154のいずれか1つの細胞。
実施形態156.哺乳動物細胞である、実施形態125〜155のいずれか1つの細胞。
実施形態157.ヒト細胞である、実施形態125〜156のいずれか1つの細胞。
実施形態158.MCF7細胞である、実施形態125〜157のいずれか1つの細胞。
実施形態159.SH−SY5Y細胞である、実施形態125〜157のいずれか1つの細胞。
実施形態160.HEK293A−GDF15 KO細胞である、実施形態125〜157のいずれか1つの細胞。
実施形態161.GDF15ペプチドの活性を決定するためのキットであって、GDF15ペプチドと接触するための、実施形態125〜160のいずれか1つの細胞と;接触された細胞における生物学的応答を検出する手段とを含むキット。
実施形態162.肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であって、GDF15ペプチドを対象に投与することを含み、GDF15ペプチドは、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、生物学的応答は、実施形態1〜124のいずれか1つの方法によって検出されるか又は検出され得る、方法。
実施形態163.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態162の方法。
実施形態164.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態162の方法。
実施形態165.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態162の方法。
実施形態166.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態162〜165のいずれか1つの方法。
実施形態167.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態162〜166のいずれか1つの方法。
実施形態168.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態162〜167のいずれか1つの方法。
実施形態169.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態162〜168のいずれか1つの方法。
実施形態170.生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態162〜169のいずれか1つの方法。
実施形態171.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態162〜170のいずれか1つの方法。
実施形態172.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態162〜171のいずれか1つの方法。
実施形態173.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態171の方法。
実施形態174.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態171の方法。
実施形態175.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態162〜170のいずれか1つの方法。
実施形態176.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態175の方法。
実施形態177.対象は、過体重又は肥満である、実施形態162〜176のいずれか1つの方法。
実施形態178.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態162〜177のいずれか1つの方法。
実施形態179.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態162〜177のいずれか1つの方法。
実施形態180.肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態162〜179のいずれか1つの方法。
実施形態181.肥満症関連の障害は、癌、II型糖尿病(T2DM)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態162〜180のいずれか1つの方法。
実施形態182.対象の肥満症又は肥満症関連の障害の処置におけるGDF15ペプチドの使用であって、GDF15ペプチドは、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、生物学的応答は、実施形態1〜124のいずれか1つの方法によって検出されるか又は検出され得る、使用。
実施形態183.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態182の使用。
実施形態184.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態182の使用。
実施形態185.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態182の使用。
実施形態186.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態182〜185のいずれか1つの使用。
実施形態187.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態182〜186のいずれか1つの使用。
実施形態188.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態182〜187のいずれか1つの使用。
実施形態189.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態182〜188のいずれか1つの使用。
実施形態190.生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態182〜189のいずれか1つの使用。
実施形態191.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態182〜190のいずれか1つの使用。
実施形態192.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態182〜191のいずれか1つの使用。
実施形態193.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態191の使用。
実施形態194.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態191の使用。
実施形態195.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態182〜190のいずれか1つの使用。
実施形態196.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態195の使用。
実施形態197.対象は、過体重又は肥満である、実施形態182〜196のいずれか1つの使用。
実施形態198.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態182〜197のいずれか1つの使用。
実施形態199.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態182〜197のいずれか1つの使用。
実施形態200.肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態182〜199のいずれか1つの使用。
実施形態201.肥満症関連の障害は、癌、II型糖尿病(T2DM)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態182〜200のいずれか1つの使用。
実施形態202.食欲及び/又は体重を低減させる方法であって、GDF15ペプチドを対象に投与することを含み、GDF15ペプチドは、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、生物学的応答は、実施形態1〜124のいずれか1つの方法によって検出されるか又は検出され得る、方法。
実施形態203.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態202の方法。
実施形態204.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態202の方法。
実施形態205.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態202の方法。
実施形態206.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態202〜205のいずれか1つの方法。
実施形態207.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態202〜206のいずれか1つの方法。
実施形態208.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態202〜207のいずれか1つの方法。
実施形態209.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態202〜208のいずれか1つの方法。
実施形態210.生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態202〜209のいずれか1つの方法。
実施形態211.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態202〜210のいずれか1つの方法。
実施形態212.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態202〜211のいずれか1つの方法。
実施形態213.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態211の方法。
実施形態214.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態211の方法。
実施形態215.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態202〜210のいずれか1つの方法。
実施形態216.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態215の方法。
実施形態217.対象は、過体重又は肥満である、実施形態202〜216のいずれか1つの方法。
実施形態218.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態202〜217のいずれか1つの方法。
実施形態219.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態202〜217のいずれか1つの方法。
実施形態220.対象の食欲及び/又は体重の低減におけるGDF15ペプチドの使用であって、GDF15ペプチドは、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、生物学的応答は、実施形態1〜124のいずれか1つの方法によって検出されるか又は検出され得る、使用。
実施形態221.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態220の使用。
実施形態222.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態220の使用。
実施形態223.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態220の使用。
実施形態224.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態220〜223のいずれか1つの使用。
実施形態225.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態220〜224のいずれか1つの使用。
実施形態226.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態220〜225のいずれか1つの使用。
実施形態227.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態220〜226のいずれか1つの使用。
実施形態228.生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態220〜227のいずれか1つの使用。
実施形態229.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態220〜228のいずれか1つの使用。
実施形態230.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態220〜229のいずれか1つの使用。
実施形態231.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態229の使用。
実施形態232.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態229の使用。
実施形態233.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態220〜228のいずれか1つの使用。
実施形態234.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態233の使用。
実施形態235.対象は、過体重又は肥満である、実施形態220〜234のいずれか1つの使用。
実施形態236.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態220〜235のいずれか1つの使用。
実施形態237.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態220〜235のいずれか1つの使用。
実施形態238.ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む可溶性GFRAL。
実施形態239.ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む、実施形態238の可溶性GFRAL。
実施形態240.シグナルペプチドを更に含む、実施形態238又は実施形態239の可溶性GFRAL。
実施形態241.配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態238〜240のいずれか1つの可溶性GFRAL。
実施形態242.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態238〜240のいずれか1つの可溶性GFRAL。
実施形態243.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態238〜240のいずれか1つの可溶性GFRAL。
実施形態244.配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態238〜240のいずれか1つの可溶性GFRAL。
実施形態245.親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)、実施形態238〜244のいずれか1つの可溶性GFRAL。
実施形態246.親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグを含む、実施形態245の可溶性GFRAL。
実施形態247.肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であって、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALを対象に投与することを含み、GDF15ペプチドは、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む、方法。
実施形態248.可溶性GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む、実施形態247の方法。
実施形態249.可溶性GFRALは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態247又は実施形態248の方法。
実施形態250.可溶性GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態247〜249のいずれか1つの方法。
実施形態251.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態247〜249のいずれか1つの方法。
実施形態252.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態247〜249のいずれか1つの方法。
実施形態253.可溶性GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態247〜249のいずれか1つの方法。
実施形態254.可溶性GFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)、実施形態247〜253のいずれか1つの方法。
実施形態255.親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグを含む、実施形態254の方法。
実施形態256.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態247〜255のいずれか1つの方法。
実施形態257.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態247〜255のいずれか1つの方法。
実施形態258.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態247〜255のいずれか1つの方法。
実施形態259.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態247〜258のいずれか1つの方法。
実施形態260.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態247〜259のいずれか1つの方法。
実施形態261.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態247〜260のいずれか1つの方法。
実施形態262.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態247〜261のいずれか1つの方法。
実施形態263.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同時に投与される、実施形態247〜262のいずれか1つの方法。
実施形態264.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、連続で投与される、実施形態247〜262のいずれか1つの方法。
実施形態265.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同じ組成物中にある、実施形態263の方法。
実施形態266.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、混合物中にある、実施形態265の方法。
実施形態267.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、二元複合体中にある、実施形態265の方法。
実施形態268.生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態247〜267のいずれか1つの方法。
実施形態269.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態247〜268のいずれか1つの方法。
実施形態270.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態247〜269のいずれか1つの方法。
実施形態271.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態269の方法。
実施形態272.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態269の方法。
実施形態273.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態247〜268のいずれか1つの方法。
実施形態274.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態273の方法。
実施形態275.対象は、過体重又は肥満である、実施形態247〜274のいずれか1つの方法。
実施形態276.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態247〜275のいずれか1つの方法。
実施形態277.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態247〜275のいずれか1つの方法。
実施形態278.肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態247〜277のいずれか1つの方法。
実施形態279.肥満症関連の障害は、癌、II型糖尿病(T2DM)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態247〜278のいずれか1つの方法。
実施形態280.対象の肥満症又は肥満症関連の障害の処置におけるGDF15ペプチド及び可溶性GFRALの使用であって、GDF15ペプチドは、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む、使用。
実施形態281.可溶性GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む、実施形態280の使用。
実施形態282.可溶性GFRALは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態280又は実施形態281の使用。
実施形態283.可溶性GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態280〜282のいずれか1つの使用。
実施形態284.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態280〜282のいずれか1つの使用。
実施形態285.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態280〜282のいずれか1つの使用。
実施形態286.可溶性GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態280〜282のいずれか1つの使用。
実施形態287.可溶性GFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)、実施形態280〜286のいずれか1つの使用。
実施形態288.親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグを含む、実施形態287の使用。
実施形態289.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態280〜288のいずれか1つの使用。
実施形態290.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態280〜288のいずれか1つの使用。
実施形態291.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態280〜288のいずれか1つの使用。
実施形態292.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態280〜291のいずれか1つの使用。
実施形態293.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態280〜292のいずれか1つの使用。
実施形態294.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態280〜293のいずれか1つの使用。
実施形態295.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態280〜294のいずれか1つの使用。
実施形態296.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同時に投与される、実施形態280〜295のいずれか1つの使用。
実施形態297.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、連続で投与される、実施形態280〜295のいずれか1つの使用。
実施形態298.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同じ組成物中にある、実施形態296の使用。
実施形態299.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、混合物中にある、実施形態298の使用。
実施形態300.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、二元複合体中にある、実施形態298の使用。
実施形態301.生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態280〜300のいずれか1つの使用。
実施形態302.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態280〜301のいずれか1つの使用。
実施形態303.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態280〜302のいずれか1つの使用。
実施形態304.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態302の使用。
実施形態305.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態302の使用。
実施形態306.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態280〜301のいずれか1つの使用。
実施形態307.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態306の使用。
実施形態308.対象は、過体重又は肥満である、実施形態280〜307のいずれか1つの使用。
実施形態309.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態280〜308のいずれか1つの使用。
実施形態310.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態280〜308のいずれか1つの使用。
実施形態311.肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態280〜310のいずれか1つの使用。
実施形態312.肥満症関連の障害は、癌、II型糖尿病(T2DM)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態280〜311のいずれか1つの使用。
実施形態313.食欲及び/又は体重を低減させる方法であって、GDF15ペプチド及び可溶性GFRALを対象に投与することを含み、GDF15ペプチドは、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む、方法。
実施形態314.可溶性GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む、実施形態313の方法。
実施形態315.可溶性GFRALは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態313又は実施形態314の方法。
実施形態316.可溶性GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態313〜315のいずれか1つの方法。
実施形態317.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態313〜315のいずれか1つの方法。
実施形態318.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態313〜315のいずれか1つの方法。
実施形態319.可溶性GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態313〜315のいずれか1つの方法。
実施形態320.可溶性GFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)、実施形態313〜319のいずれか1つの方法。
実施形態321.親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグを含む、実施形態320の方法。
実施形態322.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態313〜321のいずれか1つの方法。
実施形態323.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態313〜321のいずれか1つの方法。
実施形態324.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態313〜321のいずれか1つの方法。
実施形態325.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態313〜324のいずれか1つの方法。
実施形態326.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態313〜325のいずれか1つの方法。
実施形態327.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態313〜326のいずれか1つの方法。
実施形態328.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態313〜327のいずれか1つの方法。
実施形態329.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同時に投与される、実施形態313〜328のいずれか1つの方法。
実施形態330.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、連続で投与される、実施形態313〜328のいずれか1つの方法。
実施形態331.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同じ組成物中にある、実施形態329の方法。
実施形態332.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、混合物中にある、実施形態331の方法。
実施形態333.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、二元複合体中にある、実施形態331の方法。
実施形態334.生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態313〜333のいずれか1つの方法。
実施形態335.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態313〜334のいずれか1つの方法。
実施形態336.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態313〜335のいずれか1つの方法。
実施形態337.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態335の方法。
実施形態338.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態335の方法。
実施形態339.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態313〜334のいずれか1つの方法。
実施形態340.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態339の方法。
実施形態341.対象は、過体重又は肥満である、実施形態313〜340のいずれか1つの方法。
実施形態342.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態313〜341のいずれか1つの方法。
実施形態343.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態313〜341のいずれか1つの方法。
実施形態344.対象の食欲及び/又は体重の低減におけるGDF15ペプチド及び可溶性GFRALの使用であって、GDF15ペプチドは、GDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む、使用。
実施形態345.可溶性GFRALは、ドメインD1を欠いたGFRAL細胞外ドメインを含む、実施形態344の使用。
実施形態346.可溶性GFRALは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態344又は実施形態345の使用。
実施形態347.可溶性GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態344〜346のいずれか1つの使用。
実施形態348.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態344〜346のいずれか1つの使用。
実施形態349.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態344〜346のいずれか1つの使用。
実施形態350.可溶性GFRALは、配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態344〜346のいずれか1つの使用。
実施形態351.可溶性GFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)、実施形態344〜350のいずれか1つの使用。
実施形態352.親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグを含む、実施形態351の使用。
実施形態353.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態344〜352のいずれか1つの使用。
実施形態354.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態344〜352のいずれか1つの使用。
実施形態355.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態344〜352のいずれか1つの使用。
実施形態356.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態344〜355のいずれか1つの使用。
実施形態357.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態344〜356のいずれか1つの使用。
実施形態358.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態344〜357のいずれか1つの使用。
実施形態359.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態344〜358のいずれか1つの使用。
実施形態360.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同時に投与される、実施形態344〜359のいずれか1つの使用。
実施形態361.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、連続で投与される、実施形態344〜359のいずれか1つの使用。
実施形態362.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、同じ組成物中にある、実施形態360の使用。
実施形態363.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、混合物中にある、実施形態362の使用。
実施形態364.GDF15ペプチド及び可溶性GFRALは、二元複合体中にある、実施形態362の使用。
実施形態365.生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態344〜364のいずれか1つの使用。
実施形態366.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態344〜365のいずれか1つの使用。
実施形態367.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態344〜366のいずれか1つの使用。
実施形態368.タンパク質は、ERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、RET−ERK経路における細胞内タンパク質である、実施形態366の使用。
実施形態369.タンパク質は、AKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、実施形態366の使用。
実施形態370.生物学的応答は、GDF15ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態344〜365のいずれか1つの使用。
実施形態371.タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態370の使用。
実施形態372.対象は、過体重又は肥満である、実施形態344〜371のいずれか1つの使用。
実施形態373.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態344〜372のいずれか1つの使用。
実施形態374.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態344〜372のいずれか1つの使用。
実施形態375.GDF15活性を調節することができる薬剤を同定する方法であって、
(a)実施形態125〜160のいずれか1つの細胞を薬剤及びGDF15ペプチドと接触させることと;
(b)接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、薬剤の非存在下でGDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答に対して増大又は減少される場合、GDF15活性を調節すると決定される、方法。
(a)実施形態125〜160のいずれか1つの細胞を薬剤及びGDF15ペプチドと接触させることと;
(b)接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、薬剤の非存在下でGDF15ペプチドと接触された細胞における生物学的応答に対して増大又は減少される場合、GDF15活性を調節すると決定される、方法。
実施形態376.薬剤は、抗体である、実施形態375の方法。
実施形態377.薬剤は、抗GDF15抗体である、実施形態375又は実施形態376の方法。
実施形態378.薬剤は、抗GFRAL抗体である、実施形態375又は実施形態376の方法。
実施形態379.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現、活性又はリン酸化レベルの増大又は減少である、実施形態375〜378のいずれか1つの方法。
実施形態380.細胞内タンパク質は、RET−ERK経路にあり、且つERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、実施形態379の方法。
実施形態381.細胞内タンパク質は、RET−AKT経路にあり、且つAKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、実施形態379の方法。
実施形態382.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態375〜381のいずれか1つの方法。
実施形態383.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態375〜381のいずれか1つの方法。
実施形態384.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態375〜381のいずれか1つの方法。
実施形態385.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態375〜384のいずれか1つの方法。
実施形態386.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態375〜385のいずれか1つの方法。
実施形態387.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態375〜386のいずれか1つの方法。
実施形態388.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態375〜387のいずれか1つの方法。
実施形態389.GDF15活性を調節することができる薬剤を同定する方法であって、
(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;
(b)細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることと;
(c)細胞を薬剤と接触させることと;
(d)接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含み、且つドメインD1を欠く、方法。
(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;
(b)細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることと;
(c)細胞を薬剤と接触させることと;
(d)接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含み、且つドメインD1を欠く、方法。
実施形態390.薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、GDF15ペプチド、可溶性GFRAL及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触された細胞における生物学的応答に対して増大される場合、GDF15活性を調節するか又は増大させると決定される、実施形態389の方法。
実施形態391.薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、GDF15ペプチド、可溶性GFRAL及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触された細胞における生物学的応答に対して減少される場合、GDF15活性を調節するか又は減少させると決定される、実施形態389の方法。
実施形態392.薬剤は、抗体である、実施形態389〜391のいずれか1つの方法。
実施形態393.薬剤は、抗GDF15抗体である、実施形態389〜392のいずれか1つの方法。
実施形態394.薬剤は、抗GFRAL抗体である、実施形態389〜392のいずれか1つの方法。
実施形態395.生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現、活性又はリン酸化レベルの増大又は減少である、実施形態389〜394のいずれか1つの方法。
実施形態396.細胞内タンパク質は、RET−ERK経路にあり、且つERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、実施形態395の方法。
実施形態397.細胞内タンパク質は、RET−AKT経路にあり、且つAKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、実施形態395の方法。
実施形態398.可溶性GFRALは、配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態389〜397のいずれか1つの方法。
実施形態399.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態389〜397のいずれか1つの方法。
実施形態400.可溶性GFRAL又は機能的変異体は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態389〜397のいずれか1つの方法。
実施形態401.可溶性GFRALは、親和性タグを更に含む(例えば、親和性タグに融合される)、実施形態389〜400のいずれか1つの方法。
実施形態402.親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグを含む、実施形態401の方法。
実施形態403.GDF15ペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態389〜402のいずれか1つの方法。
実施形態404.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態389〜402のいずれか1つの方法。
実施形態405.GDF15ペプチド又は機能的変異体は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態389〜402のいずれか1つの方法。
実施形態406.GDF15ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び/又はグリコシル化を含む、実施形態389〜405のいずれか1つの方法。
実施形態407.GDF15ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ又はmycタグでタグ化される、実施形態389〜406のいずれか1つの方法。
実施形態408.GDF15ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合される、実施形態389〜407のいずれか1つの方法。
実施形態409.GDF15ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態389〜408のいずれか1つの方法。
実施形態410.薬剤を含む医薬組成物を製造する方法であって、
(a)実施形態375〜409のいずれか1つの方法により、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定することと;
(b)薬剤を医薬組成物中に処方することと
を含む方法。
(a)実施形態375〜409のいずれか1つの方法により、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定することと;
(b)薬剤を医薬組成物中に処方することと
を含む方法。
実施形態411.薬剤は、抗体である、実施形態410の方法。
実施形態412.薬剤は、抗GDF15抗体である、実施形態410又は実施形態411の方法。
実施形態413.薬剤は、抗GFRAL抗体である、実施形態410又は実施形態411の方法。
実施形態414.対象における肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であって、
(a)実施形態375〜409のいずれか1つの方法により、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定することと;
(b)薬剤を対象に投与することと
を含む方法。
(a)実施形態375〜409のいずれか1つの方法により、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定することと;
(b)薬剤を対象に投与することと
を含む方法。
実施形態415.薬剤は、抗体である、実施形態414の方法。
実施形態416.薬剤は、抗GDF15抗体である、実施形態414又は実施形態415の方法。
実施形態417.薬剤は、抗GFRAL抗体である、実施形態414又は実施形態415の方法。
実施形態418.対象は、過体重又は肥満である、実施形態414〜417のいずれか1つの方法。
実施形態419.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態414〜418のいずれか1つの方法。
実施形態420.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態414〜418のいずれか1つの方法。
実施形態421.肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態414〜420のいずれか1つの方法。
実施形態422.肥満症関連の障害は、癌、II型糖尿病(T2DM)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態414〜421のいずれか1つの方法。
実施形態423.対象における食欲及び/又は体重を低減させる方法であって、
(a)実施形態375〜409のいずれか1つの方法により、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定することと;
(b)薬剤を対象に投与することと
を含む方法。
(a)実施形態375〜409のいずれか1つの方法により、GDF15活性を調節することができる薬剤を同定することと;
(b)薬剤を対象に投与することと
を含む方法。
実施形態424.薬剤は、抗体である、実施形態423の方法。
実施形態425.薬剤は、抗GDF15抗体である、実施形態423又は実施形態424の方法。
実施形態426.薬剤は、抗GFRAL抗体である、実施形態423又は実施形態424の方法。
実施形態427.対象は、過体重又は肥満である、実施形態423〜426のいずれか1つの方法。
実施形態428.対象は、25〜29.9の肥満度指数を有する、実施形態423〜427のいずれか1つの方法。
実施形態429.対象は、30以上の肥満度指数を有する、実施形態423〜427のいずれか1つの方法。
Claims (45)
- GDF15ペプチドの活性を検出する方法であって、
(i)
(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;
(b)前記細胞を前記GDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることであって、前記可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む、接触させることと;
(c)前記接触された細胞における生物学的応答を検出することと;又は
(ii)
(a)細胞表面受容体キナーゼ並びにドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを発現する細胞を提供することと;
(b)前記細胞を前記GDF15ペプチドと接触させることと;
(c)前記接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含む方法。 - 前記GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く、請求項1に記載の方法。
- 細胞表面受容体キナーゼ及びGFRAL細胞外ドメインを発現する細胞を提供し、
(i)前記GFRAL細胞外ドメインは、可溶性GFRAL細胞外ドメインであるか、又は
(ii)前記GFRAL細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記テザーは、
(i)GFRAL膜貫通ドメイン又はその機能的断片であるか;
(ii)配列番号18のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(iii)前記GFRAL細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインであるか;
(iv)グリコホスファチジルイノシトール(GPI)であるか;
(v)配列番号19のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号20のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号21のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか;
(vi)膜挿入配列であるか;
(vii)配列番号22のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号23のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか;又は
(viii)膜挿入脂肪酸である、請求項3に記載の方法。 - 前記GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、
(i)配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(ii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(iii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(iv)配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(v)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(vi)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(vii)配列番号3のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;又は
(viii)配列番号25のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記GDF15ペプチド又はその機能的変異体は、
(i)配列番号13、14、15、16若しくは17のアミノ酸配列又はその機能的変異体含むか;
(ii)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;又は
(iii)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記GDF15ペプチドは、
(i)アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化され;
(ii)ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合され;
(iii)脂肪酸に抱合され;
(iv)ペグ化を有し;及び/又は
(v)グリコシル化を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞表面受容体キナーゼは、
(i)内因性細胞表面受容体キナーゼ;
(ii)外因性細胞表面受容体キナーゼ;及び/又は
(iii)RET受容体チロシンキナーゼ
である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞は、
(i)内因性GFRAL;
(ii)全長GFRAL;及び/又は
(iii)内因性GDF15
を発現しない、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞は、無効GDF15遺伝子を含むGDF15ノックアウト(KO)細胞である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的応答は、
(i)前記GDF15ペプチド、前記可溶性GFRAL又は前記GFRAL細胞外ドメイン及び前記細胞表面受容体キナーゼが三元複合体を形成するときに誘導され;
(ii)前記可溶性GFRALの非存在下で前記GDF15ペプチドと接触された細胞において誘導されず;及び/又は
(iii)前記GDF15ペプチド及び/又は前記可溶性GFRALと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した前記細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであり、及び前記タンパク質は、
(i)ERK1、ERK2、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的から選択される、前記RET−ERK経路における細胞内タンパク質であるか;又は
(ii)AKT1、AKT2、AKT3、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的から選択される、前記RET−AKT経路における細胞内タンパク質である、請求項14に記載の方法。 - 前記生物学的応答は、前記GDF15ペプチド及び/又は前記可溶性GFRALと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した前記細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- (i)前記タンパク質キナーゼは、前記細胞表面受容体キナーゼであるか;
(ii)前記タンパク質キナーゼ及び/又は細胞表面受容体キナーゼは、RET受容体チロシンキナーゼであるか;又は
(iii)前記タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、前記細胞内タンパク質キナーゼは、前記細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、請求項16に記載の方法。 - 前記タンパク質キナーゼは、
(i)ERK1、ERK2、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2又はその任意の下流標的から選択される、前記RET−ERK経路における細胞内タンパク質キナーゼ;又は
(ii)AKT1、AKT2、AKT3、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β及びmTOR又はその任意の下流標的から選択される、前記RET−AKT経路における細胞内タンパク質キナーゼである、請求項16又は17に記載の方法。 - GDF15ペプチドの活性を検出するための単離及び改変された細胞であって、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する、単離及び改変された細胞。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く、請求項19に記載の細胞。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、
(i)可溶性GFRAL細胞外ドメインであるか;又は
(ii)テザーによって細胞表面に付着される、請求項19又は20に記載の細胞。 - 前記テザーは、
(i)GFRAL膜貫通ドメイン又はその機能的断片であるか;
(ii)配列番号18のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(iii)前記GFRAL細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインであるか;
(iv)グリコホスファチジルイノシトール(GPI)であるか;
(v)配列番号19のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号20のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号21のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか;
(vi)膜挿入配列であるか;
(vii)配列番号22のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号23のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか;又は
(viii)膜挿入脂肪酸である、請求項21に記載の細胞。 - 前記GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、請求項19〜22のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化される、請求項19〜23のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、
(i)配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(ii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(iii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(iv)配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(v)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(vi)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(vii)配列番号3のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;又は
(viii)配列番号25のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、請求項19〜24のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記細胞表面受容体キナーゼは、
(i)内因性細胞表面受容体キナーゼ;
(ii)外因性細胞表面受容体キナーゼ;及び/又は
(iii)RET受容体チロシンキナーゼ
である、請求項19〜25のいずれか一項に記載の細胞。 - (i)内因性GFRAL;
(ii)全長GFRAL;及び/又は
(iii)内因性GDF15
を発現しない、請求項19〜26のいずれか一項に記載の細胞。 - 無効GDF15遺伝子を含むGDF15ノックアウト(KO)細胞である、請求項19〜27のいずれか一項に記載の細胞。
- 哺乳動物細胞、ヒト細胞、MCF7細胞、SH−SY5Y細胞及びHEK293A−GDF15 KO細胞から選択される、請求項19〜28のいずれか一項に記載の細胞。
- GDF15ペプチドの活性を検出するためのキットであって、前記GDF15ペプチドと接触するための、請求項19〜29のいずれか一項に記載の細胞と;前記接触された細胞における生物学的応答を検出する手段とを含むキット。
- ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含む可溶性GFRAL。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、ドメインD1を欠く、請求項31に記載の可溶性GFRAL。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、請求項31又は32に記載の可溶性GFRAL。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化される、請求項31〜33のいずれか一項に記載の可溶性GFRAL。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、
(i)配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(ii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(iii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(iv)配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(v)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(vi)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(vii)配列番号3のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;又は
(viii)配列番号25のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、請求項31〜34のいずれか一項に記載の可溶性GFRAL。 - GDF15活性を調節することができる薬剤を同定する方法であって、
(a)請求項19〜29のいずれか一項に記載の細胞を前記薬剤及びGDF15ペプチドと接触させることと;
(b)前記接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、前記薬剤は、前記接触された細胞における前記生物学的応答が、前記薬剤の非存在下で前記GDF15ペプチドと接触された細胞における前記生物学的応答に対して増大又は減少される場合、GDF15活性を調節すると決定される、方法。 - GDF15活性を調節することができる薬剤を同定する方法であって、
(a)細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと;
(b)前記細胞をGDF15ペプチド及び可溶性GFRALと接触させることであって、前記可溶性GFRALは、ドメインD2及びD3を含むGFRAL細胞外ドメインを含み、且つドメインD1を欠く、接触させることと;
(c)前記細胞を前記薬剤と接触させることと;
(d)前記接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、前記薬剤は、
(i)前記接触された細胞における前記生物学的応答が、前記GDF15ペプチド、前記可溶性GFRAL及び前記薬剤の存在下において、前記薬剤の非存在下で前記GDF15ペプチド及び前記可溶性GFRALと接触された細胞における前記生物学的応答に対して増大される場合、GDF15活性を調節するか又は増大させるか;又は
(ii)前記接触された細胞における前記生物学的応答が、前記GDF15ペプチド、前記可溶性GFRAL及び前記薬剤の存在下において、前記薬剤の非存在下で前記GDF15ペプチド及び前記可溶性GFRALと接触された細胞における前記生物学的応答に対して減少される場合、GDF15活性を調節するか又は減少させると決定される、方法。 - 前記GFRAL細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化される、請求項37に記載の方法。
- 前記GFRAL細胞外ドメインは、
(i)配列番号1のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(ii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(iii)配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(iv)配列番号2のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;
(v)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(vi)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するか;
(vii)配列番号3のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか;又は
(viii)配列番号25のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、請求項37又は38に記載の方法。 - 前記薬剤は、抗GDF15抗体及び抗GFRAL抗体から選択される抗体である、請求項36〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的応答は、RET−ERK、RET−AKT、タンパク質キナーゼC、JAK/STAT、JNK、p38及びRAC1経路の1つ以上における細胞内タンパク質の発現、活性又はリン酸化レベルの増大又は減少である、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞内タンパク質は、前記RET−ERK経路にあり、且つERK、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1及びMSK2から選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記細胞内タンパク質は、前記RET−AKT経路にあり、且つAKT、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、カスパーゼ−9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β及びmTORから選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記GDF15ペプチド又はその機能的変異体は、
(i)配列番号13、14、15、16若しくは17のアミノ酸配列又はその機能的変異体含むか;
(ii)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか;又は
(iii)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項36〜43のいずれか一項に記載の方法。 - 前記GDF15ペプチドは、
(i)アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、FLAGタグ及びmycタグから選択される親和性タグでタグ化され;
(ii)ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−1−アンチトリプシンに融合され;
(iii)脂肪酸に抱合され;
(iv)ペグ化を有し;及び/又は
(v)グリコシル化を有する、請求項36〜44のいずれか一項に記載の方法。
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